автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии комплекса питательных сред и мониторинговые исследования мяса и мясных продуктов на наличие листерий

На правах рукописи

Юшина Юлия Константиновна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ КОМПЛЕКСА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И МОНИТОРИНГОВЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ НА НАЛИЧИЕ ЛИСТЕРИЙ

Специальность: 05.18.04 -технология мясных, молочных, рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2005 г.

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В. М. Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИ мясной промышленности им. В.М. Горбатова Россельхо-закдемии).

Научный руководитель: - доктор ветеринарных наук,

профессор Костенко Ю.Г

Официальные оппоненты: - доктор технических наук,

профессор Семенихина В.Ф

- кандидат технических наук Апраксина С.К

Ведущая организация: ГУ ВНИИПП

Всероссийский институт птицеперерабатывающей промышленности

Защита диссертации состоится » в

на заседании диссертационного совета Д 006.(Й 1.01 Нри ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им В.М. Горбатова Россельхозакдемии

по адресу: 109316, Москва, ул.Талалихина, д.26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИМП.

Автореферат разослан «

2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук, с.н.с.

ZI ZW7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Одной из основных задач отечественной мясной промышленности на современном этапе развития является обеспечение безопасности для потребителя выпускаемых мясных продуктов.

Известно, что в мясном сырье и продукции из него изготовленной, особенно при нарушении технологических режимов и санитарно-гигиенических условий производства, можно выявить опасные для человека микроорганизмы - листерии.

В связи с этим, в зоне Европейского экономического сотрудничества, а также других развитых странах (США, Канада, Япония) строго регламентированы требования по контролю патогенных листерий в мясе и мясных продуктах, потребление которых может вызвать заболевание людей. Исследование пищевых продуктов на наличие возбудителя листериоза является обязательным.

Вопросам изучения проблемы листериоза посвящены научные работы отечественных и зарубежных ученых: Бакулова И.А., Бутко М.П., Васильева Д.А., Ермолаевой С.А., Карликановой Н.Р., Костенко Ю.Г., Котлярова В.М., Кривоносовой О.В., Малахова Ю.А., Сахарова П.П., Сливко П.П., Тартаковского И.С., Янковского К.С., Casolari С., Curíale М S., Donelly C.W., Fabio A., Farber J.M., Gray M.L., Lewus С., Messi P., Seeliger H.P., Schlech W.F., и др.

С начала 1990-х годов листериоз проявил себя как пищевая инфекция человека. Доказано, что вспышки его у людей с летальностью до 35% связаны с употреблением в пищу различных продуктов питания (мясо, мясные продукты, молоко, мягкие сыры, яйца, рыба), контаминированных листериями.

Ранее известные в СССР (начало 70-х годов) специальные питательные среды предназначались в основном для выделения возбудителя листериоза от больных животных. До начала настоящей работы в России не было технологии производства современных эффективных питательных сред для выявления листерий в пищевых продуктах.

Проблема пищевого листериоза приобретает также существенное социально-экономическое значение по причине ущерба от изъятия контаминированной продукции, ограничения экспорта и импорта, остановки производства.

Принимая во внимание указанное выше, необходимо было обосновать и создать в Российской Федерации технологию современных питательных сред для выявления листерий.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА J

В России до последнего времени практически не было достоверных сведений о выделении листерий из пищевых, в частности из мясных продуктов. Одной из причин этого было отсутствие эффективных отечественных питательных сред. Используемые в зарубежной практике аналоги весьма дорогостоящи и не могут широко использоваться в нашей стране.

В тоже время следует отметить, что в нашей стране, несмотря на актуальность и значимость проблемы листериоза, не проводились широкие мониторинговые исследования мясных продуктов на наличие листерий.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является создание технологии производства комплекса отечественных питательных сред, разработка нормативной методологической базы контрольных исследований и мониторинг мяса и мясопродуктов на наличие возбудителя листериоза.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих основных задач:

1.Обосновать и разработать комплекс отечественных питательных сред для диагностики листерий в пищевых продуктах.

2.Разработать технологию производства питательных сред и методологическую основу контроля мясных продуктов на наличие листерий.

3.Выполнить мониторинговые исследования мяса и мясных продуктов на наличие листерий с использованием созданных питательных сред и методологии контроля.

Научная новизна. Обоснованы технология производства и состав комплекта питательных сред, определена их эффективность и возможность использования при контроле безопасности мяса и мясопродуктов.

Впервые в России обоснована современная методология контроля мяса и мясных продуктов на наличие патогенных листерий.

Определена частота выявления листерий при мониторинговых исследованиях мяса и мясных продуктов в некоторых регионах России.

Практическая значимость. Разработаны питательные среды предобогащения, обогащения, для выделения и культивирования листерий (ТУ 9385-670-00419779-2001 «Питательный бульон для выделения и культивирования листерий» - ПБЛ и ТУ 9385-66900419779-2001 «Питательный агар для выделения и культивирования листерий» - ПАЛ) с Наставлениями к их применению. Утверждены регламенты производства Питательного бульона для выделения и

культивирования листерий (ПБЛ) №00001927-15-97-2002 и Питательного агара для выделения и культивирования листерий (ПАЛ) №00001927-15-98-2002. Получен патент на изобретение №2223313 «Дифференциально-диагностическая среда для выявления листерий», приоритет от 26.12.2001г.

Результаты исследований включены как составная часть ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes» , а также «Методическое руководство по санитарно-микробиологическому контролю мясных и молочных продуктов на наличие листерий».

Получены мониторинговые данные о частоте выявления возбудителя листериоза в мясе и мясных продуктах в некоторых регионах России.

Апробация результатов исследований. Материалы по теме диссертационной работы доложены на Научно-практических конференциях: «Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, крейтцфельдта-якоба и др. прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена» (г. Покров 2001 г.); "Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней" (г. Саратов, 2003 г.), на семинаре работников мясной промышленности «Ветеринарно-санитарный контроль в мясной отрасли» (г. Москва, 2003 г); «XV интернациональный симпозиум по проблеме листериоза» (Упсала, Швеция, 2004 г).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 9 статей в журналах «Мясная индустрия», «Все о мясе», в сборниках научных трудов ВНИИМП им. В.М. Горбатова, в материалах отечественных конференций и зарубежного симпозиума.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, основной части, выводов, списка литературы и приложения. Материалы диссертации изложены на 114 страницах машинописного текста, содержат 21 таблицу и б рисунков, дополнены приложениями. Список литературы включает в себя 183 научно-технических источников отечественных и зарубежных авторов.

ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Организация эксперимента. Исследования выполнены в лаборатории микробиологии и гигиены производства ГНУ ВНИИ мясной промышленности им В.М. Горбатова. В разработке технологии комплекса питательных сред участвовали сотрудники отдела

диагностических препаратов ФГУП Государственного Научного Центра прикладной микробиологии (г.Оболенск). Разработки выполнены при консультации и личном участии начальника отдела диагностических препаратов, к.м.н. М.В.Храмова. Идентификацию выделенных культур листерий проводили во ВНИИМПе, подтверждали во ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии. Положения, разработанные при выполнении наших исследований включены как составная часть в общий нормативный документ ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes». Настоящая диссертационная работа выполнена при консультативной помощи к.в.н Янковского К.С. Схема проведения исследований представлена на рис 1.

Объекты исследований. Музейный штамм Listeria monocytogenes serovar 4а, Listeria monocytogenes 766, Listeria monocytogenes 19111, Listeria monocytogenes 19112, музейные штаммы Salmonella choleraesuis ATCC 13312, Staphylococcus aureus «Лоссманов», Escherichia coli 675, E.coli 3912/41, Bacillus subtilis ATCC 6052, Proteus vulgaris HX 19 222, Enterococcus faecalis, полученные из ГИСК им. Тарасевича, выделенные микроорганизмы; листериозные бактериофаги^- 2А L-4A; разработанные селективные питательные среды: питательный бульон для листерий (ПБЛ I, ПБЛ II), питательный агар (ПАЛ) для культивирования и выделения листерий; зарубежные аналоги питательных сред для листерий фирм bioMerieux (Франция), Himedia (Индия) - полуконцентрированный бульон Фразера, бульон Фразера, Oxford и PALCAM агар; ТСА-трипказо-соевый агар и ТСВ-трипказо-соевый бульон -Himedia (Индия); модельная мясная среда (стерилизованные консервы детского питания «Говядина и свинина»); продукты убоя животных: мясо и субпродукты охлажденные (головной мозг, печень, селезенка, сердце, почки, поверхностные шейные лимфатические узлы); мясной фарш; мясное сырье отобранное в технологических процессах производства вареных колбас; полуфабрикаты мясные рубленые крупнокусковые, мелкокусковые, в тестовой оболочке; колбасы (вареные, варено-копченые, сырокопченые); сосиски, сардельки; пищевые ингредиенты и вспомогательные материалы, мясо птицы механической обвалки.

Методы исследований. При проведении исследований использовали принятые микробиологические методы, в том числе, регламентируемые ISO 11290.2-98 "Микробиология продуктов питания и животных кормов. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета микроорганизмов Listeria monocytogenes". Дополнительно

Анализ научно-технической литературы

Определение и обоснование составляющих компонентов питательных сред

Испытание комплекса разработанных питательных сред

А.

Изучение эффективности разработанных питательных сред

Испытание питательных сред с использованием тест-культур музейных штаммов

Испытание питательных сред с контаминацией тест-культурами музейных штаммов модельной мясной среды и мясных продуктов

I

Исследование эффективности селективных питательных сред в процессе их длительного хранения

Разработка технологии производства питательных сред и комплекта нормативной документации

Разработка методологии контроля пищевых

продуктов на наличие Ь.топосуЬ^епе8 --

Мониторинг мяса и мясных продуктов на наличие листерий с использованием комплекса созданных питательных сред

Рис.1. Схема проведения эксперимента

использовали систему для идентификации микроорганизмов рода Listeria фирмы bio Merieux (Франция) - api Listeria; экспресс-метод индикации листерий при помощи наборов Listeria и Listeria monocytogenes для miniVIDAS фирмы bio Мепеих(Франция).

Эффективность разработанных питательных сред и зарубежных аналогов (ISO) изучали согласно действующим "Методическим указаниям по физико-химическому и биологическому контролю белковых гидролизатов для питательных бактериологических сред" (30.12.82 г), "Методическим рекомендациям к контролю питательных сред по биологическим показателям" (19.02.80 г.). Сроки хранения питательных сред определяли, используя методические рекомендации "Определение сроков годности сухих микробиологических сред и питательных основ методом "ускоренного старения" при повышенной температуре" (22.08.86 г.). Для исследования эффективности разработанных жидких питательных сред (ПБЛ I и ПБЛ II) и плотных (ПАЛ) исследовали следующие показатели: скорость роста, дифференциацию, чувствительность, ингибицию, эффективность и стабильность основных биологических свойств тест-культуры листерий. Показатель эффективности жидких питательных сред ПБЛ I и ПБЛ II изучали по изменению оптической плотности (Е).

Мониторинговые исследования мяса и мясных продуктов проводили согласно созданному при выполнении настоящей работы ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий L.monocytogenes».

Пробы мясного сырья и субпродуктов поступили при экспертизе продуктов убоя животных из Белгородской, Воронежской, Курской, Московской,Тамбовской и Тульской областей.

Все опыты ставили с числом повторностей (не менее 3-х), обеспечивающих получение воспроизводимых и достоверных результатов. Достоверность статической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стьюдента-Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования по обоснованию компонентного состава комплекса питательных сред для диагностики Listeria monocytogenes в пищевых продуктах. На первом этапе разработки комплекса микробиологических питательных сред, нами были изучены различные их варианты, разработанные с использованием панкреатических гидролизатов рыбной муки (ПГРМ) и казеина (ПГК), пептона ферментативного, экстракта пекарных дрожжей, в качестве компонентов для эффективного роста листерий при их

культивировании, а также в целях сравнения их с компонентами, входящими в наиболее часто используемые зарубежные питательные среды (ТСА-трипказо-соевый агар и ТСВ-трипказо-соевый бульон, а также бульон Фразера и ПАЛКАМ агар).

Основным компонентом первого варианта сред служил ПГРМ с добавлением хлористого натрия, дрожжевого экстракта и агара для плотной питательной среды, второго - 111К с дрожжевым экстрактом и пептоном ферментативным, хлористого натрия и агара, третьего -ПГРМ и ПГК с дрожжевым экстрактом, хлористого натрия и агара. Из исследованных прописей наиболее высокой чувствительностью в отношении поддержания роста листерий, сравнимой с ТСА (трипказо-соевый агар) и ТСВ (трипказо-соевый бульон), обладали среды, приготовленные на основе второго и третьего вариантов. Проверка сочетаний в средах на этих основах компонентов (ПГРМ и ПГК) различных серий показала что все серии гидролизатов обеспечивали хороший рост листерий. Следует отметить, что введение в качестве источника азота панкреатического гидролизата рыбной муки, а также панкреатического гидролизата казеина в состав плотной питательной среды явилось принципиально важным, поскольку позволило получить сухую, стандартную среду. Наиболее оптимальными оказались следующие варианты основы жидкой и плотной питательной сред (на 1000 см3 дистиллированной воды):

Жидкая питательная среда, г: Плотная питательная среда, г: Пептон ферментативный - ПГРМ - 15,0

При использовании жидких сред рост листерий характеризовался легким помутнением питательных сред, при встряхивании которых наблюдались муаровые волны (опалесценция) -(рис 2). Следует отметить, что время визуального обнаружения роста листерий для жидких сред находилось в пределах 24ч, что соответствует зарубежным аналогам жидких питательных сред.

15,0

ПГК-10,0

Экстракт пекарных дрожжей -2,0

МаС1-3,5

ПГК -10,0

Экстракт пекарных дрожжей -2,0

№С1-3,5 Агар -13,0

© @

ф

Рис. 2. Рост культуры листерий в жидкой среде © - контроль, © - Listeria monocytogenes 19112, ® - Listeria monocytogenes 19111

Другим принципиальным моментом при разработке питательных сред явилось введение в состав плотной питательной среды эскулина в качестве источника углерода и цитрата железистого аммония в качестве индикатора гидролиза данного углевода -(рис 3).

Рис.3 Рост культуры листерий на плотной питательной среде

Листерии являются эскулинположительными

микроорганизмами. Данная индикаторная система (эскулин + соль железа) позволяет легко выявить гидролиз эскулина по образованию черного ореола вокруг колоний листерий.

Для получения эффекта селективности питательных сред нами испытаны различные антимикробные препараты. Наилучшие результаты получены с использованием комбинации полимиксина В сульфат, налидиксовой кислоты, акрифлавина. Были изучены различные концентрации компонентов селективной добавки:

Уменьшение концентраций антимикробных препаратов влекло за собой быстрый рост посторонней микрофлоры и вследствие этого невозможности получения оптимального роста листерий. Увеличение же способствовало подавлению роста не только сопутствующей микрофлоры, но и непосредственно листерий. Таким образом, в результате проведенных исследований определены оптимальные дозы их внесения (полимиксина В сульфат-0,01; налидиксовой кислоты-0,02; акрифлавина-0,01), обеспечивающие выделение листерий из материала и четкую дифференциацию от сопутствующей микрофлоры. Было показано, что предварительная инкубация суспензии бактерий исследуемого штамма листерий вместе со штаммами E.coli, S.choleraesuis, P.vulgaris и др. при температуре 30°С в средах в присутствии данных антимикробных препаратов в течение 48 ч инкубации приводила к элиминации посторонней микрофлоры почти во всех случаях. Для подавления роста Е. faecalis в пропись разрабатываемых сред была введена такая селективная добавка как хлорид лития. Эквпериментально установлено, что наиболее оптимальная концентрация хлорида лития в плотной питательной среде составляет 15 г/л. При внесении данной концентрации происходило полное подавление роста E.faecalis и не происходило ингибирование L.monocytogenes. В составе жидкой питательной среды ПБЛ определена оптимальная концентрация хлорида лития -3 г/л.

Полученные результаты исследований послужили основой разработанных питательных сред: «Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ)» и «Питательный агар для выделения и культивирования листерий (ПАЛ)».

Изучение эффективности разработанных питательных

сред.

Полимиксина В сульфат Налидиксовая кислота Акрифлавин

миним. средн. максим,

конц. г/л конц. г/л конц. г/л

0,005 0,01 0,015

0,015 0,02 0,025

0,005 0,01 0,015

При исследовании показателя чувствительности и скорости роста, установлено, что среда ПАЛ обеспечивает на всех засеянных чашках Петри рост тест-штамма L.monocytogenes 766 не позднее 48 ч инкубации при температуре 30°С при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10"7 (около 10 м.к.) в виде мелких, круглых, серо-желтых колоний диаметром 0,2-1,0 мм с образованием вокруг колоний черной зоны на фоне зелено-желтой среды.

Показатель ингибиции для тест-штаммов S.choIeraesuis и E.coli более 10 и достигает 105 КОЕ/мл.

Изучение показателя эффективности жидких питательных сред ПБЛ I и ПБЛ П показало, что значение оптической плотности (Е) при максимальном разведении L. monocytogenes 10s и времени инкубирования в ПБЛ I 48 ч составило 0.132, в то время как для культуры S.aureus - 0.099. Из этого следует, что рост и развитие листерий в данных средах более интенсивный по сравнению со стафилококками.

Значения оптической плотности для наименьшего разведения культур (105 КОЕ/мл) S.choIeraesuis и E.coli колебались от 0.060 до 0.065 (в ПБЛ II). Это свидетельствует об отсутствии роста данных микроорганизмов, т.е. разработанные среды неблагоприятны для их роста. Наиболее выраженным показателем дифференциации обладала плотная среда ПАЛ, выразившимся в способности L.monocytogenes образовывать черное окрашивание среды. S. aureus образовывал красно-коричневую зону, что является диагностирующим признаком от листерий. Тест-кулыуры S. dublin и Е. coli не обладали способностью расти на этой среде. При изучении стабильности биологических свойств тест-кулыуры Listeria monocytogenes на разработанных питательных средах ПБЛ I, ПБЛ II и ПАЛ не отмечено морфологических (форма и расположение клеток, подвижность, отсутствие спор и капсул) и культуральных изменений в характере роста тест-культуры.

Обоснование и разработка технологии и нормативной документации для производства комплекса питательных сред.

Основание для разработки. Проект технических условий отечественных питательных сред для выделения и культивирования патогенных листерий разработан в связи с необходимостью совершенствования и улучшения диагностики листериоза у животных и людей и завершением производственных испытаний.

Цели и задачи разработки ТУ. Основная цель и задача разработки ТУ- установление единых норм, требований и показателей качества питательной среды для выделения и культивирования

листерий, а также единых методов испытания этих показателей и требований к упаковке, маркировке, транспортированию, хранению и исследовать их свойства в процессе длительного хранения.

Изучение специфичности и эффективности питательных сред в зависимости от концентрации и экспозиции культивирования листерий.

Для получения сведений о специфичности и эффективности разработанных питательных сред для выделения листерий были проведены контрольные испытания на мясных модельных средах и мясных продуктах с использованием тест культур музейных штаммов микроорганизмов. При исследовании ростовых свойств смеси микроорганизмов L. monocytogenes, S.aureus, S.choleraesuis и E.coli установлено (табл. 1) наличие визуально-видимого роста микроорганизмов (помутнение питательной среды на среде предобогащения ПБЛI и ПБЛII) через 24 ч инкубирования разведений микробной взвеси концентраций 105 и 104. При увеличении сроков инкубирования до 48 ч обнаружен рост на меньших концентрациях. Учитывая, что в мясопродуктах изначальное КОЕ/г листерий может быть невысоким, культивирование посевов в течение 48 ч следует признать обязательным. Также была изучена эффективность комплекса созданных питательных сред с контаминацией тест-культурами музейных штаммов модельной мясной среды. При этом установлена высокая селективная способность разработанных питательных сред: ингибирование S. choleraesuis и Е. coli наблюдалось при всех испытанных концентрациях (105, 104, 103 и 102). Наличие роста возбудителя листериоза (почернение питательной среды) на ПАЛ был обнаружен при пересеве всех испытанных разведений.

Разработка технологического регламента производства питательных сред и нормативных документов. На основании полученных данных разработанные выше питательные среды вырабатывали в соответствии со схемой, представленной на рис.4.

Получение основы микробиологических питательных сред ПБЛ и ПАЛ. Технологические процессы производства питательных сред, в том числе ПБЛ и ПАЛ имеют одинаковые стадии и отличаются только тем, что на стадии смешивания в питательный агар листериозный (ПАЛ) добавляется агар-агар в качестве гелеобразуюшего вещества. Все процессы приемки сырья, подготовки оборудования, вспомогательных операций и основного технологического процесса отражены в технологических инструкциях и СОПах (стандартных операционных процедурах), согласованных и утвержденных в установленном порядке.

Рост тест-культур микроорганизмов зависимости от концентрации внесенной культуры.

_ Таблица 1

Кон-ция t. ин- Listeria monocytogenes Staphilococcus .aureus Salmonella Е. coli L. т., S. aureus, Salmonella, Е. coli

взвеси куб

м/о ч ПБЛ I ПБЛ II ПАЛ ПБЛ I ПБЛ 11 ПАЛ ПБЛ I ПБЛ II ПАЛ ПБЛ I ПБЛ II ПАЛ

По П По П По П По П По П По П По П По П

му тн А Л му тн А Л му тн А Л му тн А Л мут н А Л мут н А Л мут н А Л му тн А Л

24 + +* + +* +* + + + + + - - - - - + +* + +* +*

10s 48 + +* + +* +* + + + + + - - - - - + +* + +* +*

24 + +* + +» + + + + + - - - - + +* + +* +*

104 48 + + + + + + + - - - - - + +* + +* +»

24 + +* + +» - - + + + * +*

103 48 + +* + +* - - + + + - - - - - + +* + +*

24 + + + + * +*

102 48 + + + + + +* + +* +*

Условные обозначения:

+ рост микроорганизмов на средах ПБЛI, ПЕЛ II, ПАЛ, - отсутствие роста микроорганизмов на средах ПБЛ I, ПБЛ II, ПАЛ, наличие КОЕ Listeria monocytogenes на среде ПАЛ, отсутствие КОЕ Listeria monocytogenes на среде ПАЛ

йит- Фильтрация

Рис.4. Аппаратурно-технологическая схема производства питательных сред для выявления листерий

Основной технологический процесс смешения заключается в взвешивании и загрузке ингредиентов и их смешения в лопастном смесителе периодического действия ФЛ-0,16 объемом 160 л с учетом веса одной серии около 50 кг сухого порошка.

Получение селективной добавки (СД). Для получения СД на аналитических весах поочередно взвешивают в следующей последовательности: полимиксина В сульфат, налидиксовая кислота, акрифлавин. Взвешенные компоненты засыпают поочередно в ступку и растирают до образования однородной массы. Получение готовой среды ШЕЛ или ПАЛ). Отобранные пробы основы и СД передают в контрольную лабораторию для проведения физико-химического контроля питательной среды на соответствие требованиям ТУ 9385669-00419779-2001 и ТУ 9385-670-0041979-2001. После проведенного контроля на соответствие препарата требованиям ТУ по физико-химическим показателям ЦЗЛ заполняет и передает в ОБТК «Заключение лаборатории о качестве препарата».

Разработка нормативной документации. На основании анализа результатов проведенных исследований по изучению чувствительности и эффективности разработанных питательных сред ПБЛ I, ПБЛ II, ПАЛ и скорости роста испытанных тест-культур, совместно с ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии были разработаны и утверждены ТУ по технологии производства комплекса микробиологических питательных сред для выявления листерий: ТУ 9385-670-00419779-2001 «Питательный бульон для выделения и

культивирования листерий (ПБЛ)» и ТУ 9385-669-00419779-2001 «Питательный агар для выделения и культивирования листерий (ПАЛ)» и Наставления к их применению. Также разработаны регламенты производства Питательного бульона для выделения и культивирования листерий (ПБЛ) №00001927-15-97-2002 и Питательного агара для выделения и культивирования листерий (ПАЛ) №00001927-15-98-2002. Получен патент на изобретение №2223313 «Дифференциально-диагностическая среда для выявления листерий», приоритет от 26.12.2001г.

Исследование эффективности селективных питательных сред в процессе длительного хранения. При разработке технологии производства питательных сред обязательно исследование их характеристик в процессе длительного хранения для определения сроков их годности. Исследованиями в этом направлении установлено, что при хранении разработанных питательных сред в течение 12 и 24 мес. не выявлено особо значимых изменений качественных показателей сред ПБЛ I и ПБЛ II, так и плотной селективной ПАЛ по сравнению с исходными образцами.

Разработка методологии микробиологических исследований при контроле мясных продуктов на наличие Listeria monocytogenes. В России методология выявления листерий из мясных продуктов до проведения наших исследований не была разработана и могла быть осуществимой только после создания современного отечественного комплекса микробиологических питательных сред.

С учетом вышеизложенного при нашем участии впервые в России создан ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий L.monocytogenes». Разработанный стандарт гармонизирован с международным стандартом ISO 11290-11996 в части разработки принципа проведения исследования; отбора и подготовки образцов для исследований; применения специальных питательных сред и реактивов; применения основных диагностических тестов при идентификации микроорганизмов и подтверждении принадлежности выделенных колоний к L. monocytogenes.

Метод обнаружения листерий в мясных продуктах включает в себя четыре этапа: предварительное селективное обогащение исследуемых проб в жидкой микробиологической питательной среде (предобогащение) при температуре 30°С в течение 24ч; селективное обогащение - посеве на обогащенные среды предварительно предобогащенных проб с последующим выдерживанием в термостате при температуре 37°С 24-48ч; посеве материала из обогащенной среды на плотную селективную» диагностическую среду с последующим

культивированием в термостате при 37°С в течение 24-48ч на наличие микроорганизмов рода Listeria; изучение колоний, характерных для листерий с определением их биологических свойств. Схема указанных выше контрольных испытаний мяса и мясопродуктов на наличие листерий представлена на рис 5.

Мониторинговые исследования мяса и мясных продуктов на наличие листерий. Результаты исследований 440 проб мясного сырья и субпродуктов животных приведены в табл.2. Из них исследовано 176 продуктов убоя крупного рогатого скота и 172 -продуктов убоя свиней, также были исследованы 2 образца баранины, 15 образцов мяса птицы механической обвалки, 75 образцов фаршей и мясного сырья из куттера.

Листерии были обнаружены в 73 исследованных пробах, что составило 16,6% от общего количества исследованных образцов. В 8 из исследованных образцах выделен вид L.welshimeri (1,82%), в 53 пробах обнаружен вид L.iimocua (12,1%), в 12 случаях изолирован вид L.monocytogenes (2,73%). Установлена совместная контаминация 7 исследованных образцов двумя видами листерий: L.monocytogenes и L.innocua. При мониторинговых исследованиях мясного сырья и субпродуктов, поступивших из различных регионов России (табл. 3.), установлено, что в пробах головного мозга, печени, селезенки 3 туш свиней, отобранных в Тульской области, выявлен вид L.monocytogenes, при чем в двух из этих туш совместно с L.innocua. В четырех тушах обнаружен только вид L.innocua (выделен в двух случаях из головного мозга, селезенки, печени и сердца, в двух случаях только из печени и сердца). Из одной туши выделен вид L.welshimeri (обнаружен в пробах головного мозга и печени). Ни в одной пробе поверхностных шейных лимфатических узлов ни одного вида листерий не обнаружено. При исследовании продуктов убоя крупного рогатого скота ни в одной туше не был обнаружен вид L.monocytogenes. Обнаружен лишь вид L.innocua (выделен из трех проб головного мозга и двух проб печени).

В продуктах убоя крупного рогатого скота и свинины, поступивших из Белгородской области обнаружена L. innocua в 1туше свинины (выделена из головного мозга, печени, селезенки) и в 2 тушах крупного рогатого скота (обнаружена в головном мозгу и печени). Из 10 проб головного мозга крупного рогатого скота, поступивших из Воронежской области, в 3 образцах выявлен вид L.innocua.

о

Рис.5 Схема проведения исследований мяса и мясопродуктов на наличие листерий

Мясо и мясопродукты

1(25 ±0,1 г) Предварительное селективное обогащение:

ПБЛI (наличие роста - помутнение среды), Half Fraser бульон (почернение) 225 мл термостатирование 30 ± 1°С С, 24± 2 ч_

у 0.1 мл Селективное обогащение:

ПБЛ П (наличие роста - помутнение среды), Fraser бульон (почернение) (10 мл) термостатирование 37 + 1°С 48ч

Ï 4

Выделение на агаризованных селективно-диагностических средах:

ПАЛ

термостатирование 37+1°С, 24 - 48ч

Серо-желтые колонии с черной ореолом

на фоне лимонной среды

PALCAM агар термостатирование 37+1°С, 24 - 48ч (Серовато-зеленые колониис черным ореолом на фоне карминово-красной среды)

или Oxford агар термостатирование 37±1°С, 24 - 48ч (Серо-белые колонии с черным ореолом на фоне лимонно-желтой среды)

f *

Продолжение рис.5

Подтверждение принадлежности выделенных микроорганизмов к роду Listeria:

*-*-1

'I-

Обнаружение микроорганизмов рода Listeria в мясном сырье и

субпродуктах

_Таблица 2

№ Наименование Кол- Количество положительных

№ продукта во результатов

п/п иссл. Lwelshimeri L.innocua L.monocyto

проб genes

1 Продукты убоя

крупного

рогатого

скота: 18 — - —

говядина 51 4 12 -

мозги 33 - 8 -

печень 35 - 4 -

селезенка 17 - 3 -

сердце 22 - - -

лимфатические

узлы 176 4 27 -

Всего:

2 Продукты убоя

свиней:

свинина 12 - - -

мозги 32 \ 5 3

печень 32 1 7 3

селезенка 32 - 5 3

сердце 32 - - -

лимфатические 32 - -

узлы

Всего: 172 2 17 9

3 Баранина 2 - - -

4 Мясо птицы 15 - 5 3

механической

обвалки

5 Фарши, мясное 75 2 4 -

сырье из

куттера

ВСЕГО: 440 8 53 12

В 2 образцах печени и в 2 пробах селезенки также выявлен вид L.innocua. В 2 пробах головного мозга выделен штамм L.welshimeri. В головном мозге 2 туш крупного рогатого скота, отобранных в продуктах убоя из Курской области обнаружен вид L.innocua. В 2 пробах головного мозга изолирован вид L.welshimeri. Из 6 исследованных образцов печени в 2 случаях выделен L.innocua. Также в 2 случаях данный вид был обнаружен в 8 исследованных пробах селезенки.

С целью обнаружения листерий было исследовано 128 образцов различных мясных продуктов (полуфабрикаты мясные крупнокусковые, котлеты, пельмени; колбасные изделия: сосиски, сардельки, сырокопченые и полукопченые колбасы) с использованием комплекса разработанных питательных сред. Из них в 10 пробах выделены микроорганизмы рода Listeria. Всего было выделено 10 штаммов листерий. Чаше всего изолировался вид L.innocua - 5 штаммов (3,9%). Вид L.welshimeri выявлен в 4 случаях, что составило 3,12 % от общего количества исследованных проб. Больше всего данный вид встречался в полуфабрикатах мясных (котлеты) - 2 штамма. В одном случае данный вид выявлен в колбасных изделиях (сырокопченая колбаса). При исследовании 1 образца шпика замороженного удалось обнаружить L.monocytogenes. Это составило 0,78% от общего количества исследованных мясных продуктов. Наибольшее количество штаммов различных видов листерий обнаружено в полуфабрикатах мясных (котлеты) - 5 культур различных видов листерий.

Результаты сравнительных исследований по выявлению листерий в продуктах убоя свиней и крупного рогатого скота с использованием прибора miniVTOAS и классических методов оказались различными.

При исследовании 10 продуктов убоя крупного рогатого скота и 20 продуктов убоя свиней с использованием miniVIDAS ни в одном образце продуктов убоя крупного рогатого скота L.monocytogenes обнаружена не была. Положительный результат на наличие L.monocytogenes в головном мозге свиней дали 6 образцов; в печени и селезенке - 4. Однако при подтверждении этих данных классическими методами наличие L.monocytogenes подтвердилось в головном мозге и печени в 3 образцах; в селезенке - также в 3 образцах. Во всех 7 исследованных пробах мяса птицы механической обвалки при помощи прибора удалось получить положительный результат на наличие L.monocytogenes. При использовании же классических методов удалось изолировать только 3 культуры L.monocytogenes.

Выявление листерий в продуктах убоя животных различных регионов России

_Таблица 3

Кол-во Наличие м/о рода Listeria

Пробы иссл.проб L. monocytogenes L. innocua L.welshimeri

Тульская область Продукты убоя крупного рогатого скота

мозги 10 Н/о 3 Н/о

печень 10 Н/о 2 Н/о

селезенка 10 Н/о Н/о Н/о

сердце 10 Н/о 3 Н/о

лимф, узлы 10 Н/о Н/о Н/о

Продукты убоя свиней

мозги 20 3 4 1

печень 20 3 6 1

селезенка 20 3 4 Н/о

сердце 20 Н/о Н/о Н/о

лимф. узлы 20 Н/о Н/о Н/о

Белгородская область Продукты убоя крупного рогатого скота

мозги 7 Н/о 2 Н/о

печень 7 Н/о 2 Н/о

селезенка 7 Н/о Н/о Н/о

лимф. узлы 7 Н/о Н/о Н/о

Продукты убоя свиней

свинина. 12 Н/о Н/о Н/о

мозги 12 Н/о 1 Н/о

печень 12 Н/о 1 Н/о

селезенка 12 Н/о 1 Н/о

сердце 12 Н/о Н/о Н/о

Окончание табл.3

лимф. узлы 12 Н/о Н/о Н/о

Воронежская область Продукты убоя крупного рогатого скота

говядина 10 Н/о Н/о Н/о

мозги 10 Н/о 3 2

печень 6 Н/о 2 Н/о

селезенка 8 Н/о 2 Н/о

Тамбовская область Продукты убоя крупного рогатого скота

мозги 14 Н/о 2 Н/о

Курская область Продукты убоя крупного рогатого скота

говядина 10 Н/о Н/о Н/о

мозги 10 Н/о 2 2

печень 6 Н/о 2 Н/о

селезенка 8 Н/о 2 Н/о

Н/о - не обнаружено

Интерпретировать полученные данные можно более высокой чувствительностью прибора тниУГОАБ по сравнению с классическими методами, а также возможностью получения ложноположительных результатов вследствие существенного числа общих антигенных детерминант непатогенных видов (Ь.шпосиа и Ь.луеЬЫшеп) с Ь.топосу1о£епе5. Для идентификации с использованием классических методов отбирали не менее 5 характерных колоний с плотной среды ПАЛ. Одним из основных тестов, позволяющих дифференцировать Ь.шопос^одепев от других видов листерий, является определение лецитиназной активности. Лецитиназная активность Ь.топосуК^епез проявляется только на чашках с активированным углем. Анализ полученных данных указывает, что лецитиназная активность на среде с углем проявляется не у всех отобранных колоний. В среднем, при исследовании 5

колоний только 1-2 из них обладали лецитиназной активностью на среде с углем, а в некоторых случаях она не выявляется совсем. Это еще раз подтверждает, что выявление L.monocytogenes напрямую зависит от числа исследованных колоний. Резюмируя результаты микробиологического анализа мясного сырья, субпродуктов и мясных продуктов, следует отметить, что всего выделено 83 культуры листерий. Из них L.monocytogenes - 13 штаммов (2,29%), L.innocua -58 штаммов (10,21%), L.welshimeri - 12 штаммов (2,11%).

Выводы.

1.Разработана современная отечественная технология производства комплекса питательных сред для выявления листерий в пищевых продуктах.

2.0босновано использование панкреатических гидролизатов рыбной муки и казеина, пептона ферментативного, дрожжевого экстракта как основы питательных сред в качестве компонентов для эффективного роста листерий при их культивировании в сравнении с наиболее часто используемыми в зарубежной практике-триптическим соевым гидролизатом - ТСА (трипказо-соевый агар) и ТСВ (трипказо-соевый бульон). Установлена высокая селективная способность разработанных питательных сред ПБЛI, ПБЛ II и ПАЛ в отношении L. monocytogenes.

3.Выяснено, что композиция таких антимикробных компонентов как налидиксовая кислота, акрифлавин, полимиксин В сульфат, хлорид лития, позволяет ингибировать энтерококки; энтеробактерии, в том числе сальмонеллы и эшерихии, не оказывая губительного воздействия на листерии.

4.Проведены расширенные лабораторные и производственные испытания разработанного комплекса питательных сред. Доказана их высокая чувствительность в отношении поддержания роста микроорганизмов рода Listeria и полное ингибирование такой санитарно-показательной микрофлоры как БГКП (бактерий группы кишечных палочек).

5.В результате исследований установлено, что при хранении питательных сред (ПБЛ, ПАЛ) для выделения листерий в условиях, характерных для двух лет хранения, эффективность выделения этих микроорганизмов не снизилась и указанные сроки могут служить нормативом годности для данных питательных сред.

б.Определен методологический подход в исследованиях мясных продуктов на наличие листерий, соотвествующий международному стандарту, а именно последовательное

использование разработанных сред предобогащения ПБЛ I, среды обогащения ПБЛ II, плотной питательной среды выделения ПАЛ.

7.Мониторинговыми исследованиями в России проведена комплексная оценка уровня контаминации листериями мясного сырья, субпродуктов, а также мясных продуктов из различных регионов Российской Федерации (Белгородской, Воронежской, Курской Тамбовской, Московской и Тульской областей) и выделены различные виды листерий.

8.Выявлено присутствие различных видов листерий в 73 из 440 исследованных образцов мясного сырья и субпродуктов, что составило 16,6% от общего количества исследованных образцов. Из них L. monocytogenes изолирован в 12 случаях (2,73% от общего числа исследованных продуктов). Установлена совместная контаминация семи исследованных образцов двумя видами листерий: L.monocytogenes и L.innocua.

9.При мониторинге определено, что из 128 исследованных мясных продуктов (полуфабрикаты мясные крупнокусковые, котлеты, пельмени, колбасные изделия: сосиски, сардельки, сырокопченые и полукопченые колбасы) 10 образцов (7,8%) оказались положительными на наличие микроорганизмов рода Listeria. Патогенные листерии не были обнаружены ни в одном случае из мясных продуктов, подвергнутых тепловой обработке.

Ю.Изолировано 83 культуры различных видов листерий. L.monocytogenes выделены из 13 образцов исследованной продукции. Наиболее часто L.monocytogenes изолировался из субпродуктов свиней (девять случаев). В трех случаях L.monocytogenes изолирован из мяса птицы механической обвалки, в одном - из шпика замороженного. L.innocua обнаружена в 58 образцах продукции (27 штаммов - из субпродуктов крупного рогатого скота, 17 - из субпродуктов свиней, 5 — из мяса птицы механической обвалки, 4 - из фарша вареных колбас, 3 - котлет, 2 - полуфабрикатов крупнокусковых). L.welshimeri выявлена в 12 образцах исследованной продукции.

11.С использованием прибора miniVIDAS диагностировано наибольшее количество изолятов Listeria monocytogenes (21 случай), в то время как классическими методами - только в 12 образцах. Такое несоответствие можно объяснить более высокой чувствительностью прибора miniVIDAS по сравнению с классическими методами или же возможностью получения ложноположительных результатов вследствие существенного числа общих антигенных детерминант непатогенных видов (L.innocua и L.welshimeri) с L.monocytogenes.

12.По результатам комплексных исследований совместно с ФГУГТ ГНЦ прикладной микробиологии были разработаны и утверждены ТУ по технологии производства комплекса микробиологических питательных сред для выявления листерий: ТУ 9385-670-00419779-2001 «Питательный бульон дл^ выделения и культивирования листерий (ПБЛ)» и ТУ 9385-669-00419779-2001 «Питательный агар для выделения и культивирования листерий (ПАЛ)» и Наставления к их применению. Также разработаны регламенты производства Питательного бульона для выделения и культивирования листерий (ПБЛ) №00001927-15-97-2002 и Питательного агара для выделения и культивирования листерий (ПАЛ) №00001927-15-98-2002. Получен патент на изобретение №2223313 «Дифференциально-диагностическая среда для выявления листерий», приоритет от 26.12.2001г. Впервые в России создан ГОСТ Р 519212002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Ь.шопосу1о§епе5», а также «Методическое руководство по санитарно-микробиологическому контролю мясных и молочных продуктов на наличие листерий».

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1.Костенко Ю.Г., Янковский К.С., Ерофеева Ю.К., Храмов М.В. Разработка комплекса сухих микробиологических питательных сред для выявления листерий в пищевых продуктах // Научн.-практ. конф. "Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крс, крейтцфельдта-якоба и др. прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена". Материалы докладов, 2001 г, ВНИИВВиМ, г. Покров, с. 147-149.

2. Храмов М.В., Ажермачева Н.И., Маракуша Б.И., Мартовецкий М.Н., Ерофеева Ю.К. Комплект питательных сред для культивирования и выделения листерий // Научн.-практ. конф. "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микросистем". Изд. Минздрава РФ НПО "Питательные среды", г. Махачкала, 2001, с. 45

3. Костенко Ю.Г., Янковский К.С., Шагова Т.С., Ерофеева Ю.К. Проблема пищевого листериоза и пути ее решения в России //Сборн. докладов ВНИИМП им. В.М. Горбатова "Функциональные продукты", 2001, с. 253-254

4. Костенко Ю.Г., Янковский К.С., Ерофеева Ю.К. Исследование эффективности селективных питательных сред после

длительного хранения для выявления листерий // Сборн. научн. труд. ВНИИМП им. В.М. Горбатова 2001, с. 94-97

5. Костенко Ю.Г., Янковский К.С., Ерофеева Ю.К. Контроль пищевых продуктов на наличие листерий // Ж. "Мясная индустрия", №1,2003, с. 26-29

6. Костенко Ю.Г., Янковский К.С., Ерофеева Ю.К. Обнаружение листерий в мясном сырье и его санитарная оценка // Ж. "Все о мясе", №3, 2003, с. 31-32

7. Храмов М.В., Ажермачева Н.И., Костенко Ю.Г., Янковский К.С., Ерофеева Ю.К. Сравнительная оценка использования отечественных и зарубежных питательных сред для обнаружения листерий в продуктах убоя животных // Научн.-практ. конф: "Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней". Изд. Совета по сотр. в обл. здравоохр., г. Саратов, 2003, с. 192.

8. Kostenko Yu. G., Yankovsky K.S., Erofeyeva Yu. K. Tartakovsky I.S., Yermolayeva S.A., Khramov M.V., Kotlyarov V.M., Sheveleva S.A. Creation of Russian national system of foods safety with regards to the presence of pathogenic Listeria, international symposium on problems of listeriosis (XV-Isopol), Sweden, Uppsala, 2004, №56.

9. Kostenko Yu. G., Yankovsky K.S., Erofeyeva Yu. K. Monitoring meat product for the presence of Listeria, international symposium on problems of listeriosis (XV-Isopol), Sweden, Uppsala, 2004, №57.

10. Храмов M.B., Ажермачева Н.И., Костенко Ю.Г., Янковский К.С., Ерофеева Ю.К. Дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий. Патент на изобретение № 2223313 приоритет от 26 сентября 2003 г.

Зак. 185 Тираж Ю0 экз.

ООО «Полиграфсервис» 109316 Москва, ул. Талалихина, 26

- 2 2 6 77;

РЫБ Русский фонд

2006-4 23574

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Краткие сведения о возбудителе листериоза.

1.2. Общая характеристика и идентификация листерий.

1.3. Краткие сведения о листериозе животных и человека.

1.4. , Выявление листерий в пищевых продуктах.

1.5 Отечественные и зарубежные питательные среды для выявления листерий.

1.6. Технология производства питательных сред.

1.7. Методы обнаружения возбудителя пищевого листериоза.

Актуальность работы. Одной из основных задач отечественной мясной промышленности на современном этапе развития является обеспечение безопасности для потребителя выпускаемых мясных продуктов.

Известно, что в мясном сырье и продукции из него изготовленной, особенно при нарушении технологических режимов и санитарно-гигиенических условий производства, можно выявить опасные для- человека микроорганизмы - листерии.

В! связи с этим, в зоне Европейского экономического сотрудничества, а также других развитых странах (США, Канада, Япония), строго регламентированы требования по контролю патогенных листерий в мясе и мясных продуктах, потребление которых может вызвать заболевание людей. Исследование пищевых продуктов на наличие возбудителя листериоза является обязательным.

Об этой болезни животных известно давно. Однако в последние десятилетия она широко проявила себя как пищевая инфекция человека. Доказано, что вспышки листериоза у людей с летальностью до 35% связаны с употреблением в пищу различных продуктов питания (мясо, мясные продукты, молоко, мягкие сыры, яйца, рыба), контаминированных листериями.

Ранее известные в СССР (начало 70-х годов) специальные питательные среды предназначались в основном для выделения возбудителя листериоза от больных животных. До начала настоящей работы в России не было технологии производства современных эффективных питательных сред для выявления листерий в пищевых продуктах.

Вопросам изучения проблемы листериоза посвящены научные работы отечественных и зарубежных ученых: Бакулова И.А., Бутко М.П., Васильева Д.А., Ермолаевой С.А., Карликановой Н.Р., Костенко Ю.Г., Котлярова В.М., Кривоносовой О.В., Малахова Ю.А., Сахарова П.П., Сливко П.П., Тартаковского И.С., Янковского К.С., Casolari С., Curiale М S., Donelly C.W.,

Fabio A., Farber J.M., Gray M.L., Lewus C., Messi P., Seeliger H.P., Schlech W.F., и др.

Проблема пищевого листериоза приобретает также существенное социально-экономическое значение, по причине ущерба от изъятия контаминированной продукции, ограничения экспорта и импорта, остановки производства.

Принимая! во внимание указанное выше, необходимо было обосновать и создать в Российской Федерации технологию современных питательных сред для выявления листерий.

В России до последнего времени практически не было достоверных сведений о выделении листерий из пищевых, в частности из мясных продуктов. Одной из причин этого было отсутствие эффективных отечественных питательных сред. Используемые в зарубежной практике аналоги весьма дорогостоящи и не могут широко использоваться в нашей стране.

В тоже время следует подчеркнуть, что в нашей стране, несмотря на актуальность и значимость проблемы листериоза, не проводились широкие мониторинговые исследования мясных продуктов на наличие листерий.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является создание технологии производства комплекса отечественных питательных сред, разработка нормативной методологической базы контрольных исследований и мониторинг мяса и мясопродуктов на наличие возбудителя листериоза.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих основных задач:

1. Обосновать и разработать комплекс отечественных питательных сред для диагностики листерий в пищевых продуктах.

2. Разработать технологию производства питательных сред и методологическую основу контроля мясных продуктов на наличие листерий.

3. Выполнить мониторинговые исследования мяса и мясопродуктов на наличие листерий с использованием созданных питательных сред и методологии контроля.

Научная новизна. Обоснованы технология производства и состав комплекта питательных сред, определена их эффективность и возможность использования при контроле безопасности мяса и мясопродуктов.

Впервые в России обоснована современная методология/ контроля мяса и мясных продуктов на наличие патогенных листерий.

Определена частота выявления^ листерий при мониторинговых исследованиях мяса и мясных продуктов в некоторых регионах России.

Практическая^ значимость. Разработаны питательные среды предобогащения, обогащения, для выделения и культивирования листерий (ТУ 9385-670-00419779-2001 «Питательный бульон для выделения и культивирования листерий» - ПБЛ и ТУ 9385-669-00419779-2001 «Питательный агар для выделения и культивирования листерий» - ПАЛ) с Наставлениями к их применению. Утверждены технологические регламенты производства Питательного бульона для выделения и культивирования листерий (ПБЛ) и Питательного агара для выделения! и культивирования листерий (ПАЛ). Получен патент на изобретение №2223313 «Дифференциально-диагностическая среда для выявления листерий», приоритет от 26.12.2001г.

Результаты исследований вошли как составная часть ГОСТ Р 519212002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes»,

Получены мониторинговые данные о частоте выявления возбудителя листериоза в мясе и мясопродуктах в некоторых регионах России.

Апробация результатов исследований. Материалы по теме диссертационной работе доложены на Научно практических конференциях: «Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крс, крейтцфельдта-якоба и др. прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена» (г. Покров 2001 г.); "Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней" (г. Саратов, 2003 г.), на семинаре работников мясной промышленности «Ветеринарно-санитарный контроль в мясной отрасли» (г. Москва, 2003 г); «XV интернациональный симпозиум по проблеме листериоза» (Упсала, Швеция, 2004 г).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 9 работ в журналах «Мясная индустрия», «Все о мясе», в сборниках научных трудов ВНИИМП им. В.М. Горбатова, в материалах отечественных конференций и зарубежного симпозиума.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, основной части, выводов, списка литературы и приложения. Материалы диссертации изложены на 114 страницах машинописного текста, содержат 21 таблицу и 6 рисунков, дополнены приложениями. Литературные источники включают 183 работы отечественных и зарубежных авторов.

4.ВЫВОДЫ

1 .Разработана современная отечественная технология производства комплекса питательных сред для выявления листерий в пищевых продуктах.

2.Обосновано использование панкреатического гидролизата рыбной муки, панкреатического гидролизата казеина, пептона ферментативного, дрожжевого экстракта как основы питательных сред в качестве компонентов для эффективного роста листерий при их культивировании в* сравнении с наиболее часто используемыми в зарубежной практике-триптическим соевым гидролизатом — ТСА (трипказо-соевый агар) и ТСВ (трипказо-соевый бульон). Установлена высокая селективная способность разработанных питательных сред ПБЛ I, ПБЛ II и ПАЛ в отношении L. monocytogenes.

3.Выяснено, что композиция таких антимикробных компонентов как налидиксовая кислота, акрифлавин, полимиксин В сульфат, хлорид лития, позволяет ингибировать энтерококки; энтеробактерии, в том числе сальмонеллы и эшерихии, не оказывая губительного воздействия на листерии.

4.Проведены расширенные лабораторные и производственные испытания разработанного комплекса питательных сред. Доказана их высокая чувствительность в отношении поддержания роста микроорганизмов рода Listeria и полное ингибирование такой санитарно-показательной микрофлоры как БГКП (бактерий группы кишечных палочек).

5.В результате исследований установлено, что при хранении питательных сред (ПБЛ, ПАЛ) для выделения листерий в условиях, характерных для 2 лет хранения, эффективность выделения этих микроорганизмов не снизилась и указанные сроки могут служить нормативом годности для данных питательных сред.

6.Определен методологический подход в исследованиях мясных продуктов на наличие листерий, соотвествующий международному стандарту, а именно последовательное исспользование разработанных сред предобогащения ПБЛ I, среды обогащения ПБЛ II, плотной питательной среды выделения ПАЛ.

7.Мониторинговыми исследованиями в России проведена комплексная оценка уровня контаминации листериями мясного сырья, субпродуктов, а также мясных продуктов из различных регионов Российской Федерации (Белгородской, Воронежской, Курской Тамбовской, Московской, Тульской областей) и выделены различные виды листерий.

8.Выявлено присутствие различных видов листерий в 73 из, 440 исследованных образцов мясного сырья и субпродуктов что составило 16,6% от общего количества исследованных образцов. Из них L. monocytogenes изолирован в 12 случаях (2,73% от общего числа исследованных продуктов). Установлена совместная^ контаминация^ 7 исследованных образцов двумя видами листерий: L.monocytogenes и L.innocua.

9.При мониторинге определено, что из 128 исследованных мясных продуктов (полуфабрикаты мясные крупнокусковые, котлеты, пельмени, колбасные изделия: сосиски, сардельки, сырокопченые и полукопченые колбасы) 10 образцов (7,8%) оказались положительными на наличие микроорганизмов рода Listeria. Патогенные листерии не были обнаружены ни в одном случае из мясопродуктов, подвергнутых тепловой обработке.

10.Изолировано 83 культуры различных видов листерий. L.monocytogenes выделены из 13 образцов исследованной продукции. Наиболее часто L.monocytogenes изолировался из субпродуктов свиней (9 случаев). В 3 случаях L.monocytogenes изолирован из мяса птицы механической обвалки, в 1 - из шпика замороженного. L.innocua обнаружена в 58 образцах продукции (27 штаммов - из субпродуктов крупного рогатого скота, 17 - из субпродуктов свиней, 5 - из мяса птицы механической обвалки, 4 - из фарша вареных колбас, 3 - котлет, 2 - полуфабрикатов крупнокусковых). L.welshimeri выявлена в 12 образцах исследованной продукции.

11. С использованием прибора miniVIDAS диагностировано наибольшее количество изолятов Listeria monocytogenes (21 случай), в то время как классическими методами - только в 12 образцах. Такое несоответствие можно объяснить более высокой чувствительностью прибора miniVIDAS по сравнению с классическими методами или же возможностью получения ложноположительных результатов вследствие существенного числа общих антигенных детерминант непатогенных видов (L.innocua и L.welshimeri) с L.monocytogenes.

12.По результатам комплексных исследований совместно с ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии были разработаны и утверждены ТУ по технологии производства комплекса микробиологических питательных сред для выявления листерий: ТУ 9385-670-00419779-2001 «Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ)» и ТУ 9385-669-004197792001 «Питательный агар для выделения и культивирования листерий (ПАЛ)» и Наставления к их применению. Также разработаны регламенты производства Питательного бульона для выделения и культивирования листерий (ПБЛ) №00001927-15-97-2002 и Питательного агара для выделения и культивирования листерий (ПАЛ) №00001927-15-98-2002. Разработаны и находятся на рассмотрении «Фармакопейная статья предприятия на ПБЛ» и «Фармакопейная статья предприятия на ПАЛ». Получен патент на изобретение №2223313 «Дифференциально-диагностическая среда для выявления листерий», приоритет от 26.12.2001г. Впервые в России создан ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий L.monocytogenes»

1. Авылов Ч.К. Комплексная система ветеринарно-санитарного контроля на Чф крупных предприятиях по производству и переработке свинины. //

2. Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Москва, 2000.- С. 200-208

3. Бакулов И.А. Листериоз сельскохозяйственных животных // М., «Колос»1967.-С.4-6, 17, 34.

4. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция. Вопросыдиагностики и профилактики // Ульяновск, 1991.-С. 5-6.

5. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Бактериологический контроль пищевыхпродуктов на наличие листерий // Методические рекомендации. * Ульяновск, 1999.С. 5-6, 16-18.

6. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Пищевой листериоз-новое направлениеизвестной болезни //Вестник РАСХН.1995. т2. С.-69.

7. Бакулов И.А., Котляров В.М., Шестиперова Т.И. Эпидемиологические иэпизоотологические аспекты листериоза // Ж. Микробиол. -1994.-№ 5.-С. 100-105.

8. Бакулов И.А., Цыганова А.А., Васильев Д.А., Белоусов В.Е., Котляров

9. В.М. Методические рекомендации по'дифференциации и идентификации листериозных бактерий//Ульяновск 1995.-С.14-16.

10. Беленова И.А., Масленникова Э.Ф. Условнопатогенные бактерии,обнаруживаемые в культивируемых мидиях //Ж. Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-2002.-№ 2.-С.81-83.

11. Ю.Бутко М.П. Исследования по изысканию элективной среды для выделения возбудителя листериоза из органов и тканей убойных животных // Проблемы ветеринарной санитарии. -1972. -С. 126-137.

12. Гершун В.И. Листериоз сельскохозяйственных животных. // Алма-Ата, 1981.-С.15-17

13. Гершун В.И. Экология листсрий и пути их циркуляции в природном очаге // Экология возбудителей сапронозов. М., 1988.-С. 80-85.

14. Гостев B.C. Биохимические основы медицинской микробиологии. М.: Медицина ,1951.- С. 564

15. Ефимов В.Е., Иванов B.C., Тарасенко В.М. Изучение кинетики гидролизаказеина.—Химико-фармацевтический журнал, 1982., №7, С.-70-74.

16. Ильина З.М. // «Ветеринария» №10, 1957.-С.14.1 б.Карликанова Н.Р. Куваева И.Б. Карликанова Н.С. // Листсрий в молоке и молочных продуктах. Москва—Углич, 1999.-С. 4, 31, 65-68, 95, 112.

17. Карпова Т.И. Идентификация и типирование Listeria monocytogenes на основе особенностей полиморфизма и экспрессии генов факторов патогенности //Автореферат диссертации кандидата биологических наук. Москва-2003 .-С.-12.

18. Карпова Т.Н., Ермолаева С.А., Лопырев И.В., Бродинова Н.С., Тартаковский И.С., Васкез-Боланд Х.А. Новые методы идентификации Listeria monocytogenes //Клин.микробиол. антимикроб.химиотер. 2001;№ 3-С.-266-273.

19. Книзе А.В., Бузун А.И. Эпизоотическая ситуация по листериозу в странахмира и России // Материалы международного симпозиума «Листериоз на рубеже тысячелетий» Покров, 1999., № 20.-С. 118-122.

20. КольпиковаТ.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Использование листери-озных бактериофагов при диагностике и индикации листерий. // Материалы международного симпозиума «Листериоз на рубеже тысячелетий» Покров, 1999., № 21.-С. 64-67

21. Костенко Ю.Г., Шагова Т.С., Янковский К.С. Листерии- критерий безопасности мясных продуктов. // Мясн. Индустрия. 1997; № З.-С. 2324.

22. Котляров В.М. Проблема листериоза на рубеже тысячелетий. // Материалы международного симпозиума «Листериоз на рубеже тысячелетий» Покров, 1999.-С. 48-52.

23. Кривоносова О.В., Мелехов П.П., Бакулов И.А. Изыскание элективных питательных сред для выявления листерий // Ветеринария.-1970.-№9.-С.48-50.

24. Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактика. Госагропром, МЗ СССР. М., 1987.-С.4,8,12-17.

25. Ларионова О.С. Роль молока и мяса в передаче листериозной инфекции

26. Автореферат диссертации кандидата биологических наук. Саратов-2003.-С.13-16.

27. Листериоз. Методические рекомендации (№11) комитета здравоохранения г. Москвы, 2001.-С.4-6.

28. Маевский М. П., Гальцева Г.В., Малай В.И., Цепко И.Н., Корсунская С.А.

29. Сухие питательные среды для культивирования и выделения листерий // Листериоз на рубеже тысячелетий. Материалы международного симпозиума, г. Покров, 1999 г.-С. 100-102.

30. Малахов Ю.А. Материалы доклада научной конференции ветеринарно-санитарного факультета Московского технологического института мясной и молочной промышленности, 1961.-С.44.

31. Матвееев В.Е. Научные основы микробиологической технологии.-М.:Агропромиздат, 1985.-С.61-62.31 .Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам. Махачкала, 2004.-С. 13.

32. Меджидов М.М., Султанов 3.3. Использование непищевого сырья в производстве микробиологических питательных сред.-Махачкала: Дагкнигиздат,1986.- С.- 72.

33. Покровский В.И. Годованный Б.А. Листериоз. В кн. Инфекционные болезни//М. Медицина, 1996.-С.291-296.

34. Поманская Л.А. Материалы научной конференции по токсоплазмозу и листериозу в акушерстве и педиатрии // М. Медицина 1962, С.27-28.

35. Равилов А.З., Гильмутдинов Р.Я., Хусаинов М.Ш. Микробиологические среды. Казань, 1999. -С.9.

36. Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем // Матер.З-й международ.науч.-прак.конф.-Махачкала, 2001.-С.107.

37. Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии: Тез.конф.-Махачкала.-1992.-С.208.

38. Рахманова А.Г., Пригожина В.К. Справочник по инфекционным болезням. Раздел. Листериоз.//Санкт-Петербург, 1999.-С. 172-174.

39. Родина Л.В., Маненкова Г.М., Тимошков В.В., Цвиль Л.А. Шестеперова Т.И. Состояние заболеваемости и эпизоотическая ситуация по листериозу в Москве // Дезинфекц. Дело. 2000.-№4 .-С.62-66.

40. Родина Л.В., Маненкова Г.М., Тимошков В.В., Цвиль Л.А. Шестеперова Т.И. Состояние заболеваемости и эпизоотическая ситуация по листериозу в Москве // Дезинфекц. Дело. 2000.-№4 .-С.62-66.

41. Савельева Л.В. Селективная среда для выявления листерий // Сборник трудов молодых ученых « Проблемы общей биологии и прикладной экологии» под ред. Шляхтина .Г.В. Изд. Саратовского университета. -1997.-С.26.

42. Сахаров П.П., Гудкова Е.И. Листереллезная инфекция. // Медгиз, 1959.-С.4-8.

43. Тартаковский И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. // Клин, микробиол. антимикроб, химиотерапия. 2000; №2.-С. 20-30.

44. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика // М.: Медицина для всех, 2002. С. 200.

45. Триполитова А.А. Методические указания по лабораторной диагностике листериоза // Томск,1962.-С.6, 34.

46. Триполитова А.А., Борисова Г.В. Листериоз. // Томск, 1965.-С.7,44. 49.Честнова Т.В. Эпизоотолого-эпидемиологические аспекты листериоза в

47. Тульской области. Автореферат диссертации кандидата биологических наук. Тула, 1999.- С. 12.

48. Шарма Р.К. Совершенствование бактериологического анализа для индикации листерий в продуктах, импортируемых в Россию. Автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук. Покров, 1999.-С. 5,14-19.

49. Янковский К.С. Санитарно-микробиологическая оценка листерий как показателя безопасности мясных продуктов. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук. Москва.-2000г. -С. 134.

50. Янковский К.С. Гидролизат крови убойных животных стимулятор роста листерий. Тезисы док. 2-ой международной конференции «Здоровое животное - безопасная пища - здоровый человек»,-Москва.-1997, ч.2.-С.27.

51. Atrache V. et al. Rapid enzyme immunoassay for detection of Listeria in food and environmental samples. // Mod. Microbiol. Methods Dairy Prod.: Int. Semin., Santander, 1989, 5, 22-24.

52. Audurier A,. & Martin C. Phage typing of Listeria monocytogenes. 1989. Int. // J. Food Microbiol. 8: 251-257.

53. Bankroft GJ. The role of natural killer cells in innate resistance to infection. 1993. // Curr. Opin. Imimmol. 5: 503-516

54. Bannerman E. S. and Bille. A new selective medium for isolating Listeria spp. from heavily contaminated material // Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54, 165-167.

55. Beganovic A., HadZihalilovic F. Listeria monocytogenes utvrdeda u suSenom ovejem mesu // Veterinaria (Sarajevo). -1960. -Vol. 9. -p. 523-526.

56. Belyi Y., Tartakovskii I., Prosorovskii S.K. Purification and characterization of cell wall proteins of Listeria monocytogenes. 1992. // Med. Microbiol. Immunol. 181:283-291.

57. Beumer R. R., Brinkman E. Detection of Listeria spp. with a monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) // Food Microbiology, 1989,6,3, 171-177.

58. Вешпег R. R., Brinkman E., Stoelhors I. Antonen van Listeria met behulp van en enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) // Voedingsmidelentechnologie, 1989, 22, 2,13-16.

59. Bille J. Epidemiology of human listeriosis in Europe, with special reference to the Swiss outbreak 1990. p. 71-74.

60. Breer C., & Schopfer K. Listeria and food. 1988. p.32-34.

61. Вгеег С., & Schopfer К. Listerien in Nahrungsmitteln. 1989 // Schweiz. Med. Wochenschr. 119:306-311.

62. Buchanan R.L., Stahl H.G. & Archer D.L. Improved plating media for simplified, quantitative detection of Listeria monocytogenes in foods // International journal of food microbiology. -1987. -Vol. 4. -№ 2. -p. 269-275.

63. Cassiday P. K., Brackctt R. E. Methods and Media to isolate and Knumerate Listeria monocytogenes: A Review J. of Food Protection, 1989,52(3),207-214.

64. Centers for Disease Control. Update: multistate outbreak of listeriosis United

65. States, 1998. // Morb. Mortal. Wkly. Rep. 47: 1085-1086.

66. Centers for Disease Control. Update: multistate outbreak of listeriosis — United States, 1998 //Morb. Mortal. Wkly. Rep. 47: 1085-1086.

67. Centers for Disease Control. Update: multistate outbreak of listeriosis — United States, 1998-1999. 1999 // Morb. Mortal. Wkly. Rep. 47: 1117-1118

68. Christie R., Atkins N.E., Munch-Petersen- E. A note on lytic phenomenon shown by group В streptococci. 1944. Aust. // J. Exp. Biol. Med. Sci. 22: 197200.

69. Ciesielski C.A., Hightower A.W., Parsons S.K., Broome C.V. Listeriosis in the United States: 1980-1982. 1988. Arch. Intern. Med. 148: 1416-1419.

70. Curtis G.D., Mitchel R.G., King A.F., Griffin E.J. A new medium for detection Listeria monocytogenes //Lett, in applied microbiology. -1989. -Vol. 8. -p. 95-98.

71. Curtis G.D.W., Mitchell R.G., King A.F,. Griffin EJ. A selective differentialmedium for the isolation of Listeria monocytogenes. 1989. // Lett. Appl. Microbiol. 8: 95-98.

72. Derek J. Listeriennachweis bei der bakteriologischen fleischuntersuchung // Zentralblatt ftir veterinarmedizin. -1967. -Bd. 22. -№ 15. -s. 632-634.

73. Despierres M. Isolation of L. monocytogenes in medium inhibitory to Streptococcus faecalis. Ann. Inst. Pasteur., 1971, 121, 493-501.

74. Dominguez L. et al. Overlay technique for direct detection and identification of haemolytic Listeria on selective plating medium. Comparison of five media., Zeitschrift fur lebensmittel Unterstichiing und - Forshung., 1990, 191, 1, 1619.

75. Donelly C. W. Listeria monocytogenes. Historical perspectives on methodology detect Listeria monocytogenes., // J. Assoc. Offic. Chcm. 1988, 71,3, 644646.

76. Dumont J. & Cotoni L. Bacillc semblablc a celui du rouget du pore rcnconui dans le L.C.R. d'un muningitique. 1921. Ann. Inst. Pasteur 35: 625-633.

77. Eraser J.A., & Sperber W.H. Rapid detection of Eisteria spp. in food and environmental samples by esculin hydrolysis. 1988.// J. Food. Prot. 51: 762765.81 .Farber J.M., Listeria monocytogenes 1990. //Microbiol. Rev 52: 472-510.

78. Farber J.M., & Peterkin P.I. Listeria monocytogenes, a food-borne patohogen 1991. //Microbiol. Rev 55: 476-511.

79. Farber J.M., Sanders G.W., Johnston M.A. A survey of various foods for the presence of Eisteria species. 1989. J. Food Prot. 52: 456-458

80. Farber J.M., Warburton D. W., Gour L., Tittigler F. Surveillance of raw-fermented (dry-cured) sausages for the presence of of Listeria spp.//Canadian inst. of science and technology journal.-1988.-Vol. 21.-p.430-434.

81. FenlonD.R. Listeria monocytogenes in the natural environment. 1999. P. 2137. In: E.T.Ryser and E.H. Marth (de.) Eisteria, listeriosis and food safety. 2"d ed. Marcel Dekker Inc. New York, NY.

82. Femando Garayzabal J. et al. Survival of Listeria monocytogenes in raw milk treated in pilot plan pasteurizer. J. Appl. Bacteriol., 1987, 63, 533-537.

83. Fleming D.W., Cochi M.D., MacDonald K.E., Brondum J,, hayes P.S., Pikaytis B.D., Holmes M.B., Audurier A., Broome C.V., Rcingold A.E. Pasteurized milk as a vehicle of infection in an outbreak of listeriosis. 1985. // N. Engl. J. Med. 312:404-407.

84. FSIS (Food Safety and Inspection Service United Department of Agriculture) Strengthens Regulations to Reduce Listeria monocytogenes In Ready-To-Eat Meat and Poultry Products, http:/ www. fsis. com/.

85. Gellin B.G., Broome C.V., Bibb W.F., Weaver R.E., Gaventa S., Mascola L., & the Listeriosis Study Group. The Epidemiology of listeriosis in the United States—1986. 1991. Am. J. Epidemiol. 1133:392-401.

86. Gellin B.G., Broome C.V., Bibb W.F., Weaver R.E., Gaventa S., Mascola L., & the Listeriosis Study Group. The Epidemiology of listeriosis in the United States—1986. 1991. Am. J. Epidemiol. 1133:392-401.

87. Genigergious C.A., Oanca P., Dutulescu D. Prevalence of Listeria spp. in turkey meat at the supermarket and slaughterhouse. 1990. J. Food Prot. 53: 282-288.

88. Girard K. F. and Sbarra А. Д. Some studies on the selective isolation of L. monocytogenes and their clinical applications with findings to date. Second Symp. on Listeriosis. Inf., 1963,159-164. .

89. Goulet V., Lepoutre A., Rocourt J., Courtieu A.L., Dchaumont P., Veil P. Epidfimie de listiiriose en France: bilan final et resultants de 1'cnquKte ftpidemiologique. 1993. Bull. Epidemiol. Hebdom. 4: 13-14.

90. Grau F.H., & Vandcrlinde P.B. Growth of Listeria monocytogenes on vacuum package beef, p.518-519. In: proceedings of the 34'" International Congress of Meat Science and Technology, Part B. Brisbane, Australia.

91. Gray M. L. ct al. A new technique for isolating listereilae from the bovine brain //J. Bactcriol. 1948. 55, 471-476.

92. Gray M.L., Stafscth H.J., Thorp F., Jr., Sholl L.B., Riley W.F., Jr. A new technique for isolating listereilae from bovine brain. 1948. 55: 471-476.

93. Greenwood M.H., Roberts D., Burden P. The occurrence of Listeria species inmilk and dairy products: a national survey in England and Wales. 1991. // Int. J. Food Microbiol. 12: 197-206

94. Hammer P., Halm G., Heeachen W. Vcrgleichende Untersuchungen zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Wcichkase. Kiel. Michwirt. Forschung., 1989,41, 175-210.

95. Henry B.S. Dissociation in the genus Brucella. 1933. J. Infect. Dis. 52: 374402.

96. Hitchins A.D. FDA Bacteriological analytical manual. 8th edition. -1995. -Part 10.-p. 10.01-10.13.

97. Ho J.L., Shands K.N., Friedland G., Eckind P., Eraser D.W. An outbreak of type 4b Listeria monocytogenes infection involving patients from eight Boston hospitals. 1986. Arch. Intern Med. 146: 520-524.

98. International standard EN ISO 11290-1: 1996. Microbiology of food and animal feeding stuffs horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes, -p. 2-8.

99. Jaton K., Sahli R., Bille J. Development of polymerase chain reaction for detection of Listeria monocytogenes in clinical cerebrospinal fluid samples. 1992. //J. Clin. Microbiol. 30: 1931-1936.

100. JemmiT. Actual knowledge of Listeria in meat and fish products. 1990. Mitt. Gcb. Lebens mittcliinters. Hyg. 31: 144-157.

101. Kampelmacher К. II. and Hansen L. Occurrence of L. monocytogenes in effluents. Problems of Listeriosis., 1974, 66-70.

102. Karches H., & Teufel P. Listeria monocytogenes — vorkommen in Hackfleisch und verhalten in frischer Zwiebelmettwurst 1988. Fleischwirtschaft. 68: 1388-1392.

103. Kempton G. Listeria monocytogenes: a protocol for rapid identification. 1989. // Med.J.Austr. 150:607.

104. Kleinlein N., Untermann F., Beissner H. Znm vorkommcn von Salmonella tind Yersinia Spezies sowic Listeria monocytogenes in liackflcisch. 1989. // Fleischwirtschaft. 69: 1474-1476.

105. Klinger J.D. Isolation of Listeria: a review of procedures and future perspectives. 1988. Infection. 16 (suppl.): S89-S105.

106. Klinger J.D., Johnson A., Croan D., et al. Comparative studies of nucleic acid hybridization assay for Listeria monocytogenes in foods. 1988. // J. Assoc. Anal. Clicm. 71:669-673.

107. Kotilainen P., Jalava J., Meurman O., et al. Diagnosis of meningococcal meningitis by broad-range bacterial PCR with cerebrospinal fluid. 1998. // J. Clin Microbiol. 36: 2205-2209.

108. Larsen H. E. Isolation technique for L. monocytogenes primary cultivation and cold incubation technique. Proc. Third Int. Symposium in Listeriosis., 1966, 43-48.

109. Lee W. II. and McClain D. Improved L. monocytogenes selective agar. Appl. Environ. Microbiol., 1986, 52, 1215-1217.

110. Linnan M.J., Mascola L, Lou X.D., Goulct V., May S., Salminen C., Hud

111. D. W., Yonekura L,. Hayes P., Weaver R., Auduricr A., Plikaytis B.D., Fannin S.L., Kleks A., Broome C.V. Epidemic listeriosis associated with Mexican-style cheese. 1988. //N. Engl. J. Med. 319: 823-828.

112. Lorber B. Listeriosis. 1997. Clin Infect. Dis. 24: № 202. 1-11

113. Lovett J. Isolation and identification of Listeria monocytogenes in dairy products 1988. //J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71: 658-660.

114. Lovett J., Francis D. W., Hunt J. M. Listeria monocytogenes in raw milk: detection, incidence and pathogenicity.//J. FoodProt., 1987,50, 188-192.

115. Lovett J., Francis D.W., Hunt J.M. Listeria monocytogenes in raw milk: detection, incidence & pathogenicity // Journal of food protection. -1987. -Vol. 50.-p. 188-192.

116. Low J.C. & Donachie W. A review of Listeria monocytogenes and listeriosis. 1997//Vet. J. 153:9-29.

117. Lowry P.D., & Tiongt I. The incidence of Listeria monocytogenes in meat am meat products — fadctors affecting distribution, p. 528-530. In: Proceedings о the 34'" International Congress of Meat Science and Technology, Part В Brisbane, Australia.

118. Mattingli J. et al. Rapid monoclonal antibody-based cn/.ynic-linked immunosorbent assay for detection of Listeria in food products.// J. Assoc. Offic. Anal. Chem., 1988, 71, 3, 679-681.

119. Mc Evoy J.The incidence of Listeria spp. and Esherichia coli 0157:H7 on beef carcasses // 43th International congress of meat science & technology (43rd ICoMST). Congress proceedings. Vitality of meat, Auckland, New Zealand.-1997.- p. 346.

120. McBride M.E. & Girard K.F. A selective method for the isolation of Listeria monocytogenes from mixed bacterial populations // The journal of laboratory & clinical medicine. -1960. -Vol. 55. -№ 1. -p. 153-157.

121. McBride M.E., & Girard K.F. A selective medium for the isolation of Listeria monocytogenes from mixed bacterial populations. 1960. // J. Lab. Clin. Med. 55: 153-157.

122. McBride M.E., & Girard K.F. A selective medium for the isolation of Listeria monocytogenes from mixed bacterial populations. 1960. J. Lab. Clin. Med. 55: 153-157.

123. McCarthy S.A. Listeria in the environment. P. 25-29. In: A J. Miller, J.L.Smith, G.A. Somkuti (ed.), Foodbornc listeriosis. 1990. Elsevier, New York, NY.

124. McClain D., Lee W.H. Improved Listeria monocytogenes selective agar // Applied & environmental microbiology. -1986. -Vol. 52. -№ 5. -p. 12151217.

125. McClain D., Lee W.M. FSIS method for the isolation & identification of Listeria monocytogenes from pricessed meat & poultry products // USDA Laboratory communication. -1989. -№ 57. -p. 324-328.

126. McLauchlin J. Human listeriosis in Britain, 1967-1985, a summary of 72 cases. 1. Listeriosis during pregnancy and in the newborn. 1990. Epidemiol. Infect. 104: 181-189.

127. McLauchlin J. Human listeriosis in Britain, 1967-1985, a summary of 72 cases. 1. Listeriosis during pregnancy and in the newborn. 1990. Epidemiol. Infect. 104: 181-189.

128. Mead P.S., Slutsker L., Dictz V., McCaig L.F., Bresec J.S., Shapiro C., Griffin P:M., Tauxe R.Y. Food-related illness and death in the Unites States. 1999. Emcrg. Infect. Dis. 5: 607-625 № 223.

129. Messi P., Casolari C., Fabio A., Fabio G., Giberoni C., Menziani G., Quagio P. Presenza di Listeria in matrici alimentari / Ind. Alim. (Italia).-2000. 39, № 389.-C. 151-157.

130. Michael S.Curiale and Catherine Lewus. Detection of Listeria monocytogenes in samples containing Listeria innocua // Journal of Food Protection vol.57, December 1994-C 1048-1051.

131. Michard J., & .lardy N. Dtinobrcment e localisation dc Listeria monocytogenes dans des fromages a pate mollc et б croute lavtic fabriqutis avee du lait cm en provenance d'une enteprisc fromagure. 1989. Microbiol. Aliment. Nutr. 7:131-137.

132. Notermans S., Chakraborty Т., Leimeister-Wachter M., et al. Specific gene probe for detection of biotyped and serotyped Listeria strains. 1989. // Appl. Environ. Microbiol. 55:902-906.

133. Nunes Keith Listeria monocytogenes // Meat and Poultry.-2000. -46, № 2-C.32-33.

134. Ojeniyi В., Christensen J., Bisgaard M. Comparative investigations if Listeria monocytogenes isolated from turkey processing plant, turkeyproducts, and from human cases of listeriosis in Denmark // Epidemiol. And Infec.-2000.-125, № 2.- C.303 -308.

135. Peel M., Donachie W., Shaw A. Temperature-dependent expression of (lagella of Listeria monocytogenes studied by electron microseopy, SDS-PAGE and Western blotting. 1988. J. Gen. Microbiol. 143: 2171-2178.

136. Peterkin P.I., Idziak E.S., Sharpe A.N. Detecton of Listeria monocytogenes by direct colony hybridization on hydrophobic grid-membrane filters by using a chromogen labeled DNAprobe. 1991. // Appl. Environ. Microbiol. 57: 586591.

137. Pine E., Malcolm В., Brooks J.B., Dancshvar M.I. Physiological studies on the growth and utilization of sugars by Eisteria species. 1989. // Can. J. Microbiol. 35: 245-254.

138. Pini P.M., & Gilbert RJ. The occurrence in U.K. of Eisteria species in raw chickens and soft cheese. 1988. // nt. Food Microbiol. 6: 317-326.

139. Post D.E. Food-borne pathogens. Monograph number 2. Listeria // Technical support manager (Oxoid standards). -1997. -p. 1-25.

140. Rocourt J. & Jacket C. Surveillance ftpidftmiologiquc de la listiiriosc humanie en France: role du center national de reference. 1995. Med. Mai. Infect. 25: 177-183.

141. Rodriguez L.D., Vazquez-Boland J.A., garayazabal J.F.D., Tranchant P.E., Gomez-Lucia E., Fcrri E.F.R., Fernandez G.A. Microplatc technique to determine hemolytic activity for routine typing of Listeria strains. 1986. // J. Clin. Microbiol. 24:99-103.

142. Ryser E. T. and Marth D. Fate of L. monocytogenes during the manufacture and ripening of cheddare cheese. // J. Food Prot., 1987, 50, 7-13.

143. Ryser E.T.& E.H. Marth (ed.) Listeria, listeriosis and food safety. 2"d cd. 1999. Marcel Dekker Inc. New York, NY.

144. Ryser E.T., & Marth E.H. Fate of Listeria monocytogenes during the manufacture and ripening of Camambcrt cheese. 1987 // J. Food Pro.50: 372378.

145. Schlech W.F., Lavignc P.M., Bortolussi R.A., et al. Epidemic listeriosis — evidence by transmission by food. 1983. // N. Engl. J. Med. 308: 203-206.

146. Schlech W.F., Lavignc P.M., Bortolussi R.A., et al. Epidemic listeriosis — evidence by transmission by food. 1983. N. Engl. J. Med. 308: 203-206

147. Schlech Walter F. Foodborne listeriosis // Clin. Infec. Diseases.-2000.-31, №3.-C.-770-775/

148. Schuchat A., Swaminathan В., Broonic C.V. Epidemiology of human listeriosis. 1991. Clin. Microbiol. Rev. 4: 169-183.

149. Schwartz В., Hextcr D., Broome C.V. et al. Investigation of an outbreak of listeriosis: new hypotheses for the etiology of epidemic Listeria monocytogenes infections. 1989. J. Infect. Dis. 159: 680-685.

150. Scogio M.E., Di Pietro A., Mauro A., Picemo I., Lagana P., Delia S.A. Isolamento in prodotti ittici li Listeria spp., Aeromonas spp., Vibrio spp. // Ann. Ig.: Med. Prev. e comunita. 2000. -12, №4. -C. 297-305.

151. Seeliger H.P.R. & Jones D. Genus Listeria, p. 1235-1245. In: Sncath P.H.A., MairN.S., Sharpe M.E., Holt J.G. Bergey's manual of Systematic bacteriology. 91" Ed. Vol.2. 1986. Williams and Wilkins, Co., Baltimore. MD. №275.

152. Seeliger H.P.R. Listeriosen. 1958. Springer-Verlag KG, Berlin.

153. Seeliger H.P.R. Listeriosis — history and actual development. 1988. Infection. 16: S 80-S84.

154. Seeliger H.P.R. Listeriosis. 1961. Karger, New York, NY.

155. Skovgaard N., Morgen C.A. Detection of Listeria spp in faeces from animals in fields and in raw foods of animal origin // International journal of food microbiology. -1988.- № 6.-p.229-242.

156. Skovgaard N., Norrung B. The incidence of Listeria spp in faeces of Danish pigs and in minced pork meat // International journal of food microbiology. -1988.- № 8.-p.59-63 №.

157. Slutsker L., Evans M.C., Schuchat A. 2000 Listeriosis, p. 83-106. In: Emerging Disease 4. W.M.Scheld, W.A.Craig, J.M.Hughes (cd.). ASM Press, Washington, D.C.

158. Smola J. Possibilities of differentiation of listcrial hemolysins by synergistic hemolytic reactions (CAMP reaction). 1989 // Int. J. Food Microbiol. 8: 265267.

159. Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G. Bergey's manual of Systematic bacteriology. Vol.2. 1986 Williams and Wilkins, Co., Baltimore. MD.

160. Swaminathan В., & Hayes P.S. Sampling, isolation and rapid detection, p. 2137. In: Isolation and identification of Listeria monocytogenes. 1989 US Department of Health and Human Services, CDC, Atlanta.

161. Swaminathan В., Feng P. Rapid detection of Foodhorne pathogenic bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 1994,48,401-426.

162. U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual, chapter 29 — Listeria isolation; revised methods of analysis:notice. 1988. Fed. Registr. 53: 44147-44153.

163. Vazquez-Boland J.A., Dominguez L., Fcrnandez-Garayzabal J.F., Suarez G. Listeria monocytogenes CAMP reaction. 1992. // Clin. Microbiol. Rev. 5: 343.

164. Vera H.D., Dumoff M. Culture media // In Blair J.E., Lanette E.N., Truant J.P. Manual of clinical microbiology. American society for microbiology. Washington D.C. -1970. -p. 633-674.

165. Vidon D.J.M., Andre P., Baaj D., GryczkaC., Philipp P.Lumionol-enhanced the miluminesccnce by Listeria monocytogenes: a test for rapid assessment of antimicrobial agents. 1994. 120: 225-230.

166. Walter E. Hill. The Polymerase Chain Reaction: Application for the Detection of Foodborne Pathogens // Clinical Reviews in Food and Nutrition 36 (1&2): 123-173, 1996.

167. Watkins J., & Slcath K.P. Isolation and enumeration of Listeria monocytogenes from sewage, sewage sludge, and river water. 1981 // J. Appl. Bacteriol. 50: 1-9.

168. Weaver R.F. Morphological, physiological, and biochemical characterization, p. 39-43. In: James G.L. (ed.) Isolation and identification of Listeria monocytogenes. 1989. // US Department of Health and Human Services, CDC, Atlanta.

169. Welshimer H.J. & Donker-Voet J. Listeria monocytogenes in nature. 1971. // Apl. Microbiol. 21:516-519.

170. Welshimer HJ. Isolation of Listeria monocytogenes from vegetation. 1968. // J. Bacterid. 95: 300-303.

171. Welshimer H.J. Survival of Listeria monocytogenes in soil. 1960. // J. Bacteriol. 80: 316-320.

172. Wernars K. et al. Use of the polymerase chain direct detection of Listeria monocytogenes in soft cheese // J. Appl. Bacterioi., 70, 121, 1991.

173. Wesley I.Y. Listeriosis in animals, p.39-73. In: E.T.Ryser and E.H. Marth (ed.) Listeria, listeriosis and food safety. 2"d ed. 1999 // Marcel Dekkcr Inc. New York, NY.