автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка технологии дрожжевой липазы для применения в пищевой промышленности

На правах рукописи

ГАСКАРОВА ЕЛЕНА ФИДАЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ДРОЖЖЕВОЙ ЛИПАЗЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Специальность: 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических

активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

г СЕН 2015

Москва-2015

005561844

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Иванова Людмила Афанасьевна

Официальные оппоненты: Ефременко Елена Николаевна доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник кафедры химической энзимологии химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Горин Кирилл Викторович кандидат технических наук, ведущий инженер отделения биотехнологий и биоэнергетики НИЦ «Курчатовского института» (Российская Федерация)

Ведущая организация: ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии» (ФГБНУ ВНИИПБТ)

Зашита состоится: 24 сентября 2015 г. в 11-00 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.025.01 по специальности 05.18.07 при ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности» (ФГБНУ ВНИИПБиВП) по адресу: 119021, г. Москва, ул. Россолимо, д.7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности» и на сайте www.vniinapitkov.ru.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ Министерства образования и науки РФ по адресу http://www.vak2.ed.gov.ru.

Автореферат разослан « » августа 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук

Л.Н. Харламова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих направлений в развитии биотехнологии во всем мире. Их применение в промышленности позволяет интенсифицировать множество технологических процессов, увеличить объем выпускаемой продукции, повысить ее качество и снизить себестоимость, а так же сэкономить дефицитное сырье.

В современной пищевой промышленности существует важная проблема - это модификация жиров с целью придания им определенных биологических и физико-химических свойств: нужной пластичности, твердости, консистенции, повышения пищевой ценности. Достичь этого можно с помощью регулирования жирнокислотного состава жиров и масел. Наиболее перспективным методом в этом отношении считается ферментативная трансформация растительных масел.

Известные в отечественной и зарубежной практике микробные липолитические ферментные препараты являются, как правило, грибного и бактериального происхождения, оптимум действия липаз которых чаще всего находится в нейтральной и щелочной областях рН. В этой связи возникла необходимость поиска нового высокоактивного дрожжевого штамма-продуцента липаз, проявляющего свою активность в кислой области значений рН, пригодного для использования в пищевой промышленности.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в поиске нового активного дрожжевого продуцента липазы, разработке условий его культивирования для биосинтеза фермента, получении очищенного ферментного препарата липазы и его апробации в пищевой промышленности.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

скрининг микроорганизмов-продуцентов липаз, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора штаммов, обладающих наибольшей липазной активностью; отбор штаммов-продуцентов липазы дрожжевого происхождения по совокупности их морфологических и культуральных признаков;

идентификация выбранного штамма-продуцента липазы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических характеристик, а также на основе анализа участка ДНК, кодирующего часть 188 рРНК; разработка эффективного режима глубинного культивирования штамма-продуцента и оптимизация состава питательной среды;

проведение индуцированного мутагенеза штамма-продуцента с целью получения дрожжевого мутанта, обладающего повышенной липазной активностью;

- разработка биотехнологии ферментного препарата липазы на основе нового перспективного штамма дрожжей;

изучение состава ферментного препарата липазы и условий его использования в пищевой промышленности;

- установление жирнокислотной специфичности полученного ферментного препарата на примере гидролиза растительных масел, применяемых в пищевой промышленности.

Научная новизна работы. В результате проведенного направленного скрининга микроорганизмов отобран новый штамм дрожжей, продуцирующий липазу. На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик штамм идентифицирован как Candidaparapsilosis MIO.

В результате проведенного индуцированного мутагенеза получен мутант C.parapsilosis MI 0-10, обладающий липазной активностью на 15% выше по сравнению с родительским штаммом.

На основе лабораторных исследований и полученных зависимостей накопления новым штаммом С. parapsilosis MI0-10 липазной активности и выхода липазы от условий культивирования этого штамма, параметров выделения и очистки ферментного препарата, дано научное обоснование разработаной биотехнологии препарата дрожжевой липазы.

Впервые проведена оптимизация условий гидролиза растительных масел с применением липазы Ml0-10 Г20х в отсутствии эмульгатора, исследованы состав, условия действия и жирнокислотная специфичность полученного ферментного препарата.

Практическая значимость работы. Проведенные лабораторные исследования явились основой для разработки технологии дрожжевой липазы, пригодной для применения в пищевой промышленности. С использованием математических методов планирования экспериментов были оптимизированы основные значимые параметры процессов в технологии ферментного препарата липазы.

На основе наиболее продуктивного штамма С. parapsilosis М10-10, полученного в результате скрининга микроорганизмов-продуцентов липаз, разработан проект Лабораторного технологического регламента по производству ферментного препарата липаза Ml0-10 Г20х, на основе которого проведена наработка липазы М10-10 Г20х штамма С. parapsilosis М10-10 с активность 30600 ед/г (оптимум действия препарата: рН 5,5; t=37°C) в условиях опытного производства ОАО «Биохиммаш». Результаты подтверждены актом о наработке (утверждены заместителем генерального директора по науке ОАО «Биохиммаш» 20.03.2014 г.). Составлен проект Технических условий на ферментный препарат липаза Ml0-10 Г20х штамма С. parapsilosis Ml 0-10.

Проведенный расчет экономической эффективности разработанной технологии липазы М10-10 Г20х показал, что оптовая цена ферментного препарата находится ниже уровня мировых рыночных цен и составляет 14909,63 руб/кг.

Штамм дрожжей С. parapsilosis MIO депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-4055.

Подана заявка №2014138579 от 24.09.2014 на выдачу патента РФ «Штамм дрожжей Candida parapsilosis MIO - продуцент липазы».

В производственных условиях ООО «Компания Трасса» и ООО «Золотой голос» осуществлено изготовление сдобных хлебобулочных изделий и майонеза с заменой в рецептуре растительных масел и маргарина на липидные продукты на их основе, модифицированные с помощью липазы MIO-10 Г20х. Применение модифицированных липидных продуктов не оказало негативного влияния на форму, консистенцию, вкус и аромат продукции, при этом положительно сказалось на структуре изделия и его пищевой ценности. В производственных условиях ООО «Русский рыбный мир» осуществлены испытания по очистке сточных вод на локальных очистных сооружениях рыбоперерабатывающего предприятия с применением липазы MI0-I0 Г20х. Применение фермента оказало положительное действие на качество очистки стоков. Введение модифицированного узла реагентной обработки в схему очистки сточных вод предприятия позволило снизить содержание жировых загрязнений на 86,8%, БПКполн на 69,5%, ХПК на 61,3%. Результаты проведенной работы подтверждаются актом (приложение В).

Методология и методы исследований. Исследования выполнены по стандартным методикам с использованием современных микробиологических, биохимических и физико-химических методов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработанная схема скрининга микроорганизмов-продуцентов липазы;

- новый штамм дрожжей С. parapsilosis М10-10, обладающий липазной активностью; оптимизированный состав питательной среды и условия глубинного культивирования штамма С. parapsilosis М10-10 на основании анализа его физиолого-биохимических особенностей;

- обоснованные эффективные параметры выделения и очистки препарата липазы; биохимический состав ферментного препарата и условия его использования в пищевой промышленности;

эффективные условия гидролиза растительных масел с использованием нового ферментного препарата липазы.

Степень достоверности результатов. Все измерения проводились не менее чем в трех повторностях. Результаты экспериментальных исследований обработаны с помощью Microsoft Office Excel 2007. В диссертационной работе представлены средние результаты с достоверностью 95%.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Международной конференции «Биология -наука XXI века» (Москва, 2012 г.); Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» в рамках конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2014 г.); VII Международном научно-практическом симпозиуме «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» (Москва, 2014 г.), Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» в рамках конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2015 г.).

На международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» в рамках конкурса молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу результаты разработок отмечены дипломом и медалью.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 196 источников (в том числе 132 зарубежных), и 6 приложений. Работа изложена на 215 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 21 рисунок.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В литературном обзоре рассмотрено общее состояние проблемы создания производства липаз в мире. Приведены сведения о строении, свойствах липаз и перспективах их практического использования в пищевой, фармацевтической промышленности, биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве. Описаны механизм действия и реакции, катализируемые липазами, основные продуценты и влияние условий их культивирования на биосинтез этих ферментов.

Анализ данных литературы выявил проблемы, существующие в данной области, и позволил сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Микроорганизмы

В работе были использованы дрожжевые культуры из лабораторной коллекции кафедры «Биотехнология» ФГБОУ ВПО «МГУПП» (Candida interace, Candida maltosa, Candida tropicalis, Debaryomyces hansenii, Rhodolorula rubra, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces rouxii, Saccharomyces cerevisiae), штамм дрожжей Yarrowia lipolytica из Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов, а также микроорганизмы, выделенные в результате скрининга из природных источников обитания.

2.2 Источники выделения микроорганизмов, обладающих липазной активностью

Источниками для выделения дрожжей-продуцентов липаз служили образцы почвы, фруктов, масел, мясные и молочные продукты, содержащие повышенное количество липидов. С момента отбора материал хранили при температуре +4°С не более 1 месяца.

2.3 Методы

Определение массовой доли золы проводили согласно ГОСТ 13979.6-69. Определение массовой доли жира осуществляли согласно ГОСТ 13496.15-97. Определение влажности мякиша хлебобулочных изделий проводили согласно ГОСТ 21094-75. Определение пористости хлебобулочных изделий проводили согласно ГОСТ 5669-96. Определение кислотности готовой продукции проводили согласно ГОСТ 53595-2009 и ГОСТ 5670-96. Определение стойкости эмульсии готовой продукции осуществляли согласно ГОСТ 53595-2009. Определение кислотного числа растительных масел проводили согласно ГОСТ Р 52110-2003. Определение содержания белковых веществ проводили по методу Лоури. Определение количества клеток микроорганизмов осуществляли методом Коха (высевом на плотные питательные среды). КМАФАнМ определяли согласно ГОСТ 10444.15-94; дрожжей и плесневых грибов - по ГОСТ 28805-90.

Скрининг дрожжевых микроорганизмов, обладающих липазной активностью, осуществляли согласно схеме, разработанной в соответствии с особенностями роста культур. Идентификация культуры проводилась путем анализа секвенсов вариабельных участков 18S рРНК, а также ПЦР анализа с использованием видоспецифических праймеров.

Определение активности липазы (JIA) проводили по методу Ота, Ямада в модификации, протеолитической активности - по методу Ансона в модификации, амилолитической

активности - согласно ГОСТ 54330-2011, активности каталазы - с помощью спектрофотометрического метода Беера, Сизера.

Осаждение ферментов осуществляли органическими растворителями с последующим отделением осадка путем центрифугирования.

Определение молекулярной массы белковых фракций полученного ферментного препарата осуществляли методом гель-фильтрации.

Гидролиз масел проводили в течение 4 ч при 37°С, дозировка ферментного препарата - 0,1 % (61.2 ед/г липидов), соотношение маслогвода 1:1, рН 5,5. Определение жирнокислотного состава липидов проводили методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе Shimadzu GC 2010 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха РАН.

Все измерения проводили не менее, чем в трех повторностях. Результаты экспериментальных исследований были обработаны с помощью программ Statistica 6 и Microsoft Excel 2010. В работе представлены средние результаты с достоверностью 95%.

ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Скрининг дрожжевых микроорганизмов-продуцентов липаз

В ходе проведения диссертационной работы было получено более 110 изолятов дрожжевых культур. Выращивание культур на селективной среде (%: Na2HP04 - 0,6; КН2Р04 - 0,3; NaCl -0,05; NH4CI — 0,1; оливковое масло — 1; агар — 2) позволило установить, что 23 изолята способны усваивать оливковое масло в качестве единственного источника углерода. Для качественного определения наличия липолитической способности у дрожжевых микроорганизмов скрининг проводили на дифференцированной питательной среде (ПС) (%: Na2HP04 - 0,6; КН2Р04 - 0,3; NaCl - 0,05; NH4CI - 0,1; трибутирин - 0,3; агар - 2; в присутствии красителя метиловый красный). При использовании приведенного выше метода скрининга продуцентов липаз активные колонии отбирали по величине зон просветления вокруг них, и при переходе цвета плотной ПС от желтого к оранжевому и далее к красному.

В результате проведенного исследования было отобранно 12 изолятов. Глубинное культивирование дрожжей на жидкой ПС (%: дрожжевой экстракт - 2; глюкоза - 2; СаСОз -0,5; КН2Р04 - 0,05) показало, что наибольшей липазной активностью (ЛА) (7,5 ед/см3) обладает культуральная жидкость (ЮК) изолята M10 (дрожжевой штамм, выделенный из смыва сливочного масла), который был отобран для дальнейших исследований.

3.2 Исследование морфологических, культуральных и фнзиолого-биохнмнческнх признаков дрожжевого изолята М10

По результатам проведенных исследований морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков сделан вывод о принадлежности изучаемого изолята к роду Candida.

Идентификация штамма Candida MIO с помощью анализа 18S рРНК осуществлялась в лаборатории ФГУП ГосНИИГенетика. Анализ филогенетического родства, построенный с использованием штаммов близкородственных микроорганизмов, а также анализ участка ДНК, кодирующего 18S рРНК исследуемого штамма, позволили установить, что исследуемый штамм наиболее близок к виду Candida parapsilosis (99%).

3.3 Изучение путей повышения активности липазы С. parapsilosis М10

Биосинтез ферментов в значительной степени зависит от условий развития продуцента. Важными и определяющими условиями развития являются состав ПС, условия культивирования продуцентов (рН питательной среды, температура), физиологическое состояние инокулята и длительность культивирования.

Планирование эксперимента осуществлялось методом последовательных смещений, предусматривающим последовательное изучение влияния факторов среды и использование каждого полученного предыдущего уровня в качестве фона для изучения последующего.

3.3.1 Определение наиболее эффективного состава питательной среды для биосинтеза липазы С. parapsilosis MIO

При глубинном культивировании штамма-продуцента последовательно варьировали следующие факторы: виды и концентрации источников углерода, азота, фосфора, микроэлементов, ТВИН-80 в ПС.

Согласно полученным результатам, наиболее эффективным оказался следующий состав ПС (%): горчичное масло - 2; глюкоза - 0,5; дрожжевой экстракт - 2; соевая мука - 1; КН2Р04 -0,03; MgS04'7H20 - 0,02; СаСОз - 0,3; ТВИН-80 - 0,2 (рН 5,5).

Экспериментально показано, что внесение только ионов Mg2+ в состав ПС оказывало положительное влияние на активность липазы. В то время как ионы К+, Fe2+, Cu2+, Мо2+, N¡u снижали этот показатель.

Добавление в ПС в качестве индуктора ТВИН-80 способствовало росту дрожжей, путем биоинтенсификации процессов дыхания и транспорта питательных веществ, и биосинтезу липазы. В процессе роста штамма использовались три вида углеродсодержащего субстрата, которые являлись основными для клеток источниками энергии. На раннем этапе роста в лаг-

фазе и до середины логарифмической фазы роста в качестве субстрата использовали глюкозу, которая является приоритетным субстратом для клеток. Культура при этом росла активно, однако глюкоза подавляла индукцию синтеза фермента. Вся энергия в клетке тратилась на прирост биомассы, синтез целевого белка блокировался. После утилизации глюкозы в среде культура начинала использование липидного компонента - горчичного масла. Культура на ПС росла активно, и при этом индукция целевого фермента не ингибировалась. К окончанию логарифмической фазы роста вносился ТВИН-80, который является одновременно и индуктором, и субстратом. Культура при этом замедлила рост, и начала активно осуществлять синтез липазы. В этой связи было изучено не только влияние различных концентраций ТВИН-80 на рост дрожжей и синтез фермента, но и оптимальное время внесения индуктора в состав ферментационной среды. Глубинное культивирование штамма-продуцента липазы проводили с внесением ТВИН-80 через 0,8,12,16,18,20 и 24 ч после начала культивирования. Внесение индуктора в состав ПС в количестве 0,2% через 12 ч после начала ферментации привело к увеличению уровня накопления липазы относительно контроля на 23%.

Проведена оптимизации состава ПС с использованием математических методов планирования экспериментов. Для построения математической модели планирования эксперимента был реализован полный факторный эксперимент (ПФЭ 23), в котором варьировали три параметра: концентрации ТВИН - 80, дрожжевого экстракта и горчичного масла. Эффективность ПС оценивали по уровню накопления липазы. В результате проведенной оптимизации состава ПС (%: горчичное масло - 2,6; глюкоза - 0,5; дрожжевой экстракт - 1,8; соевая мука - 1; КН2Р04 - 0,03; MgS04-7H20 - 0,02; СаСОз - 0,3; ТВИН-80 - 0,42 через 12 ч после начала культивирования) удалось увеличить JIA С. parapsilosis М10 до 204 ед/см3 КЖ.

3.3.2 Проведение с помощью УФ-облучения индуцированного мутагенеза дрожжей C.parapsilosis М10 с целью увеличения их биосинтетичеекон способности

С целью увеличения биосинтетической способности полученных в результате скрининга микроорганизмов используют различные методы индуцированного мутагенеза. Ультрафиолетовое (УФ) излучение является весьма эффективным и широко применяемым физическим мутагеном, способным воздействовать на ДНК, приводя к изменениям в метаболизме.

УФ-облучения проводили в течение 120 мин с интервалом отбора 10 мин (мощность УФ-лампы 30 Вт, расстояние от УФ-лампы до объекта исследования 1 м. Далее культуры инкубировались в течение 48 ч при 30±2°С и затем использовались в качестве посевного материала при глубинном культивировании. В результате проведенного УФ-индуцированного

мутагенеза исследуемых дрожжей удалось получить мутант С. рагаряНоз/з М10-10, ЛА в фугате КЖ которого составила 235 ед/см3.

3.3.3 Влияние количества и возраста вносимого посевного материала на уровень липазной активности культуры С. рагарзИоз/э М10-10, выращенной в условиях глубинной ферментации

Для определения требуемого возраста посевного материала (ПМ) культуру выращивали в течение 12; 24; 36; 48; 60; 72 ч в колбах на качалочной установке при 30°С. Готовым ПМ засевали колбы с ферментационной средой (объем посевной дозы варьировали в диапазоне от 1 до 6% от объема ферментационной среды). По истечении времени культивирования определяли ЛА в фильтрате КЖ (рис. 1).

В результате было установлено, что максимум ЛА (242 ед/см3) соответствует посевной дозе — 6%, возрасту ПМ - 72 ч. Однако выращивание ПМ свыше 48 ч дало незначительный прирост ЛА (на 3%). Увеличение дозировки ПМ свыше 5% также не дал значительного эффекта. Поэтому в дальнейшем получали двухсуточный посевной материал (водная суспензия дрожжей, содержащая 5 • 106 кл/см3) и производили засев в количестве 5% от объема питательной среды. В этом случае достигалась ЛА 235 ед/см3.

3.3.4 Влияние условий культивирования С. рагаряИояЫ М10-10 на накопление липазной активности в культуралыюй жидкости

Экспериментально было установлено, что активно липаза начинает накапливаться в КЖ после 24ч культивирования. Рост ЛА в КЖ значительно замедляется после 48 ч культивирования (235 ед/см3).

Возраст ПМ, ч ~ ПМ, %

Рисунок I - Зависимость J1A в фильтрате КЖ С. parapsilosis M10-J0 от возраста и дозы посевного материала

Длительность культивирования, ч

В промежутке времени

культивирования 48 - 60 ч JIA остается примерно на одном уровне, в связи с чем культивирование свыше 48 ч можно считать нецелесообразным (рис.2).

При исследовании оптимальных температурных режимов ферментации культуры и рН исходной ПС (рис.3)

было установлено, ЧТО максимальную Рисунок 2 - Динамика изменения ЛА в КЖ в зависимости от

длительности культивирования С. parapsilosis Ml 0-10

JIA штамм проявляет в диапазоне рН 4-

ЛА, ед/см3 7 и ПрИ температуре 30-40°С. При более

■ 200-250

высоких или низких значениях рН питательной среды она резко уменьшается. Аналогичная ситуация наблюдается при культивировании штамма при температурах, выходящих за рамки оптимальных. Таким образом, культивирование штамма Candida parapsilosis Ml0-10 следует проводить при температуре 30-40 °С и рН питательной среды 4-7. Оптимальными значениями при этом являются температура 30°С и рН 5,5-6,0.

Температура

культивиро

вания, (

рН питательной среды

Рисунок 3 - Влияние рН исходной питательной среды и температуры культивирования на биосинтез липазы С. /югар5//б№И М10-10

3.4 Осаждение липазы Candida parapsilosis М10-10 из культуральной жидкости

Экспериментально установлено, что наиболее эффективно осаждение липаз из фильтрата КЖ Candida parapsilosis Ml0-10 происходит этанолом (70%) в соотношении осадитель:КЖ 2,5:1 и рН 5,0, при этом выход ферментного препарата (ФП) с влажностью 10 % составил 9,8 г/дм3. Значение остаточной активности высушенного ФП составило =17600 ед/г.

3.5 Стабилизация и активация ферментного препарата

Высокая каталитическая активность и специфичность действия любого фермента обусловлена уникальной структурой его активного центра. Поэтому для проявления функций

ферментов первостепенное значение имеет сохранение целостности активного центра. Согласно литературным данным в качестве стабилизирующих агентов для липолитических ферментных препаратов используют соли Са2+, М§2+ и иногда А13+.

Поэтому было изучено влияние хлоридов кальция, магния и алюминия на активность ФП

липазы. Концентрации исследуемых хлоридов варьировали от 0 до 0,09%. Данные

представлены в процентном отношении к контролю (ФП до стабилизации). Его

ферментативная активность составляет 17600 ед/г и соответствует нулевому уровню (рис. 4).

Экспериментально было

установлено, что оптимальной

концентрацией 1У^С12 является 0,05

%, при которой ЛА ФП

увеличивалась на 17%, для А1С13 -

0,07 %, при которой достигалось

увеличение активности на 8% по

сравнению с контролем. По

результатам исследования Рисунок 4 - Подбор стабилизирующего агента и его оптимальной

концентрации для ферментного препарата липазы С. parapsilosis оптимальным стабилизатором М10-10

является соль СаС12 использование которой в концентрации 0,03 % приводит к увеличению ЛА на 32% с 17600 ед/г до 23200 ед/г, что существенно улучшает выходные характеристики препарата.

3.6 Исследование температурного и рН - оптимума действия ферментного препарата

Исследования оптимальных условий действия фермента (рис. 5,6) показали, что оптимальная температура действия ФП до и после стабилизации находится в интервале 30-40°С. Снижении температуры до 30'С приводит к снижению ЛА стабилизированного ФП на 9,5 %, а до 20"С уже на 57%. При значениях I > 40'С стабилизированный ФП также теряет свою активность в условиях опыта. Повышение температуры до 50'С приводит к потере активности на 29%, дальнейшее повышение температуры до 60'С снижает активность липазы еще на 54%. Тем не менее, ЛА стабилизированного ФП в диапазоне температур 30-50 "С выше, чем максимальная ЛА ФП до стабилизации.

Концентрация стабилизирующего агента, %

Температура, °С

• ФП до стабилизации ■ ФП после стабилизации

Рисунок 5 - Влияние температуры на активность ФП липазы

рН

• ФП до стабилизации ■ ФП после стабилизации

Рисунок 6 - Влияние рН на активность ФП липазы

Оптимальное значение рН для стабилизированного ФП находится в промежутке 5,0- 6,0. Увеличение рН до 7,0 приводит к снижению активности стабилизированного ФП на 8%, а при отклонении в более кислую сторону до рН 4,0 активность снижается на 17%, однако несмотря на это ДА стабилизированного ФП выше, чем максимальная ЛА ФП до стабилизации.

Оптимальная температура действия ФП 37°С, рН 5,5.

3.7 Очистка липазы С. рагарьИояи М10-10

На основании результатов исследований, представленных в разделе 3.3, разработана принципиальная технологическая блок-схема процессов получения ФП липазы М10-10 Г20х (рис.7).

В ОАО «Биохиммаш» была проведена очистка КЖ, полученной в результате выращивания С. рагар$Ио$15 М10-10 в лабораторном ферментере общим объемом 16 дм3, методом ультрафильтрации. Выход сухого ФП составил 7,92 г/дм3, активность липазы в нем - 30630 ед/г.

Прием и храиемм сырь*

| Биологическая проберка сырья

Лопрои .3001 ГВР*

| °з | Прием и крокет» ивтериалой \ |пригошр6»еиие »«ульет

и пенсгосшм*« I-

| ?; | СтерилшоцйТ

пемогастмл*

НшУ , | 1 Грч8оя очистка боздцка

Осанка Ьв1Йухе

Тонкой очистка бснЭцха

Пойготобяа смры

Подготовка п#могосит§я«

| ПоД<о»о9«о, с»»рияц>дии« бмдукд

*) «п ¡ПриготоОленцЕ растОора кислоты [

IШ» I „ ■ >

Приготовление ростбора цмочи I

ПобгвяюОко оЗорожхй в»¿и

Лригожовлеиие раягАороб регулиробвму» рН

43

Подготовив «ло&хаг»«*>а

ДЦ

Приготовление с»с 5 и ли »скора

-И

ПрцгочюСлеиие маполнитем

Пов«жо6*а оЗорудрваии* к ра5о»е ;

хранение и поддержание

культурм продуцента

к поюции ТПИ.ТГН2, *ТП], ТПН, ТГТТ5.

тпть. тпи.тпитгт

птицои ТП П

От 8Р 1

ш

Трщ—ое.чия ямм*

ктеоитпаии« питательной со?Зы Г

и 11 ОглекЗечие и эв'»в

ПЦАвМ^аОи

При*о*ов*е*ие пипмзюельмоо среЭм

ь

*1 т?; | Скерилцюци» ередм г

ГПП-1

Т?3|01М»9»«ие и ксеО рабочей «^«»гурмг

Ш.

Приготовление ги»пот>»л»»ои среды

ГГТП-

Пя ?|0»*д»|

(■»ерилииии« ги»а»»»иои ср«Дм

9е>^о и эосев ровочец \

От ВР 9

ВирдщЛсмие посевного материала В лаборатории

Неисполыобаимыи посевной _иср>ер11сл но ОЬО 1

г«—, «е 1

), 6о«о I т/ ора &оохл

вирошибаице посевного «■атериола б инмумяом

1

• «з 060 7

Л

] я | ПроцзОобстОенноя фериентдцц«

■ороякя* бсДа ив ОЬО 7 0* ВР 9 и Ц [ Ряд» »»О* ■ ул»и>црал>и0и кидвОСЛО ротЛ** Ым" 060 1

чп

X

Чльтрафцдьтраии*

060 1

Т

В ВР ? Н < 1 Стерилизуема» филыпроиия ^»»».»^'»Уду^а лэ 1 )юр рд ВР Т »

ХлоЙооген* о* Ва 6 г Ст ер ч

к о* р* а .

>9 * I

Наг№ми»е*» от ВР В

_£а_££.

? 3

СцЗлинаииониая сц««а

19 | Сюндссяимци» пре*хорс»о

X

Чпоково-шыи иоверио/* |Д|

Оя В» < "' I 1 *м«сЭ«а. нар«ироа«о, ожгружо

Готовый продукт но склад

Рисунок 7 — Технологическая блок-схема процессов получения ферментного препарата липазы М10-10 Г20х

3.7.1 Изучение биохимического состава ферментного препарата липаза М10-10 Г20х

В ходе проведения работы был определен биохимический состав полученного ФП липазы М10-10Г20х (табл.1).

Таблица 1 - Биохимический состав ФП липаза М10-10 Г20х

Наименование % % от СВ

показателя

Влага 8,0 -

Протеины 81,7 88,8

Углеводы 7,4 8,0

Липиды 0,8 0,9

Зола 2,1 2,3

Определение фракционного состава белков полученного ФП липазы М10-10 Г20х проводили методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом Г-100. Определение суммарного количества белка во фракциях, соответствующих каждому пику, проводили по методу Лоури. Результаты хроматографического разделения приведены в табл. 2.

Таблица 2 - Фракционный состав ФП липаза Ml0-10 Г20х

№ Молекулярная масса белка во фракции, Да Доля фракции, %

1 60015 85,72

2 26085 8,42

3 9226 5,86

Исходя из представленных данных, ФП включает в себя три вещества белковой природы, молекулярные массы которых равны 60, 26 и 9 кДа. Экспериментально было установлено, что ЛА обладает только белок с молекулярной массой 60 кДа.

3.7.2 Исследование термостабильности и рН-стабильности ферментного препарата липазы М10-10 Г20х

Для определения рН-стабильности ФП липаза Ml0-10 Г20х готовили фосфатные буферные смеси с различными значениями рН от 3 до 10. 0,1%-ный раствор липазы М10-10 Г20х выдерживали в буфере 3 ч после чего определяли ЛА. С целью выяснения зон термостабильности препарата, 0,1%-ный раствор липазы Ml0-10 Г20х выдерживали в течение 180 мин (с интервалом отбора проб 10 мин) при температурах 30,40,50,60 и 70 °С, затем определяли ЛА.

Полученные данные показали, что при температурах 30-40'С липаза Ml0-10 Г20х сохраняла свою активность в течение 180 мин. Увеличение температуры выдерживания до 50'С приводило к снижению активности через 30 мин на 22%, через 60 мин - на 30%, 120 мин - 47% и 180 мин - на 56%. При значениях температуры 60 и 70'С препарат терял свою активность через 30 мин на 70 и 86 % соответственно, через 60 мин остаточное значение ферментативной активности составило лишь 11 и 2% от первоначальной, через 120 мин наступила полная инактивация фермента.

В диапазоне рН от 4 до 7 при трехчасовой экспозиции наблюдалось лишь небольшое снижение JIA и ферментный раствор оказался достаточно стабильным. При рН 8,0 наблюдалось снижение активности на 51%, при рН 9,0 на 76%, а при рН 10,0 на 88%. Отклонение рН в более кислую сторону до 3,0 приводило к снижению активности на 60%.

3.8 Исследование эффективности ферментативной трансформации растительных масел препаратом липазы М10-10Г20х

3.8.1 Подбор наиболее эффективных условий гидролиза растительных масел

Для определения наиболее эффективных условий проведения гидролиза растительных масел под действием ферментного препарата липаза Ml0-10 Г20х изучали влияние температуры, количества вносимого ФП, соотношения масло:вода и длительности реакции.

Планирование эксперимента осуществлялось методом последовательных смещений, предусматривающим последовательное изучение факторов среды и использование каждого полученного предыдущего уровня в качестве фона для изучения последующего. Эффективность гидролиза исследовали при следующих параметрах: соотношение оливковое масло:вода- 1,0:0,5, 1,0:1,0, 1,0:1,5, 1,0:2,0; количество вносимого фермента - 0,05% (30,6 ед/г липидов), 0,1% (61,2 ед/г липидов), 0,15% (91,8 ед/г липидов), 0,2% (122,4 ед/г липидов); температура - 30, 35, 37, 40, 45 и 50°С; длительность - 2, 3, 4, 5, 6 ч. Выводы об эффективности процесса составлены на основе изменения значения кислотных чисел (КЧ) липидного продукта на основе оливкового масла. Исходные параметры проведения пиролиза - количество фермента 0,1 % (61,2 ед/г липидов), температура 37°С. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Таблица 3 - Влияние параметров проведения ферментолиза оливкового масла на выход ЖК

Параметры Выход ЖК, КЧ (мг КОН/г жира)

2 часа 3 часа 4 часа 5 часов 6 часов

Соотношение масло:вода

1,0:0,5 8,5 16,8 37,9 46,2 46,7

1,0:1,0 13,8 25,8 54,8 53,5 53,3

1,0:1,5 20,1 28,5 42,9 46,4 47,3

1,0:2,0 9,8 19,6 47,3 47,3 45,9

Количество фермента, % (ед/г липидов)

0,05(30,6) 4,1 15,8 17,3 20,6 25,7

0,10(61,2) 13,8 25,8 54,8 53,5 53,3

0,15(91,8) 15,6 21,8 48,3 50,5 47,9

0,20(122,4) 12,9 22,9 51,4 50,4 51,4

Температура, °С

30 5,3 14,8 38,9 42,5 45,1

35 13,5 22,3 50,2 53,7 53,3

37 13,8 25,8 63,5 53,5 53,3

40 12,2 20,8 52,3 51,5 52,8

45 10,1 13,7 25,1 24,9 24,3

50 3,7 4,8 7,9 7,8 6,9

В результате эксперимента были определены наиболее эффективные условия проведения гидролиза оливкового масла с применением в качестве катализатора ферментного препарата липазы М10-10 Г20х в системе масло:вода без эмульгатора: соотношение масло:вода — 1:1, количество фермента - 0,1 % (61,2 ед/г липидов), температура - 37°С, рН 5,5, длительность гидролиза -4 ч.

3.8.2 Исследование глубины ферментолиза растительных масел препаратом липазы М10-ШГ20х

При изучении глубины ферментативного гидролиза исследования проводили с маслами, наиболее часто применяемыми в пищевой промышленности. Гидролиз проводили с катализатором ФП липазы М10-10 Г20х при оптимальных условиях, определенных в п. 3.7.1.

Были рассмотрены 10 образцов масел: подсолнечное нерафинированное и рафинированное, оливковое, льняное, горчичное, кокосовое, арахисовое, кунжутное, кукурузное и репейное. Результаты исследования КЧ исходных масел и липидных продуктов этих масел после ферментолиза представлены в табл. 4.

Таблица 4 - Значение КЧ растительных масел и липидных продуктов на их основе

Вид масла КЧ (мг КОНЛ-жира) исходного масла КЧ (мг КОН/г жира) липидного продукта Вид масла КЧ (мг КОН/г жира) исходного масла КЧ (мг КОН/г жира) липидного продукта

Подсолнечное рафинированное 1,0 51,5 Кокосовое 1,7 81,0

Подсолнечное нерафинированное 1,7 70,9 Арахисовое 1,4 51,9

Оливковое 0,7 63,5 Кунжутное 1,5 48,9

Льняное 1,9 56,6 Кукурузное 0,6 44,9

Горчичное 1,1 63,1 Репейное 1,8 52,8

Наиболее глубоко ферментативный гидролиз прошел в подсолнечном нерафинированном, оливковом, льняном, горчичном и кокосовом маслах. Именно они были отобраны для проведения дальнейших исследований.

3.83 Оценка жирнокислотного состава липидных продуктов

Питание современного человека характеризуется недостатком многих питательных веществ - макро- и микронутриентов, и избыточным потреблением простых углеводов, животных жиров. Среди дефицитных микроингредиентов, следует отметить витамины, макро-и микроэлементы, антиоксиданты и полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК). Важнейшими ПНЖК являются 2 жирные кислоты - линолевая (омега-6) и линоленовая (омега-3), которые не синтезируются организмом, а их отсутствие в пище вызывает симптомы недостаточности ЖК.

Достижения фундаментальных и прикладных наук позволили создать технологические решения для производства нового поколения жировых продуктов, отвечающих требованиям нутрициологии. Современные методы ферментативной модификации масел и жиров с использованием отечественного и тропического сырья позволяют получать жировые продукты целевого назначения с заданным составом и свойствами, не содержащие транс-изомеры ЖК, для различных отраслей пищевой промышленности.

Для выяснения жирнокислотной специфичности фермента липазы М10-10 Г20х и возможности получения липидных продуктов, обогащенных ПНЖК, был исследован гидролиз растительных масел наиболее часто используемых в пищевом производстве. Сухой ферментный препарат липазы М10-10 Г20х в концентрации 0,1 % (61,2 ед/г липидов) вносили в эмульсию масло - вода (1:1) при постоянном перемешивании. Ферментолиз вели в течение 4 ч при температуре 37'С. Максимальный выход свободных ЖК через 4 ч составил у оливкового

19

масла 32,74%, подсолнечного — 36,03%, горчичного — 32,52% льняного — 29,17%, кокосового -41,76% от общего содержания кислот в маслах.

Для получения липидных продуктов с улучшенным жирнокислотным составом отделение свободных ЖК проводили методом холодной рафинации, а полученные липидные продукты анализировали методом ГЖХ на базе ФГБУ Института биохимии им, А.Н.Баха РАН. Результаты испытаний отображены в табл.5, 6.

Таблица 5 — Жирнокислотный состав масел и липидных продуктов на их основе,

полученных в результате гидролиза с катализатором липазой М10-10 Г20х

Наименование ЖК Оливковое Подсолнечное Горчичное Льняное Кокосовое

исходное Модифицированное исходное Модифицированное исходное Модифицированное исходное Модифицированное исходное Модифицированное

Массовая доля ЖК (%)

Каприновая Сто - - - - - - - - 7,29 2,25

Лауриновая С120 ■ - - - 1,27 - - - 45,26 35,17

Мирисгиновая С|4:0 - - - - - - - - 21,17 18,28

Пальмитиновая С160 15,50 6,75 7,65 1,31 9,36 1,36 7,07 2,14 12,34 10,73

Стеариновая Сию 4,20 1,58 3,99 2,74 3,05 1,78 5,83 3,72 3,00 2,76

Петроселиновая С181 7,14 9,45 3,23 2,92 3,76 5,69 2,70 2,20 - -

Олеиновая Сц-1 61,26 64,69 26,26 27,61 34,45 38,28 26,21 20,14 9,30 19,91

Линолевая С] 8 2 6,93 7,87 58,51 65,42 23,96 27,87 13,90 15,75 1,64 10,90

Линоленовая С] 8 з 4,45 9,66 - - 13,30 19,01 44,16 56,05 - -

Арахиновая С200 0,26 0,36 - 0,58 - 0,13 - - -

Гондоиновая С201 0,26 - - - 5,50 2,80 - - - -

Эруковая С221 ■ - 4,77 3,21 - - - -

Таблица 6 - Содержание жировых компонентов в растительных маслах и липидных продуктах

на их основе

оливковое подсолнечное горчичное льняное кокосовое

и = о Н ° и £ и I 12 и я и я § и £ о | § и 1 8

наименование 3 о X и Я 1Г 5 5 Й о 2 2 г ч о X и К "М § 1 Ч о X и г § 8 2 а Б 4 о X и 5 "гг* Ш * 8 о 2 2 ь Е 4 О X и 5 1-1 § 1 2

Массовая доля ЖК (%)

насыщенные ЖК 19,96 8,33 12,00 4,05 14,26 3,14 13,03 5,86 89,06 60,73

ПНЖК 11,38 17,53 58,51 65,42 37,26 58,06 58,06 71,80 1,64 19,36

МНЖК 68,40 74,14 29,49 30,53 48,48 49,98 28,91 22,34 9,30 19,91

ПНЖК омега-6 6,93 7,87 58,51 65,42 23,96 27,87 13,90 15,75 1,64 19,36

ПНЖК омега-3 4,45 9,66 - - 13,30 19,01 44,16 56,05 - -

Анализ полученных данных показывает, что ФП липазы М10-10 Г20х преимущественно способствует отделению в ацилглицеридах остатков насыщенных ЖК. Отделив эти кислоты от модифицированных растительных масел, становится возможным обогатить полученные продукты ПНЖК.

Гидролиз с участием липазы М10-10 Г20х и последующая рафинация оливкового, подсолнечного, горчичного, льняного и кокосового масел позволили снизить относительное содержание насыщенных ЖК на 58, 66, 78, 55 и 32% соответственно, а относительное содержание незаменимых ПНЖК увеличить на 54, 12, 26, 24% и в 12 раз соответственно. Исходя из представленных данных, можно сделать вывод о специфичности фермента к остаткам насыщенных ЖК. Таким образом, модификация растительных масел ФП липаза М10-10 Г20х в системе масло/вода в отсутствии эмульгатора позволяет получить липидные продукты обогащенные ценными омега-3 и омега-6 ПНЖК.

3.9 Апробация полученного ферментного препарата липаза М10-10 Г20х в пищевой промышленности

В производственных условиях ООО «Компания Трасса» произведено изготовление сдобных хлебобулочных изделий с заменой в рецептуре маргарина на модифицированный липидный продукт на основе маргарина, с повышенной пищевой ценностью, а также в производственных условиях ООО «Золотой голос» изготовлены образцы соуса «Майонез» с введением в рецептуру модифицированных с помощью ФП липаза М10-10 Г20х липидных продуктов на основе растительных масел.

Проведенные испытания органолептических, микробиологических и физико-химических показателей изготовленных сдобных хлебобулочных изделий показали соответствие готовой

21

продукции ГОСТ 24557-89 и СанПиН 2.3.2.1078-01. Замена маргарина в составе сдобных хлебобулочных изделий на модифицированный липидный продукт положительно сказалась на структуре изделия и его пищевой ценности.

Испытания соуса «Майонез» показали, что полученный продукт соответствует требованиям ГОСТ Р 53590-2009 и СанПиН 2.3.2.1078-01. Использование липидных гидролизатов оливкового и подсолнечного масел с известным жирнокислотным составом, позволило обогатить соус ПНЖК омега-6 на 12%, а ПНЖК омега-3 более чем в 2 раза и улучшить его вкусовые характеристики.

Исходя из представленных результатов, можно сделать вывод о возможности замены растительных масел на модифицированные липидные продукты на их основе без потери потребительских качеств готовых изделий. Результаты подтверждены актами испытаний (приложение В).

В производственных условиях ООО «Русский рыбный мир» осуществлены испытания по очистке сточных вод на локальных очистных сооружениях рыбоперерабатывающего предприятия с применением липазы М10-10 Г20х. Применение фермента оказало положительное действие на качество очистки стоков. Введение модифицированного узла реагентной обработки в схему очистки сточных вод предприятия позволило снизить содержание жировых загрязнений на 86,8%, БПКпол„ на 69,5%, ХПК на 61,3%. Результаты проведенной работы подтверждаются актом (приложение В)

ВЫВОДЫ

1 Проведенный скрининг микроорганизмов-продуцентов липазы из различных источников позволил получить дрожжевой изолят, обладающий липазной активностью (7,5 ед/см3).

2 Изучение культуральных, морфологических, физиолого-биохимических признаков и анализ филогенетического родства показали, что штамм относится к роду Candida виду parapsilosis с точностью 99%.

3 В результате проведенного подбора оптимального состава ПС для культивирования штамма-продуцента и УФ-индуцированного мутагенеза JIA ферментов КЖ была увеличена более чем в 30 раз с 7,5 ед/см3 до 235 ед/см3.

4 Подобраны оптимальные параметры культивирования дрожжей. Максимум активности в КЖ приходится на 48 ч роста при рН 5,5-6,0 и температуре культивирования 30°С. Возраст посевного материала 48 ч, посевная доза составляет 5% от объема ПС.

5 Подобраны наиболее эффективные условия осаждения липазы этанолом: соотношение объемов этанола (70%): культуральная жидкость 2,5:1; рН культуральной жидкости 5,0. При этих условиях был получени ФП со средней активностью липазы 17600 ед/г.

6 Подобраны оптимальные условия проведения ферментативной трансформации масел: концентрация ферментного препарата - 0,1 % (61,2 ед/г липидов), температура - 37°С, соотношение масло:вода - 1:1, рН 5,5, длительность проведения реакции - 4ч.

7 Определен биохимический состав ферментного препарата липаза М10-10 Г20х. Выяснено, что ферментный препарат содержит в себе 3 основные фракции белков, которые составляют 81,7% от общей массы препарата. Их молекулярные массы равны 60, 26 и 9 кДа. JIA обладает только белок с молекулярной массой 60 кДа. Доля активного белка в ФП липаза М10-10 Г20х составляет 85,72%.

8 В результате анализа жирнокислотного состава нативных масел и модифицированных липидных продуктов на их основе было установлено, что полученный ФП липазы М10-10 Г20х в большей степени способствует гидролизу ацилглицеридов, содержащих насыщенные ЖК.

9 Произведено изготовление сдобных хлебобулочных изделий с заменой в рецептуре маргарина на модифицированный с помощью ФП липаза М10-10 Г20х липидный продукт на основе маргарина. Такая замена положительно сказалась на структуре изделия и его пищевой ценности. Осуществлено изготовление майонеза с заменой в рецептуре подсолнечного и оливкового масел на модифицированные липидные продукты на их основе. Введение в рецептуру соуса модифицированных масел позволило улучшить вкусовые характеристики готового продукта, а так же обогатить продукт ПНЖК омега-6 на 12%, а ПНЖК омега-3 более чем в 2 раза.

10 Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии липазы М10-10 Г20х, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится ниже уровня мировых рыночных цен и составляет 14909,63 руб/кг (Приложение Д).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Гаскарова Е.Ф. Скрининг нового дрожжевого штамма - продуцента липазы / Е.Ф. Гаскарова, JI.A. Иванова, Г.Л. Филатова, Ю.А. Краевская // Естественные и технические науки. - 2014. - №2 (70). - с. 257 - 259.

2. Гаскарова Е.Ф. Оптимизация состава питательной среды при культивировании дрожжей Candida parapsilosis MIO / Е.Ф. Гаскарова, Л.А. Иванова, С.С. Строева, Г.Л. Филатова // Естественные и технические науки. — 2014. - №2 (70). — с. 255 — 256.

3. Гаскарова Е.Ф. Изучение характеристики нового ферментного препарата липазы М10-10 // Е.Ф. Гаскарова, Л.А. Иванова, С.С. Строева, Н.В. Фадякина // Естественные и технические науки. -2014. -№11-12 (78). - с. 340-343.

4. Гаскарова Е.Ф. Штамм дрожжей Candida parapsilosis MIO - продуцент липазы / Е.Ф. Гаскарова, Л.А. Иванова//Заявка на патент № 2014138579 от 24.09.2014 г.

Статьи и материалы конференций:

5. Гаскарова Е.Ф. Применение методов индуцированного мутагенеза с целью увеличения биосинтетической способности нативного штамма Candida parapsilosis MIO / Е.Ф. Гаскарова, Л.А. Иванова, Ю.А. Краевская // Сборник материалов XI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» / Отв.ред. к.т.н. A.B. Лаврова, к.п.н., доц. Т.А. Стахи. - М.: ИК МГУПП, 2013. - с. 29 - 30.

6. Гаскарова Е.Ф. Новый дрожжевой продуцент липазы / Е.Ф. Гаскарова, Л.А. Иванова, Ю.А. Краевская // Сборник материалов Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2014. - с. 368 - 369.

7. Гаскарова Е.Ф. Дрожжи Candida parapsilosis MIO - новый продуцент липазы / Е.Ф. Гаскарова, Л.А. Иванова // Сборник 7-го Международного научно-практического симпозиума «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» - 2014. - с.44-47.

8. Гаскарова Е.Ф. Оценка специфичности действия ферментного препарата липаза М10-10 Г20х / Е.Ф. Гаскарова, Л.А. Иванова, С.С. Строева, Н.В. Фадякина // Сборник материалов Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2015. - с. 415 -417.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В АВТОРЕФЕРАТЕ

ГЖХ - газожидкостная хромотография;

ЖК - жирная кислота;

КЖ - культуральная жидкость;

КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных

микроорганизмов;

КЧ - кислотное число;

ЛА - липазная активность;

ПМ - посевной материал;

ПНЖК - полиненасыщенная жирная кислота;

ПС - питательная среда;

ПФЭ - полный факторный эксперимент;

СВ — сухие вещества;

УФ - ультрафиолетовое;

ФП - ферментный препарат.

Автор выражает благодарность своему научному руководителю д.т.н., профессору Ивановой Л.А. за руководство при написании работы, внимание и поддержку, а также заведующей кафедрой «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» ФГБОУ ВПО «МГУПП» д.б.н., профессору Бутовой С.Н. и всем сотрудникам кафедры «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» ФГБОУ ВПО «МГУПП».

Формат 60x90/16. Заказ 1295. Тираж 120 экз. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96