автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Получение, исследование физико-химических свойств и применение дрожжевой липазы в технологии сырокопченых колбас

На правах рукописи

Мотина Екатерина Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ, ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ПРИМЕНЕНИЕ ДРОЖЖЕВОЙ ЛИПАЗЫ В ТЕХНОЛОГИИ СЫРОКОПЧЕНЫХ КОЛБАС

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Воронеж 2009

003492231

Работа выполнена на кафедре микробиологии и биохимии ГОУВПО «Воронежская государственная технологическая академия»

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор

Корнеева Ольга Сергеевна (ГОУВПО «Воронежская государственная технологическая академия»)

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор

Ковалева Тамара Андреевна (ГОУВПО «Воронежский государственный университет»)

кандидат технических наук, доцент Ильина Надежда Михайловна (ГОУВПО «Воронежская государственная технологическая академия»)

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГНУ Всероссийский научно-

исследовательский институт мясной промышленности им. В. М. Горбатова, г. Москва

Защита состоится 30 декабря 2009 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.035.04 при ГОУВПО «Воронежская государственная технологическая академия» по адресу: 394036, г. Воронеж, проспект Революции, 19, ауд. 035.

Отзывы на автореферат (в двух экземплярах), заверенные гербовой печатью учреждения, просим присылать в адрес совета академии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Воронежской государственной технологической академии.

Автореферат размещен на официальном сайте Воронежской государственной технологической академии www.vgta.vrn.ru..

Автореферат разослан 28 ноября 2009 года.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, д.т.н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Колбасные изделия традиционно пользуются высоким потребительским спросом. В настоящее время при постоянно нарастающей конкуренции актуальной проблемой является разработка и внедрение новых технологий, ориентированных на интенсификацию комплекса сложных биохимических превращений, которые протекают в мясном сырье при производстве колбасных изделий, и позволяющих выработать продукты со специфическим вкусом и ароматом.

Одним из путей решения такой проблемы является биотехнологический принцип модификации мясного сырья - направленное регулирование хода биохимических, физико-химических и микробиологических процессов, в результате которых формируется структура, цвет и вкусоароматические характеристики готового продукта.

Действие микроорганизмов связано с их способностью продуцировать в мясе специфические биологически активные вещества: органические кислоты, бактериоцины, ферменты, витамины, которые способствуют улучшению санитарно-микробиологических, органолептических показателей готового продукта и позволяют интенсифицировать технологический процесс.

Пути улучшения вкусовых и ароматических свойств мясных продуктов, ускорения процесса созревания и подавления роста нежелательной микрофлоры разрабатывались рядом ученых: Л. В. Антиповой, В. М. Бондарен-ко, А. Н. Габараевым, В. Б. Крыловой, Л. С. Кудряшовым, И. А. Роговым, Н. Г. Машенцевой, В. В. Хорольским, Э. Шиффнером и другими отечественными и зарубежными учеными.

В мясной промышленности до последнего времени используют штаммы микроорганизмов молочнокислых бактерий и микрококков. Молочнокислые бактерии обладают исключительно лабильным метаболизмом, способны приспосабливаться к изменению среды благодаря вариабельному приспособительному обмену. При внесении их в колбасный фарш в виде бактериальных заквасок продукты метаболизма этих бактерий формируют аромат изделия.

Важная роль в формировании аромата мясных продуктов принадлежит ферментации жиров, в процессе которой образуются ди- и моноглицериды, летучие жирные кислоты (уксусная, масляная, капроновая и др.) и продукты их распада (альдегиды, кетоны, метилкетоны, эфиры, спирты). Данный процесс осуществляется микрококками, лактобациллами, дрожжами и мицели-альными грибами, синтезирующими липолитические и другие ферменты, которые участвуют в превращениях жиров.

Образующиеся летучие низкомолекулярные жирные кислоты могут окисляться до перекисей, которые под действием каталазной активности

микрококков превращаются в карбоксильные соединения, способствующие вкусообразованию продукта.

На основании вышеизложенного следует, что включение липазы в композицию микроорганизмов для производства сырокопченых колбас является весьма перспективным с точки зрения создания характерного вкуса, аромата и консистенции данного вида продукта. Перспективность такого рода исследований объясняется и тем, что липолитические и протеолитические ферменты принимают участие также в ускорении созревания колбас. Однако в отечественной практике такие исследования практически отсутствуют. В связи с этим вопросы, связанные с практическим применением липазы в технологии сырокопченых колбас, вызывают значительный интерес.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы было получение фермента липазы, изучение ее биохимических и физико-химических свойств, обоснование и разработка технологии производства сырокопченых колбас с применением композиции из стартовых культур и ли-политического фермента.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

• исследование условий биосинтеза липазы Уаггомга Чро1уйса У-1711;

• разработка эффективного способа выделения и очистки ферментного препарата липазы, определение физико-химических свойств и субстратной специфичности фермента;

• выбор и обоснование целесообразности использования композиции из бактериальных стартовых культур и липазы для производства сырокопченых колбас;

• исследование влияния технологических параметров на активность композиции из стартовых культур и липазы;

• исследование изменения аромата модельного фарша с использованием композиции стартовых культур и ферментного препарата липазы;

• определение условий и обоснование режимов производства сырокопченой колбасы с применением липазы и стартовых культур микроорганизмов; оценка качественных показателей готового мясного изделия;

• разработка проекта нормативной документации на композицию из стартовых культур микроорганизмов и липазы и производственная апробация технологии.

Научная новизна. Изучены физиолого-биохимические особенности дрожжей Уаггота \ipolytica У-1711 и условия их рационального культивирования при биосинтезе липазы.

На основании теоретических обобщений и экспериментальных исследований впервые обоснована целесообразность использования композиции из стартовых культур микроорганизмов и дрожжевой липазы при производстве сырокопченых колбас.

Получены новые данные о влиянии композиции на процесс ароматооб-разования при производстве сырокопченых колбас.

Установлен характер изменений микробиологических, физико-химических, органолептических показателей формирования структуры в процессе производства сырокопченых колбас под влиянием стартовых бактериальных культур и липазы.

Практическая значимость работы. Получен новый ферментный препарат, установлены оптимальные условия ферментативного гидролиза жиров растительного и животного происхождения: температура, рН, длительность процесса и дозировка препарата. Определена субстратная специфичность липазы дрожжей Yarrowia lipolytica Y-1711, что позволяет рекомендовать данный ферментный препарат для интенсификации процесса производства сырокопченых колбас.

Разработана композиция из молочнокислых бактерий и ферментного препарата липазы «Липолитин Г10х», установлено ее положительное влияние на функционально-технологические свойства мясного сырья. Разработаны рекомендации по использованию композиции из молочнокислых бактерий и ферментного препарата липазы «Липолитин Г10х» при производстве сырокопченых колбас. Изучено изменение вкусоароматических характеристик в процессе созревания мясного фарша.

Результаты апробированы на ОАО «Комбинат мясной Калачеевский».

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы представлены и обсуждены в период 2005 - 2009 г.г. на ежегодных отчетных научных конференциях Воронежской государственной технологической академии; международных и всероссийских научно-технических конференциях: «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2005); «Экстракция органических соединений ЭОС» (Воронеж, 2005); «Техника и технология пищевых производств» (Могилев, 2006); «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); «Биотехнология и современность» (С.-Петербург, 2006); «Пищевые технологии» (Казань, 2006); «Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов» (Улан-Удэ, 2006); «Наукоемкие химические технологии» (Самара, 2006); «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007); «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности» (Воронеж, 2009).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 23 работы, в том числе три в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики объектов и методов исследований, трех экспериментальных глав, выводов, списка использованных источников и приложения. Работа содержит 154 страниц машинописного текста, 19 таблицы, 37 рисунков. Библиография включает 121 наименование.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы и определены основные направления исследования.

ГЛАВА I. Обзор литературы. Осуществлен аналитический обзор данных литературы, касающихся ферментов липаз, их физико-химических свойств, способов выделения и очистки.

Проанализирован зарубежный и отечественный опыт применения микроорганизмов и ферментов в технологии мясных продуктов, в том числе при производстве сырокопченых колбас.

ГЛАВА II. Объекты, материалы и методы исследований. Представлена характеристика объектов исследований, описаны условия постановки эксперимента и методы определения изучаемых показателей.

На рис. 1 приведена схема проведения эксперимента, объекты и мето-

Рис. 1. Схема экспериментальных исследований

Основным объектом исследований служили чистые культуры дрожжей Yarrowia lipolytica Y-1711, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ, г. Москва), а также чистые культуры молочнокислых бактерий: Lactobacillus casei, Staphylococci carnos, Bifidombacterium siccum, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Bifidombacterium bifidum.

В работе использовали следующие виды мясного сырья: говядину жи-лованную высшего сорта, свинину жилованную нежирную и жилованную жирную.

Глубинное культивирование дрожжей Yarrowia lipolytica Y-1711 проводили в качалочных колбах вместимостью 750 см3, содержащих по 200 см3 питательной среды заданного состава, в течение 120 ч при температуре 28-33 °С.

Для выращивания использовали модифицированную питательную среду (г/дм3): глюкоза - 2; дрожжевой экстракт - 1; СаС03 - 0,4; MgS04 - 0,1; КН2Р04 - 0,2; мочевина - 0,1; соевая мука - 0,5; оливковое масло - 8; вода -остальное.

Для определения липолитической активности использовали метод рН-статирования, за единицу активности принимали такое количество фермента, которое отщепляет 1 мкмоль жирных кислот от эмульсии триолеина за 1 час при 37 °С. В качестве субстрата в опытах использовали эмульсии триг-лицеридов оливкового масла, триолеина, трибутирина, стабилизированные водным раствором поливинилового спирта (ПВС-8/14) с массовой долей 2 %. Активность сопутствующих ферментов определялась следующими методами: протеазы (метод Ансона), каталазы (колориметрический метод).

Для очистки ферментного препарата использовали этиловый спирт, а также ряд последовательных ионообменных колонок.

Молекулярную массу липазы определяли методом электрофореза в по-лиакриламидном геле (ПААГ). Разделение и контроль гомогенности ферментов осуществляли по Дэвису.

Кинетические характеристики липазы изучали на высокоочшценном препарате. Определение константы Михаэлиса осуществляли по Диксону и Уэббу.

Состав композиции подбирали по следующим характеристикам: скорость снижения величины рН, устойчивость к хлориду натрия и симбиотические взаимоотношения между стартовыми культурами.

При изучении характеристик модельного фарша определяли функционально-технологические свойства: жироудерживающую, влагосвязывающую и влагоудерживающую способности - согласно рекомендациям (JI. В. Антипова и др., 2001). Оценку аминокислотной сбалансированности и биологической ценности продукта проводили по следующим показателям: аминокислотный скор продукта; коэффициент различия аминокислотного скора; биологическая ценность.

При определении химического состава мясного изделия были проанализированы следующие показатели: массовая доля влаги - гравиметрическим ме-

тодом, массовая доля белка - по Кьельдалю, массовая доля жира - путем экстрагирования этиловым эфиром.

Все определения проводили не менее чем в трех повторениях трех серий экспериментов. В диссертации представлены средние результаты серии экспериментов, обеспечивающие 95 % точности по статистическим критериям.

ГЛАВА III. Получение ферментного препарата липазы и исследование его физико-химических свойств

С целью увеличения биосинтетической способности продуцента и повышении уровня активности фермента нами был оптимизирован процесс глубинного культивирования дрожжей.

Влияние различных источников углерода, азота и жирового компонента на биосинтез липазы. Исследования по подбору химического состава питательной среды проводили поочередно, варьируя качественный состав источников углерода.

Изучение биосинтеза липазы при росте продуцента Уаггоша ИрЫуйса У-1711 на различных источниках углерода показало, что хороший рост обеспечивали такие углеродные субстраты, как глюкоза и фруктоза, что объясняется физиологическими потребностями продуцента.

Липолитическая активность на среде с глюкозой увеличивалась в среднем на 30 % по сравнению с другими источниками углерода. На среде с мальтозой и крахмалом накапливалось минимальное количество биомассы дрожжей, что сопровождалось минимальным уровнем активности липазы (рис. 2).

На биосинтез ферментов оказывает влияние не только источник углерода, но и его количественное содержание в среде. Наиболее активный синтез фермента обеспечивало содержание глюкозы в среде с массовой долей 8 %.

При изучении влияния источников азота на биосинтез липазы использовали различные минеральные соли: 1У^(МОз)2, ЫН4С1, КЖ)з и источни-

ки органического азота: мочевина, пептон, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт (рис. 3). Источники азота вносили в питательную среду в количестве 0,1 % по азоту.

Данные, представленные на рис. 3, получены на 72-м ч роста Уаггоша \ipolytica У-1711, когда наблюдалась максимальная

щ активность, % от максимальной

[3 биомасса, % от максимальной

Рис. 2. Влияние источников углерода на активность (А, %) липазы и рост дрожжей Уаггота Нро1уИса У-1711:

1 - глюкоза, 2 - фруктоза, 3 - сахароза, 4 - лактоза, 5 - мальтоза, 6 - крахмал, 7 - манноза, 8 - рамноза.

А, %

активность фермента в культуральной жидкости.

Проведенные опыты показали, что дрожжи хорошо растут на всех испытанных вариантах сред, однако внесение того или иного азотного источника оказывало различное влияние на уровень липазной активности. Наилучшими источниками азотного питания оказался комплекс мочевины и дрожжевого экстракта в соотношении 1:10.

Массовая доля комплекса 1,4 % (в пересчете на азот) обеспечивала максимальный биосинтез фермента.

Известно, что при культивировании продуцентов липолитических ферментов в питательную среду добавляют жировой компонент. В традиционной среде при культивировании используют оливковое масло, которое является дорогостоящим компонентом. В связи с этим нами была предпринята попытка удешевления питательной среды для культивирования дрожжей, используя в качестве жирового компонента соапсток - отход мас-ложировой промышленности (ТУ 10-04-02-80-91).

Сравнительная характеристика влияния различных жировых компонентов на биосинтез липазы

У

У 1

/

1

1

1

• 1 1

-1 —

Рис. 3. Влияние источников азота на активность (А, %) липазы:

1 - дрожжевой экстракт; 2 - КН4С1; 3 - ЫаИОз;

4 - мочевина; 5 - пептон; 6 - ККОз, 7 - кукурузный экстракт;

8-Ме(Ш3)2

А, %

<=э

/

—

Рис. 4. Влияние жирового компонента на активность (А,%) липазы: 1 - оливковое масло, 2 - подсолнечное масло, 3 - соапсток, 4 - льняное масло, 5 - касторовое масло, 6 - без жирового компонента

Уаггота Иро1уйса У-1711 представлена на рис. 4.

Как видно, из рис. 4, наибольшая липолитическая активность наблюдалась на среде с соапстоком. В результате проведенных исследований по изучению влияния со-апстока на биосинтез липазы было установлено, что массовая доля соапстока 8 % в среде обеспечивала наиболее активный синтез фермента.

Влияние физико-химических факторов на биосинтез липазы \arrowia Иро1уйса У-1711. Интенсивному образованию ферментов способст-

вует ряд условий, среди которых величина рН, температура культивирования и аэрация процесса занимают важное место. Было установлено, что максимальный биосинтез наблюдался при рН 7,0 и температуре 37 °С. Наибольшее значение липазной активности было получено при соотношении 0,7 объема воздуха на 1 объем среды, что соответствовало 200 см3 среды.

Получение очищенного ферментного препарата липазы. Для исследования физико-химических свойств фермента необходимо иметь очищенный ферментный препарат. С этой целью нами разработана схема очитки ферментного препарата, включающая следующие стадии: осаждение органическим растворителем, гель-фильтрацию на сефадексе в-25, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-фильтрацию на сефадексе 0-150. Использование многостадийной очистки позволяет повысить долю активного белка в общей массе препарата.

На первой стадии очистки в качестве органического растворителя использовали этиловый спирт, максимальный выход ферментного препарата «Липолитин Г10х» составил 6,0 мг/см3, липолитическая активность -400 Е/г. В качестве сопутствующих ферментов были обнаружены протеаза и катал аза.

Схема получения очищенного препарата липазы представлена в табл. 1.

Таблица 1

Схема получения очищенного препарата липазы

Стадии очистки Общий Общая Белок, Удельная Степень

объем, активность, мг активность, очистки

см3 Е Е/мг бежа

Осаждение 5,0 2000,0 6,70 298,5 1,0

этиловым спиртом

Гель фильтрация на сефадексе G-25 4,0 380,0 0,32 1187,5 3,9

Ионообменная

хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 3,0 210,0 0,05 4200,0 14,0

Гель фильтрация на сефадексе G-150 1,5 100,0 0,02 5000,0 25,0

Молекулярная масса липазы, согласно данным электрофореза в присутствии ДСН, составила 63 кДа и соответствовала единственной белковой зоне в полиакриламидном геле. Это позволило утверждать, что данный ферментный препарат имеет субъединичную структуру и является мономером. В составе аминокислот преобладали аргинин (0,18 %), валин (0,104 %) и про-лин (0,314 %).

Для биотехнологии исследование рН- и термостабильности ферментов представляет определенный интерес. Наибольшую стабильность фермент прояв-

лял при величине рН 6,0 и температуре 30 °С. При температуре 15-20 °С и величине рН 4,5 - 5,0 сохранялось 65 - 70 % активности в течение 48 ч.

Определение субстратной специфичности липазы. Субстратом для липазы служат сложные эфиры жирных кислот и глицерина, представленные, главным образом, природными жирами, маслами. В качестве субстратов были испытаны эмульсии триглицеридов различных растительных масел и жиров.

Для количественной оценки способности липазы гидролизовать те или иные субстраты был проведен анализ кинетических параметров Кт и Vmax. Результаты проведенных исследований показали, что для описания процесса гидролиза используемых субстратов применимо уравнение Михаэлиса-Ментен. Константы Михаэлиса, Кт и максимальные скорости гидролиза, Vmax различных субстратов представлены в табл. 2.

Таблица 2

Значения кинетических параметров липазы Yarrowia lipolytica Y-1711 при

гидролизе различных субстратов

Субстрат Кш, ммоль/дм3 V,,,,, мкмоль/мин/дм3 на мг белка

Оливковое масло 11±0,65 0,70±0,04

Подсолнечное масло 12±0,52 0,80±0,05

Говяжий жир 3±0,16 2,20±0,12

Кукурузное масло 49±2,20 0,37±0,03

Льняное масло 16±0,77 0,50±0,03

Свиной жир 4±0,25 1,80±0,08

Горчичное масло 10±0,41 0,60±0,02

Касторовое масло 111±5,55 0,21±0,02

Куриный жир 9±0,37 0,80±0,04

Рыбий жир б±0,24 1,13±0,05

Результаты исследований показали, что наибольшее сродство липаза проявляла к жирам животного происхождения.

Таким образом, полученные физико-химические свойства, кинетические характеристики его субстратная специфичность, а также наличие проте-азной и каталазной активности, позволяет рекомендовать ферментный препарат «Липолитин Г10х» в технологии производства мясных изделий.

ГЛАВА IV. Выбор и обоснование стартовых культур для создания композиции

Изготовление сырокопченых колбас с использованием бактериальных культур сокращает продолжительность процесса, обеспечивает хорошую ферментацию и стабильность качества готового продукта, предотвращает возникновение дефектов, вызываемых нежелательными микроорганизмами, а также подавляет рост патогенных бактерий и выделение ими токсинов.

При подборе перспективной культуры или композиции культур необходимо учитывать следующие требования: культуры должны обладать антагонистическими свойствами по отношению к санитарно-показательной мик-

рофлоре, продуцировать молочную кислоту, жирные кислоты, карбонильные соединения и другие вещества, обусловливающие вкусовые и ароматические свойства продукта, иметь ограниченный протеолиз, продуцировать фермент катал азу.

Удачный выбор культур, обладающих указанными свойствами, обеспечивает ускорение процесса созревания и улучшение вкусовых свойств продукта. Для создания композиции были выбраны распространенные в продаже и используемые для лечения и профилактики микрофлоры желудочно-кишечного тракта культуры микроорганизмов: Lactobacillus casei, Staphy-lococcuc carnos, Bifidombacterium siccum, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Bifidombacterium bijidum.

Исследования проводили на модельном фарше (говядина жилованная высшего сорта 50 %, свинина жилованная нежирная 25 % и свинина жилованная жирная 25 %), предварительно активируя молочнокислые бактерии в теплой воде при температуре 30 °С с добавлением источников углеводов (глюкоза и лактоза в соотношении 1 : 1). Влияние концентраций поваренной соли на выживаемость клеток показано на рис. 6. В модельный фарш с молоч-

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

Массовая доля соли, %

Рис. 6. Выживаемость клеток микроорганизмов в зависимости от массовой доли соли: ] -Ь. р!ап[атт, 2- В. Ъф(1ит, 3 -Ь. Ьи^апсш, 4-5. сатоът, 5 -В. $1ссит, 6-1. саче\

Время, ч

Рис. 7. Изменение рН модельного фарша: 1 - L. plantarum, 2 - В. bifidum, 3 - L. bulgaricus, 4-5. carnosus, 5 -В. siccum , 6 - L. casei

нокислыми бактериями добавляли поваренную соль разной концентрации от 0 до 5 % к массе модельного фарша. Интерпретируя полученные результаты, можно сделать вывод, что L. р1аШагит обладает большей толерантностью к поваренной соли, чем все остальные микроорганизмы. L. Ьи^апсш более толерантен, чем Ь. сая&, а из бифидобактерий большая выживаемость клеток наблюдалось у В. bifldum по сравнению с клетками В. 5ксит.

Способность микроорганизмов снижать рН до 4, 8 - 5,0 среды при росте имеет практическое значение, так как помогает снизить обсемененность

колбасных изделий патогенной микрофлорой. Динамика изменения рН среды при культивировании микроорганизмов приведена на рис. 7.

Как видно из рис. 7, способностью снижать величину рН до 4,8 - 5,0 обладают следующие микроорганизмы: Ь. Ьи^апсиз, Ь. р1аМагит, В. ЫАс1ит, снижение величины рН до более низких значений приводит к подкислению мясного фарша.

Исходя из приведенных характеристик, из шести штаммов были выбраны три для создания композиции: Ь. Ьи^аггсш, Ь. р!аШагит, В. Ы/к1ит.

При изучении симбиотических свойств выбранных культур микроорганизмов, установлено, что взаимоотношения между исследуемыми штаммами молочнокислых бактерий не являются антагонистическими.

Существуют немногочисленные данные об активации молочнокислых бактерий ферментными препаратами. В этой связи в дальнейших исследованиях изучали влияние дрожжевой липазы на развитие молочнокислых бактерий в модельном фарше. В ходе ряда экспериментов было установлено, что внесение ферментного препарата «Липолитина ГЮх» к исследуемым молочнокислым бактериям сопровождался усиленным ростом бактерий. Так, через 24 часа в опытном образце общее количество молочнокислых бактерий составило 106, тогда как в контрольном образце (без ферментного препарата) -105.

В ходе создания композиции молочнокислых бактерий и «Липолитина ГЮх» были проведены исследования по поиску оптимальных соотношений выбранных компонентов. Установлено, что оптимальным соотношением всех компонентов является 1:1:1: 0,5, соответственно МКБ и «Липолитина ГЮх». При данном соотношении происходил равномерный рост микроорганизмов, наблюдалось оптимальное снижение рН, характерный для колбас цвет, аромат и вкус.

ГЛАВА V. Исследование возможности применения композиции молочнокислых бактерий и ферментного препарата липазы в технологии сырокопченых колбас

Исследование влияния массовой доли композиции на рН модельных фаршей. В процессе производства сырокопченых колбас контроль величины рН необходим по многим причинам. При равномерном снижении значения величины рН до 4,8 - 5,0 к 24 - 48 ч, создаются оптимальные условия для уплотнения консистенции колбас и быстрого равномерного высушивания батонов. Кроме того, при данном значении рН подавляется развитие в нем патогенных и токсикогенных бактерий.

В табл. 3 приведены результаты исследований по влиянию массовой доли композиции МКБ и «Липолитина ГЮх» на рН модельных фаршей.

Таблица 3

Динамика изменения рН в зависимости от вносимой дозировки композиции_

Дозировка композиции, % к массе сырья Величина рН в зависимости от продолжительности обработки, ч

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Контроль 6,35 6,05 6,0 5,95 5,70 5,65 5,45 5,45 5,45

0,2 6,35 6,15 6,00 5,95 5,65 5,50 5,35 5,20 5,40

0,4 6,35 6,10 5,95 5,85 5,65 5,45 5,30 5,00 5,00

0,6 6,35 6,00 5,80 5,60 5,45 5,35 5,20 5,00 5,00

0,8 6,35 5,90 5,70 5,55 5,40 5,20 5,15 5,00 4,90

1,0 6,35 5,85 5,40 4,90 4,80 4,80 4,75 4,70 4,70

1,2 6,35 5,5 5,35 4,85 4,80 4,80 4,75 4,70 4,70

Как видно из табл. 3, при массовой доле композиции 1,0 % требуемый уровень рН, равный 4,8, достигается уже через 24 ч, что существенно сокращает время производства сырокопченых колбас.

Исследование функционально-технологических показателей модельных фаршей. Основой эффективности любой биотехнологии является знание всех закономерностей изменения свойств применяемого сырья в ходе технологического процесса.

В технологии производства мясных продуктов, в частности сырокопченых колбас, наиболее значимыми параметрами являются функционально-технологические свойства: жиро-удерживающая (ЖУС), влагосвязы-вающая (ВСС), влагоудерживающая (ВУС) способности мясного сырья и его липкость. Представленные (рис. 8) параметры ЖУС показали, что ЖУС модельного фарша с добавлением композиции несколько выше по сравнению с контрольными пробами, очевидно, это объясняется действием ферментов: протеазы и липазы. Липкость играет важную роль в процессе формования изделий и косвенно характеризует способность образовывать монолитную структуру в процессе технологической обработки. Результаты экспериментальных исследований пока-

° без добавления композиции

6 с композицией

Рис. 8. Динамика изменения жироудерживающей способности

(ЖУС) модельного фарша

зали, что действие композиции МКБ и «Липолитина Г10х» существенно повышает липкость модельного фарша (рис. 9), из-за роста адгезионной способности. В технологии сырокопченых колбас необходимым условием, обеспечивающим нормальное протекание процесса сушки, является низкое значение ВСС и ВУС.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что разработанная композиция МКБ и «Липолитина Г10х» может быть успешно применена в технологии сырокопченых колбас, т.к. идет равномерное снижение рН, что способствует снижению ВСС и ВУС и в конечном итоге способствует эффективному удалению влаги при осадке и сушке сырокопченых колбас.

Оценка аромата модельного фарша с добавлением композиции. Качество мясных изделий в значительной степени определяется их вку-Рис. 9. Динамика изменения липкое™ сом и ароматом Специфический вкус и модельного Фарша

приятныи аромат сырокопченым колбасам придает образующийся в процессе их производства сложный комплекс химических веществ. Известно, что в сырокопченых колбасах ароматические летучие вещества образуются, главным образом, в результате действия про-теолитических и липолитических ферментов, микробиологических процессов, а также за счет компонентов коптильного дыма.

Использование стартовых культур в производстве сырокопченых колбас обусловлено тем, что в результате углеводного обмена микроорганизмов образуется молочная, пировиноградная, винная, уксусная кислоты, этанол и другие низкомолекулярные соединения, которые придают готовому продукту специфический вкус и аромат. Также важная роль в формировании аромата принадлежит продуктам расщепления жиров: жирным кислотам и карбонильным соединениям.

Для решения задач, связанных с исследованием особенности аромата, применен метод пьезокварцевого микровзвешивания с использованием 6-сенсорной матрицы.

На рис. 10 приведены кинетические «визуальные отпечатки» равновесных газовых фаз модельных фаршей, при сравнительном анализе которых установлено, что геометрия кинетических «визуальных отпечатков», характеризующая качественный состав смеси легколетучих соединений, опытного и контрольного образцов различна.

время, ч

в без добавления композиции ф с добавлением композиции

Площадь кинетических «визуальных отпечатков», характеризующая интенсивность аромата, в модельном фарше с МКБ и «Липолитином ПОх» увеличивается за счет появления новых ароматформирующих веществ и увеличении концентрация изначально присутствующих компонентов.

Таким образом, использование композиции МКБ способствует интенсификации процесса арома-тообразования, что является немаловажным при производстве сырокопченых колбас.

Модификация технологии и определение качественных показателей готового продукта. Создание высококачественных биологически ценных продуктов связано, прежде всего, с разработкой и модификацией технологического процесса производства с применением новых пищевых компонентов. За основу была выбрана рецептура и технология сырокопченой колбасы «Сервелат» (ГОСТ 16131-86).

На основе проведенных исследований нами была разработана и предложена технологическая схема производства сырокопченых колбас с использованием композиции (рис. 11).

Одним из важных показателей качества продукта является значение его пищевой и биологической ценности. В большинстве случаев изменение этих показателей зависит в первую очередь от состава сырья, его изменений в процессе внутренних биохимических процессов, внешних воздействий, а также за счет используемых аддитивов.

Для определения биологической ценности белков важным показателем является количество незаменимых аминокислот, входящих в состав готового изделия. Из данных табл. 4 видно, что по аминокислотному составу белков сырокопченая колбаса «Сервелат по-особенному» является полноценным продуктом, так как ее белки содержат полный набор незаменимых аминокислот.

Рис. 10. "Визуальный отпечаток" аромата:

1 - модельный фарш без добавления композиции 2- модельный фарш с добавлением композиции МКБ и «Ли-политина Г10х»

Рис. 11. Технологическая схема производства сырокопченой колбасы

Таблица 4

Аминокислотный состав разработанной сырокопченой колбасы

Наименование аминокислот Белок по шкале ФАО/ВОЗ Наименование образца

Контроль Опыт

Валин 5,00 5,42 5,53

Изолейцин 4,00 2,96 3,02

Лейцин 7,00 5,40 5,98

Лизин 5,50 6,40 6,54

Метионин+цистин 3,50 2,79 3,21

Треонин 4,00 4,22 4,32

Фенилаланин+тирозин 6,00 4,76 5,09

Триптофан 1,00 1,29 1,34

В табл. 5 представлены показатели пищевой и биологической ценности разработанной сырокопченой колбасы.

Таблица 5

Показатели биологической ценности сырокопченой колбасы

Наименование образца КРАС, % БЦ, % Коэффициент утилитарности

Сервелат по-особенному 19,8 80,2 0,805

Контроль 18,5 68,4 0,780

Для оценки биологической ценности вырабатываемой сырокопченой колбасы была исследована переваримость белков пищеварительными ферментами в опытах in vitro. Показатели переваримости системой пищеварительных ферментов «пепсин-трипсин» (in vitro) позволяют оценить скорость ферментативного гидролиза опытных образцов.

Данные рис. 12 показывают, что наибольшая скорость гидролиза белков ферментами желудочно-кишечного тракта наблюдалось в опытном образце. Это можно объяснить тем, что образуются высоко- и низкомолекулярные продукты гидролиза, более доступные действию пи-

пепсин

. * * '

контроль

-

трипсин

0 H-1-1-1-1-г

1 2 3 4 5 6

Продолжительность воздействия, ч

Рис. 12. Перевариваемость сырокопченой колбасы «Сервелат поособенному» системой пищеварительных ферментов «пепсин-титсин» fin vitro)

щеварительных ферментов.

Определение микробиологических показателей, проводили в соответствии с СанПин 2.3.2.1078-01 (табл. 6).

Таблица 6

Микробиологические показатели сырокопченой колбасы

Наименование показателя Характеристика

МАФАМ, кое/г 4,5х104

Бактерии группы кишечных палочек в 0,0001 г продукта Отсутствуют

Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы в 25 г продукта Отсутствуют

Данные табл. 6 свидетельствуют о доброкачественности и положительно характеризуют сырокопченую колбасу для питания человека.

Решающее значение для формирования потребительского восприятия продукта имеет органолептическая характеристика.

Сенсорная оценка, выраженная цифровыми значениями по 9-бальной системе, представлена в табл. 7.

Таблица 7

Органолептические показатели сырокопченой колбасы

Показатель

Наименование образца Внешний вид Вид и цвет на разрезе Запах Вкус Консистсн- | Ш'.Я Сочность Общая оценка

Контроль 7,5 6,2 7,0 7,7 7,4 5,9 7,0

Опыт 8,8 7,8 8,8 8,7 7,8 8,0 8,4

Результаты целого комплекса исследований, проведенных в данной диссертационной работе, показали, что применение композиции молочнокислых бактерий и ферментного препарата «Липолитин Г10х» позволит интенсифицировать технологический процесс и повысить качество готовой продукции, что свидетельствует о целесообразности применения композиции в технологии сырокопченых колбас.

ВЫВОДЫ

1. Оптимальными условиями биосинтеза липазы дрожжами Уаггота Нро1уйса Г1711 являются: время 72 часа, температура 37 °С, величина рН среды 7,5. Установлено, что замена дорогостоящего оливкового масла в со-

ставе среды на отход масложировото производства - соапсток (8 %) позволяет увеличить синтез целевого фермента на 20-25 %.

2. Разработан эффективный способ выделения и очистки дрожжевой липазы, позволяющий получить гомогенный ферментный препарат с удельной активностью 5000 Е/мг белка. Установлено, что фермент имеет субъединичную структуру и является мономером с молекулярной массой 63 кДа.

3. Исследование физико-химических свойств липазы и ее субстратной специфичности показало, что наибольшую стабильность фермент проявляет при рН 6,0 и температуре 30 °С. При 15 - 20 °С и величине рН 4,5 липаза сохраняла 65 - 70 % активности в течение 48 ч и проявляла наибольшую специфичность к жирам животного происхождения, что свидетельствует о возможности ее применения в технологии производства мясных изделий.

4. Выбран и обоснован состав композиции стартовых культур для производства сырокопченых колбас. Показано, что композиция, включающая Ь. Ьи^апсия, Ь. р1аШагит, В. В 'фс1ит, характеризуется высоким содержанием жизнеспособных клеток, высокой кислотообразующей способностью, устойчивостью к поваренной соли, симбиотическими взаимоотношениями.

5. Установлено, что внесение ферментного препарата «Липолитин Г10х» к исследуемым молочнокислым бактериям стимулирует их рост: через 24 часа в опытном образце общее количество молочнокислых бактерий составило 10е, тогда как в контрольном (без ферментного препарата) - 105, и способствует снижению рН до оптимальной величины 4,8 - 5,0 за 24 - 48 ч, что существенно сокращает продолжительность процесса созревания мясного фарша.

6. Различная геометрия кинетических «визуальных отпечатков» и увеличение их площади в модельном фарше с композицией из стартовых культур и дрожжевой липазой свидетельствуют о появлении новых аромат-формирующих веществ и увеличении концентрации изначально присутствующих компонентов, что указывает на интенсификацию процесса аромато-образования.

7. Выявлено положительное влияние композиции стартовых культур и «Липолитина Г10х» на органолептические, физико-химические, структурно-механические, микробиологические характеристики и биологическую ценность готового продукта. Применение композиции ускоряет протекание биохимических процессов, интенсифицирует процесс осадки, повышает содержание летучих жирных кислот, свободных аминокислот, улучшая вкус и аромат колбас, что свидетельствует о целесообразности применения композиции в технологии сырокопченых колбас.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Корнеева, О.С. Биосинтез и свойства дрожжевой липазы Yarrowia lipolytica Y-1711 [Текст] / О.С. Корнеева, Е.А. Мотина, B.C. Капранчиков // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2008. - № 8. - С. 52-55.

2. Корнеева, О. С. Идентификация каталитически активных групп липазы зародышей семян пшеницы [Текст] / О. С. Корнеева, Т. Н. Попова, В. С. Капранчиков, Е. А. Мотина // Прикладная биохимия и микробиология. - 2008. - № 4. - С. 387-393.

3. Мотина, Е. А. Применение ионнообменной хроматографии как основного этапа в процессе очистки липазы штамма Yarrowia lipolytica Y-1711 [Текст] / Е. А. Мотина, О. С. Корнеева, ]А. Н. Ивентьев, В. С. Капранчиков //

Сорбционные и хроматографические процессы. - 2007. - Т. 7, вып. 3. -С. 485-488.

Статьи и материалы конференций

1. Корнеева, О. С. Новые подходы к изучению микробных липаз [Текст] / О. С. Корнеева, В. С. Капранчиков, Е. А. Мотина // Материалы XLIII отчет, науч. конф. за 2004 - 2005 г. - Воронеж : ВГТА, 2005. - 4.1. -С. 94.

2. Корнеева, О. С. Перспективы применения липаз в пищевой промышленности [Текст] / О. С. Корнеева, В. С. Капранчиков, Е. А. Мотина // Сб. науч. тр. Вып. 15. Модернизация существующего и разработка новых видов оборудования для пищевой промышленности. - Воронеж : ВГТА, 2005. -С. 74.

3. Мотина, Е. А. Исследование биосинтетической активности Yarrowia lipolytica [Текст] / О. С. Корнеева, Е. А. Мотина, В. С. Капранчиков // Материалы XLIV отчет, науч. конф. за 2005 - 2006 г. - Воронеж : ВГТА, 2006. -Ч. 1.- С. 76-77.

4. Корнеева, О. С. Липазы дрожжей Yarrowia lipolytica 34088: биосинтетическая активность, свойства [Текст] / О. С. Корнеева, В. С. Капранчиков, Е. А. Мотина // Материалы V-й Межд. науч.-техн. конф. Техника и технология пищевых производств. - Могилев, 2006. - С. 124.

5. Мотина, Е. А. Биосинтез липазы Yarrowia lipolytica [Текст] / Е. А. Мотина, О. С. Корнеева, В. С. Капранчиков// Сбор. тез.в 10-ой Пущин-ской школы-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2006. - С. 385.

6. Перов, С. Н. Очистка сточных вод от белково-жировых компонентов [Текст] / С. Н. Перов, О. С. Корнеева, Е. А. Мотина // Сборник тезисов 10-ой Пущинской школы-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века». -Пущино, 2006. - С. 388.

7. Корнеева, О. С. Использование липазы Yarrowia lipolytica W 29 для утилизации отходов масложировой промышленности [Текст] / О. С. Корнеева, Е. А. Мотина, В. С. Капранчиков, Т. В. Тарасевич // Успехи современного естествознания. - Барселона, 2006. - № 10. - С. 75 - 76.

8. Корнеева, О. С. Ферменты микробного происхождения и их применение в пищевой промышленности [Текст] / О. С. Корнеева, В. С. Капранчиков, О. Ю. Божко, Е. А. Мотина, С. Н. Перов // Материалы VII межд. форума «Биотехнология и современность». - СПб, 2006. - С. 43 - 44.

9. Мотина, Е. А. Биотрансформация жиров липазой дрожжей Yarrowia lipolytica [Текст] / Е. А. Мотина, О. С. Корнеева, В. С. Капранчиков, О. А. Еремина // Материалы Всерос. Конф. молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии». - Казань, 2006. - С. 30.

10. Корнеева, О. С. Изучение биосинтетических свойств липазы дрожжей Yarrowia lipolytica [Текст] / О. С. Корнеева, В. С. Капранчиков, Е. А. Мотина // Сб. научн. тр. Модернизация существующего и разработка новых видов оборудования для пищевой промышленности. - Воронеж : ВГТА, - 2006. -С. 52.

11. Корнеева, О. С. Влияние условий культивирования дрожжей Yarrowia lipolytica [Текст] / О. С. Корнеева, В. С. Капранчиков, Е. А. Мотина //Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегиональный сб. науч. работ. - Воронеж : ВГУ, 2006. - Вып. 8. - С. 167- 169.

12. Мотина, Е. А. Липолитическая активность Yarrowia lipolytica [Текст] / Е. А. Мотина, О. С. Корнеева, В. С. Капранчиков // Материалы Всероссийской научной молодежной конференции с международным участием «Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов». - Улан-Удэ, 2006 - С. 11.

13. Мотина, Е. А. Оптимизация процесса биосинтеза липазы Yarrowia lipolytica Y 1711 [Текст] / Е. А. Мотина, О. С. Корнеева, Т. В. Тарасевич // Материалы IX международной конференции «Наукоемкие химические технологии - 2006». - Самара, 2006. С. 150-151.

14. Божко, О. Ю. Применение продуктов микробного синтеза в пищевой промышленности и биотехнологии [Текст] / О. Ю. Божко, О. С. Корнеева, И. В. Черемушкина, Т. В. Свиридова, Н. А. Чигирина, В. С. Капранчиков, Е. А. Мотина, Т. И. Фурсова// Материалы Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». -Москва 2007. - Ч. 2. - С. 176.

15. Ивентьев, А. Н.| Применение ионообменной хроматографии как основного этапа в процессе очистки изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici и липазы Yarrowia lipolytica / А. Н. Ивентьев|, О. С. Корнеева, В. С. Капранчиков, Е. А. Мотина, О. Ю. Божко // VIII Всероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии». - Казань, 2007. -С. 197.

16. Корнеева, О. С. Получение и очистка ферментного препарата липазы Yarrowia lipolytica Y-1711 [Текст] / О. С. Корнеева, Е. А. Мотина,

A. Н. Ивентьев|, В. С. Капранчиков // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. - Воронеж : ВГУ, 2007 . - С. 120-125 .

17. Мотина, Е. А. Разработка условий получения сырокопченых колбас с использованием консорциума микроорганизмов [Текст] / Е. А. Мотина,

B. С. Капранчиков, А. Н. Ивентьев| // Материалы XLVI отчетной научной конференции за 2007 - 2008 г. - Воронеж : ВГТА, 2008. - Ч. 1. - С. 64-65.

18. Мотина, Е. А. Липазы дрожжей Yarrowia lipolytica Y-1711: физико-химические свойства и кинетические параметры [Текст] / Е. А. Мотина, О. С. Корнеева, В. С. Капранчиков, П. С. Репин // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. - Воронеж : ВГУ, 2008. - С. 176-181.

19. Репин, П. С. Подбор оптимальных условий гидролиза отходов мас-ложировой отрасли [Текст] / П. С. Репин, О. С. Корнеева, И. В. Попова, Т. В. Тарасевич, Е. А. Мотина // Материалы XLVII отчетной научной конференции за 2008 - 2009 г. - Воронеж : ВГТА, 2009 - Ч. 1. - С. 182.

20. Мотина, Е. А. Биотехнология липазы дрожжей Yarrowia lipolytica Y-1711 [Текст] / Е. А. Мотина, В. С. Капранчиков, П. С. Репин // Материалы III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности». - Воронеж : ВГТА, 2009 - Т. 2. - С. 49 -50.

Подписано в печать 27.11.2009. Формат 60 х 84 1/16 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 120 экз. Заказ № 466

ГОУВПО «Воронежская государственная технологическая академия» (ГОУВПО «ВГТА») Отдел полиграфии ГОУВПО «ВГТА» Адрес академии и отдела полиграфии: 394036, Воронеж, пр. Революции, 19

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Продуценты микробных липаз и их характеристики.

1.2 Факторы, влияющие на биосинтез липазы при культивировании продуцентов.

1.3 Получение очищенных препаратов липазы и их физико-химические свойства.

1.4 Практическое применение препаратов микробной липазы.

1.5. Использование микроорганизмов в мясной промышленности.

1.6. Применение стартовых культур в технологии мясных продуктов.

1.6.1 Характеристика и свойства стартовых культур.

1.7 Взаимодействие дрожжей и стартовых культур.

Глава 2. Объекты, материалы и методы исследований.

2.1 Схема экспериментальных исследований.

2.2 Объекты исследований.

2.2.1 Оживление чистой культуры.

2.2.2 Культивирование дрожжей Yarrowia lipolytica

Y-1711.

2.3 Методы определения активности липазы.

2.4 Подбор субстратов.

2.5 Аминокислотный анализ.

2.6 Общие биохимические и микробиологические методы исследования.

2.7 Выделение и очистка ферментного препарата.

2.8 Определение молекулярной массы.

2.9 Физико-химические методы исследования мясного сырья.

2.10 Оценка биологической ценности продуктов.

2.11 Специальные методы исследования.

Глава 3. Получение ферментного препарата липазы и исследование его физико-химических свойств.

3.1 Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез липазы.

3.2 Выбор условий культивирования Yarrowia lipolytica Y-1711.

3.3 Разработка условий получения очищенного ферментного препарата липазы.

3.4 Молекулярная масса и аминокислотный состав молекулы липазы.

3.5 Исследование влияния рН и температуры на активность липазы.

3.6 Исследование влияния рН и температуры на стабильность липазы.

3.7 Определение субстратной специфичности липазы.

Глава 4. Выбор и обоснование стартовых культур для создания композиции

4.1 Подбор видов микроорганизмов для создания композиции.

4.2 Изучение возможности совместного использования микроорганизмов различных видов.

4.3 Подбор оптимальных соотношений молочнокислых бактерий и ферментного препарата.

Глава 5. Исследование возможности применения композиции молочнокислых бактерий и ферментного препарата липазы в технологии сырокопченых колбас

5.1 Исследование влияния массовой доли консорциума микроорганизмов на рН модельных фаршей.

5.2 Исследование функционально-технологических показателей ферментированных модельных фаршей.

5.3 Оценка аромата модельного фарша с добавлением композиции.

5.4 Определение общего микробного числа модельного фарша.

5.5 Модификация технологии и определение качественных показателей готового продукта.

Выводы.

Колбасные изделия традиционно пользуются высоким потребительским спросом. В настоящее время при постоянно нарастающей конкуренции актуальной проблемой является разработка и внедрение новых технологий, ориентированных на интенсификацию комплекса сложных биохимических превращений, которые протекают в мясном сырье при производстве колбасных изделий, и позволяющих выработать продукты со специфическим вкусом и ароматом.

Одним из путей решения такой проблемы является биотехнологический принцип модификации мясного сырья - направленное регулирование хода биохимических, физико-химических и микробиологических процессов, в результате которых формируется структура, цвет и вкусоароматиче-ские характеристики готового продукта.

Действие микроорганизмов связано с их способностью продуцировать в мясе специфические биологически активные вещества: органические кислоты, бактериоцины, ферменты, витамины, что способствует улучшению санитарно-микробиологических, органолептических показателей готового продукта, а также позволяет интенсифицировать технологический процесс.

Пути улучшения вкусовых и ароматических свойств мясных продуктов, ускорения процесса созревания и подавления роста нежелательной микрофлоры разрабатывались рядом ученых: JI. В.Антиповой, В. М. Бонда-ренко, В. Б. Крыловой, JI. С. Кудряшовым, И. А. Роговым, Н. Г. Машенце-вой, Э. Шиффнером и другими отечественными и зарубежными учеными.

В мясной промышленности до последнего времени использовали штаммы микроорганизмов молочнокислых бактерий и микрококков. Доминирующим критерием отбора микроорганизмов в качестве стартовых культур во всем мире служит их степень влияния на вкусоароматические характеристики готового продукта в условиях интенсификации технологий производства мясопродуктов.

Молочнокислые бактерии обладают исключительно лабильным метаболизмом, способны приспосабливаться к изменению среды благодаря вариабельному приспособительному обмену. При внесении их в колбасный фарш в виде бактериальных заквасок продукты метаболизма этих бактерий формируют, в том числе, аромат изделия.

Важная роль в формировании аромата мясных продуктов принадлежит ферментации жиров, в процессе которой образуются ди- и моноглице-риды, летучие жирные кислоты (уксусная, масляная, капроновая и др.) и продукты их распада (альдегиды, кетоны, метилкетоны, эфиры, спирты). Данный процесс осуществляется микрококками, лактобациллами, дрожжами, синтезирующими липолитические и другие ферменты, участвующие в превращениях жиров.

Образующиеся летучие низкомолекулярные жирные кислоты могут окисляться до перекисей, которые под действием каталазной активности микрококков превращаются в карбоксильные соединения, способствующие вкусообразованию продукта.

На основании вышеизложенного следует, что включение липазы в консорциум микроорганизмов для созревания сырокопченых колбас является весьма перспективным с точки зрения создания характерного вкуса, цвета, аромата и консистенции данного вида продукта. Перспективность такого рода исследований объясняется и тем, что липолитические и протеоли-тические ферменты принимают участие также в ускорении созревания колбас. Однако в отечественной практике такие исследования практически отсутствуют. Поэтому вопросы, связанные с практическим применением липазы в технологии сырокопченых колбас, вызывают значительный интерес.

В связи с этим целью диссертационной работы является обоснование и разработка технологии производства сырокопченых колбас с применением композиции из стартовых бактериальных культур и липолитических ферментов.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

• исследование условий биосинтеза липазы Yarrowia lipolytica Y-1711;

• разработка эффективного способа выделения и очистки ферментного препарата липазы, определение физико-химических свойств и субстратной специфичности фермента;

• выбор и обоснование целесообразности использования композиции из бактериальных стартовых культур и липазы для производства сырокопченых колбас;

•исследование влияния технологических параметров на активность композиции из стартовых культур и липазы;

• исследование изменения аромата модельного фарша с использованием композиции стартовых культур и ферментного препарата липазы;

• определение условий и обоснование режимов производства сырокопченой колбасы с применением липазы и стартовых культур микроорганизмов; оценка качественных показателей готового мясного изделия;

•разработка проекта нормативной документации на композицию из стартовых культур микроорганизмов и липазы и производственная апробация технологии.

выводы

1. Оптимальными условиями биосинтеза липазы дрожжами Yarrowia lipolytica Y1711 являются: время 72 часа, температура 37 °С, величина рН среды 7,5. Установлено, что замена дорогостоящего оливкового масла в составе среды на отход масложирового производства - соапсток (8 %) позволяет увеличить синтез целевого фермента на 20-25 %.

2. Разработан эффективный способ выделения и очистки дрожжевой липазы, позволяющий получить гомогенный ферментный препарат с удельной активностью 5000 Е/мг белка. Установлено, что фермент имеет субъединичную структуру и является мономером с молекулярной массой 63 кДа.

3. Исследование физико-химических свойств липазы и ее субстратной специфичности показало, что наибольшую стабильность фермент проявляет при рН 6,0 и температуре 30 °С. При 15 - 20 °С и величине рН 4,5 липаза сохраняла 65 - 70 % активности в течение 48 ч и проявляла наибольшую специфичность к жирам животного происхождения, что свидетельствует о возможности ее применения в технологии производства мясных изделий.

4. Выбран и обоснован состав композиции стартовых культур для производства сырокопченых колбас. Показано, что композиция, включающая L. bulgaricus, L. plantarum, В. Bifidum, характеризуется высоким содержанием жизнеспособных клеток, высокой кислотообразующей способностью, устойчивостью к поваренной соли, симбиотическими взаимоотношениями.

5. Установлено, что внесение ферментного препарата «Липолитин Г10х» к исследуемым молочнокислым бактериям стимулирует их рост: через 24 часа в опытном образце общее количество молочнокислых бактерий составило 10б, тогда как в контрольном (без ферментного препарата) — 105, и способствует снижению рН до оптимальной величины

4,8 - 5,0 за 24 - 48 ч, что существенно сокращает продолжительность процесса созревания мясного фарша.

6. Различная геометрия кинетических «визуальных отпечатков» и увеличение их площади в модельном фарше с композицией из стартовых культур и дрожжевой липазой свидетельствуют о появлении новых ароматформирующих веществ и увеличении концентрации изначально присутствующих компонентов, что указывает на интенсификацию процесса ароматообразования.

7. Выявлено положительное влияние композиции стартовых культур и «Липолитина Г10х» на органолептические, физико-химические, структурно-механические, микробиологические характеристики и биологическую ценность готового продукта. Применение композиции ускоряет протекание биохимических процессов, интенсифицирует процесс осадки, повышает содержание летучих жирных кислот, свободных аминокислот, улучшая вкус и аромат колбас, что свидетельствует о целесообразности применения композиции в технологии сырокопченых колбас.

1. Авдеева, Л. В. Биохимия Текст. / Л. В. Авдеева. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 759 с.

2. Адлер, Ю. П. Управление качеством Текст. / Ю. П. Адлер. М. : МИСиС, 2000.- 163 с.

3. Алана, Р. Переработка мяса птицы Текст. / пер. с анг. В. В. Гущина. -Санкт-Петербург : Профессия. 2007. — 430 с.

4. Андреенков, В. А. Отечественные добавки для производства колбас салями Текст. / В. А. Андреенков, Л. В. Алехина, Л. Ф. Митасева, Л.А. Пыльцова, О. И. Сергиенко, С. М. Мухина, С. А. Рыжков // Мясная индустрия. 2002. - № 8. - С. 27-28.

5. Антипова, Л. В. Методы исследования мяса и мясных продуктов Текст. / Л. В. Антипова, И. А. Глотова, И. А. Рогов. М. : Колос, 2001.- 376 с.

6. Антипова, Л. В. Прикладная биотехнология Текст. : учеб. пособие / Л. В. Антипова, И. А. Глотова, А. И. Жаринов. Воронеж : Изд-во Воронеж, гос. технол. акад., 2000. - 332 с.

7. Афанасов, Э. Э Аналитические методы описания технологических процессов мясной промышленности Текст. / Э. Э. Афанасов, Н. С. Николаев, И. А. Рогов, С. А. Рыжов. М. : Мир, 2003. - 183 с.

8. Бабьева, И. П. Биология дрожжей Текст. / И. П. Бабьева, И. Ю. Чернов. М.: Товарищество науч. изд. КМК, 2004. - 221 с.

9. Безбородов, А. М. Ферментативные процессы в биотехнологии Текст. / А. М. Безбородов, Н. А. Загустина, В. О. Попов. М. : Наука, 2008. - 334 с.

10. Беккер, Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика: методы хроматографии и капиллярного электрофореза Текст. / Ю. Беккер. -М. : Техносфера , 2009. 470 с.

11. Беленький, Б. Г. Высокоэффективный капиллярный электрофорез Текст. / Б. Г. Беленький. Санкт-Петербург : Наука, 2009. - 314 с.

12. Белькова, Н. Л. Введение в молекулярную экологию микроорганизмов Текст. / Н. JI. Белькова, А. М. Андреева. М. : Российская академия наук, 2009. - 91 с.

13. Белякова, JI. Д. Газовая хроматография Текст. / JI. Д. Белякова, О. Г. Ларионов. Самара : Универс-групп , 2007. - 10 с.

14. Березов, Т. Т. Биологическая химия Текст. / Т. Т. Березов, Б. Ф. Ко-ровкин. М.: Медицина , 2008. - 703 с.

15. Бобренева, И. В. К вопросу о создании лечебно-профилактических продуктов питания Текст. / И. В. Бобренева // Мясная индустрия. — 2003. -№1. С. 16-19.

16. Борисова, С. В. Дрожжи и их использование в промышленности Текст. / С. В. Борисова, О. А. Решетник, 3. Ш. Мингалеева. Казань. : Новое знание, 2007. - 299 с.

17. Брокерхофф, X. Липолитические ферменты Текст. / X. Брокерхофф, Р. Дженсен. М. : Мир, 1978. - 400 с.

18. Вецозола, А. О. Биосинтез липазы культурой Candida paralipolytica 739 Текст. : автореферат дис. .канд. биол. наук / А. О. Вецозола. -М., 1984.-21 с.

19. Винаров, А. Ю. Лабораторные и промышленные ферменты Текст. / А. Ю. Винаров, А. А. Кухаренко В. И. Панфилов. М. : Рос. химико-технол. ун-т им. Д.И. Менделеева, 2004. - 97 с.

20. Виноградова, Н. И. Тонкослойная хроматография Текст. / Н. И. Виноградова. -М.: МосУ МВД России , 2008. 23 с.

21. Войцековская, С. А. Биохимия и основы биорегуляции организмов. Биологическая химия. Молекулярная биология. Белки и нуклеиновые кислоты Текст. / С. А. Войцековская. Томск : Том. гос. пед. ун-т, 2009. - 75 с.

22. Воронова, Т. Д. Ферменты: строение, свойства и применение Текст. / Т. Д. Воронова, Н. А. Погорелова. Омск : Изд-во ФГОУ ВПО Ом-ГАУ ,2006. - 119 с.

23. Габараев, А. Н. Дрожжи и мицеальные грибы в производстве мясных продуктов Текст. / А. Н. Габараев, Н. Г. Машенцева, М. А. Лобач, О. В. Семина, Н. Г. Винокурова // Мясная индустрия 2006. - № 9. -С. 32-34.

24. Ганина, В. И. Техническая микробиология продуктов животного происхождения Текст. / В. И. Ганина, Н. С. Королева, С. А. Фильчакова. М.: ДеЛи принт, 2008. - 351 с.

25. Ганина, В. И. Пробиотики. Назначение, свойства и основы биотехнологии Текст. / В. И. Ганина. М.: МГУПБ, 2001.- 169 с.

26. Гельдыш, Т. Г. Биохимическое обоснование использования сухого белкового полуфабриката Текст. / Т. Г. Гельдыш // Мясная идустрия. 2002. - № 7.- С. 34-36.

27. Глазунова, JI. М. Обзорная информация. Получение и применение ферментов, витаминов, аминокислот, премиксов. Липазы микроорганизмов. Текст./ Л. М. Глазунова, Ю. И. Гончаров, В. С. Минина. М. : ОНТИ-ТЭИмикробоипром, 1984. - 28 с.

28. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение Текст. / Б. Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир, 2002. - 589 с.

29. Горлов, И. Ф. Современные аспекты создания мясных изделий общего и лечебно-профилактического назначения Текст. / И. Ф. Горлов // Мясная индустрия. 1997. - № 8. - С. 5-6.

30. ГОСТ 9959-91. Продукты мясные. Общие условия проведения орга-нолептической оценки Текст. -М. : Изд-во стандартов, 1992. 14 с.

31. ГОСТ Р 51331-99 Продукты молочные. Йогурты. Общие технические условия. Текст. М.: Изд-во стандартов, 2001. — 21 с.

32. ГОСТ Р 51479-99 Мясо и мясные продукты. Метод определения массовой доли влаги Текст. М. : Изд-во стандартов, 2000. -18 с.

33. Грачев, С. В. Научные исследования в биомедицине Текст. / С. В. Грачев, Е А. Городнова, А. М. Олферьев. М. : МИА, 2005. -207 с.

34. Грачева, И. М. Технология ферментных препаратов Текст. : учебник для студ. вузов (гриф УМО) / И. М. Грачева, А. Ю. Кривова // 3-е изд., перераб. и доп. М.: Элевар, 2000. - 512 с.

35. Грень, А. И. Химия вкуса и запаха мясных продуктов. Текст. / А.И. Грень, Л.Е. Высоцкая, Т.В. Михайлова. Киев : Наук, думка, 1995. - 100 с.

36. Грибакин, С. Г. Пребиотики против пробиотиков? Текст. / С. Г. Грибакин // Вопросы детской диетологии. 2003. - Т. 1. -С. 71-74.

37. Жаринов, А. И. Пищевая биотехнология Текст. / А. И. Жаринов. М. : Вестник РАСХН, 2007 - 476 с.

38. Жеребцов, Н. А. Биохимия Текст. : учебник / Н. А. Жеребцов, Т. Н. Попова, В. Г. Артюхова Воронеж : Издательство Воронежского государственного университета, 2002. - 696 с.

39. Исаев, В. А. Жирные кислоты в оптимизации питания Текст. / В. А. Исаев, А. Н. Кудров. М. : Мир и Согласие, 2009. - 39 с.

40. Капранчиков, B.C. Липазы зародышей семян пшеницы: препаративное получение, свойства и регуляция активности Текст. : автор, дис. . канд. биол. наук. Воронеж : ВГУ, 2003. - 23 с.

41. Каширская, Н. Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции нормальной микрофлоры. Текст. / Н. Ю. Каширская // РМЖ, 2000. - С. 13-14.

42. Квасников, Е. И. Дрожжи. Биология. Пути использования / Е. И. Квасников, И. Ф. Щелкова; АН УССР. Ин-т микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного. Киев : Наук, думка, 1991. -328 с.

43. Кольман, Я. Наглядная биохимия Текст. / Я. Кольман, К. Г. Рем. -М. : Мир, 2004. 469 с.

44. Корнеева, О. С. Карбогидразы: препаративное получение, структура и механизм действия на олиго- и полисахариды Текст. / О. С. Корнеева. -Воронеж, 2001.- 183 с.

45. Коросов, А. В. Специальные методы биометрии Текст. / А. В. Коро-сов. Петрозаводск : Издательство ПетрГУ , 2007 - 363 с.

46. Костенко, Ю.Г. Новые виды сырокопченых изделий Текст. / Ю. Г. Костенко, Д. А. Текутьева, А. И. Жаринов, Н. А. Соколова // Мясная индустрия. 2000. - № 2. - С. 25-26.

47. Краснов, В. В. Микрофлора кишечника и иммунитет Текст. / В. В. Краснов. Н. Новгород : Изд-во НГМА, 2003. - 45 с.

48. Крючкова, И. В. Микробиология молочных продуктов Текст. / И. В. Крючкова. Хабаровск : РИЦ ХГАЭП, 2007. - 80 с.

49. Кучменко, Т. А. Применение метода пьезокварцевого микровзвешивания в аналитической химии Текст. / Т. А. Кучменко; Воронеж, гос. технол. акад. Воронеж, 2001. - 280 с.

50. Лапина, Г. П. Пероксидазы растений и гидролазы: структурные и ре-гуляторные свойства Текст. / Г. П. Лапина. Тверь : ТГУ, 2009. -114 с.

51. Лисицын, А. Б. Функциональные продукты на мясной основе путь к оздоровлению населения России Текст. / А. Б Лисицын, И. М. Чернуха // Мясная индустрия. - 2003. - №1. - С. 12-15.

52. Марковская, Г. К. Микробиология пищевых производств Текст. / Г. К. Марковская. Самара : СГсхА, 2004. - 121 с.

53. Машенцева, Н. Г. Функциональные стартовые культуры в мясной промышленности Текст. / Н. Г. Машенцева, В. В. Хорольский. М. : ДеЛи, 2008. - 336 с.

54. Медведева, М. В. Электрофорез в полиакриламидном геле Текст. / М. В. Медведева, Н. В. Мает . Москва. : МАКС Пресс , 2008. - 28 с.

55. Мурадова, Е. О. Микробиология Текст. / Е. О. Мурадова, ^К.-Вт-Ткаченко^--М.:-Эксмо,2009-334-с.—— —

56. Немова, Н. Н. Протеолитические ферменты Текст. / Н. Н. Немова, JL А. Бондарева. Петрозаводск : РИО Карельского НЦ РАН, 2005. -90 с.

57. Нетрусов, А. И. Микробиология Текст. / А. И. Нетрусов, И. Б. Кото-ва. М. : Академия, 2009. - 350 с.

58. Нефедова, Н. В. Ферментированные пищевые добавки и их использование в мясных продуктах Текст. / Н. В. Нефедова. // Известия вузов. Пищевая Биотехнология. 2003. - № 2-3. - С. 18-19.

59. Нечаев, А. П. Пищевая химия Текст. / А. П. Нечаев, С. Е. Траубенберг, А. А. Кочетов. СПб.: ГИОРД, 2001. - 592 с.

60. Нечаев, А. П. Технология пищевых продуктов Текст. / А. П. Нечаев. -М.: Колос, 2008. 766 с.

61. Онищенко, Г. Г. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии Текст. / Г. Г. Онищенко. М. : ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ , 2002. - 607 с.

62. Перкель, Т. П. Физико-химические и биохимические основы производства мяса и мясных продуктов Текст. / Т. П. Перкель. Кемерово. : КТИПП, 2004. - 100 с.

63. Пилат, Т. JI. Биологически активные добавки к пище (теория, производство, применение) Текст. / Т. Л. Пилат, А. А-. Иванов.- М. : Ав-валлон, 2002.-710 с.

64. Позняковский, В. М. Использование витаминов при производстве мясных продуктов Текст. : обз. инф. / В. М. Позняковский, А. Н. Богатырев, В. Б. Спиричев. М. : АгроНИИТЭИММП, 1996. - 24 с.

65. Покровский, А. А. Разработка новых продуктов повышенной биологической ценности важнейшая задача науки о питании Текст. / А. А. Покровский // Клинические и экспериментальные аспекты диетологии. - М. : Медицина. - 1991. - С. 14-20.

66. Пономарев, В. Я. Биотехнологические основы применения препаратов микробиологического синтеза для обработки мясного сырья с пониженными функционально-технологическими свойствами Текст. / В. Я Пономарев. Казань : КГТУ, 2009. - 190 с.

67. Рогов, И. А. Химия пищи Текст. В 2 кн. Кн. Белки: структура, функции, роль в питании / И. А. Рогов, JI. В. Антипова, Н. И. Дунченко, Н. А. Жеребцов. М.: Колос, 2000. - 384 с.

68. Рогов, И. А. Химия пищи. Принципы формирования качества мясопродуктов Текст. / И. А. Рогов, А. И. Жаринов, М. П. Воякин. -Санкт-Петербург : Изд-во РАПП, 2008. 338 с.

69. Рогов, И. А.Современные подходы к созданию мясных изделий общего и лечебно-профилактического назначения Текст. / И. А. Рогов, Е. И. Титов, В. А. Алексахина, Н. Г. Кроха, JI. Ф. Митасева // Мясная промышленность. — 1994. № 2. — С. 7.

70. Рубина, Е. И. Микробиология, физиология питания, санитария Текст. / Е. А. Рубина, В. Ф. Малыгина. М. : Форум, 2008. - 238 с.

71. Сарафанова, JI. А. Современные пищевые ингредиенты. Особенности применения Текст. / JI. А. Сарафанова. Санкт-Петербург : Профессия, 2009. - 205 с.

72. Сафронова, М. И. Основы практической биохимии белка Текст. / М. И. Сафронова Москва. : МАКС пресс, 2009. - 87с.

73. Синеокий, С. П. Разработка эффективных продуцентов липаз и новые технологии их использования / С. П. Синеокий // В мире науки. 2006. -№ 7. - С. 11-13.

74. Слюсаренко, Т. П. Лабораторный практикум по микробиологии и пищевых производств Текст. / Т.П. Слюсаренко. М. : Легкая промышленность. 1984. - 208 с.

75. Смагунова, А. Н. Методы математической статистики в аналитической химии Текст. / А. Н. Смагунова. Иркутск : Изд-во Иркутского гос. ун-та, 2008-339 с.

76. Сысоев, В. В. Введение в линейное программирование. Методические указания по курсу «Математические методы и модели в расчетах на ЭВМ» Текст. / В. В. Сысоев; Воронеж, технол. ин-т. Воронеж, 1990. - 27 с.

77. Титов, С.А. Стабилизация цветности комбинированных колбас с использованием препаратов пищевых кислот Текст. / С. А. Титов, А. С. Пешков, А. В. Соколов // Мясная индустрия. 2003. - № 9. - С. 32-34

78. Тюкавкина, С. Ю. Санитарная микробиология Текст. / С. Ю. Тюкав-кина, О. И. Сылка, Т. Д. Гасретова. Ростов-на-Дону : РостГМУ, 2009. - 79 с.

79. Хавкин, А. И. Микроэкология кишечника: методы неспецифической коррекции Текст. / А. И. Хавкин, С. В. Бельмер. РМЖ 2003.- № 13 - С. 185.

80. Хвыля, С. И. Использование полисахаридов в мясных изделиях для детского и лечебно-профилактического питания Текст. / С. И. Хвыля, Т. М. Гиро, Н. М. Птичкина // Мясная индустрия. 2002. - №7. -С. 20-22.

81. Хлебников, В. И. Качество мясных изделий, обладающих функциональными свойствами Текст. / В. И. Хлебников, С. Ю. Дмитриенко // Известия вузов. Пищевая биотехнология. 2004. — №4. - С. 67-68.

82. Хорохольский, В. В. Создание безопасных мясопродуктов с использованием пробиотических культур Текст. / В.В. Хорольский,

83. C.П. Синеокий, Н.Г. Машенцева, Ю.А. Рыбаков, И.А. Лаптев // Международная конференция «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы». 2004. - С. 200.

84. Чуйкова, Т. В. Аминокислоты, пептиды, белки Текст. / Т. В. Чуйкова. Кемерово : Кузбассвузиздат , 2003. - 97 с.

85. Шахназаров, А. Г. Методические рекомендации по оценке эффективности инвестиционных проектов Текст. / А. Г. Шахназаров. М. : Экономика, 2000. - 421 с.

86. Шиффнер, Э. Бактериальные культуры в мясной промышленности Текст./ Э. Шиффнер, В. Хагедорн, К. Опель. М. : Пищевая промышленность. - 1980. - 95 с.

87. Beisson, F. Oil-bodies as substrates for lipolitic enzymes Text. / F. Beis-son, N. Fcrte, S. Bruley, R. Voultoury, R. Verger, V. Arondel // Biochim. et Bioph. Acta. 2001. - V. 1537. - P .47-58.

88. Bruna, J. Changes in selected biochemical and sensory parameters as affected by the superficial of Penicillium camemberti on dry fermented sausages Text. / J. Bruna, E. Hierroa, S. Donald // Internetional Journal of Food Microbiology. 2003. - P. 85.

89. Che, Omar I. Purification and some properties of a thermostable lipase from Humicola lanuginose Text. / I. Che Omar, M. Hayashi, S. Nagai // Agric. Biol. Chem. 2001. - V. 51, № 3. - P. 37-45.

90. Chen, S. С Cryptococcus neoformans var. gattii infection in northern Australia: existence Text. / S. C. Chen, B. J. Currie, H. M. Campbell,

91. D. A. Fisher, T. J. Pfeiffer, D. H. Ellis, Т. C. Sorrell // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2000. - V.91 (5), № 5. - P. 547-550.

92. Davies, В. J. Disk Electrophoresis. Method and application to human serum proteins Text. / B.J. Davies // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1964. - V.121, № 4. - P. 404-427.

93. Fischer, В. E. Isolation and characterization of the extracellular lipase of Acinetobacter calcoaceticus 69 V Text. / В. E. Fischer, H. P. Kleber // J. Basic Microbiol. 2002. - V. 27. - P. 427- 432.

94. Fuller, R. Probiotics in human medicine. Text. / R. Fuller. Gut. 2001, -P. 329.

95. Gaoa, X. Production, properties and application to nonaqueous enzymatic catalysis of lipase from a newly isolated Pseudomonas strain Text. / X. Gaoa, S. Cao, K. Zhang // Enzyme Microb. Technol. 2000. - V. 27(1-2), №7.-P. 74-82.

96. Gargouri, Y. Inhibition of pancreatic and microbial lipases by proteins Text. / Y. Gargouri, R. Julien, A. Sugihara, R. Verger, L. Sarda // Bio-chem. Biophys. Acta. 2004. - V. 795. - P. 326-331.

97. Hostacka, A. Lipase activity of Acinetobacter baumani after treatment with meropenem Text. / A. Hostacka // Arzneimittelforschung. 2000. - V. 50, № 12. - P. 1134-1137.

98. Ibrik, A. Biochemical and structural characterization of triacylglycerol lipase from Penicillium cyclopium Text.- / A. Ibrik, H. Chahinian, N. Ru-gani, L. Sarda, L. Comeau // Lipids. 2002. - V. 33. - P. 377 - 384.

99. Jollivet, N. Comparison between volatile flavor compounds produced between ten strains of Penicillium camemberti Text. / N. Jollivet, J. Belin, Y. Vayssuer// Thorn. Journal of Dairy Science. 2003. - P. 76.

100. Kambhampati, Dev. Protein microarray technology Text. / Dev Kamb-hampati. Weinheim: Wiley-VCH, 2004. - 243 p.

101. Klein, G. Taxonomy and physiology of lactic acid bacteria Text. / G. Klein, A. Pack, C. Bonaparte // Int. J. Food Microbiology. 1998. - V.41. - № 2. - P. 103 - 125.

102. Klijn, N. Identification of mesophilic lactic acid bacteria by using polymerase chain reaction-amplified variable regions of 16s rRNA and specific DNA probes // Appl. Environ Microbiol. 1994. V.60. - P. 3390 - 3393.

103. Knol, J. Stimulation of endogenous Bifidobacteria in term infants by an infant formula containing prebiotic. Text. / J. Knol, ES Poelwijk, et al. // J Pediatr Gastroent Nutr.- 2001. P. 34.

104. Kundu, M. Isolation and characterization of an extracellular lipase from the conidia of Neurospora crassa Text. / M. Kundu, J. Basu, M. Guchhait, P. Chakrabarti // J. Gen. Microbiol. 2001. - V. 133, №1 (Pt 1). -P. 149-153.

105. Lawrence, R. C. Reviews of the progress of Dairy Science: Cheese starters (Ruckblicke uber die Forts-chritte der Milchwissenschaft: Kascrei-saurewecker) Text. / R. C. Lawrence, T. D. Thomas und В. E. Terzaghi. // J. Dairy Res. 43.- 2002, P. 141 - 193.

106. Mitsuda, S. Neutron-depolarization studies on re-entrant spin glass Text. / S. Mitsuda, N. Matsuo, S. Nabeshima, M. Goto, S. Noda, N. Kamiya, F. Nakashio // Biosci. Biotechnol. Biotech. 2002. - V. 56. - P. 357-358.

107. Muderhwa J. M. Purification and properties of the lipases from Rhodoto-rula pilimanae Hedrick and Burke Text. / J. M. Muderhwa, R. Ra-tomahenina, M. Pina, J. Graille, P. Galzy // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1999.-V. 23.-P. 348-354.

108. Nawani, N. Purification, characterization and thermostability of lipase from a thermophilic Bacillus sp. J33 Text. / N. Nawani, J. Kaur // Mol. Cell. Biochem. 2000. - V. 206 (1-2), №3. - P.91-96.

109. Pohjanjoki, Pekka. Functional properties of soluble inorganic pyrophosphatase from Saccharomyces cerevisiae / Pekka Pohjanjoki. Turku : Tu-runyliop., 2000 - 77 p.

110. Pratuangdejkul J. Purification and characterization of lipase from psy-chrophilic Acinetobacter calcoaceticus LP009 Text. / J. Pratuangdejkul, S. Dharmsthiti I I Microbiol. Res. 2000. - V. 155 (2), №7. - P. 95-100.

111. Wickman, M. Physicochemical investigation of two phospatidilcho-line/bile salt interfaces: implications for lipase activation Text. / M. Wickman, P. Wilde, A. Fillery-Travis // Biochim. et Biophysica Acta. -2002.-V. 55851.-P. 1-14

112. Yang, J. In vitro analysis of roles of a disulfide bridge and a calcium binding site in activation of Pseudomonas sp. strain KWI-56 lipase Text. / J. Yang, K. Kobayashi, Y. Iwasaki, H. Nakano, T. Yamane // J. of Bacteriology. 2000.- V.l. - P. 295-302.

113. Zhou, J. S. Antibiotic susceptibility profiles of new probiotic Lactibacil-lus and Bifidibacterium strains Text. / J. S. Zhou, C. J. Pillidge, P. K. Goral // Int. J. Food Microbiol. 2005. - № 2. - P. 211 - 217.