автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии пептидного биорегулятора из селезенки яков

На правах рукописи

ГОНГАЕВА АЮНА ГАЛДАНОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПЕПТИДНОГО БИОРЕГУЛЯТОРА ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ ЯКОВ

Специальность: 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

21 МАР 2013

005050931

Улан-Удэ-2013

005050931

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (ВСГУТУ)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Жамсаранова Сэсэгма Дашиевна

Официальные оппоненты: Гармаев Дылгыр Цыдыпович,

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, зав. кафедрой «Технология производства, переработки и стандартизации сельскохозяйственной продукции» ФГБОУ ВПО «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия имени В.Р. Филиппова»

Хамаганова Инга Вячеславовна, кандидат технических наук, доцент кафедры «Технология мясных и консервированных продуктов» ВСГУТУ

Ведущая организация: ГНУ «Бурятский научно-исследовательский

институт сельского хозяйства» РАСХН (Улан-Удэ)

Защита состоится «28» марта 2013 года в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.039.05 при ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» по адресу: 670013, г. Улан-Уда, ул. Ключевская, 40 в, ауд. 8-124.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСГУТУ.

Автореферат разослан «28» февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Столярова А.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Совершенствование современных технологий производства продуктов питания тесно связано с расширением ассортимента за счет переработки нетрадиционного сырья, с переходом от использования искусственных пищевых добавок к натуральным, обладающим высокой биологической активностью, а также с разработкой функциональных продуктов питания (Приходько, 2009; Чернуха, 2009).

Источником природных биологически активных веществ, которые могут быть использованы как биологически активные добавки к пище или ингредиенты продуктов функционального питания, является растительное и животное сырье.

Установлено, что центральные и периферические органы иммунитета животных, которые относят к отходам основного производства, играют важную роль в качестве продуцентов регуляторных пептидов. В свою очередь, регуляторные пептиды участвуют в поддержании гомеостаза и являются важнейшими компонентами в функционировании основных регуляторных систем организма, а именно нервной, эндокринной и иммунной (Гриневич, 2001; Ха-винсон с соавт., 2002).

Географическое положение Республики Бурятия благоприятствует развитию всех отраслей животноводства, в том числе содержанию яков. Отличительными особенностями яков по сравнению с культурными породами являются отличная приспособленность к климатическим и хозяйственным особенностям, неприхотливость к корму и условиям содержания, устойчивость к ряду заболеваний (Бадмаев, 2009).

В настоящее время субпродукты, в том числе и селезенка яков, используются нерационально (либо не реализуются, либо идут на кормовые цели), хотя являются источником биологически активных веществ.

В связи с этим достаточно актуальным является использование отходов основного производства, получаемых при убое и переработке яков, в биотехнологии пищевых продуктов направленного действия и биологически активных добавок к пище.

Целью данного исследования являются разработка технологии пептидного биорегулятора из селезенки яков, оценка его эффективности, а также поиск пути практического использования полученного средства.

Для достижения указанной цели были сформулированы следующие

задачи:

- определить оптимальные параметры процесса автолиза гомогената селезенки яков с использованием метода математического планирования и реакции «активного розеткообразования»;

- оценить иммунобиологическую эффективность автолизатов;

- разработать технологическую схему получеши пептидного биорегулятора;

- охарактеризовать физико-химические свойства биорегулятора;

- исследовать возможность использования биорегулятора в качестве биологически активного компонента в производстве колбас;

- произвести оценку иммуномодулирующего эффекта готового продукта.

Научная новизна. На основе многофакторного эксперимента, а также реакции «активного розеткообразования» установлены оптимальные параметры ключевого этапа в технологии пептидного биорегулятора - автолиза. Выделены биорегуляторы из селезенки яков разной степени ростстимули-рующей активности.

Впервые установлены адаптогенные и иммуномодулирующие свойства биорегуляторов на лабораторных животных, находящихся в состоянии иммуносупрессии. Выявлена нейротропная активность испытуемых средств.

Установлено, что молекулярная масса пептидов, определяющих иммунобиологическую эффективность биорегулятора с высокой ростсгимули-рующей активностью, находится в диапазоне 0,68-1,70 кДа.

Обоснована возможность использования пептидного биорегулятора в технологии колбас. Выявлено, что готовый продукт обладает иммуномоду-лирующим действием.

Новизна технических решений оформлена в заявке на патент РФ (№2011122355 от 14.07.2011).

Практическая ценность работы. Разработана технология пептидного биорегулятора из селезенки яков.

Предложен способ использования биорегулятора в производстве колбас. Опытно-промышленная апробация, проведенная на учебном научно-практическом предприятии «Технолог» (Улан-Удэ), показала, что колбасы, в состав которых включен биорегулятор, обладают высокими потребительскими свойствами. Разработан проект технической документации на колбасу «Высокогорная».

Исследования по данной работе выполнены при поддержке гранта для молодых ученых ВСГУТУ.

Апробация работы. Основные положения работы и результаты исследований доложены и обсуждены на научных конференциях ВСГУТУ (Улан-Удэ, 2011, 2012); XI Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2010); VIII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2010); международной школе-семинаре «Current Problems of Food Engineering and Biotechnology» (Ulan-Ude, 2010); всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока» (Улан-Удэ, 2010, 2012); International Conference on «Chemistry in medicine» (Ulaanbaatar, Mongolia, 2010); международной конференции «Биология - наука XXI века» (М„ 2012).

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 12 работ, в том числе две статьи в журналах из перечня, рекомендуемого ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение, аналитический обзор, объекты и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, практическая реализация результатов исследования, расчет экономической эффективности, выводы, библиографический список и приложения. Содержание работы изложено на 131 странице машинописного текста, содержит 29 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 192 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследований использовали селезенку от клинически здоровых молодых яков (фермерские хозяйства Окинского района Республики Бурятия, благополучные по эпидемиологическому окружению).

Для оптимизации этапа автолиза применяли факторные эксперименты с использованием математического метода Протодьяконова (Малышев, 1977). Содержание белка определяли колориметрическим методом Лоури (Lowry, 1951). Ростстимулирующую активность определяли in vitro по содержанию розеткообразующих клеток тимоцитов морской свинки с эритроцитами кролика согласно ВС 42-1571-85.

Для проведения экспериментов in vivo использовали самцов половозрелых мышей массой 20-22 г. Животных содержали в стандартных клетках в условиях вивария при одинаковом уходе и рационе питания со свободным доступом к воде. Методом случайной выборки разбили животных на 5 групп. Первая группа мышей - интактная - находилась на общевиварном рационе. У второй группы животных иммунодефицит воспроизводили перо-ральным введением иммунодепрессанта - цитостатика азатиоприна в концентрации 50 мг/кг массы тела 1 раз в сутки в течение 5 дней. Третьей, четвертой и пятой группам животных на фоне иммуносупрессии вводили испытуемые средства в дозе 0,1 мг/кг массы тела животного 1 раз в сутки в течение 7 дней.

Определение относительной массы и клеточности органов иммунной системы проводили по общепринятым методикам (Методические рекомендации, 1998). Исследование состояния клеточного звена иммунного ответа осуществлялось согласно реакции гиперчувствительности замедленного типа. Изучение состояния гуморального звена иммунного ответа проводилось на основе реакции гемагглютинации (Петров, 1987).

Исследование адаптогенной активности испытуемых средств включало определение физической выносливости лабораторных животных в тесте «Плавание до полного утомления» (Dawson, Horvath, 1970), изучение силовой выносливости по методу С.Я. Арбузова; влияние антиортостатических нагру-

зок оценивали в тесте «Подвешивание до полного утомленил». Нейротроп-ную активность определяли в тесте «Открытое поле» (Буреш с соавт., 1991).

Для фракционирования биорегулятора методом гель-фильтрации использовали колонку с Sephadex G-25 Superfine, уравновешенной в 0,1 М СН3СООН, скорость потока 60 мл/ч.

Для оценки достоверности результатов использовали параметрический критерий статистической обработки данных по методу Стьюдента. Различия считали достоверными при вероятности 95% (р<0,05).

В соответствии с задачами диссертационной работы были проведены исследования согласно схеме, представленной на рисунке 1.

Рисунок 1 - Общая схема проведения исследования 6

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оптимизация процесса автолиза гомогената селезенки яков

При получении биорегулятора за основу был взят способ выделения биологически активной фракции (АФС) из селезенки крупного рогатого скота, где ключевым этапом являлся автолиз. Но данный процесс требовал более глубокого изучения и представлял интерес с точки зрения перспектив максимального извлечения биологически активных субстанций.

Для оценки степени влияния технологических параметров на выход белка и оптимизации этапа автолиза применяли факторные эксперименты с использованием математического метода Протодьяконова. По запланированным уровням факторов составлена матрица трехфакторного эксперимента на пяти уровнях, по которой были проведены 25 опытов (табл.1).

Таблица 1 - Уровни изучаемых факторов

Фактор Уровень

1 2 3 4 5

XI, Температура, °С 0 4 15 25 38

Хг, Продолжительность, ч 24 16 14 10 8

Х3, Гидромодуль 1:4 1:3 1:2,5 1:2 1:1,5

По результатам факторного эксперимента была сделана выборка на графические зависимости (рис. 2).

О 0 5 10 15 20 25 30 35 40 ц

а) Температура, "С б) Продолжительность, ч

Рисунок 2 - Влияние факторов на содержание белка

На основе данных получено обобщенное уравнение Протодьяконова,

которое имеет следующий вид:

Уп=(-0,00045хХ1 х Х1+ОД 932475219хХ,+1,941) х (-0,00795хХ2хХ2-ЮД62686924хХ2+3,57)х(0,25713хХзхХз+2,3187899604хХз+4,43)/(5,47х5,47)

По результатам математического планирования эксперимента и уравнения Протодьяконова установлены следующие оптимальные параметры автолиза гомогената селезенки яков: температура - 38°С, продолжительность -16 ч, гидромодуль - 1:1,5. При этих технологических параметрах содержание белка в автолизате составило 9,64 мг/мл.

Так как исследования касались биологических субстанций, необходимо было не только увеличить количественное содержание пептидов, но и сохранить их иммунобиологические свойства. Для оценки ростстимулирую-щей активности были выбраны пять опытных образцов с максимальным содержанием белка и учетом фактора температуры, а также образец, полученный при оптимальных параметрах автолиза, исходя из уравнения Протодьяконова (рис. 3).

40

£ 30

■Л

О 20

а< ■

10

О

контроль II опытШ ОПЫТ №7 ОПЫТ' ОПЫТ ОПЫТ- опт

I №13 №16 №24

контроль I - содержание Еа-РОК в исходной суспензии тимоцитов, контроль II - после инкубации тимоцитов в растворе трипсина; опт - автолизат, полученный при оптимальных параметрах согласно уравнению Протодьяконова

Рисунок 3 - Реакция «активного розеткообразования» тимоцитов морской свинки с эритроцитами кролика ш \itro

Установлено, что нет прямой зависимости между содержанием пептидов в автолизатах селезенки и показателем ростстимулируюхцей активности. Для дальнейших исследований были выделены биорегуляторы из селезенки яков с высокой (№1), средней (№2) и низкой (№3) ростстимулирую-щей активностью.

Биорегулятор №1 получен при следующих параметрах автолиза: температура - 15°С, продолжительность - 14 ч, гидромодуль - 1:3. Биорегулятор №2 выделен при температуре 3°С, в течение 16 ч и гидромодуле 1:2.

8

Биорегулятор №3 получен при температуре 25°С и гидромодуле 1:3, автолиз продолжался 8 ч.

Для оценки иммунобиологической эффективности биорегуляторов была предпринята попытка установить их влияние на регуляторные системы организма животных в экспериментах ш vivo.

Исследование иммунобиологических свойств биорегуляторов

При экспериментальной оценке специфической активности биорегуляторов необходимо было исследовать их действие на основные звенья иммунной системы (табл. 2).

Таблица 2 - Влияние биорегуляторов на клеточность селезенки и тимуса, индекс реакции ГЗТ и титр гемагглютининов (ГА) на фоне азатиопри-новой иммуносупрессии____

Вариант опыта Клеточность селезенки хЮ6 Клеточность тимуса* 106 Индекс реакпии ГЗТ Титр ГА, \П

Интактные 126±9,0 57,8±4,1 0,35*0,03 31,6±4,9

Азатиоприн (Аз) 102±10,5 50,3±3,9 0,22±0,03" 12,9±0,6*

Аз+биорегулятор №1 136,5±4,9" 69,3±6.9" 0,32±0,03" 20,0±3,9"

Аз+биорегулятор №2 127,5±19,0 55,8±3,0 0,31±0,03" 8,0±1,9

Аз+биорегулятор №3 127±11,3 51,5±2,5 0,31±0,04" 6,4±0,8

Примечание (к табл. 2,3,5): - достоверное отклонение значения в контрольной группе по сравнению со значением в интактной группе (р<0,05);"— достоверное отклонение значения в экспериментальной группе по сравнению со значением в контрольной группе (р^),05)

Установлено, что введение азатиоприна сопровождалось развитием иммунодефицитного состояния, характеризующегося супрессией иммуно-компетентных органов, в то время как у животных, получавших биорегуляторы, наблюдалось увеличение клеточности иммунных органов. Однако лишь биорегулятор №1 достоверно повышал соответствующие показатели. При исследовании влияния биорегуляторов на клеточно-опосредованную реакцию ГЗТ установлено, что все испытуемые средства достоверно увеличивали индекс данной реакции. Биорегулятор №1 оказывал большее модулирующее влияние и на реализацию гуморального иммунитета в реакции гемагглютина-ции. При этом очевидно, что данное средство способствовало активации как клеточного, так и гуморального звеньев иммунного ответа на фоне азатио-приновой иммуносупрессии, что, вероятнее всего, связано с его высокой биологической активностью.

В тесте «Открытое поле» установлено, что животные, получавшие биорегуляторы, проявляли высокую двигательную активность. Введение биорегуляторов вызывало увеличение двигательной активности у мышей в (1,4 -2) раза по сравнению со второй группой за счет возрастания горизонтальных перемещений и вертикальных стоек.

Включение в рацион питания животных биорегулятора №1 на фоне иммуносупрессии повысило вертикальную двигательную активность на 75%, что относительно показателей контрольной группы составило 93,8%. Данный биорегулятор восстанавливал показатели актов груминга и дефекации до уровня контрольной группы. Показатели познавательной деятельности мышей, получавших биорегуляторы со средней и низкой биологической активностью, увеличились на 40, 5 и 22,1% и составили 75,3 и 65,4% соответственно относительно контрольной группы (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние биорегуляторов на поведение животных в тесте «Открытое поле»

Вариант опыта ВА ДА Гр Б

Интакпше 8,1±0,98 158,8±5Д 1,8±0Д 2,2±0,3

Азатиоприн (Аз) 4,34 ±0,5' 49,1±3,8' 1,4±0,4 1,5±0,4

Аз+б иор егудятор №1 7,б±1,2"" 104±4,4"-" 2,3±0,5 2,0±0,3

Аз+биорегулягор №2 6,1±0,75" 79,4±2,8"" 2,0±0,3 1,3±0,4

Аз+биорегулягор ХаЗ 5,3±0,34* 70,2±2,3"'" 1,8±0Д 1,7±0,3

Примечание: ВА - вертикальная (познавательная) активность, ДА - общая двигательная активность, Гр - груминг, Б - болюсы

Таким образом, экспериментальное иммунодефицитное состояние оказывало влияние на нервную систему животных, вызывая изменение поведенческой реакции. Биорегулятор №1 не только достоверно повышал горизонтальную и вертикальную двигательную активность относительно второй группы, но и восстанавливал показатели груминга и дефекации до уровня контрольной группы, что приводило к усилению суммарной двигательной активности и ориентировочно-исследовательского поведения животных.

На следующем этапе исследования была изучена адагггогенная активность испытуемых средств.

Воздействие азатиоприна достоверно снижало устойчивость к плаванию животных. Так, продолжительность плавания интактных мышей составила (12,86±1,21) мин, тогда как у мышей, подвергнутых воздействию цито-статика, - (9,27±1,56) мин. Введение животным биорегуляторов №1, №2 и №3 приводило к повышению устойчивости к физическому утомлению, выражающемуся увеличением исследуемого показателя. Биорегулятор №1 способствовал повышению общей физической выносливости на 18% относительно второй группы, в то время как биорегуляторы №2 и №3 оказывали менее выраженное влияние на физическую работоспособность.

Результаты проведенного эксперимента показали, что биорегулятор с высокой ростстимулирующей активностью в наибольшей степени повышал физическую работоспособность экспериментальных животных на модели аза-тиоприновой иммуносупрессии.

Как и в предыдущем эксперименте, воздействие азатиоприна достоверно снижало устойчивость животных и к вису на шесте. Продолжительность виса на шесте у мышей интактной группы составила (4,79±0,71) мин, в то время как у животных азатиоприновой группы -(1,69±0,41) мин.

В результате исследования установлено, что у животных, получавших биорегулятор №1, отмечалось наиболее выраженное увеличение на 23,4% времени пребывания на шесте по сравнению с группой интактных животных, в то время как остальные испытуемые средства не оказывали значительного влияния.

В заключительном тесте «Подвешивание до полного утомления» было достоверно установлено, что азатиоприн оказывал явное угнетающее действие на организм экспериментальных животных. Об этом свидетельствует продолжительность подвешивания мышей вниз головой -(4,54±0,53) мин против аналогичной процедуры у интактных животных, составившей (14,59±1,12) мин. В свою очередь, введение трех испытуемых образцов в организм животных оказывало стимулирующее действие, повышая выносливость животных более чем в два раза по сравнению со второй группой.

Таким образом, биорегулятор №1 оказывал выраженное адаптоген-ное действие, о чем свидетельствовало повышение общей, антиортостатиче-ской и силовой физической выносливости животных, характеризующихся различными механизмами энергообеспечения тканей.

Обоснование технологических параметров получения пептидного биорегулятора

На основании результатов исследований разработана технологическая схема получения пептидного биорегулятора из селезенки яков (рис. 4).

Как видно из рисунка 4, способ получения биорегулятора включает отбор селезенки и ее замораживание, измельчение на волчке, гомогенизацию. Полученный гомогенат подвергают автолизу (гидромодуль 1:3) в 0,9%-ном растворе хлористого натрия при температуре 15°С в течение 14 ч, осадок устраняется по завершению центрифугирования. После нагревания надоса-дочной жидкости большое количество денатурированных белков удаляется центрифугированием. Далее проводится стерилизующая фильтрация через мембранный фильтр У1асНроге с диаметром пор 0,4 нм.

Известно, что консервирование биологических материалов методом сублимационной сушки при атмосферном давлении позволяет получать высокие качественные характеристики готового продукта. Поэтому дополнительно проводятся этапы сублимационного высушивания и тепловой досушки при установленных технологических параметрах.

Хранение при температуре (3-5)°С позволяет сохранить иммуномо-дулирующую активность биорегулятора до 24 мес.

Осадок -Р-

Осадок -Р-

Рисунок 4 — Технологическая схема получения пептидного биорегулятора

из селезенки яков

Для оценки молекулярной массы веществ, входящих в состав полученного биорегулятора, проводилось предварительное гель-фильтрационное разделение на колонке, в результате которого получены 4 фракции. Последующее снятие масс-спектров осуществляли в диапазоне от 500 до 20 ООО Да. В частности, было выявлено, что большинство информационных сигналов располагалось в области от 700 до 1700 Да (табл. 4).

Таблица 4 - Сигналы масс-спектров пептидов, идентифицированных во фракциях пептидного биорегулятора_

Номер фракции Молекулярная масса, Да

Cl 15157

С2 2834,3059,5420,5837,7337

СЗ 2832,3885,4520,5880,6221

С4 675,717,774, 804,859, 875, 887,929, 944, 974, 986, 1015,1031, 1057, 1098, 1128, 1158, 1201,1211, 1244,1268,1284, 1300, 1363,1440,1457,1694

Далее по воздействию на экспрессию Е-рецепторов тимоцитов морской свинки судили о ростстимулирующей активности в каждой из фракций (табл. 5). Под влиянием фракции С4 экспрессия мембранных рецепторов восстанавливалась в большей мере, о чем свидетельствовало увеличение содержания Еа-РОК до 72% контрольного уровня. Фракции С1, С2, и СЗ проявляли менее выраженное действие на розеткообразующую функцию «трипсини-зированных» тимоцитов.

Таблица 5 - Реакция «активного розеткообразования» тимоцитов морской свинки с эритроцитами кролика__

Группы Количество РОК, %

Интаиные тимоциты 40,2±2,5

Тимоциты, обработанные трипсином 17,8±1,4*

С1 21,5±2,1*

С2 22,4±2,4*"

СЗ 24,2±3,2'"

С4 28,9±3,4'"

Таким образом, можно предположить, что биорегулятор является комплексом регуляторных пептидов, неоднородным и многокомпонентным по спектру составляющих индивидуальных пептидов. Полученные данные открывают перспективы использования отдельных фракций для получения иммунокорригурующих средств на основе сырья номадного животноводства.

Качественная характеристика пептидного биорегулятора представлена в таблице 6.

Таблица 6 - Характеристика пептидного биорегулятора

Наименование показателей Характеристика нормы

Внешний вид Порошок аморфный

Цвет Темно-желтый

Запах Без посторонних запахов

Массовая доля влаги, % не более 4

КМАФАнМ, не более ШО'КОЕ/г

Бактерии группы кишечной палочки не обнаружено

Патогенные микроорганизмы, в том числе Salmonella не обнаружено

Практическая реализация результатов исследования

Для реализации возможности применения биорегулятора при создании продуктов функционального питания была произведена опытная партия колбасы «Высокогорная» с добавлением указанного средства. За основу была взята рецептура колбасы «Раменская». Так как рецептура предусматривает использование воды, которую вводят на стадии куттерования, нами было предложено произвести частичную замену воды на экстракт биорегулятора в изоэффективной концентрации. Для сравнительного анализа параллельно была выработана контрольная партия колбасы «Раменская» по традиционной технологии (ТУ 61 РСФСР 01-99).

Опытная партия колбасы «Высокогорная» получила одобрение дегустационной комиссии. Контрольная и опытная партии характеризовались ор-ганолептическими показателями со средним баллом 4,5.

На заключительном этапе исследования проведена сравнительная оценка иммунного статуса людей, находившихся в стационаре. Для оценки состояния иммунной системы организма были проведены иммунологические исследования (рис. 5).

— после включения в рацион питания колбасы «Раменская»

— после включения в рацион питания колбасы «Высокогорная»

Рисунок 5 - Иммунологические показатели периферической крови людей, употреблявших в пищу колбасы

После включения в рацион питания колбасы «Высокогорная» наблюдалась тенденция к увеличению содержания субпопуляций Т-лимфоцитов, экспрессирующих дифференцировочные рецепторы основных классов, по сравнению с контрольной партией.

Таким образом, функциональный продукт, в состав которого включен пептидный биорегулятор, проявлял иммуномодулирующее действие.

14

выводы

1. Установлено, что пептидный биорегулятор из селезенки яков восстанавливал показатели клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа экспериментальных животных на модели иммуносупрессивного состояния, а также оказывал нейротропное и адаптогенное действие.

2. Экспериментально обоснованы оптимальные технологические параметры автолиза гомогената селезенки (температура - 15°С, продолжительность - 14 ч, гидромодуль -1:3).

3. Выделены 3 автолизата из селезенки яков с высокой («Биорегулятор №1»), средней («Биорегулятор №2») и низкой («Биорегулятор №3») рост-стимулирующей активностью, выражающейся в усилении экспрессии мембранных рецепторов в 2,4; 2,2; 2 раза соответственно, по сравнению с уровнем Еа-РОК тимощггов, обработанных трипсином. Наибольшую эффективность проявлял биорегулятор №1. Иммунобиологическая эффективность данного средства определялась веществами пептидной природы с молекулярной массой от 0,68 до 1,70 кДа.

4. Разработана технология сублимированной формы пептидного биорегулятора из селезенки яков.

5. Включение в рацион питания колбасы «Высокогорная», в состав которой входит пептидный биорегулятор, приводило к увеличению иммуно-регуляторного индекса (CD4/CD8) на 11,5% по сравнению с контролем, что указывало на иммуномодулирующий эффект продукта.

6. Разработан проект технической документации на производство колбасы «Высокогорная» с добавлением пептидного биорегулятора из селезенки яков.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Гонгаева А.Г. Модификация способа выделения биологически активных фракций из органов иммунной системы яков бурятского экотипа / А.Г. Гонгаева, A.B. Битуева, С.Д. Жамсаранова // Материалы XI Междунар. конф. молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологию). Казань, 2010. С. 232.

2. Гонгаева А.Г. Оценка адаптогенной активности пептидных биорегуляторов, выделенных из селезенки аборигенных яков / А.Г. Гонгаева, A.B. Битуева, С.Д. Жамсаранова // Материалы I Всерос. науч.-практ. конф. «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока». Улан-Удэ, 2010. С. 41-44.

3. Гонгаева А.Г. Оценка иммуномодулирующей активности пептидных биорегуляторов, выделенных из селезенки яков бурятского экотипа / А.Г. Гонгаева, A.B. Битуева, С.Д. Жамсаранова // Материалы VIII Междунар.

науч. конф. студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». М., 2010. С.70-71.

4. Гонгаева А.Г. Исследование влияния пептидных биорегуляторов на нервную систему животных в тесте «открытое поле» / А.Г. Гонгаева

А.В. Бету ев а, С.Д. Жамсаранова // Сб. науч. тр. с междунар. участием Серия: Химия и биологически активные вещества природного происхождения. Улан-Удэ, 2011. Вьш.16. С. 26-29.

5. Гонгаева А. Г. Оптимизация этапа аутолиза гомогената селезенки яков на основе математического метода планирования эксперимента / А Г Гонгаева, А. В. Бигуева, С. Д. Жамсаранова // Вестник Восточно-2011мТс Г1°С9У^Рственного технологического университета. Улан-Удэ,

6. Гонгаева А.Г. Анализ пептидов из ткани селезенки яков бурятского экотипа методом MALDI-TOF масс-спекгрометрии / А.Г. Гонгаева С Д Жамсаранова // Сб. науч. тр. с междунар. участием, посвящ. 50-летию' университета. Серия: Химия и биологически активные вещества природного происхождения. Улан-Удэ, 2012. Вып. 17. С. 3-7.

7. Гонгаева А.Г. Биорегуляторные пептиды ткани селезенки яков бурятского экотипа и оценка их биологической эффективности /А.Г. Гонгаева, С.Д. Жамсаранова // Материалы междунар. конф. «биология - наука XXI века». М., 2012 . С. 190-191.

8. Жамсаранова С. Д. Оценка иммунобиологической эффективности аутолизатов селезенки яков на модели азатиоприновой иммуносупрессии /

C.Д. Жамсаранова, А.Г. Гонгаева // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. Иркутск, 2012. № 4. С. 190-192.

9. Гонгаева А.Г. Селезенка яков Бурятии как перспективный источник биорегуляторных пептидов/ А.Г. Гонгаева, С.Д. Жамсаранова // Материалы II Всерос. науч.-практ. конф. «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока». Улан-Удэ, 2012. С. 128-130.

10 Gongaeva A. G. Isolation of biologically active peptides from cattle and yaks spleen / A. G. Gongaeva, A. V. Bitueva, S. D. Zhamsaranova // Current Problems of Food Engineering and Biotechnology Proceedings of the International Workshop, July 4-7,2009, Ulan-Ude (Russia).Ulan-Ude, 2010. P. 6-10.

11. Bitueva A. V. Research into adaptogenic activity of peptide bioregulators isolated from the spleen native yaks / A. V. Bitueva, A. G. Gongaeva S

D. Zhamsaranova // Booklet of International Conference «Chemistry in medi-cine».Ulaanbaatar, 2010. P. 67-69.

12. Gongaeva A. G. Choice of autolysis parameters for optimum extraction of biologically active peptides from yaks spleen / A. G. Gongaeva, A V Bi-

™S,V,a' т'P' Zhamsaranova " Booklet of International Conference «Хурэл Тогоот-2011 ».Ulaanbaatar, 2011. P. 205-209

Подписано в печать 27.02.2013 г. Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л. 0,93. Тираж 100 экз. Заказ №50

Издательство ВСГУТУ 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40 в ©ВСГУТУ, 2013

ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет

технологий и управления»

ГОНГАЕВА АЮНА ГАЛДАНОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПЕПТИДНОГО БИОРЕГУЛЯТОРА

ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ ЯКОВ

Специальность 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

На правах рукописи

СО

со тг

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

С.Д. Жамсаранова

~ Ю

О °

П СО

С I £

Улан-Удэ-2013

Содержание

с.

Введение.................................................................................... 5

Глава 1 Аналитический обзор.........................................................7

1.1 Функциональные продукты питания............................................. 7

1.2 Пептидные биорегуляторы как современные биологически активные добавки...................................................................................... 15

1.3 Механизмы пептидной регуляции гомеостаза............................... 19

1.4 Иммунная система. Иммунодефицитные состояния........................ 29

1.4.1 Регуляторные пептиды из центральных органов иммунной системы......................................................................................... 37

1.4.2 Регуляторные пептиды из периферических органов иммунной системы..................................................................................... 41

1.5 Заключение по аналитическому обзору........................................ 46

Глава 2 Материалы и методы исследования...........................'..................49

2.1 Организация выполнения работы................................................ 49

2.2 Материалы и объекты исследования............................................ 49

2.3 Методы исследования.............................................................. 51

Глава 3 Результаты исследования.................................................... 56

3.1 Модификация способа получения биорегулятора............................56

3.1.1 Оптимизация процесса автолиза гомогената селезенки яков.......... 58

3.1.2 Определение ростстимулирующей активности автолизатов........... 62

3.2 Оценка иммунобиологической эффективности биорегуляторов на модели азатиоприновой иммуносупрессии......................................... 64

3.2.1 Исследование относительной массы и клеточности иммунных органов при введении испытуемых средств на фоне иммуносупрессии...... 64

3.2.2 Экспериментальная оценка эффективности испытуемых средств в регуляции клеточного иммунитета мышей на фоне азатиоприновой иммунодепрессии.........................................................................66

3.2.3 Влияние биорегуляторов на функциональное состояние гуморального иммунного ответа при вторичном иммунодефицитном состоянии.......68

3.2.4 Исследование влияния биорегуляторов на нервную систему животных в тесте «Открытое поле»...................................................69

3.2.5 Оценка адаптогенной активности биорегуляторов на фоне иммунодефицита..........................................................................71

3.3 Разработка технологии сублимированной формы пептидного биорегулятора....................................................................................... 75

3.4 Гель-фильтрационное фракционирование биорегулятора.................. 77

3.5 Масс-спектрометрический анализ биорегулятора............................79

3.6 Оценка безопасности и токсичности биорегулятора, полученного из

селезенки яков............................................................................. 81

Глава 4 Практическая реализация результатов исследования.................. 85

4.1 Разработка мясопродукта с добавлением

пептидного биорегулятора..............................................................85

4.2 Оценка качественных характеристик продукта...............................88

4.3 Изучение иммуномодулирующей эффективности готового продукта... 91 Глава 5 Расчет экономической эффективности пептидного биорегулятора

из селезенки яков......................................................................... 93

Обсуждение результатов................................................................. 100

Выводы......................................................................................108

Библиографический список............................................................. 109

Приложения................................................................................ 127

Список сокращений

Аз - азатиоприн

БАД - биологически активная добавка

ВИД - вторичные иммунодефициты

ГА - титр гемагглютининов

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ИДС - иммунодефицитные состояния

ИР - индекс реакции

КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультативно - анаэробных микроорганизмов ММ - молекулярная масса ЭБ - эритроциты барана КРС - крупный рогатый скот РОК - розеткообразующая клетка ФПП - функциональные продукты питания

CD - cell differentiation antigens или cluster definition - антигены кластеров дифференцировки клеток.

Введение

Совершенствование современных технологий производства продуктов питания тесно связано с расширением ассортимента за счет переработки нетрадиционного сырья, с переходом от использования искусственных пищевых добавок к натуральным, обладающим высокой биологической активностью, а также с разработкой функциональных продуктов питания.

Источником природных биологически активных веществ, которые могут быть использованы как биологически активные добавки к пище или ингредиенты продуктов функционального питания, является растительное и животное сырье.

Установлено, что центральные и периферические органы иммунитета животных, которые относят к отходам основного производства, играют важную роль в качестве продуцентов регуляторных пептидов. В свою очередь, регуляторные пептиды участвуют в поддержании гомеостаза и являются важнейшими компонентами в функционировании основных регуляторных систем организма, а именно нервной, эндокринной и иммунной.

Географическое положение Республики Бурятия, гористая территория благоприятствуют развитию всех отраслей животноводства, в том числе содержанию яков. Отличительными особенностями аборигенных яков является отличная приспособленность к климатическим и хозяйственным условиям, неприхотливость к корму и условиям содержания, устойчивость к ряду заболеваний, по сравнению с культурными породами, хорошие вкусовые качества мясной продукции, высокая экономическая эффективность при содержании.

Домашний як (Bos Poephagus grunnies) остается малоизученным видом среди других сельскохозяйственных животных, так как разведение его ограничено в основном высокогорными труднодоступными территориями азиатского континента, где этот вид является объектом традиционного экстенсивного животноводства.

В регионе Забайкалья, в Бурятии, як разводится в хозяйствах, угодья которых расположены в отрогах и долинах хребтов Саянской горной системы и прилегающих хребтов.

На сегодняшний день субпродукты, в том числе и селезенка яков, используются нерационально (либо не реализуются, либо идут на кормовые цели), хотя являются источником биологически активных веществ.

Таким образом, чрезвычайно актуальным является поиск новых природных биологически активных веществ, которые могут быть использованы как БАД к пище или в качестве ингредиентов продуктов функционального питания с профилактическими и биокорригирующими свойствами.

Глава 1 Аналитический обзор

1.1 Функциональные продукты питания

Питание является одним из важнейших факторов, предопределяющих трофический гомеостаз организма как здорового, так и больного человека. Хорошо известно, что между состоянием питания человека, здоровьем и болезнью существует тесная взаимосвязь. Многочисленными исследованиями установлено, что нарушения питания могут приводить к различным структурно-функциональным изменениям в организме и, как следствие этого, к нарушению метаболизма, гомеостаза и его адаптационных резервов [82].

В связи с неблагоприятными воздействиями окружающей среды, возрастающим количеством заболеваний и учащающимся стрессовым состоянием людей, возникает все большая необходимость в разработке и применении функциональных продуктов питания (ФПП).

Исследования и наблюдения убедительно показали, что ФПП обладают не только питательной ценностью, но и регулируют функции и биохимические реакции организма [90].

Варьируя основами продуктов в процессе их производства, обогащая их БАД, можно добиться определенной направленности защитных комплексов [1].

В развитых странах мира, таких как Япония, Англия, США, Германия, Франция и др., реализуются целевые национальные программы по оздоровлению населения путем разработки и организации производства пищевых компонентов, корректирующих биохимический состав продуктов питания массового потребления. Например, в Японии производство продуктов функционального питания приобрело стратегическую направленность [128].

В настоящее время 40-60 % североамериканцев и японцев, а также около 32 % жителей Западной Европы вместо традиционных лекарственных препаратов для укрепления и восстановления здоровья используют биологически активные добавки к пище и функциональные пищевые продукты [135].

7

Все продукты питания можно разделить на две большие группы. К первой группе относятся продукты питания общего назначения, ко второй группе - продукты питания функционального назначения.

Производство ФПП является актуальной задачей для современной пищевой промышленности. В мировом масштабе идет постоянная работа по созданию новых ФПП, обладающих как широким спектром применения, так и точечной направленностью на конкретный орган, биотип, систему. Создание и внедрение в производство ФПП является одним из направлений гуманистической программы человека, провозглашенной ООН [128].

Концепция функционального (или позитивного) питания зародилась в 80-е гг. прошлого века в Японии, где приобрели большую популярность так называемые функциональные продукты (сокращённо от «физиологически функциональные»). Эти продукты питания содержат ингредиенты, приносящие пользу человеку, повышают его сопротивляемость заболеваниям, улучшают физиологические процессы в организме, позволяя долгое время сохранять активный образ жизни. Они предназначены широкому кругу потребителей, имеют вид обычной пищи и должны потребляться регулярно в составе установленного рациона питания.

Концепция «Функциональное питание» как самостоятельное научно-прикладное направление в области здорового питания в современном терминологическом плане сложилась в начале 90-х годов [5].

С современных позиций под термином «функциональные пищевые продукты» понимают такие продукты питания, которые предназначены для систематического употребления в составе пищевых рационов всеми возрастными группами здорового населения с целью снижения риска развития заболеваний, связанных с питанием, сохранения и улучшения здоровья за счет наличия в их составе физиологически функциональных пищевых ингредиентов.

Основные подходы к определению функционального питания должны отвечать трем признакам:

• составлять часть каждодневного рациона;

• компоненты должны быть натуральными;

• наряду с пищевой полноценностью должны способствовать регулированию какой-либо функции организма [134,162].

Существует несколько определений понятия функционального питания. Это определение:

• в законе ЕС о пищевых продуктах;

• данное Israel Goldberg (1994);

• принятое на научной конференции «Функциональные продукты: методологические, технологические и трофологические аспекты производства», Москва, 2001 г., ВНИИ мясной промышленности им. Горбатова;

• предложенное «согласно мнению большинства зарубежных и отечественных исследователей», группой авторского коллектива во главе с профессором Тужилкиным В.И. (МГУПП) [42,63].

В законе ЕС о пищевых продуктах дано следующее определение функциональному питанию: «Функциональные пищевые продукты - любой модифицированный пищевой продукт или пищевой ингредиент, который может оказывать благотворное влияние на здоровье человека помимо влияния традиционных питательных веществ, которые он содержит».

Определения, данное Israel Goldberg и принятое на научной конференции «Функциональные продукты: методологические, технологические и трофологические аспекты производства» схожи между собой и определяют функциональный продукт «как продукт, представляющий собой продукт (а не капсулы, таблетки или порошки), полученный из природных ингредиентов. Может и должен входить в каждодневный рацион питания человека. При употреблении регулирует определенные процессы в организме, например, стимулирует активность иммунных реакций, предотвращает развитие

определенных заболеваний, контролирует физические процессы в организме и т.п.» [14,162].

Ученые, занимающиеся проблемами функционального питания в Московском государственном университете пищевых производств во главе с проф. Тужилкиным В.И. под термином функциональное питание предлагают понимать «такие пищевые продукты, которые предназначены для систематического употребления в составе обычных пищевых рационов всеми группами здорового населения, полезные для здоровья, сохраняющие и улучшающие его состояние, снижающие риск развития, связанных с питанием заболеваний, за счет наличия в составе пищевых функциональных ингредиентов, обладающих способностью оказывать благоприятный эффект на одну или несколько физиологических функций, метаболических или поведенческих реакций организма человека» [128].

С учетом этого определения авторы предлагают выделить основные категории пищевых продуктов, состав и свойства которых «позволяют позиционировать их как функциональные»:

• традиционные продукты, содержащие в нативном виде значительные количества физиологически активных макро- и микронутриентов;

• традиционные продукты, в которых технологически понижено содержание вредных для здоровья компонентов;

• традиционные продукты, дополнительно содержащие функциональные ингредиенты путем введения в продукт БАД.

Функциональные продукты должны отвечать следующим требованиям:

• быть натуральными;

• иметь вид обычной пищи, то есть не выпускаться в таких лекарственных формах, как таблетки, капсулы, порошки;

• употребляться перорально, то есть как обычная пища;

• быть полезными для питания и здоровья, при этом полезные качества должны быть научно обоснованы, а ежедневные дозы должны быть одобрены специалистами;

• быть безопасными с точки зрения сбалансированного питания;

• не снижать питательную ценность пищевых продуктов;

• иметь установленные значения физико-химических показателей и точные методики их определения.

Функциональные продукты предназначены для:

• компенсации дефицита биологически активных компонентов в организме;

• поддержания нормальной функциональной активности органов и систем;

• уменьшения факторов риска какого-либо заболевания;

• поддержания полезной микрофлоры в организме человека, поддержания нормального функционирования желудочно-кишечного тракта [99].

При создании функциональных продуктов необходимо осуществлять выбор и обоснование пищевых основ (продуктов) и функциональных ингредиентов с учетом совокупности потребительских свойств и целевого физиологического воздействия создаваемого продукта.

К функциональным пищевым ингредиентам относят биологически ценные, безопасные для здоровья, имеющие точные физико-химические характеристики ингредиенты, для которых выявлены и научно обоснованы свойства, установлена суточная физиологическая потребность [5].

В целом общая схема создания функциональных продуктов питания представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 - Схема создания функциональных продуктов питания

В состав ФПП могут входить: аминокислоты, пептиды, протеины, витамины, молочнокислые бактерии, жирные ненасыщенные кислоты, минералы, жизненно важные вещества из растений и антиоксиданты [5,91,113,172].

В России и за рубежом функциональные ингредиенты широко используются для обогащения традиционных продуктов (мясные и молочные продукты, хлебобулочные изделия, напитки, сухие завтраки, растительные масла, соль) с целью придания им функциональных свойств, например, кальций, витамины Б и К, изофлавоны для поддержания хорошего состояния костной ткани; витамины В6, В]2, А, С, Е, фолиевая кислота, каротиноиды, линолевая, линоленовая кислоты, - омега-3 жирные кислоты, фитостеролы, фитостано-

лы, хитозан, пектины - для снижения риска развития сердечно-сосудистых заболеваний; различные пребиотики и пробиотики - для общей резистентности организма и сохранения нормальных функций пищеварительного тракта [14,42].

В связи с недостаточностью в питании человека белка животного происхождения была разработана технология производства пищевого белка из малоценных продуктов переработки птицы. Изучены возможные направления использования белковых концентратов в производстве продуктов быстрого приготовления и колбасно-кулинарных изделий. Доказано, что разработанный биотехнологический способ производства белковых концентратов позволяет увеличить использование белка из мяса птицы на пищевые цели с 45 до 65% [65].

Так, трипептиды Пе-Рго-Рго (1РР) и/или Уа1-Рго-Рго (УРР) применяют для получения мягких сыров, снижающих артериальную жесткость и улучшающих эластичность кровеносных сосудов [98].

Известе