Выделение продуцента альфа-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы из природных источников и разработка технологии ферментного препарата на его основе

Строева, Светлана Сергеевна

Технология чая, табака и биологически активных веществ и субтропических культур

автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Выделение продуцента альфа-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы из природных источников и разработка технологии ферментного препарата на его основе

кандидата технических наук: Строева, Светлана Сергеевна
город: Москва
год: 2006
специальность ВАК РФ: 05.18.10
цена: 450 рублей

Диссертация по технологии продовольственных продуктов на тему «Выделение продуцента альфа-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы из природных источников и разработка технологии ферментного препарата на его основе»

Автореферат диссертации по теме "Выделение продуцента альфа-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы из природных источников и разработка технологии ферментного препарата на его основе"

На правах рукописи

СТРОЕВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОДУЦЕНТА АЛЬФА-СПЕЦИФИЧНОЙ ЦИКЛОДЕКСТРИНГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗЫ ИЗ ПРИРОДНЫХ ИСТОЧНИКОВ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ

Специальность 05.18.10 - Технология чая, табака и биологически активных

веществ и субтропических культур

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Иванова Людмила Афанасьевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Кривова Анна Юрьевна кандидат технических наук, доцент Чурмасова Людмила Алексеевна

Ведущая организация: Общество с ограниченной ответственностью «Биофлора».

Защита состоится: « 07 » декабря 2006 г. в 10.00 час. в ауд. Ш-101 на заседании диссертационного совета Д.212.148.04 при ГОУ ВПО «Московский Государственный Университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУГШ. Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, МГУПП, ученому секретарю диссертационного совета Д.212.148.04.

Автореферат разослан »А2006 г.

Ученый секретарь л

диссертационного совета, д.т.н., проф. Крюкова Е. В.

1. Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТ — аза, 1,4-альфа- D — глюкан- 4- альфа (1,4- альфа - глюкано) — трансфераза, К.Ф. 2.4.1.19) — фермент микробного происхождения, при воздействии которого иа крахмал и аналогичные субстраты образуются циклические нередуцирующие декстрины различных размеров. В зависимости от количества альфа - D- глюкопиранозных остатков (6, 7 и 8), циклодекстрины обозначаются соответственно как альфа -, бета -и гамма - циклодекстрины (ЦД).

Синтезируемые ЦГТ - азами ЦД, вследствие уникального строения (гидрофильная поверхность и гидрофобная внутримолекулярная полость), способны образовывать комплексы - включения с различными органическими и неорганическими молекулами, изменяя их физико-химические свойства, за счет чего можно достичь таких эффектов, как увеличение в десятки и сотни раз растворимости в воде неполярных соединений, увеличение стабильности различных веществ к воздействию кислорода, воздуха, света, температуры. Благодаря этому ЦД широко используются в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и других областях.

В промышленных масштабах ЦД можно получать лишь ферментативным путем, так как синтез этих соединений химическими методами очень дорог. В целом процесс получения ЦД сводится к следующим основным этапам: 1) культивирование микроорганизма — продуцента ЦГТ — аз, 2) выделение ферментного препарата из культуральной жидкости, 3) получение ЦД с помощью препарата ЦГТ-аз. В настоящее время выпуском ЦД заняты фирмы в различных странах мира. Стоимость бета - ЦД, промышленного производства, достигает 25 долларов США за килограмм, альфа - и гамма- ЦД имеют себестоимость в десятки раз более высокую.

Биохимические реакции, катализируемые ЦГТ — азами, очень сложны. При гидролизе субстрата (крахмала) с помощью ЦГТ — аз, может образовываться смесь альфа -, бета - и гамма - ЦД, линейных и разветвленных ЦД, моно —, ди — и три — сахаридов. В соответствии с преобладанием определенного вида ЦД в реакционной смеси ЦГТ - азы подразделяют на альфа бета - и гамма - специфичные.

изменениями социального, политического и экономического характера в начале 90-х годов эти исследования были приостановлены. Однако во всех высокоразвитых странах интерес к комплексам включений на основе ЦД только возрастает. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ЦГТ-аз и ЦД актуальна и перспективна.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в поиске активного продуцента альфа-ЦГТ-азы, оптимизации условий его культивирования для биосинтеза фермента и в получении очищенного ферментного препарата альфа-ЦГТ-зы Г10Х.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, и коллекционных культур, с целью отбора штамма, обладающего преимущественно альфа-ЦГТ-азной активностью;

- идентификация штамма-продуцента альфа-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;

- подбор оптимального состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента;

- установление влияния микроэлементов и стимулятора роста микроорганизмов Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы штамма-продуцента;

- разработка технологии получения ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х.

Работа выполнялась в рамках государственного контракта с Федеральным Агентством по науке и инновациям от 28 марта 2005 г № 02.434.11.3007 по теме: ЖС-12.4/004 «Ферментные системы и технологии получения циклодекстринов».

Научная новизна работы. На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом альфа-ЦГТ-азной активности от условий культивирования и выхода фермента, от параметров выделения и очистки, разработана биотехнология ферментного препарата альфа-ЦГТ-зы. Для создания основ биотехнологии альфа-ЦГТ-зы было произведено следующее:

- Проведен экспресс-скрининг микроорганизмов, выделенных из различных

видов почв и коллекций культур. Получен новый штамм-продуцент с высокой альфа-ЦГТ-азной активностью, одним из уникальных свойств которого является устойчивость к высоким концентрациям солей натрия.

- На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый галофильный штамм, продуцирующий альфа-ЦГТ-азу, идентифицирован как Paenibacillus macérons /АМБ.

- В результате изучения физиолого-биохимических особенностей нового продуцента подобраны: оптимальный состав питательной среды и условия культивирования.

— Установлено влияние микроэлементов и стимулятора роста полифенольной природы Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы штамма Paenibacillus macerans JAMS, определены параметры его внесения в процессе культивирования.

— На основании выявленных зависимостей накопления альфа-ЦГТ-азы в культуральной жидкости- Paenibaciltus macerans от условий культивирования и сохранения ее активности при концентрировании и очистке разработана технологическая схема получения ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х.

Практическая значимость и реализация результатов работы.

циклодекстринглюканотрансфераза Г10Х. С учетом выявленных в лабораторных исследованиях зависимостей выхода ЦГТ-азы от условий выделения, концентрирования и сушки, разработан Лабораторный регламент по производству ферментного препарата альфа-циклодекстринглюканотрансферазы Г10Х. Проведена наработка препаратов альфа- ЦГТ-азы различных степеней очистки (ГЗХ, Г10Х) в условиях опытного производства. Полученные результаты подтверждены актом ОАО "Биохиммаш". Изучены термо- и рН стабильность экспериментальных партий

препарата альфа- ЦГТ-азы, показавшие перспективность его использования для получения ЦД.

Подана заявка на выдачу патента РФ на штамм бактерий РаетЬасШия тасегат 1АМБ— продуцент альфа-ЦГТ-зы.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Всероссийской научно-технической выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва 2005); На Третьем международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, подана 1 заявка на патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 205 источников, и 7 приложений. Работа изложена на М? страницах машинописного текста, включает^ГОтаблиц и 2-{рисунков.

2. Обзор литературы

В литературном обзоре рассмотрено общее состояние проблемы создания производств ЦД и ЦГТ-аз в России. Приведены строение, свойства циклодекстринов и циклодекстринглюканотрансфераз и перспективы их практического использования в пищевой, фармацевтической промышленности, биотехнологии, химии, медицине и сельском хозяйстве. Описаны реакции, катализируемые ЦГТ-азами, основные продуценты данных ферментов, принципы выбора продуктивных штаммов для процессов получения ЦГТ-аз и влияние условий культивирования на биосинтез ЦГТ-аз различными микроорганизмами. Рассмотрены способы получения ЦД с помощью ЦГТ-аз.

Анализ данных литературы выявил проблемы, существующие в данной области, и позволил сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

3. Экспериментальная часть 3.1. Материалы и методы исследований Микроорганизмы. В работе была использована лабораторная коллекция продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания сотрудниками кафедры "Биотехнология" Московского Государственного Университета пищевых производств и Института биологии Уфимского научного центра РАН, а также

типовые культуры рода Bacillus и Micrococcus из коллекции кафедры "Биотехнология" Московского Государственного Университета пищевых производств и из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика.

Образцы почвы для скрининга. В качестве природных источников изолятов бактерий в настоящей работе использовали образцы почв Московской, Волгоградской, Воронежской и других областей России, ближнего и дальнего зарубежья. С момента отбора материал хранили при температуре (+2) — (+7)°С в течение 1-3 месяцев.

Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания и из коллекции культур МГУПП. Экспресс-скрининг микроорганизмов -продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, проводили согласно схеме, разработанной сотрудниками Института биологии Уфимского научного центра РАН^с введением некоторых модификаций (Терехова Е. Я., 1999).

Питательные среды. ^

Среды для хранения и поддержания штаммов. Микроорганизмы из коллекции культур МГУПП хранили в пробирках при температуре 4°С на различных агаризованных средах: мясопептонный агар (МПА), питательная среда ГРМ для выращивания бактерий (на основе гидролизата рыбной муки), картофельный агар. Штаммы микроорганизмов, выделенные из почв, хранили на среде «В» следующего состава, г/дм3: глюкоза - 1, пептон - 1, MgSO^ - 0,4, КН2Р04 - 0,4, агар - 2, рН среды после стерилизации - 7,2 — 7,4.

Среды, используемые при проведении скрининга. Среда «А», г/дм3: крахмал -10; пептон — 3; дрожжевой экстракт - 3; кукурузный экстракт — 3; агар — 18; Na2HP04 - 2; КН2РО4 — 2; рН сред после стерилизации — 7,4 - 7,6. Среда «Б», г/дм3: крахмал — 10; пептон — 3; дрожжевой экстракт — 3; кукурузный экстракт — 3; СаСОз — 5; рН сред после стерилизации - 7,4 — 7,6.

Среды, используемые для проведения идентификации бактерий. Для идентификации бактерий использовали питательные среды производства ФГУП ГНЦ ПМ, п. Оболенск.

Морфология клетки. Морфологию, подвижность и размеры клеток исследовали с помощью фазовой оптической микроскопии на микроскопах МИКМЕД 5, БИОЛАМ И.

Фенотнпнческая характеристика. Изучение морфологических и физиолого-биохимических характеристик выделенных культур проводили, руководствуясь общей стратегией фенотипической дифференциации, описанной в руководствах: «Определитель бактерий» (Bergey's manual, 1997), «Методы общей бактериологии (Герхард, 1983).

Определение последовательностей гена 16S рРНК.

Последовательности 16S рРНК генов были получены методом ПЦР. ПЦР проводилась на ДНК-амплификаторе GeneAmp PCR System 2700 фирмы Applied Biosystem в Центре "Биоинженерия" РАН.

Качественное определение альфа-ЦГТ-азной активности штаммов продуцентов, выращенных на тест-средах проводили модифицированным методом Тильдена-Хадсона (Tilden Е.В., Hudson C.S., 1942; Терехова Е. Я., 1999).

Количественный метод определения активности альфа-ЦГТ-азы проводили по методу методу Мякеля-Лааксо (M. J. Makela, S.V. Laakso, 1988).

Измерение активности бета-ЦГТ-азы.

Измерение активности бета-специфичной ЦГТ-азы проводили спектрофотометрически — модифицированным фенолфталеиновым методом (Терехова Е. Я., 1999).

ВЭЖХ - анализ продуктов ферментативной конверсии крахмалов проводили на колонке «SEPARON-NH2» (размер — 4,6x250 мм, скорость подачи элюента 0,8 смэ/мин, элюент — 60% водный ацетонитрил) в Центре "Биоинженерия" РАН.

Декстриннрующую активность ЦГТ-азы определяли модифицированным методом Фува, основанным на измерении падения поглощения при определенной длине волны, связанного с изменением окраски йодного комплекса с крахмалом после окончания ферментативной реакции (Nakamura N., Horikoshi К., 1976).

Статистическую обработку экспериментальных данных, полученных не менее, чем в 3-х повторностях, проводили по программе Excel 2003 Microsoft Office.

Результаты исследований и их обсуждение

3.2.1. Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитание

и из коллекции культур МГУПП

Для получения высокоактивного продуцента альфа-ЦГТ-азы из 150

образцов почвы, отобранных из различных мест обитания (Европейская часть

России, Крым, Израиль, Турция, Египет и др.) выделены 120 изолятов, осуществляющих деструкцию крахмала. Каждый изолят был подвергнут анализу на

специфичность с помощью модифицированного теста Тильдена — Хадсона. Анализ показал, что 10 штаммов оказались бета - ЦГТ-активными, 15 штаммов альфа -ЦГТ-активными и 12 штаммов обладают смешанной альфа+ бета — специфичностью.

С целью выбора активных продуцентов ЦГТ-аз из коллекции кафедры "Биотехнология", было проверено 55 культур из рода Bacillus и рода Micrococcus. Для обнаружения ЦГТ-азной активности культуральную жидкость исследуемых культур подвергали модифицированному тесту Тильдена — Хадсона и по характеру кристаллообразования судили о специфичности исследуемых культур. Анализ показал, что 10 штаммов оказались бета-ЦГТ-активными, 3 штамма альфа-ЦГТ-активными и 2 штамма обладают смешанной альфа-+ бета - специфичностью.

Таким образом, в результате проведенного скрининга для дальнейших исследований отобрано 18 штаммов микроорганизмов, секретирующих преимущественно альфа-ЦГТ-азу. С целью выбора наиболее активного продуцента все альфа — специфичные штаммы выращивали на среде состава "Б" с определением декстринирующей и альфа- и бета-циклизующей активностей по окончании культивирования. Культивирование осуществляли в течение 72 ч при 30 ±1°С в колбах объемом 750 см3 со 100 см3 питательной среды на качалочной установке при п=180 об/мин.

Результаты определения декстринирующей и альфа- и бета-циклизующей активностей ЦГТ-азы в кулыуральных жидкостях испытанных бактериальных культур представлены в таблице 1.

Таблица 1

Дексгринирующая и альфа- и бета-циклизующие активности бактериальных

культур при глубинном выращивании в колбах на качалочной установке

N° культуры декстршшрующая активность, ед/см3 активность альфа-ЦГТ-азы, ед/см3 активность бета-ЦГТ-азы, ед/см3 специфичность

1 2 3 4 5

10200 ИБ* 130,2 49,0 3,5 преимущественно альфа-ЦГГ-аза

10201 ИБ* 96,4 38,4 2,0 преимущественно альфа-ЦГТ-аза

10202 ИБ* 90.2 33,2 1.3 преимущественно альфа-ЦГТ-аза

10203 ИБ* 92,1 38,5 1,1 преимущественно альфа-ЦГТ-аза

10204 ИБ* 71,6 16,6 следы преимущественно альфа-ЦГТ-аза

1 2 3 4 5

10205 ИБ» 89,6 33,0 3,6 преимущественно альфа-ЦГТ-аза

10206 ИБ* 64,6 10,9 следы преимущественно альфа-ЦГТ-аза

1АМБ 129,5 49,0 0,8 преимущественно альфа-ЦГТ-аза

2АМБ 46,1 10,9 11,0 альфа- и бета-ЦГТ-азы

ЗАМБ 78,7 21,6 0.4 преимущественно альфа -ЦГТ-аза

4АВМБ 99,8 38,4 1,6 преимущественно альфа-ЦГТ-аза

5АВМБ 88,4 33,2 9,9 преимущественно альфа-ЦГТ-аза

6АМБ 78,3 21,6 1,7 преимущественно альфа-ЦГТ-аза

7 AM Б 81 a 28,2 5,1 преимущественно альфа-ЦГТ-аза

8АМБ 72,4 16,6 1,0 преимущественно альфа-ЦГТ-аза

B.macerans 3155 68,5 11,7 10,4 альфа- и бега-ЦГТ-азы

B.macerans 3157 78,4 10,5 5,7 альфа- и бета-ЦГТ-аз и

В. stearo-thermophi-1 us 4103 50,3 9,1 1,9 преимущественно альфа-ЦГТ-аза

* штаммы микроорганизмов, предоставленные сотрудниками Института биологии Уфимского научного центра РАН

Наибольшую альфа - ЦГТ-азную активность показали 2 штамма ИБ10200 и

1АМБ. У штамма 1АМБ активность бета - ЦГТ-азы в 4,4 раза ниже, чем у штамма

ИБ10200, что было очень важно для последующего использования этого штамма с

целью выделения ферментного препарата альфа - ЦГТ-азы.

Культуральные жидкости всех 18 штаммов микроорганизмов, отобранных в

процессе скрининга, были дополнительно обследованы методом ВЭЖХ, дающим

информацию о соотношении альфа-, бета- и гамма-циклодекстринов в реакционной

смеси. Все штаммы показали каталитическую активность преимущественно альфа-

ЦГТ-аз. Исключение составили штаммы В. species 2АМБ, B.macerans 3155 и

B.macerans 3157, у которых значения активностей альфа- и бета-ЦГТ-аз были очень

близки. Соотношение продуктов конверсии крахмала ЦГТ-азой штамма В. species

1АМБ составило, в %: альфа-циклодекстрин 74,7; бета-циклодекстрин 10,4; гамма-цикл одекстрин 14,9.

Таким образом, для дальнейших исследований был отобран штамм 1АМБ с максимальной альфа-ЦГТ-азной активностью 49,0 ед/см3 и бета-ЦГТ-азной активностью меньше альфа-ЦГТ-азной в 61,2 раза.

3.2.2. Исследование фенотипических признаков и идентификация штамма продуцента Bacillus species 1АМБ Морфологические особенности клеток: Клетки палочковидные, размером 0,2-0,3*3-5 мкм через 24 ч инкубации при 38°С, подвижные, грамвариабельные. Образуют эндоспоры. Спорообразование терминальное и субтерминальное, споры расширяют материнскую клетку булавовидно.

Культуральные признаки:

Штамм при росте на крахмалсодержащей питательной среде через 24 часа при 37 °С образует единичные колонии круглые с фестончатым краем. Диаметр колоний - 1-4 мм. Поверхность гладкая, слегка бугристая к краям, полупрозрачная, блестящая. Цвет колоний молочно-серый, молочно-желтый, иногда с легким розоватым оттенком. Профиль колоний изогнутый. Структура колоний однородная, мучнистая. Край колоний волнистый.

Физиолого-биохимические признаки продуцента.

В табл. 2 представлены основные физиолого-биохимические признаки штамма Bacillus species 1АМБ.

Таблица 2

Физиолого-биохимические признаки штамма Bacillus species 1АМБ

Признак Значение Признак Значение

1 3 4

Потребление: Глюкозы Маннита Сахарозы Мальтозы Лактозы Да Да Да Слабо Рост на молоке: Подкисление среды Протеолиз казеина Образование углекислоты Слабо Да Нет

Образование газа из глюкозы Нет Рост на безазотистой среде Эшби Нет

1 2 3 4

Реакция Фогес-Проскауэра Отрицательная Рост на синтетической среде Да

Гидролиз крахмала Да Оптимальная температура • роста, С 37-45

Разжижение желатины Слабо Отношение к кислороду Аэроб

Образование аммиака Нет Катал азная активность Да

Образование индола Нет Рост на ЫаС1 7% Да

Образование сероводорода Нет Диапазон рН 3,0-9,0

Восстановление нитратов Нет Способность образовывать ЦД Продуцент альфа-ЦГТ-азы

В процессе изучения физиолого-биохимических характеристик микроорганизма, была выявлена уникальная особенность - штамм является галофильным, так как растет на средах, содержащих 15% NaCl, тогда как рост большинства известных бактерий останавливается при концентрации 7% и ниже. Это свойство значительно облегчает поддержание чистоты культуры. Данные по определению устойчивости продуцента к высоким концентрациям солей приведены в таблице 3. По полученным данным о культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаках исследуемой культуры был сделан вывод, что она относится к бактериям рода Paenibacillus, предположительно виду macerans.

Таблица 3

Отношение выделенного штамма Bacillus species 1АМБ к концентрации

хлористого натрия.

Концентрация NaCl, % Наличие роста и его интенсивность (24 ч)

5 Хороший рост, густой штрих, по краям наличие отдельных колоний.

10 Хороший четкий рост, наличие отдельных колоний к концу штриха.

15 Слабый рост, большое количество отдельных колоний.

20 Нет роста.

Исследования филогинетических характеристик культуры проводились совместно с сотрудниками Центра "Биоинженерия" РАН. По данным сиквенса 16S ribosomal RNA и проведённого поиска гомологичных последовательностей при

помощи ВЬАЗТа (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) было построено филогенетическое дерево (рис.1), из которого заключили, что целевой штамм с точностью 98% относится к роду РаетЪасШш вида тасегат.

Таким образом, на основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый галофильный штамм, продуцирующий альфа-ЦГТ-азу, был идентифицирован как РаетЬасШия тасегат 1АМБ.

■ Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное по 16S ribosomal RNA.

3.2.3. Выбор предпочтительного варианта питательной среды для получения альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ с помощью метода многокритериального выбора

Анализ литературных данных показал, что для получения ЦГТ-азы с помощью микроорганизмов рода Bacillus разработан ряд вариантов питательных сред, основанных, как правило, на растворимом крахмале или крахмалосодержащем сырье (пшеничные отруби, картофельный экстракт и т.д.).

Были выбраны 8 вариантов питательных сред, которые подвергались сравнительной оценке по нескольким выявленным экспертами критериям эффективности и качества. Информация о предпочтительности того или иного варианта питательной среды по каждому критерию была обработана с помощью специальной методики определения результирующего ранжирования экспертов (Димитриади, 2000). Особое внимание при выборе было обращено, прежде всего на продуктивность питательной среды, ее технологичность, дефицитность составных компонентов. Наиболее предпочтительным вариантом оказалась среда, основанная на растворимом крахмале, следующего состава (%): крахмал -1,0; пептон — 0,3; дрожжевой экстракт — 0,3; кукурузный экстракт — 0,3; CaCOj — 0,5 (среда "Б") (Терехова Е.Я., 1999). Эту питательную среду и использовали для дальнейших исследований по культивированию выбранного штамма Paenibacillus macerans 1АМБ— продуцента ЦГТ-азы.

3.2.4. Изучение динамики биосинтеза альфа-ЦГТ-азы в процессе культивирования Paenibacillus macerans 1АМБ на среде с растворимым

крахмалом

На выбранной описанным выше методом среде "Б" проводилось культивирование Paenibacillus macerans 1АМБ в аэробных условиях. Процесс культивирования вели в течение 7 суток при температуре 30°С на качалочной установке с числом оборотов п = 180 об/мин в качапочных колбах 750 см3 при объеме питательной среды 50 и 100 см3. Отбор проб для анализа активности ЦГТ-азы проводили через каждые 24 часа. Динамика биосинтеза альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ представлена на рис.2.

Можно видеть, что максимум ферментативной активности приходится на третьи сутки роста культуры и составляет при объеме среды 100 см3 — 49,3 ед/см3, а при объеме 50 см3 — 56,6 ед/см3. Очевидно, что активность в колбах с объемом среды 50 см3 на 14,8 % выше, чем в колбах с 100 см3 питательной среды. Это происходит

из-за положительного влияния аэрации на продуцирование альфа-ЦГТ-азы.

Активность апьфа-ЦГТ-

Дднтелыгость культивирования, сут

• Усреды = 50 смЗ И Усреды - 100 смЗ

Рис. 2. Динамика биосинтеза альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ 3.2.5. Оптимизация состава питательной среды с растворимым

крахмалом

С целью выявления оптимальной концентрации растворимого крахмала и возможности его замены на более дешевый нерастворимый было исследовано 9 вариантов питательной среды на основе варьирования концентраций азота, фосфора и микроэлементов, входящих в состав среды "Б". В качестве источников углерода в питательные среды вносили растворимый крахмал в концентрации от 1,5 до 5,0 % или нерастворимый картофельный крахмал концентрациях от 1,0 до 3,0 %. В качестве контроля использовали питательную среду с содержанием растворимого крахмала 1,0%. Выращивание штамма — продуцента альфа-ЦГТ-азы проводили в колбах со 100 см3 питательных сред на качалочной установке при 180 об/мин в течение 72 часов и температуре 30°С. Результаты проведенных исследований показали, что с увеличением в питательной среде концентрации растворимого крахмала от 1 до 2% активность альфа-ЦГТ-азы продуцента увеличивается на 9,2 %, с дальнейшим увеличением концентрации крахмала активность ЦГТ-азы снижается на 9,2% при 3,5%, на 14,3% при 5% крахмала в среде, что, вероятно, связано с более интенсивным синтезом биомассы и снижением биосинтеза фермента. При замене растворимого крахмала нерастворимым активность ЦГТ-азы, аналогичная контролю, достигалась при культивировании продуцента на среде с 3% крахмала. Таким образом, результаты показали, что замена растворимого крахмала нерастворимым нецелесообразна, так как его расход будет в 3 раза больше при получении того же конечного результата по активности, как и в контроле.

Увеличение концентрации растворимого крахмала до 2% экономически нецелесообразно.

С целью выявления возможности замены растворимого крахмала на более дешевое сырье, проводилось исследование влияния различных декстринов, которые могут быть индукторами процесса образования циклодестринов, на биосинтез альфа-ЦГТ-азы культурой Paenibacillus macerans 1АМБ. Декстрины (картофельный белый, кукурузный белый, картофельный палевый, кукурузный палевый, картофельный желтый) Муромского ЗАО «Декстрин-Завод» вносили в среду состава "Б", вместо растворимого крахмала в концентрациях 1,2,3%. Выращивание штамма-продуцента проводили в условиях, аналогичных его выращиванию на крахмалосодержащих средах. Наибольшая активность альфа-ЦГТ-азы - 51,9 ед/см3 -достигалась при культивировании штамма-продуцента на питательной среде с 3% декстрина картофельного желтого или декстрина кукурузного белого, аналогичная активность альфа-ЦГТ-азы может быть получена при культивировании этого же продуцента с 1,5% растворимого крахмала. Таким образом, проведенные исследования показали возможность частичной замены дорогостоящего растворимого крахмала на декстрины рыночная стоимость которых на 40-50% ниже.

3.2.6. Исследование влияния физических методов обработки крахмала на биосинтез ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ

По данным литературы известно, что вместо крахмала источником углерода в среде могут служить различные продукты его деструкции. Установлено также, что биосинтез некоторых ферментов протекает быстрее, если крахмал частично гидролизовать, не допуская при этом накопления в среде низкомолекулярных Сахаров: мальтозы и глюкозы. Обработку суспензий нерастворимого крахмала, взятого в концентрациях 1;1,5;2;2,5;3 и 4%, проводили различными физическими методами, способными вызывать его частичную деструкцию: рентгеновскими лучами мощностью 0,5 mRAD и 5 mRAD, микроволновым излучением мощностью 170 - 850 Вт и ультразвуком на УЗ-дезинтеграторе с частотой колебаний 22кГц и акустической мощностью 13 кВт, а также также на УЗ-дезинтеграторе с частотой ультразвуковых колебаний 100 кГц и акустической мощностью 9 Вт в течение различных временных интервалов. После обработки суспензий они использовались в качестве основы для приготовления питательных сред. В каждый вариант суспензии вносили источники азота, фосфора и микроэлементов, входящие в состав среды "Б". По результатам эксперимента был сделан вывод, что ни один из этих

методов обработки нерастворимого крахмала не является целесообразным, так как активность альфа-ЦГТ-азы в этой серии опытов, по сравнению с контролем (с 1% растворимым крахмалом), увеличивалась в среднем на 10%, а энергетические затраты возррастали в несколько раз.

3.2.7. Влияния источников фосфора на биосинтез ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ В процессе работы изучали влияние на биосинтез альфа-ЦГТ-а?ы бактериями Paenibacillus macerans 1АМБ таких источников фосфора, как К2НРО4, добавляемого в количестве 0,06; 0,10 и 0,14%, и КН2Р04, вносимого в количестве 0,04; 0,10 и 0,20% в питательную среду состава "Б". Аммонийные соли фосфорной кислоты добавляли в концентрациях 0,05; 0,10 и 0,20%. Культивирование бактерий Paenibacillus macerans 1АМБ проводили при условиях, аналогичных описанным в предыдущих разделах. Результаты показали, что в выбранную ферментационную питательную среду для культивирования Paenibacillus macerans 1АМБ целесообразно вводить только (NH4)2HPO,4 в концентрации 0,1-0,2%.

3.2.8. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ методом аддитивно-решетчатого математического описания объекта Оптимизацию состава питательной среды для глубинного культивирования Paenibacillus macerans 1АМБ проводили с использованием метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта. Факторами, влияющими на эффективность биосинтеза ЦГТ-аз культурой Paenibacillus macerans 1АМБ, являются концентрации в, питательной среде крахмала, пептона, (NRO^HPO^ дрожжевого и кукурузного экстрактов и декстринов, являющихся индукторами.

Оптимизация процесса заключалась в выборе уровней каждого фактора, обеспечивших наибольший эффект. Такими уровнями оказались концентрации компонентов в среде: 1,0 % для растворимого крахмала, 0,3 % для пептона, 0,1% для кукурузного экстракта, 0,5 % для дрожжевого экстракта, ОД % для (NH^HPO* и 0,5 % для декстринов. Это сочетание уровней факторов дает результат, превышающий среднюю активность альфа-ЦГТ-азы в этой серии опытов на 22,8 % (средняя активность — 47,65 ед/см3, максимальная — 58,5 ед/см3). Таким образом, оптимальным для Paenibacillus macerans 1АМБ является следующий состав питательной среды (%): растворимый крахмал - 1,0; декстрины - 0,5; пептон - 0,3; дрожжевой экстракт —0,5; кукурузный экстракт - 0,1; (МН^ШЧ^* - 0,2; СаСОэ —

0,5(среда "Г").

3.2.9. Изучение влияния рН исходной ферментационной среды на биосинтез альфа-ЦГТ-азы бактериями РаепШасШив тасегапэ 1АМБ

Результаты исследований по изучению влияния рН ферментационной среды на биосинтез альфа-ЦГТ-азы бактериями РаешЬасШиэ тасегапэ 1АМБ представлены на рис. 3. где видно, что в диапазоне рН 6,0-7,0 достигается максимальная активность активность фермента. Таким образом, при культивировании РаешЬасШиэ тасегам 1АМБ рН среды после стерилизации должен находиться в диапазоне 6,0-

Рис.З Влияние рН исходной питательной среды на биосинтез альфа-ЦГТазы бактериями РаетЬасШиз тасегаш 1АМБ

3.2.10. Разработка способов получения посевного материала РаыиЬасШиз шасегапз 1АМБ

В ходе экспериментаов по определению требуемого возраста посевного материала РаешЬасШиз тасегапэ 1АМБ выращивали на среде оптимизированного состава в течение 8; 12; 18; 24; 36 часов в колбах на качалочной установке при 30°С, после чего определяли титр посевного материала и активность альфа-ЦГТ-азы в нем. Готовым посевным материалом засевали колбы с ферментационной средой (объем посевной дозы 5%). Наибольшую активность ЦГТ-азы в культуральной жидкости -58,4 ед/см3 и наибольший титр - 10« 10® кл/см3 обеспечивает использование посевного материала РаетЬасШив тасегат 1 АМБ в возрасте 30 часов.

Для определения оптимальной дозы посевного материала культуру РаешЬасШиэ тасегапэ 1 АМБ выращивали 30 часов на той же среде, что и в предыдущем исследовании, затем проводили засев ферментационной среды готовым 30-часовым посевным материалом с титром 1,0«108 кл/см3 в количестве 1; 2; 3; 5; 7; 10% по объему. Максимальная активность альфа-ЦГТ-азы в культуральной жидкости соответствует посевной дозе 5%.

7,0.

активность, %

Г"

5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5

рН

3.2.11. Изучение влияния микроэлементов и стимуляторов на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы Paen¡bacillus maceraos 1АМБ 3.2.11.1. Влияние микроэлементов на биосинтез альфа-ЦГТ-аз

Для изучения влияния микроэлементов на биосинтез альфа-ЦГТ-аз Paenibacillus macerans 1АМБ в питательную среду добавляли следующие соли : FeS04x 7Н20; o(N03)2x6H20; CuS04x5H20; МпС12х4Н20; ZnS04x7H20, в таких количествах, чтобы массовые доли металлов составляли 0,01 и 0,001% от общего объема питательной среды. Результаты показали, что наиболее высокий выход активности альфа-ЦГТ-азы (60,4 ед/мл) может быть достигнут при добавлении в питательную среду соли МпС12х4Н20 с массовой долей Мп2+ 0,001 % от объема. 3.2.11.2. Влияние стимулятора роста Гнпоксена на биосинтез альфа-ЦГТ-аз Paenibacillus macerans 1АМБ Для интенсификации биосинтеза альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ использовали препарат Гипоксен - стимулятор роста микроорганизмов полифенольной природы, который вводили в питательные среды через 24 часа роста культуры в концентрациях 3,5,7 и 10 мг/дм3.

Наиболее высокая активность альфа-ЦГТ-азы 64,2 ед/дм3 была достигнута при использовании питательной среды с добавлением Гипоксена в количестве 7 мг/дм3. При этом наблюдлось также максимальное накопление белка в к.ж., что свидетельствует о положительном влиянии Гипоксена на жизнедеятельность Paenibacillus macerans 1АМБ.

3.2.12. Изучение динамики биосинтеза фермента альфа-ЦГТ-азы бактериями Paenibacillus macerans 1АМБ на оптимизированной по составу

питательной среде Питательную среду состава "Г" засевали суспензией клеток бактерий Paenibacillus macerans 1АМБ, объем посевной дозы 5%. Культуру выращивали в течение 1-4 суток на качалочной установке при температуре 30±1*С и измеряли рН культуральной жидкости, вне- и внутриклеточную активность ЦГТ-азы через каждые 12 часов. Результаты исследований представлены на рис. 4.

Из полученных данных следует, что альфа-ЦГТ-аза начинает синтезироваться бактериями Paenibacillus macerans 1АМБ лишь после 24 часов и накапливается к 48 часам культивирования.

При этом основная доля активности (89%) находится внутри клетки и только незначительная часть - 11% — выделяется в культуральную жидкость. Максимум

активности приходится на третьи сутки и составляет 127 % от активности, наблюдаемой на вторые сутки. При этом большую часть активности составляет внеклеточная активность — 90%, внутриклеточная же активность достаточна низка -всего 10%. Полученные результаты показывают, что культивирование РаетЬасШиэ тасегапв 1АМБ на оптимизированной питательной среде целесообразно вести трое суток.

Активность, ед.

7000

6000

внутриклеточная активность внеклеточная активность

84 96

время, ч ■ общая активность

Рис. 4 Динамика биосинтеза альфа-ЦГТ-азы бактериями РаешЬасШиэ тасегапз 1АМБ и ее локализация.

3.2.13. Осаждение ферментов из культуральной жидкости РаешЬасШдо тасегапэ 1АМБ

Выращивание РаетЬасШив тасегапв 1АМБ проводили в колбах со 100 см3 питательных сред состава "Г" на качалочной установке при 180 об/мин в течение 72 часов и температуре 37 °С. По окончании культивирования культуральную жидкость центрифугировали в течение 5 минут при 12000 об/мин.

В качестве осадителей использовали этанол, изопропанол и ацетон в соотношениях осадитель: культуральная жидкость (КЖ) 2:1; 3:1; 3,5:1; 4:1. Осаждение ферментов из культуральной жидкости РаетЬасШив тасегапв 1АМБ проводили при рН 6,0 и температуре 5°С.

Наиболее эффективным осадителем альфа-ЦГТ-азы из культуральной жидкости РаетЬасШив тасегапэ 1АМБ явился 75% этанол в соотношении 4:1, при этом выход препарата с максимальной активностью альфа-ЦГТ-азы 2850 ед/г составил 9,7 г/дм3.

Для определения оптимального значения рН , осаждение альфа-ЦГТ-азы 75% этанолом из культральной жидости в соотношении 4:1 проводили в диапазоне изменения рН от 4,5 до 8,0. Результаты представлены на рис. 5.

Максимальный выход препарата 9,8 г/дм3 был получен при значении рН 6,0. Альфа-ЦГТ-азная активность составила 2900 ед/г препарата. Таким образом, эффективным способом получения концентрированного ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы РаетЬасШиэ тасегапБ 1АМБ является его цсаждение из культуральной жидкости 75% этанолом в соотношении 4:1 при рН 6,0.

4455667766

| * активность, ед/емз—■—выход препарата.г/дмз |

Рис.5. Влияние рН культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ на активность ЦГТ-азы и осаждение белка 75% этанолом.

3.2.14. Наработка опытных партий препарата альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ различной степени очистки

На основании лабораторных исследований и полученных из них выводов был разработан лабораторный регламент по производству ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х и Технические условия на ферментный препарат альфа-ЦГТ-аза Г10Х. Согласно этим нормативно-техническим документам наработку опытных партий препаратов альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ осуществляли на стендовой установке ОАО "Биохиммаш", согласно технологии, разработанной на основе установленных в результате экспериментальных исследований оптимальных условий культивирования и биосинтеза альфа-ЦГТ-аз Paenibacillus macerans 1АМБ. Технологическая блок-схема получения ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х приведена на рис. 6. Культивирование продуцента альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ проводилось в лабораторном ферментере общим объемом 20 дм3 (рабочий объем - 16 дм3 ) на питательной среде следующего состава (%): растворимый крахмал — 1,0; белый кукурузный декстрин - 0,5; пептон —

0,3; дрожжевой экстракт - 0,5; МпС12 - 0,003; (NH^HPCU - 0,2; СаСОз - 0,5. Температура культивирования -37°С, рН питательной среды - 7-7,2; количество посевного материала - 5%, возраст-30 часов; степень аэрации 1 объем воздуха на 1 объем среды в минуту; перемешивание 270 об/мин; длительность культивирования 64 часа. Процесс выращивания Paenibacillus macerans 1АМБ в ферментере представлен на рис.7. рН ; РВ,%;

Сухая био-масса,

активность а-ЦГТ-азы, ед/смЗ -г 60

1рН

Е"Ш1 биомасса

■активность а-ЦГТ-азы

-PB %

Рис. ^ Динамика роста культуры Bacillus species 1АМБ, синтеза альфа-ЦГТ-азы и изменения pH в процессе культвированих в лабораторном ферментере V=20 дмЗ

Анализируя полученные данные, можно отметить, что динамика роста

культуры Paenibacillus macerans 1АМБ в процессе культивирования в ферментере

отличалась от результатов проведенных лабораторных опытов по выращиванию

продуцента в колбах на качалочных установках. Накопление биомассы происходило

значительно быстрее (к концу вторых суток биомасса достигла максимального

значения - 4,9 г/дм3, а активность - 45,0 ед/см3). Активность альфа-ЦГТ-азы

достигала максимума - 55,5 ед/см3 к 56-му часу культивирования. Полученная

культуральная жидкость на 64-й час культивирования имела среднюю активность

53,1 ед/см3. Таким образом, при создании на стендовой установке условий более

интенсивной аэрации и перемешивания, удалось сократить длительность

культивирования с 72 до 56 часов, однако средняя активность культуралыюй

жидкости снизилась на 8 %, по сравнению с максимально возможной. Полученную

культуральную жидкость подвергали центрифугированию в течение 20 минут при

15000 об/мин на центрифуге " Beckman Model J2-21 ", с целью отделения биомассы

микробных клеток. Выделение ферментных препаратов альфа-ЦГТ-аз, их

концетрирование и сушку проводили следующим образом:

¡р и фаепвфоте

№ и 1»

Пенвякшл

Приен охранение нащимоО

8? Приенвхрокс** ^КтВРШ.6 ^ 1 тнреж^ащ ~ -----

Tfl7.8MS.19 УЮ2й

Пыогкипш ср яп 8Р2 Ви&сВРЗ Водотхн

атИРГ № .

Приготовление щльсштсж. '

ПРО

йяерипшцм

^Кт. тт

? жжитт т Очиат г/ттА

Кот ПС сВР1

Яд Дай

ВрЦНату

ЛямосфВозВ

Пар

Пар , /Угв* ОелутЖс ^

ВР |Дьодаа мдаДмс! ' бгиюбнфа&ярв'

Ошслхо сшбск

ВР (МгоаоЬп _ /Гдц щ?

т 91 Лривт&тк пай •рейи дм фермет\

т 92 Сщямаащ чтя сред*

т 93 зка и шт ерей/ |

Ш/

шКтШи

*ХтСБ8

-Ж^г т и

ш . щеяни

ШМ т№

Пригт р~ра кис/ют

аавЯР1

Моим вс/крил обарудЖм

Пор

{¡юйермт

Г-

РоВгойюбкО росяА\ ^ ^^ йюрегцыррН у—К по* №01

кягрцже

_ KmW8.9mW.i7 Конденсся 3 хвож&н/е

Комгнш атЗРГ Ш Вода 71

гриш яишеы _ сведи

ДУ \Ш Ьхааяизйшасаедк У2 \юЛа

ИаоЬ <утт 1ъ-вбттн греЛ _ сесяВРб ~ {геаЗгодзи^ЧРв"

7 чсяер. 6 лабор.

Пеногосоаел со се ВР2

8сздцхсВРЗ

Воде оВоропкя

Канет

Цаюиоблеме

А? яди {рес^

ЛцШ

т И

ПосЛкЮщШ сЮ ш

Окртвоил п/т оаЬ

Засее

я«им*

Вчяилвсеблта

8 9 /ю&Лс втер

.Млея ТИН -Кт №01

<а ОкаяяВыаЛее ¡оАра

? \ виш&пх [ /ЛрвяшНА

Цдичюфуаця&тие

Лр

КтСВИ

&ЖГСОМ

пт

Ктемраробом фильтрат но ВВУ

шориробам! отйел/еатосаЗги

Конская 6 кяшьнув

КтзЛ01

Осаждвнх ферян-

13 тюб м кощащкт

Сепар2 опделферм ■ ходы й-о! снеся ?

мрмифисаиа/

Обро&та фермвя осаВко спирта*

т (кцврАтл) ■

» апкиферк опАв

(ЫгоявЬсо сушильная агвт

Сушка

КтПВТ

. КтО£В

Яробяечя Возобого

-Пыльно (£8

19 \ баллов* и мпш

т.ЛшыаОБВ

габкцнзркф июрузко

~Г<пвЬшфхкро8мосмод

Рис.6. Блок-схема биотехнологического процесса получения ферментного препарата альфа-ЦГТ-зы ПОХ

1) Получение препарата альфа-ЦГТ-аза ГЗХ: Фугат культуральной жидкости (14дм3) подвергали концентрированию в 2,4 раза на вакуум-выпарной установке УВВ-50. Концентрат в объеме 5,9 дм3 сушили без добавления наполнителей в распылительной сушилке СРЦ-1,2/09ВК (PCJI-10). Выход воздушно-сухого препарата альфа-ЦГТ-аза ГЗХ составил 12,68 г/ дм3 (общий выход препарата - 202,3

г).

Активность альфа-ЦГТ-азы в готовом препарате составила 2 430 ед/г, удельная активность 6,47 ед/мг белка. Оптимум действия препарата: pH — 6,2; t - 40°С.

2) Получение препарата альфа-ЦГТ-аза Г10Х: фугат культуральной жидкости (14дм3) подвергали концентрированию в 2,4 раза на вакуум-выпарной установке УВВ-50. Концентрат в объеме 5,9 дм3 охлаждали до 2°С. Осаждение ферментов вели периодически в емкости объемом 10 дм3 охлажденным этанолом при соотношении этанол : концентрат 4:1. Сформировавшийся осадок отделяли на центрифуге Т24Д, перерастворяли в небольшом количестве воды и сушили без добавления наполнителей в сушилке лиофильной "Advantage". Выход воздушно-сухого препарата альфа-ЦГТ-аза Г10Х составил 10,85 г/ дм3 (общий выход препарата - 173,5 г). Активность альфа-ЦГТ-азы в готовом препарате составила 2 937,3 ед/г, удельная активность 15,53 ед/мг белка. Оптимум действия препарата: pH - 6,2; t-40° С.

Выводы

1. Проведенный скрининг микроорганизмов, выделенных из различных видов почв и взятых из коллекций культур, позволил отобрать 14 штаммов бациллярных культур с преимущественным синтезом альфа-ЦГТ-аз. Для дальнейших исследований выбран штамм Bacillus species 1АМБ с максимальной альфа-ЦГТ-азной активностью 49,0 ед/см3.

2. Проведен сиквенс 16S ribosomal RNA и построено филогенетическое дерево, с точностью 98% подтверждающее, что выбранный штамм относится к роду Paenibacillus вида macerans.

3. На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый галофильный штамм, продуцирующий альфа-ЦГТ-азу, идентифицирован как Paenibacillus macerans JAMB.

4. Методом многокритериального выбора обоснован предпочтительный вариант питательной среды для культивирования в лабораторных условиях штамма

РаешЬасШиэ тасегапз 1 АМБ, продуцента альфа-ЦГТ-азы.

5. На основе выявленных зависимостей биосинтеза альфа-ЦГТ-азы штаммом РаешЬасШиз тасегапв 1АМБ от источников углерода, азота и фосфора проведена оптимизация состава питательной среды методом аддитивно-решетчатого математического описания объекта, позволившая увеличить активность альфа-ЦГТ-азы на 22,8%.

6. Изучено влияние рН исходной ферментационной среды на биосинтез альфа-ЦГТ-азы бактериями РаешЬасШиз шасегапэ 1АМБ. Показано, что рН среды должен нходится в диапазоне 6,0-7,0.

7. Разработан способ получения посевного материала РаетЬасШиэ тасегаш 1 АМБ, изучено влияние его возраста и дозы на активность альфа-ЦГТ-азы.

8. Исследована динамика биосинтеза альфа-ЦГТ-азы РаешЬасШиз тасегавд

1 АМБ, на основании которой выявлено, что этот фермент синтезируется после накопления биомассы бактериями, а максимум его активности в культуральной жидкости приходится на третьи сутки роста и составляет 90%, внутриклеточная активность - 10%.

9. Установлено влияние ряда микроэлементов и стимулятора Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы РаешЬасШиз тасегапв 1АМБ.

10.Подобраны оптимальные условия осаждения альфа-ЦГТ-азы этанолом: соотношение объемов 75% этиловый спирт: культуральная жидкость — 4:1; рН культуральной жидкости 6,0, температура 3°С. При этих условиях был получен ферментный осадок со средней активностью альфа-ЦГТ-азы 2900 ед/г, удельной активностью 14,9 ед/мг белка.

11. На основе разработанного лабораторного регламента проведена наработка препаратов альфа- ЦГТ-азы различных степеней очистки: ГЗХ с активностью

2 430 ед/г (удельная активность 6,47 ед/мг белка, оптимум действия препарата: рН - 6,2; I - 40° С) и Г10Х с активностью 2 937,3 ед/г (удельная активность 15,53 ед/мг белка, оптимум действия препарата: рН — 6,2; I - 40° С) в условиях опытного производства, и полученные результаты подтверждены актом ОАО "Биохиммаш".

12.Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии альфа-ЦГТ-азы Г10Х, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне мировых рыночных цен и составляет 524,2 тыс.рублей за 1т.

Список публикаций

1. Иванова Л.А., Комбарова С.П., Кузнецова О.В., Строева С.С. "Влияние различных источников углерода на биосинтез альфа-циклодекстринглюканотрансферазы бактериями Bacillus sp. 1АМБ". И Хранение и переработка сельхозсырья, №8 2006 с. 48-50

2. Иванова Л.А., Строева С.С., Комбарова С.П., Баранова A.B. "Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания и из коллекции культур МГУПП" В сб.: III юбилейной международной выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» ч.2, М.: МГУПП, 2005 г.; с. 14-17.

3. Иванова Л.А., Комбарова С.П., Кузнецова О.В., Строева С.С. "Разработка условий культивирования нового штамма Bacillus sp. 1АМБ-продуцента альфа-циклодекстринглюканотрансферазы". Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК. Сб. научных трудов: ВНИИПБТ М. 2006 г. с 56-63.

4. Кузнецова О.В., Строева С.С., Иванова Л.А., Комбарова С.П. "Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза циклодекстринглюканотрансферазы Bacillus species 1АМБ". Труды V ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», М. 2005 г. с. 317-323.

5. Иванова Л.А., Комбарова С.П., Кузнецова О.В., Строева С.С. "Циклодекстрины и их применение в пищевой промышленности". Сб.докладов IV Международной научно-практической конференции «Технологии и продукты здорового питания», ч. 2, М. 2006 г., с. 53-57.

6. Заявка на патент: «Штамм бактерий Paenibacillus macerans продуцент циклодекстринглюканотрансферазы».

7. С.С. Строева, О.В. Кузнецова, Л.А.Иванова, С.П. Комбарова "Исследование фенотипических признаков и идентификация штамма продуцента альфа-ЦГТ-аз" В сб.: IV международной выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» ч.2, М.: МГУПП, 2006 г.; 4с.

8. О.В. Кузнецова, С.С. Строева, Л.А.Иванова, С.П. Комбарова "Подбор оптимальных условий осаждения ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы, полученной при культивировании штамма-продуцента Paenibacillus macerans 1АМБ" В сб.: IV международной выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» ч.2, М.: МГУПП, 2006 г.; 4с.

Подписано в печать 02.11.06. Формат 30x42 1/8. Бумага типографская №1. Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Тираж 150 экз. Заказ 299.

125080, Москва, Волоколамское ш., 11 Издательский комплекс МГУПП

Оглавление автор диссертации — кандидата технических наук Строева, Светлана Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Циклодекстрины: строение и свойства.

1.1.1. Строение циклодекстринов.

1.1.2. Свойства циклодекстринов.

1.2. Циклодекстринглюканотрансферазы.

1.2.1. Строение ЦГТ-азы.

1.2.2. Реакции, катализируемые циклодекстринглюканотрансферазой.

1.3. Циклодекстриногенные бактерии - продуценты циклодекстринглюкано-трансфераз.

1.3.1. Paenibacillus macerans.

1.3.2. Bacillus circulans.

1.3.3. Алкалофильные бациллы.

1.3.4. Продуценты циклодекстринглюканотрансферазы, развивающиеся при нормальных значениях рН.

1.3.5. Термотолерантные циклодекстриногены.

1.3.6. Продуценты циклодекстринглюканотрансфераз, не относящиеся к порядку Bacilales.

1.4. Выбор продуктивного штамма для процессов получения ЦГТ-азы.

1.5. Условия культивирования микроорганизмов - продуцентов циклодекстринглюканотрансфераз.

1.6. Идентификация микроорганизмов.

1.7. Получение циклодекстринов.

1.8. Перспективы практического использования циклодекстринов.

1.8.1. Пищевая промышленность.

1.8.2. Биотехнология и химия.

1.8.3. Косметическая промышленность.

1.8.4. Сельское хозяйство.

1.8.5. Медицина.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1.1. Микроорганизмы.

2.1.2. Образцы почвы для скрининга.

2.1.3. Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания и из коллекции культур МГУПП.

2.1.4. Питательные среды.

2.1.5. Методы исследования бактерий.

2.1.6. Подбор оптимальной для хранения культуры питательной среды.

2.1.7. Выращивание культур микроорганизмов в условиях глубинной ферментации.

2.1.8. Метод аддитивно-решетчатого математического описания объекта.

2.1.9. Определение содержания сухих веществ.

2.1.10. Определение величины рН растворов.

2.1.11. Определение восстанавливающих Сахаров.

2.1.12. Определение белка.

2.1.13. Способы выделения циклодекстринглюканотрансферазы из культуральной жидкости Bacillus sp. 1АМБ.

2.1.14. Получение лиофилизированных ферментных препаратов.

2.1.15. Определение содержания влаги в препарате.

2.1.16. Методы определения ферментативных активностей.

2.1.16.1 Определение альфа-ЦГТ-азной активности штаммов продуцентов, выращенных на тест-средах.

2.1.16.2.Количественный метод определения активности альфа-ЦГТ

2.1.16.3. Измерение активности бета-ЦГТ-азы фенолфталеиновым методом.

2.1.16.4. Метод определения внутриклеточной активности альфа-ЦГТ-азы.

2.1.16.5. Метод определения декстриназной (крахмалоразжижающей) активности ЦГТ-аз.

2.1.17. Определение циклодекстринов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2.1.18. Метод определения термостабильности альфа-ЦГТ-азы

Bacillus species 1АМБ.

2.1.19. Метод определения рН-стабильности альфа-ЦГТ-азы

Bacillus species 1АМБ.

2.1.20. Стимулятор роста микроорганизмов полифенольной природы

Гипоксен.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.2.1. Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания и из коллекции культур МГУПП.

2.2.2. Исследование фенотипических признаков и идентификация штамма продуцента Bacillus species 1АМБ.

2.2.2.1. Морфологические особенности клеток Bacillus species 1АМБ.

2.2.2.2. Культуральные признаки штамма Bacillus species 1АМБ.

2.2.2.3. Физиолого-биохимические признаки продуцента.

2.2.2.4. Устойчивость продуцента Bacillus species 1АМБ к факторам внешней среды.

2.2.2.5. Филогенетические особенности культуры.

2.2.2.6. Подбор оптимальной для хранения культуры Paenibacillus macerans 1АМБ питательной среды.

2.2.3. Выбор предпочтительного варианта питательной среды для получения альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ с помощью метода многокритериального выбора.

2.2.4. Изучение динамики биосинтеза альфа-ЦГТ-азы в процессе культивирования Paenibacillus macerans 1АМБ на среде с растворимым крахмалом.

2.2.5. Оптимизация состава питательной среды с растворимым крахмалом.

2.2.6. Исследование влияния физических методов обработки крахмала на биосинтез ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.6.1. Исследование влияния обработки крахмала ультразвуком на биосинтез ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.6.2. Исследование влияния обработки крахмала микроволновым излучением на биосинтез ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.6.3. Исследование влияния обработки крахмала рентгеновскими лучами на биосинтез ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.7.Влияние источников фосфора на биосинтез ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.8. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ методом аддитивно-решетчатого математического описания объекта.

2.2.9. Изучение влияния рН исходной ферментационной среды на биосинтез альфа-ЦГТ-азы бактериями Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.10. Разработка способов получения посевного материала Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.11. Изучение влияния микроэлементов и стимулятора роста Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.11.1. Влияние микроэлементов на биосинтез альфа-ЦГТ-аз Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.11.2. Влияния стимулятора роста Гипоксена на биосинтез альфа-ЦГТ-аз Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.12. Изучение динамики биосинтеза фермента альфа-ЦГТ-азы бактериями Paenibacillus macerans 1АМБ на оптимизированной по составу питательной среде.

2.2.13. Осаждение ферментов из культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.14. Наработка опытных партий препарата альфа-ЦГТ-азы различной Paenibacillus macerans 1АМБ степени очистки.

2.2.15. Анализ полученных препаратов альфа-циклодекстринглюкано-трансфераз методом ВЭЖХ.

2.2.16. Исследование физико-химических характеристик препаратов альфа-ЦГТ-азы ГЗХ и Г10Х.

2.2.16.1. Определение рН-оптимума ферментных препаратов альфа-ЦГТ-азы.

2.2.16.2. Определение рН-стабильности ферментных препаратов альфа-ЦГТ-азы.

2.2.16.3. Определение температурного оптимума ферментных препаратов альфа-ЦГТ-азы.

2.2.16.4. Определение термостабильноти препаратов альфа-ЦГТ-азы Г10Х и ГЗХ.

ГЛАВА 3. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Характеристика конечного продукта производства.

3.2. Изложение технологического процесса производства.

3.2.1. Характеристика сырья и материалов.

3.2.2. Изложение стадий вспомогательных работ (BP) и основного технологического процесса (ТП).

3.3. Расчет материального баланса для получения ферментного препарата ЦГТ ПОХиз 1 м культуральной жидкости.

3.4. Контроль производства и управление технологическим процессом.

3.5. Переработка и обезвреживание отходов производства.

ВЫВОДЫ.

Введение 2006 год, диссертация по технологии продовольственных продуктов, Строева, Светлана Сергеевна

Актуальность темы. Циклодекстрннглюканотрансфераза (ЦГТ - аза, 1,4- альфа- D - глюкан- 4- альфа (1,4- альфа - глюкапо) - трансфераза, К.Ф. 2.4.1.19) - фермент микробного происхождения, при воздействии которого на крахмал и аналогичные субстраты образуются циклические нередуцирующие декстрины различных размеров. В зависимости от количества альфа - D- глюкопиранозных остатков (6, 7 и 8), циклодекстрины обозначаются соответственно как альфа бета - и гамма - циклодекстрины

ЦД).

В промышленных масштабах ЦД можно получать лишь ферментативным путем, так как синтез этих соединений химическими методами очень дорог. В целом процесс получения ЦД сводится к следующим основным этапам: 1) культивирование микроорганизма -продуцента ЦГТ-аз, 2) выделение ферментного препарата из культуральной жидкости, 3) получение ЦД с помощью препарата ЦГТ-аз. В настоящее время выпуском ЦД заняты фирмы в различных странах мира. Стоимость бета - ЦД, промышленного производства, достигает 25 долларов США за килограмм, альфа - и гамма- ЦД имеют себестоимость в десятки раз более высокую.

Биохимические реакции, катализируемые ЦГТ - азами, очень сложны. При гидролизе субстрата (крахмала) с помощью ЦГТ - аз, может образовываться смесь альфа бета - и гамма - ЦД, линейных и разветвленных ЦД, моно -, ди - и три - сахаридов. В соответствии с преобладанием определенного вида ЦД в реакционной смеси ЦГТ - азы подразделяют на альфа -, бета - и гамма - специфичные.

В настоящее время в России производство ЦГТ-аз и ЦД отсутствует. В 80-е годы прошлого века в МГУПП под руководством профессора И.М.Грачевой были разработаны основы лабораторного культивирования продуцентов ЦГТ-аз. В связи с изменениями социального, политического и экономического характера в начале 90-х годов эти исследования были приостановлены. Однако во всех высокоразвитых странах интерес к комплексам включений па основе ЦД только возрастает. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ЦГТ-аз и ЦД актуальна и перспективна.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- установление влияния микроэлементов и стимулятора роста микроорганизмов Гипоксена па накопление и активность альфа-ЦГТ-азы штамма-продуцепта;

- разработка технологии получения ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х.

Научная покпзпа работы. На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом альфа-ЦГТ-азной активности от условий культивирования и выхода фермента, от параметров выделения и очистки, разработана биотехнология ферментного препарата альфа-ЦГТ-зы. Для создания основ биотехнологии альфа-ЦГТ-зы было произведено следующее:

- Проведен экспресс-скрининг микроорганизмов, выделенных из различных видов почв и коллекций культур. Получен новый штамм-продуцент с высокой альфа-ЦГТ-азной активностью, одним из уникальных свойств которого является устойчивость к высоким концентрациям солей натрия.

- На основании изучения совокупности морфологических, культуральпых, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый галофильный штамм, продуцирующий альфа-ЦГТ-азу, идентифицирован как Paenibacillus macerans 1АМБ.

- Установлено влияние микроэлементов и стимулятора роста полифепольной природы Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы штамма Paenibacillus macerans 1АМБ, определены параметры его внесения в процессе культивирования.

- На основании выявленных зависимостей накопления альфа-ЦГТ-азы в культуральной жидкости Paenibacillus macerans от условий культивирования и сохранения ее активности при концентрировании и очистке разработана технологическая схема получения ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х.

Практическая значимость н реализация результатов работы.

В результате скрининга почвенных ЦГТ-активных изолятов бактерий создана лабораторная коллекция микроорганизмов, секретирующих альфа-специфичные ЦГТ-азы. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Paenibacillus macerans IAMB разработана биотехнология получения препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х. Разработаны паспорт штамма Paenibacillus macerans 1АМБ и Технические условия на ферментный препарат альфа-циклодекстринглюканотрапсфераза Г10Х. С учетом выявленных в лабораторных исследованиях зависимостей выхода ЦГТ-азы от условий выделения, концентрирования и сушки, разработан Лабораторный регламент по производству ферментного препарата альфа-циклодекстринглюкапотрапсферазы ПОХ. Проведена наработка препаратов альфа- ЦГТ-азы различных степеней очистки (ГЗХ, ПОХ) в условиях опытного производства. Полученные результаты подтверждены актом ОАО "Биохиммаш". Изучены термо- и рН стабильность экспериментальных партий препарата альфа- ЦГТ-азы, показавшие перспективность его использования для получения ЦД.

Подана заявка на выдачу патента РФ па штамм бактерий Paenibacillus macerans I АМБ- продуцент альфа-ЦГТ-зы.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 205 источников, и 7 приложений. Работа изложена на 218 страницах машинописного текста, включает 51 таблицу и 21 рисунок.

Заключение диссертация на тему "Выделение продуцента альфа-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы из природных источников и разработка технологии ферментного препарата на его основе"

выводы

1АМБ с максимальной альфа-ЦГТ-азиой активностью 49,0 ед/см .

4. Методом многокритериального выбора обоснован предпочтительный вариант питательной среды для культивирования в лабораторных условиях штамма Paenibacillus macerans 1АМБ, продуцента альфа-ЦГТ-азы.

5. На основе выявленных зависимостей биосинтеза альфа-ЦГТ-азы штаммом Paenibacillus macerans 1АМБ от источников углерода, азота и фосфора проведена оптимизация состава питательной среды методом аддитивно-решетчатого математического описания объекта, позволившая увеличить активность альфа-ЦГТ-азы на 22,8%.

6. Изучено влияние рН исходной ферментационной среды на биосинтез альфа-ЦГТ-азы бактериями Paenibacillus macerans 1 АМБ. Показано, что рН среды должен нходится в диапазоне 6,0-7,0.

7. Разработан способ получения посевного материала Paenibacillus macerans 1АМБ, изучено влияние его возраста и дозы на активность альфа-ЦГТ-азы.

8. Исследована динамика биосинтеза альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ, на основании которой выявлено, что этот фермент синтезируется после накопления биомассы бактериями, а максимум его активности в культуральной жидкости приходится на третьи сутки роста и составляет 90%, внутриклеточная активность - 10%.

9. Установлено влияние ряда микроэлементов и стимулятора Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ.

Ю.Подобраны оптимальные условия осаждения альфа-ЦГТ-азы этанолом: соотношение объемов 75% этиловый спирт: культуральная жидкость -4:1; рН культуральной жидкости 6,0, температура 3°С. При этих условиях был получен ферментный осадок со средней активностью альфа-ЦГТ-азы 2900 ед/г, удельной активностью 14,9 ед/мг белка.

11.На основе разработанного лабораторного регламента проведена наработка препаратов альфа- ЦГТ-азы различных степеней очистки: ГЗХ с активностью 2 430 ед/г (удельная активность 6,47 ед/мг белка, оптимум действия препарата: рН - 6,2; t - 40° С) и Г10Х с активностью 2 937,3 ед/г (удельная активность 15,53 ед/мг белка, оптимум действия препарата: рН - 6,2; t - 40° С) в условиях опытного производства, и полученные результаты подтверждены актом ОАО "Биохиммаш".

Библиография Строева, Светлана Сергеевна, диссертация по теме Технология чая, табака и биологически активных веществ и субтропических культур

1. ГОСТ 12575-86 Сахар. Методы определения редуцирующих веществ.

2. ГОСТ 20264.1-89 Препараты ферментные. Методы определения органолептических, физико-химических и микробиологических показателей.

3. Абелян В.А. Циклодекстрины: Получение и применение.- Ереван: Изд. Дом "Ван-Арьян", 2001.-519 с.

4. Авторское свидетельство SU 1738852 А1. Штамм бактерий Bacillus sp. продуцент бета-циклодекстринтрансферазы. Усанов Н.Г., Логинов О.Н., Мелентьев А.И., 1990

5. Авторское свидетельство SU 18143313. Штамм бактерий Bacillus stearothermophilus продуцент циклодекстрингликозилтрансферазы и способ получения альфа-циклодекстрина. Абелян В.А. и др., 1989

6. Авторское свидетельство РФ 2244742. Метод выделения и селекции микроорганизмов-продуцентов циклодекстринглюканотрансфераз, штамм -продуцент Bacillus circulans В-65,2005

7. Беликов Б.Г., Компанцева Е.В., Гаврилин М.В., Умнова Э.Ф. Изучение возможности использования бета-ЦД для совершенствования процесса получения преднизолона//Химико-фармацевтический журнал, 1991, № 2, с. 46-47.

8. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М.: Наука, 1985,- 196 с.

9. Болдырев А.А. „.Матриксная функция биологических мембран// Соросовский образовательный журнал,2001, №7, с. 2-8

10. Бутова С.Н., Типисева И.А., Эль-Регистан Г.И. Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ. М.:Элевар, 2003. - 554с.

11. И.Вокк P. А., Пейпман Э.М. Биосинтез и применение циклодекстринглюканотрансферазы.// В. кн.: Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тезисы докладов 4 всесоюзной конференции.-Ташкент, 1988.-е. 187-188.

12. Волкова Д.А. Получение и изучение свойств высокоочищенной циклодекстринглюканотрансферазы из Bacillus sp.1070. модифицированных Р-циклодекстринов и комплексов включения на их основе.- Дисс. на соиск. уч.ст. к.н. -М.: МГУПП , 2000.-100с.

13. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применения. М.:МИР, 2002. - 590с.

14. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии. М.:ДеЛи принт, 2004. - 144с.

15. Грачев Ю.П., Плаксин Ю.М. Математические методы планиерования экспериментов. -М.: ДеЛи принт, 2005.- 296 с.

16. Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С. и др. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов.-М.:Легкая и пищевая промышленность, 1982. -240с.

17. Грачева И.М., Иванова Л.А., Кантере В.М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия.- М.: Колос, 1992.-383с.: ил.

18. Грачева И.М., Калунянц К.А. Технология проектирования предприятий ферментной промышленности.- М.:Пищевая промышленность, 1973.288 с.

19. Грачева И.М., Кривова АЛО. Технология ферментных препаратов.-М.: Элевар, 2000.-512 с.

20. Громов Б.В. Поведение бактерий//Соросовский образовательный журнал ,1997, №6.- с. 28-32

21. Гусев И.В., Глущенко А.С., Данилов В.Н. Оптимизация структур технологических линий микробиологических производств на основемодифицированных правил паретовского многокритериального выбора.//Биотехнология, 1985, №3.- с. 82-87.

22. Гусев И.В., Литвак Б.Г., Вейнер Э.С. Многокритериальный метод формирования структур технологических линий производства треонина//Биотехнология, 1987, т.З, №5.- с. 675-679.

23. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. Учебник для студ. Биол. специальностей вузов. 4-е изд., стер. - М.:Издательский центр «Академия», 2003. - 464с.

24. Дарбре А. Практическая химия белка. -М.:МГК, 1985. -376с.

25. Дерябин Д.Г. Функциональная морфология клетки. Учебное пособие. -М.:Книжный дом «Университет», 2005. 320с.

26. Димитриади Г.Г. О числе пар объектов, связанных отношением Парето-доминирования //Институт системного анализа РАН. Электронный журнал «Исследовано в России», 2000.

27. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв.- М.: Книжный дом «Университет», 2002.

28. Досон Р., Элиот Д. и др. Справочник биохимика. М.:МИР, 1991. -543с.

29. ЗО.Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию. -М.:Книжный дом «Университет», 2001. 323с.31.3енова Г.М., Степанов А.Л., Лихачева А.А. и др. Практикум по биологии почв. М.: Книжный дом «Университет», 2002.

30. Иванова И.С. Разработка технологии биологически активной добавки к пище в виде белково-углеводного концентрата из биомассы хлебопекарных дрожжей. дис. канд. тех. наук. М.:МГУПП, 2003. -197 с.

31. Иванова JI.A., Войно Л.И. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по технологии белковых препаратов, аминокислот и липидов.- М.: Издательский комплекс МГУПП, 1985. -42 с.

32. Иванова JI.A., Войно Л.И. и др. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по дисциплине «Технология биоконверсии растительного сырья». М.:Издательский комплекс МГУПП, 2002. -66с.

33. Иоффе И.Л. Проектирование процессов и аппаратов химической технологии: Учебник для техникумов. -Ленинград: Химия, 1991.- 352 е.: ил.

34. Калунянц К. А., Голгер Л. И., Балашов В. Е.Оборудование микробиологических производств.- М.: Агропромиздат, 1987. — 398 е.: ил.

35. Кантере В.М., Мосичев М.С., Дорошенко М.И. Основы проектирования предприятий микробиологической промышленности.-М.: Агропромиздат, 1990. — 304 е.: ил.

36. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. М.:ДеЛи принт, 2002. - 336с.

37. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.:Высшая школа. 2000.-479с.

38. Колесников М.П., Гинс В.К. Фенольные соединения в лекарственных растениях// Прикладная биохимия и микробиология 2001. - т37, №4. -с. 456-457.

39. Колосков С.П. Оборудование предприятий ферментной промышленности. М.: Пищевая промышленность , 1969. - 383 е., ил.

40. Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия: Учебник для ВУЗов. -М.:Дрофа, 2004. 640с.

41. Кошелева Т. В. Разработка технологии ферментативного синтеза циклодекстринов. -Дис. канд. тех. наук.- М., 1991. 160 с.

42. Крамер Ф. Соединения включения//пер. с немецкого. -М.: Издательство иностранной литературы, 1958.- 169с.

43. Кушакова Е. Е. Разработка технологии высокоочищенной циклодекстринглюканотрансферазы из Bacillus macerans 506.- Дисс. канд. тех. наук .-М., 1990.-181 с.

44. Логинов О. Н. Физиолого-биохимические свойства представителей вида Bacillus macerans продуцентов циклодекстринглюканотрансфераз. Дис.канд. биол, наук.-Киев, 1991.- 106 с.

45. Мосичев М.С., Складнев А.А., Котов В.Б. Общая технологи микробиологических производств. М.:Легкая пищевая промышленность, 1982. - 264с.

46. Никитин B.C., Бурашников В.М. Охрана труда на предприятиях пищевой промышленности.- М.: Агропромиздат, 1991. 350с.: ил.

47. Папель К.Э., Дихтярев С.И., Сугробова Н.П. Особенности получения ЦЦ и образование комплексов включения/ В кн.: Итоги науки и техники, сер. Микробиология. Циклодекстрины.- М., 1988, 21, с. 74-127

48. Патент РФ № 2244742, кл С 12 N 1/20,2000

49. Патент США № 6184001. Thermostable cyclodextrin glycosyl transferase and processes using it, 2001

50. Патент США № 6472192. Cyclodextrin glycosyl transferases for producing gamma-cyclodextrin, 2002

51. Патент США № 6960461. Gene coding for cyclodextrin glucanotransferase chiefly producing gamma -cyclodextrin and use thereof, 2005

52. Патент США № 6924136. Cyclodextrin glucanotransferase and its method of manufacture, 2005

53. Патент США № 6780624 B2. Glycosyl transferases for biosynthesis of oligosacchari-des, and genes encoding them, 2004

54. Патент США № 6777215 B2. Cyclomaltodextrin glucano-transferase variants, 2004

55. Патент США № 6570009. Region-selective method for preparing cyclodextrin C-6 monosulphonyl derivatives, 2003

56. Патент США № 6482622. Amylolytic enzyme variants, 2002

57. Патент ВОИС №01/90335. Nouvelle cyclodextrine glucanotransferase, procede de production de celle-ciet procede de production de cyclodextrine au moyen de cette enzyme, 2001

58. Патент ВОИС №03/106502. Procede de production de dextrines au mouen d'enzymes, 2003

59. Плохое А. Ю. Разработка биокаталитических процессов получения у-аминомасляной кислоты и p-циклодекстрина. -Дис,-канд. тех. наук.-М., 1997.-111 с.

60. Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева J1.B. Определение активности ферментов. Справочник. М.:ДеЛи принт, 2003. - 375с.

61. Пруцакова Е.А., Терехова Е.Я., Усанов Н.Г. "Измерение ферментативной активности ЦГТ-азы, К.Ф. 2.4.1.19.// Изучение и рациональное использование природных ресурсов. Тезисы докладов научной конференции.-Уфа, 1991.-c.108.

62. Райкис Б.Н., Пожарская В.О., Казиев А.Х. Общая микробиология с вирусологией и иммунологией (в графическом изображении). Учебное пособие. М.:Тонада - X, 2002. - 352с.

63. Рис Э., Стернберг М. Введение в молекулярную биологию. М.:МИР, 2002.- 142с.

64. Слюсаренко Т.П. "Лабораторный практикум по микробиологии пищевых прозводств". -М.: Легкая и пищевая пром., 1984.-208с.

65. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для ВУЗов. М.:Дрофа, 2004. - 256с.

66. Терехова Е. Я. Выделение продуцентов бета-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы и получение ферментных препаратов на их основе. -Дис. канд. тех. наук.-Уфа, 1999. 110 с.

67. Тырсин Ю.А., Иванова Л.А., Кривова А.Ю. Методические указания к выполнению лабораторных работ по курсу "Специальная биохимия".-М.: Издательский комплекс МГУППД993.- 66 с.

68. Усанов Н.Г., Логинов О.Н., Пруцакова Е.А., Терехова Е.Я. Получение бета-ЦД из картофельного крахмала/ Тезисы докладов Всесоюзной конференции.-Черновцы, 1991-T.l-c. 122

69. Усанов Н.Г., Е.А. Гильванова, П.А. Елизарьев, Е.А. Пруцакова, А.И. Мелентьев. Усовершенствованный метод фотометрического определения активности бета-циклодекстринглюканотрансферазы // «Прикладная биохимия и микробиология», 2006.

70. Фаллер Дж., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. М.:Бином 2003.-268с.

71. Циклодекстрины / Под ред. Егорова Н. С.- Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Серия Микробиология. 1988-1989. - Т. 20-21.

72. Шишкова Э.А., Войно Л.И. Методические рекомендации к выполнению самостоятельной работы по курсовому и дипломномупроектированию предприятий биотехнологической промышленности. Ч.1.-М.: Издательский комплекс МГУПП,2003.- 47 с.

73. Шлегель Г. Общая микробиология. М.:МИР, 1987. - 566с.

74. Штейнман А.А. Циклодекстрины/ ЖВХО им. Менделеева, 1985, №5.-с. 34-38

75. Щербаков В.Г. Биохимия: Учебник для ВУЗов. СП.б.:ГИОРД, 2003. -438с.

76. Borem Aluizio, Santos R. Fabricio, Bowen E. David Understanding Biotechnology. Prentice Hall PTR; US Ed edition. 2003. 220p.

77. Anslyn V. Eric, Dennis A. Dougherty. Modern Physical Organic Chemistry, University Science, 2005. ISBN 1-89138-931-9.

78. Bains William Biotechnology from A to Z. Oxford University Press, USA; 3 edition. 2004. 424p.

79. Basic Biotechnology / Colin Ratledge (Editor), Bjorn Kristiansen (Editor)/ Cambridge University Press, 2006.

80. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Volume 1: The Archaea and the Deeply Branching and Phototrophic Bacteria / George M. Garrity (Editor), David R. Boone (Editor)/ Springer; 2 edition, 2001, 721 p.

81. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2 (Parts А, В & С; Three-Volume Set) / George M. Garrity (Editor)/ Springer; 2 edition, 2005, 2816p.

82. Biotechnology The Science and the Business. / Derek G. Springham (Editor), Vivian Moses (Editor), Ronald E. Cape (Editor)/ CRC, 1999.

83. Biwer A., Antranikian G., Heinzle E. Mini-Review Enzymatic production of cyclodextrins. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002 Vol.59 p.609-617

84. Bovetto L. J., Backer D. P., Villette J. R. et, al. Cyclomaltodextrin

85. Glycosyltransferase from Bacillus circulans E 192 // Biotechnol. Appl. Biochem, 1992, V. 15, P. 48-58.

86. Bron, S., Meijer, W., Holsappel, S., Haima, P. Plasmid instability and molecular cloning in Bacillus subtilis. /Res.Microbiol., 1992, V.142, p.875-883.

87. Buschmann. H.-J., Knittel D., Schollmeyer. E. New Textile Applications of Cyclodextrins Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2001, Vol.40 p. 169-172

88. Copeland R.A. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis / Wiley-VCH, 2000, ISBN 0-47135-929-7.

89. Cyclodextrins and Their Complexes: Chemistry, Analytical Methods, Applications. / Helena Dodziuk (Editor)/ John Wiley & Sons, 2006, ISBN 352731-280-3.

90. De Pinto J. A, Campbell L. L. Purification and properties of the amylase of Bacillus macerans. // Biochemistry, 1968, V. 7, P. 114-120.

91. Deb. K. Multi-Objective Optimization Using Evolutionary Algorithms./ John Wiley, 2001.

92. Easton J. Christopher, Lincoln F. Stephen Modified Cyclodextrins: Scaffolds and Templates for Supramolecular Chemistry. / World Scientific Publishing Company, 1999, ISBN 1-86094-144-3.

93. Egghe L., Rousseau R. A. Proposal to Define a Core of a Scientific Subject: A Definition Using Concentration and Fuzzy Sets // Scientometrics. Vol.54, No.l , 2002.- P.51-62.

94. Ehrlich, S.D. Replication and expression from Staphylococcus aureus in Bacillus subtilis. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 1977.-p. 1680-1682.

95. Ehrlich, S.D., Janniere L., Gruss A. Plasmid replication and structural stability in Bacillus subtilis. // Res. Microbiol., 1992, V.142,p. 869-873.

96. Felsenstein J. An alternating least squares approach to inferring phylogenies from pairwisedistances. //Syst Biol.,1998, V. 46, p.101-111.

97. Fijiwara S., Kakihara H., Sakagichi K. et. al. Analysis mutation in cyclodextrin glucanotransferase form Bacillus stearothermophilus which affect cyclization characteristics and thermostability //J. Bacteriol. 1992, V. 174, P. 7478-7481.

98. Fogarty W. M. Microbial amylases //Microbial Enzymes and Biotechnology /Applied Science Publishers, Essex, U.K., 1983, P. 1-92.

99. Fromming K., Szejtli J. Cyclodextrins in Pharmacy (Topics in Inclusion Science) / Springer, 2006, ISBN 0-79232-139-1.

100. Fuwa, H.// J. Biochem (Tokyo), 1954. V.41. - P. 5.

101. Garces J.A., Gavin R.H. Using an inverse PCR strategy to clone large, contiguous genomic DNA fragments. //Methods Mol. Biol., 2001, V.161, p.3-8.

102. Glick Bernard R., Pasternak Jack J. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. ASM Press; 3rd edition, 2003. -760p.

103. Gryczan T.J., Dubnau D. Construction and properties of chimeric plasmids in Bacillus subtilis. /Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1978.-p. 1428-1432.

104. Guerout-Fleury M., Frandsen N., Stragier P. Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis. /Gene, 1996, v. 180, p.57-61.

105. Jamuna R., Saswathi N., Sheela R. et. al. Synthesis of cyclodextrin glycosyl transferase by Bacillus cereus for the production of cyclodextrins // Appl. Biocem Biotechnol. 1993, V. 43, P. 163-176.

106. Janecek S. Tracing the evolutionary lineages among a- amylases and cyclodextrin glycosyltransferases: the question of so-called 'intermediary' enzymes.//Biologia (Bratislava), 1995, 50: 515-522.

107. Janecek S. a-Amylase family: molecular biology and evolution.// Prog. Biophys. Mol. Biol., 1997, 67: 67-97.

108. Janecek S. Structural features and evolutionary relationships in the a-amylase family. /Glycoenzymes, 2000, p. 19—54.

109. Jorgensen S., Tangney M., Starnes RL. Cloning and nucleotide sequence of a thermostable cyclodextrin glycosyltransferase gene from Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 and its expression in Escherichia coli.//Biotechnol. Lett., 1997, 19: 1027-1030.

110. Hall B. Phylogenetic Trees Made Easy: A How-To Manual, Second Edition. Sinauer Associates, Inc., 2004,22lp.

111. Hennig W., Davis D., Zangerl R. Phylogenetic Systematics. University of Illinois Press; New Ed edition, 1999,280p.

112. Horikoshi K. Enzymology and molecular genetics of cyclodextrin-forming enzymes. In: 4th International Symposium on Cyclodextrins, Munich, 1988, p.7-17.

113. Horikoshi K., Nakamura N., Matzuzawa N., Yamamoto M. Industrial production of cyclodextrins. In: 1st International Symposium on Cyclodextrins, Budapest, 1981, p.25-39

114. Hartl, В., Wehrl, W., Wiegert, Т., Homuth, G., Schumann, W. Development of a new integration site within the Bacillus subtilis chromosome and construction of compatible expression cassettes.// J. Bacterid., 2001, 183, 2696-2699.

115. Kim S.H., Ahn J., Kwak H.S., Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes // Springer, 2002.

116. Kitahata S., Okada S. Action of cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus megaterium strain No 5 on starch.// Agr. Biol. Chem., 1974, v.38, N 12, p.2413-2417.

117. Kitahata S., Tsuyama N., Okada S. Purification and some properties of cyclodextrin glycanotransferase from Bacillus stearothermophillus TC-60. -J. Jap. Soc. Starch Sci., 1982., v. 29, N 1, p. 7-12.

118. Kobayashi S., Kainuma K., Suzuki S. Purification and some properties of Bacillus macerans cycloamylose (cyclodextrin) glucanotransferase/ Carbohydr. Res., 1978, V. 61., N1., P. 229-238.

119. Koizumi K., Utamura Т., Kuroyanagi T. Analyses of branched cyclodextrins by high performance liquid and yhin-layer chromatography. J.Chromatogr. (1986) v.360, p.397-406.

120. Koneman Elmer W. Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Lippincott Williams & Wilkins; 6th edition, 2005. 1736p.

121. Kwak H.S., Kim S.H., Kim J.H., Choi H.J., Kang J., Arch. Pharm. Res., 27,873-877,2004.

122. Kwak H.S., Jung C.S., Shim S.Y., Ahn J., J. Agric. Food Chem., 50, 72937298,2002.

123. Kenton S, Lai HS, Lin SP, Qian Y, Jia HG, Najar FZ, Ren Q, Zhu H, Song L, White J, Yuan X, Clifton SW, Roe BA, McLaughlin R (2001) Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes. Proc Natl Acad Sci USA 98:4658-4663.

124. Kimura К., Takano Т., Yamane K. Molecular cloning of the cyclodextrin synthetase gene from an alkalophilic Bacillus and its expression in Escherichia coli and Bacillus subtilis // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. - V.26, N 2. - P. 149-153.

125. Kitahata S., Okada S. Action of cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus megaterium strain No 5 on starch.// Agr. Biol. Chem., 1974, v.38, N 12, p.2413-2417.

126. Kitahata S., Tsuyama N., Okada S. Purification and some properties of cyclodextrin glycosyltransferase from strain of Bacillus species. // Agr. Biol. Chem., 1974, v.38, N 2, p.387-393.

127. Kobayashi S., Kainuma K., Suzuki S. Purification and some properties of Bacillus macerans cycloamylose (cyclodextrin) glucanotransferase/ Carbohydr. Res., 1978, V. 61., N1., P. 229-238.

128. Kotz S., Balakrishnan N., Norman L. Johnson Continuous Multivariate Distributions, Volume 1, Models and Applications, end Edition / Wiley, June 2000, ISBN: 0-471-18387-3.

129. Larichev O.I. Measurement of Differences in Preferences Expressed by a Simple Additive Rule / in M. Katwan, J. Sprouk, J. Wallenius (Eds.) /Essays in Decision Making, Springer Verlas.- Berlin, 1997.

130. Lane A.G., Pirt S.J. Production of cyclodextrin glycosyltransferase of batch and chemostat culture of Bacillus macerans in chemically defined media. // J. Appl. Chem. Biotechnol., 1973, v.23, N4, p.309-321.

131. Laszlo E., Banky В., Szejtli J. Comparison of production of cyclodextrin transglycosylase enzyme from different Bacillus macerans strains. //Starch, 1980, v.32, N 1, p.27-29.

132. Li M. Manufacture and application of cyclodextrins/Huaxue Shijie, 1984, V.25, N 3, P. 106-109.

133. Laszlo E., Banky В., Szejtli J. Purification of cyclodextrin glucosyltransferase enzyme by affinity chromatography. // Ibid., 1981, v. 33, N8, p. 281-283.

134. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology / editorsin chief, Arnold L. Demain, Julian E. Davies /ASM Press, 1999

135. Makela J. Mauri, Korpela K. Timo, Puisto Juhani, and Laakso V. Simo Nonchromatographic cyclodextrin assays: evaluation of sensitivity, specificity, and conversion mixture applications.// J. Agric. Food Chem. 1988/Vol. 36 pp 83-88

136. Martin Del Valle E.M. Cyclodextrins and their uses: a review. /Process Biochemistry, 2004, v.39, p. 1033-1046

137. Middleton, R., Hofmeister, A. New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis. Plasmid, 2004.- 51, 238-245.

138. MacGregor EA, Janecek S, Svensson В Relationship of sequence and structure to specificity in the a-amylase family of enzymes.// Biochim. Biophys. ,2001, Acta 1546: 1-20.

139. Methods in Enzymology, Volume 358: Bacterial Pathogenesis, Part C: Identification, Regulation and Function of Virulence Factors (Methods in Enzymology) / Virginia L. Clark (Editor), Patrik M. Bavoil (Editor)/ Academic Press, 2002, 527p.

140. Micro-organisms and Earth Systems (Society for General Microbiology Symposia) / Hilary Lappin-Scott (Editor), Geoff Gadd (Editor), Kirk Semple (Editor)/ Cambridge University Press, 2005, 388p.

141. Molecular Identification, Systematics, and Population Structure of Prokaryotes / Erko Stackebrandt (Editor)/ Springer; 1 edition, 2005, 320p.

142. Nakamura N., Horikoshi K. Characterization and some cultural conditions of a cyclodextrin glycosyltransferase-producing alcalophilic Bacillus species /Agr. Biol. Chem., 1976, V. 40, N 4, P. 753-757.

143. Nomoto M., Chen Ch.-Ch., Shen D. Purification and characterization of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic bacterium of Taiwan. // Agr. Biol. Chem., 1986, v.50, N11, p.2701-2707.

144. Nomoto M., Shew D.C., Chen S.J. et al. Cyclodextrin glucanotransferase from alkalophilic bacteria of Taiwan. // Agr. Biol. Chem., 1984, v.48, N 5, p.1337-1338.

145. Nakamura N., Horikoshi K. Purification and properties of Cyclodextrin Glycosyltransferase of an Alkaiophilic Bacillus sp// Agric. Biol. Chem., 1976, V/40, (5), P.145-153

146. Nishijo J., Moriyama S., Shiota S., Chem. Pharm. Bull. (Tokio)., 51, 12531257, 2003.

147. Nomoto M., Chen Ch.-Ch., Shen D. Purification and characterization of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic bacterium of Taiwan. // Agr. Biol. Chem., 1986, v.50, N 11, p.2701-2707.

148. Nomoto M., Shew D.C., Chen S.J. et al. Cyclodextrin glucanotransferase from alkalophilic bacteria of Taiwan. // Agr. Biol. Chem., 1984, v.48, N 5, p.1337-1338.

149. Penninga D., Strokopytov В., Rozeboom H. L. et al. Site-Directed Mutation in Tyrosine 195 of Cyclodextrin Glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251 Affect Activity and Product Specifisity // Biochemistry. 1995, V. 34; P. 3368-3376.

150. Penninga D, van der Veen BA, Knegtel RMA, van Hijum SAFT, Rozeboom HJ, Kalk KH, Dijkstra BW, Dijkhuizen L. The raw starch binding domain of cyclodextrin glycosyltransferasefrom Bacillus circulans strain 251.//J. Biol. Chem., 1996,271: 32777-32784.

151. Pongswasdi P., Yagisawa M. Purification and some properties of cyclomaltodextrin glucanotransferase. Agr. Biol. Chem., 1988, v.52, N 5, p. 1099-1103.

152. Prescott Lansing M., Harley John P., Klein Donald A. Microbiology. McGraw-Hill Science/Engineering/Math; 6 edition, 2004. 992p.

153. Proceedings of the Ninth International Symposium on Cyclodextrins, Santiago de Compostela, Spain, May 31 June 3, 1998, J.J. Torres Labandeira and J.L. Vila-Jato (Eds.) // Kluwer Academic Publishers, 1999.

154. Qi Q., Zimmermann W. Cyclodextrin glucanotransferase: from gene to applications. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 66,475-485 (2005)

155. Ramakrishna S. V., Saswathi H., Sheela et al. Evaluation of solid, slurry and submerged fermentations for the production of cyclodextrin glycosyltransferase by Bacillus cereus // Enzyme Microb, Technol., 1994, V. 16, P. 441-444.

156. Saito Y., Cserh6ti Т., Forg6cs E.: Cyclodextrins in Chromatography. //Anal. Bioanal. Chem., 2004, v.379, p.6-7

157. Schmiedel, D., Hillen, W., A Bacillus subtilis 168 mutant with increased xylose uptake can utilize xylose as sole carbon source./ FEMS Microbiol. Lett., 1996,135,175-178.

158. Schulz, A., Schwab, S., Versteeg, S., Schumann, W. The htpG gene of Bacillus subtilis belongs to class III heat shock genes and is under negative control.//J. Bacterid., 1997,10,3103-3109.

159. Schwimmer S., Garibaldi J.A. Further studies on the production, purification and properties of the Schardinger dextrintransferase of Bacillus macerans. Cereal Chem., 1952, v.29, N 2, p.108-122.

160. Seo Т., Kajihara Т., Iijima Т., Macromol. Chem., 188, 2071-2075,1987.

161. Shimotsu, H., Henner, D.J. Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis. Gene, 1986,43, 85-94.

162. Shim S.Y., Ahn J., Kwak H.S., J. Dairy Science., 86,2767-2772, 2003.

163. Simon, D., Chopin, A. Construction of a vector plasmid family and its use for molecular cloning in Streptococcus lactis. Biochimie, 1988, 70, 559— 566.

164. Singh M., Sharma R., U.C. Banerjee Research review paper Biotechnological applications of cyclodextrins. Biotechnology Advances, 2002, Vol.20 p.341-359

165. Suh J., Lee S.H., ZohK.D.,J. Am. Chem. Soc., 114, 7916-7921, 1992.

166. Sumitra Т., Hidetoshi A., Fumitoshi H. Some pharmaceutical properties of new branched cyclodextrin 6-0-a(4-0-a-D-glucuronyl)-D-glucosil-p-CD//Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2002, 44, p. 391-394

167. Schmid G. Cyclodextrin glycosyltransferase production: yield enhancement by overexpression of cloned genes // Trends Biotechnol. -1989. V.7, N 9. - P. 244-248.

168. Schwimmer, S. Evidence for the purity of Schardinger dextrinogenase. Arch. Biochem. Biophys. 43 (1953) 108-117.

169. Sicard P., Sanies M. Biosynthesis of cyclodextrin glycosyltransferase and obtention of its enzymic reaction products. In: Cyclodextrins and Their Industrial Uses, Paris, 1987, p.75-103.

170. RE, Teixeira EC, Tezza RI, Trindade dos Santos M, Truffi D, Tsai SM, White FF, Setubal JC, Kitajima JP. Comparison of the genomes of two Xanthomonas pathogens with differing host specificities.// Nature, 2002, 417:459-463.

171. Stanbury P.F., A. Whitaker, S.J. Hall. Principles of Fermentation Technology. // Butterworth-Heinemann, 1999.

172. Svensson B. Protein engineering in the a-amylase family: catalytic mechanism, substrate specificity, and stability.// Plant Mol. Biol., 1996, 25: 141-157.

173. Szejtli J. Cyclodextrins and their inclusion complexes. Akademiai Kiado. Budapest. 1982

174. Szente L., Szejtli J. Cyclodextrins as food ingredients. Trends in Food Science & Technology (2004), vl5 p. 137-142

175. Szeitli J. Cyclodextrins in the Textile Industry. Starch/Starke (2003) v.55 p.191-196

176. Szeitli J. Cyclodextrin technology. Kluwer academic publishers, 1989. 450 P

177. Tamer, Uyar. Nanostructuring polymers with cyclodextrins ~ Dissertation // ProQuest / UMI (April 1,2006), ISBN 0-54238-965-7

178. Takano T, Fukuda M, Monma M, Kobayashi S, Kainuma K, Yamane К Molecular cloning, DNA nucleotide sequencing, and expression in Bacillus subtilis cells of the Bacillus macerans cyclodextrin glucanotransferase gene.// J Bacteriol, 1986, 66:1118- 1122

179. Tilden E.B., Hudson C.S. The conversion of starch of crystalline dextrins by the action of a new type of amylase separated from culture Aerobacillus macerans. J. Am. Chem. Soc., 1939, v.61, N 9, p.2900-2902.

180. Tilden E.B., Hudson C.S. Preparation and properties of the amylases produced by Bacillus macerans and Bacillus polymixa. J. Bacteriol., 1942, v.43, N 2, p.527-544.

181. Tonkova A. Bacterial cyclodextrin glucanotransferase.// Enzyme Microb. Technol., 1998, 22: 678-686.

182. Takagi, H., Kagiyama, S., Kadowaki, K., Tsukagoshi, N., Udaka, S., 1989. Genetic transformation of Bacillus brevis with plasmid DNA by electroporation. Agric. Biol. Chem. 53, 3099-3100.

183. Vandamme E.J., Declereg C., Debonne J. Dinamic of the Bacillus circulans var. alkalophilic cyclodextrin glycosyltransferase fermentation. In: 3rd Eur. Congr. Biotechnology, Munchen, 1984, p.327-332.

184. Van der Veen B. A., Uitdehaag J. C, Penninga D. et al. Rational design of cyclodextringlycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251 to increase alpha-cyclodextrin production // J. Mol. Biol., 2000, V. 296 (4) P. 1027-1038

185. Wilkins C., Lay J., Winefordner J. Identification of Microorganisms by Mass Spectrometry (Chemical Analysis: A Series of Monographs on Analytical Chemistry and Its Applications). Wiley-Interscience, 2005, 352p.

186. Wong, S.-L. Advances in the use of Bacillus subtilis for the expression and secretion of heterologous proteins. Curr.Opin. Biotechnol., 1995, 6, 517522.

187. Wu, S.C., Wong, S.-L. Engineering of a Bacillus subtilis strain with adjustable levels of intracellular biotin for secretory production of functional streptavidin. Appl. Environ.MicrobioI., 2002, 68, 1102-1108.

188. Wu, X.-C., Lee, W., Tran, L., Wong, S.-L. Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases.//J. Bacterid., 1991, 173,4952-4958.

189. Xu E., Aoki H., Misawa M. New a- cyclodextrin producing thermostable cyclodextrin glucanotransferase. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1988, v.28, N4-5, p.377-379.

190. Yong-Hoon Choi, Chul-Hak Yang, Hyun-Won Kim, Seunho Jung, Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 39, 71-76,2001.

Похожие работы

Технология продовольственных продуктов
05.18.00