автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Совершенствование биотехнологий высокоочищенной α-циклодекстринглюканотрансферазы и α-циклодекстринов на основе новых штаммов рода Paenibacillus

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА ОКСАНА ВЛАДИМИРОВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЙ ВЫСОКООЧИЩЕННОЙ а-ЦИКЛОДЕКСТРИНГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗЫИ а-ЦИКЛОДЕКСТРИНОВ НА ОСНОВЕ НОВЫХ ШТАММОВ РОДА РАЕШВА С1ЬЬ11Б Специальность 05.18.10 - Технология чая, табака и биологически активных

веществ и субтропических культур

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

003 171302

Москва-2008

003171302

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Иванова Людмила Афанасьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Бутова Светлана Николаевна

кандидат технических наук, старший научный

сотрудник

Петрова Наталья Тихоновна

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии

Защита состоится: «26» июня 2008 г. в 10 00 час в ауд Ш-101 на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212 148.04 при ГОУ ВПО «Московский Государственный Университет пищевых производств» по адресу 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу. 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д 11, МГУПП, ученому секретарю совета Д 212 148 04

Автореферат разослан «*£?» еЛ&^гЛ- 2008 г

Ученый секретарь

Совета, д т н, проф

Крюкова Е В.

Общая характеристика работы. Актуальность темы. Циклодекстрииы (ЦД) относятся к классу углеводов, точнее олигосахаридов, получаемых ферментативным путем из крахмала Являясь представителями одного гомологического ряда, они различаются количеством звеньев глюкозы в макроциклах, и обозначаются буквами греческого алфавита -а, [}, у, 5 и т д в сторону увеличения длины кольца

Для биохимической трансформации крахмала в ЦД используется фермент, циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТ-аза), относящийся к подклассу микробных трансфераз (К Ф 2 4 1 19), а именно, к циклизующим трансферазам, осуществляющим реакцию переноса и присоединения остатков Сахаров на —ОН группы других Сахаров

Молекулы ЦД имеют гидрофильную внешнюю поверхность (обусловливающую хорошую растворимость циклических олигосахаридов в воде) и сквозную гидрофобную полость, по своим размерам сопоставимую с величиной многих органических и неорганических соединений Последние, попадая в растворы ЦД, проникают в полость, остаются там, удерживаемые силами гидрофобных и других взаимодействий, и меняют свои физико-химические свойства нерастворимые субстанции становятся растворимыми, обладающие горьким вкусом - безвкусными, пахучие - лишенными запаха, летучие - нелетучими, а нестабильные - стабильными Вследствие уникального строения ЦД широко используются за рубежом в самых различных отраслях промышленности В пищевой промышленности они применяются для введения в рецептуры пищевых продуктов витаминов и ароматических веществ, повышая их растворимость в воде

Среди ведущих компаний на мировом рынке ЦД бесспорное первенство принадлежит китайским, японским (Hayashibara Biochem Lab, Rikagaku Kenkyusho, Hako Co, Kikkoman Corp и др ) и американским фирмам (Corn Products Сотр., СРС Intern Inc , American Maize Techn Inc , Genetics Inst и др ) Наиболее дешевым продуктом является Р-ЦЦ промышленного производства, доступный по ценам от 7 до 25 долларов США за килограмм а - и у-ЦД, имеют себестоимость (и соответственно цену) в десятки раз более высокую

В России производство ЦД отсутствует, поэтому, разработка научно-обоснованных, высокоэффективных биотехнологий ЦГТ-аз и ЦД является актуальной проблемой

Решению задач получения очищенного микробного ферментного препарата а-ЦГТ-азы, разработки биотехнологии ЦД и комплексов включений на их основе посвящена данная работа

Цели и задачи исследования

Основные цели диссертационной работы состояли в разработке технологии ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х с использованием штамма-продуцента Paembacillus macerans 1АМБ и интенсификации биотехнологии а-ЦД на его основе с последующим получением комплексов включений с ароматическими веществами Для достижения поставленных целей решались следующие задачи

- скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора термостабильного а-ЦГТ-активного штамма Идентификация штамма-продуцента а-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его культуральных, морфологических, физиолого-биохимических и филогенетических особенностей,

- подбор оптимального состава питательной среды и условий культивирования с целью накопления максимальной активности а-ЦГТ-азы,

- разработка технологии получения ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х,

- интенсификация биотехнологии а-ЦД,

- получение комплексов включений а-ЦД с ароматическими веществами и апробация полученных комплексов в технологии кондитерских изделий

Работа выполнялась в рамках государственного контракта с Федеральным Агентством по науке и инновациям от 28 марта 2005 г № 02 434 11 3007 по теме ЖС-12 4/004 «Ферментные системы и технологии получения циклодекстринов» Научная новизна работы.

На основе анализа данных, полученных экспериментальным путем, выявленных зависимостей накопления а-ЦГТ-азной активности штаммом Paembacillus macerans 1АМБ от условий культивирования, параметров выделения и очистки, разработана технология ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х На основании нового штамма продуцента термостабильной а-ЦГТ-азы, полученного путем скрининга, и экспериментально обоснованных зависимостей выхода а-ЦД от способов предварительной обработки крахмала, усовершенствована биотехнология получения а-ЦД В результате экспериментально выявленных условий включения веществ в полость а-ЦД, получены их комплексы с ароматическими веществами

Для экспериментального и теоретического обоснования путей создания биотехнологий а-ЦГТ-азы Г20Х, а-ЦД и получения комплексов включений на их основе, было произведено следующее

- Проведен скрининг микроорганизмов, выделенных из различных видов почв, и получен новый термостабильный (top, = 65°С) штамм продуцент с максимальной а-ЦГТ-азной активностью 37,0 едЦгА/см3

- На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, фи-зиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый галофильный штамм, продуцирующий а-ЦГТ-азу, идентифицирован как Paembacillus macerans 1024

- В результате изучения физиолого-биохимических особенностей штамма Paembacillus macerans 1024 определены оптимальный состав питательной среды и условия культивирования для максимального накопления в культу-ральной жидкости а-ЦГТ-азы.

- На основании определенных ранее зависимостей накопления а-ЦГТ-азы Paembacillus macerans 1АМБ в культуральной жидкости и выявления условий сохранения ее активности от параметров всех процессов разработана технологическая схема получения ферментного препарата а-ЦГТ-азы степени очистки Г20Х

- Изучены свойства а-ЦГТ-азы (термостабильность, рН-стабилыюсть, температурный и рН-оптимумы действия, аминокислотный состав белка, его молекулярная масса)

- В результате изучения поведения различных видов крахмалов в процессе обработки химическими, физическими и ферментативными методами усовершенствована биотехнология а-ЦД

- На основании установленных параметров процессов включения различных веществ в полость а-ЦД разработаны условия получения комплексов включений а-ЦД с кристаллическим ванилином и эфирным маслом апельсина и их применения в технологии кондитерских изделий

Практическая значимость и реализация результатов работы.

Расширена лабораторная коллекция кафедры «Биотехнология» МГУПП, за счет новых микроорганизмов секретирующих а-, и у-специфичные ЦГТ-азы Выделен новый термостабильный штамм продуцент а-ЦГТ-азы Paembacillus macerans 1024 Для нового штамма оптимизированы условия процесса культивирования Разработаны Лабораторный регламент получения а-ЦГТ-азы Г10Х и проект Технических условий на ферментный препарат а-ЦГТ-аза Г10Х Осуществлена наработка препаратов а-ЦГТ-аз Г10Х в условиях опытного производства НТЦ «Лекбио-тех» Полученные результаты подтверждены актом НТЦ «Лекбиотех»

Разработана технология получения ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х с использованием ранее выделенного штамма Paembacillus macerans 1АМБ Разработаны Лабораторный регламент получения а-ЦГТ-азы Г20Х и проект Технических

условий на ферментный препарат а-ЦГТ-аза Г20Х Осуществлена наработка препаратов а-ЦГТ-аз Г20Х в условиях опытных производств НТЦ «Лекбиотех» и ОАО «Биохиммаш» Полученные результаты подтверждены актами НТЦ «Лекбиотех» и ОАО «Биохиммаш». Усовершенствована биотехнология а-ЦД, составлен проект Технических условий на а-ЦД, произведена наработка препарата а-ЦД в условиях опытного производства НТЦ «Лекбиотех» (полученные результаты подтверждены актом НТЦ «Лекбиотех»)

Получены опытные партии комплексов включений а-ЦД с кристаллическим ванилином и эфирным маслом апельсина, прошедшие апробацию при изготовлении помадных конфет на кафедре «Технология кондитерского производства» МГУПП Полученные результаты подтверждены актом о приготовлении кондитерских изделий с добавлением в рецептуры комплексов включений

Штамм бактерий РаетЪасМт тасегат 1АМБ - продуцент а-ЦГТ-азы, защищен патентом РФ № 2303062

Проведен расчет экономической эффективности разработанных технологий а-ЦГТ-азы Г20Х и а-ЦД, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне мировых рыночных цен и составляет 1039,1 рублей за 1 кг Цена а-ЦД при этом составляет 656,6 рублей за 1 кг. Апробация работы.

Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах Всероссийской научно-технической выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2005), на Третьем международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 2006), V юбилейной школе-конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2007), на Международной научно-практической конференции «Биотехнология Вода и пищевые продукты» в рамках московского международного конгресса «Биотехнология- состояние и перспективы развития» (Москва, 2008)

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 1 патент РФ, где отражены основные положения диссертации

Структура н объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 208 наименований, 13 при-

ложений Работа изложена на 221 странице компьютерного текста, включает 56 рисунков и 42 таблицы

Краткое содержание работы

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследований, показана научная новизна и практическая значимость результатов исследований

1. Обзор литературы

Литературный обзор включает в себя общие представления о ЦГТ-азах и ЦД строение и свойства, реакции катализируемые ферментами, способы получения циклических олигосахаров Описано и обосновано практическое применение препаратов ЦГТ-аз и ЦД в пищевой промышленности Проанализирована проблема отсутствия промышленного производства ЦГТ-аз и ЦД в России

2. Экспериментальная часть

2 1 Объекты, материалы и методы исследований

Объекты исследований: микроорганизм-продуцент а-ЦГТ-азы из коллекции кафедры «Биотехнология» МГУПП, штамм Paenibacillus macerans 1АМБ с максимальной а-ЦГТ-азной активностью 50,0 едЦгА/см3, новый термостабильный штамм-продуцент а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024 с максимальной а-ЦГТ-азной активностью 37,0 едЦгА/см3 и температурным оптимумом действия 65°С

Образцы почв: в качестве природных источников изолятов бактерий использовались образцы почв Москвы, Московской, Дмитровской и Тульской областей

Методы определения активностей: а-ЦГТ-азы - метод Мякеля-Лааксо (М J Makela, S V Laakso, 1988), метод Тильдена-Хадсона (Tilden Е В , Hudson С S , 1942, Терехова Е Я , 1999), бета-ЦГТ-азы - фенолфталеиновый метод (Усанов Н Г , 2005) Анализ продуктов ферментативной конверсии крахмалов проводили в Центре «Биоинженерия» РАН методом ВЭЖХ на колонке «ИНг-диасфер» со средним диаметром частиц 5 мкм, размером 4,6 х 250 мм Неподвижная фаза колонки - с размерами частиц 5,1 мкм, подвижная фаза - ацетонитрил . бидистиллированная вода (70.30), объем вводимой пробы - 80 мкл, скорость элюции - 0,8 см3/мин , скорость ленты - 10 см/ч

Поддержание температур в диапазоне от 30 до 100°С для определения активностей ЦГТ-аз проводилось в ультратермостате - «LKB Bromma 2209 Multitemp»

Ультрафильтрация проводилась на установке «Amicon Ni 2000» с использованием мембран типа УПМ (фирма «Владипор») различной селективности

Сушка препаратов проводилась на лиофильной сушильной установке «Crist Alpha 1-2»

Источник ультразвука, ультразвуковая ванна ПСБ-1335-05 с частотой

35 кГц

Электрофорез проводили на приборе Mini Protein II (Вю-Rad)

Хроматографические носители (гидрофобная, аффинная хроматографии)

TSK-гель бутил-тойоперл (Toyo Soda Со , Япония), агароза, сефароза 4В (Pharmacia Biotech, Швеция)

Питательные среды, используемые для проведения идентификации микроорганизмов были предоставлены ФГУП ГНЦ ПМ, г Оболенск- ПС№ 1-12,14-23 ПС№13 «Бедная среда для выявления спор» (Состав среды,%• а-ЦД-0,1, К2НРО4-0,1; Na2HP04-0,l, кукурузный экстракт-0,3, агар-2,5, рН 7,1), ПС№24 «Жидкая питательная среда для культивирования в качалочных колбах» для продуцента Рает-bacillus macerans 1АМБ (Состав питательной среды,%• крахмал растворимый-1,0, декстрины-0,5, пептон-0,3, дрожжевой экстракт-0,5, (NH4)2HP04-0,2, СаСОз-0,5), ПС№25 «Питательная среда с а-ЦД» (Состав питательной среды, % а-ЦД-1,0, кукурузный экстракт-0,3, дрожжевой экстракт-0,3, агар-2,0), ПС№ 26 «Картофельный агар» (картофельный отвар +2% агара)

В работе использовали ферментные препараты а - амилазы с известной активностью Ликвамил-1200 Л, ООО «Русфермент»,150 едАС/см3, Амилопротоори-зин, ГНУ ВНИИПБТ, 150 едАС/см3, Термостабильная амилаза, фирма «Алкотех», 630 едАС/см3, Ликвамил, ГНУ ВНИИПБТ, 2250 едАС/ см3

Для получения комплексов включений использовали ароматические вещества ванилин (ГОСТ 16599-71), эфирное масло апельсина (ТУ 9151-019-570232162004)

Исследования проводились не менее чем в трех повторностях, использовались средние значения Обработку результатов экспериментов проводили с применением программы Excel 2003 Microsoft Office

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1 Скрининг ЦГТ-активных культур микроорганизмов из природных мест обитания.

Известно, что действие ЦГТ-аз на крахмалсодержащие субстраты в начале подобно действию фермента а-амилазы, в результате которого реакционная смесь содержит разветвленные и линейные декстрины различной длины, некоторые примеси Также известно, что при увеличении температуры субстрата процесс деградации

крахмала идет значительно быстрее, но не каждый фермент может работать при высоких температурах Ранее на кафедре «Биотехнология» МГУГ111 был получен штамм Paembacillus macérons 1АМБ, обладающий высокой а-ЦГТ-азной активностью (50 едЦгА/см3), но рабочая температура действия а-ЦГТ-азы - 40°С Поэтому, частью данных исследований явился скрининг микроорганизмов-продуцентов термостабильных а-ЦГТ-аз

Скрининг микроорганизмов проводился согласно модифицированной нами схеме, разработанной ранее сотрудниками Института биологии Уфимского научного центра РАН В процессе работы из 38 почвенных образцов были обнаружены (с помощью йодного теста) и выделены 1243 изолята, осуществляющих деструкцию крахмала Для обнаружения ЦГТ-азной активности культуральную жидкость микроорганизмов, выращенных глубинным способом на питательной среде состава ПС№24, подвергали модифицированному тесту Тильдена-Хадсона и определяли активность по методу Мякеля-Лааксо. Исследования показали, что лишь в 4-х изоля-тах обнаружилась активность а-ЦГТ-азы

Результаты определения а- и Р-циклизующих активностей ЦГТ-аз в культураль-ных жидкостях испытанных культур микроорганизмов представлены в табл 1

Таблица 1

а- и Р-циклизующие активности культур микроорганизмов, выращенных глубинно на ПС№24

№ культуры Активность а-ЦГТ-азы, едЦгА/см3 Активность р-ЦГТ-азы, едЦгА/см3 Специфичность

106 26,3 следы преимущественно а-ЦГТ-аза

234 20,1 2,8 преимущественно а-ЦГТ-аза

1024 35,0 следы преимущественно а-ЦГТ-aja

1037 18,7 8,7 а-ЦГТ-аза и бета-ЦГТ-аза

Для дальнейших исследований был выбран один лучший бактериальный штамм (№1024), продуцирующий а-ЦД Р-ЦД у-ЦД в соотношении 65 30 5 (рис 1), показавший хорошие результаты по тесту Тильдена-Хадсона при 60-65°С.

Рис 1 Определение специфичности ЦГТ-азы штамма 1024 методом ВЭЖХ 2.2.2. Исследование фенотипических признаков бактериального штамма 1024.

При определении родовой и видовой принадлежности бактерий штамма 1024 была учтена совокупность морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков

Морфологические особенности клеток штамма 1024 клетки палочковидные, размером 0,2-0,3x3,0-5,0 мкм через 24 ч инкубации при 37°С, подвижные, грамва-риабельные, образуют эндоспоры Спорообразование терминальное и субтерминальное, споры расширяют материнскую клетку булавовидно

Культуральные особенности штамма 1024 колонии круглые, диаметр колоний от 1 до 3 мм, поверхность гладкая с глянцевым блеском, непрозрачная на богатых средах, прозрачная на бедных средах. Цвет колоний молояно-бежевый, молочно-желтый. Профиль колоний изогнутый, структура колоний однородная Особенности роста штриха четко видный (четкий, сплошной на богатых средах, состоящий из отдельных колоний на бедных средах) Проявляется способность роста на 15% NaCl, следовательно, исследуемый штамм является галофильным

Морфологические и культуральные признаки штамма позволяют предположить, что исследуемый микроорганизм относится к роду Paembacillus Образование пленки на жидких средах и слизистая консистенция культуры на твердых агаризованных средах характерна для вида macerans

Физиолого-биохимические признаки исследуемого штамма, такие как- отрицательная реакция Фогес-Проскауэра, разжижение желатины, каталазная активность, потребление сахаро-спиртов и углеводов, определенно указывают на принадлежность данного микроорганизма к роду Paembacillus 2 2.3. Филогенетические особенности бактериального штамма 1024.

По данным сиквенса 16S ribosomal RNA и проведенного поиска гомологичных последовательностей при помощи BLAST'a (http //www nebt nlm nth gov/BLASTA

было построено филогенетическое дерево, показавшее, что целевой штамм с точностью 96% относится к роду РаетЬааЦия виду тасегапз

На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, фи-зиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый галофилышй штамм, продуцирующий а-ЦГТ-азу, идентифицирован как Рае-шЬасгИиз тасегапз 1024

2.2 4. Подбор питательной среды, оптимальной для хранения, поддержания и культивирования микроорганизма РаетЬааНия тасегапя 1024.

По данным, полученным после 6-ти месячного хранения культуры Р тасегапз 1024 при 1=4°С (табл 2), были выявлены оптимальные для храпения и поддержания питательные среды- стерильная почва (природная среда обитания), «бедная» питательная среда (ПС№13), картофельный агар (ПС№26)

Таблица 2

Остаточная активность а-ЦГТ-азы Р тасегат 1024 после хранения

в течение 6 мес при температуре 4°С на средах различного состава

Активность Активность

Питательные среды а-ЦГТ-азы, а-ЦГТ-азы,

едЦгА/см3 в % от начальной*

ПС№1 (МПА) 26,7 76,3

ПС№8 (Тиогликолевая среда) 8,2 23,4

ПС№10 (ГРМ) 25,9 74,0

ПС№11 (Агар Олькеницкого-ГРМ) 22,5 64,3

ПС№13 («бедная» питательная среда) 35,0 100,0

ПС№25 (Питательная среда с а-ЦД) 33,2 94,9

ПС№26 (картофельный агар) 34,8 99,4

Стерильная почва 34,4 98,3

"Исходная активность а-ЦГТ-азы 35,0 едЦгА/см''

Для поддержания чистоты культуры прекрасно подходят следующие питательные среды ГРМ с 15% NaCl (ПС№17), среда с а-ЦД (элективная среда) с добавлением антибиотика цефотаксима

Дальнейшие исследования были направлены на конструирование оптимальной жидкой питательной среды для культивирования штамма Р macerans 1024 За основу была взята питательная среда ПС№24 (Строева С С , 2006) С помощью метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта был установлен состав оптимальной питательной среды, обеспечивающий максимальную циклизующую активность - 37,0 едЦгА/см3 Основное отличие состава новой питательной среды от состава питательной среды, используемой для культивирования штамма Р macerans

1АМБ в замене дорогостоящего растворимого крахмала более дешевым, нерастворимым.

Состав оптимальной питательной среды (ПС№27),%: крахмал нерастворимый-2,0; дрожжевой экстракт - 0,3; кукурузный экстракт - 0,5; (МН4)2НР04 - 0,1; СаС03-0,5.

2.2.4.1. Подбор оптимальных условий культивирования микроорганизма

Paenibacillus macerans 1024.

Изучение влияния рН питательной среды на рост культуры P. macerans 1024 и накопление ею активности а-ЦГТ-азы в культуральной жидкости показало, что оптимальное значение рН среды после стерилизации 7,0-7,5.

Проведенные исследования позволили установить, что наибольшую активность а-ЦГТ-азы в культуральной жидкости - 37,2 едЦгА/см^ и наибольший титр - 10X108 кл/см3 обеспечивает использование посевного материала P. macerans 1024 в возрасте 34 ч., в количестве 7% от объема питательной среды.

Динамика биосинтеза биомассы и фермента а-ЦГТ-азы бактериями P. macerans 1024 на оптимизированной по составу питательной среде (ПС№27) представлена на рис.2.

Активность а-ЦГТ-азы, едЦгА/см5; биомасса, г/дм' 40

РН

24 48 72

активность а-ЦГТ-азы

время, ч

Iffîti биомасса

-рН

Рис.2. Динамика биосинтеза биомассы и фермента а-ЦГТ-азы бактериями

Р. тасегапэ 1024 на оптимизированной по составу питательной среде Установлено (рис.2), что а-ЦГТ-аза синтезируется после накопления биомассы бактериями Р. тасегат 1024 (72 ч.), а максимум ее активности в культуральной жидкости приходится на 84 ч. роста (температура 30±2°С, рН 7,0-7,5).

2 2.5. Определение физико-химических свойств а-ЦГТ-азы культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1024

ЦГТ-азы, продуцируемые различными штаммами, имеют различный температурный оптимум действия Так, оптимум действия а-ЦГТ-азы штамма Р macerans ВКМ 506 - 55°С, а а-ЦГТ-азы Р macerans 1АМБ - 40°С (Строева С С , 2006) Для нового штамма Р macerans 1024 необходимо было определить температурный оптимум действия фермента а-ЦГТ-азы, т к степень и быстрота деградации крахмала в значительной степени зависят от температуры реакционной среды Ферментативный гидролиз крахмала проводили при различных значениях температуры реакционной смеси в течение 1ч Активность определяли по методу Мякеля-Лааксо Результаты исследований показали, что температурный оптимум действия а-ЦГТ-азы Р macerans 1024 составляет 65°С.

Для сравнения температурной стабильности а-ЦГТ-аз Р macerans 1АМБ и Р macerans 1024, культуральные жидкости выдерживали 60 мин при температуре 70СС Каждые 15 мин отбирали пробы и определяли остаточную активность а-ЦГТ-азы Результаты исследований представлены в табл 3

Таблица 3

Стабильность а-ЦГТ-аз Р macerans 1024 и Р macerans 1АМБ при температуре 70°С

Время, мин а-ЦГТ-аза Р macerans 1АМБ а-ЦГТ-аза Р macerans 1024

Остаточная активность, едЦгА/см3 % от исходной активности фермента Остаточная активность, едЦгА/см3 % от исходной активности фермента

Исходные значения 57,6 100 38,0 100,0

15 39,4 68,4 37,0 97,3

30 36,7 63,7 36,1 95,0

45 30,3 52,6 33,2 87,3

60 25,0 43,4 32,5 85,5

Остаточная активность а-ЦГТ-азы Р macerans 1024 выше остаточной активности Р macerans 1 АМБ на 30 %

По результатам исследований, рН оптимум действия а-ЦГТ-азы Р macerans 1024-6,2

2 2.6. Разработка технологии получения ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х из культуральной жидкости продуцента Paenibacillus macérons 1АМБ. 2.2.6.1. Разработка условий ультрафильтрации для очистки и концентрирования фермента а-ЦГТ-азы штамма Paenibacillus macerans 1АМБ.

К биологически активным препаратам, в частности ферментам, предназначенным для применения в пищевой промышленности, применяются жесткие требования, а именно высокое содержание активного белка и отсутствие посторонних примесей Поэтому, одной из целей данной работы явилась разработка технологии очищенного ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х

Для реализации поставленной задачи использовался штамм-продуцент а-ЦГТ-азы Р macerans 1АМБ с циклизующей активностью 50едЦгА/см3 Микроорганизм культивировали на питательной среде ПС№24 в колбах V=750 см3 на качалочной установке (t=30°C, рН 7,0) в течение 72 ч при 180об/мин Объем питательной среды - 100см3, посевная доза - 5%, титр - 1Я109 кл/см3 (Строева С С , 2006)

Для очистки и концентрирования отфугованной (20мин, п=13500 об/мин) культуральной жидкости продуцента Р macerans 1АМБ, применялась ультрафильтрация (Р=0,35 МПа, t= 20±1°С) на установке «Amicon Ni 2000» с поверхностью фильтрации 0,018 м2, с мембранами различной селективности УПМ-20, УПМ-50, УПМ-67 По окончании процесса ультраконцентрат (УК) лиофилыю высушивали на установке «Crist Alpha 1-2»

Таблица 4

Влияние селективности мембраны на выход активного белка и степень

очистки ферментного препарата а-ЦГТ-азы

Выход ФП с Удельная Активность а- Выход актив-

1дм3 культу- активность, ЦГТ-азы, едЦ- ности а-ЦГТ-

Мембрана ральной едЦгА/мг бел- гА/г препара- азы в

жидкости, г ка та УК, %

УПМ-67 1,25 119,79 682,80 19,26

УПМ-50 3,20 257,49 2433,30 22,54

УПМ-20 10,33 322,03 3020,00 83,50

При испытании мембран УПМ-50 и УПМ-67 (табл 4) активность а-ЦГТ-азы распределилась таким образом, что максимум ее наблюдался в УК, следовательно, использование таких мембран не целесообразно При использовании мембраны УПМ-20, выход активности а-ЦГТ-азы в УК составил 83,5% Использование мембран с меньшей пропускающей способностью было не целесообразным, так как из-за маленького размера пор скорость фильтрации резко снижалась

Для изучения влияния давления на скорость ультрафильтрации, концентрирование культуральной жидкости Р тасегапя 1АМБ осуществляли при различных рабочих давлениях (0,2-0,6 МПа), кратность концентрирования по объему ш=5 Анализ полученных данных показал, что при увеличении давления до 0,35 МПа, наблюдалось увеличение скорости фильтрации При рабочем давлении выше 0,35 МПа скорость ультрафильтрации оставалась неизменной за счет концентрационной поляризации у поверхности мембраны в процессе переноса растворителя через мембрану Таким образом, для дальнейших исследований было выбрано оптимальное давление воздуха 0,35 МПа.

Проведенные исследования позволили достичь оптимальной степени концентрирования культуральной жидкости Р тасегапБ 1АМБ по объему - 5, коэффициента очистки - 3,28, коэффициента концентрирования по активности - 4,96, скорости фильтрации - 6,82 дм3/(м2ч)

2.2 6.2. Разработка условий получения спиртоосажденного ферментного препарата а-ЦГТ-азы РаетЬасШия тасегапь 1АМБ.

Метод осаждения ферментов водорастворимыми органическими растворителями в нашей стране широко применяется в промышленных масштабах

Органический растворитель, используемый для осаждения ферментов, должен полностью смешиваться с водой и не связываться с ферментом Наиболее широко в микробиологической промышленности с этой целью используют этанол, ацетон, реже изопропанол (Грачева И М ,2000) Именно эти растворители были выбраны для настоящих исследований

Осаждение ЦГТ-аз проводили из УК, охлажденного до 4-6°С этанолом, ацетоном или изопропанолом, охлажденными до 0-3°С, в различных соотношениях Реакционную смесь выдерживали при температуре 4-6 °С в течение 20 мин, затем подвергали ультрацентрифугированию В отделенных осадках определяли а-, р-ЦГТ-азные активности и содержание белка По результатам исследований, наиболее предпочтительным осаждающим агентом, позволяющим получить максимальный выход ферментного препарата (ФП) а-ЦГТ-азы (0,95 г/100см3), является этанол с концентрацией 75 % об (соотношение УК этанол =14) Этот осадитель обеспечивает выход по а-ЦГТ-азной активности 3060 едЦгА/г (табл 5)

Установлено, что осаждение необходимо проводить при рН 7,0 - 7,5, что соответствует естественному значению рН УК культуральной жидкости Р тасегат 1АМБ (табл 5)

Таблица 5

Влияние природы органического растворителя на активность осажденного ФП а-ЦГТ-азы Г20Х Р macerans 1АМБ

№ п/п Растворитель Содержание белка в осадке, м г/см3 А-ЦГТ-азная активность, едЦгА/г А-ЦГТ-азная удельная активность, едЦгА/мг белка

1 Этанол, 75 %об 9,80 3060,00 312,24

2 Ацетон 9,10 2465,00 270,88

3 Изопропанол 9,30 2810,00 302,15

Полученный ФП подвергался лиофильному высушиванию В результате, был получен ФП со следующими характеристиками СВ - 92%, общий белок - 9,44 мг/г, активность а-ЦГТ-азы - 3040 едЦгЛ/г, активность Р-ЦГТ-азы - 0,7 едЦгА/г

Физико-химические свойства ФП а-ЦГТ-аза Г20Х стабилен в пределах рН 5,5-7,0, оптимальные параметры действия - рН 6,2,1= 40°С Полученный ФП препарат отвечает требованиям СанПиН 2 3 2 1293-03 по микробиологическим показателям

2 2.7. Разработка хроматографнческнх приемов очистки а-ЦГТ-азы.

Для получения высокоочищенного гомогенного фермента а-ЦГТ-азы Р тас-егапз 1АМБ в данной работе были использованы два вида хроматографии гидрофобная и аффинная

Выбор гидрофобной хроматографии был обусловлен возможностью нанесения культуральной жидкости на носитель бутил-тойоперл 650 без предварительной трудоемкой подготовки По результатам предварительных исследований, предпочтение при выборе элюента было оказано раствору Ыа2804

После нанесения на колонку и промывки уравновешивающим буфером (Ыа-ацетатный буфер, рН 7,0) белки элюировали в ступенчатом градиенте концентрации Ка2804 от 0 до 0,5 М в буфере По окончании процесса, фракции были подвергнуты ВЭЖХ анализу для определения активности а-ЦГТ-азы а-ЦГТ-аза элюировалась в буферном растворе, содержащем 0,5 М ТМа2504

Основным достоинством аффинной хроматографии является ее высокая селективность, позволяющая извлекать из смеси разделяющих веществ компоненты, представленные в очень малых количествах (Волкова Д А , 2000)

В качестве сорбента применяли гель (эпоксиактивированная сефароза), содержащий 90 мМ а-ЦД/см3 геля На колонку, предварительно уравновешенную

0,1 М N а-ацетатным буфером, рН 7,0, наносили культуральную жидкость. После нанесения и промывки уравновешивающим буфером, сорбированную а-ЦГТ-азу элюировали 0,1 М Ыа-ацетатным буфером (рН 7,0) сначала не содержащим а-ЦД, а I потом с а-ЦД (5 мМ). В первом случае в растворе, выходящем из колонки, а-ЦГТ-азы обнаружено не было. Во втором - происходила десорбция а-ЦГТ-азы. Методом ВЭЖХ анализа было установлено, что при такой очистке соотношение выхода а- и р-ЦД из крахмала, характеризующее специфичность ЦГТ-азы, смещалось в сторону большего образования а-ЦД.

При сравнении двух вышеуказанных процессов очистки а-ЦГТ-азы Р. тасег-ат 1АМБ следует отметить, что использование гидрофобной хроматографии позво-| ляет увеличить а-специфичность фермента (выход а-ЦД при конверсии крахмала таким препаратом составляет 90% от общего количества ЦД). Использование аффинной хроматографии приводит к увеличению а-специфичности ЦГТ-азы до 95%.

Для определения молекулярной массы фермента был использован диск-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).

Электрофорез в ПААГ проводили в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-Ка) и меркаптоэтанола с целью наилучшего растворения труднорастворимых белков. Полученные электрофореграммы представлены на рис.3.

Рис. 3. Электрофореграмма а-ЦГТ-азы очищенной с помощью аффинной (I) и гидрофобной (II) хроматографии в денатурирующих условиях.

Где: f - Фильтрат исходной культуральной жидкости; 2 - Очищенная ЦГТ-аза (пик ЦД); 3 -Очищенная ЦГТ-аза (проскок ЦД); 4,5 - Белки - маркеры молекулярных масс: 14,4 кДа, 21,5 кДа, 31,0 кДа, 45,0 кДа, 66,2 кДа, 97,0 кДа (ООО «Хеликон»); 6 - Очищенная ЦГТ-аза (0 М Na2S04); 7 - Очищенная ЦГТ-аза (0,15 М Na2S04); 8 - Очищенная ЦГТ-аза (0,35 М Na2S04); 9 -Очищенная ЦГТ-аза (0,5 М Na2S04).

Первая электрофореграмма (I) показала наличие одной белковой полосы (позиция 2). На второй электрофореграмме (II) имеются те же белковые полосы, находящиеся 7, 8 и 9 позициях - 0,15М, 0,35М и 0,5М Na2S04 соответственно. По элек-

11

97,0 «к 66.2

45,0 р.

1234 56789

трофореграммам была определена молекулярная масса а-ЦГТ-азы Р macerans 1АМБ равная ЗбкДа

2.2.8. Разработка условий ферментативной конверсии крахмала в а-ЦД.

Обоснование выбора крахмалосодержащего субстрата для биотехкологического получения ЦД обычно проводят по критериям, оценивающим технологичность приготовления концентрированных растворов (вязкость, реологические свойства), а также выход из них ЦД в реакции ферментативной трансформации, происходящей под действием ЦГТ-азы (Усанов, 1999).

Для исследования способности крахмалов различного типа образовывать клейстер в процессе термообработки были испытаны 3 типа крахмала 1 крахмал картофельный, высший сорт «Картошечка» (ООО «Си-Продукт»), ГОСТ 7699-78, 2 кукурузный крахмал «Лидер прайс», 3 крахмал - индикатор (водорастворимый, чда, ТУ 2638-025-00334735-96 «Лаверна»)

2% растворы исследуемых крахмалов прогревали до температуры, заданной условиями опыта (70-120°С), выдерживали 30 мин , охлаждали до 50°С и измеряли вязкость с помощью капиллярного вискозиметра ВПЖ-1

Крахмал-индикатор, представляющий собой уже предобработанный, частично «разрушенный» крахмал, в условиях опытов клейстер не образовывал Вязкость кукурузного крахмала была существенно ниже картофельного, и повышалась при ужесточении режима термообработки Картофельный крахмал оказался наиболее предпочтительным, т к он начинал образовывать вязкие растворы и переходить в клейстер уже в результате 30 мин обработки при температуре 70°С При 90°С вязкость раствора была максимальной — 27,235 * 10"4м2/с

Результаты исследований по определению выхода а-ЦД из различных видов крахмалов под действием а-ЦГТ-азы Р macerans 1АМБ показали, что выход а-ЦД при ферментативной конверсии картофельного крахмала составил 12% (от теоретически возможного, в пересчете на АСВ субстрата), кукурузного крахмала - 9,6% Следовательно, картофельный крахмал является наиболее приемлемым субстратом для получения а-ЦД, причем, марка картофельного крахмала не оказывает существенного влияния на результаты

Для выбора способа разжижения растворов картофельного крахмала были исследованы следующие методы предобработки кислотный гидролиз, обработка ультразвуком (УЗ), ферментативный гидролиз (ФП а-амилазы, а-ЦГТ-аза Р macerans 1024, а-ЦГТ-аза Р macerans 1АМБ, водная солодовая вытяжка)

Степень деполимеризации крахмала, косвенно связана с величиной декстроз-ного эквивалента (ДЭ), значение которого не должно превышать 1-2%, т к при более высоких значениях ДЭ выход ЦД снижается (Кушакова Е Е , 1990г)

0,1 н и 0,5н НС1 хорошо разжижали растворы крахмального клейстера, при этом ДЭ увеличивался незначительно (до 0,7%) 0,5н HCI при прочих равных условиях действовала быстрее 0,1н НС1

В процессе обработки крахмального клейстера УЗ вязкость снижалась, и, уже после 35 мин обработки, составляла 27,2* ЮЛЛс ДЭ увеличивается незначительно даже после 4 ч обработки УЗ, его значение составляло 0,8%

Наилучшие результаты при обработке крахмальных клейстеров препаратами а-амилаз были получены при использовании ФП Ликвамил (ГНУ ВНИИПБТ) в концентрации 0,1 едАС/г крахмала (ДЭ=1% за 20 мин )

Получение а-ЦД возможно по схеме с использованием и для разжижения крахмала и для синтеза ЦД только а-ЦГТ-аз, при этом величина ДЭ не является показателем разжижения, т к параллельно процессу разжижения идет реакция образования ЦД (Кушакова Е Е , 1990)

Разжижение 5% крахмального клейстера вели 1ч при оптимальных условиях для действия а-ЦГТ-аз Р macérons 1АМБ Г20Х (t=40°C, рН 6,2) и Р macerans 1024 Г10Х (t=65°C, рН 6,2), в концентрациях от 0,5 до 2,5 едЦгА/см3

Таблица 6

Влияние дозировок а-ЦГТ-аз Р macerans 1024 и Р macerans 1АМБ на

вязкость 5% раствора крахмального клейстера

Дозировка а-ЦГТ-азы, едЦгА/г крахмала ЦГТ-аза Р macerans Г 024 ЦГТ-аза Р macerans 1АМБ

Вязкость, * 10"1 м2/с

0,5 8,56 14,70

1,0 3,45 10,32

1,5 2,97 8,20

2,0 2,43 4,44

2,5 2,42 4,44

При использовании для разжижения крахмального клейстера а-ЦГТ-азы Р macerans 1АМБ вязкость реакционной смеси снижалась медленнее из-за низкой температуры - всего 40 °С (табл 6) Оптимальной для разжижения 5% крахмального клейстера является дозировка а-ЦГТ-азы Р macerans 1024 2 едЦгА/г крахмала

Для определения выхода а-ЦД из картофельного крахмала (разжиженного различными методами) под действием а-ЦГТ-азы Р macerans 1АМБ 5%-ные растворы картофельного крахмала, были предобработаны различными способами ФП Ликва-мил (0,1едАС/г АСВ крахмала), 0,1н и 0,5н НС1, УЗ, солодовой вытяжкой (9 едАС/г АСВ крахмала) и а-ЦГТ-азой Г10Х Р macerans 1024 (2 едЦА/г АСВ крахмала) до получения субстанций с близкими реологическими свойствами (рН 6,2) Синтез а-ЦД из полученных декстринов проводили с помощью а-ЦГТ-азы Г20Х Р macerans 1АМБ, в оптимальной концентрации 5 едЦгА/г крахмала, при 40°С в течение 24 ч Наибольший выход а-ЦД был получен при использовании для предобработки крахмального клейстера а-ЦГТ-азы Г10Х Р macerans 1024 (8,4 г/дм3)

В дальнейшем для увеличения выхода а-ЦД исследовалась комбинированная обработка раствора крахмального клейстера УЗ и ФП

Установлено, что при последовательной предобработке крахмального клейстера УЗ и а-ЦГТ-азой Г10Х Р macerans 1024, можно достичь увеличение выхода а-ЦД на 50-60% (по сравнению с использованием для циклизации не предобработан-ного крахмального клейстера)

Таким образом, анализируя результаты ферментативной конверсии крахмала в а-ЦД, можно сделать следующие выводы предобработку крахмального клейстера целесообразно вести в два этапа.

1 Обработка с помощью УЗ, частотой 35 кГц в течение 25 мин при 60°С,

2 Обработка а-ЦГТ-азой Г10Х Р macerans 1024, из расчета 2 едЦгА/г крахмала, при 65°С в течение 40 мин , рН 6,2

Синтез а-ЦД следует проводить с использованием а-ЦГТ-азы Г20Х Р macerans 1АМБ, из расчета 5 едЦгА/г крахмала в течение 24 ч , при t=40°C, рН 6,2 Выход а-ЦД при выбранных условиях составляет 28% от АСВ крахмала 2.2.9. Получение комплексов включений с а-ЦД.

Вещества, определяющие вкус и аромат пищи, часто не стабильны и разлагаются Комплексообразование с ЦД приводит к стабилизации ароматических веществ и специй Сухие концентраты комплексов ЦД с пищевыми компонентами достаточно стабильны и хорошо растворимы в водной среде

Ванилин очень часто используется в кондитерской отрасли в качестве вкусо-ароматической добавки Кристаллический ванилин плохо растворим в воде (до 1%), в этаноле его растворимость составляет порядка 5 %, поэтому, подбор растворителя ванилина, в зависимости от области применения, достаточно сложный и трудоемкий процесс. Комплексообразование с а-ЦД позволяет увеличить растворимость ванилина в несколько раз по сравнению с кристаллическим состоянием Для образова-

ния комплекса ванилина с а-ЦД, полученным нами по предложенной схеме (рис 4), ванилин смешивали с 30% водным раствором а-ЦД в различных соотношениях (от 1 8 до 1 20) Полученную суспензию подвергали УЗ обработке на установке ПСБ-1335-05 с рабочей частотой 35кГц в течение 20 мин О комплексообразовании судили по остаточным СВ в растворе и микроскопированием образцов суспензии

ТП Приготовление 1 1 суспензии 5% крахмала

ТП 2 1

Подготовка УЗ-установки

ТП 3 1

Подготовка о-ЦГТ-азы Р macérons 1024

ТП Подготовка 41 теплоносителя

ТП 5 1

Подготовка се-ЦГТ-азы Р macérons 1АМБ

ТП Подготовка 7 1 глюкоамилазы

ТП 3

ТП 1 Приготовление крахмального клейстера 30 мин, t»90°C, рН 6,2

ТП 2 УЗ предобработка крахмального клейстера 25 мин, 1=90°С, 35кГц

Г

Предобработка крахмального клейстера а-ЦГТ-азой Р macérons 1024 в дозировке 2 едЦгА/г крахмала, 40 мин, рН 6,2, t «=65°С

ТП 4 Термообработка клейстера 0,1 МП а, 10 мнн

1

ТП 5 Циклизация 24 ч., Г»40°С, а-ЦГТ-аза в дозировке 5 едЦгА/г крахмала, рН 6,2

1 Г

ТП 6 Инактивация cf-ЦГТ-азы кипячением в течение 10 мин

1

ТП 7 Обработка реакционной смеси глюкоамилазой, 5 ед/г крахмала

I

ТП 8 Инактивация глкжоамилазы кипячением в течение 20 мин

1 '

ТП 9 Лиофильное высушивание препарата ск-ЦГТ-азы

Готовый препарат о-ЦЦ на склад

Рис 4 Двухступенчатая схема получения а-ЦД Результаты исследований показали, что при изменении соотношения ванилин а-ЦД от 1 20 до 1 12, содержание СВ в реакционной смеси не изменялось и состав-

ляло 30%, т к весь добавляемый ванилин включался в полость а-ЦД, и не увеличивал содержания СВ в растворе При дальнейшем снижении соотношения ванилин а-ЦД, происходило увеличение количества СВ, что объясняется присутствием в реакционной смеси свободного, не включенного в полость а-ЦД ванилина Следовательно, оптимальным соотношением ванилин а-ЦД является 1.12.

Полученный прозрачный раствор комплекса высушивали при 50°С Выход водорастворимого препарата ванилина составил 88% от исходного количества а-ЦД, максимальная растворимость препарата - 14 г/100см3 Микроскопирование 3-х мазков (а-ЦД, ванилин, образовавшийся комплекс) подтвердило образование комплекса кристаллы ЦЦ исчезли, их заменила аморфоподобная масса

В кондитерском производстве, также, имеется потребность в использовании в качестве ароматизатора эфирного масла апельсина, которое не применяется в настоящее время

Получение комплекса а-ЦД с эфирным маслом апельсина осуществляли путем их совместного растирания при периодическом увлажнении реакционной смеси Комплекс включения образуется при оптимальном соотношении эфирное масло апельсина а-ЦД равном 1 4 Полученный комплекс высушивали при 50°С Выход водорастворимого комплекса а-ЦД с эфирным маслом апельсина составил 90% от исходного количества а-ЦД В высушенном виде комплекс практически не имел запаха Микроскопирование подтвердило образование комплекса кристаллы а-ЦД исчезли, их заменила аморфоподобная, слегка желтоватая масса При растворении 0,001 г комплекса в воде появляется характерный запах апельсина Максимальная растворимость полученного комплекса составила 66 г/100 см3

Полученные таким образом комплексы могут быть использованы в кондитерской отрасли, в частности при изготовлении жевательной резинки, карамельной и помадной массы

2 2.10. Применение полученных комплексов а-ЦД с ванилином и эфирным маслом апельсина при изготовлении кондитерских изделий.

Полученные опытные партии комплексов включений а-ЦД с кристаллическим ванилином и эфирным маслом апельсина прошли апробацию на кафедре «Технология кондитерского производства» МГУПП при изготовлении кондитерских изделий конфет «Помадка сливочная», «Помадка сахарная» Оптимальной концентрацией комплекса «а-ЦД - ванилин» для внесения в традиционную рецептуру конфет «Помадка сливочная» является 0,2 г/1000 г готового изделия, комплекса «а-ЦД -эфирное масло апельсина» для внесения в традиционную рецептуру конфет «Помадка сахарная» - 0,12 г/1000 г готового изделия

Применяемые комплексы не требуют изменения технологического процесса, не оказывают негативного влияния на форму, структуру и консистенцию данных кондитерских изделий, но улучшают вкус и аромат продукции, повышают качество получаемых кондитерских изделий, увеличивают сроки хранения. Так, согласно экспериментальным данным, введение комплекса «а-ЦД - эфирное масло апельсина» в традиционную рецептуру конфет «Помадка сливочная», продлевает срок хранения этих коиди герских изделий в 2 раза по сравнению с контролем

Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии а-ЦГТ-азы Г20Х, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне мировых рыночных цен и составляет 1039,1 рублей за 1 кг, цена а-ЦД ниже рыночных цен и составляет 656,6 рублей за 1 кг

Выводы

1 Проведенный скрининг микроорганизмов, выделенных из природных источников, позволил отобрать новый термостабильный штамм 1024 с а-ЦГТ-азной активностью 37,0 едЦгА/см3

2 Изучение совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических характеристик исследуемого микроорганизма, подтвердило отношение галофильного бактериального штамма-продуцента а-ЦГТ-азы, к роду Paenibacillus виду macerans

3 Проведен сиквенс 16S ribosomal RNA и построено филогенетическое дерево, с точностью 97% подтверждающее идентификацию бактериального штамма 1024 как Paenibacillus macerans 1024

4 На основании анализа экспериментальных данных сконструирован оптимальный состав питательной среды и подобраны условия культивирования, обеспечивающие максимальное накопление фермента термостабильной а-ЦГТ-азы штаммом Paenibacillus macerans 1024 в лабораторных условиях

5 Разработаны оптимальные условия выделения и очистки а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ методом ультрафильтрации с использованием мембраны УПМ-20 фирмы «Владипор», осаждением этанолом (соотношение объемов 75% этанол УК = 4 1)

6 На основе разработанного Лабораторного регламента проведена наработка препаратов а-ЦГТ-азы Г10Х штамма Paenibacillus macerans 1024 с активностью 2550 едЦгА/г (оптимум действия препарата pH 6,2, t = 65° С) в условиях опытного производства НТЦ «Лекбиотех» Полученные результаты подтверждены актом НТЦ «Лекбиотех» Составлен проект Технических условий на ФП а-ЦГТ-аза Г10Х штамма Paenibacillus macerans 1024

7 На основе разработанного Лабораторного регламента проведена наработка препаратов а-ЦГТ-азы Г20Х штамма Paembacillus macerans 1АМБ с активностью 3040 едЦгА/г (оптимум действия препарата pH 6,2, t = 40° С) в условиях опытных производств НТЦ «Лекбиотех» и ОАО «Биохиммаш» Полученные результаты подтверждены актами НТЦ «Лекбиотех» и ОАО «Биохиммаш» Составлен проект Технических условий на ФП а-ЦГТ-аза Г20Х штамма Paembacillus macerans 1АМБ

8 Изучены свойства фермента а-ЦГТ-азы Paembacillus macerans 1АМБ (термо-и pH-стабильность, pH- и температурный оптимумы действия), определены аминокислотный состав и молекулярная масса фермента а-ЦГТ-азы (36 кДа)

9 Опытным путем определены оптимальные условия ферментативной био-

трансформации крахмала в а-ЦД, обеспечивающие увеличение выхода целевого продукта на 50-60% по сравнению с непредобработанным сырьем (в качестве субстрата целесообразно использовать раствор крахмального клейстера, предобработанный последовательно с помощью УЗ и а-ЦГТ-азы Paembacillus macerans 1024, синтез а-ЦД следует вести с использованием а-ЦГТ-азы Paembacillus macerans 1АМБ) Составлены Технические условия на а-ЦД, произведена наработка препарата а-ЦД в условиях опытного производства НТЦ «Лекбиотех» (полученные результаты подтверждены актом)

10 Разработаны условия, согласно которым наработаны комплексы включения а-ЦД с кристаллическим ванилином и эфирным маслом апельсина, успешно прошедшие апробацию на кафедре «Технология кондитерского производства» МГУПП при изготовлении помадных конфет Полученные результаты подтверждены актом

Список публикаций

1 Иванова Л.А , Кузнецова О.В., Комбарова С П , Петкиева О С Способы получения и свойства очищенных циклодекстринглюканотрансфераз из различных источников// Сборник докладов молодых ученых МГУПП III Юбилейная международная выставка-конференция «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации»Ч II - M МГУПП, 2005 - С 3-5

2 Иванова Л А , Комбарова С П , Кузнецова О.В , Строева С С Влияние различных источников углерода на биосинтез а-циклодекстринглюка-нотрансферазы бактериями Bacillus sp 1АМБ// Хранение и переработка сельхозсырья 2006, №8-С 48-50

3 Иванова JT А , Комбарова С П , Кузнецова О В., Строева С С Разработка условий культивирования нового штамма Bacillus sp 1АМБ-продуцента а-циклодекстринглюканотрансферазы// В кн Микробные биокагализаторы для перерабатывающих отраслей АПК Сб научных трудов ВНИИПБТ - M 2006 - С 56-63

4 Иванова Л А , Комбарова С П , Кузнецова О В., Строева С С Циклодекст-рины и их применение в пищевой промышленности// В сб докладов IV Международной научно-практической конференции «Технологии и продукты здорового питания», ч II - M 2006 - С 53-57

5 С С Строева, О В. Кузнецова, Л А Иванова, С П Комбарова Исследование фенотипических признаков и идентификация штамма продуцента а-ЦГТ-аз// В сб трудов IV международной выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» ч II - M МГУПП, 2006 - С 4-6

6 О.В. Кузнецова, С С Строева, Л А Иванова, С П Комбарова Подбор оптимальных условий осаждения ферментного препарата а-ЦГТ-азы, полученной при культивировании штамма-продуцента Paenibacillus macérons 1АМБ// В сб трудов IV международной выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» ч II - M . МГУПП, 2006-С 121

7 Иванова Л А , Строева С С , Кузнецова О.В., Комбарова С В , Усанов Ю Г , Варламов В П «Штамм бактерий Paenibacillus macerans продуцент а-циклодекстринглюканотрансферазы» Патент РФ № 2303062, зарегистрирован 20 07 2007, бюл №20

8 Кузнецова О.В., Иванова Л А , Дыкова H С Получение комплексов включений с а-циклодекстрином// В сб материалов V Международной научно-практической конференции «Технологии и продукты здорового питания», ч II - M 2007 - С 52-53

9 Кузнецова О.В., Иванова Л А Разработка хроматографических приемов очистки а-циклодекстринглюканотрансферазы Paenibacillus species 1024// В сб материалов V юбилейной международной школы-конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» - M МГУПП, 2007 - С 196-198

10 Кузнецова О.В, Шагина СЕ, Иванова JIA Разработка условий химико-ферментативной конверсии крахмала в а-циклодекстрины// Хранение и переработка сельхозсырья 2008, №1-С 17-19

11 JIA Иванова, О.В. Кузнецова, СЕ Шагина, С С Строева, КЮ Поляков Применение комплексов включений с а-циклодекстринами в кондитерской промышленности// В сб материалов Международной научно-практической конференции «Биотехнология Вода и пищевые продукты» в рамках московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития»-М 2008 -С 34

12 С Е Шагина, Э А Малахова, О.В. Кузнецова и др Комплекс включения витамина Е с p-циклодекстрином// Хранение и переработка сельхозсырья 2008, №3- С 53-56

13 Л А Иванова, О.В.Кузнецова, С С Строева, Н С Дыкова Энзиматическая трансформация крахмала в а-циклодекстрины// В кн Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях -М Пищепромиздат, 2008 -С 142-148

Сокращения: ЦГТ-аза - Циклодекстринглюканотрансфераза, ЦД - циклодек-стрин, ГРМ- гидролизат рыбной муки, ФП - ферментный препарат; ПС - питательная среда, УК - ультраконцентрат, ПААГ - полиакриламидный гель, УЗ -ультразвук, СВ - сухое вещество, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ЦгА - циклодекстринглюканотрансферазная активность, ДЭ -декстрозный эквивалент, равный отношению количества редуцирующих веществ к общему количеству углеводов, МПА - мясо-пептонный агар

Подписано в печать 21 05 08. Формат 30x42 1/8 Бумага типографская № 1 Печать офсетная Печ л 1,2 Тираж 120 экз Заказ 118 125080, Москва, Волоколамское ш, 11 Издательский комплекс МГУПП

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Фермент микробного происхождения - циклодекстринглюкано-трансфераза.

1.2. Циклодекстриногенные бактерии.

1.2.1. Paenibacillus macerans.

1.2.2. Bacillus circulans.

1.2.3. Алкалофильные бациллы.

1.2.4. Продуценты ЦГТ-азы, развивающиеся при нормальных значениях рН.

1.2.5. Термотолерантные циклодекстриногены.

1.2.6. Продуценты ЦГТ-аз, не относящиеся к порядку Bacillales.

1.3. Выбор продуктивного штамма для процессов получения ЦГТ-азы.

1.3.1. Источники культур.

1.3.2. Накопительные среды.

1.3.3. Дополнительный анализ выделенных штаммов.

1.4. Питательные среды для культивирования микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз.

1.4.1. Источники углерода.

1.4.2. Источники азота.

1.4.3. Источники фосфора.

1.5. Физико-химические свойства бактериальных ЦГТ-аз.

1.6 Структура ЦГТ-аз.

1.7. Реакции катализируемые ЦГТ-азами.

1.7.1. Реакция циклизации.

1.7.2. Реакция диспропорционирования.

1.7.3. Реакция связывания.

1.7.4. Гидролитическая (декстринизирующая) активность.

1.7.5. Суммарная схема реакции.

1.8. Методы выделения и очистки ЦГТ-аз.

1.8.1. Ультрафильтрация.

1.8.2. Осаждение органическими растворителями.

1.8.3 .Высаливание.

1.9. Хроматографические методы очистки ЦГТ-аз.

1.9.1. Гидрофобная хроматография.

1.9.2. Ионообменная хроматография.

1.9.3. Металлохелат аффинная хроматография.

1.9.4. Аффинная хроматография. Синтез аффинных сорбентов с использованием ЦД.

1.10. Строение, свойства, методы получения ЦД и комплексов включений.

1.10.1. Строение ЦД.

1.10.2. Свойства ЦД.

1.10.3. Методы получения ЦД.

1.10.3.1. Типы субстратов для получения ЦД.

1.10.3.2. Методы предобработки субстратов.

1.10.4. Комплексы-включения с ЦД.

1.10.4.1. Получение комплексов в водных растворах ЦД.

1.11. Применение ЦД в пищевой промышленности.

ГЛАВА 2.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Объекты, материалы и методы исследований.

2.1.1. Объект исследования.

2.1.2. Питательные среды.

2.1.3. Крахмал, используемый для циклизации.

2.1.4. Ферментные препараты.

2.1.5. Ароматические вещества, используемые для получения комплексов включений с а-ЦД.

2.1.6. Препарат а-ЦД.

2.1.7. Приборы.

2.1.8. Методы.

2.1.8.1. Определение вязкости растворов крахмала.

2.1.8.2. Определение РВ по методу Шомодьи-Нельсона.

2.1.8.3. Определение декстрозного эквивалента.

2.1.8.4. Определение белка по методу Лоури.

2.1.8.5. Определение содержания влаги в образцах навесок исследуемого вещества.

2.1.8.6. Методы определения ферментативных активностей.

2.1.8.6.1. Качественное определение а-ЦГТ-азной активности методом Тильдена-Хадсона.

2.1.8.6.2. Количественный метод определения активности а-ЦГТ-азы.

2.1.8.6.3. Определение амилолитической активности фотоколориметрическим методом.

2.1.8.6.4. Измерение активности р-ЦГТ-азы фенолфталеиновым методом.

2.1.8.6.5. Определение протеолитической активности (модифицированный метод Ансона).

2.1.8.7. Концентрирование культуральной жидкости методом ультрафильтрации.

2.1.8.8. Осаждение ферментов органическими растворителями.

2.1.8.9 Получение лиофилизированных ферментных препаратов.

2.1.8.10. Электрофорез.

2.1.8.10.1. Изучение степени чистоты фермента с помощью диск-электрофореза.

2.1.8.11. Диализ.

2.1.8.12. Методы определения физико-химических параметров а-ЦГТ-азы.

2.1.8.12.1. Определение рН-стабильности а-ЦГТ-азы.

2.1.8.12.2. Определение термостабильности а-ЦГТ-азы.

2.1.8.12.3. Определение рН - оптимумов действия а-ЦГТ-азы.

2.1.8.12.4. Определение температурного оптимума действия а-ЦГТ-азы.

2.1.8.12.5. Определение влияния ЭДТА и ионов металлов на активность а-ЦГТ-азы.

2.1.8.12.6. Определение аминокислотного состава белка.

2.1.8.13. Хроматографические методы очистки а-ЦГТ-азы.

2.1.8.13.1. Гидрофобная хроматография.

2.1.8.13.2. Синтез аффинных сорбентов а-ЦД - сефароза 4В.

2.1.8.13.3. Аффинная хроматография а-ЦГТ-азы.

2.1.8.14. Определение ЦД методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.!.

2.1.9. Оптимизация состава питательной среды с использованием метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта.:.

2.1.10. Рецептура кондитерских изделий (конфеты «Помадка сахарная» и «Помадка сливочная»), приготовленных с добавлением комплексов включений.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1 Скрининг ЦГТ-активных культур микроорганизмов из природных мест обитания.

2.2.2. Исследование фенотипических признаков бактериального штамма 1024.

2.2.3. Филогенетические особенности штамма 1024.

2.2.4. Питательные среды, оптимальные для культивирования, поддержания и хранения микроорганизма Paenibacillus macerans 1024.

2.2.4.1 .Хранение и поддержание культуры Paenibacillus macerans 1024.

2.2.4.2. Выращивание культуры Paenibacillus macerans 1024 на жидких питательных средах.

2.2.4.3. Изучение влияния рН исходной питательной среды на биосинтез а-ЦГТ-азы бактериями Paenibacillus macerans 1024.

2.2.4.4. Разработка способа получения посевного материала.

2.2.4.5. Изучение динамики биосинтеза фермента а-ЦГТ-азы бактериями Paenibacillus macerans 1024 на оптимизированной по составу питательной среде.

2.2.5. Определение физико-химических свойств неочищенной а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024.

2.2.5.1.Определение рН-стабильности а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans

1024.

2.2.5.2.Определение рН-оптимума а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans

1024.

2.2.5.3.Определение температурного оптимума действия а-ЦГТ-азы

Paenibacillus sp. 1024.

2.2.5.4. Определение температурной стабильности а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024.

2.2.6. Разработка технологии получения ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х из культуральной жидкости продуцента Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.6.1.Подбор условий удаления балластных веществ из культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.6.2.Разработка условий ультрафильтрации для очистки и концентрирования культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.6.2.1 .Подбор мембраны для проведения процесса ультрафильтрации культуральной жидкости.

2.2.6.2.2. Влияние рабочего давления на процесс ультрафильтрации культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.6.2.3. Влияние степени концентрирования раствора а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ на процесс ультрафильтрации.

2.2.6.3. Разработка условий получения осажденного ФП а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.6.3.1.Исследование влияния концентраций различных органических растворителей на выход препарата а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.6.3.2. Влияние различных концентраций этанола (об%) на выход препарата а-ЦГТ-азы из УК.

2.2.6.3.3. Влияние рН на осаждение а-ЦГТ-азы из УК культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.6.4. Лиофилизация препарата а-ЦГТ-азы.

2.2.6.5. Исследование физико-химических характеристик ФП а-ЦГТ-азы Г20Х.

2.2.6.5.1 Г20Х.

2.2.6.5.2 Г20Х.

2.2.6.5.

Определение рН-оптимума действия препарата а-ЦГТ-азы

Определение рН-стабильности препарата а-ЦГТ-азы

Определение температурного оптимума действия препарата а-ЦГТ-азы Г20Х.

2.2.6.5.4. Определение термостабильности препарата а-ЦГТ-азы Г20Х.

2.2.6.6.Изучение динамики изменения а-ЦГТ-азной активности в процессе биоконверсии крахмала в а-ЦД.

2.2.6.7. Анализ микрофлоры ФП а-ЦГТ-азы Г20Х.

2.2.7. Разработка хроматографических приемов очистки а-ЦГТ-азы.

2.2.7.1. Влияние ионов металлов и этилендиаминтетраацетата на активность а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.7.2. Очистка а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ с использованием гидрофобной хроматографии.

2.2.7.3. Очистка а-ЦГТ-азы с использованием аффинной хроматографии.

2.2.7.4 Изучение свойств а-ЩТ-азыPaenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.7.4.1. Определение молекулярной массы фермента.

2.2.7.4.2. Определение аминокислотного состава белка высокоочищенного препарата а-ЦГТ-азы.

2.2.8. Разработка условий ферментативной конверсии крахмала вальфа-ЦД.

2.2.8.1. Исследование поведения 2% растворов крахмала различного типа в процессе термообработки.

2.2.8.2. Определение выхода а-ЦЦ из различных видов крахмалов под действием а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.8.3. Исследование поведения картофельных крахмалов различных марок в процессе термообработки.

2.2.8.4.Выбор метода разжижения для приготовления концентрированных растворов картофельного крахмала.

2.2.8.4.1. Химический гидролиз крахмала.

2.2.8.4.2. Предобработка крахмала ультразвуком.

2.2.8.4.3. Ферментативная предобработка крахмала в биотехнологии ЦД.

2.2.8.4.3.1.Предобработка крахмала ферментными препаратами а-амилаз.

2.2.8.4.3.2. Предобработка крахмала солодовой вытяжкой.

2.2.8.4.3.3. Предобработка крахмала а-ЦГТ-азами.

2.2.8.5.Определение выхода а-ЦД из картофельного крахмала, предобработанного различными методами под действием а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ.

2.2.8.6. Интенсификация процесса получения ЦД с использованием комплексной предобработки крахмала.

2.2.8.6.1. Последовательная предобработка крахмального клейстера УЗ и а-ЦГТ-азами {Paenibacillus macerans 1024 и Paenibacillus macerans 1АМБ).

2.2.8.7. Лабораторная двухступенчатая схема получения а-ЦД с использованием УЗ и а-ЦГТ-азы Г10Х Paenibacillus macerans 1024 для предобработки крахмального клейстера и а-ЦГТ-азы Г20Х Paenibacillus macerans 1АМБ для циклизации.

2.2.9. Получение комплексов включений ароматических веществ с а-ЦД.

2.2.9.1 Получение комплекса включения а-ЦД с - кристаллическим ванилином.

2.2.9.2 Получение комплекса включения а-ЦД с эфирным маслом апельсина.

2.2.10. Апробация комплексов включений ароматообразователей с а-ЦД в технологии помадных конфет.

2.2.10.1.Приготовление кондитерских изделий по традиционной технологии с применением комплексов включений.

2.2.10.2. Характеристика кондитерских изделий при хранении.

Актуальность темы.

Циклодекстрины (ЦД) относятся к классу углеводов, точнее олигосахаридов, получаемых ферментативным путем из крахмала. Являясь представителями одного гомологического ряда, они различаются количеством звеньев глюкозы в макроциклах, и обозначаются буквами греческого алфавита -а, (3, у, 5 и т.д. в сторону увеличения длины кольца.

Для биохимической трансформации крахмала в ЦД используется фермент, циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТ-аза), относящийся к подклассу микробных трансфераз (К.Ф.2.4.1.19), а именно, к циклизующим трансферазам, осуществляющим реакцию переноса и присоединения остатков Сахаров на -ОН группы других Сахаров.

Молекулы ЦД имеют гидрофильную внешнюю поверхность (обусловливающую хорошую растворимость циклических олигосахаридов в воде) и сквозную гидрофобную полость, по своим размерам сопоставимую с величиной многих органических и неорганических соединений. Последние, попадая в растворы ЦД, проникают в полость, остаются там, удерживаемые силами гидрофобных и других взаимодействий, и меняют свои физико-химические свойства: нерастворимые субстанции становятся растворимыми, обладающие горьким вкусом - безвкусными, пахучие - лишенными запаха, летучие - нелетучими, а нестабильные - стабильными. Вследствие уникального строения ЦД широко используются за рубежом в самых различных отраслях промышленности. В пищевой промышленности они применяются для введения в рецептуры пищевых продуктов витаминов и ароматических веществ, повышая их растворимость в воде.

Среди ведущих компаний на мировом рынке ЦД бесспорное первенство принадлежит китайским, японским (Hayashibara Biochem. Lab., Rikagaku Kenkyusho, Hako Co, Kikkoman Corp. и др.) и американским фирмам (Corn Products Сотр., СРС Intern. Inc., American Maize Techn. Inc., Genetics Inst, и др.) Наиболее дешевым продуктом является бета-ЦД промышленного производства, доступный по ценам от 7 до 25 долларов США за килограмм, а а - и у-ЦД, имеют себестоимость (и, соответственно, цену) в десятки раз более высокую.

В России производство ЦД отсутствует, поэтому, разработка научно-обоснованных, высокоэффективных биотехнологий ЦГТ-аз и ЦД является актуальной проблемой.

Решению задач получения очищенного микробного ферментного препарата а-ЦГТ-азы, разработки биотехнологии ЦД и комплексов включений на их основе посвящена данная работа.

Цели и задачи исследования.

Основные цели диссертационной работы состояли в разработке технологии ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х с использованием штамма-продуцента Paenibacillus macerans 1АМБ, изучении его свойств и интенсификации биотехнологии а-ЦД на его1 основе с последующим получением комплексов включений с ароматическими веществами. Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

- скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора термостабильного а-ЦГТ-активного штамма. Идентификация штамма-продуцента а-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его культуральных, морфологических, физиолого-биохимических и филогенетических особенностей;

- подбор оптимального состава питательной среды и условий культивирования с целью накопления максимальной активности а-ЦГТ-азы;

- разработка технологии получения ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х;

- изучение свойств фермента а-ЦГТ-азы;

- интенсификация биотехнологии а-ЦД;

- получение комплексов включений а-ЦД с ароматическими веществами и апробация полученных комплексов в технологии кондитерских изделий.

Работа выполнялась в рамках государственного контракта с Федеральным Агентством по науке и инновациям от 28 марта 2005 г № 02.434.11.3007 по теме: ЖС-12.4/004 «Ферментные системы и технологии получения цикло-декстринов».

Научная новизна работы.

На основе анализа данных, полученных экспериментальным путем, выявленных зависимостей накопления а-ЦГТ-азной активности штаммом Paenibacillus macerans 1АМБ от условий культивирования, параметров выделения и очистки, разработана технология ферментного препарата а-ЦГТ-зы Г20Х. На основании полученного путем скрининга нового штамма, продуцента термостабильной а-ЦГТ-азы, и экспериментально обоснованных зависимостей выхода а-ЦД от способов предварительной обработки крахмала, усовершенствована биотехнология получения а-ЦД. В результате экспериментально выявленных условий включения веществ в полость а-ЦД,, получены комплексы а-ЦД с ароматическими веществами.

Для экспериментального и теоретического обоснования путей создания биотехнологий а-ЦГТ-азы Г20Х, а-ЦД и получения комплексов включений на их основе, было произведено следующее:

- Проведен скрининг микроорганизмов, выделенных из различных видов почв, и получен новый термостабильный (topt = 65°С) штамм продуцент с о максимальной а-ЦГТ-азной активностью 37,0 едЦгА/см .

- На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый галофильный штамм, продуцирующий а-ЦГТ-азу, идентифицирован как Paenibacillus macerans 1024.

- В результате изучения физиолого-биохимических особенностей штамма Paenibacillus macerans 1024 определены: оптимальный состав питательной среды и условия культивирования для максимального накопления в культуральной жидкости а-ЦГТ-азы.

- На основании определенных ранее зависимостей накопления а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ в культуральной жидкости и выявления условий сохранения ее активности от параметров всех процессов разработана технологическая схема получения ферментного препарата а-ЦГТ-азы степени очистки Г20Х.

- Изучены свойства а-ЦГТ-азы (термостабильность, рН-стабильность, температурный и рН-оптимумы действия, аминокислотный состав белка, его молекулярная масса).

- В результате изучения поведения различных видов крахмалов в процессе обработки химическими, физическими и ферментативными методами усовершенствована биотехнология а-ЦЦ.

- На основании установленных параметров процессов включения различных веществ в полость а-ЦД разработаны условия получения комплексов включений а-ЦД с кристаллическим ванилином и эфирным маслом апельсина и их применения в технологии кондитерских изделий.

Практическая значимость и реализация результатов работы.

Расширена лабораторная коллекция кафедры «Биотехнология» МГУПП, за счет новых микроорганизмов секретирующих а-, р- и у-специфичные ЦГТ-азы. Выделен новый термостабильный штамм продуцент а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024. Для нового штамма оптимизированы условия процесса культивирования. Разработаны Лабораторный регламент получения а-ЦГТ-азы Г10Х и Технические условия на ферментный препарат а-ЦГТ-азу Г10Х. Осуществлена наработка препаратов а-ЦГТ-аз со степенью очистки 10Х в условиях опытного производства НТЦ «Лекбиотех». Полученные результаты подтверждены актом НТЦ «Лекбиотех».

Разработана технология получения, ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х с использованием ранее выделенного штамма Paenibacillus macerans 1АМБ. Разработаны Лабораторный регламент получения а-ЦГТ-азы Г20Х и Технические условия на ферментный препарат а-ЦГТ-азу Г20Х. Осуществлена наработка препаратов а-ЦГТ-аз со степенью очистки 20Х в условиях опытных производств НТЦ «Лекбиотех» и ОАО «Биохиммаш». Полученные результаты подтверждены актами НТЦ «Лекбиотех» и ОАО «Биохиммаш».

Усовершенствована биотехнология а-ЦД. Разработаны Технические условия на а-ЦД. Получена опытная партия препарата а-ЦД в условиях опытного производства НТЦ «Лекбиотех» (результаты подтверждены актом).

Разработаны Технические условия на комплексы включения а-ЦД с кристаллическим ванилином и эфирным маслом апельсина. Комплексы включения успешно прошли апробацию при изготовлении опытных партий кондитерских изделий на кафедре «Технология кондитерского производства» МГУПП. Полученные результаты подтверждены актом о приготовлении кондитерских изделий с добавлением в рецептуры комплексов включений.

Штамм бактерий Paenibacillus macerans 1АМБ - продуцент а-ЦГТ-азы, защищен патентом РФ № 2303062.

Проведен расчет экономической эффективности разработанных технологий а-ЦГТ-азы Г20Х и а-ЦД, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне мировых рыночных цен и1 составляет 1039,1 рублей за 1 кг. Цена а-ЦД при этом составила 656,6 рублей за 1 кг.

Апробация работы.

Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Всероссийской научно-технической выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2005); на Третьем международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 2006); V юбилейной школе-конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2007); на Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» в рамках московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2008).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 1 патент РФ, где отражены основные положения диссертации.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 208 наименований, 13 приложений. Работа изложена на 221 странице компьютерного текста, включает 56 рисунков и 42 таблицы.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:

1. Проведенный скрининг микроорганизмов, выделенных из природных источников, позволил отобрать новый термостабильный штамм 1024 с а-ЦГТ-азной активностью 37,0 едЦгА/см .

2. Изучение совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических характеристик исследуемого микроорганизма, подтвердило отношение галофильного бактериального штамма-продуцента а-ЦГТ-азы, к роду Paenibacillus виду macerans.

3. Проведен сиквенс 16S ribosomal RNA и построено филогенетическое дерево, с точностью 97% подтверждающее идентификацию бактериального штамма 1024 как Paenibacillus macerans 1024. :

4. На основании анализа экспериментальных данных сконструирован оптимальный состав питательной среды и подобраны условия культивирования, обеспечивающие максимальное накопление фермента термостабильной а-ЦГТ-азы штаммом Paenibacillus macerans 1024 в лабораторных условиях.

5. Разработаны оптимальные условия выделения и очистки а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ: методом ультрафильтрации с использованием мембраны УПМ-20 фирмы «Владипор»; осаждением этанолом (соотношение объемов 75% этанол: УК = 4:1).

6. На основе разработанного Лабораторного регламента проведена наработка препаратов а-ЦГТ-азы Г10Х штамма, Paenibacillus macerans 1024 с активностью 2550 едЦгА/г (оптимум действия препарата: рН 6,2; t = 65° С) в условиях опытного производства НТЦ «Лекбиотех». Полученные результаты подтверждены актом НТЦ «Лекбиотех». Составлен проект Технических условий на ФП а-ЦГТ-аза Г10Х штамма Paenibacillus macerans 1024.

7. На основе разработанного Лабораторного регламента проведена наработка препаратов а-ЦГТ-азы Г20Х штамма Paenibacillus macerans 1АМБ с активностью 3040 едЦгА/г (оптимум действия препарата: рН 6,2; t 40° С) в условиях опытных производств НТЦ «Лекбиотех» и ОАО «Биохиммаш». Полученные результаты подтверждены актами НТЦ «Лекбиотех» и ОАО «Биохиммаш». Составлен проект Технических условий на ФП а-ЦГТ-аза Г20Х штамма Paenibacillus macerans 1АМБ.

8. Изучены свойства фермента а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ (термо- и рН-стабильность, рН- и температурный оптимумы действия), определены аминокислотный состав и молекулярная масса фермента'а-ЦГТ-азы (36 к Да).

9. Опытным путем определены оптимальные условия ферментативной биотрансформации крахмала в а-ЦД, обеспечивающие увеличение выхода целевого продукта на 50-60% по сравнению с непредобработанным сырьем (в качестве субстрата целесообразно использовать раствор крахмального клейстера, предобработанный последовательно с помощью УЗ и а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024; синтез а-ЦД следует вести с использованием а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ). Составлены Технические условия на а-ЦД, произведена наработка препарата а-ЦД в условиях опытного производства НТЦ «Лекбиотех» (полученные результаты подтверждены актом).

10. Разработаны условия, согласно которым наработаны комплексы включения а-ЦД с кристаллическим ванилином и эфирным маслом апельсина, успешно прошедшие апробацию на кафедре «Технология кондитерского производства» МГУ 1111 при изготовлении помадных конфет. Полученные результаты подтверждены актом.

1. РОСТ 12575-86 Сахар. Методы определения редуцирующих веществ.

2. ГОСТ 16599-71 Ванилин. Технические условия.

3. ГОСТ 20264.1-89 Препараты ферментные. Методы определения органолептических, физико-химических и микробиологических показателей.

4. ГОСТ 4570-93 Конфеты. Общие технические условия.

5. Абелян В.А. Циклодекстрины: Получение и применение.- Ереван: Изд. Дом «Ван-Арьян», 2001.- 519 с.

6. Авторское свидетельство SU 1738852 А1. Штамм бактерий Bacillus sp. -продуцент бета-циклодекстринтрансферазы. Усанов Н.Г., Логинов О.Н., Мелентьев А.И., 1990.

7. Авторское свидетельство SU 18143313. Штамм бактерий Bacillus stearothermophilus продуцент циклодекстрингликозилтрансферазы и способ получения альфа-циклодекстрина. Абелян В.А. и др., 1989.

8. Авторское свидетельство РФ 2244742. Метод выделения и селекции микроорганизмов-продуцентов циклодекстринглюканотрансфераз, штамм продуцент Bacillus circulans В-65, 2005.

9. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М.: Наука, 1985.- 196 с.

10. Болдырев А.А. Матриксная функция биологических мембран.// Соросовский образовательный журнал, 2001, №7, с. 2-8.

11. П.Бутова С.Н., Типисева И.А., Эль-Регистан Г.И. Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ. М.:Элевар, 2003. - 554с.

12. Вокк Р. А., Пейпман Э.М. Биосинтез и применение циклодекстринглюканотрансферазы.//В. кн.: Биосинтез ферментовмикроорганизмами. Тезисы докладов 4 всесоюзной конференции.-Ташкент, 1988.- с. 187-188.

13. Волкова Д. А. Получение и изучение свойств высокоочищенной циклодекстринглюканотрансферазы из Bacillus sp.1070,модифицированных Р-циклодекстринов и комплексов включения на их основе.-Дисс.1санд.тех.наук.-М.:МГУПП, 2000.-100с.

14. М.Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применения. М. :МИР, 2002. - 590с.

15. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии. -М.:ДеЛи принт, 2004. 144с.

16. Грачев Ю.П., Плаксин Ю.М. Математические методы планиерования экспериментов. -М.: ДеЛи принт, 2005.- 296 с.

17. Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С. и др. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов.-М.:Легкая и пищевая промышленность, 1982.-240с.

18. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов.-М.: Элевар, 2000.-512 с.

19. Громов Б.В. Поведение бактерий.//Соросовский образовательный журнал ,1997, №6.- с. 28-32.

20. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. Учебник для студ. Биол. специальностей вузов. 4-е изд., стер. - М.:Издательский центр «Академия», 2003. - 464с.

21. Дерябин Д.Г. Функциональная морфология клетки. Учебное пособие. — М.:Книжный дом «Университет», 2005. 320с.

22. Димитриади Г.Г. О числе пар объектов, связанных отношением Парето-доминирования //Институт системного анализа РАН. Электронный журнал «Исследовано в России», 2000.

23. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв.- М.: Книжный дом «Университет», 2002.

24. Досон Р., Элиот Д. и др. Справочник биохимика. -М.:МИР; 1991. 543с.

25. Иванова Л.А., Войно Л1И. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по технологии белковых препаратов, аминокислот и липидов.- М.: Издательский комплекс МГУ1111, 1985. 42 с.

26. Иванова Л.А., Войно Л.И. и др. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по дисциплине «Технология биоконверсии растительного сырья». — М.гИздательский комплекс МГУПП, 2002. -66с.

27. Иванова Л.А. и др. Ферментные системы и технологии получения циклодекстринов.//В мире науки, 2006, №11, с. 37-41.

28. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. — М.:ДеЛи принт, 2002. — 336с.

29. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.:Высшая школа. 2000. - 479с.

30. Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия: Учебник для ВУЗов. — М.:Дрофа,2004. 640с.

31. Компанцева Е.В., Гаврилин М.В., Ботезат-Белый Ю.К. и др. Исследование взаимодействия циклодекстринов с кортексонолом.//Хим.-фарм.,1990, т.2, с.81-82. ,

32. Кошелева Т. В. Разработка технологии ферментативного синтеза циклодекстринов. -Дисс. канд. тех. наук.- М., 1991. 160 с.

33. Крамер Ф. Соединения включения.//пер. с немецкого. -М.: Издательство иностранной литературы, 1958.- 169с.

34. Купянская В.Н. Получение и исследование соединения включения облепихового масла с бета-циклодекстрином.//Вестник ВГУ.Серия: Химия. Биология. Фармация. 2004, №2, с.222-224.

35. Кушакова Е.Е. Разработка технологии высокоочищенной цикло-декстринглюканотрансферазы из Bacillus macerans 506.- Дисс. канд. тех. Наук.-М.:МГУПП, 1990.-181 с.

36. Логинов О. Н. Физиолого-биохимические свойства представителей вида Bacillus macerans продуцентов циклодекстринглюканотрансфераз. Дисс. канд. биол. наук.- Киев, 1991.- 106 с.

37. Лопатин С.А., Варламов В.П., Рогожин С.В. Хроматографическое изучение участков связывания микробных рибонуклеаз с хелатированными ионами металлов.//Биотехнология, 1989, Т. 5(2).- с 183188.

38. Лопатин С.А., Варламов В.П., Даванков В.А. Лигандообменная хроматография белков и ферментов.//Биоорганическая химия, 1990, Т. 16(6).-с 725-750.

39. Мосичев М.С., Складнев А.А., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств. — М. .'Легкая пищевая промышленность, 1982. 264с.

40. Ноздрина В.А. Методические указания к выполнению курсового проекта на тему «Основные вопросы организации производства и планирования на предприятиях микробиологической промышленности» М: Издательский комплекс МГУПП, 1998.-18 с.

41. Определитель бактерий Берджи./ под ред. Дж. Хоулта и др. 9-е изд. В 2-х томах. -М.: МИР, 1997.48.0стерман Л.А. Хроматография> белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.-536 с.

42. Панова И.Г., Герасимов В.И., Топчиева И.Н. Структурообразование в системе а-циклодекстрин-полиэтиленоксид-вода.//ВМС сер.Б, Т.40(10), 1998, с. 1681-1686.

43. Папель К.Э., Дихтярев С.И., Сугробова Н.П. Особенности получения ЦД и образование комплексов включения. В кн.: Итоги науки и техники, сер. Микробиология. Циклодекстрины.- М., 1988, 21, с. 74-12751 .Патент РФ № 2244742, кл С 12 N 1/20, 2000.

44. Патент США № 6184001. Thermostable cyclodextrin glycosyl transferase and processes using it, 2001.

45. Патент США № 6472192. Cyclodextrin glycosyl transferases for producing gamma-cyclodextrin, 2002.

46. Патент США № 6960461. Gene coding for cyclodextrin glucanotransferase chiefly producing gamma -cyclodextrin and use thereof, 2005.

47. Патент США № 6924136. Cyclodextrin glucanotransferase and its method of manufacture, 2005.

48. Патент США № 6780624 B2. Glycosyl transferases for biosynthesis of oligosacchari-des, and genes encoding them, 2004.

49. Патент США № 6777215 B2. Cyclomaltodextrin glucano-transferase variants, 2004.

50. Патент США № 6570009. Region-selective method for preparing cyclodextrin C-6 monosulphonyl derivatives, 2003.

51. Патент США № 6482622. Amylolytic enzyme variants, 2002.

52. Патент ВОИС №01/90335. Nouvelle cyclodextrine glucanotransferase,tprocede de production de celle-ciet procede de production de cyclodextrine au moyen de cette enzyme, 2001.

53. Патент ВОИС №03/106502. Procede de production de dextrines au mouen d'enzymes, 2003.

54. Плохов А. Ю. Разработка биокаталитических процессов получения у-аминомасляной кислоты и (3-циклодекстрина. -Дисс. канд. тех. наук.-М., 1997.-111 с.

55. Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева JI.B. Определение активности ферментов. Справочник. М.:ДеЛи принт, 2003. - 375с.

56. Пруцакова Е.А., Терехова Е.Я., Усанов Н.Г. Измерение ферментативной активности ЦГТ-азы, К.Ф. 2.4.1.19.// Изучение и рациональное использование природных ресурсов. Тезисы докладов научной конференции.-Уфа, 1991.-е.108.

57. Райкис Б.Н., Пожарская В.О., Казиев А.Х. Общая микробиология свирусологией и иммунологией (в графическом изображении). Учебное пособие. М.:Тонада - X, 2002. - 352с.

58. Рис Э., Стернберг М. Введение в молекулярную биологию. М.:МИР, 2002. - 142с.

59. Романов А.С. Циклодекстрины — полифункциональные пищевые добавки. Кемерово :КТИПП, 1999.-147с.

60. Слюсаренко Т.П. «Лабораторный практикум по микробиологии пищевых прозводств». -М.: Легкая и пищевая пром., 1984.-208с.

61. Смирнова И.В., Кречетникова А.Н. Применение ультразвука в спиртовой1 промышленности.//Производство спирта и ликероводочных изделий.№2, 2004:- с.37-38.

62. Сто лет хроматографии.-М.:Наука, 2003.-744с.

63. Строева С.С. Выделение продуцента альфа-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы из природных источников и разработка технологии ферментного препарата на его основе. Дис.канд. тех. наук. — М.: МГУПП, 2006.- 218 с. '

64. С.Н.Сычев, В.А.Гаврилина, Р.С.Музалевская. Высокоэффективная жидкостная хроматография как метод определения фальсификации и безопасности продукции. -М.:Де Ли принт, 2005.-148с.

65. Терехова Е. Я. Выделение продуцентов бета-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы и получение ферментных препаратов на их основе. -Дисс. канд. тех. наук.-Уфа, 1999. 110 с.

66. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для ВУЗов. М.:Дрофа, 2004. - 256с.

67. Тырсин Ю.А., Иванова Л.А., Кривова А.Ю. Методические указания к выполнению лабораторных работ по курсу «Специальная биохимия».-М.: Издательский комплекс МГУПП, 1993.- 66 с.

68. Усанов Н.Г., Гильванова Е.А., Елизарьев Е.А., Мелентьев А.И. Новыйциклодекстрин-продуцирующий, штамм Paenibacillus campinasensis IB-417.//Ферменты микроорганизмов: структура, функция, применение:f

69. Сборник докладов XIII международ, конф. 4-8 апреля, 2005, Казань. — с.I87.88.

70. Усанов Н.Г., Логинов О.Н., Пруцакова Е.А., Терехова Е.Я. Получение бета-ЦД из картофельного крахмала./ Тезисы докладов Всесоюзной конференции. -Черновцы, 1991-т. 1-е. 122.а

71. Усанов Н.Г., Е.А. Гильванова, П.А. Елизарьев, Е.А. Пруцакова, А.И. Мелентьев. Усовершенствованный метод фотометрического определения активности бета-циклодекстринглюканотрансферазы.// «Прикладная биохимия и микробиология», 2006.-C.21-25.

72. Усанов Н.Г. «Цикл о декстрины: биотехнология и применение» В кн.: «Биотехнология биологически активных веществ»./Под редакцией д.б.н., проф. МГУПП И.М. Грачевой и д.т.н., проф. МГУПП Л.А. Ивановой. -М., изд. НПО «Элевар», 2006. с.89-121.

73. Фаллер Дж., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. М.:Бином 2003. -268с.

74. Циклодекстрины / Под ред. Егорова Н. С.- Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Серия Микробиология. 1988-1989. - Т. 20-21.

75. Шишкова Э.А., Войно Л.И. Методические рекомендации к выполнениюсамостоятельной работы по курсовому и дипломному проектированию1 t предприятий биотехнологической' промышленности. Ч.1.-М.:

76. Издательский комплекс МГУПП,2003.- 47 с.

77. Шлегель Г. Общая микробиология. -М.:МИР, 1987. 566с.t

78. Штейнман А.А. Циклодекстрины/ ЖВХО им. Менделеева, 1985, №5.- с. 34-38.

79. Щербаков В.Г. Биохимия: Учебник для ВУЗов. СП.б.:ГИОРД, 2003. -438с.

80. Borem Aluizio, Santos R. Fabricio, Bowen E. David. Understanding Biotechnology.//Prentice Hall PTR; US Ed edition. 2003. 220p.90:Anslyn V. Eric, Dennis A. Dougherty. Modern Physical Organic Chemistry.//University Science, 2005. ISBN 1-89138-931-9.

81. Bains William Biotechnology from A to Z.//Oxford University Press, USA; 3 edition. 2004. 424p.

82. Basic Biotechnology/ Colin Ratledge (Editor), Bjorn. Kristiansen (Editor)// Cambridge University Press, 2006.

83. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 1: The Archaea and the Deeply Branching and Phototrophic Bacteria. / George M. Garrity (Editor), David R. Boone (Editor)/ Springer; 2 edition, 2001, 721 p.

84. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2 (Parts А, В & С; Three-Volume Set) / George M. Garrity (Editor)/ Springer; 2 edition, 2005, 2816p.

85. Biotechnology The Science and the Business. / Derek G. Springham (Editor), Vivian Moses (Editor), Ronald E. Cape (Editor)/ CRC, 1999.

86. Biwer A., Antranikian G., Heinzle E. Mini-Review Enzymatic production of cyclodextrins.//Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002 Vol.59 p.609-617.

87. Bovetto L. J., Backer D. P., Villette J. R. et, al. Cyclomaltodextrin Glycosyltransferase from Bacillus circulans E 192. // Biotechnol. Appl. Biochem, 1992, V. 15, P. 48-58.

88. Bron, S., Meijer, W., Holsappel, S., Haima, P. Plasmid instability and molecular cloning kbBacillus subtilis.//Res.Microbiol. , 1992, V.142, p.875-883.

89. Buschmann. H.-J., Knittel D., Schollmeyer. E. New Textile Applications of Cyclodextrins.//Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2001, Vol.40 p. 169-172.

90. Copeland R.A. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. //Wiley-VCH, 2000, ISBN 0-47135-929-7.

91. Cyclodextrins and Their Complexes: Chemistry, Analytical Methods, Applications. / Helena Dodziuk (Editor)/ John Wiley & Sons, 2006, ISBN 352731-280-3.

92. De Pinto J. A, Campbell L. L. Purification and properties of the amylase of Bacillus macerans. // Biochemistry, 1968, V. 7, P. 114-120.

93. Deb. K. Multi-Objective Optimization Using Evolutionary Algorithms./ John Wiley, 2001.

94. Easton J. Christopher, Lincoln F. Stephen. Modified Cyclodextrins: Scaffolds and Templates for Supramolecular Chemistry.// World Scientific Publishing Company, 1999, ISBN 1-86094-144-3.

95. Egghe L., Rousseau R. A. Proposal to Define a Core of a Scientific Subject: A Definition Using Concentration and Fuzzy Sets. // Scientometrics. Vol'.54, No.l ,2002.-P.51-62.

96. Ehrlich, S.D. Replication and expression from Staphylococcus aureus in Bacillus subtilis. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 1977.-p. 1680-1682.

97. Ehrlich, S.D., Janniere L., Gruss A. Plasmid replication and structural stability in Bacillus subtilis. // Res. Microbiol., 1992, V.142,p. 869-873.

98. Felsenstein J. An alternating least squares approach to inferring phylogenies from pairwisedistances. //Syst Biol., 1998, V. 46, p. 101-111.

99. Fijiwara S., Kakihara H., Sakagichi K. et. al. Analysis mutation in cyclodextrin glucanotransferase form Bacillus stearothermophilus which affect cyclization characteristics and thermostability. //J. Bacteriol. 1992, V. 174, P. 7478-7481.

100. Fogarty W. M. Microbial amylases. //Microbial Enzymes and Biotechnology /Applied Science Publishers, Essex, U.K., 1983, P. 1-92.

101. Fromming K., Szejtli J. Cyclodextrins in Pharmacy (Topics in Inclusion Science) / Springer, 2006, ISBN 0-79232-139-1.

102. Fuwa, H.//J. Biochem (Tokyo), 1954. V.41. - P. 5.

103. Garces J.A., Gavin R.H. Using an inverse PCR strategy to clone large, contiguous genomic DNA fragments. //Methods Mol. Biol., 2001, V.161, p.3-8.

104. Glick Bernard R., Pasternak Jack J. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA.//ASM Press; 3rd edition, 2003. 760p.

105. Gryczan T.J., Dubnau D. Construction and properties of chimeric plasmids in Bacillus subtilis. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1978.-p. 1428-1432.

106. Guerout-Fleury M., Frandsen N., Stragier P. Plasmids for ectopic integration' in Bacillus subtilis. //Gene, 1996, v. 180; p.57—61.

107. Jamuna R., Saswathi N., Sheela R. et. al. Synthesis of cyclodextrin glycosyl transferase by Bacillus cereus for the production of cyclodextrins. // Appl. Biocem Biotechnol. 1993, V. 43, P. 163-176.

108. Janecek S. Tracing the evolutionary lineages among a- amylases and cyclodextrin glycosytransferases: the question of so-called 'intermediary' enzymes.//Biologia (Bratislava), 1995, 50: 515-522.

109. Janecek S. a-Amylase family: molecular biology and evolution.// Prog. Biophys. Mol. Biol., 1997, 67: 67-97.

110. Janecek S. Structural features and evolutionary relationships in the a-amylase family. /Glycoenzymes, 2000, p. 19-54.

111. Jorgensen S., Tangney M., Starnes RL. Cloning and nucleotide sequence of a thermostable cyclodextrin glycosyltransferase gene from Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 and its expression in Escherichia coli.// Biotechnol. Lett'. , 1997, 19: 1027-1030.

112. Hall B. Phylogenetic Trees Made Easy: A How-To Manual, Second Edition.//Sinauer Associates, Inc., 2004, 22 lp.

113. Hennig W., Davis D., Zangerl R. Phylogenetic Systematics. University of Illinois Press; New Ed edition, 1999, 280p.

114. Horikoshi K. Enzymology and molecular genetics of cyclodextrin-forming enzymes. — In: 4th International Symposium on Cyclodextrins, Munich, 1988, p.7-17.

115. Horikoshi K., Nakamura N., Matzuzawa N., Yamamoto M. Industrial production of cyclodextrins. In: 1st International Symposium on Cyclodextrins, Budapest, 1981, p.25-39.

116. Hartl, В., Wehrl, W., Wiegert, Т., Homuth, G., Schumann, W. Development of a new integration site within the Bacillus subtilis chromosome andconstruction of compatible expression cassettes.// J. Bacterid., 2001, 183, 2696-2699.

117. Kim S.H., Ahn J., Kwak H.S., Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes. // Springer, 2002.

118. Kitahata S., Okada S. Action of cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus megaterium strain No 5 on starch.// Agr. Biol. Chem., 1974, v.38, N 12, p.2413-2417.

119. Kitahata S., Tsuyama N., Okada S. Purification and some properties of cyclodextrin glycanotransferase from Bacillus stearothermophillus TC-60. J. Jap. Soc. Starch Sci., 1982., v. 29, N 1, p. 7-12.

120. Kobayashi S., Kainuma K., Suzuki S. Purification and some properties of Bacillus macerans cycloamylose (cyclodextrin) glucanotransferase./ Carbohydr. Res., 1978, V. 61., N1., P. 229-238.

121. Koizumi K., Utamura Т., Kuroyanagi T. Analyses of branched cyclodextrins by high performance liquid and yhin-layer chromatography. J.Chromatogr. (1986) v.360, p.397-406.

122. Koneman Elmer W. Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Lippincott Williams & Wilkins; 6th edition, 2005. 1736p.

123. Kenton S, Lai HS, Lin SP, Qian Y, Jia HG, Najar FZ, Ren Q, Zhu H, Song L, White J, Yuan X, Clifton SW, Roe В A, McLaughlin R (2001) Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes. Proc Natl Acad Sci USA 98:4658-4663.

124. Kimura К., Takano Т., Yamane K. Molecular cloning of the p-cyclodextrin synthetase gene from an alkalophilic Bacillus and its expression in Escherichia coli and Bacillus subtilis. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. - V.26, N 2. -P.149-153.

125. Kitahata S., Okada S. Action of cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus megaterium strain No 5 on starch.// Agr. Biol. Chem., 1974, v.38, N 12, p.2413-2417.

126. Kitahata S., Tsuyama N., Okada S. Purification and some properties of cyclodextrin glycosyltransferase from strain of Bacillus species. // Agr. -Biol. Chem., 1974, v.38, N 2, p.387-393.

127. Kobayashi S., Kainuma K., Suzuki S. Purification and some properties of Bacillus macerans cycloamylose (cyclodextrin) glucanotransferase./ Carbohydr. Res., 1978, V. 61., N1., P. 229-238.

128. Kotz S., Balakrishnan N., Norman L. Johnson Continuous Multivariate Distributions, Volume 1, Models and Applications, end Edition. / Wiley, June 2000, ISBN: 0-471-18387-3.

129. Kwak H.S., Kim S.H., Kim J.H., Choi H.J., Kang J. CD's.// Arch. Pharm. Res., 27, 873-877, 2004.

130. Kwak H.S., Jung C.S., Shim S.Y., Ahn J., J. Some properties of cyclodextrin.//Agric. Food Chem., 50, 7293-7298, 2002.

131. Larichev O.I. Measurement of Differences in Preferences Expressed by a Simple Additive Rule. / in M. Katwan, J. Sprouk, J. Wallenius (Eds.) /Essays in Decision Making, Springer Verlas.- Berlin, 1997.

132. Lane A.G., Pirt S.J. Production of cyclodextrin glycosyltransferase of batch and chemostat culture of Bacillus macerans in chemically defined media. // J. Appl. Chem. Biotechnol., 1973, v.23, N 4, p.309-321.

133. Larsen K.L. et.al: Purification andchsrscterisation of cyclodextrin glycosyltransferase from Paenibacillus sp. F8// Carbohydr. Pi.es., 1998,V.310,P.211-219. ,

134. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology / editorsin chief, Arnold L. Demain, Julian E. Davies /ASM Press, 2001.

135. Makela J. Mauri, Korpela K. Timo, Puisto Juhani, and Laakso V. Simo Nonchromatographic cyclodextrin assays: evaluation .of sensitivity, specificity, and conversion mixture applications.// J. Agric. Food Chem. 1988/Vol. 36 pp 83-88.

136. Martin Del Valle E.M. Cyclodextrins and their uses: a review. //Process Biochemistry, 2004, v.39, p. 1033-1046.

137. Middleton, R., Hofmeister, A. New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis. //Plasmid, 2004.- 51, 238-245.

138. MacGregor EA, Janecek S, Svensson B' Relationship of sequence and: structure to specificity in the a-amylase family of enzymes.// Biochim. Biophys. , 2001, Acta 1546: 1-20:

139. Methods in Enzymology, Volume 358: Bacterial Pathogenesis, Part C: Identification, Regulation and Function of Virulence Factors (Methods in

140. Enzymology) / Virginia L. Clark (Editor), Patrik M. Bavoil (Editor)/ Academic Press, 2002, 527p.

141. Micro-organisms and Earth Systems (Society for General Microbiology Symposia) / Hilary Lappin-Scott (Editor), Geoff Gadd (Editor), Kirk Semple (Editor)/ Cambridge University Press, 2005, 388p.

142. Molecular Identification, Systematics, and Population Structure of Prokaryotes./Erko Stackebrandt (Editor)/ Springer; 1 edition, 2005, 320p.

143. Nakamura N., Horikoshi K. Characterization and some cultural conditions of a cyclodextrin glycosyltransferase-producing alcalophilic Bacillus species.//Agr. Biol. Chem., 1976, V. 40, N 4, P. 753-757.s

144. Nomoto M., Chen Ch.-Ch., Shen D. Purification and characterization of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic bacterium of Taiwan. // Agr. Biol. Chem., 1986, v.50, N11, p.2701-2707.

145. Nomoto M., Shew D.C., Chen S.J. et al. Cyclodextrin glucanotransferase from alkalophilic bacteria of Taiwan. // Agr. Biol. Chem., 1984, v.48, N 5, p.1337-1'338.

146. Nakamura N., Horikoshi K. Purification and properties of Cyclodextrin Glycosyltransferase of an Alkaiophilic Bacillus sp.// Agric. Biol. Chem., 1976, V/40, (5), P.145-153.

147. Nishijo J., Moriyama S., Shiota S., Chem. Pharm. Bull. (Tokio)., 51, 12531257,2003.

148. Nomoto M., Chen Ch.-Ch., Shen D. Purification and characterization of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic bacterium of Taiwan. // Agr. Biol. Chem., 1986, v.50, N 11, p.2701-2707.

149. Nomoto M., Shew D.C., Chen S.J. et al. Cyclodextrin glucanotransferase from alkalophilic bacteria of Taiwan. // Agr. Biol. Chem., 1984, v.48, N 5, p.1337-1338.

150. Penninga D., Strokopytov В., Rozeboom H. L. et al. Site-Directed

151. Mutation in Tyrosine 195 of Cyclodextrin Glycosyltransferase from Bacilluscirculans strain 251 Affect Activity and Product Specifisity. // Biochemistry.t1995, V. 34-P. 3368-3376.у

152. Penninga D, van der Veen В A, Knegtel RMA, van Hijum SAFT, Rozeboom5

153. HJ, Kalk KH, Dijkstra BW, Dijkhuizen L. The raw starch binding domain of cyclodextrin glycosyltransferasefrom Bacillus circulans strain 251.// J. Biol. Chem., 1996, 271: 32777-32784.

154. Pongswasdi P., Yagisawa M. Purification and some properties of cyclomaltodextrin glucanotransferase. // Agr. Biol. Chem., 1988, v.52, N 5, p.1099-1103.

155. Prescott Lansing M., Harley John P., Klein Donald A. Microbiology. McGraw./ZHill Science/Engineering/Math; 6 edition, 2004. 992p.

156. Proceedings of the Ninth International Symposium on Cyclodextrins, Santiago de Compostela, Spain, May 31 June 3, 1998, J.J. Torres Labandeira and J.L. Vila-Jato (Eds.). // Kluwer Academic Publishers, 1999.

157. Qi< Q., Zimmermann W. Cyclodextrin glucanotransferase: from gene to applications. // Appl. Microbiol. Biotechnol, 2005, 475-485.

158. Ramakrishna S. V., Saswathi H., Sheela et al. Evaluation of solid, slurry and submerged fermentations for the production of cyclodextrin glycosyltransferase by Bacillus cereus //Enzyme Microb, Technol., 1994, V. 16, P. 441-444.

159. Saito Y. et al.: Cyclodextrins in Chromatography. //Anal. Bioanal. Chem., 2004, v.379, p.6-7.

160. Schmiedel, D., Hillen, W., A Bacillus subtilis 168 mutant with increased xylose uptake can utilize xylose as sole carbon source./ FEMS Microbiol. Lett.,1996, 135, 175-178.

161. Schulz, A., Schwab, S., Versteeg, S., Schumann, W. The htpG gene ofi

162. Bacillus subtilis belongs to class III heat shock genes and is under negative control.//J. Bacteriol., 1997, 10, 3103-3109.

163. Schwimmer S., Garibaldi J.A. Further studies on the production, purification and properties of the Schardinger dextrintransferase of Bacillus macerans.// Cereal Chem., 1952, v.29, N 2, p.108-122.

164. Seo Т., Kajihara Т., Iijima T.//Macromol. Chem., 188, 2071-2075, 1987.

165. Shimotsu, H., Henner, D.J. Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis.// Gene, 1986,43, 85-94.

166. Shim S.Y., Ahn J., Kwak H.S., J. Dairy Science., 86, 2767-2772, 2003.

167. Simon, D., Chopin, A. Construction of a vector plasmid family and its use formolecular cloning in Streptococcus lactis.lfQiochimiQ, 1988, 70, 559—566.i ■

168. Singh M., Sharma R., U.C. Banerjee Research review paper Biotechnological applications of cyclodextrins.//Biotechnology Advances, 2004, Vol.20 p.341-359180:Suh J., Lee S.H., Zoh K.D. (3-cyclodextrin. //J. Am. Chem. Soc., 114, 79167921, 1992.

169. Sumitra Т., Hidetoshi A., Fumitoshi H. Some pharmaceutical properties of new branched cyclodextrin 6-0-a(4-0-a-D-glucuronyl)-D-glucosil-P-CD.//Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2002, 44, p. 391-394.

170. Schmid G. Cyclodextrin glycosyltransferase production: yield enhancement by overexpression of cloned genes. // Trends Biotechnol. 1989. - V.7, N 9. — P. 244-248.

171. Schwimmer, S. Evidence for the purity of Schardinger dextrinogenase.// Arch. Biochem. Biophys. 43 (1953) 108-117.

172. Sicard P., Sanies M. Biosynthesis of cyclodextrin glycosyltransferase and obtention of its enzymic reaction products. In: Cyclodextrins and Their Industrial Uses.- Paris, 1987, p.75-103.

173. Silva A.C. da, Ferro J.A., Reinach F.C., et al.Comparison of the genomes of two Xanthomonas pathogens with differing host specificities.// Nature, 2002, 417:459-463.

174. Stanbury P.F., A. Whitaker, S.J: Hall. Principles of Fermentation Technology. //Butterworth-Heinemann, 1999.

175. Svensson B. Protein* engineering in the a-amylase family: catalytic mechanism, substrate1 specificity, and stability.// Plant Mol. Biol., 1996, 25: 141-157.

176. Szejtli J. Cyclodextrins and their inclusion complexes. Akademiai Kiado. Budapest. 1982.

177. Szente L., Szejtli J. Cyclodextrins as food ingredients. Trends in Food Science & Technology (2004), vl5, p.137-142.

178. Szeitli J. Cyclodextrins in the Textile Industry.// Starch/Starke (2003) v.55 p.191-196.

179. Szeitli J. Cyclodextrin technology. //Kluwer academic publishers, 1989. 450 P

180. Tamer, Uyar. Nanostructuring polymers with cyclodextrins ~ Dissertation // ProQuest / UMI (April 1, 2006) , ISBN 0-54238-965-7.

181. Takano T, Fukuda M, Monma M, Kobayashi S, Kainuma K, Yamane К Molecular cloning, DNA nucleotide sequencing, and expression in Bacillus subtilis cells of the Bacillus macerans cyclodextrin glucanotransferase gene.// J Bacteriol, 1986, 1118- 1122.

182. Tilden E.B., Hudson C.S. The conversion of starch of crystalline dextrins byithe action of a new type of amylase separated from culture Aerobacillus macerans. //J. Am. Chem. Soc., 1939, v.61, N 9, p.2900-2902.

183. Tilden E.B., Hudson C.S. Preparation and properties of the amylases produced by Bacillus macerans and Bacillus polymixa. // J. Bacteriol., 1942, v.43, N 2, p.527-544.

184. Tonkova A. Bacterial cyclodextrin glucanotransferase.// Enzyme Microb. Technol., 1998, 22: 678-686.

185. Van der Veen B. A., Uitdehaag J. C, Penninga D. et al. Rational design of cyclodextringlycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251 to increase alpha-cyclodextrin production. // J. Mol. Biol., 2000, V. 296 (4)< P. 1027-1038.

186. Wilkins C., Lay J., Winefordner J. Identification of Microorganisms by Mass Spectrometry (Chemical Analysis: A Series of Monographs on Analytical Chemistry and Its Applications). Wiley-Interscience, 2005, 352p.

187. Wong, S.-L. Advances in the use of Bacillus subtilis for the expression and secretion of heterologous proteins. //Curr.Opin. Biotechnol., 1995, 6, 517-522.

188. Wu, S.C., Wong, S.-L. Engineering of a Bacillus subtilis strain with adjustable levels of intracellular biotin for secretory production of functional streptavidin. //Appl. Environ.Microbiol., 2002, 68, 1102-1108.

189. Wu, X.-C., Lee, W., Tran, L., Wong, S.-L. Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases.//J. Bacterid., 1991, 173,4952-4958.

190. Xu E., Aoki H., Misawa M. New a-cyclodextrin producing thermostable cyclodextrin glucanotransferase. //Appl. Microbiol. Biotechnol., 1988, v.28, N 4-5, p.377-379.

191. Yong-Hoon Choi, Chul-Hak Yang, Hyun-Won Kim, Seunho Jung. Cyclodextrins.//Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 39,71-76,2001.