автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Разработка технологии бета-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РФ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

од

г--г»?. На правах рукописи

КОСОРОТОВА Елена Михайловна

УДК: 577.152.24:576.851.5

РАЗРАБОТКА ТЕШЛВГ1Ш БЕТА - СПЕЦИФИЧНО! ЦНШДЕШРИШШШОТРЖИЕРДЗЫ

/Специальность 0518.10 — технология ь*ши^шных ферментных, белковых препаратов, чая и табака/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РФ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

На правах рукописи

КОСОРОТОВА Елена Михайловна

УДК: 577.152.24:576.851.5

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БЕТА - СПЕЦИШИЧВОЙ ЦИШДЕКСТРННГЛПКАВОТРАВСФЕРАЗЫ

/Специальность 05.18.10 — технология витаминных ферментных, белковых препаратов, чая и табака/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Работа выполнена.в Московской Государственной Академии пищевых производств.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор И.М. Грачева кандидат биологических наук, Н.Г. Усанов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ВНИИ Пищевой биотехнологии A.C. Тихомирова доктор технических наук, зав. лабораторией НПО "Биотехнология" Р.Н. Гребешова

Ведущая организация:

- НПО Крахмалопродуктов

Защита диссертации состоится " " сбеЗ^/ЯА^ 199 ^г.

в _ часов на заседании специализированного Ученого Совета

К. 053.51.04 Московской Государственной Академии пищевых производств ( 125080, Москва, А-80, Волоколамское шоссе, д.II). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГАПП. Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 125080, Москва, А-80, Волоколамское шоссе, д.II, МГАПП. Ученому секретарю специализированного Совета К. 063.51.04.

Автореферат разослан " /? " Л/г^я^^_

Ученый секретарь специализированного Совета

к.т.н., доцент А.И. Садова

ОДЦЛЯ ХАРАКТВШСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние несколько десятилетий в промыиленно развитых странах.нашли широкое применение цаклодек-страны (ЦД).-Они образуются из ¿сражала под действием специфического Фермента - щпиодзкстринглюканотрансферазы (ЦГТ-азы). ЦЯ применяются в пищевой промышленности, сельском хозяйстве, медицине, косметике и многих .других областях. ЦЦ способствуют улучшению качества продуктов по многим параметрам, таким как стабильность, растворимость в воде, биологическая усвояемость, вкусоше и другие органолептичзские показатели, технологические свойства и прочее. С помощью 1Щ получают новые виды продуктов питания, а такке лекарственные препараты пролонгированного действия

Даже будучи использованы в виде добавок они зачастую оставляют значительную долю стоимости продукта, поэтому ваяшой стаио- * вится проблема повышения эффективности технологии получения Щи • комплексов включения на их основе.

Способы получения фермента и использование его в процессе синтеза ЦЦ достаточно хорошо разработаны в ряде стран и поставлены на промышленное производство и применение особенно, в Японии и Венгрии. В России производство ЦГТ-азы и, соответственно, ЦД еще не налажено, но спрос на ОД есть, что свидетельствует о перспективности проводимых исследований. Определяющим фактором в технологическом процессе получения ЦД являются специфические свойства ЦГТ-азы, поэтому работа по изучению этих свойств фермента и выбору оптимального его варианта, а такта разработка технологии ЦГТ-азы и условий применения препарата ЦГТ-азы дош получения определенных ЦД является очень вашой и актуальной задачей.Актуальность данной теш заключается еще и в том, что публикуемые работы но ЦГТ-азе и ЦЦ не - раскрывают сути технологии и поэтому пе

воспроизводятся при простом копировании публикуемых материалов.

Целью -работы являлась разработка технологии бета-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы для получения бата-ЦЦ.

Исходя из цели работы были поставлены оледущие задачи:

- исследовать физиолого-биохимические характеристики изучав-шх штаммов-продуцентов ■ ЦГТ-азы;

- изучить свойства ферментов- различных штаммов;

- обосновать выбор продуцента бета-специфичной циклодекстрин-глшано трансферазы;

- изучить процесс ферментолиза крахмала под действием цикло-декстрпнглюканотранофераз различной специфичности;

- изучить образование комплекса бета-циклодекстрина с валидолом в процессе ферментолиза.

Научная новизна. Разработана научная метрдико выбора перспективных продуцентов бета-специфичной ЦГТ-азы для промышленного использования. Настоящая методика заключается в учете всей совокупности как физиологических возможностей самого продуцента, так и биохимических свойств синтезируемого им фермента с точки зрения Требований технологического процесса получения ЦЦ.

Изучены и охарактеризованы 19 новых бактериальных штаммов-продуцентов бета-специфичной ЦГТ-азы. Проведено исследование фи-зиолого-биохимических особенностей данных культур и изучены свойства синтезируемых ш ферментов:

способность в процессе биоконверсии крахмала синтезировать весь комплекс ЦЦ Сальна, - бета - и гамма - ЦЦ)', рН - и температурные. опишу мы, рН - и т'ермостабильность, а также специфичность.

Все проведенные исследования нови в своей сумме и оригинальны.

Практическая ценность работы. На основании физиолого-сЗиохи-кических особенностей штаммов и свойств их ЦГТ-аз был предложен наиболее перспективный для промышленного получения бета-ЦД штаим

б/>- ШЗ-Н 1064. Установлены основные технологические паранетрц получения ЦГТ-азы с использованием данного штамма и разработан лабораторной регламенте на получение ферментного препарата ЦГТ-азы.

Наработана опытная партия препарата ЦГТ-азы из культуры Восеввиб ИБ-Н 1064. Проведена в лабораторных условиях апробация этого препарата, которая показала-возможность получения бета-ЦЦ с достаточно, высоким выходом /40-60 %! без использования

органически* растворителей.

Показана возможность получения комплексов включения бета-ЦД с веществами практического назначения в процессе ферментолиза крахмала, минуя стадии его выделения и очистки в форме кристаллического препарата,, что способствует удешевлению процессаг сокращению энергозатрат, а также повышению выхода препарата в расчёте на исходный крахмал.

Полученный результат даёт основание считать, что такие ЦД и соединения их включения могут найти широкое применение в пищевой промышленности, медицине и косметике. Разработанная технология оригинальна, ведутся работы по её патентованию.

Апробация работы. Предложенная технология получения Ферментного препарата Циклобашшшн Гзх на основе продуцента др-ИБ-Н 1064 была испытана в условиях Приволжского опытно-промышленного биохимического завода, о чём свидетельствует акт. Материалы

диссертации представлялись на УШ конференции молодых ученых л специалистов, посвященной 60-летию образования 1Л1ИШ (Москва, 1991 г.), конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами в Российском микробиологическом обществе" (Москва, 1993 г.), на расширенном семинаре в Институте биологии Уральского научного центра РАН» на конференции, посвященной 60-летию МТИПП.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи и 3 тезисов докладов.

Структура -уаботн. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, вклотамцей описание материалов а методов, а также результаты и их обсуждение, выводов и списка литературы (125 источников). -Работа изложена на 170 страницах машинописного'текста, включая 21 таблиц и 27 рисунка, имеет приложения.

СОДЕРЖАВ® РАБОТЫ

Во введении. Обоснована актуальность теш и определены задачи исследования.

В обзоре литературы рассмотрены современные представления о строении и свойствах 1Щ, о возможностях применения его в различных областях, обобщены данные о микроорганизмах-продуцентах ЦГТ-азы и свойствах их ферментов, а такие о процессах промышленного получения ДЦ.

ЭКСПЕРЖ1ЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и мзтодн цдслзлокшя

Объектами исследования являлись следующие продуценты бета-специфичной ЦГТ-азы: 0ac¿€¿«4 4/>- ИБ-П31, ИЗО, 1128, 1127, 1126, 1070, 1069, 1068, 1067, 1065, 1065, 1064, 1063, 1062, 1061, 1060, 1059, 1057, 1013. Культуры были выделены из почвы в Инсти-

туте биологии Уральского научного центра РАН. Сравнение овойотв данных культур проводили оо штаммом ■¿асХбгб /пасгнгл* ВКМ-506, который является исторически первым найденным продуцентом ЦГТ-азы и широко используется для получения ЦД.

Продуценты подцзротвали на агаризованной среде оледуюцего соотава в кгшкал - 0,5; (Л^)^ НРО 4 - О,*; К^НРО^ - 0,2; пептон - 0,3; дроя^евой экстракт - 0,3 , кукурузный экотракт - 0,3.

Культивирование проводили на трех средах, состав которых приведен в таблице I.

Таблица I

Состав среда дош культивирования продуцентов ЦГТ-азы

Компоненты ________ши Среда I двитнио иииттл ; Среда П ___________ : Среда ш

Крахмал 1,00 1,00 1,00

(Щ)л НРОч 0,^0 0,20 0,20

0,20 0,20 0,20

Пептон 0,30 0,05 0,05

Дрояаевой экстракт 0,30 0,05 0,05

Кукурузный экстракт 0,30 0,05 0,05

Со СО* 0,10 0,10 0,10

МогС03 - - 0,02

Длительность Выращивания 3 суток при температуре 39°С в колбах на качалке, частота вращения 200 об/мин.

Концентрацию. бета-ВД и активность фермента определяли в бесклеточной культуральной жидкости фотоэлектроколориметрическим методом с фенолфталеином. За единицу активности ЦГТ-азы принимали активность такого количества фермента, которое за I минуту в определенных условиях катализирует образование I мк Моля бета-ЦЦ.

- з

Определение совокупного'влияния среды и температуры на активность фермента проводили путем измерения его ЦГТ-азной »активности при рН 5,0; о,2; 5,4; 3,6; 5,8; б,<;; 6,4; 6,6 и температуре 50, 55. 60 и 65°С.

Определение рН-стабилькости проводили путем измерения остаточной активности ЦГГ-азы после выдер.-швания раствора бесклеточной культуральной нидкости в буфере Ыакилвейна СрН в диапазоне 4,0-7,5) в течение часа при 50°С.

Термоотабильность определяли путем измерения остаточной активности ЦЕТ-азы после выдерживания осажденного этанолом фермента при температуре 60°С в течение 15, 30, 45 и 60 минут.

Методом высокоэффективной надкостной хроматографии определяли альфа-, бета- и гамма - ОД в продуктах конверсии крахмала под действием изучаемых ферментов. Измерения.проводились на высокоэффективном хсвдкостном хроматографа, колонка /^лгл?/?- л/Иг размером 3 х 150: ш и диаметром частиц . 5,1 мкм. Элюент-ацетонигрил: вода - 63:37.

Белок определяли по Лоури, рН - среда определяли на иономе-рз ОВ-74, концентрацию сухих веществ измеряли с помощью рефрактометра Р1Ш-3.

Получение комплексов включения бета-ОД с различными кошлек-сантами и определение молярного соотношения бета-ОД: комплексант проводили в водаом растворе или в водноэтаноловой смеси о концентрацией 1Щ 3 % при 30°С,

Для изучения процесса фердентолиза использовали 5 % нативный крахмал приготовленный на нагрийацетатном буфере с рН 5,8. Для предобработки крахмала использовали ЦГТ-азу из расчета 0,5-0,7ед/г крахмала. Ферментолиз проводила после заваривания крахмала ЦГТ-азой из расчета 5-10 ед на I г крахмала. При определении динамики кон-

версии крахмала отбирали пробы через 4, 10, ¿0 и ¿4 часа, в которых определяли концентрацию бвта-1Щ.

Результаты исследований

Процесс получения Щ состоит из двух основных стадий: получение фермента и ферментативная конверсия крахмала. Причем по данным литературы и материалов зарубе:.шых фирм около 90 % их приходится па.вторую стадию и только около 10 % на получение фермента. Ка основании этого определяющими критериями при выборе.ЦГТ-азы являлись свойства фермента такие как: рН-оптимум, оптимум темпе-ратурц, рН-н термостабильность, а такгсе специфичность. В то же время нельзя совсем но учитывать физиолого-биохимических особенностей продуцента, а именно способности синтезировать ЦГТ-азу с достаточно высокой активностью на доступных средах и не терять ее при длительном хранении и пассаяировании. В связи с этим работа велась в двух направлениях. Продуценты ЦГТ-азы отбирались не только с учетом рабочих характеристик фермента, но и свойств самого продуцента.

Ставнетше метопов первоначального скрининга прртгунеигов

Для проведения первоначального скрининга продуцентов бета-специфичной ЦГТ-азы, связанного с. необходимостью постоянного измерения ЦГТ-азиой активности, после сравнения существующих мото-дик и анализа дашшх литературы е>ил выбран метод с фенолфталеином. ДагашЗ -метод достаточно чувствительный и снецшТэтшй, хорошо вос-производии, и присутствие гэдролкзатов крахмала не влияет на точность определения.

■*иппо.т:ого-иногл;.:;1мсс;сле хптоктетастики изучаешь штатов

3 результате предварительных исследований было установлено,

что внделоюше !:удьт;'рн дли: роста а биосинтеза бета-слмийичиой ЦГТ-азн чробуют наличия в среде кридалла, органического азота в в»¡до neurona, дрожжевого и кукурузного экстракта, о таете неорганического азота в шде фос&атпнх содзП !садия или «шопия, a тагске мола. Однако потребность в источнике азота у разных штатов различна. С целью шбора направления опталнзации питательной среда сравнивал!! биосинтез ЦГТ-азн на трех вариантах питательной среда, состав которых приведен в табл.1. Анализ результатов, приведенных в таблице показал, что наибольшей активности ттаыш достигают на богатой по азоту питательной среде за исключением Saciette* ¿f>-1013, :.шсшлальпая активность которого, была отмечена па среД G 111.

Изучение стабильности протот'еитов

бе та —сп единичной тти кло декотте^щугоканотттано^ешзн

Вашюй технологической характеристикой продуцентов является их стабильность, т.е.- сохранение необходимой ЦГТ-азиой активности при пассагнровании и длительном хранении. Все находившиеся в работе шташы были устойчивы к длительному хранению при температуре 5-Ю°С к не теряли своей активности на скошенной агаризоваи-iio'i среде под вазелиновым маслом без дополнительных пересевов в течение G месяцев. Изучение влияния возраста культуры на агарлзо-ваино'; среде в чашках Петра па биосинтез продуцента и ЦГТ-азы полазало, что с увеличением возраста.культуры величина активности хотя'и не была постоянной, но и не имела тенденций к снижению.

Па частые переезш реакция культур оказалась различной. Среди изучаемых продуцентов внделяется группа иташов: '/Íac¿¿éu4 4/)AI3I, ЛасМи* -á/>- ИЗО, Jjb. 112.7, £ac¿€áu<S

¿p. и,м ¡i áaa'fá/ó 4p. II¿¿>, которые быстро теряли активность при пасса:кировашш к следовательно тробовали постоянного отбора

Таблица 2

Некоторые фязиолого-биохимячесние характеристики различных бактериальных штаммов - продуцентов ЦГГ-аз.

1 Номера штаммов! Активность бета-специссичной ШТ-азы /Bac'ifätf-d ! э нультуральной жидкости, ед/мл ! |-1—^—х-*— ИБ - Н L среда I j среда II j среда III ...... -......1 Стабильность¡Время выхода при ¡активности ЦГТ-пересевах ¡азы на макси- ¡мальный уровень,

I ! 2 3 4 5 6

II3I 6,16 1,31 1,66 - 60

ИЗО 2,23 0,80 0,30 - 60

1128 1,95 0,39 0,24 - 60

112? 1,87 0,44 0,10 - 60

112 6 4,83 1,62 0,95 - 48

1070 1,16 0,93 0,81 + 60

IC69 2,04 1,71 0,97 + 48

1068 1,42 0,54 0,68 + 60

1067 1,70 0,89 0,78 + 48

1066 1,29 0,46 0,51 + 48

1065 1,70 0,83 0,79 + 48

1064 3,67 1,30 0,95 + 48

1063 Г ,29 0,41 0,52 + 48

1062 I.CB 0,22 0,25 + 72

Продолжение таблицы 2

I ! а ; з I 4 I 5 ! 6

1061 2,09 1,02 0,99 + 60

1060 1,25 0,87 0,92 + 60

1059 2,41 1,03 1,12 + ъ

1057 2,52 1,36 1,50 + 72

1013 0,58 1,15 1,37 + 71

+ - Сохраняют активность при пересевах; ,

Требуют отбора активных вариантов в каждом пассаже. й

I

активных вариантов, что существенно увеличивает трудоемкость работы с ними. Для остальных штаммов было характерно стабильное сохранение ЦГТ-азной активности при пересевах.

Изучение динамики накопления ЦГТ-азной активности продуцентами в процессе культивирования.

В таблице 2 (графа 6) представлены результаты исследования динамики накопления ЦГТ-азной активности изучаемыми штаммами. Для штаммов ¿taceféW-J jf. 1062, jBacif^-i d/>- 1059, ¿act'e&sj 4fi 1057 и £ac¿eecs<s Ю13 было отмечено, что активность выходит на максимальный уровень в 72 часу роста, для штаммов: /Йй'лЙ^

II3I, ¿>acceá/4 -íjb. изо, /ffactf&s-J <!/>. 1128, fía^ffcsj 4/> 1127, <S/>. 1068, <s/>. 1061 и J0act'¿&4

1060 - к 60 часу роста. Активность ЦГТ-азы остальных штаммов достигает максимального значения уже после 48 часов культивирования. Как наиболее перспективные среди них были отмечены ¿tacxf-ásó -ifi. 1126 и /facL?é¿/ó d/>- 1064, у которых при этом было и более высокое значение ЦГТ-азной активности.

Изучение свойств ферментов различных штаммов

Использование ЦГГ-аз при получении ЦД из крахмала накладывает ряд требований на их свойства: наличие высокой активности и стабильности ЦГТ-азы в условиях проведения урерментолиза, а'также ее специфичности.

Изучение совокупного влияния рН и температуры на активность ЦГТ-аз различных штаммов.

Совокупное влияние двух этих ^авторов достаточно сложно и имеет существенное значение для последующего промышленного применения препарата. В результате исследования совокупного влияния рН и температуры на активность дермента для ЦГТ-аз изучаемых штаммов

были опрздвлены оптимальные значения температуры и р!1, которые прэдставлены в таблице 3 (гра£а 3).

Из литературных лсточшщов известно, что для■ рсахарлвания крахмата предпочтительнее использовать Оерменты, температурный оптимум которых не пике 50°С, а рН - оптимум леяит в слабо-кислой п.т нейтральной области, 5,5-7,0. Одной из главных причин внбохи такой температуры является, стремление предотвратить за-грязнепме реакционной огласи посторонними микроорганизмами. Но в то .ке время -использование ЦГТ-аз, ямвввдах октимальную температуру свыше 70°С неэкономично, поскольку это требует повышения энергозатрат. Применение ЦГТ-аз, рН-оптимум которых лежит в сильнокислой или I".елочной области неэффективно, т.к. одновременно с (¿«рмшигаташшвди расселением будет происходить расщепление крахмала под воздействием активной среда, что заметно сникает выход целевого продукта.

Анализ полученных результатов показал, что изучаемые штаммы имели оптимум температуры 50-55°0, а штамм ¿р- Ю57-

50°С. Значение рН-оптимума у большинства штаммов составило 5,4-5,6.. У некоторых продуцентов был отмечен более высокий оптимум "рН, так у штамма Затеем <г/. Ю68 - 5,8; ¿р. 1013 - 5,9; £ассеем <!/>. 1057 - 6,0; ЗассМш -4/>. 1082 -6,0.

Изучение тешортабильности ттмслопзкотрпнглюканотранс<Т:ераз различных штаммов.

Как у тле было отмечено выше, ЦГТ-аза используемая в промышленности дожит давать не только высокий выход ЦД из крахмала и иметь приемлемый оптимум температур и рН, но обладать достаточной термостабильностыо. В таблице 3 (графа 4, 5, 6) приведены значения остаточной активности ферментов после инкубации при 60°С

Таблица 3

Некоторые характеристики ферментов различных штаммов №¿/4 ИБ-Н.

М штаммов ¿р. ИБ-Н. Оптимум рН Оптимум температуры,^ Остаточная активность ЦГТ-азы;Оптимум после инкубирования при бО'-С.^рН-ста- !Остаточная активность в рН-!оптимуме через !час инкубации .'при 5043, %

15 мин ! 30 мин 60 МИН ¡биль- !ности |

I 2 3 4 ! 5 6 Г 7 8

1131 5,6 55 81,8 52,4 10,9 7,0 12,5

ИЗО 5,4 50 75,0 52,9 36,3 7,5 25,6

1128 5,6 50 19,8 10,8 6,0 7,5 29,9

1127 5,6 50 35,1 18,9 3,6 7,5 34,1

1126 5,6 50 61,6 34,7 1,6 7,5 24,1

1070 5,5 50 80,9 63,5 20,6 7,0 61,0

1069 5,6 50 38,3 17,4 0,2 7,0 40,0

1068 5,8 50 45,1 39,6 14,0 7,0 19,5

1067 5,4 50 69,5 46,2 20,1 7,0 38,4

Г066 5,6 50 85,1 69,2 40,2 7,0 47,4

1065 5,6 55 80,6 66,1 35,0 7,0 36,8

1064 5,6 50 86,9 73,9 48,2 7,0 64,3

1063 5,4 55 79,8 55,1 18,1 7,0 23,5

Продолжение таблицы 3

-1-1-г-1-1-1-1-

I ! 2 ! 3 i 4 ! 5 ! 6 ! 7 ! 8

1062 6,2 5 5 65,4 48,1 16,5 6,0 12,3

1061 5,4 50 55,1 40,3 13,8 7,0 9,5

1060 5,6 55 37,4 27,1 0,4 7,5 5,5

1059 5,6 55 73,2 52,4 37,7 7,5 29,6

1057 6.0 60 72,1 51,7 18,1 ?,5 44,1

1013 5,9 55 71,6 54,8 19,9 7,0 42,3

506 5,6 55 88,6 72,3 43,8 6,0 20,6

в течение 15, 30 и 60 минут.

Анализ полученных данных показал, что условно все изучаете культуры ног.шо подразделить на три группы по термостабилыюсти синтезируемых ими ДГТ-аз. При максимальной длительности инкубирования (I час) при 60°С первая группа имела остаточную активность около 10 вторая - не более ¿3 % и третья не менее 34 % от исходной.

К первой группе относятся -í^b. II3I,

4Jb. rns, £acc€e¿s<s <s/>. п„7, jeac¿tfaé <*/>■ n¿,6 и ¿a-

<Sj/t>. 1069; ■ ко второй группе - 1070,

jBae¿e&,<s <s/>. iOSd, ßaeie&/<s <s/>. IOS7, ¿acc&vj 4/>. I053, ßauefad ¿p. 1061, J0ac¿efa4 <s¿>. Г057 и ¿aei&ísj 1013. Наиболыжй интерес представляла третья группа штаммов: ßacieeu-d 4/>. -ИЗО, Ю64, ¿acrffa* ■*/>. 1065,

¿keif&fiS -í/>. I0S6 и /3aci'e¿u<s 2059. Самой высокой термо-стабилыюстыо обладал штамм jßaet£&s<i <sjb. 1064, остаточная активность ЦГТ-азы которого после часа инкубирования при 60°С составляла. 48, ~¿ % от. исходной.

Изучение pH-стабильности пиклолекстпингликанотранс^ераз

тшшш-шзжш-

Данные, характеризуйте pH-стабильность ЦГТ-аз изучаемых культур представлены в таблице 3 (графа 7, 8).

Было отмечено, что оптимум pH-стабильности ферментов данных шташов расположен в более щелочной области, чем pH-оптимум их активности и для большинства шташов имеет значение 7,0. Штаммы jßaciefu<s 4Jb. ИЗО, II¿e, Saafäs-d <*/>■ IM,

ßaeteft/J Ю60, d/>: 1059 и ßaect&sd 1057

имеют оптимум pH-стабильности ЦГТ-аз 7,5, а штамм £act¿ífW 4р. 106¿ - 5,0. Высокий pH-стабильностью обладали ЦГТ-азы, проду-

цируемые штаммами <!/>. 106:3, 1067,

1013, ¿асс^м 1057 и ¿аи&и* л/). 1053. Значение остаточной активности ЦГТ-аз перечисленных культур составляло не менее 36, ¿3-47,4 %. Особый интерес представляли продуценты 1070 и Ю64, у которых остаточная активность ЦГГ-аз была соответственное!,0 и 64,3 Однако, для ЦГТ-азы штаыш 1070 была характерна низкая термостабильность и, следовательно более перспективным являлся 1064.

Изучение специфичности Ферментов различных штаммов.

В результате действия ЦГТ-азы на-крахмал образуется смесь различных ЦД, и состав и соотношение компонентов, которой варьирует в зависимости от источника ЦГТ-азы. Для получения бета-ЦД использование бета-специфпчшх ЦГГ-аз является предпочтительным как с точки зрения более высокого выхода конечного продукта, так и с позиции снижения количества побочных продуктов, требующих отде ления и утилизации.

Результаты исследования продуктов, образуемых в процессе конверсии крахмала ЦГТ-азаш различных продуцентов, методом высокоэффективной надкостной хроматографии приведены в таблице 4.

Все изучаемые'ЦГТ-азы являлись бета-специфичными.за исключением штамма 4/Ь. Ю6й, который при последующем уточнении оказался принадлежащим к виду /пажла/кз

Наибольший интерес представляет штаммы с соотношением продуктов конверсии крахмала: бета-ЦД > гамма-ЦД > альфа-ЦД , к который относятся

¿ВаеСе^и* пгд, <!/>. Ш7, Ю70,

<!/>. Ю59, Аге^е&га юза, 1064,

Засеем 4/>. юзз, 4/?. Ювт и */>. 1059.

Наиболее яысокий выход бета-ЦД был отмечен у

Таблица 4

Специфичность ЦГГ-аз различных штаммов.

Л штамма ф». ИБ-Н Соотношение ЦД/от ЦД | Соотношение

альфа-ЦД!, бета-ЦД } | гцмма- | альфа-ДД: бе гамма-ЦД

1131 9,2 68,0 22,8 I 7,4:2,5

ИЗО 9,7 68,9 21,4 I 7,1:2,2

1128 8,5 68,2 23,3 I 8,0:2,7

1127 8,3 70,3 21,4 I 8,5:2,6

1126 8,4 69,7 22,6 I а, 3:2,7

1070 8,9 66,7 24,4 I 7,5:2,7

1069 8Д 70,2 21,7 I 8,6:2,7

1068 9,7 65,4 24,9 I 6,7:2,6

1067 11,3 66,0 22,7 I 5,8:2,0

1066 28,4 57,5 14,1 I 2,0:0,5

1065 11,0 64,1 24,9 I 5,8:2,3

1054 8,3 69,1 22,6 I 8,3:2,7

1063 9,1 68,8 22,1 I 2,6:2,4

1062 64,5 25,4 10,1 I 0,4:0,2

1061 9,1 68,7 22,2 I 7,5:2,4

1060 29,4 51,7 17,6 I 2,1:0,6

1059 8,9 69,3 21,8 I 7,8:2,4

1057 39,3 45,2 15,6 I 1,2:0,4

1013 38,06 48,1 13,8 I 1,3:0,4

3. /пАсем/>4

ВКМ-506 65,5 24,8 9,7 1:0,4:0,1

11«Л, ¿}#Ссе&/<! 1053 и 1064,

соотношение альфа-ЦЦ: бзта 1Щ:гамма-1Щ у которых соответственно составило 1:о,5:2,6; 1:о,6:2,7 и 3:^,7. Однако, наибольший интерес представлял шташ . 1064, поскольку штамм

Загс^/л 1127 был нестабилен при пересевах, а для

ЦГТ-азы <!/>. Ю69 была характерна очень низкая тзрмо-

стабнлыгость.

ОЗррщвдщд ШДУЦта От-рпетщфиЧЧОЙ

Изучение различных особенностей и свойств ЦГТ-аз исследуемых штаммов позволило оценить ЦГТ-азу каздого продуцента с позиции ее специфичности, рН-и термостабильности, а также с учетом опти-муыов температуры и III .для ее действия. В результате анализа полученных данных на основании всех выше перечисленных критериев, а таете принимая во внимание физдолого-биохимические характеристики изучаемых штаммов для дальнейшей работы был отобран штамм ¿а^ейм <!/>■ 1064.

Для ЦГТ-азы данного продуцента характерна оптимальная температура действия 50°С'и высотая термостабильность. Остаточная активность ЦГТ-азы <!/>■ 1064 после часа инкубирования

при 60°С составляла 48,^ % от исходной, что превышает соответствующие показатели для всех остальных штаммов.

Оптимальное значение рН для ЦГТ-азы 1064 -

о,6 , а наибольшая стабильность данного фермента отмечена при рН 7,0. Остаточная активность в оптимуме рН после часа инкубирования лри 50°С составляла 54,3 $ от исходной. Таким образом, рН процесса ферментолиза будет располагаться в оптимальном диапазоне '5,3*7,0.

Соотношение ллк1«-Щ: бета-ЦД: гамма-ЦД в продуктах конпер-

-лЕ-

син крссзкэла под действием ЩТ-азн 8осс€£с/4 1064 составило I:Ь,3:^,7 , т.е. количество бета-ПД в 3 раз превышает количество аль£а-ЦД, что доказывает перспективность промышленного использования данном фермента дия получения бэта-1Щ.

Ток»з следует отметить, что вибрагшпД.штамм ¿васМ&га-фА 1064 имеет хоромме технологические сиоЗстт.

По-первчх, он са-абилен и сохраняет свою активность как при длительном хранении, так и при частно пересевах. Во-вторых, он имеет значительную скорость роста, па максимальный уровень активность ого выходит к 43 часу культивирования.

На основания ,чанных, получешшх в процессе работы с выбранным продуцентом, были определенн режимы и разработана технологическая схема получения препарата цяклобациллнн ГЗХ в лабораторных условиях. В частности било установлено, что максимальной активности штамм достигает па богатол по азоту среде следующего состава, %: картофельный-крахмал - 1,0; Нг.НРО<р 0,2; {МЩ )гНРО^-0,2; кукуиузння и дро:;кавоП экстракт - 0,3, пептон - 0,3, мел - 0,1. Температура культивирования 39°С, нрзгля культивирования 48 часов. Били исследованы условия концентрирования культу ралыюй яидкости методом ультрагяльтращш и разработан реяюл сушки концентрата в раштилительно!*:' сушильной установке фирмы

Разработан лабораторный регламент на получегше бета-специфично^ ЦГТ-язн с использованием штамма /$#¿¿££¿/4 1064. Предложенная схема получения ферментного препарата испытана в условиях Яриволиского опытно-промышленного биохимического завода, о чем свидетельствует'акт испытаний.-

Изучение процесса «Ттешеитолиза крахмала под действием ттдклодекстшнглупюнотлпнс^епаз различной специмнчнротп Как у:хе было отмечено ранее при получении бета-ОД применение

бета-специфичных ЦРГ-аз с высоким выходом бета-ЦД имеет ряд преимуществ.

В работе.было проведено сравнительное изучение процесса фер-ментолиза крахмала под действием бета-специфичной ЦГТ-азы отобранного штамма 8аыС£и4 г/}- 1064 и альфа-специфичного фермента

тасегалб ВЙ.1-506, который традиционно используется в промышленности для получения ЦЦ. Анализ полученных данных показал, что через 24 часа реакции степень конверсии крахмала в бе-та-ЦЦ под действием ЦГТ-азы культуры /¡аа¿р. 1064 была на 20% выше, чем с ЦГТ-азой 6- /пасетм ВМл-506 и составляла соответственно 33,49 и 78,99 %. Это объясняется, преаде воего, повышенной специфичностью фермента к образованию бета-ЦД и подтверждает перспективность использования бета-спевдфачных ЦГТ-аз для получения бета-Щ.

Высокий выход бета-ЦЦ в процессе ферментолиза под действием ££)с<.1€с/4 1064 позволит увеличить выход готового продукта с единицы промышленного сырья-крахмала, снизить количество побочных продуктов и расходы на очистку бета-ЦЦ.

Изучение РЛИЗДЭД прдащ буфера, сердимого в уэтттуп орт т шттиь Щ-азц г пщдсое

Фэрнензюддщ шамала Вило установлено, что для поддержания рН в процессе фермен-толиза крахмала следует использовать натрийацетатный буфер, в промышленных условиях на данной стадии допустимо такие использование водопроводной воды.

Получение комплексов включения бета-циююдекстрина о различными растворителя,а и определение молярного соотношения бета-ИД: растворитель

Как уже было отмечено выше, применение для производства

бата-Щ бета-специфичных ЩТ-аэ, обладающихнеобходимыми свойствами позволяет получать ЦЦ без использования органических растворителей. В то же время остается потребность в дешевом техническом ЦД, в котором донусвдется наличие органических растворителей в следовнх количествах.

Б работе была изучена возможность применения таких органических растворителей как толуол, изооктан и циклогексан, все они образовывала комплекс включения с бета-ЦД в молярном соотношении приблизительно 1:1, и судить о их пригодности для осаэдения бета-ЦД пошо было только по критерию их токсичности. На основании этого для осаждения бета-ЦЦ ыогсно рекомендовать циклогексан, как имеющий наименьшую токсичность.

Изучение образования комплекса бета-ЦД о валидолом в процессе 'ешентолиза

Во всех известных способах получения комплексов включения с бета-ЦД используется готовый чистый Щ, получешшй в результате фзрглантолиза кражала. Выделение ЦП из реакционной смеси, а . татае его последующая очистка связаны с большими затратами.

В работе показана принципиально новая возможность получения комплекса бета-ЦД: валидол в молярном соотношении 1:1 и выходом от 40 до 60 % непосредственно в процессе ферментолиза крахмала. Предложзапый способ получения соединения включения, минуя стадам выделения и очистки Щ, позволит существенно снизить трудоемкость получения и себестоимость комплекса.

ВЫВОДЫ

I. Изучены фнзиолого-биохишческие особенности 19 штаммов-продуцентов бета-специфичной ЦГТ-азы, относящихся к роду

- Определена их стабильность при дательном хранении и пас-

сагапэованик. Поглзано, что большинство штаммов сохраняют свою продуцирующую способность как при хранении в течение 6 месяцев при температуре 5-Ю°С, так и при частом пассажировании.

- Определена динамика накопления ЦГТ-аш в процессе культи-вировапия и изучено таюэд влияние состава питательной среды на уровень синтеза'фермента. Показано, что максимум ЦГТ-азной активности в культуральной иидкости при культивировании в колбах на качалке накапливается к 42-76 часу роста на богатой по азоту питательной среде.

- Исследованы свойства ферментов, синтезируемых изучаемыми штаммами. Определены оптимальная температура и рН. Отмечено, что оптимум температуры для ЦГТ-аз данных штаммов лехшт в диапазоне 30-о5°С, а оптимум рИ, за редким исключением, в интервале 5,4-5,6.

- Изучена рН-сгабнлыюсть ферментов. Отмечено, что для большие тва ЩТ-аз характерен оптимум рН-стабильности 7,0-7,5.

- Изучена термосгабильность ЦП'-аз. Среда исследуемых культур г.удзлена группа штаммов, остаточная активность ферментов ко-?ор»;с после часа инкубирования при 60°С оставалась не менее 34 %.

- Изучен состав и количественное соотношение продуктов обработки картофельного крахмала исследуемыми ЦГТ-азаш. Установлено, что основным продуктом обработки крахмала данными ферментами яв-лязтсл бета-ЦД. У наиболее специфичных по отношению к синтезу бе-гаЧЦ ИХТ-аз соотношение альфа-1Щ: бета-ЦД: гамма-ВД в реакционно'! смеси составляло приблизительно 1:7:2.

2. И результате сравнения фазиолого-биохшичеоких особенностей ;.:;учаоп!>х штаммов и свойств слито зируешх isi.ni ЦГТ-аз, а так-ме оопоотамлтельиого анализа паоих данных с данными литературы бил отобран кгсаш 1034 как наиболее иерспек-

татяшй продуцент бэта-специфичной ЩТ-язы по свои:.", технологичес-

там иярпмзтрш и по свойствам самого иормента.

о. Разработала технологическая пхема и рекиш получения «ферментного препарата бета-сиеци'Тичпой ЩТ-ази на основе культуры /0ae¿6íe/4 Ю34. Полученные оисиершенталыши путем данные

])ОС.я;';."лз.;п1 основой дал составления лабораторного регламента, в соответствии с которым была получена опытная партия ферментного препарата.

4. Изучено действие ЦГТ-ази 1064 на крах-

мал jj процессе его ферментолиза. Показана перспективность использования данного бэта-специфичного ферментного препарата по срав-нешдо с 'градационно применяемыми црзнаратами ал&оа-сиецифичноЯ ЦГТ-ази jB A^aeenzoá . Установлено, что выход бета-ИД в результате ферментолиза крахмала под действием ЦГТ-азы #ae¿C£v¿ ty. выше на 26 7», чем в ферментолизатах, получаемых с помощью ферментов

/пасемм . Экспериментально пока зано, что на основе ЦГТ-ази, культуры ¿jo. 1064 мошга получать ЦД без использования

органпчесгшх тистворитэлей.

0. Показана возмошгасть получения комплексов включения с бета-ВД непосредственно в процессе фе].ментолиза крахмала, минуя стада наделения и очистки ЦД в кристаллической «Jópese, что способствует удешевлению процесса, сокращению энергозатрат, а также пош'лению выхода конечного продукта в ¡»счете на исходный крахмал. Получен кошиекс включения бета-ЦД с валидолом в процессе Ферментолиза с выходом конечного продукта в интервале от 40 до 30 <?,.

СПИСОК

работ-, опубликованных по материалам диссертации

1. Терехова Ti.Л., Косоротова 3.T.I., Альперович Е.Д. Селекция продуцентов щпмодекстрниглюканотрансфоразыТезисы докладов

У10 конференции молодых ученых а специалистов, посвященной 60-летию образования МТИШ1, Москва, 1991.

1. Лльнерович В.Д., Косоротйва Ь\М., Грачева И.М. Изучение биосинтеза щнслодекстрипглшанотрансферазы штаммом £ас*££е/4 ^А и 13 1013.- Тезисы докладов конференции, посвадеппой 60-летию ПТИПП, Москва, 1991.

3. Косоротова ЕЛ.!., Алытерович Ё.Д., Усанов Н.Г., Грачева 11.1.!. Изучение свойств ферментов различных продуцентов цикло-л.окстрипглюканотрапсферазы.- Тезисы докладов конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами". Москва, 1993 {в печати).

4. Косоротова З.П., Лльпдрович З.Д., Усанов Н.Г., Грачева И. 1л. Получение бета-циклодекстрииа с использованием новых бета-специфичных вдклодекстринглшанотрансфераз. /Деп. в ВИНИТИ, 1993г. (в печати).

3. Косоротова З.М., Лльперович Н.Д., Усанов Н.Г., Грачева Н.П. Сравнительное изучение бета-специфичных циклодекстрин-глжиапоа'раисфераз./Деп.в ЕШИТИ, 1933г. (в печати).