автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка технологии ферментного препарата L-арабинозоизомераза для получения D-тагатозы

005001939

ВОЕВОДИНА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА АРАБИНОЗОИЗОМЕРАЗА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ О-ТАГАТОЗЫ

Специальность 05Л8.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических

активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

2 4 НО Я 2011

Москва-2011

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Иванова Людмила Афанасьевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, доцент Милорадова Елена Васильевна кандидат технических наук Черепенникова Екатерина Борисовна

Ведущая организация: ГНУ ВНИИ Пищевой биотехнологии РАСХН

Защита состоится: « 20 » декабря 2011 г. в 11.30 ч. в ауд. 302 на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.04 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «МГУПП». Автореферат отправлен по адресу referat_vak@mon.gov.ru для размещения в сети Интернет Министерством образования и науки РФ и размещен на сайте www.mgupp.ru.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, МГУПП, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.148.04.

Автореферат разослан » ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.т.н.

Тимофеев Д.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В условиях современного ритма жизни потребление сахара неуклонно растет. Но каждый знаег, что калорийность сахара достаточно велика, и если человек живет в условиях сниженных энергозатрат, то избыток калорий превращается в жир, в результате чего у большинства населения возникает угроза ожирения и сахарного диабета. При чрезмерных дозах употребления сахароза может привести к тяжелым нарушениям углеводного и жирового обмена, а также способствовать развитию различных заболеваний.

Натуральные заменители сахара такие, как фруктоза, ксилит и сорбит отличаются довольно высокой калорийностью, поэтому были синтезированы низкокалорийные искусственные подсластители, которые превосходят сахар по сладости, но никак не влияют на выброс инсулина и уровень сахара в крови. Однако искусственные подсластители имеют ряд недостатков, поэтому в настоящее время всё чаще возникает вопрос о пользе и безопасности этих соединений.

В связи с этим во многих странах проводят исследования по разработке технологии безопасного и эффективного низкокалорийного подсластителя, применение которого возможно для широкого ассортимента пищевых продуктов и разновозрастного круга населения.

О-тагатоза - полностью натуральный сахар, представляющий собой моносахарид, используемый как подсластитель. О-тагатоза фактически не отличается по вкусу от сахарозы, но с точки зрения более быстрого ощущения сладости подобна фруктозе. Её сладость составляет около 0,9 ед. от сладости сахарозы, принятой за 1,0. О-тагатоза имеет невысокую калорийность (1,5 ккал/г), в отличие от других заменителей сахарозы она лишена слабительного эффекта.

Для ферментативной конверсии Б-галактозы в О-тагатозу используют фермент Ь-арабинозоизомераза, не обладающий выраженной субстратной специфичностью. В настоящее время в РФ производство О-тагатозы отсутствует, хотя в данном направлении проводятся исследования. Тем не менее, нарастает интерес к этому уникальному заменителю сахарозы во всех странах, в том числе и РФ. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ферментного

препарата Ь-арабинозоизомераза с целью получения О-тагатозы актуальна и перспективна.

Настоящая работа посвящена разработке биотехнологии ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза для получения О-тагатозы.

Цель и задачи исследования.

Основная цель диссертационной работы состояла в поиске нового активного продуцента Ь-арабинозоизомеразы, разработке технологии очищенного ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза ПОх для трансформации О-галактозы в Э-тагатозу.

Дтя достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- скрининг микроорганизмов-продуцентов Ь-арабинозоизомеразы, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора штамма, обладающего наибольшей Ь-арабинозоизомеразной активностью;

- идентификация штамма-продуцента Ь-арабинозоизомеразы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;

- подбор наиболее эффективного состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента;

- разработка технологии получения ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза ПОх;

- наработка ферментного препарата Ь-арабинозоизомеразы в опытно-

промышленных условиях;

- изучение основных параметров действия ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза ПОх и его апробация как катализатора при биотрансформации О-галактозы в О-тагатозу.

Научная новизна работы.

Проведен направленный скрининг микроорганизмов с Ь- арабинозоизомеразной

активностью, выделенных из различных видов почв.

В результате скрининга для исследований отобран штамм-продуцент Ь-арабинозоизомеразы с максимальной активностью (25,30 ед.АиС/г). На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических

и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм, продуцирующий L-арабинозоизомеразу, идентифицирован как Bacillus mojavensis Х2.

На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом Bacillus mojavensis Х2 L-арабинозоизомеразной активности от условий культивирования, а также выхода фермента, от параметров дезинтеграции биомассы, выделения и его очистки, впервые в РФ научно-обоснована биотехнология ферментного препарата L-арабинозоизомераза ПОх для трансформации D-галактозы в D-тагатозу.

Практическая значимость и реализация результатов работы.

В результате скрининга почвенных изолятов бактерий, обладающих L-арабинозоизомеразной активностью, создана лабораторная коллекция

микроорганизмов, синтезирующих внутриклеточную L-арабинозоизомеразу. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Bacillus mojavensis Х2 разработана биотехнология получения ферментного препарата L-арабинозоизомераза ПОх.

Разработаны проекты Лабораторного регламента и Технических условий на ферментный препарат L-арабинозоизомераза ПОх. Проведена наработка препарата L-арабинозоизомераза ПОх в условиях опытного производства. Выход препарата составил 6,8г/дм3, активность ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10Х -772 ед.АиС/г. Полученные результаты подтверждены актом ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко».

Проведена апробация каталитического действия полученного препарата L-арабинозоизомераза Г10Х в лабораторных условиях. В результате изомеризации D-галактозы под действием L-арабинозоизомераза ПОх получена D-тагатоза с выходом 34,81%, что соответствует разработкам зарубежных ученых.

Апробация работы.

Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Общеуниверситетской научной конференции молодых ученых и специалистов (Москва, 2009); VII Международной научно-практической конференции и выставки "Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты"; конференции молодых ученых "Инновационные технологии продуктов здорового питания" (Москва, 2009); III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудования для пищевой

промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж, 2009); Московской Международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010); Международном симпозиуме «Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» (Москва, 2010); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы

развития» (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, где отражены

основные положения диссертации

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 201 источник, и 5 приложений. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, включает 34 таблиц и 51 рисунок.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В литературном обзоре освещена история разработок функциональных продуктов питания, пищевых и биологически активных добавок. Рассмотрены основные сахарозаменители и подсластители и способы их получения. Описаны свойства заменителя сахарозы - О-тагатозы, способы его получения, также приведены примеры использования в пищевой и фармацевтической отраслях промышленности. Описан метаболизм О-тагатозы. Приведена сравнительная характеристика ферментов й-ксилозоизомеразы и Ь-арабинозоизомеразы, катализирующих реакции изомеризации. Описаны характеристики фермента Ь-арабинозоизомеразы, выделенного из разных микроорганизмов. Приведены данные по иммобилизации фермента Ь-арабинозоизомераза.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3.1. Материалы и методы исследований Образцы почвы для скрининга. В качестве природных источников изолятов бактерий использовались образцы почв: Московской, Тамбовской, Псковской, Новгородской областей, Краснодарского края, а также образцы почв, привезенные из Казахстана, Туркменистана, Вьетнама, Египта и острова Крит. С момента отбора материал хранили при температуре +4°С в течение 1-3 месяцев.

Скрининг микроорганизмов-продуцентов фермента Ь-арабинозоизомеразы, выделенных из природных мест обитания. Скрининг микроорганизмов - продуцентов

L-арабинозоизомеразы, проводили согласно схеме, разработанной сотрудниками кафедры «Биотехнология» ФГБОУ ВПО МГУПП.

Питательные среды.

Среды, используемые для культивирования бактерий. Среда «А», %: L-арабиноза - 0,5; пептон-0,5; дрожжевой экстракт - 0,5; К2НР04-0,5; MgS04*7H20 - 0,02; (NH4)2S04 - 0,01. Среда «Б», %: L-арабиноза - 0,5; пептон - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,3; К2НР04 - 0,5; MgS04*7H20 - 0,02; (NH4)2S04 - 0,02. Среда «В», %: L-арабиноза-0,5; пептон-0,5; дрожжевой экстракт - 0,3; К2НР04-0,5; MgS04*7H20-0,02; (NH4)2S04 - 0,02.

Среды, используемые для проведения идентификации бактерий. Для идентификации бактерий использовали питательные среды производства ФГУП ГНЦ ПМ, п. Оболенск.

Морфология клетки. Морфологию, подвижность и размеры клеток исследовали с помощью фазовой оптической микроскопии на микроскопах МИКМЕД 5, БИОЛАМ.

Фенотипическая характеристика. Изучение морфологических и физиолого-биохимических характеристик выделенных культур проводили, руководствуясь общей стратегией фенотипической дифференциации, описанной в руководствах: «Определитель бактерий» (Bergey's manual, 1997), «Методы общей бактериологии (Герхард, 1983).

Определение последовательностей гена 16S rRNA. Идентификация проводилась путем анализа секвенсов вариабельных участков 16S rRNA, а также ПЦР анализа с использованием видоспецифических праймеров сотрудниками ФГУП

«ГосНИИГенетика».

Количественный метод определения активности L-арабинозоизомеразы.

Измерение активности L-арабинозоизомеразы проводили цистеин-карбазольным методом (DischeZ, Borenfreund Е, 1951).

Ферментные препараты. Поликанесцин (АС - 730 ед/г, ПС - 398 ед/г, Р-ГкС -120 ед/г, ЦС - 8 ед/г); Амилосубтилин (АС - 896 ед/г, ПС - 19 ед/г); Протооризин (АС -421 ед/г, ПС - 900 ед/г); МЭК (АС - 620 ед/г, ПС - 475 ед/г, р-ГкС - 310 ед/г, КС - 50 ед/г, ЦС — 19 ед/г); лизоцим - 26574 ед/мг.

Газовая хроматография. Анализ продуктов ферментативной биотрансформации D-галактозы проводили на хроматографе SHIMADZU GS 2010 с масс селективным

детектором QP 2010 (газ-носитель - гелий, скорость потока 1,0 мл/мин, библиотека масс спектров - NIST 05) в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программ Statistica 6.0 и Microsoft Excel 2007, в работе представлены средние результаты с

достоверностью 95%.

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.2.1. Скрининг микроорганизмов-продуцентов L-арабинозоизомеразы из природных мест обитания

В результате проведенных исследований выделены более 100 изолятов культур микроорганизмов, полученных высевом почвенных вытяжек на плотные элективные среды с L-арабинозой и различными значениями рН для алкалофильных, нормофильных и ацидофильных микроорганизмов. Проведена проверка полученных культур микроорганизмов на способность синтезировать фермент L-арабинозоизомеразу цистеин-карбазольным методом. На основании полученных результатов для дальнейших исследований отобран 1 штамм КБ4, обладавший наибольшей активностью среди исследованных штаммов - 25,30 ед.АиС/г.

3.2.2. Исследование фенотипических признаков и идентификация штамма КБ4, продуцента L-арабинозоизомеразы

В результате исследования морфологических и культуральных признаков штамма КБ4 выявлено, что выделенный во время скрининга штамм принадлежит к аэробным бактериям палочковидной формы. Бактерии размером 0,2-0,3x3,0-0,5 мкм, Неположительные, подвижные, образующие эндоспоры, на плотной среде формируют круглые колонии диаметром от 2,0 до 3,0 мм, поверхность колоний гладкая, с матовой непрозрачной структурой. Цвет колоний молочно-бежевый, молочно-желтый, профиль выпуклый, край колоний зубчатый. Рост по «штриху» четко видный, плотный, сплошной на богатых питательных средах; состоящий из отдельных колоний на бедных

питательных.

Морфологические и культуральные признаки исследуемой культуры при сравнении её с тест-культурой позволяли отнести ее к бактериям рода Bacillus.

Для выявления видовой принадлежности изучались физиолого-биохимические признаки: потребление углеводов и сахаро-спиртов, отношение к кислороду, отрицательная реакция Фогес-Проскауэра, каталазная активность. На основании

полученных данных установлено, что исследуемый микроорганизм принадлежит к роду Bacillus.

Для достоверности идентификации были изучены филогенетические особенности культуры. Секвенс I6S rRNA, проведённый поиск гомологичных последовательностей с построением филогенетического дерева (рис.1) и ПЦР анализ с использованием видоспецифических праймеров показали, что выделенный нами штамм с точностью 99% относится к роду Bacillus вида mojavensis.

Рис.1. Филогенетическое дерево с гомологичными штаммами.

Unknown - исследуемый штамм Таким образом, на основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый штамм, продуцирующий внутриклеточный фермент L-арабинозоизомеразу, идентифицирован как Bacillus mojavensis Х2.

3.2.3. Определение наиболее эффективного состава питательной среды для биосинтеза L-арабинозоизомеразы бактериальным штаммом Bacillus mojavensis Х2 Первичные исследования биосинтеза L-арабинозоизомеразы проводились при культивировании Bacillus mojavensis Х2 на среде «А», состав которой был взят из литературных источников. Дальнейшее определение наиболее эффективного состава питательной среды для глубинного культивирования Bacillus mojavensis Х2 проводили по результатам реализации метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта.

Для получения аддитивно-решетчатого описания использовали ортогональные многоуровневые планы, в которых каждый уровень каждого фактора сочетается одинаковое число раз со всеми уровнями всех остальных факторов. Факторами, наиболее влияющими на биосинтез фермента L-арабинозоизомераза культурой Bacillus mojavensis Х2, являются следующие компоненты питательной среды: L-арабиноза, пептон, дрожжевой экстракт, (NH^SOi, К2НР04, MgS04*7H20. Максимальный

■:г>;' В : ' :: 4 ')

ris ¡7!; ОЯИЗМ

■¿■ЛС1. Ь-Е : Г з ; ÄTC'C DiM ii

__r- }.■ ¡ль г ; гул : Т t>'pr «пл i [i: J i

-F^cliiuf. .Ilrif -irilnia : ; pi rAinHlK?ii>

'ЫсНЛ.из fCSAV-efiila IT: ; Ii'c.-SS' 'Mdllüa sukLUis (Tl; LWi 1 v

результат по активности L-арабинозоизомеразы Bacillus mojavensis Х2 среди проведенной серии опытов 39,68 ед.АиС/г был получен для следующего состава питательной среды (%): L-арабиноза - 0,5, пептон - 0,50, дрожжевой экстракт - 0,3, (NH4)2S04 - 0,02, К2НР04 - 0,5, MgS04*7H20 - 0,02 (среда «Б»).

3.2.4. Интенсификации биосинтеза фермента L-арабинозоизомераза бактериями Bacillus mojavensis Х2 путем совершенствования состава питательной среды по

содержанию источника углерода В связи с тем, что фермент L-арабинозоизомераза является индуцибельным и для его биосинтеза необходимо присутствие в питательной среде моносахарида L-арабинозы в качестве единственного источника углерода, были проведены исследования по влиянию концентрации L-арабинозы в питательной среде на накопление биомассы Bacillus mojavensis Х2 и биосинтез внутриклеточного фермента L-арабинозоизомеразы. Концентрацию L-арабинозы в питательной среде изменяли от 0,5 до 2,0%. Результаты показали, что наибольший выход биомассы 6,85 г/дм3 и высокий выход активности L-арабинозоизомеразы 45,01 ед.АиС/г может быть достигнут при увеличении концентрации L-арабинозы в питательной среде до 1,5% (среда «В»).

3.2.5. Изучение динамики биосинтеза фермента L-арабинозоизомеразы культурой

Bacillus mojavensis Х2 на питательной среде улучшенного состава Результаты исследований по изучению влияния продолжительности культивирования на накопление биомассы Bacillus mojavensis Х2 и на биосинтез фермента L-арабинозоизомеразы представлены на рис. 2.

Продолжительность культивирования, ч

i ш биомасса в активность фермента

Рис.2. Динамика роста культуры и биосинтеза фермента L-apaбинoзoизoмepaзы Из данных, представленных на рис. 2 видно, что прирост биомассы и увеличение

активности внутриклеточного фермента L-арабинозоизомеразы наблюдается в течение 36 ч культивирования. Далее активность фермента падает, что, возможно, является следствием ингибирования L-арабинозоизомеразы продуктами метаболизма. В результате проведенных исследований установлено, что культивирование Bacillus mojavensis Х2 на оптимизированной по составу питательной среде «В» целесообразно вести 36 ч при pH 6,8 т.к. к этому времени наблюдается максимум ферментативной активности.

3.2.6. Дезинтеграция биомассы Bacillus mojavensis Х2

Из литературных данных известно, что L-арабинозоизомераза является внутриклеточным ферментом, поэтому необходимо было подобрать наиболее эффективный метод дезинтеграции бактериальной биомассы. Так как эндоферменты обычно жестко связаны с субклеточными частицами и мембранами и образуют крупные агрегаты, полиферментные комплексы, выделение таких ферментов из клеточной биомассы невозможно без предварительного разрушения клеточных оболочек, а затем разрыва и фрагментации субклеточных частиц и мембраны, с которыми эти ферменты связаны.

В связи с этим для дезинтеграции биомассы применялись физический, химический и биохимический (ферментативный) методы: разрушение клеточных оболочек под действием ультразвука, с помощью ферментов различного происхождения и органических растворителей.

3.2.6.1. Дезинтеграция биомассы Bacillus mojavensis Х2 с помощью ультразвука

Результаты исследований по изучению дезинтеграции биомассы Bacillus mojavensis Х2 ультразвуком показали, что максимальный выход активности внутриклеточной L-арабинозоизомеразы был достигнут при 20 мин. обработке, температуре 40°С и частоте ультразвуковых колебаний 35 кГц, активность составила 48,35 ед.АиС/г, что незначительно превосходит активности фермента L-арабинозоизомеразы, полученного при культивировании Bacillus mojavensis Х2 на питательной среде состава «В» без проведения ультразвуковой дезинтеграции. При увеличении времени обработки наблюдалось снижение активности, что, вероятно, вызывалось инактивацией фермента L-арабинозоизомеразы.

3.2.6.2. Исследование процесса автолиза биомассы Bacillus mojavensis Х2 под действием органических растворителей

Исследования проводились с органическими растворителями: изопропанолом, изобутанолом, этанолом и толуолом. Наилучшие результаты исследования влияния органических растворителей в различных концентрациях на автолиз бактериальной биомассы и выход активности фермента L-арабинозоизомеразы при обработке клеточной суспензии Bacillus mojavensis Х2 в интервале температур 25- 80°С и времени автолиза от 15 до 80 мин. представлены в табл. 1.

Таблица 1

Влияние действия органических растворителей на автолиз биомассы Bacillus mojavensis

Х2

Органические растворители Концентрация, % Время автолиза, мин. Температура автолиза, °С Активность L-арабинозоизомеразы, ед.АиС/г

изопропанол 1,5 15 20 63,50

изобутанол 0,3 15 40 35,01

толуол 3,0 15 20 49,30

этанол 2,0 60 45 41,83

В результате проведенных исследований установлено, что наиболее эффективным способом для проведения автолиза клеточной биомассы Bacillus mojavensis Х2 с целью извлечения внутриклеточного фермента L-арабинозоизомеразы в бесклеточный экстракт является автолиз биомассы при участии 1,5% изопропанола температуре 20°С в течение 15 мин. Независимо от концентрации органических растворителей, времени автолиза и значения температуры, в большинстве вариантов наблюдался незначительный выход фермента L-арабинозоизомеразы в бесклеточный экстракт, что может быть обусловлено инактивацией освобождающейся L-арабинозоизомеразы, поэтому данный способ считался не эффективным.

3.2.6.3. Ферментолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2 Ферментолиз осуществили путем введения в суспензию биомассы внеклеточных ферментов, вызывающих лизис клеточной стенки. Для проведения ферментолиза использовали ферментные препараты: Поликанесцин, Амилосубтилин,

Протооризин и МЭК (мультиэнзимная композиция) в концентрации 0.1%. Обработку биомассы Bacillus mojavensis Х2 ферментными препаратами осуществляли в течение 1ч при различных температурных условиях. Проведенные исследования показали, что для ферментолиза биомассы и извлечения в бесклеточный экстракт внутриклеточного фермента L-арабинозоизомеразы Bacillus mojavensis Х2 эффективно использовать МЭК, в состав которой входят протеаза, амилаза, эндо-Р-глюканаза, ксиланаза, целлюлаза в количестве 0,1%. Оптимальная концентрация биомассы Bacillus mojavensis Х2 для дезинтеграции - 2,5%. Достигнутая активность L-арабинозоизомеразы составила 45,23 ед.АиС/г.

3.2.6.4. Фсрментолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2 комплексом ферментов

Для повышения эффективности действия исследованных ферментных препаратов на биополимеры клеточной стенки Bacillus mojavensis Х2, а именно, полисахариды и белки, было решено использовать комплексы ферментов, обладающих различной специфичностью к химическим связям в биополимерах. Ферментолиз биомассы многокомпонентными комплексами ферментных препаратов осуществляли при t=45°C и концентрации каждого ферментного препарата 0,05%. Для проведения ферментолиза использовали следующие системы: Амилосубтилин + МЭК; Поликанесцин + МЭК; Протооризин + МЭК.

Результаты проведенных исследований по обработке биомассы Bacillus mojavensis Х2 многокомпонентными ферментными системами представлены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние времени обработки биомассы Bacillus mojavensis Х2 ферментными

комплексами на активность фермента L-арабинозоизомеразы

Ферментный комплекс Время ферментолиза биомассы В. mojavensis Х2, мин. Активность L-арабинозоизомеразы, ед.АиС/г

Амилосубтилин + МЭК 60 48,3

Поликанесцин + МЭК 60 44,8

Протооризин + МЭК 40 58,3

Из результатов проведенных исследований, представленных в табл. 2, по обработке биомассы Bacillus mojavensis Х2 многокомпонентными ферментными системами видно, что лучший выход фермента L-арабинозоизомеразы в бесклеточный

экстракт наблюдается при действии на биомассу Bacillus mojavensis Х2 комплекса Протооризин + МЭК. позволяющий достичь активности L-арабинозоизомеразы 58,3 ед.АиС/г при времени ферментолиза 40 мин. По-видимому, такой эффект связан с тем, что сочетание ферментов в комплексах повышает эффективность суммарного воздействия ферментных систем на клеточную стенку бактерий Bacillus mojavensis Х2.

3.2.6.5. Ферментолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2 под действием лизоцима

Известно, что эффективным агентом, разрушающим клеточную стенку бактерий является лизоцим, осуществляющий гидролиз мурамилглюкозамина меточной стенки грам-положительных бактерий. Фермент атакует пептидогликаны (в частности, муреин), входящие в состав клеточных стенок бактерий (особенно грам-положительных). Лизоцим гидролизует (1,4)-гликозидную связь между N-ацетилмурамовой кислотой и

N-ацетилглюкозамином.

Поэтому проводили исследование разрушения клеточных стенок биомассы Bacillus mojavensis Х2 лизоцимом в его концентрациях в суспензии бактериальных клеток от 0,1 до 1,2% в течение 1ч при 45°С. По истечении этого времени суспензию центрифугировали для отделения клеточных стенок от экстракта. Результаты проведенных исследований представлены на рис. 3.

0,2 0,4 0,6 O.S 1 1.2

Дозировка ферментного препарата лизоцим. %

Рис. 3 Влияние дозировки ферментного препарата лизоцим на разрушение клеточных стенок ВасИЫ то}ауеп515 Х2 и выход фермента Ь-арабинозоизомераза в

бесклеточный экстракт.

В результате проведенных исследований выявлено, что оптимальная концентрация ферментного препарата лизоцим для проведения дезинтеграции бактериальной биомассы составила 0,7%, при этом активность Ь-арабинозоизомеразы составила 76,07 ед.АиС/г.

3.2.6.7. Интенсификация дезинтеграции биомассы Bacillus mojavensis Х2 с использованием метода аддитивно - решетчатого описания объекта Проведенные ранее исследования по влиянию физических, химических и биохимических методов дезинтеграции биомассы Bacillus mojavensis Х2 на извлечение внутриклеточного фермента L-арабинозоизомеразы в бесклеточный экстракт не привело к значительному выходу активности фермента, поэтому считали целесообразным провести интенсификацию дезинтеграции биомассы Bacillus mojavensis Х2 комплексным физико-биохимическим методом, включающим обработку лизоцимом, показавшим наилучшие результаты ферментолиза по сравнению с другими использованными ферментными препаратами и ультразвуком. Определение эффективных условий дезинтеграции биомассы Bacillus mojavensis Х2 проводили с использованием метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта. Факторами, влияющими на дезинтеграцию биомассы культуры были: концентрация лизоцима, время лизиса, температура лизиса, время воздействия ультразвука и температура.

Результаты реализации метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта приведены в табл. 3, в которой представлены наиболее эффективные сочетания факторов, позволившие достичь активности фермента L-арабинозоизомеразы выше 100 ед.АиС/г.

Таблица 3

Результаты оптимизации условий дезинтеграции клеточной биомассы культуры Bacillus

mojavensis Х2

Условия проведения дезинтеграции биомассы Bacillus

mojavensis Х2 Активность L-

Время Темпера-

Вари- Концен- Время Темпера действия тура ультра- арабинозоизоме-

ант трация ли- лизиса, тура ли- ультра- звуковой разы, ед.АиС/г

зоцима, % мин зиса, °С звука, обработки,

мин мин

1 2 3 4 5 6 7

1 0,2 20 35 40 45 134,64

2 0,7 20 40 5 35 144,30

1 2 3 4 5 6 , 7

3 0.3 20 30 10 25 102,57

4 0,4 10 j 40 10 45 111,25

В результате проведенных исследований были подобраны условия дезинтеграции биомассы бактерий Bacillus mojavensis Х2, позволяющие достигнуть выхода активности фермента L-арабинозоизомеразы 144,30 ед.АиС/г, а именно: концентрация лизоцима -

0,7%; время лизиса - 20 мин; температура - 40°С; время действия ультразвуковой обработки - 5 мин при температуре - 35 °С и частоте ультразвуковых колебаний - 35 кГц.

3.2.7 Выделение и концентрирование L-арабинозоизомеразы из водных растворов

Для выделения L-арабинозоизомеразы из водных растворов, культуры бактерий выращивали в глубинных условиях в течение 36ч при 37°С на среде «В». По окончании культивирования биомассу Bacillus mojavensis Х2 отделяли от культуральной жидкости центрифугированием и далее осуществляли деградацию ее клеток в 0,2М фосфатном буфере ферментным препаратом лизоцим и последующей обработкой ультразвуком согласно выявленным ранее оптимальным условиям юс действия. После отделения клеточных стенок проводили осаждение фермента из автолизата биомассы органическими растворителями. Полученные результаты исследования, представленны в табл.4.

Таблица 4

Влияние условий осаждения органическими растворителями на выход и активность фермента L-арабинозоизомеразы из автолизата биомассы Bacillus

mojavensis Х2

Органический Соотношение pH Выход Активность

осадитель, % автолизат ферментного ферментного

биомассы: препарата, препарата,

осадитель г/дм3 ед.АиС/г

Этанол 96 1:5 7,2 6,70 770

Изопропанол 70 1:5 7,5 6,02 670

Ацетон 50 1:5 6,5 4,23 650

Таким образом, установлено, что наиболее эффективным способом получения концентрированного ферментного препарата L-apaбинoзoизoмepaзы Г10х является его

осаждение из автолизатной вытяжки Bacillus mojavensls Х2 96%-ным этанолом в соотношении автолизат биомассы :этанол, равном 1:5, при pH 7,2, позволяющее получить ферментный препарат L-арабинозоизомеразы с активностью 770 ед.АиС/г и выходом 6,7 г/дм3.

3.2.8 Разработка технологии получения ферментного препарата L-арабинозоизомераза ПОх из биомассы Bacillus mojavensls Х2

На основании результатов исследований, представленных в предыдущих разделах работы, разработана принципиальная технологическая схема получения ферментного препарата L-арабинозоизомераза ПОх из биомассы Bacillus mojavensls Х2 (рис. 4) и проекты нормативно-технических документов: лабораторного регламента и технических условий.

3.2.9. Наработка опытных партий препарата L-арабинозоизомеразы Г10х Bacillus mojavensis Х2

Согласно разработанным нормативно-технически.» документам наработку опытный партии препарата L-арабинозоизомераза ПОх Bacillus mojavensis Х2 осуществляли на пилотной установке ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко».

Культивирование продуцента L-арабинозоизомеразы Bacillus mojavensis Х2 проводилось в лабораторном ферментере общим объемом 10 дм3 (рабочий объем 7 дм3) на питательной среде следующего состава (%):Ь-арабиноза - 1,5; пептон - 0,5; дрожжевой экстракт-0,3; К2НР04-0,5; MgS04*7H20-0,02; (NH4)2S04 - 0,02.

Температура культивирования 37±1°С, pH питательной среды 6,8, количество посевного материала 5%, длительность культивирования 36 ч при постоянной аэрации и перемешивании.

Состав питательной среды для выращивания посевного материала вт колбах аналогичен составу питательной среды для ферментера. Длительность выращивания посевного материала 24 ч, температура культивирования 37± ГС.

Отделение биомассы продуцента проводилось центрифугированием в течение 20 мин при 15000 об/мин на центрифуге «Beckman Model J2-21». Дальнейшее получение ферментного препарата L-арабинозоизомераза ПОх проводилось на оборудовании ЗАО «Мастер клон» по следующей схеме: бактериальная биомасса дезинтеграция ~> вакуум-выпаривание на вакуум-выпарной установке УВВ-50 при температуре 50"С ->

ар-11 ЗН 12 Прирм ч мшинмие

6и0«0Л^Г|гА|1 проВгрга __| Привиихвонс!** сио»в |----'"тп™'в*'!'11'11 'и

в"'- 5 3

Ч!!1Н (С (П 1

НПО' [О с«| ЯР-1

ОР-3 ВР-13

ГНи! 11«и йодЗдо Л

ПшнимАпен^коо'тАора ■ ПоиготюВлеьиР оосмйорл I

Йяи 11г<уЛ1Л»!&От1* (»И 1

ПавгмлЬкс овоочвоЛочт

—-|тп ?

Гоигефойлрлцр тимяммюй

Киинеьие и пойоеожопие (

НП 8 Г.

1......1

—чП-вн

гмШМьелънСн.- |

]игД|»

Пии^оаюанеиъс

питательной

«Л^тп И Г

!ТП-10 I центпийугироЛанн*

ПоЬготобка теплоносителе Г

ТП-11 Зезинте'роцил оиоиоссы

Г

ТП-12 | Центрифугиробоние 2

тп ! Кочцвншриробанив I фугошя ^о ВВЧ

тп-и Осаждение фермента

I Кпоз.ОЫЫ

»- конаексаФ Ь г отельную

ТП-15 | ЦентоифугироЬоние3

ТП-16 I Сушка

--^Кпсз.СДО

ТП-17 I дробление базобого -г-пьть но 0Б8

( ', препарата

ООО ?! о».т*Лгм(Оввомп»1011ЛзЛ-

1 Г*

ТП-18 . О'иыдииишииин

I севчгч'поимо --1-

к 1П-10

Гп°Ра—>{чм0-19! Упп':о6<а "ар<ироСжо. ----» готовый ацойцкт«<

I _ I «ка I с «.год

Рис. 4 Принципиальная технологическая блок-схема получения арабинозоизомераза Г10Х

ферментного препарата Ь-

охлаждение концентрата до 2°С -> осаждение L-арабинозоизомеразы из концентрата 5 объемами охлажденного до 4°С этанола (96%) отделение белкового осадка центрифугированием на центрифуге Т24Д лиофильная сушка в сушилке «Advantage». Выход воздушно-сухого препарата L-арабинозоизомераза ПОх составил 6,8 г/дм (общий выход препарата 47.6 г). Активность L-арабинозоизомераза в готовом препарате

составила 772 ед.АиС/г.

На основании опытной наработки препарата проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии L-арабинозоизомеразы ПОх, который показал, что оптовая цена ферментного препарата составила 2630,! 7 руб за 1 кг.

3.2.10 Определение температурного оптимума ферментного препарата L-

арабинозоизомераза Г10х Для определения температурного оптимума для действия полученного ферментного препарата, исследование проводили с 0,1% раствором фермента. Значения температуры изменяли в пределах 20-90°С. В качестве субстрата использовали Ш раствор галактозы в 0,2М фосфатном буфере с оптимальным рН 7,0. После инкубирования фермента с субстратом в течение 1 ч проводили определение активности L-арабинозоизомеразы. Результаты проведенного исследования представлены на рис. 5.

Температурный оптимум действия ферментного препарата L-арбинозоизомераза ПОх, выделенного из Bacillus mojavensis Х2, лежит в диапазоне 40-50°С. Дальнейшее повышение температуры субстрата вызывает потерю ферментативной активности на 23%, что является следствием температурной денатурации фермента.

С

<L> ' i IО

с:

о Г, Ой

0

£ ' г nr.

1 С.

о. сС 4 и L >

х. ?ЛК>

о

х 1 К •

о

<г

Теглперотуро, "< '

Рис. 5 Влияние температуры субстрата на активность препарата L-арабинозоизомераза ПОх

Таким образом, установлено, что оптимальным значением температуры для действия ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10х является 45°С.

3.2.9 Определение рН-оптимума ферментного препарата L-арабинозоизомераза

ПОх

Для определения оптимального значения рН среды, позволяющего достигнуть максимальной активности L-арабинозоизомеразы, исследование проводили с 0,1% раствором фермента. В качестве субстрата использовали 1М раствор галактозы в 0,2М фосфатном буфере с различными значениями рН (от 3,0 до 11,0). После инкубирования фермента с субстратом при температуре 45°С в течение 1 ч проводили определение активности L-арабинозоизомеразы. Результаты проведенных исследований представлены на рис. 6.

Е SOO ;

t 700

<JJ

о боо :

0

1 SOO

t *

g- S" 400 i

I 300

5 20O :

Se

« O

Рис. 6 Влияние рН на активность препарата L-арабинозоизомераза ПОХ Установлено, что оптимальное значение рН для действия ферментного препарата L-арабинозоизомеразы ПОХ лежит в диапазоне от 6,0 до 7,5.

3.2.12 Определение D-тагатозы методом газовой хроматографии Для проверки каталитического действия L-арабинозоизомеразы на изомеризацию D-галактозы в D-тагатозу готовили реакционную смесь путем добавления различных концентраций ферментного препарата L-арабинозоизомераза ПОх (0,1-5,0 %) к 5 %-ному раствору чистого субстрата D-галактозы. Реакционную смесь инкубировали при рН 7,0, температуре 45°С в течение 24 ч. и проводили хроматографический анализ смеси Сахаров. Сахара хроматографически разделяли в виде летучих производных — простых и сложных эфиров с использованием анализа в виде триметил-силильных (ТМС) производных моносахаридов на хроматографе SHIMADZU GS 2010 с масс селективным детектором QP 2010, газ - носитель - гелий, скорость потока 1,0 мл/мин. Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5

Содержание D-тагатозы в смеси после проведения изомеризации D-галактозы

№ п/п Концентрация ферментного препарата L-арабинозоизомеразы ПОх, % Содержание в смеси

D-галактоза, % D-тагатоза, %

1 0,1 81,31 18,69

2 0,5 79,21 20,79

3 1,0 65,19 34,81

Г4 i_ 5,0 72,51 27,49

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что оптимальной концентрацией ферментного препарата L-арабинозоизомераза ПОх для осуществления изомеризации D-галактозы в D-тагатозу является 1,0 %, позволяющей получить выход D-тагатозы 34,81 %, что соответствует результатам, полученным зарубежными учеными. Дальнейшее увеличение концентрации ферментного препарата привело к уменьшению концентрации D-тагатозы в реакционной смеси.

Выводы

1. В результате проведенного скрининга микроорганизмов-продуцентов L-арабинозоизомеразы из различных источников отобран бактериальный штамм КБ4 с L-арабинозоизомеразной активностью 25,30 едАиС/г.

2. Изучение совокупности культуральных, морфологических, физиолого-биохимических признаков и проведенный филогенетический анализ показали, что целевой штамм относится к роду Bacillus виду mojavensis с точностью 99%.

3. На основании экспериментальных данных сконструирован наиболее эффективный состав питательной среды для культивирования в лабораторных условиях штамма Bacillus mojavensis Х2, подобраны условия культивирования, обеспечивающие максимальную активность внутриклеточной L-арабинозоизомеразы - 45,01 ед.АиС/г. Исследована динамика биосинтеза внутриклеточной L-арабинозоизомеразы бактериями Bacillus mojavensis Х2, на сновании которой выявлено, что фермент синтезируется после накопления биомассы бактериями, а максимум активности в культуральной жидкости приходится на 36 ч роста при значении pH питательной среды 6,8.

4. Подобраны условия дезинтеграции биомассы Bacillus mojavensis Х2 с целью выделения внутриклеточного фермента L-арабинозоизомеразы в бесклеточный экстракт. Оптимальные условия дезинтеграции: концентрация лизоцима 0,7%; время лизиса 20 мин; температура лизиса 40°С; время действия ультразвуковой обработки 5 мин при частоте ультразвуковых колебаний - 35 кГц; температура 35°С. Подобраны условия выделения фермента L-арабинозоизомераза Г10х при осаждении этанолом (соотношение объемов автолизат биомассы Bacillus mojavensis Х2 : 96%-ный этанол равно 1:5; рН7,2).

5. Разработаны технология получения препарата L-арабинозоизомераза ПОх и проекты нормативно-технических документов: лабораторного регламента и технических условий.

6. Осуществлена наработка ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10Х в опытно-промышленных условиях на пилотной установке ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко» на основе разработанной технологической схемы. Выход воздушно-сухого препарата L-арабинозоизомераза ПОх составил 6,8 г/дм3 (общий выход препарата 47,6 г). Активность L-арабинозоизомераза Г10х в готовом препарате составила 772 ед.АиС/г. Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10х, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне 2630,17 руб за 1 кг.

7. Определены наиболее эффективные значения температуры и pH для действия ферментного препарата L-абинозоизомераза: 45°С, pH 6,0-7,5. Проведена апробация каталитического действия L-арабинозоизомеразы на 5%-ный раствор D-галактозы. С помощью газовой хроматографии установлено, что при концентрации фермента 1% выход D-тагатозы составил 34,81%.

Список публикаций

1. Воеводина О.С. Новый заменитель сахара для производства диетических продуктов питания / Иванова Л.А., Киреева Е.А. II Общеуниверситетская научная конференция молодых ученых и специалистов, МГУПП, 2009. - С. 89-95.

2. Воеводина О.С. Скрининг микроорганизмов-продуцентов L-арабинозоизомеразы с целью дальнейшего получения заменителя сахара D-тагатозы / Иванова Л.А., Киреева Е.А. // В сб. материалов VII Международная научно-практическая конференция и выставка "Технологии и продукты здорового питания.

Функциональные пищевые продукты". Конференция молодых ученых "Инновационные технологии продуктов здорового питания". Отв. ред. д.т.н. А.П. Нечаев. - М.: Изд. комплекс МГУПП, 2009. - С. 120-124.

3. Воеводина О.С. С Получение нового заменителя сахара - D-тагатозы /Иванова Л.А., Киреева Е.А. // В сб. «Инновационные технологии и оборудования для пищевой промышленности (приоритеты развития)»: Материалы III Международной научно-технической конференции. Т. 1 // ВГГА, Воронеж, 2009. - С. 384-389

4. Воеводина О.С. Энзиматический способ переработки молочной сыворотки / Иванова Л.А., Киреева Е.А. // Материалы Московской Международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов». - Москва, 1517 марта 2010 г. - РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2010. - С. 263-264

5. Воеводина О.С. Разработка биотехнологии L-арабинозоизомеразы для биоконверсии галактозы в D-тагатозу / Иванова Л.А., Киреева Е.А. // Материалы Международного симпозиума «перспективные биокатализаторы да перерабатывающих отраслей АПК». - Москва, 17-18 мая 2010 г. - М.: ВНИИПБТ, 2010. - С. 25-31

6. Воеводина О.С. Низкокалорийный сахар D-тагатоза и способы его получения / Иванова Л.А., Киреева Е.А. // Естественные и технические науки , № 6, 2010. - М.: ООО

«Издательство «Спутник+». - с. 624-626.

7. Воеводина О.С. Технология фермента L-арабинозоизомеразы. / Иванова Л.А., Киреева Е.А. // Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», ч.2., с. 173.

8. Воеводина О.С. Выделение L-арабинозоизомеразы из клеток продуцента Bacillus mojavensis / Иванова Л.А., Белуха Д.С. II Естественные и технические науки, № 5, 2011.- М.: ООО «Издательство «Спутник+». - с. 392-394.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность коллективу кафедры «Биотехнология» МГУПП.

Подписано в печать 17.11.2011 г. Заказ №2373/11А Тираж 150 шт. Усл. печ.л. 1,5 Отпечатано в типографии ООО «Аналитик» Ленинградское шоссе, д. 18

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 Обзор литературы.

1.1 Функциональные продукты питания.

1.1.1 Концепция развития функциональных продуктов.

1.1.2 Основные категории функциональных продуктов.

1.2 Пищевые и биологически активные добавки.

1.3 Сахарозаменители и подсластители.

1.4 Способы получения сахарозаменителей.

1.5 Б-тагатоза.

1.5.1 Структура и свойства О-тагатозы.

1.5.2 Метаболизм Б-тагатозы.

1.5.3 Применение Б-тагатозы.

1.5.4 Способы получения Б-тагатозы.

1.5.4.1 Химический способ получения Б-тагатозы.

1.5.4.2 Биологический способ получения Б-тагатозы.

1.6 Ь-арабинозозомераза.

1.6.1 Б-ксилозоизомераза и Ь-арабинозозомераза.

1.6.2 Ь-арабинозозомераза и ее свойства.

1.6.3 Иммобилизация фермента Ь-арабинозозомераза.

ГЛАВА 2 Материалы и методы исследований.

2.1 Микроорганизмы.

2.2 Образцы почв для скрининга.

2.3 Скрининг микроорганизмов-продуцентов фермента Ь-арабинозоизомеразы, выделенных из природных мест обитания.

2.4 Питательные среды.

2.5 Ферментные препараты.

2.6 Оборудование и приборы.

2.7 Методы.

2.7.1 Методы исследования бактерий.

2.7.2 Выращивание культуры Bacillus mojavensis Х2 в условиях глубинной ферментации.

2.7.3 Отделение биомассы продуцентов.

2.7.4 Метод аддитивно-решетчатого математического описания объекта для оптимизации состава питательной среды для биосинтеза фермента L-арабинозоизомеразы микроорганизмами.

2.7.5 Интенсификации биосинтеза фермента L-арабинозоизомеразы бактериями Bacillus mojavensis Х2 путем совершенствования состава питательной среды по содержанию источника углерода.

2.7.6 Определение содержания сухих веществ.

2.7.7 Определение величины pH растворов.

2.7.8 Определение белка.

2.7.9 Методы определения активностей ферментов.

2.7.9.1 Определение активности L-арабинозоизомеразы цистеин-карбазольным методом.

2.7.9.2 Определение протеолитической активности (модифицированный метод Ансона).

2.7.9.3 Определение целлюлолитической активности модифицированным фотоколориметрическим методом.

2.7.10 Дезинтеграция клеток Bacillus mojavensis Х2.

2.7.10.1 Дезинтеграция с помощью ультразвука.

2.7.10.2 Автолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2 под действием органических растворителей.

2.7.10.3 Ферментолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2 ферментами различного происхождения.

2.7.10.4 Ферментолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2 многокомпонентными ферментными комплексами.

2.7.11. Определение эффективных условий дезинтеграции биомассы с использованием метода аддитивно-решетчатого описания объекта.

2.7.12 Выделение фермента L-арабинозоизомеразы. Осаждение фермента органическими растворителями.

2.7.13 Определение температурного оптимума действия L-арабинозоизомеразы.

2.7.14 Определение pH-оптимума L-арабинозоизомеразы.

2.7.15 Определение D-тагатозы методом тонкослойной хроматографии.

2.7.16 Определение D-тагатозы методом газовой хроматографии.

ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение.

3.1 Скрининг микроорганизмов-продуцентов фермента L-арабинозоизомеразы, выделенных из природных мест обитания.

3.2. Исследование бактерий рода Enterobacter на способность синтезировать L-арабинозоизомеразу.

3.3. Исследование фенотипических признаков бактериального штамма КБ4.

3.3.1 Морфологические особенности клеток.

3.3.2 Культуральные признаки штамма КБ4.

3.3.3 Физиолого-биохимические признаки штамма КБ4.

3.3.4 Филогенетический анализ штамма-продуцента.

3.3.5 Устойчивость штамма Bacillus mojavensis, продуцирующего фермент L-арабинозоизомеразу, к факторам внешней среды.

3.4 Определение наиболее эффективного состава питательной среды для биосинтеза фермента L-арабинозоизомеразы Bacillus mojavensis Х2 методом аддитивно-решетчатого математического описания объекта.

3.5. Совершенствование состава питательной среды по содержанию источника углерода для интенсификации биосинтеза фермента L-арабинозоизомераза бактериями В. mojavensis Х2.

3.6 Изучение динамики биосинтеза фермента L-арабинозоизомеразы культурой Bacillus mojavensis Х2 на питательной среде улучшенного состава.

3.7 Изучение дезинтеграции биомассы Bacillus mojavensis Х2 различными методами.

3.7.1 Дезинтеграция биомассы Bacillus mojavensis Х2 с помощью ультразвука.

3.7.2 Исследование процесса автолиза биомассы Bacillus mojavensis

Х2 под действием органических растворителей.

3.7.2.1 Проведение автолиза биомассы Bacillus mojavensis Х2 с помощью этанола.

3.7.2.2 Проведение автолиза биомассы Bacillus mojavensis Х2 с помощью изопропанола, изобутанола и толуола.

3.7.3. Ферментолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2.

3.7.4 Ферментолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2 под действием лизоцима.

3.7.5 Исследование ферментолиза биомассы Bacillus mojavensis Х2 комплексом ферментов.

3.7.6 Интенсификация дезинтеграции биомассы Bacillus mojavensis Х2 с использованием метода аддитивно-решетчатого описания объекта.

3.8 Выделение L-арабинозоизомеразы из водных растворов.

3.8.1 Осаждение фермента этанолом при различных его концентрациях и значениях pH автолизата биомассы Bacillus mojavensis Х2.

3.8.2 Осаждение фермента изопропанолом при различных его концентрациях и значениях pH автолизата биомассы Bacillus mojavensis XI.

3.8.3 Осаждение фермента ацетоном при различных его концентрациях и значениях pH автолизата биомассы Bacillus mojavensisXl.

3.9 Исследование физико-химических свойств ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10х.

3.9.1 Определение температурного оптимума ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10х.

3.9.2 Определение pH-оптимума ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10х.

3.10 Разработка технологии получения ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г1 Ох из биомассы Bacillus mojavensis Х2.

3.11 Наработка опытных партий препарата L-арабинозоизомеразы Г10х Bacillus mojavensis Х2.

3.12 Определение D-тагатозы методом тонкослойной хроматографии.

3.13 Определение D-тагатозы методом ГХ.

Актуальность темы.

В условиях современного ритма жизни потребление сахара неуклонно растет. Но каждый знает, что калорийность сахара достаточно велика, и если человек живет в условиях сниженных энергозатрат, то избыток калорий превращается в жир, в результате чего у большинства населения возникает угроза ожирения и сахарного диабета. При чрезмерных дозах употребления сахароза может привести к тяжелым нарушениям углеводного и жирового обмена, а также способствовать развитию различных заболеваний.

Натуральные заменители сахара такие, как фруктоза, ксилит и сорбит отличаются довольно высокой калорийностью, поэтому синтезировали низкокалорийные искусственные подсластители, которые превосходят сахар по сладости, но никак не влияют на выброс инсулина и уровень сахара в крови. Однако искусственные подсластители имеют ряд недостатков, поэтому в настоящее время всё чаще возникает вопрос о пользе и безопасности этих соединений.

В связи с этим во многих странах проводят исследования по разработке технологии безопасного и эффективного низкокалорийного подсластителя, применение которого возможно для широкого ассортимента пищевых продуктов и разновозрастного круга населения.

D-тагатоза - полностью натуральный сахар, представляющий собой моносахарид, используемый как подсластитель. D-тагатоза фактически не отличается по вкусу от сахарозы, но с точки зрения более быстрого ощущения сладости подобна фруктозе. Её сладость составляет около 0,9 ед. SES. D-тагатоза имеет невысокую калорийность (1,5 ккал/г), в отличие от других заменителей сахарозы она лишена слабительного эффекта.

Для ферментативной конверсии D-галактозы в D-тагатозу используют фермент L-арабинозоизомераза, не обладающий выраженной субстратной специфичностью.

В настоящее время в РФ производство Б-тагатозы отсутствует, хотя в данном направлении проводятся исследования. Тем не менее, нарастает высокий интерес к этому уникальному заменителю сахарозы во всех странах, в том числе и РФ. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза с целью получения Б-тагатозы актуальна и перспективна.

Настоящая работа посвящена разработке технологии ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза для получения Б-тагатозы.

Цель и задачи исследования.

Основная цель диссертационной работы состояла в поиске нового активного продуцента Ь-арабинозоизомеразы, разработке технологии очищенного ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза Г10Х для трансформации Б-галактозы в Б-тагатозу.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- скрининг микроорганизмов-продуцентов Ь-арабинозоизомеразы, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора штамма, обладающего наибольшей Ь-арабинозоизомеразной активностью;

- идентификация штамма-продуцента Ь-арабинозоизомеразы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;

- подбор наиболее эффективного состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента;

- разработка технологии получения ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза Г10х;

- наработка ферментного препарата Ь-арабинозоизомеразы в опытно-промышленных условиях;

- изучение основных параметров действия ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза Г10х и его апробация как катализатора при биотрансформации D-галактозы в D-тагатозу.

Научная новизна работы.

Проведен направленный скрининг микроорганизмов с L-арабинозоизомеразной активностью, выделенных из различных видов почв.

В результате скрининга для исследований отобран штамм-продуцент L-арабинозоизомеразы с максимальной активностью (25,30 ед.АиС/г). На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм, продуцирующий L-арабинозоизомеразу, идентифицирован как Bacillus mojavensis Х2.

На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом Bacillus mojavensis Х2 L-арабинозоизомеразной активности от условий культивирования, а также выхода фермента, от параметров дезинтеграции биомассы, выделения и его очистки, впервые в РФ научно-обоснована биотехнология ферментного препарата L-арабинозоизомераза ГЮх для трансформации D-галактозы в D-тагатозу.

Практическая значимость и реализация результатов работы.

В результате скрининга почвенных изолятов бактерий, обладающих L-арабинозоизомеразной активностью, создана лабораторная коллекция микроорганизмов, синтезирующих внутриклеточную L-арабинозоизомеразу. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Bacillus mojavensis Х2 разработана биотехнология получения ферментного препарата L-арабинозоизомераза ГЮх.

Разработаны проекты Лабораторного регламента и Технических условий на ферментный препарат L-арабинозоизомераза ГЮх. Проведена наработка препарата L-арабинозоизомераза ГЮх в условиях опытного производства. Выход препарата составил 6,8г/дм3, активность ферментного препарата L-арабинозоизомераза ГЮХ - 772 ед.АиС/г. Полученные результаты подтверждены актом ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко».

Проведена апробация каталитического действия полученного препарата Ь-арабинозоизомераза Г10Х в лабораторных условиях. В результате изомеризации Б-галактозы под действием Ь-арабинозоизомераза Г10х получена Б-тагатоза с выходом 34,81%, что соответствует разработкам зарубежных ученых.

Апробация работы.

Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Общеуниверситетской научной конференции молодых ученых и специалистов (Москва, 2009); VII Международной научно-практической конференции и выставки "Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты"; конференции молодых ученых "Инновационные технологии продуктов здорового питания" (Москва, 2009); III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудования для пищевой промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж, 2009); Московской Международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010); Международном симпозиуме «Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» (Москва, 2010); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 201 источника, и 5 приложений. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, включает 34 таблиц и 51 рисунок.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В результате проведенного скрининга микроорганизмов-продуцентов L-арабинозоизомеразы из различных источников отобран бактериальный штамм КБ4 с L-арабинозоизомеразной активностью 25,30 едА-иС/г.

2. Изучение совокупности культуральных, морфологических, физио-лого-биохимических признаков и проведенный филогенетический анализ показали, что целевой штамм относится к роду Bacillus виду mojavensis с точностью 99%.

3. На основании экспериментальных данных сконструирован наиболее эффективный состав питательной среды для культивирования в лабораторных условиях штамма Bacillus mojavensis XI, подобраны условия культивирования, обеспечивающие максимальную активность внутриклеточной L-арабинозоизомеразы - 45,01 ед.АиС/г. Исследована динамика биосинтеза внутриклеточной L-арабинозоизомеразы бактериями Bacillus mojavensis Х2, на сновании которой выявлено, что фермент синтезируется после накопления биомассы бактериями, а максимум активности в культуральной жидкости приходится на 36 ч роста при значении pH питательной среды 6,8.

4. Подобраны условия дезинтеграции биомассы Bacillus mojavensis Х2 с целью выделения внутриклеточного фермента L-арабинозоизомеразы в бесклеточный экстракт. Оптимальные условия дезинтеграции: концентрация лизоцима 0,7%; время лизиса 20 мин; температура лизиса 40°С; время действия ультразвуковой обработки 5 мин при частоте ультразвуковых колебаний — 35 кГц; температура 35°С. Подобраны условия выделения фермента L-арабинозоизомераза Г10х при осаждении этанолом (соотношение объемов автолизат биомассы Bacillus mojavensis Х2 : 96%-ный этанол равно 1:5; pH 7,2).

5. Разработаны технология получения препарата L-арабинозоизомераза ПОх и проекты нормативно-технических документов: лабораторного регламента и технических условий.

6. Осуществлена наработка ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10Х в опытно-промышленных условиях на пилотной установке ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко» на основе разработанной технологической схемы. Выход воздушно-сухого препарата L-арабинозоизомераза Г10х составил 6,8 г/дм (общий выход препарата 47,6 г). Активность L-арабинозоизомераза Г10х в готовом препарате составила 772 ед.АиС/г. Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г1 Ох, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне 2630,17 руб за 1 кг.

7. Определены наиболее эффективные значения температуры и рН для действия ферментного препарата L-абинозоизомераза: 45°С, рН 6,0-7,5. Проведена апробация каталитического действия L-арабинозоизомеразы на 5%-ный раствор D-галактозы. С помощью газовой хроматографии установлено, что при концентрации фермента 1% выход D-тагатозы составил 34,81%.

1. Азрилевич М.Р. Заменители сахара // Пищевые ингредиенты: сырье и добавки.2001. №2. С. 42-44

2. Азрилевич М.Р. Заменители сахара // Пищевые ингредиенты: сырье и добавки.2002. № 1.С. 42-45.

3. Безбородов A.M. Ферментативные процессы в биотехнологии / A.M. Безбородов, H.A. Загустина, В.О. Попов; отв. Ред. Л.И. Воробьева.; Ин-т биохимии им. А.Н. Баха РАН. М.: Наука, 2008. - 335с.

4. Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с.

5. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. М.: КолосС, 2004. -296с.

6. Блинов Н.П. Основы биотехнологии. Для студентов институтов; аспирантов и практических работников. Издательская фирма «Наука». СПб| 1995г.

7. Бугаенко И.Ф., Сорокин А.И. Заменители сахара и их применение. М.: АгроНИИТЭИПП, 1997. Вып. 1-2. 36 с

8. Васильев С.Н., Гамова И.А., де Векки A.B., Дейнеко И.П. и др. Новый справочник химика и технолога. Сырье и продукты промышленности органических и неорганических веществ. Часть П.НПО "Профессионал" 2005, -1142с.

9. Грачев Ю.П., Плаксин Ю.М. Математические методы планиерования экспериментов. -М.: ДеЛи принт, 2005.- 296 с.

10. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов / Грачева И.М., Кривова А.Ю. 3-е изд. - М.: Элевар, 2000. - 512 с. - (Учеб. и учеб. пособия для студентов вузов).

11. Грейсс.Ф. Основы тонкослойной хроматографии (планарная хроматография): пер.с англ. М.: Мир, 1999. 753 с.

12. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. Учебник для студ. Биол. специальностей вузов. 4-е изд., стер. - М.: Издательский центр «Академия»,2003. 464 с.

13. Дане JI. Функциональное питание . Современные аспекты // Маь. Всерос. Конференции «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и леччении наиболее распространенных заболеваний человека». М., 21-23 апреля 1999, с. 15-17.

14. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. 2002, Изд-во «ГрантЪ», 295 с.

15. Евдокимов. И.А., Никишина И.Н., Серов A.B. и др. Нанобиотехнология получения тагатозы // Переработка молока. 2007, № 12, стр. 40-41

16. Евдокимов. И.А., Никишина И.Н., Серов A.B. и др. Нанобиотехнология получения тагатозы // Переработка молока. 2007, № 12, стр. 40-41.

17. Ефимов, Е.И. Осторожно! Вредные продукты: Не все вкусное полезно / Е.И. Ефимов. СПб.: Невский проспект, 2005. - 160 с

18. Закревский, В.В. Безопасность пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище. Практическое руководство по санитарно-эпидемиологическому надзору / В.В. Закревский. СПб.: ГИОРД, 2004 - 280с.

19. Иванова JI.A., Войно Л.И. и др. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по дисциплине «Технология биоконверсии растительного сырья». М.:Издательский комплекс МГУПП, 2002. -66с.

20. Иванова Л.А., Войно Л.И. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по технологии белковых препаратов, аминокислот и липидов.- М.: Издательский комплекс МГУПП, 1985. -42 с.

21. Иванова Л.А., Войно Л.И., Иванова И.С. Пищевая биотехнология. Кн.2. Переработка растительного сырья. М.: КолосС, 2008. - 472с.

22. Костенко A.B., Даеничева В.А., Костенко A.B. Особенности рынка сахара // Сахар. 2002. № 6. С. 14-17.

23. Костенко A.B., Даеничева В.А., Костенко Ан.В. Особенности рынка сахара // Сахар. 2002. № 6. С. 14-17.

24. Кочеткова A.A., Ипатова Л.Г., Нечаев А.П., Шубина О.Г. / Под ред. A.A. Кочетковой. Функиональные продукты питания: Учебное пособие. М.: Издательский комплекс МГУПП, 2007. - 104с.

25. Крутошикова А., Угер М. Природные и синтетические сладкие вещества. М.: Мир, 1988.120 с

26. Кулакова A.B., Орещенко A.B., Дурнев А.Д. Антимутагенная активность аспартама // Хранение и переработка сельхозсырья. 2003. № 5. С. 90.

27. Методические рекомендации МР 2.3.1.1915-04 «Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ». Москва. 2004, 36 стр. Изд. ГОУ «Оренбург. Гос. Университет»

28. Мировое производство подслащивающих веществ / H.A. Романика, М.А. Деулина, Н.Б. Шорохова, В.А. Маханова. М.: АгроНИИТЭИПП, 1986. Вып. 8.16 с

29. Моурик C.B. В фокусе сладости: альтернатива натуральному сахару // Пиво и напитки. 2007, №2, с. 62-64.

30. Нечаев А.П., Коткова Т.В. Ингредиенты разные, а задачи участников СППИ-общие// Пищевые ингредиенты.Сырьи добавки. 2005, №2. 12-13

31. Нечаев А.П., Кочеткова A.A., Мартынова Н.В., Николаева Ю.В. Пищевые и биологически активные добавки: Учебное пособие. М.: Издательский комплекс МГУПП, 2004. - 116с.

32. Нилов Д.Ю., Т.Э.Некрасова. Современное состояние и тенденции развития рынка функциональных продуктов питания и пищевых добавок. .// Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. 2005, №2.28-2935.