автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка технологии пищевого пектина на основе использования карбогидраз и лиаз микроорганизмов

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

Варфоломеева Ольга Анатольевна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПИЩЕВОГО ПЕКТИНА НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КАРБОГИДРАЗ И ЛИАЗ МИКРООРГАНИЗМОВ

Специальность 05.18.07 - биотехнология пищевых продуктов (перерабатывающие отрасли АПК)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре «Химия пищи и биотехнология» Московского государственного университета прикладной биотехнологии (МГУПБ).

Научный руководитель: кандидат технических наук, доцент

Румянцева Г.Н.

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Кочеткова А.А.

кандидат технических наук, ст.н.с.

Кроха Н.Г.

Ведущая организация: ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии РАСХН

_ ю

Защита диссертации состоится «/? » О^гт^е/и^ 2005 г. в /У часовня

заседании диссертационного совета Д 212.149.01 при Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, д. 33, Конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ.

Автореферат разослан « 9 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 212.149.01, к.т.н., проф. Забашта АЛ

(2549

Мб £546

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы: Одним из важнейших направлений повышения эффективности современных пищевых производств является создание малоотходных технологий, широкое вовлечение в производство вторичных ресурсов, в том числе пектинсодержащих отходов сокового и сахарного производств (яблочные выжимки, свекловичный жом, цитрусовые альбедо и др.).

Пектин, как природный полисахарид растительного происхождения, обладает гелеобразующими и сорбционными свойствами. В настоящее время в отечественной пищевой промышленности используется пектин зарубежного производства, собственное производство этого ценного полисахарида в нашей стране отсутствует. В связи с этим исследования в области получения пектина приобретают важное практическое значение.

В качестве гидролизующего агента в традиционной технологии пектина применяют неорганические кислоты (серная, соляная). Наиболее современным способом выделения пектина является биотехнологический, основанный на действии ферментов микробного происхождения, имеющий ряд неоспоримых технологических преимуществ:

- увеличивается выход готовой продукции;

- сохраняются природные гелеобразующие свойства пектина;

- отпадает необходимость в кислотоустойчивом оборудовании;

- улучшаются экологические условия производства.

Исследования в области ферментативного катализа, основанные на использовании специфичных ферментов с избирательным действием на субстраты пектинсодержащего сырья, позволит предложить промышленности наиболее эффективные режимы гидролиза и получить высококачественный пектин, отвечающий требованиям пищевых производств.

Диссертация выполнена по научно-технической программе 2-9-03 «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники», научно-техническая программа 204 «Технология живых систем».

Дели и задачи исследования.

Целью диссертационной работы является разработка технологии получения пищевого пектина на основе создания и использования новой композиции ферментных препаратов, содержащей карбогидразы и лиазы микробного происхождения.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи'

-исследовать каталитическую активность ферментных препаратов и специфичность их действия;

-определить основные кинетические параметры ферментативных реакций гидролитического и негидролитического типа;

1НОС. НАЦИОНАЛЫ. \

библиотека 1

-определить опггимальные условия действия ферментов на субстраты сырья;

-изучить продукты гидролиза компонентов пектинсодержащего сырья,

полученные с использованием карбогидраз и лиаз микроорганизмов; -изучить влияние группы индивидуальных ферментных препаратов на выход и качество пектина из различных видов сырья, а также создать на их основе композицию ферментов для интенсификации процесса; -подобрать оптимальные режимы ферментативной обработки сырья; -исследовать возможность ферментативной дсэтерификации нативного

пектина и получить его низкоэтерифицированные формы; -разработать усовершенствованную технологическую схему производства высоко- и низкоэтерифицированных форм пектина биотехнологическим методом; -дать оценку качества желейных продуктов с использованием

экспериментальных образцов пектина в производстве; -разработать экспериментальный регламент на производство пектина с

использованием ферментных препаратов; -апробировать новую технологию в опытно-промышленных и промышленных условиях.

Научная новизна работы состоит в том, что:

- установлена высокая субстратная специфичность для глюканазы Bacillus subtilis, целлюлазы Trichoderma reesei и пектинлиазы Bacillus macerans в отношении субстратов пектинсодержащего сырья;

- подтверждена теория арабано-галактанового комплекса, а также связи пектиновых веществ с другими структурными полисахаридами хроматографическим методом;

- показана роль карбогидраз и лиаз в процессе обработки пектинсодержащего сырья и создана композиция на их основе, позволяющая получить максимальный выхода пектина и сохранить его природные гелеобразующие свойства;

- впервые разработан ферментативный способ получения двух форм пектина: высоко- и низкоэтерифицированного с использованием на стадии обработки сырья карбогидраз и лиаз, а на стадии деэтерификации -пектинэстераз микроорганизмов.

Практическая ценность работы:

установлена возможность замены кислотного гидролиза пектинсодержащего сырья на ферментативный, а также исключение из технологии пектина процесса спиртоосаждения;

- показано, что для сохранения гелеобразующих свойств необходим «ограниченный» ферментативный гидролиз пектинсодержащего сырья и установлена его продолжительность;

- экспериментально обоснованы и предложены оптимальные для выделения пектина режимы ферментативной обработки

пектинсодержащего сырья, а также концентратов пектина в случае получения низкоэтерифицированных его форм;

- разработан экспериментальный регламент на производство пектина с использованием ферментативной обработки сырья на стадиях его выделения и ультрафильтрационной очистки;

- метод апробирован в условиях двух заводов ОАО «Виннифрут» и ООО «Зеленые линии».

Апробация работы. Результаты выполненного исследования были представлены на:

- И Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2003г., Москва);

- Международной научно-практической конференции ГУ ВНИТИ ММС и ППЖ РАСХН» (2003г., Волгоград);

- Научно-практической конференции «Безопасность и качество сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов» (2004г., Углич);

- Научно-практической конференции «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем» (2005г., Калининград).

Публикации. По материалам работы опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и объекты исследования, результаты и их обсуждение, выводы, список источников литературы и патентов, а также приложений.

Работа изложена на ///страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 27 рисунков, библиография включает 153 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Приложения к диссертации представлены на страницах.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы.

В первой главе представлен аналитический обзор научно-технической и патентной литературы в области получения пищевого пектина, приведена классификация растительных источников для его получения.

Отмечено, что наиболее перспективным направлением является биотехнологический способ производства пектина, основанный на действии ферментов микроорганизмов. Проведена сравнительная оценка используемых в настоящее время ферментных препаратов, представлена сфера их использования в пищевой промышленности. В заключение первой главы сформулированы цель и задачи исследования.

Во второй главе «Объекты и методы исследования» приведена схема постановки эксперимента, характеристика объектов исследования и описаны условия и методы определения изучаемых показателей.

Объектами исследования являлись промышленные источники получения пектина: сухие и свежие яблочные выжимки, свекловичный жом. В качестве ферментных препаратов микробного происхождения использовали: пектинлиазы (продуценты Bacillus macerans и Bacillus subtilis), целлюлазы (продуценты Trichoderma viride и Trichoderma reesei), глюканазы (продуцент Bacillus subtilis), комплексный препарат из смешанных культур Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii, эндополигалактуроназу (продуцент Aspergillus (селек. штамм)), пектинэстеразу (продуцент Aspergillus aculeatus). Выражаю благодарность директору НТЦ «Лекбиотех» Бравовой Г.Б. и сотрудникам центра за предоставление ферментных препаратов пектинлиазы и целлюлазы.

Каталитическую активность пектат-трансэлиминазы, целлюлазы, р-глюкозидазы, (З-глюканазы, ксиланазы, протеазы, амилазы, эндо-полигалактуроназы, пектинэстеразы оценивали по стандартным методикам (ГОСТ 20264.3-81, ТУ 11249895-43-13-92). Определение специфичности ферментных препаратов осуществляли, используя в качестве субстратов целлюлозу, глюкан и протопектин.

Для количественного определения пектиновых веществ в сырье использовали метод, основанный на осаждении пектина этиловым спиртом, и кальций-пектаггный метод. Определение полигалактуроновой кислоты вели по окрашиванию галактуроновой кислоты карбозоловым реактивом.

Количественные показатели пектина: массовую долю влаги, степень этерификации, гелеобразующую способность, рН 1%-го раствора, вязкость 1%-го раствора определяли по ГОСТ 29186-91 «Пектин».

В соответствии с целью работы и сформулированными задачами исследование проводили в несколько этапов, представленных на схеме постановки эксперимента.(рис.1.)

На первом этапе провели скрининг отечественных и зарубежных ферментных препаратов, учитывая их каталитическую активность и свойства, включая субстратную специфичность. Проведен анализ различных видов пектинсодержащего сырья по составу и качественным показателям. На втором этапе осуществлено аналитико-экспериментальное моделирование, направленное на выбор и оптимизацию процесса ферментативной обработки сырья для достижения максимального выхода.

На следующем этапе осуществляли процесс ферментативного получения пектина в стендовых условиях с целью наработки экспериментальных образцов и определение их качественных показателей. Выражаю благодарность к т.н., доценту каф. «Мембранные технологии» РХТУ им.Менделеева Свитцову А А. за помощь в работе по очистке и концентрированию пектиновых экстрактов и сушке концентратов пектина.

Провели промышленную апробацию ферментативного способа получения пектина на ОАО «Виннифрут» и ООО «Зеленые линии». Дана характеристика полученных образцов пектиновых концентратов и порошкообразных продуктов.

Рисунок 1 Схема постановки эксперимента

Изучен способ модификации пектина препаратом пектинэстеразы для придания ему заданных свойств, в частности, снижения степени этерификации пектина.

На основании полученных данных предложена принципиальная технологическая схема производства пектина. На заключительном этапе разработан регламент на производство пектина с использованием ферментативной обработки сырья на стадии его выделения.

Изучение каталитических свойств и специфичности действия ферментных препаратов

Анализ 13 ферментных препаратов проводился по 9 основным активностям, присутствие которых необходимо для разрушения протопектина, структурных полисахаридов, а также белков. Полученные экспериментальные данные, представленные в табл.1, свидетельствуют о том, что наибольшую активность целлюлазы имеют зарубежные препараты: целлюлаза L (продуцент Trichoderma reesei) - 7600 ед/мл, целлюлаза W (продуцент Trichoderma reesei) - 2600 ед/мл, а также и отечественный целловиридин Г20Х (продуцент Trichoderma viride) - 2000 ед/r.

Из представленных препаратов с высокой ß-глюканазной активностью обладают ферментные препараты глюканазы Bacillus subtilis всех марок от 748 до 1034 ед/г(мл). В других препаратах она присутствует на примерно одинаковом уровне от 110 до 407 ед/г(мл).

Одной из основных активностей, определяющей выбор ферментного препарата, являлась пектинлиазная. Самой высокой активностью этого фермента обладает отечественный препарат пектинлиазы Bacillus macerans, другие активности в препарате почти отсутствуют. Препарат пектинлиазы из культуры Bacillus subtilis, помимо основного фермента, содержит активную глюканазу, целлюлазу, ксиланазу.

Комплексный препарат, полученный из смешанных бактериальной и грибной культур Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii, обладает целлюлазной, глюканазной, ксиланазной, протеазной и амилазной активностями. Действие указанных ферментов направлено на гидролиз полисахаридов сырья, а также белков, частично связанных с пектином.

Высокой активностью эндополигалактуроназы обладает препарат из культуры Aspergillus (селек. штамм) - 833ед/г. Наличие эндополигалактуроназы в исследуемых продуктах нежелательно, т.к. этот фермент разрушает молекулу пектина до низкомолекулярных соединений, не обладающих потребительскими свойствами, в частности, гелеобразуюшей способностью.

В результате анализа полученных данных, установлено, что наиболее активными и подходящими для ферментативной обработки пектинсодержащего сырья являются препараты глюканазы всех марок, целлюлаза L (продуцент Trichoderma reesei), целлюлаза W (продуцент

Таблица 1 Каталитическая активность ферментных препаратов

Xs п/п Ферментный препарат (продуцент) Активность, ea/r(cMJ)

Пектат-трансэли-миназнах Эндо-полигалак-туроказная Пектин-эстераз-ная Целюло-литичес-кая ß- глкжози-дазная р-глюка-назная Ксила-назная Протео-литичес- кая Амило-литичес-кая

1 Пектинлиаза (Bacillus bubtilis), зарубеж 39848,0 4,1 0 340,0 0 748,0 360,2 0 3,4

2 Глюканаза HS (Bacillus subtilis), зарубеж. 0 4,3 0 680,0 3,5 1034,0 590,0 0 5,0

3 Глюканаза FBH (Bacillus subtilis), зарубеж 0 0 0 510,0 0 891,2 475,1 6.4 4,2

4 Ксиланаза (Bacillus subtilis), отечест. 0 0 0 620,0 16,6 110,0 10000,0 0 0

5 Целловиридин Г20Х (Trichoderma viride), отечест 0 3,8 0 2000,0 12,4 258,5 390 5,0 0

6 Целлюлаза W (Trichoderma reesei), зарубеж. 11401,0 4,8 0 2600,0 5,0 63,8 105,3 0 2,1

7 Целлюлаза L (Trichoderma reesei), зарубеж. 0 4,4 0 7600,0 13,5 114,4 480,3 7,2 0

8 Комплексный препарат (Bacillus subtilis, Pénicillium emersonii), зарубеж. 0 0 0 480,0 1.4 148,5 330,0 72,5 480,0

9 Пектинлиаза (Bacillus macerans), отечест. 446800,1 0 0 540,0 1,8 0 0 0 0

10 Пектинэстераза (Aspergillus aculeatus),зарубеж. 0 13,6 190,5 540,0 0 21,8 0 0 0

11 Эндополнгалактуроназа (Aspergillus (селек)), зарубеж. след 833,3 166,7 6320,0 2,0 167,8 200,1 560,0 520,4

12 Карбогидраза УФ (Bacillus subtilis), зарубеж 10127,1 6,7 2,1 420,0 6,8 335,5 560,0 0 0

13 Карбогидраза ФЗ (Bacillus subtilis), зарубеж. 0 22,2 5,7 480,0 0 407,0 520,4 0 40,0

Trichoderma reesei), комплексный препарат из смешанных культур Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii, а также пектинлиаза из культур Bacillus macerans и Bacillus subtilis.

Далее изучали каталитические параметры ферментативной реакции с использованием выбранных ферментных препаратов. Для обеспечения максимальной скорости ферментативной реакции в соответствии с уравнением Михаэлиса - Ментен необходимо знать оптимальную концентрацию субстратов. Скорость ферментативной реакции определяли по количеству образовавшихся продуктов гидролиза при действии целлюлазы, глюканазы, а также продуктов негидролитического превращения пектиновых веществ при действии пектинлиазы.

Задачей исследований являлось установление зависимости скорости ферментативного гидролиза от концентрации субстрата. Чем ниже значение константы Михаэлиса (Км) и выше значение максимальной скорости реакции (Vmax), тем большее сродство или специфичность действия имеет фермент к субстрату

б I

20 40 60 8(1 100 120 Концентрация субстрата, мг/мл

1 3 5 7 9 II Концентрация субстрата, мг/мл

В

20 40 60 80 100 Концентрация субстрата, мг/мл

•— Пектинлиаза Bacillus

maccrans •— Пекшнлиаза Bacillus subtilis

Рисунок 2 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата: а) целлюлазы Trichoderma reesei; в) глюканазы Bacillus subtilis; с) пектинлиазы Bacillus macerans и Bacillus subtilis.

По результатам проведенных исследований выявлено (рис.2а), что максимальная скорость гидролиза для целлюлолитического фермента Trichoderma reesei имеет значение Vmax = 2,8 мкг/мин, а Км = 38 мг/мл.

Максимальная скорость гидролиза для глюканазы Bacillus subtills имеет значение 17,0 мкг/мин, а Км= 4,4 мг/мл.(рис.2в)

Препарат пектинлиазы Bacillus macerans имеет следующие кинетические параметры: К„ = 27,0 мг/мл и Vraax = 33,2 мкг/мин, а для пектинлиазы Bacillus subtilis: К„ = 42,0 мг/мл и V^ = 19,3 мкг/мин. (рис.2с)

В результате изучения каталитических параметров установлено, что из карбогидраз наибольшей субстратной специфичностью к целлюлозе обладает ферментный препарат из культуры Trichoderma reesei, к глюкану - препарат из культуры Bacillus subtilis, а к протопектину - пектинлиаза из культуры Bacillus macerans.

Оптимальный температурный режим ферментативной обработки пектинсодержащего сырья определен для четырех наиболее активных препаратов и варьировали от 35°С до 70°С с интервалом 5 °С. Полученные зависимости позволяют выбрать оптимум температуры: для пектинлиазы Bacillus macerans равный 45 + 5°С, для целлюлазы Trichoderma reesei - 55 + 5 °С. Исследуемая глюканаза Bacillus subtilis и комплексный препарат из смешанных культур Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii являются термостабильными ферментными препаратами и проявляют оптимальную активность при температуре 60+5 °С.

Принимая во внимание тот факт, что активность ферментов существенно зависит от рН среды, было изучено влияние этого параметра на их каталитическую активность. Определение активности ферментных препаратов проводили в зоне рН от 2,0 до 8,0. В результате исследования показано, что оптимальные значения рН составляют для целлюлазы Trichoderma reesei 4,0 - 5,0, для глюканазы Bacillus subtilis 4,5 - 6,0, протеазы и амилазы Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii 5,0 - 6,0, а для пектинлиазы Bacillus macerans 6,0 — 7,0.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что для обработки пектинсодержащего сырья не требуется дополнительной корректировки естественного значения рН. Для яблочных выжимок этот показатель соответствует 3,9 - 4,5, для свекловичного жома - 4,9 - 5,2, что соответствует оптимальным условиям действия ферментных препаратов таких как: целлюлаза Trichoderma reesei, глюканаза Bacillus subtilis, пектинлиаза Bacillus macerans и Bacillus subtilis, a также комплексный препарат из смешанных культур Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii.

Характеристика сырья

С целью выбора пектинсодержащего сырья была проведена их сравнительная оценка. Различия в физико-химических показателях

объясняется особенностью строения растительной клетки, а также спецификой первоначальной обработки, (табл.2)

Таблица 2 Характеристика пектинсодержащего сырья

№ ii/II Наименование пектинсодержащего сырья Массовая доля влаги, % (ш±1,2) pH (т±0,05) Содержание пектина, % (га±0,1) Степень этерификации, % (т±0,5)

1 Выжимки яблочные свежие 76,4 4,4 3,12 72,5

2 Выжимки яблочные сухие 12,5 4,2 10,5 73,9

3 Свекловичный жом 10,1 5,1 18,23 43,4

В результате анализа установлено, что яблочные выжимки и свекловичный жом значительно отличаются по содержанию пектина и имеют разную степень этерификации. Природный свекловичный пектин является низкоэтерифицированным и низкомолекулярным, что снижает показатель гелеобразования и имеет узкую область применения в пищевой промышленности. В связи с этим, для дальнейших исследований в качестве источника высокоэтерифицированного пищевого пектина целесообразно использовать яблочные выжимки.

Исследовали влияние ферментных препаратов на выход и основные показатели пектина из яблочных выжимок, используемых в сухом измельченном виде с исходным содержанием пектина 10,5% к массе сырья. В качестве контроля использовался кислотный гидролиз того же сырья.(табл.3)

В результате проведенных исследований установлено, что из исследуемых ферментных препаратов наиболее эффективными по действию на нерастворимый пектин являются пектинлиаза Bacillus macerans, по действию на связанные формы пектина, в том числе на> арабано-галактановый комплекс - карбогидразы Trichoderma reesei и Bacillus subtilis.

Наилучший результат на яблочном сырье показа! ферментный препарат пектинлиазы Bacillus macerans - достигается максимальный выход пектина в экстракт 14,63% к массе сырья. Использование индивидуальных ферментных препаратов из культур Trichoderma reesei и Bacillus subtilis позволяет увеличить выход пектина из яблочных выжимок по сравнению с кислотным гидролизом до 12,5% к массе сырья.

Таблица 3 Влияние ферментных препаратов на выход и физические показатели пектина из сухих яблочных

выжимок

Препарат (продуцент) Доза Экстракт А Экстракт В Концентрация пектина в купаже, % (т±0,1) Выход, % к массе сырья (ш±0,1 )

Ед/г сырья Вязкость, мПа-с ' (т±0,2) рн (га±0,05) Вязкость, мПа-с (ш±0,2) рН (т±0,05)

Пектинлиаза (Bacillus subtilis) 3,0 , 4,8 3.38 1,25 3,5 0,5 10,36

Глюканаза HS (Bacillus subtilis) 1,65 J 5,65 3,3 1,4 3,91 0,5 10,49

Ксиланаза (Bacillus subtilis) 16 10,1 3,39 2,3 3,6 0,51 10,61

Целловиридин Г20Х (Trichoderma viride) 3,2 10,5 3,28 2,6 3,5 0,54 11,53

Целлюлаза W (Trichoderma reesei) 10,4 4,3 3,4 1,2 3,5 0,49 10,8

Целлюлаза L (Trichoderma reesei) 30,4 4,5 3,2 1,3 3,5 0,55 12,5

Компл. препарат (Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii) 0,44 4,0 3,0 1,6 3,3 0,5 10,42

Пектинлиаза (Bacillus macerans) 893,6 6 3,5 2 3,59 0,62 14,63

Эндополигалактуроназа (Aspergillus (селек)) 12,64 1,25 2,97 1 3,06 0,31 7,44

Кислотный гидролиз (контроль) - 5,4 2,0 - - 0,55 10,5

Влияние ферментных препаратов на гелеобразующую способность

пектинов

Гелеобразующую способность различных видов пектинов определяли в модельных системах, содержащих стандартное количество сахара, лимонной кислоты и воды.

Отмечено, что использование препаратов глюканазы Bacillus subtilis и комплексного препарата из культур Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii в оптимальном режиме ферментативной обработки сырья позволяет получить пектин с показателем гелеобразующей способности 140°SAG, в то время как препарат целлюлазы Trichoderma reesei при оптимальной температуре гидролиза образует желе с более низкой гелеобразующей способностью - 135°SAG.

Показано, что для достижения максимального выхода и сохранении гелеобразующих свойств пектина продолжительность ферментативной обработки целлюлазой Trichoderma reesei, глюканазой Bacillus subtilis и комплексным препаратом из смешанных культур Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii как отдельно, так и в композиции ферментных препаратов составляет 2,5-3,0 часа.

Установлено, что увеличение продолжительности гидролиза яблочных выжимок с 3 до 5 часов резко снижает показатель гелеобразующей способности готового продукта. Это объясняется тем, что более глубокий гидролиз протопектина приводит к снижению молекулярной массы высвобождаемого пектина и, соответственно, гелеобразующей способности готового продукта.

На основании экспериментальных данных сделан вывод о необходимости использования «ограниченного» времени ферментативной обработки (не более 3 часов).

Изучая влияние различных доз индивидуальных ферментных препаратов карбогидраз из Bacillus subtilis, из смешанных культур Pénicillium emersonii и Bacillus subtilis, а также из культуры Trichoderma reesei на гелеобразующую способность ферментативно выделенного пектина установлены их оптимальные значения - 0,075% к массе сырья для первых двух препаратов и 0,05% к массе сырья для третьего препарата. (рис.3)

Показано, что обработка сырья композицией ферментных препаратов при использовании оптимальных доз позволяет сохранить природную гелеобразующую способность пектина на уровне 150°SAG. Получены образцы желе и джемов, в рецептуру которых введен экспериментальный яблочный пектин, проведена с положительным результатом их дегустационная оценка.

Доза,% к массе сырья Рисунок 3 Влияние дозы ферментного препарата на гелееобразуюшую способность яблочных выжимок

-■— Глюканаза Bacillus subtäis

—А— Комплексный препарат из с менянных культур Bacflus subtäis и PemciDun emersonn -Х- Композиция ферментных препаратов из Trichoderma reesei и Bacillus sdbtäis —Ф— Целлолаэа Trichoderma reesei

Влияние основных параметров ферментативной обработки пектинсодержащего сырья

Так как основными факторами, влияющими на выход и качество пектина, являются температура, pH, продолжительность, гидромодуль (соотношение сырьё: вода) и доза ферментного препарата на следующем этапе провели оптимизацию этих параметров ферментативной обработки сырья.

Для проведения сравнительных исследований действия различных ферментных препаратов на сырьё, а также свойств пектиновых веществ, выделенных из различных растительных источников, нами разработан лабораторный метод их получения из сырья путем ферментативной обработки препаратами карбогидразного и лиазного действия, затем выделения пектина из раствора спиртоосаждением или ультрафильтрацией, и далее высушиванием и определением его массы.

Вода необходима для модификации сырья и является средой для протекания биокаталитических реакций и физико-химических процессов. Показано, что показатель гидромодуля ниже 1:12 не обеспечивает достаточно полной экстракции пектина. Оптимальным значением гидромодуля является 1:12- 1:14.

Используя лабораторную методику выделения пектина, проведено сравнительное исследование действия доз ферментных препаратов, полученных из культур Trichoderma reesei (целлюлаза), Bacillus subtilis (глюканаза), комплексного препарата из смешанных культур Bacillus

subtiüs и Pénicillium emersonii (протеаза, амилаза), a также из Bacillus macerans (пекгинлиаза) на выход пектина из сырья.(рис.4)

О,! 0,2 0,3

Доза препарата, % к массе сырья Рисунок 4 Влияние дозы ферментного препарата на выход пектина из сухих яблочных выжимок

0,4

—Целлюлаэа Trichoderma reesei -*— Глюканаза Bacflus subtile

-А— Комплексный препарат из смененных культурВасйв sublilis и Pénicillium emersonii -Х- Пекгинлиаза Васйв raacerans

На основании полученных данных выбрана оптимальная доза для наиболее эффективных ферментных препаратов разной направленности действия на сухое яблочное сырьё:

- для глгоканазы Bacillus subtilis - 0,1% к массе сырья (1,0 единиц глюканазы на фамм сырья);

- для целлюлазы Trichoderma reesei - 0,1% к массе сырья (7,6 единиц целлюлазы на грамм сырья);

- для комплексного препарата из смешанных культур Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii - 0,1 % к массе сырья (0,07 единиц протеазы на грамм сырья);

- для пектинлиазы Bacillus macerans - 0,25 % к массе сырья (893,6 единиц пектинлиазы на грамм сырья).

На следующем этапе исследований изучена динамика накопления пектиновых веществ в процессе гидролиза - экстрагирования яблочных выжимок в диапазоне от 1 до 4,5 часов с использованием ферментных препаратов в оптимальных дозировках.(рис.5)

2 ï

s

ffi 0

0,5

1,5

2 2,5 3 3,5 4 Продолжительность, час Рисунок 5 Влияние продолжительности действия ферментных препаратов на содержание яблочного пекгана в экстракте

—♦— Глюканаза Bacillus subtihs

Комплексный препарат из смешанных культур Bacillus subtile и Penicüüum emersonii —Лг- Энаополигалактуроваза Aspergillus (селек.) -*— Псктиюгааза Bacillus macerans -Ж— Целлюлаза Tnchoderma reesei

4,5

Установлено, что в течение 4,0 часов происходит интенсивный гидролиз пектинов и экстрагирование их в водный раствор. Причем первые 3 часа нарастание содержания пектина в экстракте идет прямопропорционально продолжительности гидролиза. Некоторое увеличение пектина в период отстаивания экстракта (от 3,5 до 4 часов) свидетельствует о диффузионном процессе, т.е. переходе гидролизованного пектина из твердой фазы в жидкую.

Используя данную методику, было проведено сравнительное исследование действия с целью определения оптимальной продолжительности гидролиза для достижения максимального выхода пектина.

Из пяти исследуемых ферментных препаратов четыре, а именно карбогидразы, полученных из культур Trichoderma reesei, Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii, дают выход пектина более 10%. Исключением является препарат эндополигалактуроназы из культуры Aspergillus (селек.) (выход пектина не более 7% к массе сырья), что связано с разрушением полигалактуроновой кислоты внутри цепи.

Для прекращения действия ферментов и их инактивации по окончании процесса гидролиза, который длится не более 3 часов, необходима высокотемпературная обработка пектинсодержащего

продукта. Показана эффективность инактивации при 80°С: причем достаточной является продолжительность процесса - 15 минут. Инактивация ферментов при 90°С приводит к значительному снижению гелеобразующей способности пектина: до 102° и 82°SAG при использовании соответственно 15 минутной и 30 минутной обработки.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлены основные режимы ферментативной обработки пектинсодержащего сырья:

-температура 45 - 70°С в зависимости от оптимума температуры

используемых ферментных препаратов; -pH естественный для смеси сырья с водой: для яблочных выжимок 3,9 - 4,5 (указанные значения совпадают с оптимальными условиями действия ферментных препаратов); -гидромодуль 1:12-1:14;

-доза ферментных препаратов: для обработки яблочных выжимок

составляет 0,075-0,15% к массе сырья; -продолжительность 2,5-3,0 часа;

-инактивация ферментных препаратов проводится при температуре

80°С в течение 15 мин. Необходимо отметить, что при оптимальных режимах действия ферментов достигается максимальный выход пектина из яблочных выжимок на уровне 14,63% к массе сырья. Однако дозы ферментных препаратов несколько выше тех, что необходимы для сохранения гелеобразующих свойств пектина. Исходя из этого, считали целесообразным создать композицию ферментных препаратов различной направленности действия, в которой за счет суммарного действия будет снижение дозы каждого из входящих в композицию ферментных препаратов.

Создание композиции ферментных препаратов пектинлиазы и карбогидразы для оптимизации процесса гидролиза

Ферментные препараты карбогидразного и лиазного действия, которые используются в данной работе, имеют разный механизм действия на растительные субстраты. К карбогидразам относятся ферментные препараты, которые принадлежат к классу гидролаз и катализирует гидролиз растительных полисахаридов, а пектинлиазы обладают способностью непосредственно воздействовать на

высокоэтерифицированный пектин без предварительной деэтерификации.

В результате проведённых исследований показано, что из всех исследуемых ферментативных препаратов наиболее эффективным для производства пектина является пектинлиаза Bacillus macerans, целлюлаза Trichoderma reesei и глюканаза Bacillus subtilis. Исследовали две композиции ферментных препаратов, совместное действие которых приводит к максимальному выходу пектина. Первая состояла из

пектинлиазы Bacillus macerans и комплексного препарата из смешанных культур Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii, а вторая из пектинлиазы Bacillus macerans и глюканазы Bacillus subtilis.

На основе полученных ранее данных подобран температурный режим обработки пектинсодержащего сырья: начальная температура 40 -45 °С (действие пектинлиаз) в течение 1 часа с последующим нагреванием смеси сырья с водой до 60 °С в течение 0,5 часа и продолжением процесса гидролиза при данной температуре (действие термостабильных карбогидраз) в течение 1,5 часов.

Наилучший результат дает использование композиции ферментов, состоящий из комплексного препарата карбогидраз (продуценты Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii), пектинлиазы (продуценты Bacillus macerans и Bacillus subtilis), a также целлюлазы (продуцент Trichoderma reesei) в оптимальных дозах.

Установлено, что совместное действие исследуемых композиций ферментов позволяет разрушать не только межклеточные растительные полисахариды (протопектин), но и полисахариды клеточной стенки плодовой ткани. При этом значительно увеличивается выход пектина на 40,1%.

Применение композиции ферментных препаратов дает возможность уменьшить содержание каждого компонента в системе, что важно, учитывая ограничения в дозах, связанные с сохранением гелеобразующих свойств пектина.

На основании экспериментальных данных, скорректирована доза каждого фермента, входящего в состав композиции:

- для глюканазы Bacillus subtilis - 0,075% к массе сырья (0,78 единиц глюканазы на грамм сырья);

- для целлюлазы Trichoderma reesei - 0,05% к массе сырья (3,8 единиц целлюлазы на грамм сырья);

- для комплексного препарата из смешанных культур Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii - 0,075 % к массе сырья (0,05 единиц протеазы на грамм сырья);

- для пектинлиазы Bacillus macerans и Bacillus subtilis - 0,1 % к массе сырья (446,8 единиц пектинлиазы на грамм сырья).

Изучение продуктов ферментативного гидролиза при использовании композиции ферментных препаратов

Хроматографическим методом анализировались образцы пектинопродуктов, полученные с использованием оптимальной композиции ферментных препаратов. Первый образец - пектиновый концентрат получен в заводских условиях с использованием вакуум-выпаривания экстрактов. Второй образец - сухой препарат пектина получен методом ультрафильтрации экстрактов пектина с последующей сушкой в псевдокипящем слое.

В яблочном пектиновом концентрате (образец 1) обнаружена глюкоза, мальтоза и ксилоза, которые являются продуктами гидролиза целлюлозы, крахмала и гемицеллюлоз. Такие углеводы являются промежуточными продуктами гидролиза растительного сырья и свидетельствует о наличие связанных форм пектина с полисахаридами: целлюлозой и гемицеллюлозой. Накопление арабинозы, галактозы подтверждает теорию арабано-галактанового комплекса.(рис.6) 146.2

мВ

-6.96

—н--

^ 3

А

Рисунок 6 Хроматограмма яблочного пектинового концентрата (образец 1): 1- целлюлоза, 2-мальтоза, 3-галактоза, 4-арабиноза, 5-ксилоза, 6-

глюкоза.

Хроматофамма второго образца, полученного после ультрафильтрационной очистки экстрактов пектина содержит практически только галактозу.(рис.7) На этом основании сделан вывод о том, что используемый метод ультрафильтрации позволяет получить практически чистый продукт.

12.52

мВ

-10.7

Рисунок 7 Хроматограмма сухого яблочного пектинового препарата (образец 2): 1- галактоза

Получение препаратов низкоэтерифицированного пектина

Ферментативный способ деэтерификации пектинов в настоящее время мало изучен и не используется в промышленности. Получают низкоэтерифицированный пектин действием химических реагентов, в основном, щелочей Поэтому считали целесообразным заменить химические реагенты на ферменты и разработать биотехнологический способ деэтерификации пектина, основанный на действии фермента -пектинэстеразы.

В работе использовали ферментный препарат из культуры микроорганизма Aspergillus aculeutus. Условия ферментативной обработки подобраны в соответствии с оптимумом действия препарата: температура 40°С, рН - естественная для 1%-ной суспензии пектина 3,2-3,6. Дозу ферментного препарата подбирали в соответствии с активностью пектинэстеразы и выражали в ед/г пектина.(рис.8)

. .. _

- - — -

-1---- -1 т

О 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

Продолжительность, ч Рисунок 8 Динамика процесса ферментативного гидролиза 1%-го раствора пектина

—40 ед/г пектина —■— 20 ед/i пектина 10 ед/г пектина -М- 5 едД пектина

В результате проведенных исследований показана целесообразность получения энзиматически деэтерифицированного пектина с использованием пектинэстеразы Aspergillus aculeutus, что позволяет расширить область его применения в производстве желейных кондитерских изделий с низким содержанием сухих веществ, в т.ч. сахара или в присутствии кальция.

Данный способ обработки позволяет снизить степенью этерификации до необходимого значения (20-50%), варьируя продолжительность процесса от 0,5 до 1 часа. Установлена минимальная концентрация пектинэстеразы, достаточная для проведения ферментативной реакции - 5 ед/г препарата. Процесс целесообразно проводить на стадии концентрирования пектинового экстракта.

Характеристика пектиновых препаратов, полученных в стендовых и заводских условиях

Метод получения пектина в стендовых условиях разработан совместно с Российским химико-технологическим университетом им. Д.И. Менделеева.

Предварительная очистка пектиновых экстрактов осуществлялась с использованием намывной фильтрации с предварительным образованием фильтрующего слоя из инертного материала (кизельгур).

Для стадии ультрафильтрации подобраны мембраны - УАМ - 100, позволяющая сконцентрировать растворы пектина в 5-10 раз, без ввода тепла в раствор, а также разделить вещества по молекулярной массе.

При высушивании пектинового концентрата учитывали чувствительность пектина к высоким температурам, вследствие которой теряется гелеобразуюшая способность препарата. Наиболее приемлемым для данного продукта является способ сушки в кипящем слое на инертных носителях. В ходе исследований выбран оптимальный режим сушки: температура на входе - 100°С, на выходе 70°С. (рекомендации РХТУ им. Менделеева)

Полученный образец представляет собой высокоочищенный препарат с содержанием полигалактуроновой кислоты 80%, свободный от сопутствующих фрагментов полисахаридов и белков, а также низкомолекулярных балластных примесей, в том числе органических, минеральных кислот, moho-, дисахаридов и пигментов .(табл. 4)

Разработанный процесс биокатализа для получения пектина апробирован в промышленных условиях заводов ОАО «Виннифрут» и ООО «Зеленые линии».

В условиях завода ОАО «Виннифрут» получены три промышленных образца концентрата яблочного пектина в количестве 5 тонн. Содержание СВ в продукте на уровне 8%, пектиновых веществ 4,4 - 4,75%. (табл.5)

Отмечено преимущество полученных образцов по сравнению с пектиновыми концентратами, вырабатываемыми заводом с использованием кислотного гидролиза. Оно выражалось в выходе готового продукта (увеличение в среднем на 43,7%) и улучшении таких качественных показателей как рН (до 3,8-4,4), гелеобразующая способность (до 150°SAG), содержание гапактуроновой кислоты (до 81%) и соответственно чистота продукта. Степень этерификации пектина, полученного и тем и другим методом, находилась на уровне 79-80%, что позволяет получить пектин со степенью этерификации, применительно к требованиям пищевых производств.

На основании полученных данных разработана технологическая схема, включающая основные стадии производства пектина.(рис.9) От традиционной схемы она отличается заменой кислотного гидролиза на ферментативный с использованием композиции ферментных препаратов, а также исключением стадии спиртового осаждения и замену ее на стадию выделения и очистки пектина методом ультрафильтрации.

Полученные данные легли в основу разработанного экспериментального регламента на производство яблочного пектина.

Таблица 4 Качественные показатели яблочного пектинового концентрата и сухих образцов пектина _____(промышленные образцы)__

№ Наименование продукта Сухие вещества, % (га±0,1) Содержание пектина, % (ш±0,1) Степень этерифи-кацки, % (т±0,4) Массовая доля влаги,% (т±1,2) рН 1%-го раствора (ш±0,05) Вязкость 1%-го раствора, мПа-с (т±0,2) Содержание галактуроновой кислоты,% (ш±0,3) Гелеобразующая способность, "SAG (m±0,2)

1 Яблочный пектиновый концентрат 6,7 4,75 67,1 92,9 4,1 6,5 81,3 149

2 Яблочный пектиновый концентрат 7,1 4,4 73,99 91,9 3,9 9,3 80,5 144,6

3 Сухой образец ! - 1 68,1 7,8 4,2 7,9 81.1 147,2

4 Сухой образец 1 - 1 67,9 7,5 4,23 8,4 30,2 147,9

Таблица 5 Качественные показатели экстрактов и концентратов пектина по стадиям производства

№ п/п Показатели качества и единицы измерения Стадия получения экстракта

Гидролиз, 3 часа После инактивации ферментов Т = 80°С, 30 минут Посте декантера После намывного фильтра Концентрат пектина

1 (кислотный) рН (т*0,05) 2,0 1,9 1,8 1.8 2,7

СВ, % (т±0,1) 2,2 - 2,0 1,7 12,4

Вязкость, усл.ед (ш±0,2) 2,1 - 8,5 8,4 Не определяется

СС,°8АО (т±0,2) - - - - -

Пектин, % (т±0,1) 0,18 - 0,6 0,53 4,3

2 (ферментативный) рН (т±0,05) 3,98 3,86 3,7 3.7 4,4

СВ, % (т±0,1) 1,0 1,6 1,3 1,1 6,7

Вязкость, усл.ед (т±0,2) 1,3 9,1 8,7 8,6 Не определяется

СС/БАО (т±0,2) - - - - 145

Пектин, % (т±0,1) 0,4 - 0,95 0,8 4.75

Раствор вносимой композиции ферментных препаратов'

- глкжаназа Bacillus subtilis 0,075% к массе сырья (0,78 ел/г сырья);

- целлюлаза Trichodemia reesci 0,05% к массе сырья (3,8 ед/г сырья); -комплексный препарат из сметанных культур Bacillus subtilis и Penicfflium emersonii 0,075 % к массе сырья (0,05 сд/г сырья);

- пектинлиазы Bacillus macerans и Bacillus subtilis 0,1 % к массе сырья (446,8 ед/г сырья).

Промывание и набухание выжимок в водопроводной водойТ = 20+2°С, гидромодуль 1:34,15 минут перемешивая, 15 минут в покое. Продолжительность процесса 30 мин

Гидролиз яблочных выжимок при гидромодуле 1 • 12, периодическом перемешивании, 1 час Т=50°С, 2 часа при Т=60-65°С (получение экстракта А). Продолжительность процесса 3 часа

Повтори« экстрагирование (получение экстракта В) Выжимки выдерживают в воде при Т=70°С, гидромодуль 1:10, ЗОмшут перемешивая, 30 минут в покое Продолжительность процесса 1 час.

Объединение экстрактов А и В в сборочной емкости

Раствор

пекпшэо

теразы

Aspergillus

aculeutus -

5 ел/г

пектина

Деэтерифи-

кация ферментным препаратом до степени этерификаци и 20-50%

Улмрафильтрация очищенного экстракта Р=3±0,5 кгс/W, степень концентрирования -4-5 раз

Сушка пектинового концентрата в виброкипящем слое, температура на входе

1ПОТ ия ш.г<ппр ТОТ

Стандартизация высоко- и низкоэтерифи-цировагогаго пектинового препарата

Контроль качества

Фасовка, упаковка, маркировка

Рисунок 9 Принципиальная технологическая схема производства пектина с различной степенью этерификации

ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В результате изучения каталитической активности группы ферментных препаратов выявлено три группы наиболее активных из них по действию на субстраты пектинсодержащего сырья: пектинлиазы Bacillus macerans и Bacillus subtilis, целлюлаза Trichoderma reesei и глюканазы Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii.

2. Установлен уровень специфичности карбогидраз и пектинлиаз микроорганизмов в отношении субстратов пектинсодержащего сырья. Наибольшее сродство фермента к субстрату отмечено у глюканазы Bacillus subtilis (Ku = 4,4 мг/мл).

3. Оптимальные условия действия основных ферментов на субстраты растительного сырья: для целлюлазы Trichoderma reesei t = 55±5°С и рН 4,0 - 5,0, для глюканазы Bacillus subtilis t = 60±5°С и рН 4,5 -6,0, для протеазы и амилазы препарата из Bacillus subtilis и Pénicillium emersonii t = 60±5°C и рН 5,0 - 6,0, a для пектинлиазы Bacillus macerans t = 45±5°C и рН 6,0 - 7,0.

4. Применение индивидуальных ферментных препаратов позволяет повысить выход пектина по сравнению с кислотным гидролизом с 10,5% до 12,5% к массе сырья для яблочных выжимок.

5. Созданная композиция ферментных препаратов, позволяет повысить выход пектина из яблочных выжимок на 40,1 % к массе сырья.

6. Оптимальными параметрами ферментативной обработки пектинсодержащего сырья являются: рН - естественное, t = 45 - 70°С, гидромодуль 1:12 — 1:14, продолжительность - 3 часа

7. Результаты хроматографического анализа продуктов гидролиза подтверждают теорию арабано-галактанового комплекса, а также связь пектина с другими полисахаридами сырья.

8. Показана возможность осуществления ферментативной деэтерификации высокоэтерифицированного пектина препаратом пектинэстеразы из культуры Aspergillus aculeutus для получения заданной степени этерификации.

9. Установлена целесообразность использования экспериментального пектина в составе желейных продуктов.

10. Разработана и предложена промышленности технологическая схема получения высоко- и низкоэтерифицированного пектина с использованием композиции ферментных препаратов микробного происхождения.

11. Разработан экспериментальный регламент на производство яблочного пектина с применением нового биотехнологического способа. Технология прошла испытания в стендовых условиях РХТУ им. Менделеева и на двух промышленных предприятиях ОАО «Виннифрут» и ООО «Зеленые линии».

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Румянцева Г.Н., Варфоломеева O.A. Сравнительное действие различных ферментных препаратов при получении яблочного пектина // Материалы «Международной научно-практической конференции ГУ ВНИТИ ММС и ППЖ РАСХН». - Волгоград - 2003. - С. 35-36.

2. Горячий Н.В., Свитцов A.A., Марданян М.М., Румянцева Г.Н., Варфоломеева O.A. О природе загрязнений мембран в процессе концентрирования пектиновых экстрактов // Мембраны, серия: критические технологии,- М.- 2003,- № 2 - С. 40-44.

3. Румянцева Г.Н., Варфоломеева O.A. Биотехнологический метод получения пищевых добавок на основе полисахаридов // Материалы II Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития»М,- 2003 - С. 125.

4. Румянцева Г.Н., Варфоломеева O.A. Технологические режимы биокатализа в процессе выделения пищевого пектина // Хранение и переработка сельхозсырья.- М. - 2004.- № 4 - С. 30 - 33.

5. Румянцева Г.Н., Варфоломеева O.A. Влияние карбогидраз и лиаз микробного происхождения на субстраты пектинсодержащего сырья // Хранение и переработка сельхозсырья,- М. - 2004. - № 8 - С. 30 - 32.

6. Варфоломеева O.A., Румянцева Г.Н. Пектинсодержашее сырьё: перспективы использования в пищевой промышленности и медицине // Материалы научно-практической конференции «Безопасность и качество сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов».-Углич - 2004 - С.59-63.

7. Горячий Н.В., Свитцов A.A., Румянцева Г.Н., Варфоломеева O.A., Кулифеев Д.Б., Минкин М.Л. Безкислотно-бесспиртовая технология производства пектина // Материалы II съезда общества биотехнологов России. - М .- 2004. - С.90-91.

8. Варфоломеева O.A., Румянцева Г.Н. Совершенствование технологии переработки пектинсодержащего сырья и перспектива его использования //Материалы конференции, посвященных 100-летию со дня рождения проф Лепилкина А.Н..- М. - 2004. - С. 67-69.

9. Румянцева Г.Н., Жаринов А.И., Варфоломеева O.A. Методы выделения пектина из яблочных выжимок с использованием микробных ферментных препаратов, определение их каталитической активности : методические указания к лабораторно-практическим работам для студентов специальностей 240902 и 240901.- М.: МГУПБ, 2005,- 31 с.

10. Варфоломеева O.A. Исследование взаимодействия низкоэтерифицированного пектина и кальция и изучение свойств полученных гелей. // Материалы научно-практической конференции «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем».- Калининград,- 2005.- С. 68.

Подписано в печать 05 09 2005 Фсрчат 60x84 1/16

Печать лазерная Уся неч л 1,75

Заказ 8/51 Тираж 100 лп.

МГУПБ 109316, Москва, ул. Талалихина,33.

ООО «Полисувенир» 109316, Москва, ул Талалихина,33

•15652

РНБ Русский фонд

2006-4 12349

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЙ И ПАТЕНТНОЙ

ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика пектинсодержащего сырья.

1.1.1 .Пектиновые вещества растений.

1.1.2. Другие полисахариды растительного сырья и их связь с пектином.

1.1.3. Классификация и свойства пектинсодержащего сырья.

1.2. Традиционная технология пектина и основные стадии его получения.

1.3. Ферментативный гидролиз растительных полисахаридов.

1.3.1. Общая характеристика процессов ферментативного гидролиза.

1.3.2. Получение пектина с помощью ферментных препаратов.26t

1.3.3. Негидролитические ферментативные реакции.

1.4. Свойства пектиновых веществ.

1.5. Характеристика различных форм пектиновых препаратов.

1.6. Использование ферментных препаратов и применение пектина в пищевой промышленности.36'

Одним из важнейших направлений повышения эффективности современных пищевых производств является создание малоотходных технологий, более широкое вовлечение в производство переработку вторичных ресурсов, в том числе пектинсодержащих отходов сокового и сахарного производств.

Пектин как природный полисахарид растительного происхождения, обладает желирующими, гелеобразующими и сорбционными свойствами и благодаря этому широко используются в пищевой промышленности.[93]

К сожалению, в настоящее время в отечественной промышленности используется пектин зарубежного производства, собственное производство этого ценного полисахарида в нашей стране отсутствует. В связи с этим, исследования в области получения пектина приобретают важное практическое значение.

Как известно, до настоящего времени, промышленными источниками пектина остаются цитрусовые, яблочные выжимки, свекловичный жом и др. Для получения пищевого высокоэтерифицированного пектина из используемого сырья наиболее приемлемым являются яблочные выжимки -отходы сокового производства.

Наиболее современным и экологически чистым является биотехнологический способ, основанный на действии ферментов микробного происхождения, используемых в качестве гидролизующих агентов. Ферментативный гидролиз имеет ряд неоспоримых технологических преимуществ, главное из которых увеличение выхода пектина при сохранении его студнеобразующих свойств.

Такие исследования позволят предложить промышленности эффективные ферментные препараты микробного происхождения и режимы их использования в технологии получения пектина, в том числе его модифицированных форм.

ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В результате изучения каталитической активности группы ферментных препаратов выявлено три группы наиболее активных из них по действию на субстраты пектинсодержащего сырья: пектинлиазы Bacillus macerans и Bacillus subtilis, целлюлаза Trichoderma reesei и глюканазы Bacillus subtilis и Penicillium emersonii.

2. Установлен уровень специфичности карбогидраз и пектинлиаз микроорганизмов в отношении субстратов пектинсодержащего сырья. Наибольшее сродство фермента к субстрату отмечено у глюканазы Bacillus subtilis (Км = 4,4 мг/мл).

3. Оптимальные условия действия основных ферментов на субстраты растительного сырья: для целлюлазы Trichoderma reesei t = 55±5°С и рН 4,0 -5,0, для глюканазы Bacillus subtilis t = 60±5°С и рН 4,5 - 6,0, для протеазы и амилазы препарата из Bacillus subtilis и Penicillium emersonii t = 60±5°C и рН 5,0 - 6,0, а для пектинлиазы Bacillus macerans t = 45±5°C и рН 6,0 - 7,0.

4. Применение индивидуальных ферментных препаратов позволяет повысить выход пектина по сравнению с кислотным гидролизом с 10,5% до 12,5% к массе сырья для яблочных выжимок.

5. Созданная композиция ферментных препаратов, позволяет повысить выход пектина из яблочных выжимок на 40,1% к массе сырья.

6. Оптимальными параметрами ферментативной обработки пектинсодержащего сырья являются: рН - естественное, t = 45 - 70°С, гидромодуль 1:12-1:14, продолжительность - 3 часа

7. Результаты хроматографического анализа продуктов гидролиза подтверждают теорию арабано-галактанового комплекса, а также связь пектина с другими полисахаридами сырья.

8. Показана возможность осуществления ферментативной деэтерификации высокоэтерифицированного пектина препаратом пектинэстеразы из культуры Aspergillus aculeutus для получения заданной степени этерификации.

9. Установлена целесообразность использования экспериментального пектина в составе желейных продуктов.

10. Разработана и предложена промышленности технологическая схема получения высоко- и низкоэтерифицированного пектина с использованием композиции ферментных препаратов микробного происхождения.

11. Разработан экспериментальный регламент на производство яблочного пектина с применением нового биотехнологического способа. Технология прошла испытания в стендовых условиях РХТУ им. Менделеева и на двух промышленных предприятиях ОАО «Виннифрут» и ООО «Зеленые линии».

1. А.с. 840043 СССР МКИ3 С 08 В 37/6.Способ получения пектина / М.П. Филлипов, Г.А. Школенко, Р.Е. Дорма ; Институт химии АН Молдовы.-№2779633/23-05; Заявл. 14.06.79, 0публ.23.06.81, Бюл.№23.

2. А.с. 1184514 СССР МКИ3 С08 В 37/06. Способ получения пектина из яблок / Т.Н.Архипова, З.Д. Ашубаева; Институт ОХ АН Кирг. ССР.- №3996088/3113; Заявл. 10.11.83; Опубл. 12.07.85, Бюл.№38

3. А.с. 1340718 СССР МКИ2 С 08 В 37/06. Способ производства порошкообразного яблочного пектина/ А.Б. Зубченко, С.М. Агаев, А.Я. Олейникова; Краснод. НИИПП.- №2461062/28-13; Заявл. 10.07.85; Опубл. 12.04.87, Бюл. №20.

4. А.с. 1599303 СССР МКИ2 А 23 1/04 //С 08 В 37/06. Способ получения яблочного пектина / В.А.Погребная, М.К. Полтуньянц, О.А. Улиткин. Краснодарский НИИПП. 4152466/30 - 13; Заявл. 26.10.86; Опубл. 16.02.88, Бил.№20.

5. А.с. 467732 СССР МКИ А 23 1/04. Способ получения пектина / Ф.Г. Нахметов, М.Л.Фрумкин, К.А. Калунянц, Р.П. Гребешкова, ВНИИКОП.-№1960386/28-13; 3аявл.06.09.73; Опубл. 25.04.75, Бюл. №15.

6. А.С. № 577212. Способ получения яблочного пектина из яблочных выжимок / Погребная B.JL, Алтуньян М.К., 1989 г.

7. Алтуньян М.К. Кинетика деструкции полисахаридов в процессе получения пектина//Авторефер. дисс.канд. техн. наук.- Краснодар, 1988.-156 с.

8. Андреев В.В., Науменко И.В., Паршакова Л.П. Способы получения и применения различных типов яблочного пектина // Консервная, овощесушильная и пищеконцентратная промышленность. М., ЦНИИТЭИпищепром, 1981, вып. 16. - 13 с.

9. Андреев В.В., Паршакова Л.П., Демченко Л.А. Влияние условий гидролиза свекловичного жома на выход и качество пектина. В кн.: Качество консервной продукции и методы его определения.- Кишинев.-1989.- с.77-81.

10. Ю.Артемова Е.Н. Формирование пенных структур пищевых продуктов, содержащих белки и пектины // Известия вузов. Пищевая технология.- 2001 .№4.- с. 20-22.

11. П.Ашубаева З.Д. Химические реакции пектиновых веществ.- Фрунзе: Илим, 1984,- 186 с.

12. Барашкина Е.В., Тамова М.Ю., Боровская JI.B. Исследование студней на основе каррагинана и пектина методом дифференциальной сканирующей калориметрии // Пищевая технология.- 2003,- №4,- с. 85-86.

13. Березин И.В. Исследования в области ферментативного катализа и инженерной энзимологии.- М.: Наука, 1990.- 384 с.

14. Биотехнология: сборник обзоров. Т.19 Ферменты микроорганизмов. 4.1 Ферменты, катализирующие расщепление полисахаридов / Под. Ред. Безбородова А.М.-М., 1986.-196с.

15. Биохимия растительного сырья / под ред. В.Г. Щербакова М.: Колос, 1999.-376с.

16. Богданов Е.С., Дегтярев JI.C. Купчик М.П. Пектины. Строение мономерных звеньев и механизмы их поликонденсации.// Пищевые ингредиенты. Сырьё и добавки,- 1999.- №2.- с.42-43.

17. Бондарь С.Н., Голубев В.Н. Экстрагирование свекловичного пектина // Пищевая промышленность, 1992, №12, С.18-19.

18. Бравова Г.Б., Самойлова М.В. Мацерирующие ферменты.- М: ОНТЭИмикробиопром, 1982.-c.9-l 2.

19. Брык М.Т., Голубев В.Н., Чагаровская А.П. Мембранная технология в пищевой промышленности. К.: Урожай.- 1991.-220с.

20. Бузина Г.В., Кибрик Э.Д., Паршененко В.В. Производство свекловичного пектина // Обзорная информация. Кондитерская промышленность. ЦНИИ-ТЭИПищепром, 1984, вып.3.-32с.

21. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В., Биотехнология: кинетические основы микробиологических процессов. М.: Высшая школа.- 1990.- 296 с.

22. Влияние температуры на экстрагирование пектина / Л.В. Донченко, В.В. Нелина, Н.С. Карпович и др. // Пищевая промышленность, 1988, №6.-с.31.

23. Голубев В.Н., Беглов С.Ю., Поджуев А.В. Функциональные свойства пектинов и крахмала // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки.- 2000,-№1.-с.14-18.

24. Голубев В.Н., Бондарь С.Н. Мембранная обработка экстрактов пектина // Пищевая промышленность , 1994. №1, с.27-28.

25. Голубев В.Н., Губанов С.Н. Безотходная технология при переработке растительного сырья // Пищевая промышленность.-1989.-№11.-С. 19-20.

26. Голубев В.Н., Кушелаков Х.М. Разработка технологии концентрированных экстрактов из природного растительного сырья. // Сб. «Экоресурсосберегающие технологии переработки сельскохозяйственного сырья», Москва-Астрахань, 1993, с.58-64.

27. Голубев В.Н., Михайлов Г.В., Волкова И.В. Управление коллоидно-химическими свойствами пектина в ходе технологического процесса // Пищевая промышленность.- 1997.- №8 с.12-15.

28. Голубев В.Н., Михайлов Г.В. Управление коллоидно-химическими свойствами свекловичного пектина // Хранение и переработка сельхоз сырья,1993,№3, С. 22-24.

29. Голубев В.Н., Шелухина Н.П. Пектин: химия, технология, применение. -Москва, 1995,-387с.

30. Гольдберг Я.М., Фан-Янг А.Ф. Использование отходов в консервной промышленности. М.:Пищ.пром-ть, 1971.-с.59-62

31. ГОСТ 29186-91. Пектин. Технические условия.

32. ГОСТ 51806-2001. Пектин. Термины и определения.

33. ГОСТ 20264.3-81. Препараты ферментные. Методы испытаний.

34. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов.- М.: Элевар, 2000.-512с.

35. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов.- М.:Агропромиздат.-2000.-92с.

36. Гребешкова Р.Н., Виноградова Г.Л., Гнатенко А.Г. Эффективность ферментативного гидролиза в технологии получения пектина // Хранение и переработка сельхозсырья.- 1996.- №1.

37. Гребешкова Р.Н. Способы стабилизации ферментных препаратов // Прикладная биохимия и микробиология.-1994.-№2.-С. 196-203.

38. Грысс 3. Использование отходов плодовоовощной и консервной промышленности.- М.: Пищ.пр-ть, 1974.- 278с.

39. Гудвин Т., Мерсер Э., Введение в биохимию растений. В 2-х томах // Пер. под. ред. В.Д. Кретовича.-М.: Мир, 1986.

40. Дегтярёв Л.С., Купчик М.П., Донченко Л.В., Богданова О.В. Свойства и строение галактуроновой кислоты в технологии производства пектинов // Известия вузов. Пищевая технология.- 2002.- №4.- с.15-18.

41. Донченко Л.В., Калайциди Л.Ю. Физико-химические свойства пектинов из различных видов растительного сырья // V Международный симпозиум «Экология человека: пищевые технологии и продукты на пороге XXI века».-Москва-Пятигорск: Биоинформсервис, 1997.

42. Донченко Л.В., Сычева Т.М., Ильина И.Л., Бакирь Я.Д. Режим гидролиза яблочных выжимок и свойства пектина // Пищ. Пром-ть.-1989.-№9.- с.26-27.

43. Донченко Л.В. Технология пектина и пектинопродуктов / Учебное пособие М.: ДеЛи, 2000,- 255с.

44. Дорофеева Л.С. , Сапожникова Е.В., Киселева Р.В. Накопление и локализация пектиновых веществ в плодах яблони // Прикладная биохимия и микробиология, 1971, т.7.- №1.- с.65-69.

45. Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф. Новые продукты питания. М.:Наука, 1998.-304с.

46. Ежова А.Ю. Разработка технологии выделения и очистки трансэлиминаз Bacillus macerans и изучение их свойств. Авторефер. дисс.канд. техн. наук.-Москва, 2002.-24 с.

47. Ежова А.Ю., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б. Разделение и характеристика ферментного комплекса культуры Bacillus macerans // Биотехнология.- 2002,-№1.- с.21-27.

48. Ежов В.Е., Сонина Е.Г., Семакова М.В. Влияние режимов сушки яблочных выжимок на выход и качество пектина // Виноград и вино России,- 1999,-№5,- С.33-34.

49. Ежов В.Е., Сонина Е.Г., Танащук Т.И. Использование грибной пектинэстеразы для получения яблочного пектина // Виноград и вино России,- 2000.- №3.- с.46-48.

50. Иванова Т.Н., Ершова Е.Д., Колесное А.Ю. Использование пектина при производстве напитков на основе плодово-овощного сырья.// Пиво и напитки.-1996.-№2.-с.34-35.

51. Ильина И.А., Земскова З.Г., Донченко Л.В. Извлечение пектина с предварительной СВ-сушкой сырья // Хранение и переработка сельхозсырья.-2000,- №12.- с.23-25.

52. Ильина И.А., Земскова З.Г. , Мгебришвили Т.В. Разработка детерминированной модели гидролиза экстрагирования пектинов методом механохимии // Известия вузов. Пищевая технология.- 2000.- №4.- с.91-93.

53. Ильина И.А. Научные основы технологии модифицированных пектинов.-Краснодар. 2001.- 312 с.

54. Калайциди Л.Ю. Биохимическое обоснование и разработка технологии пектиновых веществ с заданными комплексообразующими свойствами из различных видов сырья // Авторефер. дисс.канд. техн. наук,- Краснодар, 1998.-20 с.

55. Калдаре В.Г. Энергосберегающая технология производства пектина // Международная н.-т. конференция «Научно-технический прогресс в пищевой промышленности». Тез.докл.- Могилев.: МТИ, 1995.

56. Карпович Н.С., Гааг О.С., Плакса Л.В., Холодова В.А. Концентрирование пектинового экстракта // Пищевая промышленность.-1990.-№11.-С.37-39.

57. Кастельянос О., Синицин А.П., Ермолова О.В. Кинетические свойства индивидуальных компонентов целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum // Биохимия. -1995. -№ 10.-С.1609-1617.

58. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир.-1990.-350с.

59. Кислухина О.В., Кюдулас И. Биотехнологические основы переработки растительного сырья. Каунас: Технология,1997.-183с.

60. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов,- М.: ДеЛи принт, 2002.- 336с.

61. Колеснов А.Ю. Методы оценки качества сухих яблочных выжимок // Пищевая промышленность.-1992.-№10 с.22-24.

62. Колеснов А.Ю., Таблерос М.А., Гришнер К.Х. Методы скрининг-анализа коммерческих ферментных препаратов // Тез.докладов VIII конференции молодых ученых и специалистов, посвященных 60-летию образования МТИПП. М.:1991.-с.75-76.

63. Колеснов А.Ю. Способы контроля в ферментативном анализе // Пищевая промышленность.-1999.-№5.-С.74-76.

64. Колеснов А.Ю. Ферментативный анализ в пищевой промышленности // Пищевая промышленность.-l 996.-№11.-С.24-28.

65. Кочеткова А.А., Колеснов А.Ю. Классификация и применение пектинов // Пищевая промышленность.-l995.-№9.-С.28-29.

66. Кочеткова А.А. Некоторые аспекты применения пектина // Пищевая промышленность.- 1992.- №7.

67. Крапивницкая И.А. Разработка технологии свекловичного пектинового экстракта и пектинопродуктов на его основе. Авторефер. дисс.канд. техн. наук.- Киев., 1992.-25с.

68. Краснова Н.С., Лугина Л.Н. Разработка пектина для лечебно-профилактического питания // Пищевая промышленность. 1998. - №1,-с.39-42.

69. Крац Р., Колеснов А.Ю. Использование пектина в производстве конфитюра, желе и мармелада//Пищевая промышленность.-l993.-№7.-с.20-23.

70. Крац Р., Кочеткова А.А., Колеснов А.Ю. Строение, функциональные свойства и производство пектина // Пищевая промышленность.-1993.-№1.-с.31-32.

71. Кристиансен С.Х. Пектиновые желе-структуры для кондитерских изделий // Пищевая промышленность.-l994.-№3.

72. Кроха Н.Г., Румянцева Г.Н., Дианова В.Т., Браудо Е.Е. Полиуронидные комплексообразователи радиопротекторного действия // Материалы VI международной научно-технической конференции «Пища, экология, человек.» М., МГУПБ,2001

73. Кузнецова Е.Н., Нариниянц Г.Р. Перспективный способ производства пектина // Вестник РАСХН.-1997.- №3.- с.77-78.

74. Лебедев Е.И. Комплексное использование сырья в пищевой промышленности.- М.: Легкая и пищевая промышленность.- 1982. №3.-с.25-28

75. Левченко Б.Д. Использование полезных свойств пектиновых веществ в медицинской практике // Электротехнология пектиновых веществ: Тез. Докл. 4 н.-т. Сем.-К., 1993.- с.ЗО.

76. Лысянский В.М., Гребенюк С.Т. Экстрагирование в пищевой промышленности,- М.:Агропромиздат,-1987 .-190с.

77. Магомедов Г.О, Магамедова А.К. Объективная оценка пектинов для производства зефира. //Тез.докл. Всероссийской научно-практической конференции 12-13 ноября.-Воронеж, 1996.-c.lll.

78. Микеладзе О.Г. Разработка технологии получения пектиновых веществ из вторичного сырья при производстве консервированного мандаринового сока. Авторефер. дисс.канд. техн. наук.- Одесса, 1990.-16 с.

79. Молочников В.В., Герасюта Т.М. Разделяющая способность некоторых пектинов // Пищевая промышленность.-1994.-№6.-С.22-23.

80. Мохначев И.Г., Гранатова В.П., Давиденко Л.И. Комплексное использование яблочных выжимок // Известия вузов. Пищевая технология.- 1998.- №2-3.-с.49-51.

81. Орлова Т.А., Акинин П.В. Новые направления использования пектина // Пищевая промышленность, 1988, №5.- С.4-5.

82. Пат. 2055484 РФ. Способ получения пектина / Птичкина Н.М., Ишин А.Г, ДаниловаН.А. -№ 5035191/13. Заявл. 31.03.92. Опубл. 10.03.96. БИ№7.

83. Пат. 2181551 РФ. Способ производства пектиновых препаратов./ Румянцева Г.Н. НТЦ «Лекбиотех»

84. Пат. RU 02073014 С1 94042493/04 С08В 37/06 Способ извлечения пектиновых веществ из растительного сырья / Кочеткова А.А., Тужилкин В.И., Малченко О.А., Колеснов А.Ю., Нестерова И.Н., Паничева С.А., Гернет М.В., Заявл.28.11.94, Опубл. 10.02.1997

85. Пат. RU 02247737 С2 2003114345/04 С08В-37106 Способ производства пектина / Квасенков И.И., Донченко Л.В. Заявл. 16.05.03 Опубл. 10.03.05.

86. Пат. 02035165 CI 5019564/13 A23L-1/05-24 Способ получения пектина из растительного сырья / Карпович Н.С., Донченко JI.B., Гулый И.С., Нелина В.В. и др. Заявл. 20.12.91 Опубл. 20.05.1995.

87. Пат. 2093523, МКИ5 С08В 37/06 Способ получения пектина из растительного сырья /Пигалов А.Н., Гурусова А.А., Арифходжаева Х.А.-№94024850/04. Заявлено 1.07.94. Опубликовано 20.10.97. Бюл.№29.

88. Пектин. Методы контроля в пектиновом производстве / В.В. Нелина, Л.В. Донченко, Н.С. Карпович и др.- Краснодар: Ассоц. «Пектин», 1992.- 112с.

89. Пектин. Производство и применение / Н.С. Карпович, Л.В. Донченко, В.В. Нелина и др.- Киев: Урожай.- 1989.- 88с.

90. Пищевая химия / Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А. и др.; под ред. А.П. Нечаева.- СПб.: ГИОРД, 2001.- 592с.

91. Пищевые волокна / Дудкин М.С., Черно Н.К., Казанская И.С. и др.- К.: Урожай, 1998.-150с.

92. Поляков В.А., Римарева Л.В. Перспективные ферментные препараты и особенности их применения в спиртовой промышленности // Пиво и напитки.-2000.-№2.-С.52-55.

93. Птичкина Н.М., Птичкин И.И. К теории экстракции полисахаридов из растительного сырья // Хранение и переработка сельхозсырья,- 2000.- №6.-с.57-58.

94. Птичкина Н.М., Птичкин И.И. Совершенствование технологии и оборудования для переработки сельскохозяйственной продукции,- Саратов: СГАУ, 2000.- 362с.

95. Птичкина Н.М. Сырьевой потенциал для производства пектина в Нижнем Поволжье // Хранение и переработка сельхозсырья.-2000.-№11.

96. Прощенко З.И., Седадечная К.И. О продуктах кислотного расщепления пектиновых веществ // Известия вузов. Пищевая технология,- 1977.- №1.-с.37-39.

97. Рогов И.А., Антипова Л.В. Шуваева Г.П. Пищевая биотехнология: В 4 кн. Кн. 1. Основы пищевой биотехнологии,- М.: Колос, 2004,- 440с.

98. Родионова Н.А., Тиунова Н.А. Определение активности отдельных ферментов целлюлолитического комплекса. В кн. Ферментативное расщепление целлюлозы. М.: Наука, 1987.

99. Ромоданова В. А., Бондаренко И. А. Использование яблочного пектинового концентрата в производстве молочных продуктов // Электоротехнология пектиновых веществ: Тез. докл. III н.т.сем.-К., 1992.-С.54.

100. Рудая В.В., Янчевский В.К., Вовченко Г.К., Шалобанов С.Н. и др. О возможности производства пектина из сухого свекловичного жома на основе ферментативного гидролиза // Тез. докл. Всес. конф. «Химия пищевых добавок», Черновцы.-К., 1989.- С.237.

101. Румянцева Т.Н., Маркина О.А., Птичкина Н.М. Экстракция пектина из тыквенного жома с помощью отечественных ферментных препаратов // Хранение и переработка сельхозсырья,- 2002.- №6.- с.33-35.

102. Румянцева Г.Н. Мацерирующие ферменты как биокатализаторы процесса экстракции пектина // Материалы 3-й Международной конференции «Пища, экология, человек».-М., 1999.

103. Румянцева Г.Н. Микробные ферментные препараты в производстве пектина: механизм действия и эффективность применения // Вестник РАСХН.- 1993.-№12.

104. Румянцева Г.Н. Модифицированный пектин радиопротекторного действия: получение и свойства // Хранение и переработка сельхозсырья. -1998.-№12.- с.30-33.

105. Рустамбекова Г.У., Мирзарахметова Д.Т., Абдуразакова С.Х. Сравнительная характеристика пектинов различного сырья // Виноградство и виноделие, 1992, №1 2. - с.72-74.

106. Рухлядева А.П., Полыгалина Г.В. Методы определения активности гидролитических ферментов,- М.: Легкая и пищевая промышленность.-1981 .-288с.

107. Саломатова Т.С. Физиология растительной клетки. Л.; Изд-во ЛГУ, 1983.- 232с.

108. Сапожникова Е.П. Пектиновые вещества плодов.- М.: Наука, 1965.- 182с.

109. Свойства пектиновых веществ / Л.В. Донченко, Н.С. Карпович, Т.И. Костенко и др.- К.: Знание, 1992.-34с.

110. Сенников С.А., Литенко В.А. Создание мясопродуктов профилактического и лечебного назначения, обладающих протекторными свойствами // Электротехнология пектиновых веществ: Тез.докл. 3 н.-т. Сем. -К., 1992.-С.56.

111. Снапян Г.Г., Мкртчян, Арутюнян А.Ц. Влияние технологических факторов на пектиновые вещества и пектолитические ферменты при хранении плодов яблони // Биохимия хранения картофеля, овощей и плодов.-М., 1990, с. 146-151.

112. Строганов В.А., Колеснов А.Ю. Термостабильные фруктовые начинки на пектинах // Пищевая промышленность.-1996.-№1.-с.32-33.

113. ТУ 10.963.27-91. Выжимки яблочные сушеные. Технические условия.

114. ТУ 11249895-43-13-92 Метод определения целлюлолитической активности.

115. ТУ 9291-034-34588571-2001. Метод определения Р-глюканазной активности.

116. Тужилкин В.И., Кочеткова А.А., Колеснов А.Ю. Теория и практика применения пектина // Известия вузов. Пищевая технология.- 1995.- №1-2. -с.78-83.

117. Ферментные препараты в пищевой промышленности / под ред. В.Л. Кретовича, В.Л. Яровенко. М.: Пищевая промышленность, 1975.- 536с.

118. Фершт Э.А. Структура и механизм действия ферментов.-М.: Мир, 1980.-432с.

119. Филлипова В.Е., Широчкина Т.П., Бетева Е.А. Получение очищенной пектинэстеразы и пектинов пониженной степени этерификации.// Тез.

120. Доклада Всесоюзной конференции «Химические превращения пищевых полимеров».- Светлогорск, Калининград.-1191.-с.62.

121. Функциональные свойства гидроколлоидов. Каррагинаны // Жаринов А.И., Гурова Н.В. и др. Методические указания для студентов специальностей 070100, 072000, 2709000, 271100, 270500,- М., 2001

122. Хатко З.Н., Донченко JI.B. Влияние рН процесса осаждения свекловичного пектина на показатели его качества // Известия вузов. Пищевая технология,- 1999.- №1.- с.22-23.

123. Хербстрайд унд Фокс: многолетний опыт получения и применения пектина // Пищевая промышленность.-1992.-№8.-С.23-24.

124. Хорн Р., Кондерман Н. Получение и изготовление пектинов с уделением особого внимания специальным видам пектина // Сб. докл. На симпозиуме «Современная технология Австрии».- 1981.- с.23-25.

125. Шалаева О.А., Калунянц К.А., Колчева Р.А. Кинетика ферментативного гидролиза пектинов // Фермент. И спиртовая промышленность.-1981.-№7.-С.34.

126. Шелухина Н.П., Ашубаева З.Д., Аймухамедова Г.Б. Пектиновые вещества, их некоторые свойства и производные.- Фрунзе: Илим, 1970.-73с.

127. Шелухина Н.П. Научные основы технологии пектина.- Фрунзе, 1988.-168с.

128. Шилов А.В., Паршикова Л.П. Определение динамической вязкости пектинового экстракта // Журнал прикладной химии.-1981.-№7.

129. Шош М., Моисеева В.Г., Таран А.А. Факторы, влияющие на процесс гидролиза, выход и качество пектинов // Известия вузов. Пищевая технология.- 1982.- №4.- с. 122-124.

130. Anon. Биотехнология: Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов / под ред. С.Д. Варфоломеева. М., 1993.- 150с.

131. Brigand G., Denis A. Insight into the structure of Pectin by High performance chromatographic metods // Carbohydrate Polimers.- 1990.- V.12, №1.- P.61-77.

132. Canal-Llauberes R-M. Les enzymes industrielles dans la biotechnologie du vin. // Revu Fransaise d'Onologie.-1989.-№53.- p. 17-22.

133. Datta R.K. Pectin extraction from fruits and vegetables //Ins. Horticultur, 1987, vol.11, №2. P.15-17.

134. Elias A.N., Foda M.S., Attia Lottfia. Production of pectin and pigments from orange peels by using microbial enzymes // Egyp.Food Sci.-1984.-V.12,№l-2.-P. 159-162.

135. Guerrand D. Preparations enzymatiques: profils d' activite et performances // Revu Fran9aise d'0nologie.-2000.-№183.- p. 19-24

136. Hennik H.,Stam H., Oort V.G. Pectins and Pectinases: Proceedin of an International Simposium.- Netherlands, 1996.-P.485-494.

137. Leroux H., Schubert E. Les applications des pectines HM dans les industries agro-alimentaires // Industries Alimentaires et agricoles.-l983.-е. 615-618.

138. May C. D. Industrial Pectins: sources, Production and Application // Carbohydr. Polym.-1990, №12.-P.79-99.

139. May C.D. Pectin the additive from fruit. 1. Origins and Properties//Food. Trade Review.- 1988.-V.58, №8.-p.438-439.

140. Michel C., Mercier C. Extraction of pectines from sugar but pulp // Food Sc.,1995.,V.145.

141. PanchevI.N., Kirtchev N.A., Kratchanov С. H. Kinetik model of pectin extraction// Carbohydr.Polym.-1989.- №11.- p.193-204.

142. Pat.268857 (GDR). MKL A 23 L 2/30. Verfahren zur Gewinnung von Pektinen / J. Kroll, M. Krause, R. Krock.- Academie der Wissenschaften der DDR.-№3010165.-1989.

143. Pat. 3761463(USA). К 1260-209.5,С 08 В 19/12. The process of pectin extraction / J.M.S. Haug.-1973.

144. Pat. 4950689(USA) МКИ5 A 23 с 1/29. Pectin delivery system / Yang Robert, Shaw James, Bagan James ets.-1990.

145. Reginald H. Walter The chemistry and technology of pectin // Academic press, inc, 1991, p. 325.

146. Seethaler D., Hafrtmeier W.//Biotechnol.Conf.-1992.-V.5.- P.213-216.

147. Souty M., Lapize F., Breuils L. Possibilite de dosage simultane sur autoanalyseur de l'acide galacturonique et des oses neutres lors de la determination des substances pectiques // Ann. Technol. Agric.,1980, 29(1), 89-98.

148. Wantz S., Bajard C. Ver une utilisation optimale des enzymes oenologiques en thermovinification // Revu Fran5aise d'0nologie.-2000.-№184.- p.22-27.

149. Wightman Jd., Wrolstad R. Beta-glucosidase activity in juice processing enzymes based on anthocyanin analysis //Food Science.-1996.- №3.-p.544-552.