автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка биотехнологии ферментного препарата липазы

Р Г D о, О 2 ИЮН

на правах рукописи

КУЗЬМИНОЙА ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ íEPMEHTHOrO ПРЕПАРАТА ЛИПАЗЦ

Специальность 05.1Р.04 - технология мясных, молочных и рыбных продуктов

ABTOPEfEPñ? диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Ставрополь 1947

Работа выполнена в Ставропольском государственном техническом университете

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Кунижев Станислав Мухадинович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Е^ыкалов A.D.,

доктор технических наук, профессор Нестеренко П.Г.

Ведущая организация - Комбинат молочный "Ставропольский"

диссертационного Совета К 064.11.07 Ставропольского государственного технического университета по адресу: 355038, г. Ставрополь, пр.Кулакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного технического университета

Автореферат разослан '¿1" Ц 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного

Совета, к.т.н. Евдокимов И.А.

Защита состоится

часов на заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В клинической практике постоянно существует необходимость питания детой (и взрослых) с нарушениями липид-ного обмена. Кроме того, заменители грудного молока в общепринятом порядке должны содержать липолнтические ферменты. В настоящее время в России такие продукты не выпускаются в связи с жесткими требованиями к вводимым лилаэным препаратам. В связи с изложенным разработка биотехнологии получения препарата .липазы из молочного сырья является актуальной, а ее решение имеет большое научное и практическое значение.

ЦеАЬ работы. Исследовать состав н свойства эстераз коровьего молока и разработать технологию получения ферментного препарата липолитического действия для специфического гидролиза липидов пищи у людей с нарушением функции желудочно-кишечного тракта, особенно важно это для детей раннего (младенческого) возраста и пожилых людей. Задачи:

- определить источник и локализации эстераз, специфично гидроли-^ зуищнх лшшдц молока и други;: липидов и вводимых в продукты питания детей и.людей пожйлого возраста;

- уточнить состав и строение фермента (липазы);

- найти способы выделения и очистки фернета (липазы);

- выявить.особенности кинетики ферментативного действия липазы в зависимости от внешних условий;

оценить активность липазы п зависимости от чистоты препарата, содержания в нем естественник принеезй и вводимых добавок (активаторов );

- установить механизмы и пути регуляции активности липазы;

- провестц моделирование действия липазы в иммобилизованном состоянии с учетом сохранения активности рпепарата во времени;

- разработать технолог! ческий регламент получения ферментного препарата липолитического действия;

- предложить аппаратурное оформление процесса получения фермент-

нрго препарата;

-рассчитать экономическую эффективность технологии;

провести апробацию препарата (пути и методы использования фер-метного препарата).

Научная нозизна.

В'результате проведенных исследований впервые предложена модель локализации фермента липазы в клетке лактирукщей молочной железы и механизм её активации в желудочно-кишечном тракте.

На основе полученных закономерностей разработана биотехнология препаратов мембранной и плазменной липазы. Новизна разработанной биотехнологии подтьлрждена патентом РФ Н 2065273 на изобретение "Способ получения белкового продукта с липолитичес-кой' активностью".

Практическая ценность.

Проведено аппаратурное оформление процесса получения препаратов липазы-, составлена нормативно-техническая документация, регламент производства, утвержденная Н'П( СтГГУ.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены "а научных конференциях (Ставропольская государственная сельскохозяйственная академия, 1995, Ставропольский государственный технический университет, 1995), на 4 Международном симпозиуме (Москва-Видное, 1995), на Второй Всероссийской научно-теоретической конференции (г.Углич, 1996) н Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии" ( Ставрополь, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, получен один патент па изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 1 главы обзора литературы, 4 глав собственных исследований, выводов, списка литературы, включающего 112 работ отечественных и бб работ зарубежных авторов. Работа изложена на Щ0 страницах машинописи, иллюстрирована 21 таблицами и 22 рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась в лаборатории Ставропольского государственного технического университета.

Опытные выработки проводились на базе СтГТУ в лаборатории "Биохимия и биотехнология" кафедры технологии молока и полочных продуктов.

Объектом исследований служили: пахта (непастеризованная) и обезжиренное молока (непастеризованное), ферментный препарат липазы.

Эксперименты проводились поэтапно в соответствии со схемой приведенной на рис.1.

В процессе выполнения работы использовались следующие методы:

- определение липазной активности - метсд Ota, Yaroada, модифицированным,

- определение фракционного состава липидов - метод тонкослойной хроматографии,

- минеральный состав - высокоэффективной жидкостной хроматографией,

- состав жирных кислот - гаэожидкостной^хроиатографией.

Такие, использовались специальные стандартные методики.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Данные о происхождении липазы в клетках лактирующей молочной яелезы весьма противоречивы. Часть исследователей склоняется к тому, что липаза синтезируется в клетках железы по определенному сигналу. Другие авторы утверждают, что липаза приносится с кровью из печени, жировой ткани или дане представляет модификации панкреатической липазы. В любом случае, внутриклеточная липаза принимает участие в биосинтезе специфических триацилглице-

Рис. 1. Схема проведения исследований.

рннов молочного жира.

Совмэстио с другими белками внеклеточного происхождения, такими как трансферрин (лактоферрин), иммуноглобулины и различными ферментами, она выводится из клетки и поступает в молоко.

Рассмотренные нами разнообразные гипотезы переноса белков из клеток железистых тканей позволяют утверждать следующее!

- в клетках одновременно функционирует несколько различных механизмов переноса белков' (мономерных и олигомерных, простых и

ч

сложных), различающихся для гликопротеинов, фосфопротеинов и др.

- в связи с этим, строение различных участков клеточной менб-раны эукариотов специфично, поскольку они выполняют и различные функции - базальные участки ответственны за перенос питательных веществ в железистые клетки, апикальные - за введение секрета, боковые принимают участие в межклеточном обмене информацией.

Липаза из клетки молочной железы переносится за пределы ее аналогично механизму, описанному для выведения ферментов из поджелудочной железы. Выходящая цепь гликопротеина иммобилизуется на наружной поверхности мембраны за счет образования 0-гдикозид-ной связи с углеводами гликолипидов м гликопротеинов, утопленных в гидрофобный слой мембраны. В пользу этого говорит тот факт, что мембранную липазу можно выделять изопропанолом, ацетоном и другими жирорастворителями, при этом липаза экстрагируется в виде липидбелкового комплекса (мембранный гликолипид+липаза), а оставшийся белок-белковыЛ комплекс (мембранный гликопротеин+ли-паза) резко снижает активность. Энергия связи между липазой и гликолипидон неньяе, чем между ею и гликопротеином, вторая О-гликозидная связь более прочная.

Вероятно предположить, что в момент прохождения капа-казеина через мембрану, а он выходит олигосахаридным концом вперед, именно слабосвязанная с липидом липаза, являясь гликопротеином, переиммобилизуется на гликомакропептидном конце капа-капенна, образуя связи не только по типу углевод-углеводных взаимодействий при перекрывании олигосахаридного конца, но и межрадикальные белок-белковые взаимодействия с неспирализованным макропеп-

€

тидом от 106-го до 169-го С-концевого аминокислотного остатка, при этом и образовании поперечных сшивок принимают главным образом остатки гидроксилсодержащих аминокислот (15 связей - с коли-паэой поджелудочной железы и 16 - с гликомакропептидом).

Таким образом, можно утверждать, что в свежевыдоенном молоке Присутсвуёт один вид липази, иммобилизованной на разных носителях: мембранная - на оболочке жирового шарика, связанная с оболочкой 2 типами различных по энергии связей, и плазменная, иммобилизованная на капэ-казрияе. И плазменная, и мембранная липазы, будучи жестко закреплены на природной матрице, малоактивны. При этом не столько искажена структура активного центра (что не исключено), сколько создаются -зтерическиэ трудности для взаимодействия фермента и субстрата. Возможно, что липазный комплекс не обладает при этом Достаточной гидрофобностыо, чтобы обеспечить сродство с субстратом, а именно ети моменты определяют скорость ферментативной реакции для такого сложного процесса как энзима-тическиП распад липидов.

По нашрму мнению, "основанному на экспериментальных данных других исследователей и собственных наблюдениях, механизм активации липаз молока заключается в следующем.

Активация мембранных липаз отмечается уже в ротовой полости под действием Т'ЯД* ферментов, поступающих из слюнных, подчелюстных, подъяэьгтяых п околоушных желез. Лизоцим (мурамидаза), фуко-зидаза и др. гликоэидазы разрывают определение связи в модифицированной клеточной мембране, которая распадается на отдельные фрагменты, на каждом из которых остается закрепленной молекула липазы и таким образом мембранная липлза, оставаясь на осколках оболочки жирового шарика значительно меньшего размера, должна перейти в новую конформяцию, что сказывается-на ее активности -катзлитческий центр форментя, согласно теории Хораны, за счет изменения расположения функциональна групп обпечечивает теперь . высокую скорость образования фермент-субстратного комплекса. За счет отщепления от комплекса высокомолекулярных пептидов новая структура становится более гидрофобной, повышается сродство ее и

субстрата, меньшее стерические помехи оказывают на образование ферментсубстратного комплекса оказывают отдельные группы вблизи активного центра. Вспенивание молока обеспечивает значительное увеличение поверхности раздела фаз, что ведет к увеличению скорости липолнэа. В желудке активность липаза сохраняется за счет того, что она не подвергается денатурации при рН 3,0 - 4,0 и не гидролизуется пепсином (наши наблюдения в искусственном желудке). Некоторые исследователи обнаруживали липолитическую активность в желудке ребенка, приписывал ее некой желудочной лмпазе. Оптимум рН мембранной липазы 4,0-5,0 совпадает с рН в желудке ребенка в первый постнатальный период. В тонком кишечнике, под действием специфических гидролаэ, по механизму активации таких проферментов как трипсиноген, химотрипсиноген, происходит отщепление еще одного петидного фрагмента, еще раз меняется конформа-ция активного центра мембранной липазы, при этом смещается опти-мун рН в щелочную область (8,0-4,0). Аналогичный сдвиг (по обращенной схеме) отмечается нами при иммобилизации липазы с оптимумом рН 9,0 на синтетич. гком носителе, после чего иммобилизованная липаза имела оптимум при рН 6,0.

Следует отметить тот факт, что при механической обработке молока (перекачивании центробежными насосами, гомогенизации) липаза оболочек жировых шариков может переходить в плазму, какое-то зремя она остается активной, после чего, иэменчв конформацию, не будучи иммобилизованной, теряет активность. Такая липаза (свободная) термолабильна и денатурирует при температуре выше 45°С.

В свежевыдоенном молоке всегда содержится некоторое количество жира с нарушенной нативной оболочкой. Это обусловлено тем, что молоко, проходя через узкие капилляры в вымени, подвергается давлению. В связи с этим могут изменяться размеры жировых шариков и выделяться свободный жир. Наличие в молоке активных ферментов, кислорода воздуха, микроорганизмов вызывает гидролиз жира, .вследствие чего г юисходит накопление свободных жирных кислот.

Первичная обработка, способствует увеличению количества сво-

■го

бодного жира. При матинном доении изменяется дисперсность жировых шариков молока "вследствие механических воздействий на различных участках доильной установки и молокопроводов. В результате этого происходит десорбция ферментов, связанных с оболочками жировых шариков, а следовательно, повышение их активности. Они становятся более доступныйи для соединений, реакций изменений которых ояи катализируют.

Другим путем идет активация плазменной липазы. В ротовой полости она не претерпевает никаких изменений. Попадая в желудок, под действием реннина капа-казеин с иммобилизованной липазой в кислой среде желудочного сс :а частично деспирализуется и подвергается гидролизуется с разрывом пептидной связи между 105 и 106 аминокислотными остатками. Образовавшийся пара-капа-казеин гидролизуется пептидгидролазами желудочно-кишечного'тракта по известной схеме, а липаза остается иммобилизованной на гликомакро-пептиде, ее молекула подвергается структурной перестройке и новая конформация активного центра обеспечивает высокую'активность липолиза. При этом следует учесть усиление гидрофобности носителя липазы - гликомакропептид за счет слабой спирализации и присутствия в его составе большого числа неполярнмх радикалов. Оптимум активности такого липазного комплекса находится в диапазоне рН 8,0-9,0 и он проявляет максимальную активность в тонком кишечнике.

Таким образом, в кишечнике "работает" несколько видов липаз! мембранная липаза молока, иммобилизованная на фрагментах однослойной мембраны, плазменная липаза молока на гЛикомакропептиде, липаза поджелудочной железы с колипазой, липаза микроворсинок кишечника, и в нижних отделах кишечника - зкзолипазы микроорганизмов.

В клетках лактирующей молочной железы при участии липазы идет синтоз специфических липидоп молочного жира. Анализ накопленного материала позволяет построить примерную модель процесса переноса молочного жира из клптки в молоко.

Липиды в спстяпп молока появляются дпумп путями. Первый - за

и

счет липидов, синтезированных в других клетках и доставляемых кровью к лактирующей молочной железе в виде хиломикронов. Хило-микроны, проходя через зону слипания межклеточных контактов или через щели между плазматическими мембранами соседних клеток, поступают без трансформации в полость альвеолы.

На базальной стороне железистых эпителиальных клеток располагаются специализированные белки-рецепторы (гликопротеины, пронизывающие всю толщу плазматической мембраны), которые связывают доставляемые кровью липопротеины (ЛОНП, ЛНП, ЛВП, ЛОВП), интер-нализуют их и пропускают внутрь клетки. Здесь фосфолипиды липоп-ротеинов под действием лияолитических ферментов клетки частично гидролизуется и используется клеткой для синтеза специфических липидов молочного жира (второй путь). Имеются указания на то, что доставляемые кровью липопротеины гидролизуются в эндотели-альном слое капилляров молочной железы липопротеинлипазой, после чего переносятся внутрь клеток.

Эти два пути функционируют одновременно. Такой подход объясняет " наличие мелких И крупных жировых шариков в молоке - мелкие жировые шарики формируются из хиломичронов, а крупные - за. счет синтез» липидов в клетке по второму пут».

В ¿актирующей железе интенсивно протекают процессы окисления углеводов с цель« получения энергии для множества синтетических процессов сборки макромолекул и их переноса через клеточную мембрану..

Вряд ли справилась бы клетка с таким объемом работ, если бы здесь же осуществлялся первичный синтез всех строительных блоков. Только в клетках молочной железы идет биосинтез лактозы (именно здесь обнаружен комплекс ферментов осуществляющих этот непростой синтез), здесь же синтезируются казенны и ряд других белков молока, здесь же синтезируются специфические триацилгли-церины молока, имеющие в своем составе низкомолекулярные жирные кислоты. Строительные блоки, синтезируемые в клетках печени в виде ацетоатетила, доставляются а ^актирующие клетки, где из ацетил-Кол идет синтез' жирных кислот, преимущественно короткои

среднецепочных насыщенных, . которые ацилируют глицерол-3-фосфат, отбираемый после восстановления диоксиацетон-3-фосфата из гликолиза, а также моко- и диацилглицерины после дефосфорилирования фосфолипидов. Предполагают, что биосинтез происходит при участии высокоактивных липаз лактирующих клеток, которые ацилируют глицерин в положений 3 или 1, проявляя затем при липолизе специфичность, гидролизуют ине'нно эти связи в триацилглицеринах молока.

Молекулы лйпидов, будучи гидрофобными, агрегируются (сливаются) и смещаются к периферии клетки (апикальная часть), где проходят через первый слой мембраны, раздвигая мембранные слои, при сжатий клетки мембрана изгибается и охватывает довольно крупную жйровую каплю диаметром 2 мкм, после чего сформировавшийся жировой шарик, окруженный однослойной клеточной мембраной, отрывается и уходит в просвет альвеолотрубки. Варьирование размеров связано с химическим составом триацилглкцеринов, с их жирнокис-лотным составом.На гистологических препаратах клеток лактирующей молочной железы при окрашивании судаком Шварца мы неоднократно наблюдали скопление жира в апикальной части клетки. Кроме того, наши исследования структуры крупных и мелких жировых шариков выявили существенные различия в их строении. Наличие жидкого жира обеспечивает "растворение" гидрофобных хвостов фосфолипидов, составляющих однослойную мембрану.

Таким образом, в молоке присутствуют два типа жировых шариков - мелкие, бывшие хиломикроны, и крупные, покрытые однослойной клеточной мембраной, которая содержит большой набор ферментов, в частности иммобилизованную липазу.Наши специальные исследования по выделению липазы различными методами показали, что липазная активность мелких жировых шариков нулевая. Не удалось выяснить различия в количественном и качественном составе липидов жировых шариков женского и-коровьего молока. Присутствие липазы в виде белок-бёлкового комплекса биологически оправдано: липаза молока вырабатывается клетками молочной железы матери с целью компенсации недостаточности панкреатической липазы и должен активны;, поступить в кишечник, пройти при этом желудок с пептидгидролаза-

ии широкого спектра действия (пепсин, гастриксин), а также сохранить активность в точкой кишечнике. Липаза, связанная в комплексе с гидрофобным белком за счет прочных связей между карбоксильной группой аспарагина и 1<-концевой аминогруппой липазы и по другому концу 0-гликозидной связью с олигосахаридами ко-липазы, имеет до двух десятков поперечных связей. Такой комплекс устойчив к денатурации и не гидролизуется пептидгидролазами желудка и тонкого кишечника. Гидролиз прочных связей этого комплекса идет под действием ферментов микроорганизмов в толстом кишечнике.

Как бактериальные липазы, так и липаза молочной железы по сравнению с другими ферментами отличаются свой термоустойчивостью и выдерживают обычную температуру пастеризации. Для инактивации липазы требуется температура 88-95°С. Возможна ее реактивация (восстановление) в молоке, пастеризованном при 90°С в течении 3 с и хранившемся в течение 48 ч при 4-5°С. По-видимому, липаза, как и большинство ферментов, разрушается при более низких температурах (около 70°С). Но она хорошо растворяется в жирах и свободно проникает в жировые шарики молока и сливок, поэтому при моментальной пастеризации (72-75 "С) жир не успевает полностью нагреться до температуры инактивации фермента и липаза частично.остается неразрушенной.

Исходя из вышеизложенного, можно постулировать следующие выводы : ' ,

- Липаза молока, являясь клеточным эндоферментом, не встречается в нем в свободном виде, остается иммобилизованной на наружной поверхности оболочки жирового шарика или на гликомакро-пептиде капа-казеина.

Мембранная липаза обнаружена на крупных жировых шариках и отсутствует у мелких, что свидетельствует в пользу гипотезы о различном происхождении липидов молока.

Мембранная липаза ч плазменная липаза активируются по разным механизмам, но во всех случаях остаются иммобилизованными на гидрофобных носителях. Активация мембранной липазы имеет каокад-

чч

ный характер - молоактивная нативная липаза активируется за счет ступенчатого гидролиза белкового носителя, аналогично протекает процесс активирования плазменной липазы.

• - Природа решила сложную задачу - синтезировала глобулярный белок-фермечт, одновременно обеспечив ему в виде комплекса с природным носителем гидрофобные свойства, что способствует йстрече фермента с "гидрофобным субстратом на границе раздела фаз жмр-водй.

Специфичность липаз объясняется стерическими возможностями комплекса липазы и колипазы и может трансформироваться при модификации колипазы.

Ингибирование липазы специфично протекает по реакции, приводящей к блокированию активного центра фермента, неспецифично связано с аллостерическими эффектами.

Представленная модель локализации липазы и механизм эё активации в желудочно-кишечном тракте хорошо согласуется с экспериментальными данными других исследователей и объясняет Все имеющиеся невязки.

При разработке технологии получения ферментных препаратов липолитКческого действия выполнялись следующие условия:

1. Во"всех случаях необходимо; чтобы липаза оставалась на естественных носителях, но в то-же время активировать её.

2. Активную "липазу целесообразно инкапсулировать с целью исключения липолиза'при яраненяи продуктов.

3. Технология получения фермента должна быть безотходной.

4. При получении препарата плазменной липазы (ППЛ) соблюдать мягкие условия выделения капа-казеина.

5. Полученный препарат должен отвечать существующим медико-биологическим требованиям.

Технология получения препарата мембранной липазы (ПМЛ) включает следующие этапы: пахту смешивают с 2%-ым раствором метил-целлюлозы в соотношении 3:1, смесь оставляют в реакторе ра 3-4 часа для разделения на фракции при температуре 10-12°С.

Копичество•вносимого раствора полисахарида (метилцеллюлоэы) 1

часть на 3 части пахты необходимо для выделения 96-98% белковых веществ пахты, а температурный режим, при котором смесь отстаивается до б часов (10-12вС) обеспечивает сохранность пахты без изменения, что дозволит получить продукт высокого качества и без потерь. ■ ■

Затем комплекс сывороточных белков с-метилцеллюлозой удаляют, а белковый концентрат обрабатывают 1М раствором МаС1 в соотношении 1:3, концентрат сепарируют, полученный экстрат фермента подвергают очистке методом электродиализа после осаждения фермента сульфатом аммония, подвергают сушке в мягких условиях, предпочтительно сублимацией.

Сухой порошок подвергают микрокапсулированию. Капсулы изолируют препарат от нежелательных воздействий его на липиды продукта при хранении. В качестве оболочки для формирования микрокапсул использованы полисахариды, выделенные из биомассы слизистых рас ацидофильных бактерий, выращенных й условиях интенсивно"1? капсулообразовання. Полисахариды смешивали с тонкодисперсным порошком липазы и распыляли через специальную головку в лабораторной вакуум-сушильно* установке.

Принципиальная схема технологии получ&ния «икрокапсулирован-ного препчрата липолитического действия изображена на рис.2.

Рис.2. Принципиальная схема технологии получения микрокапсу-лированного препарата липолиткческого действия.

и

Условные обозначения.

Потоки.

1' - пахта (обезжиренное молоко);

2* - 2%-ый раствор метилцеллюлозы;

3' - смесь пахты с 2%-ым раствором метилцеллюлозы;

- полисахаридная фракции; 5* - концентрат нативного казеина (КНК); 6* - 1М раствор хлорида натрия; 7* - смесь КНК с 1М раствором хлорида натрия; 8* - экстракт фермента;

9* - насыщенный раствор сульфата аммония;

104 — смесь экстракта фермента с насыщенным раствором сульфата

аммония; 11'- неактивный фугат; 12*- осадок фермента; 13*- 96%-ый этиловый спирт; 14*- очищенный фермент; 15*- ферментный препарат после диализа;

16'- капсулируюцй материал - гкзополисахариды молочнокислых бактерий;

17'- капсудированный ферментный препарат;

1В'- готовый продукт; •

19*- закваска молочнокислых бактерий;

21*- сквашенная смесь;

2^*- 1Н раствор соляной кислоты;

23'- дестабилизированная смесь;

24'- экзополисахарид;

25'- осажденный белок.

Машины и аппараты.

1 - резервуар для кисломолочных напитков;

2 - насос центробежный;

3 - бактофуга;

4 насос ротационный;

5 - сепаратор для выделения белка;

6 - сепаратор-осветлитель;

7 - фильтр; •

8 - эле'ктродиализная'установка;

9 - вакуумная установка для сушки;

10- гомогенизатор;

11- вакуум-выпарной аппарат.

В процессе выделения ферментного препарата определялась активность по ходу технологических операций. Полученные данные приведены в диаграмме изменения липазной активности по этапам выделения фермента (рис.4).

Удельная активность

~~Г

1 | 2

I_I_

3 | 4 | 5 | б | 7

^_I_I_и-1-

этапы выделения-

Рис.4. Диаграмма изменения липазной активности по этапам выделения фермента.

Этапы выделения:

1 - после сепарирования .в сливках;

2 - после получения в пахте;

3 - после разделения метицеллюлозой в КНК;

4 - высаливание хлоридом натрия;

5 - осаждение сульфатом аммония;

6 - после очистки;

7 - после сушки.

Рассмотрим изменения липазной активности по этапам выделения фермента. Из диаграммы (рис.3) видно, что на первых этапах выделения (1-6) активность липазы равномерно возрастает, за счет удаления балластных веществ. После сушки ферментного препарата происходит значительное снижение активности. Это можно объяснить структурными изменениями в активном центре фермента.

а процессе хранения (в течение 6 месяцев) активность падает на 10%, возможно проявляется структурный эффект в связи с потерей влаги вблизи активного центра.

Технология получения ферментного препарата плазменной липазы (ППЛ) включает следующие этапы: обезжиренное молоко сме шивают с 2%-ым раствором метилцелдюлозы в соотношении 3:1, смесь оставляют в реакторе на 3-4 часа для., разделения на фракции при температуре 10-12°С , после чего комплекс сывороточных белков с ме-тилцеллюлозой удаляют, а белковый концентрат смешивают с водой 1:1 и обрабатывают сычужным ферментом. После сквашивания центрифугируют и .осаждают фермент из сыворотки сульфатом аммония, экстракт фермента подвергают очистке методом электордиализа, суша в мягких условиях, микрокапсулирование или иммобилизация. На рис.4 изображена принципиальная схема получения ферментного препарата липазы из обезжиренного молока.

и

Рис.5. Принципиальная схема получения ферментного препарата липазы из обезжиренного молока.

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ НАТИВНОЙ ЛИПАЗЫ

ВЛИЯНИЕ рН РЕАКЦИОННОЙ СРЕДЫ НА ЛИПОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИПАЗЫ

На рис. 6 показано влияние величины рН реакционной снеси на липолитическуп активность нативной липазы. Как видно из рисунка, оптимум рН нативной липазы находится при рН 8-9 и выражен довольно резко; даже небольшое смещение как в кислую, так.и вщелоч-ную область приводило к значительному снижению активности фермента.

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ЛИПОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИПАЗЫ

При проверке температурного оптимума действия липазы было установлено, что изучаемая липаза достаточно тврмостабнльна. На рис.7 представлена зависимость активности "препарата липазы от температуры реакционной среды.

Оптимум действия ферментного препарата .липазы, как видно из рис. 7, находится при температуре 35-<0°С. Но даже при температуре 45-50°С активность липазы еще довольно высока. При низких температурах (0-10°С) гидролиз оливкового масла не -наблюдался. При наблюдении за скоростью липолиэа оказалось, что скорость возрастает с 10°С и достигает максимума к 40-50°С.

А,Б г

800

600

400

200

1 А,Бг

800

600

400

200

рН

20

40

60 I, С

Рис.б. Эависисость вктивности ли- Рис.7. Зависимость активнос-паэы от рН реакционной среды. ти липазы от температуры

рекционной среды. Субстрат - оливковое масло. Л - удельная актианость, Е.

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ПОЛУЧЕННЫХ МИКРОКАПСУЛ

Исследования свойств микрокапсул проводились с целью получения качественных характеристик порошков, таких как массовая доли влаги в конечном продукте, объемная плотность порошка, коэффициент (индекс) растворимости, смачиваемость, дисперсность. Резуль-

В

5

б

7

Таблица 1

Характеристики исходных материалов и капсулированных продуктов

IГ

I" I

~Г

Продукт

| Качественные характеристики

1 |массо- 1 об.пло-|коэффи- смачи- 1 1 |дисперс-|

вая до- тность |циент ваем . , ¡ность, |

|ля вл,% г/см )раств. 1 с ) ~ с |

| 3,5 1,20 1 1 | 1,6 1 15,6 1 14<а 1

1 5'г 1,17 1 | 2,1 12,1 1 13'9 1

| 6,2 1,37 | 2,2 1 12,0 1 14'5 1

| 4,22 1,1В | 1,90 14,0 | 15,75 |

| 3,78* 1,24 | 1,75" 12,5 | 15,70 |

1 ¡Препарат липазы |до капсулнрования

2 |Капсулирующий [материал:

|зкзополисахарид |отвар

3 ¡Препарат липазы ¡капсулированный: ¡с экзополисахарнд ¡с отваром

По органолептическим, физико-химическим и микробиологическим показателям микрокапсулированный препарат липазы должен соответствовать требованиям, указанным в табл.2.

4 ^ Таблица 2

Органолептические, физико-химические и микробиологические показатели мнкрокапсулированного препарата липазы

1 1 наименование показателя ' 1 Норна |

(Консистенция и внешниП вид Мелкий сухой порошок. Допуска-|

1 ется наличие легко рассыпаю- |

щихся комочков. |

1 Вкус и запах Чистый, молочный |

|Цвет Белый. Допускается с яелтопа- |

тын оттенком. . 1

(Массовая доля жира,%, не более 0,05 |

|Активность,Е, не менее 200 |

|Индекс растворимости, мл осад-

|ка, не более 0,20 ;

|Общее количество бактерий в 1г

|препарата липазы, ед.,не более 10000 |

|Бактерии группы кишечной пало-

(чки п 0,3г не допускается |

|Патогенные микроорганизмы не допускаются |

Содержание тяжелых металлов, афтгптоксиноа, , антибиотиков и пестицидов в препарате не должно превышать допустимые уровни, установленные в медико-биологических нормах Минздрава РФ.

26

выводы

1. Проведен анализ состояния и тенденции получении препаратов липазы.

2. Впервые предложена модель, в которой отражены аспекты происхождения липазы, ее активность в молоке, каскадный механизм активации, механизм действия фермента.

3. В соответствии с моделью сформулированы требования к технологическим приемам и режимам получения препаратов.

4. Разработаны биотехнологии получения препаратов мембранной и плазменной липаз., ' особенностями которых является безотход-иость; мягкие режимы выделения; сохранение на естественных носителях; высокая микробиологическая чистота; защита активного фермента путем инкапсулирования.

5. Экспериментальными исследованиями определены, параметры технологического производства ферментного препарата:

- разделение молочного сырья на полисахаридную фракцию и белковый концентрат (содержащий капа-казеин) при помощи 2%-го раствора метилцеллюлозы при температуре 10-12°С;

- осаждение фермента после обработки решшном кала-казеина насыщенным раствором сульфата аммония;

- щадящие режимы сущкн в вакуум-сушильной-установке или сублимацией, не допуская нагрева препарата выиа 40°С;

- микробиологическая чистота за счет обработки этанолом,

- инкапсулирование с полисахаридами. слизистого слоя

Lactobacillus acidophilum.

6. По разработанным технологиям получены препараты широкого спектра применения, высокорентабельные, из доступного сырья, неаллергенные, специфичные относительно триацилглицеринов молочного жира.

Препараты могут быть использованы в детском, геродиетическом и диетическом питании, хлебопечении, получении синтетических моющих средств, а также как фармпрепараты.

> 7. Удельная активность препарата мембранной липазы составляет не менее 200 Е, плазменной - 800 Е, что выше всех извес-

тных фармпрепаратов липолитичесхого действия.

8. Разработан технологический регламент для малотоннажного производства ферментных препаратов липолитнческого действия.

9. Проведены маркетинговые исследования рынка детских' молочных продуктов с введением препаратов липазы для питания детей с нарушениями липкдного обмена.

10. Разработана рецептура белкового продукта с введением препарата инкапсулированной липазы для питания детей с низким уровнем липолиэа.

11. Технология ферментных препаратов и лечебного продукта защищены патентом на изобретение "Способ получения белкового продукта с липолитической активностью".

СПИСОК ОПУДЛИКОВАННЫХ „АБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Патент N 2065273, А 23 С 17/00, А 23 J 1/20. Способ получения белкового продукта с липолитической активностью. /С.М.Ку-нижев, Э.Т.Кимова, Т.П.Кузьминова, Л.Е.Курганова, Т.£.Воротникова, Л.Н.Иванова,1996 г.

2. Микрокапсулирование биологически активных веществ. /С.М.Кунижер, Э.Т.Кимова, Т.П.Кузьминова.// Тезисы докладов научно-исследовательской работы профессорско-преподавательского состава, аспирантов и стедунтоп за 1994 г. Ставрополь, 1995.

3. Микрокапсулирование ферментных препаратов. /Т.П.Кузьминова. //4 Международный симпозиум."Экология человека: пищевые технологии и продукты". Москва-Видное , 1995.

4. Исследование и разработка процесс,1 микрокапсулирования жира молока. /А.В.Шуваев, Н.К.Ли, 7.П.Кузьминова //Материалы Первой конференции Сеяаро-Капказского региона "Современные достижения иотехнологии."

5. Новая система для разделения липидов методом ТСХ. /Т.П.Кузьминова. //Тезисы к докладам. Вторая Всероссийская конференция "Прогрессивные экологически безопасные технологии хранения и комплексной переработки сельхозпродукции для создания пподуктоп питанияпопыпенной пищавой и биологической ценности". Углич, 1996.