автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Создание и использование коллагенолитического препарата микробного происхождения для улучшения качества мясных продуктов

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика протеолитических ферментов их влияние на струк- 7 туру, свойства коллагена и других белков.

1.2. Применение ферментов в технологии мясных продуктов.

Актуальность работы. Одним из подходов, используемых в мире для преодоления белкового дефицита, является все нарастающее применение в мясной промышленности биологически активных веществ (БАВ), позволяющих улучшать качество вырабатываемой продукции и значительно расширить используемую сырьевую базу. При этом одним из наиболее привлекательных направлений является вовлечение в производство модифицированных форм коллаген-содержащего сырья, которое до настоящего времени в силу своих низких функционально-технологических свойств и потребительских характеристик лишь ограниченно применяется при изготовлении мясных продуктов. Существует ряд методов улучшения качества данного сырья, основанных на механической обработке, термическом воздействии, а также на обработке ферментными препаратами. Именно последний подход представляется нам наиболее интересным и перспективным. Однако специфика молекулярной и надмолекулярной организации соединительной ткани, которая в основном и определяет жесткость мяса, в сочетании с технологическими особенностями используемых производств, выдвигают весьма «жесткие» требования к физико-химическим и энзи-матическим свойствам ферментов, которые могли бы быть использованы при переработке коллагенсодержащего сырья. Действительно, практика применения ферментных препаратов показывает, что далеко не все из них, даже обладающие высокой протеолитической активностью, способны воздействовать на соединительную ткань. Кроме того, рН-оптимум активности многих ферментов находится в кислой или щелочной зоне, т.е. значительно удален от значения рН мяса. Установлена решающая роль температуры и существенное влияние ряда других технологических факторов на эффективность действия протеолитиче-ских ферментов относительно белков мяса. Поэтому, в настоящее время, существенный научно-практический интерес для предприятий мясной отрасли представляют сведения о новых ферментах, способных эффективно воздействовать на нативный коллаген при значениях рН, свойственных мясу и низких положительных температурах.

Установив закономерности превращения белков мясного сырья под действием ферментных препаратов и используя их при производстве, представляется возможным получение готового продукта с высокой пищевой и биологической ценностью.

Вопросам применения ферментных препаратов в мясной промышленности посвящены научные работы отечественных и зарубежных ученых: Рогова И.А., Большакова А.С., Хорольского В.В., Журавской Н.К., Титова Е.И., Антиповой JI.B., Борескова В.Г., Ратушного А.С., Кудряшова JI.C, Мицыка В.Е., Вуйн-штейн К.Е., Blackmore Н., Gudaszewski Т., Muller Н и др.

Настоящая работа направлена на создание ферментного препарата микробного происхождения активного при низких положительных температурах и изыскание путей его воздействия на мясное сырье с высоким содержанием соединительной ткани в целях умягчения мяса и получение из него продукции улучшенного качества.

Выше указанные положения послужили основанием для выбора цели и соответствующих задач настоящей диссертационной работы.

Целью настоящей работы является создание коллагенолитического препарата микробного происхождения и определение способов его использования для улучшения качества мясного сырья и вырабатываемой из него продукции.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Выполнить скрининг музейных и природных штаммов микроорганизмов для выявления перспективных штаммов-продуцентов протеиназ.

2. Изучить свойства отобранных штаммов микроорганизмов и комплекса ферментов, секретированных ими.

3. Разработать технологический регламент производства ферментного препарата.

4. Изучить воздействие ферментного препарата на мясном сырье и разработать рекомендации по его применению.

Научная новизна. В результате скрининга микроорганизмов выделен штамм, продуцирующий при низких положительных температурах комплекс протеоли-тических ферментов, преимущественно воздействующий на соединительную ткань сырья. Изучена продуктивность выделенного штамма при низких положительных температурах и обоснованы условия его культивирования, при которых повышается выход целевых ферментов. Установлены изменения физико-химических и микроструктурных характеристик мясного сырья с высоким содержанием соединительной ткани при низких положительных температурах под воздействием ферментного препарата. Выяснена взаимосвязь между параметрами степени измельчения мясного сырья и количеством ферментного препарата, добавляемого для его умягчения.

Практическая ценность. На основании полученных данных получен ферментный препарат, обладающий коллагеназной активностью при низких положительных температурах, разработан технологический регламент его производства и рекомендации по его применению при изготовлении мясных продуктов.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 6 работ и получены положительные решения о выдаче патентов на изобретения № 2000111282/13 (012268) "Штамм Serratia proteamaculans 94 - продуцент коллагеназы" от 10.04. 2001 г и № 20011140620 "Субстрат для определения коллагеназной активности "от 25.05. 2001 г (приложение 1).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, содер

ВЫВОДЫ

1. В результате скрининга музейных и природных 342 штаммов микроорганизмов выделен психрофильный штамм Serratia proteamaculans-94, способный активно воздействовать на соединительную ткань мясного сырья в условиях низких положительных температур.

2. Определена оптимальная среда для культивирования продуцента на основе панкреатического гидролизата казеина без глюкозы, температура культивирования (4-10 °С), рН среды (7,0 - 7,2) и продолжительность культивирования (48 - 56 ч). При этом отработана схема получения ферментного препарата из культуральной жидкости.

3. Установлено, что ферментный комплекс при режимах тепловой обработки вареных, варено-копченых и полукопченых колбас, а именно 65 - 70 °С теряет свою активность, что обеспечивает безопасность вырабатываемой продукции для потребителя.

4. Медико-биологическими испытаниями продуцента и сухого ферментного препарата определено, что штамм Serratia proteamaculans-94 не патогенен для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам. Препарат отнесен к 4-му классу опасности, что соответствует требованиям, предъявляемым к пищевым добавкам микробного происхождения.

5. Определено, что при воздействии ферментного препарата на мясное сырье в условиях посола и созревания увеличивается влагосвязывающая способность на 18-20 %, при этом развариваемость коллагена увеличивается на 29-30 %.

6. Гистологическими исследованиями выявлено, что в соединительной ткани в процессе посола и созревания мясного сырья при использовании разработанного ферментного препарата происходит разволокнение коллагеновых

91 пучков, набухание, фрагментация и частичный лизис их волокон, а в микроструктуре мышечной ткани применение этого препарата не вызывает существенных изменений.

7. Установлено, что применение ферментного препарата в количестве 50 - 100 г на 100 кг измельченного мяса и 100 - 150 г на 100 кг кускового мясного сырья оказывает эффективное воздействие, а именно способствует его умягчению, улучшению других качественных показателей (повышению влагос-вязывающей способности, развариваемости коллагена).

8. По результатам комплексных исследований разработаны и утверждены "Технологический регламент на изготовление сухой формы ферментного препарата коллагеназ", "Временные рекомендации по использованию ферментного препарата микробного происхождения (ФПМ-МП) для умягчения соединительной ткани сырья при производстве мясных продуктов" и получены положительные решения о выдаче патентов на 2 изобретения (приложение 4).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволили обосновать проведение скрининга микроорганизмов при 4 °С с целью выделения перспективных штаммов - продуцентов протеаз и получение ферментного препарата для умягчения соединительной ткани низкосортного мясного сырья в условиях посола и созревания.

В результате скрининга музейных и природных штаммов был отобран штамм Serratia proteamaculans - 94, который характеризуется, способностью расти при низких положительных температурах и секретировать протеазы, гид-ролизующих коллаген.

Проведена оптимизация условий его культивирования. Наиболее перспективной средой для культивирования штамма являлась среда на основе панкреатического гидролизата казеина без добавления глюкозы, оптимальной температурой для роста 4 - 10 °С, продолжительность культивирования 48 - 56 ч. Комплекс ферментов секретированных микробными клетками в среду, относится внеклеточным сериновым и металлопротеиназам.

Разработана схема получения ферментного препарата из культуральной жидкости в лабораторных условиях при 4 °С культивирования штамма микроорганизмов. Коллагеназная активность ферментного препарата полученного в лабораторных условиях 8 ед гли/мл.

В ходе исследований научно обоснована и экспериментально подтверждена технология производства сухого ферментного препарата. Так, подобрана не дорогая питательная среда для культивирования штамма. В качестве критерия завершения процесса культивирования является пиковая активность ферментов.

На основании проведенного исследования сухого ферментного препарата было определено, что он обладал коллагеназной активностью равной 0,5 уе/мг при рН 5,8 - 6,2 и низких положительных температурах. Ферментный комплекс препарата является термолабильным и полная его инактивация была отмечена при режимах тепловой обработки мясных изделий.

Применение ферментного препарата в производстве мясных продуктов для умягчения низкосортного мясного сырья в процессе посола и созревания способствовало увеличению его влагосвязывающей способности на 18 - 20 %, а развариваемости коллагена на 29 % по сравнению с контролем.

При ферментации в микроструктуре мясного сырья с высоким содержанием соединительной ткани были отмечены глубокие деструктивные изменения. Они характеризовались резким набуханием коллагеновых волокон, разво-локнением их пучков, фрагментацией и лизисом коллагеновых волокон. В тоже время на фоне таких изменений соединительной ткани воздействие препарата на мышечную ткань оказалось незначительным, что подчеркивает коллагеноли-тическую направленность действия этого препарата.

Проведенная медико-биологическая оценка штамма по таким показателям как вирулентность, диссеминация, токсичность и токсигенность характеризовала штамм Serratia proteamaculans - 94 как не патогенный для теплокровных животных и удовлетворяющим требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам. Первичная токсикологическая оценка ферментного препарат позволила отнести его к 4-ой группе опасности, что соответствует требованиям, предъявляемым к пищевым добавкам микробного происхождения.

Таким образом, применение сухого ферментного препарата в технологии мясных продуктов с использованием сырья с высоким содержанием соединительной ткани позволяет более рационально использовать низкосортного мясное сырья, создать новые виды продукции с высокими потребительскими свойствами. Это открывает возможности создания широкого спектра новых видов ферментированных продуктов, повышения эффективности производства мясных изделий.

Проведенная экспериментальная работа, включая опытно-промышленные выработки, позволила решить поставленные задачи и получить ферментный препарат для умягчения низкосортного сырья в условиях посола и созревания.

Технология изготовления ферментного препарата была разработана на опытно-промышленном участке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им.Г.К. Скрябина.

Опытно-промышленная партия мясных продуктов была выработана на ЗАО "Мясокомбината "Тихорецкий".

Результаты опытно-промышленной проверки свидетельствуют о том, что разработанные технологии имеют практическую ценность, а именно получен эффективный ферментный препарат обладающий коллагенолитической активностью при низких положительных температурах применение которого в технологии мясных продуктов позволяет создать продукцию с высокими потребительскими свойствами, благодаря умягчению соединительной ткани мясного сырья.

Разработаны и утверждены "Технологический регламент по изготовлению сухой формы ферментного препарата коллагеназ" и "Временные рекомендации по использованию препарата микробного происхождения (ФПМ МП) для умягчения соединительной ткани сырья при производстве мясных продуктов".

Новизна технических решений, основанных на научных результатах и составляющих предмет практической значимости подтверждены положительными решениями о выдаче патентов на 2 изобретения.

1. Авторское свидетельство СССР № 311958, 1971. Гончаров А.Ф. Штамм Bacillus glutisosus № 2376 продуцент протеолитических ферментов.

2. Авторское свидетельство СССР № 4914908/13/0096 от 7.07.91. Демина Н.С., Лысенко С.В. Способ получения коллагеназы.

3. Антипова Л.В. Биотехнологические аспекты рационального использования вторичного сырья мясной промышленности: Обзорная информация. М.: АгроНИИТЭНММП, 1991. - 36 с.

4. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука, 1991. - 479 с.

5. Бердутина А.В. Разработка технологии белковых гидролизатов из вторичного сырья мясной промышленности: Дис. канд. техн. наук. -М.: ВНИИМП. -2000.- 159 с.

6. Бонне М., Дж.Копп "Деградация коллагена мышечной ткани крупного рогатого скота коллагеназой, создаваемой микроорганизмом Achromobacter iophagus'V/Proceedings Evropean meeting of meat research workers. Bristol, Great Britain. -1984. C.102 - 110.

7. Бюллетень ВОЗ. 1981. - T.59, - № 6. - C.20 - 27.

8. Ю.Ваганова Т.И., Иванова Н.М. Степанов В.М. Выделение и свойства "кислой " металлопротеиназы Aspergillus oryzae // Биохимия. 1988. - Т.53. - С.1344 - 1351.

9. П.Вейс А. Макромолекулярная химия желатина: Пер. с англ. М.: Пищ. промышленность, 1971. - 474 с.

10. Гаспаров B.C., Дягтярь В.Г. Определение белка по связыванию с красителем кумасси бриллиантовым голубым G-25 //Биохимия. 1994. - Т.59. - № 6. -С.763-777.

11. Глемжа А.А., Люджюс Л.Л., Петрова Л.И. Микробные ферменты в народном хозяйстве. Вильнюс: Мокслас, 1985. - 188 с.

12. Горбатов В.М. Способы улучшения качества мяса при выработке мясных полуфабрикатов общественного питания. М.: Госинти, 1963. - №3.

13. Горбатов В.М., Аджян М.П. Новые направления в исследованиях и технологии ферментированных продуктов: Обзорная информация. М.: АгроНИИ-ТЭИММП, 1990. - 32 с.

14. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М.: Пищевая промышленность, 1975. - 392 с.

15. Грин Н., Нейрат Г. Протеолитические ферменты.-В кн.: Белки. Под ред. Г.Нейрата и К.Бейли. (Пер.с англ). М., 1959. - Т.З. - 4.2. - С.7-165.

16. Демина Н.С.,Лысенко С.В. Экзопротеазы культуры Streptomyces 1ауепёи1ае//Микробиология. 1995. - Т.64. - № 4. - С.458-460.

17. Долгов В.А. Методические аспекты и практическое применение ускоренной биологической оценки кормов, продуктов животноводства и других объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля: Автореф. дис. д-ра вет. наук. М.: ВНИИВСГЭ, 1992. - 41 с.

18. Журавская Н.К., Алехина Л.Т., Отряшенкова JI.M. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов. М.: Агропромиздат, 1985. - 296с.21.3айдес A.JL, Михайлова А.Н., Пушенко О.И. //Биохимия. 1964. - № 29. -с.61-63.

19. Заявка 2147299. Великобритания.

20. Заявка 2229348. Великобритания.24.Заявка 60-9779. Япония.

21. Каверзнева Е.Д. Определение протеолитической активности//Прикладная биохимия и микробиология. 1971. - Т.7. - Вып.2. - С.225-228.

22. Каган И.С. Чамова Ю.Д. Влияние условий термической обработки колбас на изменение протеолитической способности ферментных препаратов Actinomyces fradiae и "Терризина ПК'7/Прикладн. биохим. и микробиология. 1971. - Т.VII. - Вып.6. - С.664-667.

23. Каган И.С., Украинец Г.А. и др. Примененеие ферментов в колбасном производстве. Научный отчет технологического института пищевой и холодильной промышленности. Одесса, 1965.

24. Каган И.С., Украинец Г.А. и др. Примененеие ферментов при производстве колбас. Научный отчет Одесского технологического института пищевой и холодильной промышленности. 1966. -4.1 - II.

25. Каган И.С., Чамова Ю.Д. Влияние условий термической обработки колбас на изменение протеолитической способности ферментных препаратов Actinomyces fradiae и "Терризина ПК"/Прикладная биохимия и микробиология. -1971." Т.VII. - Вып.6. - С.664-667.

26. Кахраманов A.M. Разработка технологии вареных колбас из ферментированного сырья с использованием мясной обрези. Дис. канд. техн. наук. М., 1994.

27. Ковалев Ю.И., Токаев Э.С., Рогов И.А. Определение рационального уровня содержания пищевых волокон в мясных продуктах //Известия Вузов. Пищевая технология. 1990. - № 2-3. - С.50-52.

28. Козловская Э.П., Артюков А.А., Алыыевская Е.К. и др. Способ получения белковых гидролизатов из белоксодержащего сырья М: Химия и технология пищевых продуктов, 1997.

29. Костров С.В., Кайдалова Н.В., Стронгин А .Я. Структурно-функциональные соотношения в ряду металлопротеиназ бацилл//Молекулярная биология. -1989. Т.23. - С.255-265.

30. Крылова Н.Н., Лясковская Ю.Н. Физико-химические методы исследования продуктов животного происхождения. М.: Пищепромиздат, 1961. - 234 с.

31. Кудряшов JI.C Биотехнологические аспекты создания высокоэффективной технологии нового поколения соленых мясопродуктов: Автореф. дис. доктора тех. наук. -М., 1989.

32. Кузнецова Г.Н. Исследования лабильности компонентов соединительной ткани при созревании мяса и обработке его протеолитическими ферментами. Дисс. канд. техн. наук. М., ВНИИМП. - 1964.

33. Лагутина Л.С., Петрова И.С. Действие отдельных фракций препарата проте-аз Act. Frodiae 119 на коллаген и эластин// Прикладная биохимия и микробиология. 1974. - Т.Х. - Вып.6. - С.873-876.

34. Липатов Н.Н., Рогов И.А., Алексахина В.А., Бандуркин Н.Г., Лисицина В.А., Митасева Л.Ф. Способ производства деликатесного продукта из ферментированного мяса. М: Химия и технология пищевых продуктов, 1997.

35. Лысенко С.В., Демина Н.С., Васина С.В. О специфичности действия внеклеточных протеаз из Streptomyces spp/УПрикладная биохимия и микробиология. 1992. - Т.28. - Вып.1. - С.33-36.

36. Люджис Л.Л., Глемжа А.А., Кунисский Д.Г., Петрова Л.И. "Применение ферментных препаратов в мясной и молочной промышленности"- Обзорная информация. М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1984. 28 с.

37. Мазуров В.И. Биохимия коллагеновых волокон. М.: Медицина, 1974. -247 с.

38. Махонина В.Н., Прокушенков П.А., Забашта С.Г. и др. Способ обработки мяса птицы. Обзорная информация М: Мясная и холодильная промышленность, 1996.

39. Методические рекомендации использования экспресс-метода биологической оценки продуктов и кормов. М. 1990.

40. Методические указания к лабораторной работе и изучение структурно-механических свойств мясопродуктов на универсальной испытательной машине "Instron", выполняемый по системе НИРС-УИРС /Липатов Н.Н., Си-дых Е.В., Титов Е.И. и др. М.: МТИММП, 1985. 15 с.

41. Методы определения активности гидролитических ферментов. М., 1971. -С.3-13.

42. Михайлов А.Н. Коллаген кожного покрова и основы его переработки. М.: Легкая индустрия, 1971. - 527 с.

43. Михайлов А.Н. Химия и физика коллагена кожного покрова. М.: Легкая индустрия. - 1980. - 232 с.

44. Ноздрина Т.Д. Влияние ферментов на качество говядины //Мясная промышленность. -1995. -№ 5. -С.11-12.52.0хрименко О.В., Власенко Л.М., Толодиков Д.В., Мищадин Д.М. Продукты диетического и лечебного питания. //Молочная промышленность. 1998. -№1.-18 с.

45. Паберит Н.Ю., Панк М.С., Лийдерс М.А., Ванатулу К.П. Очистка и свойства нейтральной металлопротеиназы из термофильной бактерии Bacillus brevis// Биохимия. 1984. - Т.49. -С.275-283.

46. Патент 2234659, Англия, МКИ A 23L 1/318. Способ обработки мяса. X. Блэкмор № 89175228, Заявлено 01.08.89.55.Патент № 4755393. США.56.Патент Франции № 2474052.

47. Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М, Позднякова Ю.Н., Давидович В.В. Ферментативные способы приготовления белковых гидрализатов с использованием протеолитических ферментов различной специфичности//Вопросы питания. 1997. - № 5. - С.34 - 38.

48. Ратушный А.С. Применение ферментов для обработки мяса. М.: Пищевая промышленность, 1976. 88 с.

49. Римарева JIB. Использование комплексного ферментативного препарата амилопртофизина для гидролиза дрожжевого белка//Хранение и переработка сельхозсырья. 1996. - № 2. - С.39-40.

50. Рогов И.А., Токаев Э.С. Производство продуктов повышенной пищевой ценности с использованием эмульсий: Обзорная информация. М.: Агро-НИИТЭИММП, 1988. - 32 с.

51. Рогов И.А., Токаев Э.С., Ковалев Ю.И., Клочкова Е.А. Использование сырья с высоким содержанием пищевых волокон в технологии диетических продуктов-М: Пищевая промышленность, 1985.

52. Розанцев Э.Г., Акперов И.М. Растительные протеазы и качество мясных продуктов М: Мясная промышленность, 1992.

53. Салаватулина P.M., Алиев С.А., Любченко В.И. Новый метод определения основных функциональных свойств фарша//Мясная индустрия СССР. -1983. №.9. - С.26-27.

54. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов//Санитарные правила и нормы 2.3.2.560-96. -М., 1997.-270 с.

55. Сахаров И.Ю. Литвин Ф.Е. Влияние денатурирующих факторов на стабильность коллагенолитической протеазы А краба. Биохимия. 1989. Т54. Вып. 11.С. 1913-1918.

56. Сахаров И.Ю., Литвинов Ф.Е., Артюков А.А., Кофанова Н.Н. Очисткаи характеристика коллагенолитической протеазы из гепатопанкриаса Paralithodes camtchatica // Биохимия. 1988. -Т.53. - С. 1844-1849.

57. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. Справочник. -М.: Колос, 1995. 319с.

58. Слабоспицкая А.Т., Крымовская С.С., Резник С.Р. Коллагенолитическая активность бактерий рода Bacillus, выделенных из различных экологических источников/УМикробиологический журнал. 1989. -№ 6. -С.54-56.

59. Соловьев В.И. Созревание мяса. М.: Пищевая промышленность. 1966. -340 с.

60. Соловьев В.И., Кракова В.З. Ферментативная активность препаратов фици-на, полученных различными методами, и действие их на мясо// Прикладная биохимия и микробиология. 1971. -Т.VII. - № 2. - С.189-195.

61. Титов Е.И., Митасева Л.Ф., Пыльцева Л.А., Сергеенко О.И., Мамиконян М.А. Новые мясные продукты реальный путь к созданию безотходных технологий. Обзорная информация - М.: Мясная и холодильная промышленность, 1996.

62. Титов Е.И., Апраксина С.К. Коллагенсодержащее сырье и пути его переработки: Обзорная информация -М.: АгроНИИТЭИПП, 1995. 31 с.

63. Токаев Э.С., Рогов И.А. Производство продуктов повышенной пищевой ценности: Обзорная информация,- М: АгроНИИТЭИММП, 1988. 31с.

64. Труды Московского института народного хозойства им. Плеханова. 1966. - Вып.41.

65. Федонин М.Ю. Разработка технологии формованных продуктов из говядины с использованием ферментного препарата: Дисс.кан.тех.наук М.: МГУПБ. -2000.- 159 с.

66. Циперович А.С. Ферменты в народном хозяйстве. Киев: Техника. - 1965. -114 с.

67. Черкасова Л.Г. Биотехнологическая модификация мясного сырья стартовыми культурами микроорганизмов.: Автореф.дисс.канд.техн.наук. -М.: МИПБ. 1994. - 21 с.

68. Якубке Х.Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1985. -С.262-271.

69. Adamson N. J., Reynolds Е.С. Relationship between of casein hydrolysis and phoshopeptide release//J.Dairy Res. -1997. -№ 4. -P.505-514.

70. Alt J., Heymann E., Krisch K. //Europ. J. Biochem. 1975. -Vol. 53. P.357-369.

71. Barrett A.J., Knight C.G., Brown N.A. A continunuous fluorimetric assay for clostridial collagenase and Pz-peptidase activity // Biochem. J. 1989. - Vol. 237. -P. 259-271.

72. Batista I., Nunes M.L. Preparatio of enzymic hydrolyzates from fish wastes.// Dev. Food Sci. 1997. - V.38. - № 1. - P.59-70.

73. Blumberg S., Schechter I., Berger A .//Europ.J.Biochem. 1970. - Vol.15. -P.97-102.

74. Bond M.D., van Wart H.E. // Biochemistry. 1984. -Vol. 23. - P.3085-3091.

75. Bredfor M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding.// Anal.Biochem. 1976. - Vol.72. -№> 1-2. - P.248-254.

76. Charney J., Tomarelli R.M. Determination of the proteolytic activity of duodenal juice. // J.Biochem. 1947. - Vol. 177. - P.501-505.

77. Chihanover A., Hod Y., Hershko A. // Biochem. and Biophys. Res. Commund. 1978. Vol. 81. P.l 100-1105.

78. Desnuelle P.// The enzymes/ Ed. P.Boye. N.Y.: Acad.press, 1960. - Vol.4 -P.93-118.

79. Eisen A.Z., Henderson K.O., Jeffrei J.J., Bradshaw R.A. A collagenolytic protease from the hepatopancreas of the fiddler grab, Uca pugilator. Purification and properties.//Biochemistry. 1973.-Vol. 12.-P. 1814-1822.

80. E1-Garbawi M., Whitaker J.R. Factors affecting enzymatic solubilization of beef protein.//Journal of Food Science". -1963. V.28. - P.168-172.

81. Emi M., Nakamura Y., Ogawa M. et al. // Gene. 1986. - Vol. 41. - P.305-310.

82. Fik M., Surowka K. Enzymic hydrolysis of proteins from chicken heads using Al-calase and Esperase.// Acta Aliment. 1997. - V.26. - № l. P.35-45.

83. Fukumura Т., Talbot G., Misono H. et al. / FEBS Lett. 1978. - Vol.89. - P.298-300.

84. Grant C.A., Henderson K.O., Eisen A.Z., Bradshaw R.A. // Ibid. 1980. - Vol.19. - P.4653-4659.

85. Grant C.A., Sacchettini J.C., Welgus H.G. A collagenolytic serine protease with trypsin-like specifity from the fiddler grab Uca pugilator// Biochem.J. -1983. -V.22. P.354-358.

86. Gudaszewski T. Lesiow T. L Action proteolitique et lipolitique enzymes sur la matiere reoloqique du beuf France: Nachrunq, 1990.

87. Hartley B.S. // Annu.Rev. Biochem. 1960. - Vol.29. - P.45-72.

88. Hartley B.S.// Nature. 1964. -Vol.201. - P.1284-1288.

89. Henderson G., Krygsman P., Liu C.J. et al. // J.Bacteriol. 1987. - Vol. 169. -P.3778-3784.

90. Hurion N., Fromentin H., Keil B. Specificity of the collagenolytic enzyme from the fungus entomoptkora coronata: comparision with the bacterial collage-nase from Achromobacter iophagus // Arch. Biochem. and Biophys. -1979. -Vol.192.-P.438-445.

91. Hurion N., Fromentin H., Keil В. // Сотр. Biochem. and Physiol. B. 1977. -Vol.56. -P.259-264.

92. Husain S.S., Lowe Y. // Biochem.J. 1969. - Vol.114. - P.279-288.

93. Husain S.S., Lowe Y. // Biochem.J. 1970. - Vol.117. - P.333-340.

94. Ito Т., Saito T. Whey beverages and their manufacture with proteasis. Pat. Japan. -1998.-№ 10.

95. Jurasek L., Carpenter M.R. Smillie L. B. et al. // Biochim. And Biophis. Res.Commun. 1974. - Vol.61. -P. 1095-1100.

96. Keil-Dlouha V. // Biochim. et biophys. acta. 1976. Vol. 429. P.239-251.

97. Kenny J., Booth A.G., George S.G. et al. // Ibid. 1976. - Vol.157. -P. 169182.

98. Kopple K.D., Marz D.H. // J. Amer. Chem. Soc. 1967. - Vol. 89. - P. 61936200.

99. Kreissler M.A., Akhmedov N.A., Arkhipova S.F. et al. // J. Chem. Phys. -1974.-Vol.71.-P.913-919.

100. Lecroisey A., Boulard Ch., Keil B. // Europ. J.Biochem. 1979. Vol. 101. P 385393.

101. Lecroisey A., Gilles A.M., de Wolf A., Keil B.// J.Biol.Chem. 1987. -Vol.262.-P.7546-7551.

102. Lecroisey A., Keil-Bloucha V., Woods D.R. et al. Purification stability and inhibition of the collagenase from Achromobacter iophagus// FEBS Lett. 1975. -Vol. 59. - P.167-172.

103. Lee I.S., Warabayashi S., MiyataK. et al. // J.Biochem. -1984. Vol.96. -P.1409-1418.

104. Liener J.E., Friedenson B. // Meth.Enzymol. 1970. - Vol. 19. -P.261 -273.

105. Lorenzen P., Schulzen D., Schulte D., Schlimme E. Caseinolyse mit lab. und chymosin boviner sowie gentechniser herkunft .// Dttsch. Millehwirk. 1996. -V.47. - № 11 - P.492-495.

106. Meloun В., Kluh J., Kostra Y. Et al.// Biochim. et biophys.acta. 1966. -Vol.130.-P.543-546.

107. Metrione R.M., Johnston R.B., Seng R. // Arch.Biochem. and Biophys. 1967. -Vol.122.-P.137-143.

108. Mikes O., Tomasek V., Holeysovsky V., Sorm F. // Biochim. et biophys. acta. 1966.-Vol.117.-P.281-284.

109. Miyata K. // Agr. and Biol.Chem. 1970. - Vol.34. - P. 1457-1462.

110. Murachi T. // Meth. Enzymol. 1976. - Vol.45. - P.475-485.

111. Narahama K., Yoshimura K., Marumoto R. et al. // Nucl.Acids Res. 1986. -Vol.14.-P.5843-5855.

112. Narahashi Y. // Meth.Enzymol. 1970. Vol.19. P.651-664.

113. Narahashi., YodaK. //J. Biochem. 1977. - Vol.81. - P.587-597.

114. Ota S., Muta E., Katahira Y., Okamoto Y. // J. Biochem. 1985. - Vol.98. -P.219-228.

115. Pintado M.E., Pintado A.E., Silva E.R. Evaluation of whey protein hydrolysis using protease A and trypsin. // Biol. Wet. ( Univ. Gent) 1997. - V.62. -№ 4. -P.1365-1368.

116. Ritonja A., Roman A.D., Buttle D.J. et al. // FEBS Lett. 1989. - Vol.247. -P.419-424.

117. Rosen H.//Arch. Biochemistry and Biophysics. 1957. - V.67. - P.10-15.

118. Ryle A. P. //Meth. Enzymol. 1970. - Vol.19. -P.316-336.

119. Schroeder D.D., Shaw E. // J. Biol. Chem. 1968. - Vol.243. - P.2943- 2949.

120. Seifter S., Harper E. The collagenases //Methods in Enzymology / Tds.Prelman G.E., Lorand L.N.Y., San Fransisco: Acad. Press, 1971. V. 3, P. 649-697.

121. Smillie L.B., Furka A., Nagabhushan N. et al.// Nature. 1968. - Vol. 218.-P.343-345.

122. Trocher I., Herry P., Keil-Dlouha V., Keil B. // Ibid. 1980. - Vol.615. -P.436-448.

123. Trop M., Birk YJ! Biochem. J. 1968. - Vol.109. - P.475-482.

124. Trujillo A., Guamis В., Carreto C. Hydrolysis of bovin and caprin caseins by reanet and plasmin model sestem. // j. Agr. Food Chem. 1998. - V.46. -№ 8. -P.3066-3072.

125. Walsh K. A., Neurath H. // Proc. Nat. Acad. Sci.USA. 1964. - Vol.52. -P.884-889.

126. Yoshimoto t., Kabashima t., Fuji m. Novel salt-resistant prolil oligopeptidase from Sphingomonas capsulata, cloning of its gene, and use of the enzyme for preparing agents. Pat. Japan. 1998. -№ 10. - P.665-670.

127. Zhao X., Shipin Lexue.//Food Sci. 1996. - V.17. -№ 5. -P.3-6.105