автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Разработка технологии ферментных препаратов пектинэстеразы для получения модифицированных пектинов

^э с^дарс аоыитвт Российской Федерации по высшему

образована»

• Уооковокая Государственная академия пищевых производств

Еа оравах руководя

УДК:663.152.31:664.292 (043.3)

Ивлвва Алла Игоревна

РАЗРАБОТКА ТШОЛОГИИ ФЕРШШШ ПРЕПАРАТОВ ШКТИНЭСТЕРАЗЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЦОДОШЩРСВАННЫХ ПЕКТИНОВ

Спацнальноо«» 05.16.10 - Технология антаиннннх,

ферментных а белковыг препаратов, чая я табака

Автореферат

диооертащт на ооноканиэ ученой отадени кандидата технических наук

Ыооква, 1995

Работа выполнена в Московской государственной академия

ПИЩ8БНХ ПрОИЭВОДОТВ

Научный рукоБодвтель: доктор технических наук,

профессор Ы.В.Гврнет

Официальные оппоненты: доктор технических наук,

профессор Е.Г.Борвоенко,

кандидат технических наук

Г.Н.Рушнцева

Ведущая организация: Кафедра химической веземолопш Московского Гооударотвенного университета ш. и.ВДсшэпоомга

Защита соотоатоя * ¿i * дскаЬрл 1995 г. в ______ часов

на заседании диссертационного совета К 063,51.04 Московской государственной ажадешга пещовых производств. "

Просим Bao принять участие в заседании диссертационного совета вли прислать отзыв в двух зкоешлярах, заввронпых печатью учреждения, по адресу; 125080, Москва, А-80, Волоколамское шоссе, д.И

С диссертацией иохно ознакомиться в библиотека МГАЛП. Автореферат разослан . _ 1995 г.

Секретарь диссертационного совета к.т.н., доцент

0.И.Тихомирова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Пектолитические ферменты микробиологи-[вского происхождения нашли глубокое применение в различных [траолях народного хозяйства в нашей отраве я за рубежом.

Основное применение нх связано о гидролитическим расщеп-[вняеы пектнновнз возеотв при переработке плодов, ягод я >вощей, позволягщи значительно повысить выход конечного про-Огкта н улучшить его качество. Необходимо отметить, что для 1тих целей попользуются комплексные ферментные препараты, юдержагшо а гндродазы (пекигаэотеразу н лолнгалактуропазу), г траноэлшзназы.

В процесса получения таких ферыеятных препаратов авторы »раэдтируются либо на иаксииалыгай выход общей неполитической «тнвностн, дабо полнгаладтуроназы, так как именно она обладает йзяиаахщиы действием а гндролизует нативннй высокоэтервфици-юванный пектин.

В литературе ничтожно мало работ, посвященных вопросу [вленаправленного получения фермента пектннэстэразы, потреб-юота 9 котором возрастают в последние годы.

Во всей ыирэ ежегодно увеличивается спрос на продукты штання, обогащенные пектиновыми веществами различной отепени верификации, что связано в основном о неблагоприятной экологи-■еской обстановкой.

Известно, что модифицированные (в оововвои ниэкоэтарифи-щровашше) пектины является эффективными препаратами для ювышения сопротивляемости к неблагоприятным природный факторам, выведения из организма токсичных веществ, ионов тяжелых (вталлов и их радионуклеидов, а также для оказания лечебного

действия при заболевания* аэлудочно-ктвчиого тракта, нарушения обмена веществ н т.д.

В настоящее время низкоэтерифщированныв пектины получают химическим путей, и используемые для втих целой кислоты в щелочи неблагоприятно воздействуют на структуру в свойства пектина. Энзимная деэтерифакация лишена этих недостатков.

Необходимо отметить, что в России практически отсутствует технологии ферментных препаратов поктнвэотераз, а те лабораторные которые были сделаны ранее, не явдяотся экономически целесообразными для их промышленного внедрения.

В связи с вышеизложенным, актуальными являются исследования, посвященные разработке технологии фершнтных препаратов пектинэстераза микробиологического нроиохоадения с целью получения пектинов различной степени э тарификации.

Цель в задачи работы. Цольв исследования являлась разработка технологии ферментного препарата пектинзотерааы на оонов< отечественных шташов - микроорганизмов о использованием имеющегося на заводах оборудования в традиционных технологических схем производства.

В соответствии о целью были поставлены следущие задачи:

- скрининг микроорганизмов и выбор активного продуцента пектинэстеразы;

- конструирование и оптимизация состава питательное среды и условий культивирования микроорганизма с цельв направленного синтеза пектинэстеразы;

- разработка режимов концентрирования и очистки пектинэстеразы от полвгалактуроназы с использованием мембранной технологии;

- разработка технологической охемы получения ферментного препарата пактинэотеразы,

Натчвад новизяа. Проведен окривинг микроорганизмов и отобран гриб Р.|е^ц.1йпот 57699, способный синтезировать комплехо пектолитаческих ферментов о превалирувдэй активностью покткяэотэразн.

Изучена закономерность биосинтеза ферментов на различных питательных оредах н установлены основные факторы, влнявдно па соотноаение отдельных ферментов в комплексе.

На всех основных отадаях получения ферментных препаратов (культивирование, концонтрарованпэ, очистка) уотанрвлены зави-оимоотв ыезду соотноевяяои основных ферментов в технологичео-кищ прзецаш, используемыми о долью направленного получения пектвнэотеразы.

Праутлчэская ценность. Разработана технология получения ферментного препарата пектинэоторазн о использованием новой оценки эффективности различных технологических приемов. На всех этапах получения препарата основным критерием оценки являотря соотношение основных . ¡тов комплекса.

Технология опробирована на стендовой уотановка МГАПП и была подтверждена ее эффективность. Получены образцы низкоэте-рифицированного яблочного пектина с использованием ферментативного гидролиза пехтинсодерващего сырья.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на двух международных конференциях "Научно-технический прогресс в перерабатывай®* отраслях АПК" Шооква, 1995) я "Пища. Экология, Человек" (Москва, 1995). '

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 4 работы. . '

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, экспериментальной части, выводов, описка литературы и приложений. Работа изложена на 123 стр. основного текота, включает 21 таблицу в 7 рисунков. Список литература включает 134 источника.

1. СОДЕРЯАНКЕ РАБОТЫ

В<? вэедеции обоснована актуальность темы а определены основные задачи исследования, сформулированы новизна и практическая значимость полученных результатов.

В обзоре литературу приведены данные о пектодитичеоких ферментах и микроорганизмах - их продуцентах. Рассмотрены особенности биосинтеза и получения ферментов. Изложена аспекты применения ферментных препаратов пзктиназ. Дано представление о современных методах мембранной технологии.

2. ЖСПЕРШЕНТШНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Объекты и методы исследований

Объектами исследований являлись ферментные растворы, полученные при культивировании грибов A.petlduS тташы Ц-45, Д-Ы и P. ftttutanum штаммы BKMF-248, BKMF - 1073, BKMF -1075 BKMF - 1292 м штамм 57699. Вышеназванные штамыы - продуценты неполитических ферментов, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РФ (ВКЫ), в институте микрбвололга и вирусологии им. Д.К.Заболотного (г.Киав), НПО "Биотехнология", а.также из коллекции кафедры "Процессы ферментации и промышленного биокатализа" МГАШ. Культуры поддерживали, пересевали на пробирках со скошенным сусло-агаром раз в 2-3 месяца.

Периодическое культивирование осуществляли глубинным методом в колбах объемом 250 мл, заполненных на 50 ил средой, на круговой качалке при скорости вращения 180-200 об/мин и на

стендовой установка "Лякуы". емкостью 20 л.

Вое огштн проводили не менее чем в 5 повторноотях. Результаты. прэдотавлешыэ в работе, являются средними арифметическими в ала чиламз,

Д,тя наследования применяли следугаога питательные орады: Среда К%): гвдролиаат яблочных выашок - 9,5; солодовые ростки - 2; (iVH4)^IP04 - 0,1; UjSO^THgO - 0,05."

Среда 2(5?): яблочный пектпн - I; C/VH4)2S04 - 0,7; KBgPO^ -0,1; O^THgO - 0,05.

Среда 3($S): яблочный поктш - I; глшоза - Г; (/V'H^.S'O^ -0,7; KHgPO^ - 0,1; Ug SO^THgO - 0,05.

Срода A{%): окстраиг яйяочных выхныок; 04 - 0,7;

iljjS04- TBLjO - 0,05; КН^ - 0,1.

■ Доя проведенных исследований вспользовали английский яблочный пектин производства фстрш "Вufшел LTD яблочный пектин производства Бендерского консервного завода, свекловичный пектин ТУ С-09-3458-73 а ТУ C-09-10-I556-83, а такав яблочный н цнтру-оовнЭ пектины поденной фзрш "far-kstreith Fo)C "

Ферментативную активность определяли следующими методами: активность полигадактуроназы определяли виокозиметрнчеокиц методом (Лзфлшц Д.Б. з др., 1974), пектинэотера8нух> активном* определяла по титрованию овободаых карбоксильных груш (Филиппова

В.Е., 1990). .....

Для-получения концентрата культуральной жидкости использовала едетатледлмоанне мембраны Вдадипор (уАЫ-300) концентриро-ванве осуществляли на лабораторной ультрафзльтраодонной уотановке,

В ходе иоследоваявя определяли белок методам Лоурн (Lourr-ц et оЛ. , 1951), восстанавливающие сахара - методом Шомодьи-Нэль-оона (Клесов А.А. в др., 1980).

Сухие вещества в растворе .определяли рефрактометрическим

катодом. Водородный показатель среды рН определяли о помощью иономера " рН-121".

В работе применял? ыатештичеокие методы планирования экспериментов (.Грачев, 1979).

2.2. Скрининг микроорганизмов и разработка состава питательных оред для биосинтеза пектинаотеразы

При подборе штатов до исходили иг возможности более высокого выхода пектинаотеразы ШЭ) относительно полнгалактуроназн СНГ) -Это делали для того, чтобы обеспечить получение препарата, обога-кенного пектинэстеразой. В связи о этим при подборе продуцента для характеристики процесса культивировался ввели коэффициент п=ПГ/ПЭ-Ю3. Исходя из результатов (табл.1) навлучаее ооотношо-ние показателя ПГ/ПЭ-Ю3 обладает шташ Р. ^г11и1о.Цй,(Т\ 57699. Наличие этого факта, а гагата наилучшая пентниэотвразвая активность в 1,2-1,8 раза выше, чем у других культур, позволено выбрать Р. ^е{1и1апи.т штшм 57699 в качестве продуцента ПЭ.

Таблица I

Скрининг микроорганизмов - продуцентов пектинаотеразы

Наименование продуцента С.В. * рН цэ. ед/ыл ИТ ед/мл пг/пэ.ю3

I г 3 4 5 " 6

Я.{о&Ыи$ М-45 Я. УоеШ А-57 Р. /е((икпит 57699 0,84 0,97 3.5 6,88 6,60 2.7 0,21 0,39 0,34 119,7 234,2 173,4 0,57 0,58 0,51

ВКМГ-248 1.9 2,87 0,07 10,8 1,44

ВКМЕ-ЮТЭ' 2,0 3,55 0,05 10,1 2,16

ВКМБ-Шб 2,2 3,60 сл. сл. сл.

ВКМГ-1292 2,0 3,40 сл. сл. сл.

Давний шташ граба был получен в результате направленной ступенчатой оеяакция (Айзенберг В.А., Билай Т.И. и др.,1982). Ферментативный коыплеко, продуцируемый грибом, отличается повышенным оодерханием пактанэотерааы и сравнительно низком, по сравнению с известными промышленными продуцентами, активностью поля-галантуроназы. Это обстоятельство, на наш взгляд, является оуще-отвениш для попытки получения в дальнейшей индивидуального фермента.

Авторы предлагают различные методы разделения полигалакту-ронаэы п похтинвстеразы, которые можно систематизировать, в основной, в 2 раздела: 1-ый - химическая или фязичеокая инактивация полигалактурояазы; 2-ой - хроштогра$аческое разделение ферментов в готовых препаратах. На наа взгляд, более целесообразно попользовать различные приемы на воех технологических стадиях получения препарата, о целью поэтапного уменьшения псишгалак-туропазы.

Извеотно, что кошшеио ферментов, синтезируемый микроорга-вввиамя в значительной степени варьируется и завиоит от вида продуцента, состава среды, условий культивирования, выделения п т.д.. Существенную роль играют основные источники питания -азот, углерод, фосфор, оостав пектиновых веществ и даже степень нх цетоксицировання,

В литературе описаны данные о благоприятной влиянии экстракта солодых роотков, кукурузного экстракта пектиновых вещеотв и их гидродвзатов и др. на накопление общей неполитической активности у грибных пэктиназ (Калуиянц, 1978). Однако сведений о«} источниках питания для биосинтеза пектинзотэраа, очень мало.

Учитывая физиологические потребности гриба Р. ^е1[иЬпит 57699 в источниках углерода (гриб усваивает глюкозу, галактозу, мальтозу, фруктозу, сахарозу, крахмал, инулин, сорбит, маннит),

\

нами были испытаны наиболее часто применяемые в технологов фер-метных препаратов.

Наилучшие санные предотавлены на рис. I.

Нами был отмечен хороший роот биомассы гриба, практически, на воех испытанных соединениях, однако наилучшие данные По биосинтезу пекткнаотеразы зафиксирован при использовании глгаоаы.

Известно, что на первых стадиях роста различных культур микроорганизмов желательно наличие в среде легкометаболивируемых углеводов. Однако, увеличение концентрация юс в среде ысяет вызвать подавление синтеза ферментов по механизму катаболатиой репрессии. Вероятно, подобным механизмом когно объяснить резкое сникение активности пектшэстеразы прн повышенных концентрациях глюкозы в среде. Наш было проанализировано влияние концентрации углеводов от 0,5 до 2,5%.

Наилучшие данные получены прн использовании 1% глюкозы, активность ПЭ воэрасла в 3 раза, при 8Том синтез ПГ оотался на уровне контроля.

Работами многих исследователей установлено, что именно смесь пектина и низкомолекулярных углеводов дает наибольший эффект в синтезе ферментов. Учитывая это обстоятельство, а также то, что при синтезе ферментов необходимо наличие индуктора ( в данном саг/чае пектина) наш было исследовано влияние различных типов пектинов (свекловичного, яблочного и цитрусового) на биосин тез пектолиткческих ферментов. Наилучше .результаты получены при использовании яблочного пектина. Величина пектинэсторазной активности в этом случае в 2,5 раза выше; чем при культивировании на цитрусовом пектино и в 2 раза - чем на свекловичном. Даяние представлены на табл. 2.

>0 100'

1,2 ■ I 0.8 - а 0,4

К-- к

V] ---? 2 3' 1

а)

1,2 - ^ 0,8 . е 0,4 к

ч чК- —• 1 > „ 2

1 -X. - ' 1 'О— Ч 1 3

б)

2,0 - 3 1,2 - е 0,4 >

Уг ■ ¿V о\ '

Г _1— _____1_ —.1 _______»„ 2 1

в)

0,5 1,0 1,6 2,0 2,5

концентрация углеводов, % РисЛ. Влияние углеводов на синтез пектолитических ферментов

а) лактоза ( I - ПЭ; 2 - ПГ ) сорйит ( 3 - ПЭ; 4 - ПГ )

б) арабиноаа ( I - ПЭ; 2 - ПГ \ глицерин ( 3 - 113; 4 - ПГ )

в) глюкоза (I - ПЭ; 2 -ПГ )'

Таблица 2

Вжвяняе типов пектинов на бпооинтез пектолвтвгаеоких ферментов.

Тктт пектина рн С.В., ПЭ, ПГ, ПГ/ПЭ Юа

% ед/мл ед/мл

Свекловичный 2,7 3,4 0,80 359,5 0,45

Цитрусовый 2,4 1.6 0,90 271,5 0,30

Яблочный 2,5 1.8 1,38 535,8 0,39

Б дальнейшем мы последовали влияние концентрации пектина •'д, синтез внеклеточной пектшэотеразн грибом Р. ^И^йпит 57699, Лчопаршентальныв данные представлены на рио. 2 ев которого сле-;,;,-(•?, что увеличение концентрации яблочного пекигна в питательно« среде до 1% способствует возрастании синтеза пектннэотераза.

Следует отметить, что изменение концентрации свекловичного •;як.трна (в изученных интервалах) шло влияет на синтез пектин-• г.тзразн, что согласуется о данными, опиоаннкш ранее в литературе.

Необходимо отметить противоречивые сведения о влиянии сте-■••онс иетоксилирования пектиновых веществ, вносимых в пнтатель-среда, на синтез пектинястераз. Известны прямо противополог-результаты, полученные на одном в том ве продуценте -¡ '1и2сри$ при использовании свекловичного и яблочного

га:тшов различной степени метоксилирования (Грачева, 1987). .'¡,;птому очень ваяно было исследовать влияние отепени зтерифика-■ =,,! на синтез пекгсхлитичэских ферментов.

Результаты исследований представлены в табл. 3.

При анализе полученных данных следует отметить, что высокого ротированные пектины способствуют увеличению синтеза пектин--:на 35-45%. Соотношение активностей полкгалактуроназ к .^г.-.-ш^стеразе изменяется незначительно.

Tadшш 3

Влияние степени эгервфшщии пектина на биосшггиз пектолитических фэрыоптов.

Й» Степень

п/п . этерифакациз рН

74 2,2 1,6

70 2,3 1,45

40 2,6 1,6

пэ, од/мл ед/мд ПГ/ПЭ-iu'

1,33 532,9 0,40

1,18 476,2 0,40

0,57 181,3 0,32

Такш образом, для культивирования граба Р. jtiitdanum Ь'.'оЬл

рекомендуется использовать яблочный поктнн в концентрации 1% w

степэньэ атерзфззсацпз 70$ п вше.

2.3. Разработка условий и оптимизация способа глубинного культивирования p. jeliutanu.m .

Известно, что на рост микроскопических грибов н образовании шз пектолнтвчеокнх фэрментов пошшо состава среды существенное влияние оказывав? рН среда, температура и режим аэрации при пультпвнровашш п другие факторы. Следовательно, изменяя условия роота микроорганизмов, ыоано регулировать процеооы биосинай-8а н соотношение ферментов в комплекое.

Для получения ферментного раствора о преимущественным оо-дераана ей пектинэотера8ы эффективно использовать овойства микроорганизмов осуществлять синтез ферментов а различной скоростью

Из полученных результатов (рао. 3) видно, что максимальное шкоа-

1

лание пектшэоторазн завершается к 68. часу культивирования Сактнвнооть пектинэстеразы 1,6 ед/ыцг, ИГ/ПЭ-Юэ « 0,49). Однако шшимальноа соотношение активлоотей наблюдается в интервале 62-66 чаоов культивирования, на этом этапе накопление пектинэстеразы происходит быстрее, чем полигалактуронази (ЛГ/ПЗ-103~0,41 :,

0,7

0,3

л э ед/мл 1,4 1,2 1.С - 0,Е ? 1 •

Р п*пЛа*

* С 5

0,25 0,5 0,75 1,0 1,25 1,5

концентрация,^ Рис. 2. Влияние концентрации пектина на синтез

пектолигических ферментов

Ж 73

, час,

Рис. 3. Динамика роста культуры и накопление ею внеклеточной пектинэстеразы

врез несколько часов поело достижения максиму?» происходит начительноэ снижение активностей пектолитнчеокжх ферментов в ультуральной жидкости.

В процессе изучения опубликованных данных научно-нсоледо-ательских работ нами не выявлено четкой корреляции ыввду зпаче-ием рН среды в способностью микроорганизмов накапливать ПЭ и ПГ, ак правило, опгсшальзоо эначэнле рН для биосинтеза втах двух ерментов лежат в очень близких друг от друга интервалах. Однако, процессе выполнения наших исследований было обнаругено, что оаиожно регулирование соотношения ИГ/ПЭ, изменяя начальную еличину рН питательной среды.

На рио. 4 приводятся данные о влиянии начального значения д питательной среды в диапазоне от 4,0 до 7,5 аа продуцнруицуы пособнооть культуры Р. {(Ии1(жит 57699. Было установлено, то минимальное соотношение полигалактуроназяой активности в ектинэотеразной наблюдается в культуральной яндкооти при началь-ом значении рН питательной ореда от 4,4 до 4,8 ШГ/НЭ *108 « ,40 - 0,41).

- В качестве посевного материала использовали глубинную куль-рру микроорганизм., выраденную на оптшалытой питательной ореде. эличество посевного материала варьировали от 0,5 до 2%. Было зказано, что заметного увеличения или изменения синтеза фермен-)в в данном диапазоне ае происходит. В связи о вышеизложенным, несообразно вносить глубинный посевной материал в количестве ,5-0,7%.

Для оптимизации бшш выбраны следухщие факторы: Х^ - рН оре-I, %2 ~ &оза посевного материала; Хд - количество кислорода )даваемое на аэрирование; Х4 - длительность культивирования. т постановке опытов использовался план дробного факторного ¡сперимента ДОЗ 24.

В результате математической обработки экспериментальных данных были подучены рограссионнные модели, опиоываюте зависимость пектинэртерааной активности от исследуемых факторов 12» 12« Хд, Уравнение регрессии имеет вид:

У - 0,53 - 0,144 Хд + 0,79 Ц - 0,096 Х^ + 0,05 Хд + -I- 0,22 Х^ 0,11 Х^ - 0,086 Х4

Дда расчета програшы оптимизации о учетом магфакторного ввашодействая линеаризовали уравнение и использовали процедуру Бокса-Ушгссна. В результате были получены следующие оптимальные условия культивирования Р, ^1Си1йпигт\ 57699: рН = 4; доза посевного материала - 0,7%; длительность культивирования 65,5 часов; оптимальное количество необходимого для аэрирования кислорода.

Как было описано ранее, для увеличения синтеза поктолите-ческвх ферментов в соотаве питательных сред долшш находиться глюкоза и яблочный пектин. Однако, для промышленного получения ферментов в Роосип вводят обычно различные продукты растительного прозехоадония, содераацие те нлн иные источники питания, либо их гидролиэатн.

Целесообразно использовать для зтих целей, так называемые, вторичные материальные ресоурсы - - отходы от переработки растительного сырья.

Нами были проанализированы различные партии яблочных выжимок, поступающих о сокоперерабатнвапцих заводов, и выявлено в их состава значительное количество пектина, редуцирующих веществ ж в том числе глюкозы. Из яблочных выжимок были получены вкотрак ты, а также ферментативные и кислотные гидролизаты, определены

их составы и затем они были использованы в составе питательных сред для замены яблочного пектина. Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4

Влияние яблочных выжимок на процесс биосинтеза пектсшгипескнх ферментов грзбоа Т.^1В£и.1лпи/п

й 1 Способ обработки :/п ! яблочных внешок

! Колн-! чеотво ! в оос-1 таве I пита-I тельной ! среды, Л32.

Ферментативный гидролиз . < 50

Кислотный

гидролиз 50

Водная экстракция- 50 Контроль ^пектин 1%) -

ПЭ, эд/ал

сл.

сл.

0,63

1,38

! !

! ИТ,

од/мл

сл.

сл. 181,8 535,0

ПГ/ПЭ.Ю8

0,29 0,39

Ферментативный и кислотный гидролизаты не дали полоаитель-ых результатов, в то ае время экстракт яблочных выянмок, добав-яешй в количестве 50 ил, несмотря на более пнэкзй уровень ердентативншс активностей по сравнении о контролем, позволил начительно снизить накопление полпгалактуроназы. При атом оотношение ПГ/ПЭ • Юэ ооотавило 0,295?, что на 26% лучше контроля.

После проведения этой серзпг опытов наш была осуществлена нтимизация глубинного культивирования о помощью полного фактор-ого эксперимента ПФЭ 23. На основании обработанных результатов или установлены следувдие условия:

состав питательной среда 06): (/УН4)25 04 - 0,7; М^О^ТЗ^О -,05; КН2Р04 - 0,1; экстракт яблочных вшгамок до 100;

условия культивирования: рН = 3,7; длительность культи-ирования - 68 - 69 чао.

г

а

0,6

0,4 0,2

са/нл - 1,6 • 1,4 - 1,0 . , . 1 -

■ ЕЙ \ а-— пя в»

/ I N лэ

1 ч 1

В

Рис. 4. Влияние начального вначенил рН среды на биосинтеа пвктолитических ферментов

I /пэ ¥

ч > щ ш 1

ш 1

т у//,

%

80'

60 40

15

30 45

60 75 90

< вьщержки, мин Рис. 5. Влияние времени воздействия раствора щелочи

на активность неполитического комплекса Р. ■ 1£1и{апит

2.4. Исследование процесса концентрирования н очистки культуральной жидкости Р. jeiEatanu.nl методом ультра^аяьтрахош

Известно, что метод ультрафяльтрации позволяет не тонко ¡концентрировать ферментные растворы, но и значительно очистить □с от балластных веществ пря шзншалышх енергозатратах и инак-ивацзя.

Однеа из существенных педоотатков этого процесса считает □аление концентрационной поляризация, связанное о образованием га поверхности мембраны голообразного слоя. Ддя предотврадопгя ' того явления необходима качественная предварительная очистка оршнтных растворов, достигаемая разлэтлши фкжулянтеш (ссшаа, ¡ентоннтовынн глинами), а таете измененной рП до пзоэлоктряческогс* начензя, при котором осаждаются балластные вечества. В связи вьшшизлонешшм, о дней из разделов ушбранзой технологии фер-ентных препаратов является нссдоядрдааа гздроивхаяэтомшх я язико-хвмических методов прэда^цданой обработка культураль-ой жидкости.

В качестве флокулянтов яэщ испытаны боятмшт, кнзоль-ур, желатин, соли АЗ^^ ^ 0^ )д, ЗДДз? которые не оказали полоая-ельного освотляицого действия, ^ рцо. 5 представлены данные о обрабдда культуральной ашд^оо^з при различных значениях рЗ, э котор^ следует, что рациональными режимами обработки культу-альнрЦ дадкооти являются следующие: доведение ферментного раст-эра рН 10,8, выдержка в течениа 30-60 шш., отделение выпав-эго осадка, нейтрализация раствора до походного значения.

При этом выход пектинэстеразной активности составляет -92,8^, то время как выход полигалактуроназной активности от 3,5%. Таким образом полученные результаты свидетельствуй О ютичном фракционировании ферментов.

Для предварительной очистка использовали микропористые мембраны, любезно предоставленные ФХИ им. Я.Я.Карпова (г.Обнинск) Критерии, по которым опевивали пригодность мембран служили аффект со скорости фильтрации, разделящей способности ПЭ и ПГ, выходу по активностям, а также прозрачности фильтрата. Полученные данные представлены в таблице 5.

Таблица 5

Предварительная обработка ферментного раствора о использование** микропористых мембран

й партии мембраны Скорость фильтрации, Ш1/1Ш1 Прозрачность, % Выход, %

по ПЭ по ПГ

I 0,35 86,0 93,1 88,5

2 2,20 84,5 97,9 99,3

3 2,10 80,0 97,2 97,8

4 2,00 98,0 93,1 92,1

5 0,16 99,0 63,5 75,4

Наибольшая скорость фильтрации в прозрачность раствора

наблвдалась при использований мембраны £ 4. При отои не наблв- 1 далось разделения ферментов - ПЭ н ПГ и их выход составил 93,1 и 92,156 соответственно.

Для определения рационального режима предварительной обработки растворов о последутаим ультраконцентрированием были иосл дованы наилучшие варианты физико-химических и гидромеханических способов. В результате эксперимента установлено, что достаточно использовать подщелачивают раствора, при этом происходит частичное разделение ферментов: выход по пектинэстеразе - 93,8$; по полигалактуроназе - 64,5$.

Таблица 6

Сравнительные данные но влиянии различных способов предобработки культуральной жидкости ?.fe.Uutanu.m.

№ /п Наименование Скорость фильтрации, мл/нзш Прозрачность, % Выход, по ПЭ , % по ПГ

. Исходная культу-ральная аидкость 1,23 75,0 100,0 100,0

. Обработка щелочью (pH = 10,8) 1,44 91,5 КЗ,8 72,5

. Мзкрофзльтрацня 1,43 97,8 93,4 90,2

. Микрофильтрацш + обработка щелочью ' 1,50 98,0 87,0 60,3

Выбор мембран, пригодных дая концентрирования культуральной здкости Р.jefüu-tünum обосновывался отсутствием пектинэстера-j в фильтрате (А. = 100%) и высокой скороотьв фильтрации ютвора.

При анализе полученных данных (табл.7), следует отиотнть, го мембрана YAM - 500 обеспечивает наибольшую скорость фзльтра-ш. Однако более 80% активного белка обнаружено в фильтрате, змбрана YAM - 200 при 100% задерживающей способности нопригод-1 из-за чрезвычайно низкой скорости фильтрацна (0,095 ид/мин), эебуемым критериям соответствует мембрана YAIJ - 300. Высокая сорость фильтрации ( 1,67 ыл/инн) и 100$5-цая задерживающая опо-эбность по пектинэстеразе.

После того, как был отработан режим ультрафильтрацни, в атворе все еще оставалась полигалактуроназа, не отделенная на ;ех этапах получения ферментного препарата.

Таблица 7

Подбор мембран ддя концентрирования культуральной аидкооти Р. feltute.nu.tn.

т п/п Мембраны Скорость фильтрации, ип/шш С.в.. ПЭ ПГ в ф-те в ф-те од/ш: ед/мл к.% по ПЭ и.% по Ш

I. УЖ-200 0,095 0,3 _ _ 100 100

2. уш-зоо 1,67 0,9 - 67,5 100 87,4

3. УАЫ-500 3,10 1.2 1,16 456,0 20,0 15,С

4. Исходная куль-туральная яидкость, прошедшая предочистку нет 1.2 1,45 536,5 нет нет

Я - эадерзшващая споообнооть

Известно, что ингЕбзрованив ИТ возможно о коыскцьс щелочной обработки при рЕ 11-12 (Ахвледиани З.Г., 1991 ), при атом, по данннм автора, сохраняется до 60% ПЭ, а ПГ инактивируетоя на 99,5-97,7%.

Наш был использован этот прием в проведены эксаеривдвты по определении величины рН, длительность экспозиции в температуры.

Было показано, что при рН 10, = 35° в времени выдараски 1,5 часа, практически полностью инактивируется ПГ, при этом выход ПЭ ооставляет 85-87%.

Из полученного концентрата был получен спиртоосажденный ферментный препарат при концентрации водноопиртовой смеси 75% и рН раствора 4,0-4,5.

Ферментный препарат был опробирован для получения низкоме-токоилированного пектина из яблочных выжимок.

** <-1 v

3 :

II

_а

^ /О

ш

3

ш

а [Л г 1

э I г*) с 7

I - экстрактор непрерывного действия; 2 - бак для приготовления солевого раствора; 3 - емкость дая яблочного экстраК1з; 4 смеситель; 5 - стерилизационная колонка; 6 - выдерживатель; 7 - теплообменник; в * посевной аппарат; 9 - ферментер; 10,16,24 - сепаратор; II, 17, 20, 22 - сборник; 12, 15 -- «йкбсть для биомассы; 13-, 18 - рекктор; 14 - емкость для щелочного раствора; 19 - емкость м для кислотного раствора;21 - УФ установка; 23 - установка непрерывного осаждения; 25-вакуумсушильный шкаф

вывода •

1. Проведен скрининг микроорганизмов ореди грибов родов Л^регдгССил в РетаШит. Показано, что наибольшим синтезом

пектинэстеразн ( н наименьший полигалактуроназы) обладает

Р. ¡еИи1а.аит шт. 57699.

2. Разработаны основные стадии технологии пектинэотерады иг кудьтуральной жидкооти Р. ^еРСи'Са.пит основным критерием которых было совладение условий минимального соотношеая полигалак-туроназы к пектинастеразе (ПГ/ПЭ).

2.1. Определены основные компоненты питательной среды для глубинного культивирования:

- установлено сткцулируицее действие 1% глюкозы в составе питательных оред;

- исследован в определен источник пектина, его концентрация и степень эгерифнкацин. Наилучшие данные получены о 1% яблочным пектином, со степенью этерификации 7036 в выше;

- показана целесообразность и экспериментально доказана эффективность использования экотракра вбдота» двдшок » качестве источника углерода и пектиновых вэдеств.

Предложенный состав питательной среды (а ЖН^ - 0,1; (Д/ Н432504 - 0.7; М^-Т^О _ 0(05?. экстра?т яблочных выжимок до 100) позволяет получать культуральную жидкость о пектин-эотеразной активностью - 1,48 ед/мл; ПГ/ПЭ • Ю3 в 0,36.

2.2. Выбраны оптимальные условия для концентрирования в очистки глубинной культуры Р. ^{¡Лапигп методом мембранной технологии;

- проведен сравнительный анализ различных способов предварительной обработки культуральной жидкооти перед ультрафильтрацией. При сравнении гидромеханических и физико-химических способов -предпочтение отдано последним.

Докйяайо, что для очистки целесообразно попользовать подаелачива-ние раствора до рН 10,8-10,85, вндерхку в течение 80 мин. о поо-ледуЩШ центрифуглроваааеи в нейтрализацией до исходного аначення. В результате увеличивается на 20$ скорость фильтрации, срок работы ультрафяльтрацвонноЙ установка 3 достигается частичное фракционирование ферментов;

- подобраны мембраны для ультрафзльтрацнп а определены рентам для очистка ферментного раствора: ацетатцелввлозшо мембраны Владнпор со средним диаметром пор 300 А; рабочее давление

0,5 Ша.

2.3. Разработали условия выделения ферментного препарата юктинэотеразы:

- предлоаен метод инактивации остаточной пешегалактуроназы > использованием подаелачивания раствора до рН» 10, Ь » 35°;

Т » 1,5 часа.

- выделен ферментный препарат с Использованием 75% этанола качестве осадителя прй рН растбора 4,0 - 4,5.

Полученный препарат имеет блэдувдув характеристику: Э = 249 оД/г; ПГ - следы«

3. Разработан лабораторный регламент получения пектинэстеразы [робироёШЫЙ На бШДовой установке ЫГАШ1.

4. Показана эффективность применения пектинэстеразы доя лученйй нйЭкометйксилированного яблочного пектина.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ивлвва ¿.И., Филиппова Р.Л., Гернет М.В. Очистка в концентрированна нектинэстеразы вз P. ■J&Clcctajuuri шташ 57699 методой мембранного разделения.// Научно-технический инф. сб. "Винодельческая, сиво-безалкогольная, спиртовая, ликеро-водочная и дроагевая промышлелнооть" - Ыооква, АгроНИИТЭШШ,

V.i

1995, вып. 1-2.

2. Ивлева А.И., Филдишова Р.Л., Гернет М.В. Скрининг микроорганизмов - продуцента пектинастеразы и подбор питательной среды для его культивирования.// Научно-технический инф.сб. "Винодельческая, што-безалкогольяая, спиртовая, ликеро-водочная в драххавая промышленность". - Москва, АгроНИИТЗШШ, 1995,вып.З.

3. Ивлева А.И., Филлвпова Р.Л., Гернет Ы.В. Разработка технологии ферментного препарата нектинэстеразы для получения модифицированных пектинов.// Tea. докл. Ыехгд. конф. "Научно-технический прогресс в перерабатывгшаих отраслях АПК". - Москва, 1995, о. 67.

4. Ивлева А.И., Гернет U.B., Филиппова Р.Л. Получение очищенной пектинастеразы о использованием методов мембранного разделения. // Тез. докл. Ыезд. научно-технической конф. "Пища, Экология. Человек", 1995, в печати.

SUMMARY.

Taking into consideration unfavourable ecological situation in the orld the creation of foodstuffs enriches with pectin substances is an urgent sk.For this purpose it is the most expidient task is to use pcctin with low ttent of esterification permitting to remove toxis substances ,ions of heavy etals and radionucledes from the body.

It is of interest to obtain modified pectins by enzyme decterification. 5,the aim of the present study is to work out pectinesterase technology for roduction of low methoxilated pectin with application of membrane ethods.

The research object was a cultured liquid obtained by deep cultivation f fungus P.ftllatessa strain 57699.

To intensify the process of pectinesterase ultrafiltration different ethods of pectinesterase pretreatment were inwestigated and optimal irameters and their treatment conditions were determined.

Comperative characteristic of above mentioned methods of enzyme ilution was carried out. It was shown that the most expedient method for xtinesterase purification is alkalizaticn up to pH 10.83-10.85. As a result 5t only the speed of the reaction is increased by 17% but also partial actionation of enzymes of pectolytic complex is achieved.

It was also determined that when the liquid preparation Pectinesterase" is obtained by ultrafiltration (concentration is increased by ) times) a partial fractionation is achieved. Thus,retarding ability of Mygalacturonase is 87-90%. Pectinesterase losses are 10%.

Thus,a technology for liquid pectinesterase preparation production dog membrane filtration methods has been worked out