автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка технологий гамма-циклодекстринглюканотрансферазы, гамма-циклодекстрина и комплексов включения на его основе

На правах рукописи

005004574

ШИПАРЕВА ДАРЬЯ ГЕРАСИМОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ ГАММА-ЦИКЛОДЕКСТРИНГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗЫ, ГАММА-ЦИКЛОДЕКСТРИНА И КОМПЛЕКСОВ ВКЛЮЧЕНИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических

активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

- 1 ДЕК 2011

Москва-2011

005004574

Рабата выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Иванова Людмила Афанасьевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Карпенко Дмитрий Валерьевич, кандидат биологических наук, доцент Типисева Ирина Анриевна

Ведущая организация: ГНУ ВНИИ Пищевой биотехнологии РАСХН

Защита состоится: « /^ г^&ьс^АЛ 2011 г. в в ауд. £Ойщ заседании

Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д212.148.04 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГУПП. Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, МГУПП, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.148.04.

Автореферат отправлен по адресу referat_vak@mon.gov.ru для размещения в сети Интернет Министерством образования и науки РФ и размещен на сайте www.mgupp.ru.

Автореферат разослан « -/У» ноября 2011 г.

диссертационного совета, к.т.н.

Ученый секретарь

Тимофеев Д.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Циклодекстрины (ЦД) - уникальная группа химических веществ, обладающих специфической функциональной активностью. Они представляют большой интерес для пищевой, фармацевтической, химической и других отраслей промышленности благодаря способности образовывать комплексы включения. ЦД используются для стабилизации летучих эфирных масел, ароматических веществ и специй, повышения устойчивости и улучшения усвояемости витаминов, пролонгирования действия лекарств, снижения их вредного воздействия, устранения нежелательного запаха и вкуса и т.д.

Поскольку синтез этих соединений химическими методами очень дорог, в промышленных масштабах ОД можно получать лишь ферментативным путем при помощи специальных ферментов, называемых циклодекстрипглюканотрансферазами (ЦГТазами). В целом процесс получения ЦД сводится к следующим основным этапам: 1) культивирование микроорганизма - продуцента ЦГТаз, 2) выделение ферментного препарата из культуральной жидкости, 3) получение ЦД с помощью препарата ЦГТ-азы.

В настоящее время выпуском ЦД заняты фирмы в различных странах мира. Бесспорное лидерство в производстве ЦД принадлежит китайским, а также японским, индийским и американским фирмам. Стоимость Р-ЦЦ, промышленного производства в зависимости от степени очистки составляет 1,5-8$ США за кг, а-ЦД - 25-40$ США за килограмм и у-ЦД 40-100$ США за кг.

В настоящее время в России производство ЦГТ-аз и ЦД отсутствует, хотя исследования в этом направлении проводились. Тем не менее, во всех высокоразвитых странах интерес к комплексам включений на основе ЦД только возрастает. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ЦГТ-аз и ЦД актуальна и перспективна.

Настоящая работа посвящена разработке технологий у-ЦГТазы, у-ЦД и комплексов включения на основе у-ЦД.

Цель и задачи исследования.

Основные цели диссертационной работы состояли в поиске нового активного продуцента у-ЦГТ-азы, разработке технологии очищенного ферментного препарата у-ЦГТ-зы Г10Х, получении у-ЦД и комплексов включения на его основе.

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

- скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора штамма, обладающего наибольшей у-ЦГТ-азной активностью;

- идентификация штамма-продуцента у-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;

- подбор оптимального состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента;

- разработка технологии получения ферментного препарата у-ЦГТ-азы Г10Х;

- биоконверсия крахмала в циклодекстрины с помощью полученного препарата у-ЦГТазы Г10Х;

- выделение у-ЦД из реакционной смеси;

- получение комплексов включения на основе у-ЦД.

Научная новизна работы.

Проведен направленный скрининг микроорганизмов, обладающих у-ЦГТазной активностью, выделенных из различных видов почв.

В результате скрининга для исследований отобран штамм-продуцент у-ЦГТазы с максимальной активностью (15 ед/см3). На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм, продуцирующий у-ЦГТазу, идентифицирован как Bacillus thuringiensis АЛБ.

Впервые в РФ выделен продуцент ЦГТазы, трансформирующий крахмал преимущественно в у-ЦД. На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом у-ЦГТазной активности от условий культивирования и выхода фермента, от параметров выделения и очистки, разработана биотехнология ферментного препарата у-ЦГТазы.

При использовании полученного в результате скрининга нового штамма-продуцента y-ЦГГазы с учетом экспериментально обоснованных зависимостей выхода у-ЦД от способов предварительной обработки крахмала, разработана биотехнология получения у-ЦД.

Разработаны способы получения комплексов включения у-ЦД с рыбьим жиром и витаминами I: и В2 на основе молекулярных моделей и анализа физических методов обработки.

Выявлено положительное влияние процесса комплексообразования с у-ЦД на устойчивость биологически активных веществ (БАВ) к воздействию света и кислорода воздуха.

Практическая значимость и реализация результатов работы.

В результате скрининга почвенных ЦГТ-активпых изолятов бактерий создана лабораторная коллекция микроорганизмов, секретирующих у-специфнчные ЦГТ-азы. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Bacillus thuringiensis АПБ разработана биотехнология получения препарата у-ЦГТазы Г10Х.

Разработаны проекты Лабораторного регламента и Технических условий на ферментный препарат у-циклодекстринглюканогрансфераза Г10Х. Проведена наработка препарата у-ЦГТ-азы Г10Х в условиях опытного производства. Полученные результаты подтверждены актом ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко».

Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии у-ЦГТазы Г10х, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне мировых рыночных цен и составляет 2174 руб за 1 кг.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis АПБ депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКГ1М В-11066. Подана заявка на выдачу патента РФ «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis АПБ -продуцент у-циклодекстринглкжанотрансферазы»

Получены комплексы включения рыбьего жира и витаминов Е и В2 с у-ЦД с молярным соотношением компонентов от 1:1 до 1:5. В лабораторных условиях кафедры «Технология продуктов общественного питания» МГУПП изготовлен бисквит с добавлением комплексов витаминов Е и В2 с у-ЦД. Показано, что применяемые комплексы не оказывают негативного влияния на форму, структуру и консистенцию бисквита и аромат продукции, улучшают вкус и повышают пищевую ценность получаемых продуктов, обогащая их БАВ. Результаты проведенной работы подтверждены актом лабораторных испытаний.

На заводе ОАО «Московская косметическая фабрика «Рассвет» произведена опытная партия крема, содержащего комплекс включения витамина Е с у-ЦД.

Добавление комплекса в состав крема не влияло на его внешний вид, цвет, запах и стабильность. Комплекс витамина Е с у-ЦД позволяет предупреждать преждевременное старение кожи и снижает вредное воздействие ультрафиолетового излучения. Полученные результаты подтверждены актом.

Подана заявка на патент «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ЛПБ -

продуцент у-циклодекстринглюканотрансферазы» от 01.11.2011 г.

Апробация работы.

Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 2009); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва 2009); III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж 2009): VII Международной научно-практической конференции и выставке «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» (Москва 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 заявка на патент РФ, где отражены основные положения диссертации

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 202 источника, и 11 приложений. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 21 таблицу и 31 рисунок.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В литературном обзоре освещена история исследования ЦД и развития их производства в мире. Рассмотрены строение и свойства ЦД и ЦГТ-аз, основные продуценты данных ферментов, приведены примеры использования ЦД в пищевой, фармацевтической и других отраслях промышленности. Описаны реакции, катализируемые ЦГТ-азами, а также способы получения ЦД с помощью ЦГТ-аз. Рассмотрены методы получения комплексов различных веществ с ЦД.

Анализ данных литературы выявил проблемы, существующие в данной области, и позволил сформулировать цели и задачи настоящего исследования.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3.1. Материалы и методы исследований Образцы почвы для скрининга. В качестве природных источников изолятов бактерий использовались образцы почв: Московской, Тамбовской, Псковской, Новгородской областей, Краснодарского края, а так же образцы почв, привезенные из Казахстана, Туркменистана, Вьетнама, Египта и острова Крит. С момента отбора материал хранили при температуре +4°С в течение 1-3 месяцев.

Скрининг ЦГТ-активиых микроорганизмов из природных мест обитания. Скрининг микроорганизмов - продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, проводили согласно схеме, разработанной сотрудниками Института биологии Уфимского научного центра РАН, с введением некоторых модификаций (Терехова Б. Я, 1999).

Питательные среды. Среды, используемые при проведении скршшига. Среда «А», г/дм3: крахмал- 10,0, пептон -5,0, дрожжевой экстракт -5,0, К2НР04 -1,0, MgS04*7II20 -0,2, Na2C03 -10,0. Среда «Б», г/дм3: крахмал -10,0; пептон -5,0; дрожжевой экстракт - 7,0; К2НР04 -0,5; Na2C03 - 5,0; MgS04*7H20-0,3. Среда "Вг/дм3: крахмал - 10,0; К2НР04 - 0,5; пептон - 7,0; дрожжевой экстракт - 7,0; Na2C03 - 5,0; MnS04*7H20 -0,3; MgS04*7H20 -0,3.

Среды, используемые для проведения идентификации бактерий. Для идентификации бактерий использовали питательные среды производства ФГУП ГНЦ ПМ, п. Оболенск.

Морфология клетки. Морфологию, подвижность и размеры клеток исследовали с помощью фазовой оптической микроскопии на микроскопах МИКМЕД 5, БИОЛАМ.

Фенотипическая характеристика. Изучение морфологических и физиолого-биохимических характеристик выделенных культур проводили, руководствуясь общей стратегией фенотипической дифференциации, описанной в руководствах: «Определитель бактерий» (Bergey's manual, 1997), «Методы общей бактериологии (Герхард, 1983).

Определение последовательностей гена 16S рРНК.

Идентификация проводилась путем анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК, а также ПЦР анализа с использованием видоспецифических праймеров сотрудниками ФГУП «ГосНИИГенетика»..

Качественное определение у-ЦГТазной активности штаммов продуцентов,

выращенных на тест-средах проводили модифицированным методом Тильдена-Хадсона (Tilden Е.В., Hudson C.S., 1942).

Количественный метод определения активности у-ЦГТазы. Измерение активности у-специфичной ЦГТазы проводили спекхрофотометрически -модифицированным бромкрезоловым методом (Kato, Horikoshi, 1984).

ВЭЖХ - анализ продуктов ферментативной конверсии крахмалов проводили на колонке Shimadzu LC-20 (колонка 150x4.6 Reprosil Amino, элюент ацетонитрил-вода 65:35, скорость потока 2 см3/мин) в центре прикладных разработок в области хроматографии фирме «СКАН».

Содержание витаминов в комплексах определяли фотометрическим (КФК-3) и флуориметрическим методами (Shimadzu RF-5Û00).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программ Statistica 6.0 и Microsoft Excel 2007, в работе представлены средние результаты с достоверностью 95%.

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.2.1. Скрининг ЦГТ-активиых микроорганизмов из природных мест обитания

В процессе работы было получено более 400 изолятов культур, осуществляющих деструкцию крахмала. Все они были проверенны на способность к биосинтезу у-Ц1Тазы модифицированным бромкрезоловым методом. Все изоляты после глубинного культивирования были проанализированы на ß-ЦГТ-азную активность фенолфталеиновым методом. В результате проведенного скрининга для дальнейших исследований был отобран 1 у-ЦГТ-активный штамм АПБ, показавший наибольшую активность 15 ед/см3

3.2.2. Исследование фенотнпических признаков и идентификация штамма АПБ

продуцента у-ЦГТ-азы

Исследование морфологических и культуральных признаков штамма АПБ показало, что выделенный при скрининге штамм принадлежит к аэробным бактериям, образующим эндоспоры, располагающиеся в терминально и субтерминально и не раздувающие клетку. Через 24ч инкубации при 37°С обнаруживаются подвижные грам-положительные палочки размером 0,5x3,9 мкм. На плотной среде бактерии формируют круглые колонии диаметром от 1,0мм до 4,0мм, поверхность колоний гладкая, с полупрозрачной, блестящей кремовой структурой. Цвет колоний белый с желтоватым оттенком, профиль выпуклый, четко сформированный рост по «штриху».

Морфологические и культуральные признаки исследуемой культуры при сравнении её с тест-культурой позволяют отнести ее к бактериям рода Bacillus.

Для выявления видовой принадлежности изучались физиолого-биохимические признаки: потребление углеводов и сахаро-сгшртов, отношение к кислороду, отрицательная реакция Фогес-Проскауэра, каталазная активность. На основании полученных данных установлено, что исследуемый микроорганизм принадлежит к роду Bacillus.

Для достоверности идентификации были изучены филогенетические особенности культуры. Сиквенс 16S rRNA, проведённый поиск гомологичных последовательностей с построением филогенетического дерева (рис.1) и ПЦР анализ с использованием видоспецифических праймеров показали, что выделенный нами штамм с точностью 99% относится к роду Bacillus вида thuringiensis.

-Bftogu&w Cfewringpwtgjg ¿■ысу.'лх гыиг.игАД;? УЭТ-020

,$8*еШив «wwjbi ЗбОМХШЗ Bacillus njtthmzio290203*37о SaciUuK ¿aebracis; Iäi00326ill s»-cl i овгейё; S3 >1 7

terillu® etwosj aeottttW)

a&ci 11-ЛГ. cereüS; 20Gw324S1 Bacillus ÄdJthraciei Вгътпе

Рис.1. Филогенетическое дерево с гомологичными штаммами unknown -исследуемый штамм

Таким образом, на основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый штамм АПБ, продуцирующий преимущественно у-ЦГТазу, идентифицирован как Bacillus thuringiensis.

3.2.3. Определение наиболее эффективного соетаза питательной среды для

Определение наиболее эффективного состава питательной среды для глубинного культивирования Bacillus thuringiensis АПБ проводили по результатам реализации метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта. Факторами, влияющими на эффективность биосинтеза ЩТ-аз культурой Bacillus thuringiensis АПБ являются концентрации в питатель крахмала, пептона, КН2Р04, дрожжевого экстракта, Na2C03, MgSQ4*7H20.

|B«illu® Qtt«aei Ш» —Мвм>1Ш» гэтеил!?«

' 'sariliue -ссгжш: V

биосинтеза ЦГТ-азы Bacillus thuringiensis АПБ.

Процесс определения наиболее эффективного состава питательной среды заключался в выборе уровней каждого фактора, обеспечивших наибольший эффект. Такими уровнями оказались концентрации компонентов в среде: 1,0% крахмала, 0,5% пептона, 0,7% дрожжевого экстракта, 0,05% КН2Р04, 0,03% MgS04*7H20 и 0,5% Na2C03. Это сочетание уровней факторов дает результат, превышающий среднюю активность у-ЦГТазы в этой серии опытов на до 16,0 ед/см3.

Таким образом, оптимальным для Bacillus thuringiensis АПБ является следующий состав питательной среды (%): крахмал - 1,0; пептон - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,7; КН2Р04 - 0,03; Na2C03 - 0,5; MgS04*7H2Q - 0,03 (среда «Б»),

3.2.4. Изучение влияния микроэлементов и стимуляторов на накопление к активность у-ЦГТ-азы Bacillus thunngiensisAJJE Для изучения влияния микроэлементов на биосинтез у-ЦГТаз в питательную среду добавляли следующие соли: FeS04x7H20; Co(N03)2x6H20; CuS04x5H20; ZnS04x7H20, MnS04x7H20. Результаты показали, что наиболее высокий выход активности у-ЦГТ-азы 17 ед/см3 может быть достигнут при добавлении в питательную среду соли Мп2+.

3.2.5. Изучение влияния pH исходной ферментационной среды на биосинтез у-ЦГТазы бактериями Bacillus thurirtgiensisA ПIi Результаты исследований по изучению влияния pH ферментационной среды на биосинтез у-ЦГТазы бактериями Bacillus thuringiensis АПБ представлены на рис. 2. где видно, что в диапазоне pH 9,5-10,5 достигается максимальная активность фермента. Таким образом, при культивировании Bacillus thuringiensis АПБ pH среды после стерилизации должен находиться в диапазоне 9,5-10,5.

7.5 8 3,5 9 9.5 10 10.5 21 11.5 12

pH

Рис.2. Влияние pH исходной питательной среды на биосинтез у-ЦГТазы

3.2.6. Разработка способов получения посевного материала Bacillus thuringiensis

АПБ

В ходе экспериментов по определению требуемого возраста и дозы посевного материала Bacillus thuringiensis АПБ выращивали на среде улучшенного состава в течение 24,30,36,42 и 48ч в колбах на качалочной установке при 30°С, после чего определяли активность у-ЦГТазы в нем. Затем проводили засев ферментационной среды готовым посевным материалом в количестве 1; 2; 3; 5; 7; 10% по объему. Наибольшую активность ЦГТ-азы в культуральной жидкости - 17,0 ед/см3 обеспечивает использование посевного материала Bacillus thuringiensis АПБ в возрасте 36ч и посевной дозе 5%.

2.2.7. Изучение динамики биосинтеза фермента у-ЦГТазьи бактериями Bacillus thuringiensis АПБ.

Питательную среду состава "В" засевали суспензией клеток бактерий Bacillus thuringiensis АПБобъем посевной дозы 5%, возраст посевного материала 36 ч. Культуру выращивали в течение 1-4 сут на качалочной установке при температуре 30±1°С и измеряли pH культуральной жидкости и активность у-ЦГТазы через каждые 24 ч. Результаты исследований представлены на рис. 3.

24 48 72 96

Время, »г а рн

N Активность, ед/смЗ |

Рйс.З. Динамика биосинтеза у-ДГТазы бактериями Bacillus thuringiensis АПБ Из полученных данных следует, что у-ЦГТ-аза начинает синтезироваться баг-стернями Bacillus thuringiensis АПБ лишь после 24 ч и накапливается к 72 ч культивирования. Поэтому культивирование Bacillus thuringiensis АПБ на улучшенной питательной среде целесообразно вести трое суток, т.к. к этому времени наблюдается максимум ферментативной активности.

2.2.8. Осаждение у-ЦГТазы Bacillus thuringiensis АПБ из культуралькой

жидкости

Выращивание культуры Bacillus thuringiensis АПБ проводили в качалочных колбах со 100 см3 питательных сред состава "В" в течение 72 ч и температуре 30°С. По окончании культивирования культуральную жидкость центрифугировали в течение 15 мин при 8000 об/мин.

В качестве осадителей использовали этанол, ацетон и изопропанол в соотношениях осадите ль: культуральная жидкость (КЖ) 2:1; 3:1; 3,5:1; 4:1. Осаждение ферментов из культуральной жидкости проводили при температуре 5°С.

Наиболее эффективно осаждение у-ЦГТазы из культуральной жидкости Bacillus thuringiensis АПБ происходит этанолом в соотношении 3,5:1, при этом выход препарата с максимальной активностью у-ЦГТ-азы 1055 ед/г составил 6 г/дм3.

Для выбора наиболее эффективной концентрации осадителя, активный белок из культуральной жидкости осаждали этанолом различной концентрации (70-96 % об) в соотношении 3,5:1. Наиболее эффективной концентрацией этанола для осаждения у-ЦГТ-азы Bacillus thuringiensis АПБ является 96% об.

Для определения оптимального значения pH культуральной жидкости, осаждение у-ЦГТ-азы Bacillus thuringiensis АПБ 96% этанолом из культуральной жидкости в соотношении 3,5:1 проводили в диапазоне изменения pH от 6,0 до 10,0. Максимальный выход препарата 6,0 г/дм3 получен при значении pH 8,0. у-ЦГТ-азиая активность составила 1060 ед/г препарата.

2.2.9. Наработка опытных партии препарата у-ЦГТазы Bacillus thuringiensis АПБ ГЮх.

На основании лабораторных исследований был разработан лабораторный регламент по производству ферментного препарата у-ЦГТазы ГЮх и технические условия на ферментный препарат у-ЦГТаза ГЮх. Согласно этим нормативно-техническим документам наработку опытных партий препарата у-ЦГТазы Bacillus thuringiensis АПБ осуществляли на пилотной установке ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко» по схеме, представленной на рис. 4.

Культивирование продуцента у-ЦГТазы Bacillus thuringiensis АПБ проводилось в лабораторном ферментере общим объемом 10 дм3 (рабочий объем 7 дм3) на питательной среде следующего состава (г/дм3): крахмал - 10,0; пептон - 7,0; дрожжевой экстракт - 7,0; Na2C03 - 5,0; К2НР04 - 0,5; MnS04*7H20 -0,3; MgS04*7H20 -0,3.

ВР [Прием и /ранение 1.1 \сырья

Биапог,проверка \а,рьр

Пекогасите/., са ст ВРГ\ ,420

Прием и хранение

| Прием и хран сь'рь^ к поз ВР 235и

ТП 7.8.9.13.1519 №020

Приготовление змульсии многое.

Стерилизация

1ЯР подготовка пекагоситш -~К паз /77 ДО

}г 0№ 1 Очисто апокоб

Атмасф дозд

Получение сжат.

Сьисяки схст.доз£ 6 табн. фильтра,

Ьсяерильн доздахщ

ОтВР1 № Пригт р-ра

и щелочи

Мзсщ ср-ба^

ВР Мойка и стерил. 5.Г '

г

для оегулир рН '(-«- к поз. 0601

Пробврка на герметичн.

- К поз ТП8.9.10.Ю2Л1Ь.17 " Конденсат 6 натешу в

ГП 71 григот лидаЩ|/ ерей}

ГП 72 'тери/шэатм средьк ) копдах

ТП \3aceb пиши г ссЩ 73 [исходной кцаытщ

> Вь'раш постного у-итер. в побор

Зоздцх с ВР]

И а? Пригстздтие тшп сред*

от и Стеришсиия пшют средь:

ТП и ЗасеВ 1 питт среды 1

ТП I Бырощтсейнтт. {—-_ К ¡юз. ОБ01

8 \5 посеЬн. апаар )-—,

ОВВ Очистка быходнаи Ёаздухс

Ш, Охлаждение 1 оборотной (¡оды

Пенагасутепь с с ст ВР2

Воздух с 8РЗ

Вода оШаротноя

Приготовление пищ.

Пор, додд ^ ... бруйашу 19.2

ТП \Произ6адстденния 9

_ К поз ОБО 1.2 "Кпоз. ОБВ

Центрифугирование^

'Ч

ТП Подготовка 11.} | теплоносителя

ТП \Канцентриродание (-11 фильтрата на 8ВЬ'\

ТП Сепарирование 1 !— 12 йтделнезх,Убссдт\

Вода ТП Осаждение фермен-

13 тпб из концентрате

ТП I Сепар.2 отдел ферм 'А осад.из д-сп снеси\

Вода ТП ! Обработка фермер спирт I --------

ТП I Сепарироданче 3

[5П 12£1

:ушильного агента

г®

(13 (препарата

Биомасса на сушку

■ПО Отработ спирт \2 на ректификации

Наполнитель ТП

19 базой преп и налом.

Тара УМО 20 Упаковка. маркир отгрузка

К паз ОБВ

- Пыль на 058 ~Лшь на ОБВ

- Г отаЬый продукт но склад

Рис.4. Блок-схема процесса биотехнологического получения ферментного препарата гамма-ЦГТазы ГЮх

Температура культивирования 30±1°С, рН питательной среды 10,0-10,2, количество посевного материала 5%, степень аэрации 1 объем воздуха на 1 объем среды в минуту, перемешивание 270 об/мин, длительность культивирования 72 ч.

Посевной материал получали в колбах объемом 250 см3 со стерильной питательной средой объемом 50 см3 на качалочной установке с частотой 220 об/мип. Дл засева колб использовали косяки с чистой 36-часовой культурой Bacillus thuringiensis ЛПБ.

Состав питательной среды для выращивания посевного материала (г/дм3): крахмал - 10,0; пептон - 7,0; дрожжевой экстракт - 7,0; Na2C03 - 5,0; К2ПР04 - 0,5; MnS04*7H20 -0,3; MgS04*7H20 -0,3 (рН сред после стерилизации 10,0-10,2). Длительность выращивания посевного материала 36ч, температура культивирования 37±1°С.

Полученную культуральную жидкость подвергали центрифугированию в течение 20 мин при 15000 об/мип на центрифуге «Bcckman Model J2-21» с целью отделения биомассы микробных клеток.

Фугат культуральной жидкости (6 дм3) подвергали концентировашпо в 2,4 раза на вакуум-выпарной установке УВВ-50. Концентрат в объеме 2,5 дм3 охлаждали до 2°С. Осаждение ферментов вели периодически в емкости объемом 5 дм3 охлажденным этанолом при соотношении этанол : культуральная жидкость 3,5:1. Сформировавшийся осадок отделяли на центрифуге, перерастворяли в небольшом количестве воды и сушили без добавления наполнителей в сушилке лиофильной «Advantage». Выход воздушно-сухого препарата у-ЦГТаза ГЮх составил 9,5 г/дм3 (общий выход препарата 66,5 г). Активность у-ЦГТазы в готовом препарате составила 1050ед/г. Оптимум действия препарата: рН - 6,0; t - 40° С.

Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии у-ЦГТазы Г10х, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне мировых рыночных цен и составляет 2174 руб за 1 кг.

2.2.10. Разработка условий ферментативной конверсии крахмала в у-ПД.

2.2.10.1. Предобработка крахмала ферментными препаратами а-амилаз.

При ведении процесса получения у-ЦД с применением а-амилаз для разжижения картофельного крахмала, были использованы следующие ФП:

1. а-амилаза (жидкая) - Ликвамил -1200 Л,ООО «Русфермент», 1050 едАС/см3

2. а-амилаза (жидкая) - Ликвамил ВНИИ ПБТ, 2250 едАС/см3.

Для установления наиболее эффективных условий разжижения крахмала под действием ферментных препаратов а-амилазы, а именно, времени разжижения и концентрации разжижающего фермента, 5% крахмальный клейстер нагревали до 40°С и вносили растворы а-амилаз в количестве от 0,01 до 1,0 ед/г крахмала. Через каждые 10 мин. в течение часа из реакционной смеси отбирали пробы, инактивировали и определяли декстрозный эквивалент (ДЭ). Результаты представлены в табл.1.

Таблица 1

Влияние концентрации ФГ1 Ликвамил ВНИИ ПБТ и Ликвамнл-1200Л и времени

разжижения 5% крахмального клейстера на величину ДЭ

Время разжижения, мин Концентрация ФП Ликвамил-1200 Л, едАС/г крахмала Концентрация ФП ВНИИ ПБТ, едАС/г крахмала

1 0,5 од 0,05 0,01 1 0,5 0,1 0,05 0,01

ДЭ,% дэ,%

10 2,40 1,88 1.50 1,08 0,92 8,34 7,00 5,52 2,50 2,30

20 2,84 2,18 1,88 1,24 1,04 8,54 7,20 5,72 2,72 2,40

30 3,30 2,44 2,18 1,72 1,30 9,54 7,40 6,02 4,02 2,60

40 3,70 2,84 2,42 2,08 1,68 10,04 8,20 7,44 5,52 2,72

50 3,92 3,16 2,82 2,52 2,04 10,24 9,00 7,74 6,82 5,02

60 4,02 3,32 3,12 2,82 2,40 10,34 10,00 9,90 7,94 6,32

Оптимальный для выхода ЦД ДЭ (равный 1) может быть достигнут при концентрации ФП Ликвамил-1200Л 0,01 ед/г крахмала за 20 мин. или 0,05 едАС/г крахмала за 10 мин.

Учитывая, что процесс получения ЦД должен быть по возможности мало затратным (предпочтительно применение минимальных количеств ферментов), а так же тот фактор, что проводить процесс в производственных условиях в течение короткого времени может быть затруднительно (ввиду большой инерционности технологических процессов) представляется целесообразным проведение процесса при использовании ФП Ликвамил-1200Л, ООО «Русфермент» в концентрации 0,01 едАС/г крахмала в течение 20 мин.

2.2.10.2. Определение оптимальных условий биоконверсии крахмала у-ЦГТазой Bacillus thuringiensis АПБ

Для изучения влияния дозировки ферментного препарата и длительности биоконверсии на выход у-ЦД 5%-ный картофельный крахмал обрабатывали а-амилазой Ликвамил-1200Л в концентрации 0,01 едАС/г крахмала в течение 20 мин.

Затем фермент инактивировали кипячением, смесь охлаждали до 40°С и вводили у-ЦГТазу ПОх в разных дозировках (см. табл.2). Каждые 12 ч из реакционной смеси отбирали пробы и определяли содержание у-ЦД бромкрезоловым методом.

Таблица 2

Влияние дозы ферментного препарата у-ЦГТазы Bacillus thuringiensis ЛПБ и

времени конверсии на выход у-Ц Д из крахмала

Количество у-ЦГТазы, едЦгА/г СВ крахмала Время реакции, ч Выход у-ЦД, г/дм3

1,0 12 2,0

24 3,2

36 4,4

2,0 12 2,2

24 3,7

36 4,1

3,0 12 3,6

24 7,6

36 8,8

4,0 12 5,8

24 7,6

36 9,2

5,0 12 4,0

24 9,1

36 8,6

6,0 12 5,3

24 8,9

36 7,4

В результате исследований выяснилось, что наибольший выход 9,1-9,2 г/дм3 происходит при обработке крахмала 4 едЦгА/r СВ в течение 36 ч и 5 едЦгА/г СВ крахмала в течение 24 ч. Увеличение времени обработки у-ЦГТазой крахмального клейстера приводило к дециклизации уже образованных ЦД.

2.2.11 Разделение ЦД на основе их растворимости в различных растворителях.

Для получения ЦД к предварительно обработанным а-амилазой 5%-ным растворам картофельного крахмала (рН 6,0) добавляли препарат у-ЦГТ-азы из расчета 5 едЦгА/г крахмала. Пробы инкубировали в течение 24 ч. в герметично закрытых колбах при 40°С на качалочной установке (180 об/мин). Затем реакцию останавливали кипячением и обрабатывали глюкоамилазой для полного осахаривания крахмала. Полученную смесь упаривали в 2 раза при температуре 70-80°С на вакуум выпарной установке и охлаждали до температуры 5-И0°С. Выпавшие кристаллы [3-ЦД отделяли центрифугированием при 8000 об/мин. К фугату приливали равные количества (но

объему) охлажденного 99%-ного изопропанола и тщательно перемешивали.

16

Выпавший осадок у ЦЦ отделяли на центрифуге при 8000 об/мин в течение 10 мин. Полученный фугат снова упаривали в 2 раза, охлаждали и приливали равные количества (по объему) 98%-ного пропанола. При этом выпадали кристаллы а-ЦД. Собранные осадки ЦД высушивали при комнатной температуре в течение 24 часов. В результате эксперимента получили осадки:

в а-ЦД 6,4 г/дм1 (12,8% от исходного крахмала) ® [3-ЦД в количестве 2,4 г/дм"1 (4,8% от исходного крахмала) ® у-ЦД 10 г/дм3 (20% от исходного крахмала) Чистоту полученных таким способом кристаллов у-ЦД проверяли методом ВЭЖХ, которая проводилась в Центре прикладных разработок в области хроматографии фирмы «СКАН». Хроматограмма представлена на рис.4. Результаты хроматографии показали, что содержание у-ЦД в полученном осадке составляет 88,8%.

Г

1

V» (««О /

I 1 1 1 1 I

1-й 2.0

С--

•М Р>

Р

Рис.4.Хроматограмма осадка у-ЦД

3.2.12. Получение комплексов зключения витамина Е с у-ЦД Для изучения возможности создания комплекса у-ЦД с ц-токоферол ацетатом (витамином Е) использовали молекулярное моделирование комплекса в программе СЬет(Жюе12.0.

Построенные молекулярные модели веществ (рис.5) подтверждают возможность образования комплекса между а-токоферол ацетатом и у-ЦД. Пространственная «вытянутость» молекулы витамина Е не исключает образования комплексов «витамин Е:у-ЦД» со стехиометрией как !: 1, так и 1:2.

Рис.5. Возможные молекулярные модели комплекса а-токоферол ацетата с у-ДД: а) за счет проникновения хроманового кольца витамина в полость у-ЦД, б) за счет проникновения изопреноидной боковой цепи витамина в полость у-ЦД, в) в соотношении а-токоферол ацетат : у-ЦД 1:2

Наилучшие результаты были получены при использовании метода получения комплексов «растирание в пасте». Смесь витамина Е и у-ЦД увлажняли небольшим количеством воды и растирали в течение 2-3 ч с последующим высушиванием продукта в вакуум-сушильном шкафу при 1°=45±2°С. Процесс комплексообразования контролировали, используя микроскопирование комплексов: по отсутствию масляных включений - свободного витамина Е, и по исчезновению кристаллов у-ЦД (смена на аморфоподобную массу).

Степень включения витамина Е в полость р-ЦД оценивалась спектрофотометрическим методом (/=285,5 нм). Результаты исследования представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Характеристика комплексов включения у-ЦД с витамином Е.

Комплекс «витамин Е:у-ЦД» Соотношение в комплексе «витамин Е: у-ЦД» 1:1 Соотношение в комплексе «витамин Е: у-ЦД» 1:2

Содержание витамина Е в комплексе, % 23 10

Влажность полученного комплекса, % 8 12

Для определения стабильности полученных комплексов при хранении их оставляли при комнатной температуре в герметичных емкостях в течение недели. По истечении срока определяли остаточное содержание витамина. Кроме того, для

сравнения использовали комплексы включения витамина Е с (3-ЦД, полученными по той же методике. В результате исследований выяснили, что наиболее стабильным является комплекс витамина Е с у-ЦД в соотношении 1:2.

3.2.13. Получение комплексов включения витамина В2 с у-ЦД Существование комплекса витамина В2 с у-ЦД возможно, исходя из пространственного строения витамина В2, гидрофобности и степени поляризации его отдельных частей (рис.б).

Рис. 6. Возможные молекулярные модели комплекса рибофлавина с у-ЦД: а) рибофлавин: у-ЦД, 1:1; б) рибофлавин: у-ЦД, 1:2.

Для получения комплекса у-ЦД с витамином В2 использовали метод комплексообразования в пасте. Для характеристики полученных комплексов включения, в них определяли содержание витамина В2 фотофлуориметрическим методом. Характеристика полученных комплексов по содержанию витамина В2 и массовая доля влаги представлена в таблице 4.

Таблица 4

Характеристика комплексов включения ЦД с витамином В2.

Комплекс «витамин В2:у-ЦД» Комплекс «витамин В2: у-ЦД» 1:1 Комплекс «витамин В2: У-ЦД» 1:2

Содержание витамина В2 в комплексе, % 77 55

Влажность полученного комплекса, % 8 10

Известно, что витамин В2 разрушается под действием солнечного света и, в частности, УФ-излучения. Для определения устойчивости комплексов к УФ готовили их водные растворы и подвергали действию УФ-излучения в течение 1 часа. По истечении времени определяли остаточное содержание витамина. Для сравнения взяли комплекс с ß-ЦД в оптимальном в соотношении 1:2. Результаты представлены

на рис.7. Результаты показали, что наиболее стабильным оказался комплекс витамина В2 с у-ЦД в соотношении 1:1.

ä> 100 -г" Д-»

М ------------.----_

СЕ ! |ШЯ ^хзж,

3 SO -г' ЩШ |«Я

я -ИМ...........§ш.....-......

s ! ^ шш&мшШ —

% 60 • - .

В 40

1 20 к

т щ

llfr -1 • .....-

Щр / Доо6рабои<иУФ

_ ^вдЩГ / Ппгпрлбплбтки УФ

'S i „ г -----«Иг После обработки УФ

Л 2 , '

Рис.7. Изменение содержания витамина В2 после обработки УФ. 1 - Витамин В2; 2 - Комплекс «витамин В2: у-ЦД» 1:1; 3 - Комплекс «витамин В2: у-ЦД» 1:2; 4 -Комплекс «витамин В2: Р-ЦД» 1:2.

3.2.14, Апробация полученных комплексов у-ЦД с витамином Е при изготовлении косметического крема.

Витамин Е очень важен для продуктов по уходу за кожей. Он питает кожу, является отличным антиоксидантом, обладает противовоспалительным, успокаивающим, смягчающим и увлажняющим свойствами. Однако, он чувствителен к свету и кислороду воздуха. Этот недостаток снижает его эффективность в косметических препаратах. Образование комплексов с ЦД позволяет надежно защитить витамин Е от разрушения. Кроме того, у-ЦД улучшает биодоступность витамина путем увеличения проницаемости мембран, поэтому его используют в рецептурах антивозрастных кремов.

Изготовление крема проводили на ОАО «Московская косметическая фабрика «Рассвет» по стандартной рецептуре. Введение комплекса витамина Е с у-ЦД производили на стадии приготовления жировой основы в количестве 0,01%.

В результате получили крем, представляющий собой стабильную однородную массу белого цвета, приятного цветочного запаха.

3.2.15. Апробация нолучениых комплексов у-ЦД с витаминами при изготовлении бисквитного полуфабриката.

Одним из направлений производства функциональных пищевых продуктов является обогащение их витаминами и .минеральными веществами. Внесение витаминов в продукты осуществляют в количествах, соответствующих степени этою дефицита, т. е. 30—50 % средней суточной потребности на 100 г изделия. Именно такой подход чаще всего используют при обогащении продуктов массового потребления, адресуемых самым широким слоям населения (мука, хлеб, молоко, напитки, кондитерские изделия и т. п.).

Для повышения пищевой ценности бисквитного полуфабриката комплексы «витамин Е:у-ЦД, 1:2» и «витамин В2:у-ЦД, 1:1» вводились в рецептуру в таком количестве, чтобы содержание витаминов в 100 г готового продукта составляло 50% от суточной нормы потребления.

Применяемые комплексы не требовали изменения технологического процесса, не оказывали негативного влияния на форму, структуру и консистенцию кондитерских изделий, не влияли на аромат продукции, вместе с тем повышалась пищевая ценность готового продукта за счет обогащения его витаминами, улучшались влагоудерживающие свойства полученного бисквита, вкус становился более мягким и тающим.

Выводы

1. Проведенный скрининг микроорганизмов-продуцентов у-ЦГТазы из различных источников позволил получить штамм с максимальной у-ЦГТазной активностью 15 едЦгА/см3.

2. Изучение культуральных, морфологических, физиолого-биохимических признаков и проведенный филогенетический анализ показали, что целевой штамм относится к роду Bacillus виду thuringiensis с точностью 99%.

3. Улучшен состав питательной среды для глубинного культивирования нового штамма Bacillus thuringiensis АПБ, при котором активность увеличилась на 15%.

4. Изучено влияние pH исходной питательной среды на биосинтез у-ЦГТазы бактериями Bacillus thuringiensis АПБ. Показано, что pH среды должен находиться в диапазоне 9,5-10,5.

5. Разработан способ получения посевного материала Bacillus thuringiensis АПБ, изучено влияние его возраста и дозы на активность у-ЦГТазы.

6. Исследована динамика биосинтеза у-ЦГТазы бактериями Bacillus thuringiensis АПБ. Максимум активности в культуральной жидкости приходится на 72 ч роста.

7. Подобраны оптимальные условия осаждения у-ЦГТазы этанолом: соотношение объемов 96% этанол : культуральная жидкость 4:1; pH культуральной жидкости 8,0, температура 2-3°С. При этих условиях был получен ферментный препарат со средней активностью у-ЦГТазы 1050 ед'г препарата. Проведенный экономический расчет показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне мировых рыночных цен и составляет 2174 руб за 1 кг

8. Установлено, что для получения у-ЦД ферментным препаратом предобработку крахмального клейстера необходимо проводить при использовании ФП Ликвамил- Л, ООО «Русфермент» в концентрации 0,01 едАС/г крахмала в течение 20 мин.

9. Выявлено, что синтез у-ЦЦ следует проводить с использованием у-ЦГТазы Г10х Bacillus thuringiensis АПБ из расчета 5 едЦгА/г крахмала в течение 24 ч или 4 едЦгА/г крахмала в течение 36 ч при t=40°C, pH 6,2. Выход у-ЦД при данных условиях составляет 18% от исходного сырья.

10.Разработан способ выделения у-ЦД из реакционной смеси на основе различия растворимости гомологов ЦД в растворителях

11. Разработаны компьютерные модели комплексов включения витамина Е с ЦД. Подобран оптимальный метод получения в лабораторных условиях порошкообразной формы витамина Е в виде комплексов включения с ЦД. Показано, что наиболее стабильным является комплекс включения витамина Е с у-ЦД с молярным соотношением 2:1.

12. Созданы компьютерные модели возможных комплексов включения витамина В2 с ЦД. Для получения комплексов включения в лабораторных условиях подобран оптимальный метод. Наиболее стабильным к действию УФ-излучения оказался комплекс витамина В2 с у-ЦД с молярным соотношением 1:1.

13.Введение комплекса витамина Е с у-ЦД в рецептуру косметического крема производили на стадии приготовления жировой основы в количестве 0,01%. В

результате получили крем, представляющий собой стабильную однородную массу белого цвета, приятного цветочного запаха.

14. Введение в рецептуру бисквигного полуфабриката комплексов витаминов Е и 02 с у-ЦД не требовали изменения технологического процесса, не оказывали негативного влияния на форму, структуру и консистенцию кондитерских изделий, не влияли на аромат продукции. Вместе с тем повышалась пищевая ценность готового продукта за счег обогащения его витаминами, улучшались влагоудерживающие свойства полученного бисквита, вкус становился более мягким и тающим.

Список публикаций 1 .Шипарсва Д.Г. Новый штамм-продуцент у-ЦГТ-азы. / Иванова Л.А., Строева С.С. // Материалы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 16-20 марта 2009г., т.2. - с. 284-285.

2.Шипарева Д.Г. Новый штамм-продуцент гамма-циклодекстринглюканотрансферазы. / Иванова J1.A. // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломопосов-2009», секция «Биология»/ Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев. — М.: МАКС Пресс, 2009 - с. 179

3. Шипарева Д.Г. Скрининг активных продуцентов у-ЦГТазы. /Иванова Л.А.//Сборник материалов III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития)». В Зт.ТЛ.Воронеж.гос.технол.акад.Воронеж,2009.-е. 558-561.

4. Шипарепа Д.Г. Гамма-циклодекстринглюканотрансфераза и источники ее получения. / Иванова Л.А., Асташкина A.B. // Сборник материалов VII Международной научно-практической конференции и выставки «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» 7-8 октября 2009/ Отв.ред. д.т.н. А.П.Нечаев. - М.: Изд.комплекс МГУПП, 2009. - с.381-385.

5. Шипарева Д.Г. Новый гамма-циклодекстринпродуцирующий штамм Bacillus sp.AilB и препарат гамма-ЦГТаза на его основе./ Иванова Л.А., Волкова A.C.// Естественные и технические науки, №6(50), 2010 г. - М.: ООО «Издательство «Спутник+». - стр.627-629

6. Шипарева Д.Г. Получение комплексов включения с циклодекстринами. / Иванова Л.А., Скрылева С.А., Тихонова И.С. // Пищевая промышленность, №10, 2011г. - М.: «Пищевая промышленность» - стр.67-69

7. Шипарева Д.Г. Циклодекстрины и комплексы включения на их основе. / Иванова Л.А., Войно Л.И. // Международный журнал экспериментального образования, № 11, 2011г.

8. Заявка на патент №2011144169. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis АПБ -продуцент у-циклодекстринглюкано-трансферазы. / Иванова Л.А., Шипарева Д.Г. -заявлено 01.11.2011 г.

Подписано в печать 10.11.11. Формат 60x90 '/и. Печ. л. 1,1. Тираж 200 экз. Изд. № 125. Заказ 153. Издательский комплекс МГУПП 125080, Москва, Волоколамское ш., 11

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1Д.Циклодекстрины: строение и свойства.

1.2. Циклодекстринглюканотрансферазы.

1.2.1. Реакции, катализируемые циклодекстринглюканотрансферазой.

1.2.2. Микроорганизмы-продуценты циклодекстринглюканотрансфераз.

1.3. Ферментативное производство у-ЦЦ.

1.4. Получение комплексов включения циклодекстринов.

1.4.1. Получение комплексов в водных растворах ЦД.

1.4.2. Приготовление комплексов в суспензии.

1.4.3. Твердофазный метод получения комплексов.

1.5. Применение у-Ц Д.

1.5.1.Пищевая промышленность.

1.5.2.Фармацевтивческая промышленность.

1.5.3. Косметическая промышленность.

1.5.4. Химическая промышленность.

1.5.5. Текстильная промышленность.

1.5.6. Другие области применения.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Микроорганизмы.

2.2. Образцы почвы для скрининга.

2.3. Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания.

2.4. Питательные среды.

2.5. Реактивы.

2.6. Крахмал, использованный для циклизации.

2.7. Ферментные препараты.

2.8. Циклодекстрины.

2.9.Вещества, использовавшиеся для получения комплексов включения.

2.10. Оборудование и приборы.

2.11. Методы.

2.11.1. Методы исследования бактерий.

2.11.2. Выращивание культур микроорганизмов в условиях глубинной ферментации.

2.11.3. Метод аддитивно-решетчатого математического описания объекта

2.11.4. Определение содержания сухих веществ.

2.11.5. Определение величины pH растворов.

2.11.6. Определение белка.

2.11.7. Способы выделения у-циклодекстринглюкано-трансферазы из культуральной жидкости Bacillus thuringiensis АПБ.

2.11.8. Определение содержания влаги в препарате.

2.11.9. Методы определения ферментативных активностей.

2.11.9.1. Качественное определение у-ЦГТ-азной активности штаммов-продуцентов, выращенных на тест-средах.

2.11.9.2. Количественный метод определения активности у-ЦГТ-азы.

2.11.9.3. Определение амшолитической активности фотометрическим методом.

2.11.10. Определение вязкости раствора крахмала.

2.11.11 .Определение редуцирующих веществ (РВ) по методу Шомодьи-Нельсона.

2.11.12. Определение декстрозного эквивалента (ДЭ).

2.11.13. Методы определения физико-химических параметров у-ЦГТазы.

2.11.13.1. Определение оптимума рН у-ЦГТазы.

2.11.13.2. Определение температурного оптимума у-ЦГТазы.

2.11.14. Методы разделения циклодекстринов.

2.11.14.1. Тонкослойная хроматография.

2.11.14.2. Разделение циклодекстринов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2.11.15. Методы, используемые при получении комплексов включения. 63 2.11.15.1. Методы синтеза комплексов включения.

2.11.15.2. Определение массовой доли а-токоферол ацетата в комплексе

2.11.15.3. Фотофлуориметрический метод анализа комплекса «витамин В2:у-ЦЦ».

2.12. Рецептура косметического крема с добавлением комплекса включения

2.13. Рецептура бисквитного полуфабриката с добавлением комплекса включения.

Глава 3. Результаты и обсуждения.

3.1. Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания

3.2. Исследование фенотипических признаков и идентификация изолята АПБ.

3.2.1. Морфологические особенности клеток изолята АПБ.

3.2.2. Культуральные признаки изолята АПБ.

3.2.3. Физиолого-биохимические признаки изолята АПБ.

3.2.4. Филогенетический анализ штамма-продуцента.

3.3. Определение наиболее эффективного состава питательной среды для биосинтеза ЦГТ-азы Bacillus thuringiensis АПБ.

3.4. Влияние микроэлементов на биосинтез у-ЦГТазы Bacillus thuringiensis АПБ.

3.5. Изучение влияния pH исходной ферментационной среды на биосинтез у-ЦГТ-азы Bacillus thuringiensis АПБ.

3.6. Определение дозы и возраста посевного материала для культивирования Bacillus thuringiensis АПБ.

3.7. Изучение динамики биосинтеза фермента у-ЦГТазы бактериями Bacillus thuringiensis АПБ.

3.8. Осаждение у-ЦГТазы Bacillus thuringiensis АПБ из культуральной жидкости.

3.9. Наработка опытных партий препарата у-ЦГТазы Bacillus thuringiensis ЖПОх.

3.10.Определение оптимума pH у-ЦГТ-азы Bacillus thuringiensis АПБ.

3.11. Определение температурного оптимума действия у-ЦГТ-азы Bacillus thuringiensis АПБ.

3.12. Разработка условий ферментативной конверсии крахмала в у-ЦД.

3.12.1. Определение выхода у-ЦД из различных видов крахмалов под действием у-ЦГТ-азы Bacillus thuringiensis АПБ.

3.12.2.Предобработка крахмала ферментными препаратами а-амилаз.

3.13. Определение наиболее эффективных условий биоконверсии крахмала у-ЦГТазой Bacillus thuringiensis АПБ.

3.14. Разработка способа разделения циклодекстринов.

3.14.1.Определение циклодекстринов методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).

3.14.2 Разделение ЦД на основе их растворимости в различных растворителях.

3.15. Получение комплексов включения биологически активных веществ с у-ЦД.ЮЗ

3.15.1. Получение комплексов включения витамина Е с у-ЦД.

3.15.2. Получение комплексов включения рибофлавина с у-ЦД.

3.15.3. Получение комплексов включения рыбьего жира с ß- и у-ЦД.

3.16. Апробация полученных комплексов у-ЦД с витаминами.

3.16.1. Апробация полученного комплекса у-ЦД с витамином Е при изготовлении косметического крема.

3.16.2. Апробация полученных комплексов у-ЦД с витаминами при изготовлении бисквитного полуфабриката.

Актуальность темы

Циклодекстрины (ЦД) — уникальная группа химических веществ, обладающих специфической функциональной активностью. Они представляют большой интерес для пищевой, фармацевтической, химической и других отраслей промышленности благодаря способности образовывать комплексы включения. ЦД используются для стабилизации летучих эфирных масел, ароматических веществ и специй, повышения устойчивости и улучшения усвояемости витаминов, пролонгирования действия лекарств, снижения их вредного воздействия, устранения нежелательного запаха и вкуса и т.д.

Поскольку синтез этих соединений химическими методами очень дорог, в промышленных масштабах ЦД можно получать лишь ферментативным путем при помощи специальных ферментов, называемых циклодекстринглюканотрансферазами (ЦГТ-азами). В целом процесс получения ЦД сводится к следующим основным этапам: 1) культивирование микроорганизма - продуцента ЦГТаз, 2) выделение ферментного препарата из культуральной жидкости, 3) получение ЦД с помощью препарата ЦГТазы.

В настоящее время выпуском ЦД заняты фирмы в различных странах мира. Бесспорное лидерство в производстве ЦД принадлежит китайским, а также японским, индийским и американским фирмам. Стоимость [З-ЦД, промышленного производства в зависимости от степени очистки составляет 1,5-8$ США за кг, а-ЦД - 25-40$ США за килограмм и у-ЦД 40-100$ США за кг.

В настоящее время в России производство ЦГТ-аз и ЦД отсутствует, хотя исследования в этом направлении проводились. Тем не менее, во всех высокоразвитых странах интерес к комплексам включений на основе ЦД только возрастает. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ЦГТ-аз и ЦД актуальна и перспективна.

Настоящая работа посвящена разработке технологий у-ЦГТазы, у-ЦД и комплексов включения на основе у-ЦД.

Цель и задачи исследования

Основная цель диссертационной работы состояла в поиске нового активного продуцента у-ЦГТ-азы, разработке технологии очищенного ферментного препарата у-ЦГТ-зы Г10Х, у-ЦД и комплексов включения на его основе.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора штамма, обладающего наибольшей у-ЦГТ-азной активностью;

- идентификация штамма-продуцента у-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;

- подбор оптимального состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента;

- разработка технологии получения ферментного препарата у-ЦГТ-азы Г1 ОХ.

- биоконверсия крахмала с помощью полученного препарата у-ЦГТазыГЮХ

- выделение у-ЦД из реакционной смеси

- получение комплексов включения на основе у-ЦД

Научная новизна работы

Проведен направленный скрининг микроорганизмов, обладающих у-ЦГТазной активностью, выделенных из различных видов почв.

В результате:скрининга для исследований отобран штамм-продуцент о . у-ЦЕТазы с максимальной активностью (15 ед./см ). На основании изучения совокупности морфологических,. культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм, продуцирующий у-ЦГТазу, идентифицирован KaKBacillusthuringiensisAnE.

На основе анализа? экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным^ штаммом у-ЦГТазной активности» от условий культивирования и выхода фермента от параметров выделения и очисткиразработана^ биотехнология ферментного препарата у-ЦГТазы.

При использовании полученного в результате, скрининга? нового» штамма-продуцента! у-ЦГТазы с учетом, экспериментально обоснованных зависимостей выхода у-ЦД от способов предварительной обработки, крахмала разработана биотехнология,получения^у-ЦД1

Разработаны способы; получения комплексов включения у-ЦД с рыбьим, жиром» и витаминами Е и В2 на; основе молекулярных моделей» и анализа физических методов обработки.

Выявлено положительное влияние процесса комплексообразования, с у-ЦД на устойчивость биологически активных^ веществ (БAB) к воздействию света и кислорода воздуха.

Практическая значимость работы

В результате скрининга почвенных ЦГТ-активных. изолятов бактерий создана лабораторная коллекция; микроорганизмов, секретирующих у-специфичные ЦГТ-азы. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Bacillus thuringiensis АПБ разработана биотехнология получения препарата у-ЦГТазы Г1 ОХ.

Разработаны проекты Лабораторного регламента и Технических условий на ферментный препарат у-циклодекстринглюканотрансфераза Г10Х. Проведена наработка препарата у-ЦГТ-азы Г10Х в условиях опытного производства. Полученные результаты подтверждены актом ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко».

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis АПБ депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-11066. Подана заявка на выдачу патента РФ «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis АПБ — продуцент у-циклодекстринглюкано-трансферазы».

Получены комплексы включения рыбьего жира и витаминов Е и Вг с у-ЦД с молярным соотношением компонентов от 1:1 до 1:5. В лабораторных условиях кафедры «Технология продуктов общественного питания» МГУПП изготовлен бисквит с добавлением комплексов витаминов Е и В2 с у-ЦД. Применяемые комплексы не оказывают негативного влияния на форму, структуру и консистенцию бисквита и аромат продукции, при этом улучшают вкус и повышают пищевую ценность получаемых продуктов, обогащая^ их БАВ. Результаты проведенной' работы подтверждены актом лабораторных испытаний.

На заводе ОАО «Московская косметическая фабрика «Рассвет» произведена опытная партия крема, содержащего комплекс включения витамина Е с у-ЦД. Добавление комплекса в состав крема не влияло на его внешний вид, цвет, запах и стабильность. Комплекс витамина Е с у-ЦД позволяет предупреждать преждевременное старение кожи и снижает вредное воздействие ультрафиолетового излучения. Полученные результаты подтверждены актом.

Апробация работы

Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 2009); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва 2009); III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж 2009); VII Международной научно-практической конференции и выставке «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» (Москва 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 заявка на патент РФ, где отражены основные положения диссертации

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 202 источника, и 11 приложений. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 21 таблицу и 31 рисунок.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведенный скрининг микроорганизмов-продуцентов у-ЦГТазы из различных источников позволил отобрать бактериальный штамм АПБ с у-ЦГТазной активностью 15 ед. ЦгА/см .

2. Изучение совокупности культуральных, морфологических, физиолого-биохимических признаков и проведенный филогенетический анализ показало, что целевой штамм относится к роду Bacillus виду thuringiensis с точностью 99%.

3. На основании экспериментальных данных сконструирован наиболее эффективный состав питательной среды для культивирования в лабораторных условиях штамма Bacillus thuringiensis АПБ, подобраны условия культивирования, обеспечивающие максимальную активность у-ЦГТазы.

4. Исследована динамика биосинтеза у-ЦГТазы бактериями Bacillus thuringiensis АПБ, на сновании которой выявлено, что фермент синтезируется после накопления биомассы бактериями, а максимум активности в культуральной жидкости приходится на 72 ч роста.

5. Подобраны условия получения ферментного препарата у-ЦГТаза Г10х при осаждении этанолом (соотношение объемов 96% этанол : культуральная жидкость 3,5:1; pH 8,0)

6. Разработан проект Лабораторного регламента по производству ферментного препарата у-ЦГТаза Г10х, на основе которого проведена наработка у-ЦГТазы Г10х штамма Bacillus thuringiensis АПБ с активностью 1050 ед./г (оптимум действия препарата: pH 6,0, t=40°C) в условиях опытного производства ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко». Составлен проект Технических условий на ферментный препарат у-ЦГТаза Г10х штамма Bacillus thuringiensis АПБ.

7. На основании выявленных зависимостей выхода у-ЦД от параметров стадий процесса определены наиболее эффективные условия энзиматической биотрансформации крахмала в у-ЦД. В качестве субстрата используется картофельный крахмал; предобработку крахмального клейстера необходимо проводить при использовании ФП Ликвамил-1200Л, ООО «Русфермент» в концентрации 0,01 ед. АС/г крахмала в течение- 20 мин; синтез у-ЦД следует осуществлять с использованием у-ЦГТазы Г10х Bacillus thuringiensis АПБ из расчета 5 ед. ЦгА/г крахмала в течение 24 ч при t=40°C, pH'6,2. Выход у-ЦД при указанных условиях составляет 18% от исходного сырья (крахмала).

8. Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии у-ЦЕТазы Г10х, который показал, что?оптовая*цена.ферментного препарата находится на уровне мировых рыночных цен и составляет 2174 руб. за 1 кг.

9. В результате^ лабораторных исследований, разработан способ выделения у-ЦД из реакционной смеси на основе различия растворимости гомологов ЦД в разных растворителях. Получен препарат у-ЦД с чистотой 88%

10. Разработана технологическая схема биотехнологического получения у-ЦД с использованием у-ЦГТазы Г10х Bacillus thuringiensis АПБ.

11. Разработаны компьютерные модели комплексов включения витамина Е с ЦД. Подобран наиболее эффективный метод получения в лабораторных условиях порошкообразной1 формы витамина Е в виде комплексов включения с ЦД. Показано, что наиболее стабильным является комплекс включения витамина Е с у-ЦД с молярным соотношением 2:1.

12. Созданы компьютерные модели возможных комплексов включения витамина В2 с у-ЦД. Для получения комплексов включения витамина В2 с у-ЦД в лабораторных условиях подобран наиболее эффективный метод.

Самым стабильным к действию УФ-излучения оказался комплекс витамина В2 с у-ЦД с молярным соотношением 1:1.

13. Осуществлено введение комплекса витамина Е с у-ЦД в рецептуру косметического крема. В результате получен крем, представляющий собой стабильную однородную массу белого цвета с приятным цветочным запахом.

14. Введение в рецептуру бисквитного полуфабриката комплексов витаминов Е и В2 с у-ЦД не требовало изменения технологического процесса, не оказывало негативного влияния на форму, структуру и консистенцию кондитерских изделий, не влияло на аромат продукции. Вместе с тем повышалась пищевая ценность готового продукта за счет обогащения его витаминами, улучшились влагоудерживающая способность полученного бисквита, вкус стал более мягким и таящим.

1. Абелян В.А. Циклодекстрины: получение и применение.- Ереван: Изд. Дом "Ван-Арьян", 2001.- 519 с.

2. Авторское свидетельство SU 1738852 AI. Штамм бактерий Bacillus sp. продуцент бета-циклодекстринглюканотрансферазы. Усанов Н.Г., Логинов О.Н., Мелентьев А.И., 1990.

3. Авторское свидетельство SU 18143313. Штамм бактерий Bacillus stearothermophilus продуцент циклодекстрингликозилтрансферазы и способ получения альфа-циклодекстрина. Абелян В.А. и др., 1989.

4. Айвазов Б.В. Практическое руководство по хроматографии. М.: Высшая школа, 1987. - 280с.

5. Анализ рынка крахмала в России в 2006-2010 гг, прогноз на 2011-2015 гг. электронный ресурс. — Режим доступа: URL: http://megaresearch.ru/work/goodsmap?researchid=8007 (дата обращения 16.03.2011).

6. Березовский В. М. Хромановые витамины: токоферолы (витамины группы Е). Химия витаминов. М.: Пищепромиздат. 1959. с.с.295-315.

7. Биотехнология биологически активных веществ. Учебное пособия для студентов высших учебных заведений. Под ред. И.М. Грачевой, JI.A. Ивановой. -М.: Элевар, 2006 г. 453 с.

8. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М.: Наука, 1985.- 196 с.

9. Витамин Е (токоферола ацетат). Электронный ресурс. — Режим доступа: URL: http://www.yitamini.ru/yitamin23.html (дата обращения 16.04.2011).

10. Войно Л.И., Матреничева В.В. Методические указания к выполнению лабораторных работ по общей микробиологии. М.: Издательский комплекс МГУПП, 2005. - 46 с.

11. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применения. М.:МИР, 2002. - 590с.

12. ГОСТ 12575-86 Сахар. Методы определения редуцирующих веществ.

13. ГОСТ 14621-78 Рулеты бисквитные (технические условия).

14. ГОСТ 29139-91 Мука, хлеб и хлебобулочные изделия пшеничные витаминизированные. Метод определения . витамина В2 (рибофлавина).

15. ГОСТ Р 52343-2005 Кремы косметические. Общие технические условия.

16. Грачев Ю.П., Плаксин Ю.М. Математические методы планиерования экспериментов.-М;: ДеЛй принт, 2005!-296 с.

17. Грачева И;М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С. и др. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов.-М.:Легкая и пищевая промышленность, 1982. 240с.

18. Грачева И;М:, Кривова АЛО. Технология ферментных препаратов.-М.: Элевар, 2000.-512 с.

19. Грейсс.Ф. Основы тонкослойной^ хроматографии (планарная хроматография): пер.с англ.- М;: Мир, 1999: 753 с.

20. Гусев М.В., Минеева Л:А. Микробиология. Учебник для студ. Биол. специальностей вузов. — 4-е изд., стер. — М.: Издательский центр «Академия», 2003. 464 с.

21. Дарбре А. Практическая химия белка. М.:МГК, 1985. - 376с.

22. Иванова Л.А., Войно Л.И. и др. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по дисциплине «Технология биоконверсии растительного сырья». — М.:Издательский комплекс МГУПП, 2002. -66с.

23. Иванова Л.А., Войно Л.И. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по технологии белковых препаратов,аминокислот и липидов,- М.: Издательский комплекс МГУ lili, 1985. -42 с.

24. Каталог MBI Fermentas 1998X1999, 146-157.

25. Кошелева Т.В. Разработка технологии ферментативного синтеза циклодекстринов: дисс.канд.тех.наук. М., 1991. - 160с.

26. Крамер Ф. Соединения включения, пер. с немецкого. М.: Издательство иностранной литературы, 1958. 169 с.

27. Кузнецова О.В. Совершенствование биотехнологий высокоочищенной альфа-циклодекстринглюканотрансферазы и альфа-циклодекстринов на основе новых штаммов рода Peanibacillus: дисс.канд.тех.наук М., 2008. - 221с.

28. Кушакова Е.Е. Разработка технологии высокоочищенной циклодекстринглюканотрансферазы из Bacillus macerans 506: дисс.канд.тех.наук. -М., 1990. 181с.

29. JI.A. Иванова, Л.И. Войно, И.С. Иванова. Пищевая биотехнология. Переработка растительного сырья. Под ред. И.М. Грачевой. М.: КолосС, 2008 г. - 472 с.

30. Надиров Н. К. Токоферолы и их использование в медицине и сельском хозяйстве. М.: Наука, 1991.-с.с. 10, 196.

31. Нековалентные ассоциации цикломальтоолигосахаридов (циклодекстринов) с каротиноидами в воде. Изучение систем а- и ß-циклодекстрин ЛР^-каротин (ликопин) с помощью светорассеяния, ионраспылительной ионизации и тандемной масс-спектрометрии. //

32. РЖ 19Е. Природные органические соединения и их синтетические аналоги, 2005. №12 - с. 12.

33. Нетрусов А,И., Егорова М.А., Захарчук JIM. Практикум по микробиологии: учеб.пособие для студ.высш.учеб. Заведений. М.: Издательский центр "Академия", 2005. - 608 с.

34. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова A.A. и др. Пищевая химия. СПб.: ГИОРД, 2001. - 592 с.

35. Определитель бактерий Берджи/ под ред. Дж. Хоулта и др. 9-е изд. В 2-х томах. М.: МИР, 1997.

36. Павлов A.B. Сборник рецептур мучных кондитерских и булочных изделий для предприятий общественного питания. Спб: Издательство "Профессия", 2001 - 242с.

37. Патент США № 6472192. Cyclodextrin glycosyl transferases for producing gamma-cyclodextrin, 2002.

38. Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева Jl.B. Определение активности ферментов. М.: ДеЛи принт, 2003 - 375 с.

39. Ребров В.Г., Громова O.A. Витамины и микроэлементы, М.: «Алев-В», 2003. -с.с.227-228.

40. Рынок картофельного крахмала в России, Аналитический обзор, июль 2010 года электронный ресурс. Режим доступа: URL: http://megaresearch.ru/work/goodsmap?researchid=5875 (дата обращения 16.03.2011).

41. Рынок кукурузного крахмала в России. Выпуск: июль, 2010 г. электронный ресурс. — Режим доступа: URL: http://megaresearch.ru/work/goodsmap?researchid=5876 (дата обращения 16.03.2011).

42. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А. Аналитическая хроматография. М.: Химия, 1993. - 464с.

43. СанПиН 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов.

44. СанПиН 2.3.2.2804-10 «Дополнение и изменения №22 к СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

45. Скурихин И.М., Нечаев А.П. Все о пище с точки зрения химика. М.: Высшая школа, 1991 - 288с.

46. Слюсаренко Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых прозводств. -М.: Легкая и пищевая пром., 1984.-208с.

47. Столяров Б.В., Савинов И.М., Витенберг А.Г. Практическая газовая и жидкостная хроматография: Учебное пособие. СПб.:Изд-во С.-Петерберг. ун-та, 2002. - 616с.

48. Строев Е.А. Биологическая химия. М, Высшая школа, 1986, 479 с.

49. Строева С.С. Выделение продуцента- альфа-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы из природных источников и разработка технологии ферментного препарата на его основе: дисс.канд.тех.наук. М., 2006. - 200с.

50. Сычев С.Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография на микроколоночных хроматографах серии "Милихром": Монография. -Орел: ОрелГТУ, 2002. 134с.

51. Терехова Е. Я. Выделение продуцентов бета-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы и получение ферментных препаратов на их основе: дис. канд. тех. наук.-Уфа, 1999. 110 с.

52. Тырсин Ю:А., Иванова Л.А., Кривова А.Ю. Методические указания к выполнению лабораторных работ по курсу "Специальная биохимия".-М.: Издательский комплекс МГУПП,1993.- 66 с.

53. Усанов Н.Г. , Логинов О.Н., Пруцакова Е.А. Получение бета-ЦД из картофельного крахмала.// Тезисы докладов Всесоюзнойконференции, т. 1. Черновцы, 1991 - с. 122.

54. Фаллср Дж., Шилдс Д. , Молекулярная; биология клетки. М.:Бином 2003.-268с.

55. Хафизов Р. X., Надиров II. К., Сакаева Р. Ф. Химия витамина Е и его биологических производных. // В кн.: Витамины. — Киев: Наукова думка. Вып. 8., 1975. с. 22-30.

56. Химический;состав российских пищевых продуктов. /Под ред и В.А. Тутельяна. М.: ДеЛи приит, 2002 - 236 с.

57. Циклодекстрины / Под ред. Егорова Н. С.// Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Серия Микробиология. 1988-1989. - 'Г. 20-21.

58. Шагина С.Е. Выделение продуцента бета-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы, получение бета-циклодекстринов и комплексов включений на их основе: дисс.канд.тех.наук. М., 2008. -184 с.

59. Экспериментальная витаминология, под ред. Островского Ю. М. Минск.: Наука и техника, 1979.-е. 18-57, 224-265.

60. Anna Sopkova, Peter Mezes. Combinations of Cyclodextrins with Synthetic and Natural Compounds.//Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 1999, v.33. - p. 109-120.

61. Abderrazzak Douhal. Cyclodextrin Materials. Photochemistry, Photophysics and Photobiology. Elsevier B.V., 2006. - 322 p.

62. Arias MJ, Moyano JR, Munoz P. Study of omeprazole-gamma-cyclodextrin complexation in the solid state. //Drug Dev Ind Pharm 2000, v. 26. - p.253-259.

63. Astray, G.; Gonzalez-Barreiro, C.; Mejuto, J. A review on the use of cyclodextrins in foods. //Food Hydrocolloids. 2009, vol. 23, no. 7. - p. 1631-1640.

64. Bains William. Biotechnology from A to Z. Oxford University Press, USA; 3 edition, 2004. - 424p.

65. Bar R. Cyclodextrin aided bioconversions and fermentations. //Trends Biotechnol. 1989, v.7. - p.2-4.

66. Basic Biotechnology / Colin Ratledge (Editor), Bjorn Kristiansen (Editor) -Cambridge University Press, 2006.

67. Becket G, Schep LJ, Tan MY. Improvement of the in vitro dissolution of praziquantal by complexation with alpha-, beta and gamma-cyclodextrins. Hint J Pharm. 1999, v. 179 - p.65-71.

68. Bender H. An improved method for the preparation of cyclooctaamylose, using starches and the cyclodextrin glycosyltransferase of Klebsiella pneumoniae M 5 al. //Carbohydr Res. 1983, v. 124. - p.225-233.

69. Biotechnology The Science and the Business. / Derek G. Springham (Editor), Vivian Moses (Editor), Ronald E. Cape (Editor)// CRC, 1999.

70. Biotechnology of Amylodextrin Oligosaccharides/ Edited by Robert B. Friedman: American Chemical Society, 1991. - 458 p.

71. Biwer, A.; Antranikian, G., Heinzle, E. Enzymatic production ofcyclodextrins. //Applied Microbiology and Biotechnology. 2002, vol. 59, no. 6. - p. 609-617.

72. Boer, T.; Zeeuw, R.A.; Jong, G.J. Recent innovations in the use of charged cyclodextrins in capillary electrophoresis for chiral separations in pharmaceutical analysis. //Electrophoresis. 2000, v.21. - p.3220-3239.

73. Borem Aluizio, Santos R. Fabricio, Bowen E. David Understanding Biotechnology. Prentice Hall PTR. US Ed edition. 2003. - 220p.

74. Burr, G.O., Burr, M.M. and Miller, E. On the nature and role of the fatty acids essential in nutrition. // J. Biol. Chem. 1930,v.86 - p.587.

75. Buschmann HJ, Knittel D, Schollmeyer E. New textile applications of cyclodextrins. // J Incl Phenom Macrocycl Chem. -2001, v.40. p. 169-172

76. Buschmann HJ, Schollmeyer E. Applications of cyclodextrins in cosmetic products: a review. // J Cosmet Sci. 2002, v.53 - p.575-592.

77. Cao XZ, Jin ZY, Wang X, Chen F. A novel cyclodextrin glycosyltransferase from an alkalophilic Bacillus species: purification and characterization. //Food Res Int. 2005,v. 38. - p.309-314.

78. Challa R, Ahuja A, Ali J, Khar RK. Cyclodextrins in drug delivery: an updated review. //AAPS PharmSciTech. 2005,v.6. - p. 329-357.

79. D G Yim, H H Sato, Y H Park. Production of cyclodextrin from starch by cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus firmus and characterization of purified enzyme. // Journal of industrial microbiology & biotechnology. 1997, v. 18, N.6. - p. 402-405.

80. D H Waalkens-Berendsen, F J Verhagen, A Bar. Embryotoxicity and teratogenicity study with gamma-cyclodextrin in rats. // Regul. Toxicol.

81. Pharmacol. -1998, v.27,№2. p. 166-171.

82. De Bie AT, Van Ommen B, Bär A. Disposition of 14C.gamma-cyclodextrin in germ-free and conventional rats. // Regul Toxicol Pharmacol. 1998,v.27,N2. - p. 150-158.

83. Fava: F, Gioia D, Marchetti L. Cyclodextrin effects on the exsitu biöremediätion of a chronically polychlorobiphenyl-contaminated soil; //Biotechnol Bioeng. 1998,v.58 - p.345-355.

84. Fijiwara S. Kakihara H et al. Analysis mutation in cyclodextrin1 . glucanotransferase from Bacillus stearothermophilus which affectcyclization characteristics and thermostability. // J.Bacteriol. 1992, v. 174. - p.7478-7481.

85. Food Standards in Australia New Zealand. Final assessment report, application a438:: gamma cyclodextrin, as a> novel food ingredient/food additive. 1998, March 19.

86. Friedman SH; Schinazi RF, Wudl F. Method of treatment of viral infection including hiv using water soluble fullerenes. //US Patent 6613771, 1998.

87. Fugita Y, Tsubouchi H, Inagi Y, Tomita K, Ozaki A, Nakanishi K. Purification and properties of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus sp. AL-6.// J Ferment Bioeng 1996, v.70 - p. 150-154

88. George B, Govindaraj M, Ujiie H, Freeman H, Hudson S. Integration of fabric formation and coloration processes. //NTC Research Briefs June, 2004. p.C02-PH03.

89. Glick Bernard R., Pasternak Jack J. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. ASM" Press; 3rd edition, 2003. -760p.

90. Goel A, Nene S. A novel cyclomaltodextrin glucanotransferase from Bacillus firmus that degrades raw starch. //Biotechnol Lett 1995, v.7. -p.411-416.

91. Hall B. Phylogenetic Trees Made Easy: A How-To Manual, Second Edition. Sinauer Associates, Inc., 2004. - 22lp.

92. Han SM. Direct enantiomeric separations by high performance liquid" chromatography using cyclodextrins. //Biomed Chromatogr. 1997,v.ll. -p.259-271.

93. Helena Dodziuk. Cyclodextrins and Their Complexes: Chemistry, Analytical Methods, Applications. Wiley-VCH, 2006. - 409 p.

94. Helena Ma Cabral Marques. A review on*, cyclodextrin encapsulation of essential oils and volatiles. //Flavour and Fragrance Journal. 2010, V.25, N.5.-p.313-326.

95. Hennig W., Davis D., Zangerl R. Phylogenetic Systematics. University of Illinois Press. New Ed edition, 1999. - 280p.

96. Hibbeln J. Maternal seafood consumptionf in pregnancy and neurodevelopmental outcomes in childhood (ALSPAC study): an observational cohort study //Lancet. 2007, v.369. - p.578—585.

97. Hirano K, Ishihara T, Ogasawara S. Molecular cloning and characterizationof a novel gamma-CGTase from alkalophilic Bacillus sp. //Appl Microbiol Biotechnol. 2005,v.67. - p. 1-9.

98. Horikoshi K., Nakamura N. Matzuzawa N. Industrial production of cyclodextrins. //First International Symposium on Cyclodextrins. -Budapest, 1981. p.25-39.

99. Horikoshi, K. Alkaliphilies: some applications of their products for biotechnology. //Microbiology and Molecular Biology Review. 1999,v.63, N. 4. - p. 735-750.

100. Ibrahim, A.S.; El-Tayeb, M;A., Al-Salamah, A.A. Characterization of immobilized' alkaline cyclodextringlycosyltransferase; from? a newly isolated Bacillus agaradhaerens KSU-A11. //African Journal, of Biotechnology. 2010- vol;9, no; 441 - p. 7550-7559:

101. Innis M, Gelfand D., Sninsky J. PCR Protocols. A Guide to methods and applications. London: Academic Press, Inc., 1990. - p.14-15:

102. Innis SM. Dietary (n-3) Fatty Acids and Brain Development // J. Nutr. -2007, v.137. p.855-859.

103. Irie T, Uekama K. Cyclodextrins in peptide and protein delivery. //Adv Drug Deliv Rev. 1999, v.36. - p; 101-123.

104. J:. Szejtli. Cyclodextrins and their inclusion complexes. Akademiai Kiado, 1982-296 p.

105. J.Szejtli. Introduction and general overview of cyclodextrin chemistry. //

106. Chem.Rev. 1998, v.98 - p.1743-1753.

107. Jarho P, Vander Velde D, Stella VJ. Cyclodextrin-catalyzed deacetylation of spironolactone is pH and cyclodextrin dependent. // J Pharm Sci 2000, v.89. -p.241-249.

108. Kato T, Horikoshi K. Colorimetric determination of gamma-cyclodextrin // Anal.Chem. 1984, v.56. - p.1738-1740.

109. Kato T, Horikoshi K. A new gamma-cyclodextrin forming enzyme produced by Bacillus subtilis no. 313. // J Jpn Soc Starch Sci. -, 1986, v.34. -p.137-143.

110. Kim MH, Sohn CB, Oh TK. Cloning and sequencing of a cyclodextrin glycosyltransferase gene from Brevibacillus brevis CD 162 and' its expression in Escherichia coli. // FEMS Microbiol, Lett 1998, v. 164. -p.411-418.

111. Kitahata S., Okada S. Action of cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus megaterium strain №5 on starch. // Agr.Biol.Chem. 1974, v.38, N.12. - p.2413-2417.

112. Koji Kobayashi, Kei Hamazaki, Shuntaro Fujioka. The effect of n-3 PUFA/y-cyclodextrin complex on serum lipids in healthy volunteers a randomized, placebo-controlled, double-blind trial. //Asia Pac J Clin Nutr. -2007, V.16.N3,-p.429-434.

113. Kondo, H., Nakatani, H., Hiromi, K. In-vitro action of human and porcine alpha-amylases on cyclo-maltooligosaccharides. //Carbohydr. Res. 1990, v.204 - p.207-213.

114. Koppenhoefer B, Epperlein U, Christian B. Separation of enantiomers of drugs by capillary electrophoresis: part I. Gamma-cyclodextrin as chiral solvating agent. //J Chromatogr 1995,v.717. - p. 181-190.

115. Koppenhoefer B, Epperlein U, Jakob A. Separation of enantiomers of drugs by capillary electrophoresis,part 7: gamma-cyclodextrin as chiral solvating agent. //Chirality. 1998, v. 10. - p.548-554.

116. Lai CS, Chow JM, Wolf BW. Method of using gamma cyclodextrin to control blood glucose and insulin secretion. US Patent 20050215523 Al, 2005.

117. Leemhuis, H.;. Kelly, R.M. andDijkhuizen, L. Engineering of cyclodextrin glucanotransferases and the impact for biotechnological applications. //Applied Microbiology and Biotechnology. 2010, vol. 85, no. 4. - p. 823835.

118. Li B, Haynie DT. Chiral! drug separation. Encyclopedia of Chemical Processing. Sungyu Lee ed. Vol. 1, New York: Taylor & Francis,2007 -p.449-458. ,

119. Li Zh. y-Cyclodextrin: a review on enzymatic production and applications. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2007,Volume 77, Number 2. -p. 245-255.

120. Lipman RD. Cyclodextrin containing pressure sensitive adhesives. Eur Patent EP1206290, 2000.

121. Loftsson T, Brewester M. Pharmaceutical applications ofcyclodextrins. 1. Drug solubilization and stabilization. //J Pharm Sci 1996, v.85l - p. 10171025.

122. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology./ edit: Arnold L.Demain, Julian E.Davies -ASM Press, 2001.

123. Marshall JJ, Miwa I.Kinetic difference between hydrolyses of gamma-cyclodextrin by human salivary and pancreatic alpha-amylases.// Biochim

124. Biophys Acta. 1981, v.661, N.l.-p.142-147.

125. Matioli G, Zanin GM, Moraes FF. Enhancement of selectively for producing gamma-cyclodextrin. //Appl Biochem Biotech. 2000, v.84. - p. 955-962:

126. Matsuda H, Arima H. Gyclodextrins: in transdermal! andv rectaldelivery. //Adv Drug Dcliv Rev 1999, v.36. - p.81-99.

127. Moldenhauer JP, Cully J. Method for producing a coenzyme Q10/ gamma-cyclodextrin complex. US Patent 20030012774 Al, 2003,

128. Moldenhauer JP, Regiert M, Wimmer T. Complexes of gamma-cyclodextrin- and retinol or retinol derivatives, processes for their preparation and their use. US Patent 5985296, 1998.

129. Mori S, Hirose S, Oya T. Purification and properties of cyclodextrin glucanotransferase from Brevibacterium sp. No. 9605. //Biosci Biotech Biochem.-1994, v.58. p. 1968-1972.

130. Moyano Mendez JR, Arias Blanco MJ, Gines Dorado JM. Application of gamma-cyclodextrin to the improvement of dissolution characteristics ofoxazepam; /Л1 Farmaco 1995,v.50 - p.791-799.

131. Munro 1С, Newberne PM, Young VR. Safety assessment , of gamma-cyclodextrin. // Regul Toxicol Pharmacol. 2004, v.39, N.l. - p.3-13.

132. Muoz-Botella S, del Castillo B, Martyn MA. Cyclodetrin properties and applications of inclusion complex formation. //Ars Pharm 1995, v.36 -p. 187-198.

133. Nicolaas Jan Zuidam,Viktor Nedovic. Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and-Food Processing. New YorkA Springer, 2010 - 400p.

134. O'Donnell CD. New encapsulating molecule improves taste, prepared? foods july. электронный ресурс. Режим доступа: URL: http://findarticles.eom/p/articles/mim3289/is7l 70/ai771073 80 (датаобращения 20.12.2010). ,

135. Otero-Espinar, F.J.; Euzardó-Alvarez, A. Blanco-Mendez, J; Gyclodextrins: more than pharmaceutical excipients. //Mini-Reviews; in Medicinal Chemistry. 2010, vol. 10, no. 8 - p. 715-725.

136. Penninga D, Strokotypov B, Rozeboom HJ. Site directed mutation in tyrosine 195 of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strai 251 affected activity and product specifity. //Biochemistry 1995, v.34- p.3368-3376.

137. Prabhu KS, Ramadoss CS. Penicillin acylase catalyzed synthesis of penicillin-G from substrates anchored in cyclodextrins. // Indian J Biochem Biophys 2000, v.37 - p.6-12.

138. Pszczola, D. E. Production and potential food applications od cyclodextrins. //Food Technol. 1988, v.42 - p. 96-100.

139. Rahman, K.; Illias, R.M.; Hassan, O. Molecular cloning of a cyclodextrin glucanotransferase gene from alkalophilic Bacillus sp. TS 1-1 and characterization of the recombinant enzyme. //Enzyme and Microbial Technology 2006, vol. 39; no. 1. - p. 74-84.

140. Rajewski RA, Stella VJ. Pharmaceutical! applications of cyclodextrins.2. In vivo drug delivery. //J Pharm Sei 1996, v.85 - p. 1142-68.

141. Ramakrishnan U, Imhoff-Kunsch B, DiGirolamo AM. Role of docosahexaenoic acid in maternal and child mental health //Am J Clin Nutr.- 2009; v.89, N3. p.958S-962S.

142. Redenti E, Fronza G, Bovis G. Application of gamma-cyclodextrin to enantiomeric purity determination of a new 2-amino-tetralin derivative by H-l-NMR spectroscopy. // Chirality, 1992, v.4. - p.404-405.

143. Regiert M. Light-stable vitamin E by inclusion in gamma-cyclodextrin. //SOEFW Int J Appl Sei 2005, v. 131 - p. 10-18.

144. Regiert M, Kupka M. 2:1-Inclusion compound from beta- or gamma-cyclodextrin and alpha-tocopherol. US Patent 20030130231A1, 2003.

145. Regiert M, Kupka M. Cosmetic composition comprising a complex of cyclodextrin and vitamin F. US Patent 20040096413 Al, 2004.

146. Regiert M, Moldenhauer JP. Inclusion compound from gammacyclodextrin and retinol, production and application. Eur Patent EP0867175 Al, DE19847633 CI, 1998.

147. Regiert M, Wimmer T, Moldenhauer JP. Application of gamma-cyclodextrin for the stabilization and/or dispersion of vegetable oils containing triglycerides of polyunsaturated acids. //J Inclu Pheno Mol Recogn Chem 1996, v.25. - p.213-216.

148. Rendleman JA Jr. Enhanced production of cyclomaltooctaose (gamma-cyclodextrin) through selective complexation with С12 cyclic compounds. // CarbohydRes 1992, v.230. - p.343-359.

149. Rendleman JA Jr. Enhanced production of gamma-cyclodextrin from corn syrup solids by means of cyclododecanone as selective complexant. //Carbohydr Res. 1993, v. 247 - p.223-237.

150. Ribosomal Database Project II электронный ресурс. — Режим доступа: URL: http://www.cme.msu:edu (дата обращения 15.07.2011).

151. Rosenfeldt F, Hilton D, Pepe S. Systematic review of effect of coenzyme Q10 in physical exercise; hypertension and heart failure. //Biofactors -2003, v.18 p.91—100.

152. S. TILBOY, F. HAPIOT, E. MONFLIER. Design of New Water-Soluble Catalytic Systems from Supramolecular Assembly between Cyclodextrins and Phosphanes. // Materials of First European Cyclodextrin Conference, 2009, p.22.

153. S.Kobayashi, K.Kainuma, S.Suzuki. A New Preparation Method of Cyclodextrin. //Denpun Kagaku (J.Japn.Soc.Starch Sci.) 1975, v.22 - p.6

154. Schlenk W., Sand D.M. The Association-of a- and P-Cyclodextrins with Organic Acids. // J. Am. Chem. Soc. 1961, v.83, N.10 - p. 2312-2320.170 Schmid G. Preparation and industrial production of cyclodextrins. In:

155. Atwood J, Davies ED, MacNicol DD, Vogtle F (eds) Comprehesive supermolecular chemistry, vol 3: Cyclodextrins. Pergamon, Oxford, 1996 -p. 41-56.

156. Schneiderman E, Stalcup AM. Cyclodextrins: a versatile tool in separation science. //J Chromatogr B. 2000, v.745. - p.83-102.

157. Schwimmer S. Garibaldi J.A. Further studies on production, purification and properties of Shardinger dextrintransferase of Bacillus macerans. // Cereal Chem. 1952, v.29, N.2. - p.108-122.

158. Sen CK, Khanna S, Roy S. Tocotrienols: Vitamin E beyond tocopherols. //Life Sciences 2006, v.78, N18 - p.2088-2098.

159. Shieh W. Process for producing gamma-cyclodextrin. US Patent 5550222, 1996.

160. Singla AK, Garg A, Aggarwal D. Paclitaxel and its formulations. //Int J Pharm 2002, v.235. - p. 179-192.

161. Suvegh K, Fujiwara K, Komatsu K. Positron lifetime in supramolecular gamma- and deltacyclodextrin-C60 and C70 compounds. //Chem Phys Lett 2001, v.344 - p.263—269.

162. Szejtli J. Cyclodextrins in the textile industry. //Starch/Starke 2003, v.55 -p.191-196.

163. Szejtli J. Past, present, and future of cyclodextrin research. //Pure Appl Chem 2004, v.76 - p. 1825-1845.

164. Szejtli J. Cyclodextrins: Applications. / Encyclopedia of Supramolecular Chemistry, Marcel Dekker, 2004. p.p. 405-413.

165. Szejtli J., Szente L. Elimination of Bitter, Disgusting Tastes of Drugs and Foods by Cyclodextrins. // 'European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2005,Vol. 61 - p. 115-125.

166. SZERMAN, N.; SCHROH, I.; ROSSI, A. Cyclodextrin production by cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans DF 9R. //Bioresource Technology 2007, vol. 98, no. 15 - p. 2886-2891.

167. Takada M; Ide T, Yamamoto T. Novel cyclodextrin glucanotransferase, process for producing the same and process for producing cyclodextrin by using this enzyme. US Patent 20030194796 Al. 2003.

168. Takada M, Nakagawa Y, Yamamoto T. Biochemical and genetic analyses of a novel gamma-cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic Bacillus clarkii 7364. //J Biochem (Tokyo) 2003, v. 133 - p.317-324.

169. Terao K, Nakata D, Fukumi H. Enhancement of oral bioavailability of coenzyme Q10 by complexation with gamma-cyclodextrin in healthyadults. //Nutr R.es2006, v.26 p.503-508.

170. Thoss M, Schwabe L, Fromming KH. Cyclodextrin-Einschlussverbindüngen von Zitronen-, Orangen-, Hopfen- und Kamillenol. //Pharm Ztg Wiss 1993, v.6 - p. 144-148.

171. Tilden; E;B;, Hudson G.S; Preparation and properties of the amylases produced by Bacillus macerans and Bacillus polymixa. — J. Bacteriol. -1942, v.43,N2 p.527-544.

172. Tilden E.B., Hudson C.S. The conversion of starch of crystaline dextrins by the action of a new type of amylase separated from culture. Aerobacillus, macerans. // J.Am.Chem.Soc. 1939, v.61, N.9. - p.2900-2902.

173. Tonkova A. Bacterial cyclodextrin gluconotransferase. //Enzyme and Microbial Technology 1998, v.22, N.8 - p. 678-686.

174. Uchiyama H, Jensen JM, DuVal DL. Reduction of odors from coating material. US Patent 20020132861 Al, 2002. .

175. Uekama K, Fujinaga T, Hirayama F. Improvement of the oral bioavailability of digitalis glycosides; by cyclodextrin complexation. //J Pharm Sei 1983, v.72 - p.1338-1341.

176. Van der Veen В A, Uitdehaag JC, Dijkstra BW. Engineering of cyclodextrin glycosyltransferase reaction and product specificity. //Biochim Biophys Acta 2000, v.1543 - p.336-360.

177. Waalkens-Berendsen DH, Smits van Prooije AE, Bär A. Embryotoxicity and teratogenicity study with gamma-cyclodextrin in rabbits. //Regul Toxicol Pharmacol. 1998, v.27, N.2 - p. 172-177.

178. Wang F, Du GC, Li Y. Effects of dissolved oxygen tension and two-stage oxygen supply strategy on the production of gamma-CGTase by Bacillus macorous. //Process Biochem 2005, v.40 - p. 3468-3473.

179. Wang F, Du GC, Li Y. Regulation of CCR in the gamma-CGTase production from Bacillus macorous by the specific cell growth rate control. //Enzyme Microb Technol 2006, v.39 - p. 1279-1285.

180. Wang F, Du GC, Li Y. Enhanced gamma-CGTase production by Bacillus Macorous with membrane active substances. //Food Biotechnol 2006, v.20 - p.171-181.

181. Wang F, Du GC, Li Y. Optimization of cultivation conditions for the production of gamma-cyclodextrin glucanotranferase by Bacillus macorous. // Food Biotechnol 2004, vl 8 - p.251- 264.

182. Yang GW, Li J, Xie WM. Studies on CGTase from Bacillus sp. 32-3-1. //Ind microbiol 2001, v.31 - p.30-32.