автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Теоретическое обоснование и практическая реализация биотехнологий специализированных молочных продуктов с использованием L-фенилаланин-аммоний-лиазы

На правах рукописи

БАБИЧ Ольга Олеговна

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЙ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Ь-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ

05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов

и холодильных производств 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

пз /.пР 2014

005546757

Кемерово 2014

005546757

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ФГБОУ ВПО «КемТИПП»),

Научный консультант: доктор технических наук, профессор,

лауреат премии Правительства РФ в области науки и техники

Просеков Александр Юрьевич

Официальные оппоненты: Храмцов Андрей Георгиевич

доктор технических наук, профессор, академик Россельхозакадемии, заслуженный деятель науки РФ, лауреат премии Правительства РФ в области науки и техники, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Кавказский федеральный университет», Институт живых систем, кафедра «Прикладная биотехнология», профессор-консультант

Петров Андрей Николаевич

доктор технических наук, профессор, член-корреспондент Россельхозакадемии, Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности Россельхозакадемии, директор

Гаврилов Гавриил Борисович

доктор технических наук, заслуженный работник пищевой индустрии РФ, Государственное учреждение Ярославской области Ярославский государственный институт качества сырья и пищевых продуктов, директор

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет»

Защита диссертации состоится 26 мая 2014 г. в 10:00 ч. на заседании диссертационного совета Д 212.089.01 при ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» по адресу: 650056, г. Кемерово, б-р Строителей, 47, 4 лекц. ауд., тел/факс: (8-384-2)39-68-88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» ('www.kemtipp.ru').

С авторефератом можно ознакомиться на официальных сайтах ВАК Минобрнауки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и ФГБОУ ВПО «КемТИПП» (www.kemtipp.ru). Автореферат разослан 25 апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Кригер Ольга Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Промышленное производство продуктов специализированного питания жизненно необходимо больным в критических и хронических состояниях, в т.ч. при нарушении функции пищеварения. Основу таких продуктов, как правило, составляют гидролизаты белков с различной степенью гидролиза, зачастую являясь единственно возможным средством при терапевтическом воздействии, обеспечивающем полноценное развитие детей и жизнедеятельность взрослых с различной патологией.

К таким патологиям относится фенилкетонурия - наследственное заболевание, вызванное нарушением перехода фенилаланина (незаменимой аминокислоты) в тирозин и приводящее к задержке психического развития и тяжелым поражениям центральной нервной системы.

Количество фенилаланина в питании таких больных должно быть строго нормировано с учетом возраста больного, что, как правило, достигается потреблением специализированных продуктов. Одним из направлений получения таких продуктов является использование L-фенилаланин-аммоний-лиазы (PAL) (КФ 4.3.1.5), которая катализирует реакцию обратимого дезаминирования L-фенилаланина до безопасных для организма соединений: транс-коричной кислоты и аммиака.

PAL является ключевым продуктом метаболизма фенилпропаноидов в растениях и грибах, где вовлечена в биосинтез вторичных метаболитов (флаво-ноидов, фуранокумаринов, компонентов клеточный стенки) и существует в виде множественных изоформ. Она обнаружена в активной форме в водорослях, актиномицетах, 12 видах базидиомицетов, разрушающих древесину. Среди микроорганизмов, обладающих PAL-активностью, известны некоторые штаммы красных дрожжей Rhodotorula, Rhodosporidium и Sporobolomyces и два представителя актиномицетов - продуцентов митомицина.

Данный фермент находит применение и как продукт самостоятельный в терапии и/или диагностике больных фенилкетонурией, как вспомогательный в производстве продуктов питания специального назначения, а также в биотехнологическом производстве L-фенилаланина из транс-коричной кислоты, для подавления роста злокачественных клеток, стимулирования роста растений и т.д.

Все вышесказанное подтверждает актуальность работы.

Степень разработанности. Существенный вклад в создание и освоение технологии получения специализированных продуктов питания внесли Г.Б. Гаврилов, Н.Б. Гаврилова, В.И. Ганина, Н.И. Дунченко, И.А. Евдокимов, В.И. Круглик, К.С. Ладодо, JI.A. Остроумов, А.Н. Петров, В.О. Попов, Г.Ю. Сажинов, В.А. Тутельян, В.Д. Харитонов, И.С. Хамагаева, А.Г. Храмцов; ферментного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы - В.И. Муштаев, М. Jason Mac Donald, H. Orum, О.F. Rasmussen.

Разработка новых и усовершенствование существующих технологий получения ферментного препарата PAL требует нахождения новых, более интенсивных источников его сверхсинтеза, что невозможно без изучения генетических особенностей уже известных продуцентов. В базах данных генетических

последовательностей (EMBL и GeneBank) обнаружено только 26 последовательностей генома микроорганизмов, обладающих PAL-активностью. Поэтому актуальны поиск микроорганизмов, обладающих L-фенилаланин-аммоний-лиазной активностью, на основе анализа генетических последовательностей их генома, разработка технологий получения и использования L-фенилаланин-аммоний-лиазы в производстве специализированных молочных продуктов.

Отдельные этапы работы выполнены в рамках:

- ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме «Молекулярное клонирование и экспрессия гена pal, обеспечивающего биотрансформацию фенилаланина с целью разработки технологии получения продуктов питания для лечения больных фенилкетону-рией», государственный контракт № П1701;

- ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме «Разработка технологии получения продуктов питания для больных наследственными нарушениями аминокислотного обмена», государственный контракт № 16.740.11.0239;

- ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме «Разработка альтернативных подходов получения продуктов для больных наследственными нарушениями аминокислотного обмена с использованием методов биоинформатики и математического моделирования», соглашение № 14.В37.21.0565;

и при финансовой поддержке:

- фанта Президента Российской Федерации МД-48.2009.4, договор №02.120.11.48-МД по теме «Биохимический и геномный анализ экспрессии гена pal с целью получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы в связи с созданием продуктов питания для больных фенилкетонурией»;

- аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 года)», задание № 2.1.2/3566 по теме «Разработка биотехнологии получения специфических ферментов, продуцируемых микроорганизмами»;

- Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина (г. Москва, договор № 154/1 от 23.03.2012 г.).

Цель и задачи исследования. Целью работы является развитие существующих и создание новых биотехнологий специализированных молочных продуктов с использованием L-фенилаланин-аммоний-лиазы.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- разработать технологию получения направленных гидролизатов белков молочной сыворотки, предназначенных для производства продуктов питания для больных фенилкетонурией;

- сформировать стратегию скрининга пигментных дрожжей, отличающихся способностью к синтезу L-фенилаланин-аммоний-лиазы, и изучить фе-нотипические особенности и биохимические свойства штаммов-продуцентов L-фенилаланин-аммоний-лиазы;

- разработать технологию получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы, осуществить выбор штамма ее суперпродуцента, подобрать компоненты и оптими-

зировать состав питательной среды для его культивирования, изучить влияние параметров процесса периодического культивирования выбранного штамма на выход L-фенилаланин-аммоний-лиазы и ее активность, разработать технологию выделения и очистки полученного ферментного препарата;

- разработать технологию иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы и исследовать основные физико-химические, биохимические и каталитические свойства нативной и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы;

- разработать технологию лиофилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы, обеспечивающую максимальное сохранение ее активности в процессе хранения;

- использовать установленные закономерности для разработки технических документов на ферментный препарат и специализированные молочные продукты на его основе, а также внедрения результатов исследования в промышленности, в т.ч. путем трансфера технологий.

Научная новизна. Разработана технология получения целенаправленных гидролизатов белков молочной сыворотки, обеспечивающая максимальное удаление фенилаланина из полипептидной цепи.

Проведен молекулярно-функциональный скрининг группы пигментных дрожжей, из которых выделено 19 новых продуцентов L-фенилаланин-аммоний-лиазы (Aureobasidium pullulons Y863, Bullera alba Y1581, Bullera piri-cola Y1577, Candida glabrata Y2813, C. maltosa Y242, Cryptococciis laurentii Y227, Cr. macerans Y2763, Cystofilobasidium capitatum Y1852, Debaryomyces castellii Y968, D. robertsiae Y3392, Dioszegia hungarica Y3208, Dioszegia sp. Y3320, Geotrichum klebahnii Y3053, Phaffia rhodozyma Y1668, Rhodosporidium diobovatum Y1565, Rh. infirmominiatum Y1569, Rh. glutinis Y77, Rh. lactosa Y2770, Rh. riibra Y1193, Saccharomyces cerevisiae Y1127, S. kluyveri Y2559, Spo-robolomyces holsaticus Y991, Tilletiopsis washingtonensis Y1650, Torulopsis apicola Y566, Tremella foliacea Y1624, Tr. mesenterica Y1625).

Установлена корреляция между генетической организацией штаммов микроорганизмов и их биосинтезом L-фенилаланин-аммоний-лиазы.

На основе методов случайных процессов, дисперсионного анализа и полного факторного эксперимента исследованы закономерности периодического глубинного культивирования пигментных дрожжей и биосинтеза PAL с использованием модели Людекинга-Пайри, выделен высокоактивный продуцент PAL - штамм Aureobasidium pullulons, для него определен компонентный состав субстрата, теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены режимы ферментации PAL.

Разработаны методики организации биосинтеза, выделения и очистки, иммобилизации на наноносителях и лиофилизации PAL, позволяющие не только получить фермент, превосходящий по качеству существующие аналоги, но и гарантировать его сохранность на протяжении более восемь месяцев.

Исследованы состав, свойства и хранимоспособность новых видов специализированных молочных продуктов с использованием PAL, предназначенных для питания больных фенилкетонурией.

Практическая значимость. На основе теоретических и экспериментальных исследований сформулированы требования к технологическим процессам, связанным с получением продуктов питания для больных фенилкетонурией: параметры и условия гидролиза белков молочной сыворотки, обеспечивающие максимальное удаление фенилаланина из полипептидной цепи; параметры и условия периодического культивирования Aureobasidium pullulans Y863; биосинтеза, выделения и очистки, иммобилизации на наноносители, лиофилизации PAL, направленного гидролиза молочного сырья. Техническая новизна разработанных технологических решений подтверждена патентами РФ № 2376893 «Способ получения белкового эквивалента продукта, предназначенного для лечения больных фенилкетонурией»; № 2415943 «Биологически активный пептид, полученный из молочного белка»; № 2425879 «Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ»; № 2437935 «Способ производства мультиферментного препарата»; № 2460790 «Способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах».

Разработаны и утверждены технические условия и технологическая инструкция на производство L-фенилаланин-аммоний-лиазы (ТУ 9291-144-020683152011 и ТИ 9291-144-02068315-2011). Разработана и аттестована методика определения коричной кислоты и ее солей методом капиллярного электрофореза в алкогольных и газированных безалкогольных напитках, не содержащих фенилаланина гидролизатах молочных белков (свидетельство № 01.00225/205-21-11). Результаты моделирования реализованы в программе для ЭВМ «Программа моделирования периодического процесса культивирования пигментных дрожжей» (свидетельство № 2014611451 от 03.02.2014 г.).

Составлена техническая документация на производство белковых продуктов для больных фенилкетонурией «Фенилаланин-фри» (ТУ 9745-145-0206838152012 и ТИ 9745-145-020683815-2012); рецептуры питательных сред для культивирования пигментных дрожжей (№ 01.01264/212-21-11), методики выделения и очистки PAL (№ 01.00106/006-21-11); иммобилизации PAL на наночастицы оксида железа (№ 01.00107/007-21-11); лиофилизации PAL (№ 01.00108/008-21-11); идентификации микроорганизмов, обладающих L-фенилаланин-аммоний-лиазной активностью (№ 01.00114/104-21-12).

Наработана и протестирована партия фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы и проведены его опытно-производственные испытания in vivo. В экспериментах in vivo установлена антипролиферативная активность L-фенилаланин-аммоний-лиазы, синтезированной штаммом Aureobasidium pullulans Y863, что открывает перспективы ее использования как противоопухолевого агента.

Результаты исследований используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» при подготовке студентов и магистрантов, обучающихся по направлениям 240700 «Биотехнология» и 141200 «Холодильная, криогенная техника и системы жизнеобеспечения», а также при организации научно-исследовательской и практической работы аспирантов.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты работы представлены на симпозиумах, конгрессах, конференциях,

семинарах и совещаниях различного уровня за рубежом (Армения, Германия, Канада, США) и в России (Барнаул, Бийск, Волгоград, Звенигород, Москва, Новосибирск, Омск, Санкт-Петербург, Ставрополь, Тамбов и др.).

Результаты диссертационной работы прошли апробацию на предприятиях биотехнологической и пищевой промышленности: ООО «Биотек», ООО «Инновационно-исследовательский центр», Институт молекулярной биологии (ИМБ) Национальной академии наук Республики Армения (HAH РА), ЗАО «Хладо-техника», ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» и внедрены в производство на ClusterNanoTech LTD (Англия) путем трансфера технологий в рамках лицензионного договора № 4/13 от 20.12.2013 г.

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в более чем 70 печатных работах, в том числе монографиях, статьях в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных материалов диссертационных исследований: «Journal of Analytical Chemistry», «Biotechnology and Applied Biochemistry», «Биомедицинская химия», «Нанотехнологии и наноматериалы», «Известия высших учебных заведений. Серия «Химия и химическая технология», «Биотехнология», «Фундаментальные исследования», «Журнал аналитической химии», «Технология живых систем», «Известия Самарского научного центра Российской академии наук», «Вестник ВСГТУ», «Техника и технология пищевых производств», «Достижения науки и техники АПК», «Молочная промышленность», «Хранение и переработка сельхозсырья», отчетах по НИОКР, а также патентах РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология получения направленных гидролизатов белков молочной сыворотки.

2. Стратегия молекулярно-функционального поиска микроорганизмов -продуцентов L-фенилаланин-аммоний-лиазы; последовательности генов, ответственных за синтез L-фенилаланин-аммоний-лиазы; фенотипические особенности и биохимические свойства изучаемых культур.

3. Факторы, повышающие PAL-активность биотехнологических процессов.

4. Технология получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы.

5. Параметры использования L-фенилаланин-аммоний-лиазы в производстве продуктов питания для больных фенилкетонурией.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, восьми глав, результатов и выводов, списка использованных литературных источников (524 наименования) и 15 приложений. Основной текст изложен на 309 страницах, содержит 83 таблицы, 98 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность, сформулированы научная новизна и практическая значимость диссертационной работы, положения, выносимые на защиту.

Глава 1. Аналитический обзор. Рассмотрены особенности строения и свойств PAL, обобщены обнаруженные в литературе аспекты ее получения, пока-

заны направления использования. Сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 2. Организация, объекты и методы проведения исследований. Теоретические и экспериментальные исследования выполнены в соответствии с поставленными задачами на кафедре «Бионанотехнология» ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». Общая схема исследований представлена на рисунке 1. Исследования состояли из нескольких логически взаимосвязанных блоков.

Экспериментальный блок исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов: на первом — разрабатывали технологию получения направленных гидролизатов белков молочной сыворотки, предназначенных для производства продуктов для больных фенилкетонурией (варьировали вид и дозу ферментного препарата, определяли продолжительность процесса, контролировали степень гидролиза и массовую долю высвобожденного из полипептидной цепи фенилаланина); на втором — разрабатывали стратегию скрининга пигментных дрожжей, отличающихся способностью к синтезу PAL. Для этого проводили анализ последовательностей ДНК, кодирующих синтез PAL, синтезировали универсальные праймеры, комплементарные консервативным участкам гена pal, проводили амплификацию фрагмента гена методом полимеразной цепной реакции, определяли нуклеотидную последовательность данного фрагмента методом секвенирования по Сэнгеру, редактировали нуклеотидные последовательности, проводили их множественное выравнивание и трансляцию в аминокислотные последовательности, анализировали оптимальные модели аминокислотных замен. Для филогенетического анализа фрагмента гена pal исследуемых видов брали дополнительные последовательности данного гена аскомицетов и базидиоми-цетов из базы данных NCBI. Филогенетические деревья строились как дистанционным методом, так и методом байесовской статистики. Изучали фенотипические особенности и биохимические свойства выбранных культур. Выделили штаммы, обладающие наибольшей PAL-активностью. В итоге разрабатывали методику идентификации этих микроорганизмов.

Для реализации технологии получения PAL осуществляли выбор штамма суперпродуцента, подбор компонентов питательной среды и режимов (с аэрацией и перемешиванием) периодического культивирования для обеспечения высокой PAL-активности выбранного штамма Подбирали параметры очистки PAL с целью сохранения ее высокой активности в процессе хранения.

Третий этап посвящен исследованию физико-химических свойств и выбору оптимального носителя (наночастицы Fe304 и Fe203) для иммобилизации PAL. Подбирали параметры иммобилизации PAL на модифицированные и немодифи-цированные наночастицы Fe304. Изучали влияние иммобилизации PAL на условия (рН и температурный оптимумы) сохранения свойств фермента: анализировали физико-химические свойства иммобилизованного ферментного препарата (удельная активность, операционная стабильность, стабильность при хранении, константа Михаэлиса - Ментен, максимальная скорость, изменение энтальпии, изменение энтропии, изменение свободной энергии Гиббса).

Изучали теплофизические характеристики (температуропроводность, теплопроводность, плотность, массовая теплоемкость) PAL до и после замораживания.

Рисунок 1 - Общая схема исследований

Исследовали влияние замораживания на активность фермента, определяли его криоскопические температуры.

Моделировали процессы кристаллизации влаги при замораживании ферментного препарата. Исследовали кинетические особенности процесса лиофиль-ной сушки. Обезвоживание проводили как при постоянных значениях параметров на протяжении всего процесса, так и при переменных в условиях ступенчатой сушки. На основании проведенных экспериментов устанавливали рациональные режимные параметры лиофильной сушки фермента: температуру, тепловую нагрузку и остаточное давление, которые легли в основу технологии его лиофилизации.

Практический блок исследований связан с реализацией возможности получения ферментного препарата в производственных условиях. Внедрение результатов в производство обеспечивали путем разработки технической документации и трансфера технологий.

При выполнении работы использовали общепринятые, стандартные и оригинальные методы исследований. Для поиска гомологичных последовательностей использовали программу BLAST2, для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей - Generunner, Chromas, для множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей - Clustal Omega, для редактирования и выравнивания, а также трансляции в аминокислотную последовательность - BioEdit 7.0.0. Анализ оптимальной модели аминокислотных замен осуществляли на on-line сервере ProtTest 3 согласно критерию Akaike (AIC) (в качестве аутгруппы использовали последовательность гена pal Arabidopsis thalianà). Построение филогенетического дерева дистанционным методом проводили в пакете программ Phylip 3.69, для построения деревьев байесовым методом использовали программу MrBayes 3.2, для визуализации - TreeGraph 2, для построения лого-диаграммы - WebLogo. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе ABI3730xl (Applied Biosystems, USA) по методу Сэнгера согласно протоколу производителя с использованием наборов для сек-венирования BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Олигонуклеотиды получали на синтезаторе ABI3900 (Applied Biosystems, USA). Результаты экспериментов обрабатывали методами математической статистики. Адекватность уравнений регрессий экспериментальным данным проверяли критерием Фишера. Доверительную ошибку коэффициентов уравнения регрессии рассчитывали по критерию Стьюдента.

Глава 3. Разработка технологии получения направленных гидролизатов белков молочной сыворотки. В ходе исследований проводили направленный гидролиз белков подсырной сыворотки ферментами, обладающими специфичностью к ароматическим аминокислотам, а также определяли аллергенные фракции и их эпитопы. С целью наиболее полного удаления фенилаланина из полипептидной цепи использовали энзиматическую систему, состоящую из алкалазы, карбоксипеп-тидазы А и лейционаминопептидазы.

В ходе исследований варьировали следующие параметры: фермент-субстратное соотношение - 1:25-1:100, продолжительность гидролиза - 60-120 мин, температура 45-55°С, pH среды - 7,0±0,1, соотношение ферментов алкалаза,

карбоксипептидаза А и лейцинаминопептидаза - 1:1:1. Результаты исследований представлены на рисунке 2 и таблице 1.

Рисунок 2 - Электрофореграмма сывороточный ферментативного гидролизата

альбУмин белков молочной сыворотки при

^-лактоглобулин Р3™00 Продолжительности ГИДрОлиза: 1 - 30 мин, 2-60 мин, —-а-лактальбумин з _ 90 мин. М - маркер Roti-Mark Standard, 5-98 кДа (Carl Roth, Германия)

Таблица 1 - Характеристика гидролизатов белков молочной сыворотки, %

Показатель Глубина гидролиза, при продолжительности, мин

слабо, 30 умеренно, 60 глубоко, 90

Доля расщепленных белков в гидролизате:

а-лактальбумин 11,3±0,6 45,5±2,3 98,3±4,9

р-лактоглобулин 5,6±0,3 28,7±1,4 77Д±3,8

бычий сывороточный альбумин 0 13,9±0,7 58,4±2,9

Массовая доля фракции с молекулярной массой <500 Да 6,8±0,3 12,4±0,6 63,4±4,7

Соотношение а-аминного и общего азота 3,5±0,2 8,8±0,4 60,2±3,0

Анализ данных показал, что с увеличением глубины гидролиза (регулируется продолжительностью процесса) возрастает доля расщепленных белков в гидролизате молочной сыворотки, причем наиболее интенсивно происходит ферментолиз а-лактальбумина: после 30 мин гидролиза доля расщепленного белка составляет 11,3%, после 90 мин гидролиза расщепляется 98,3% низкомолекулярной фракции белков молочной сыворотки. Менее подвержен гидролизу при выбранных параметрах бычий сывороточный альбумин: 30 мин гидролиза протекают без расщепления его молекулы, по истечении 90 мин ферментолиза гидролизуется 58,4% высокомолекулярной фракции белков молочной сыворотки. Что касается |3-лактоглобулина, доля расщепленного белка увеличивается с 5,6% при 30 мин гидролиза до 77,1% при 90 мин ферментативного процесса.

Кроме того, в процессе гидролиза белков молочной сыворотки происходит увеличение массовой доли низкомолекулярной фракции (молекулярная масса менее 500 Да): после 90 мин гидролиза она составляет 93,4%. Степень гидролиза в 90 минутном гидролизате молочной сыворотки равна 60,2%.

Установили, что рациональными параметрами направленного ферментативного гидролиза белков молочной сыворотки комплексом эндо- и экзопептидаз являются: температура 50±1°С, продолжительность 90±1 мин, соотношение фермент-субстрат 1:25.

В таблице 2 представлен аминокислотный состав, гидролизата, полученного при выбранном режиме организации гидролиза. При такой организации процесса

удается достичь высокой концентрации свободных аминокислот, среди которых фенилаланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, аспарагиновая кислота, глута-миновая кислота, тирозин, триптофан, что позволяет рекомендовать эти гидроли-заты (отвечающие требуемым органолептическим параметрам, основные физико-химические показатели приведены в таблице 3) для производства продуктов специализированного питания, в т.ч. для больных фенилкетонурией.

Таблица 2 - Содержание свободных аминокислот в гидролизате молочной сыворотки, г/100 г продукта__

Аминокислота Молочная сыворотка Гидролизат

Аргинин 0,02±0,001 -

Валин 0,04±0,002 0,035±0,002

Гистидин 0,02±0,001 0,011±0,001

Изолейцин 0,04±0,002 0,038±0,002

Лейцин 0,07±0,002 0,068±0,003

Лизин 0,07±0,001 0,032±0,002

Метионин 0,01±0,001 0,009±0,004

Треонин 0,04±0,001 0,027±0,001

Триптофан 0,02±0,002 0,019±0,004

Фенилаланин 0,03±0,001 0,030±0,002

Аспарагиновая кислота 0,07±0,001 0,064±0,003

Алании 0,03±0,002 0,020±0,001

Глицин 0,01±0,001 0,005±0,001

Глутаминовая кислота 0,14±0,002 0,100±0,005

Пролин 0,05±0,001 0,004±0,002

Серин 0,04±0,002 0,030±0,001

Тирозин 0,02±0,001 0,019±0,003

Цистеин 0,01±0,002 -

Итого: 0,73±0,02б 0,4832±0,034

Анализ остаточной антигенности гидролизата показал ее снижение в 96000 раз по сравнению с нерасщепленными белками молочной сыворотки, что является дополнительным и весьма существенным достоинством.

Таблица 3 - Физико-химические показатели гидролизата молочной сыворотки

Показатели Значение показателя

Плотность, кг/дм'1 1,020±0,01

Массовая доля влаги, % 93Д±0,90

жира, % 0,54±0,03

белка, % 0,78±0,04

золы, % 1,56±0,08

кальция, % 0,050±0,01

Активная кислотность, рН 7,15±0,36

Массовая доля антигенов молочной сыворотки в белковом компоненте продукта l.O-lO"5

Кратность снижения антигенности в сравнении с нерасщепленным белком молочный сыворотки, раз 96000

Перевариваемость белков in vitro, % 85,5±4,30

Глава 4. Скрининг пигментных дрожжей, идентификация культур, продуцирующих L-фенилаланин-аммоний-лиазу, и их физиолого-биохимическая характеристика. Проводили сравнительный анализ 26 нуклео-тидных последовательностей гена pal, содержащихся в базе данных генетических последовательностей GenBank. Результаты представлены на рисунке 3 в виде мо-лекулярно-филогенетического дерева, анализ которого показал достаточно высокое сходство последовательностей гена pal. Для каждого кластера множественное выравнивание отобранных нуклеотидных последовательностей проводили по гену pal базидиомицетных дрожжей Rhodosporidiutn toruloides и Rhodotorula glutinis, которые обладают наибольшим родством со штаммами пигментных дрожжей.

• gi|119480760jNeosartaya fischen . g i)7100l 127|Aspenji!lus Fjmigatijs - gi|12169887C|Aspagä!us clavatus ■ gi]317157281 ^Aspergillus oiyzae gl|258493630|Aspergiltus flavus gi[242730352iTalaromyces stipitatus gi|21253375C[Penidllfum mameffiäi gipi7034460|Aspenaius niger g:|l 15437191 [Aspergillus ierreus

gi|1162C621 l|Chaetomium gbbosum gil164422921|Neurospofa crassa gi|507833B91 [Lethana vulpina

gi|i69610841|phaeospliaefla nodorum

gpe3639£69|Magnaportiie oryzae

gi|49741^Arabidopsis Ihaliana gil331236172[Puccinia gramlnis g¡|3293 Rhodospofidium toruloses g(32S4 RtKxïotonjla mucilaginosa i|839763£Sp!>«totoraü gramints

gi|15e24530|Ustilago mayCis

gi|4S2667462¡PleurctiJS eryngü gi|1666264|

gi|4127282(Amanita muscaria gi|299751359|Coprinopsts cinerea okayama gi|17C097945[Laccaria bicolor gi|4G9924409|Tncticloma matsutake

Рисунок 3 - Дендрограмма нуклеотидных последовательностей гена pal

Выбранные универсальные праймеры (фланкируют фрагмент гена pal, расположенный с 292 по 1319 нуклеотид, размер полученного фрагмента - 1027 п.н.) представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Последовательности универсальных праймеров

Название Нуклеотидная последовательность праймера Занимаемая позиция

PAL2F 5'- CCGAYAACCCYCTSATMGA -3' 292-308

PALIR 5-САТ YTC TGC CGG YTG ААС RTG -3' 1299-1319

Для сконструированных пар праймеров рассчитаны температура отжига и параметры амплификации. Установлены условия проведения ПЦР-реакции: 95±1°С, 60 с, 30 циклов (95±1°С, 30 с; 64±ГС, 30 с; 72±1°С, 60 с). Полученные результаты легли в основу ПЦР-тест система для идентификации гена pal пигментных дрожжей.

Прямое секвенирование подтвердило, что полученные амплификаты являются фрагментами гена pal. Установлено, что только штаммы Aureobasidium pullulans Y863, Bullera alba Y1581, Bullera piricola Y1577, Candida glabrata Y2813, C. maltosa Y242, Cryptococcus laurentii Y227, Cr. macerans Y2763, Cysto-Jilobasidium capitatum Y1852, Debaryomyces castellii Y968, D. robertsiae Y3392, Dioszegia hungarica Y3208, Dioszegia sp. Y3320, Geotrichum klebahnii Y3053, Phaffia rhodozyma Y1668, Rhodosporidium diobovatum Y1565, Rh. infirmominia-tum Y1569, Rh. glutinis Y77, Rh. lactosa Y2770, Rh. rubra Y1193, Saccharomyces cerevisiae Y1127, S. kluyveri Y2559, Sporobolomyces holsaticus Y991, Tilletiopsis washingtonensis Y1650, Torulopsis apícola Y566, Tremella foliáceo Y1624, Tr. mesen terica Y1625 содержат в своем составе ген pal и, соответственно, будут использоваться в дальнейших исследованиях.

Составили матрицу идентичности нуклеотидных и аминокислотных последовательностей (таблицах 5 и 6). Степень идентичности как нуклеотидных, так и аминокислотных последовательностей очень высока и составляет порядка 93-97% для некоторых видов.

Исследование фенотипических особенностей и биохимических свойств выбранных культур проводили по совокупности микро- и макроморфологических свойств. Установлено, что клетки выделенных дрожжей имеют круглую, овальную и цилиндрическую форму. Размеры «взрослых» дрожжевых клеток варьируются у разных видов от 1,0 до 8,0 мкм по ширине и достигают 17,0 мкм в длину у продолговатых клеток, при этом консистенция у всех клеток пастообразная (таблица 7).

Далее определяли PAL-активность выбранных штаммов пигментных дрожжей. В результате установлено, что наибольшей активностью обладают штаммы Aureobasidium pidlulans Y863, Rhodosporidium infirmominiatum Y1569, Candida glabrata Y2813, C. maltose Y242, Debaryomyces robertsiae Y3392, Rhodosporidium diobovatum Y1565, Rh. lactose Y2770, Saccharomyces cerevisiae Y1127, Tilletiopsis washingtonensis Y1650, Torulopsis apícola Y566, Tremella foliácea Y1624, Rhodotorula rubra Y1193, Debaryomyces castellii Y968, что позволяет рекомендовать их для дальнейших исследований с целью разработки технологии получение ферментного препарата PAL.

Моделирование периодического процесса культивирования пигментных дрожжей проводили с целью выделения наиболее активного штамма-продуцента PAL. Пусть X(t) - средняя концентрация биомассы мг/см3 в момент времени t, t е [0, со) и D(t) - соответствующая дисперсия. Из модели, определяющей процесс рождения и гибели с постоянной средней скоростью роста и средней скоростью гибели популяции, пропорциональной численности популяции, получили систему уравнений:

Таблица 5 - Идентичность нуклеотидных последовательностей фрагмента гена pal некоторых видов, %

Aspergí llus mger Aureahaáduim puHular.s Candida apícola Candida glabrata Candida rmilcsa Cystofilobaadatm capitatum Debaryomyzes castalia DebaryomycQS robartnae Newospora crassa Fhqffia rkodazytna Puccima

Rhodolorula gluäxis Rhodolorula gransms Rhodotorula muciia&nosa Rhodolorula rubra Saccharomyces cerevisiae Saccfiaroirtyces tiqyveri Ti Лей оря s -wasfangionojisis Tremellajbliacea Tremella rmsenterica

Таблица 6 - Идентичность нуклеотидных последовательностей фрагмента гена pal некоторых видов, %

Asperglius niger Aunobaádium puüulans Candida apícola Candida glabrata Candida maltosa Cysíofilobasiáum capilatum Debaryomyces castalia DibaryomycQs robertsiaa

91 94 ' Щ 88 92 82 "893

92 84 84 90 87 J

шШШ 36- - Щ} Шшт

41 40 35 41 43 44 41

Phoffia rhodazyma 26 26 63 63 63 60 65 60 65 31

Puccima grammsj. zp. Inй'ст 46 46 45 44 45 50 49 50 45 49 29

Rkodospondium diobowtwn 45 41 91 86 6S? 91 Ш 95 93 43 53 50

Rhodcspor.áium iqfirmo-rmmatum 38 38 87 91 86 90. '90; 92 91 41 58 47

Rhodosporidium loruloides 47 47 73: 71 67 73 72 69 50 51 57

RJiodotorula glutims 47 39 91 V 35. .91. 93 95 43 53 52

Rhodolorula granúnis 50 47 68 65 60 67 65 64 46 48 58

Rhodotorula mucilaginosa 42 42 94. Ш 84 m 90 43 63 52

Rhodotorula rubra 44 40 87 83 81. X} 44 60 51

Saccharan^ces cemvisiae 38 39 94 Ш,- 89 ■sí 93 92 42 63 46

Saccharomtves Hiipven 40 37 83 85 83 92 87 85 40 63 46

TilkáopsisvMshmgtcniinsis 41 42 93. 88 86 90. 90 95 43 63 49

Tramella jdxacsa 40 39 90 36 36 ш 91 93 42 65 49

Trefixlla rnesanlarica 27 28 69 "l'„ 66 m 69 i 31 58 33

100, Ш i

ICO

■■> I 91;;;a

85 87 77

93 ' 91 75 93 í 64 94

Ц '¡OS 90 ?3.87 "95] 50 71 74 75 : 68 72J 68

II! !

||

¡I

11 ú il Hfl gilí til 11 f I

II i' ili É i1 J Л |1 11,11

llilll AMtiiJifji ili

Таблица 7 - Фенотипические свойства колоний пигментных дрожжей

Название штамма Размер, мкм Форма Характер конкура края Рельеф Поверхность Цвет

Candida glabrata У2813 2,5x6,0 овальная неровные края гладкий матовая кремовый

Aureobasidium pullulans Y863 8,0x6 элипсовидная неровные края складчатый матовая кремовый

Tremella foliacea Y1624 2,0x6,5 круглая неровные края гладкий блестящая кремовый

Phaffia rhodozyma Y1668 3,8x10,0 от круглой до овальной неровные края гладкий матовая красно-оранжевый

Rhodotorula lactose Y2770 2,5x8,0 от овальной до вытянутой неровные края гладкий блестящая красно-розовый

Rhodosporidium diobovatum Y1565 1,0x9,0 от круглой до овальной неровные края складчатый матовая красно-розовый

Rhodotorula rubra Y1193 2,3x6,5 от овальной до вытянутой ровные края гладкий блестящая красно-розовый

Tremella mesenterica Y162 5 2,0x8,5 от круглой до овальной неровные края гладкий блестящая кремовый

Debaromyces castellii Y 968 3,8x8,5 от круглой до овальной неровные края складчатый матовая белый

Candida maltose Y242 2,0x7,0 от круглой до цилиндрической ровные края гладкий блестящая кремовый

Rhodosporidium capitatum Y1567 1,0x14,0 от круглой до цилиндрической ровные края гладкий матовая розово-оранжевый

Saccharomyces kluyveri Y2559 5,0x12,0 от круглой до цилиндрической ровные края гладкий блестящая кремоватый

Bullera alba Y 1581 2,0x6,5 овальная неровные края гладкий матовая кремовый

Rhodotorula glutinis Y77 2,3x10,0 от круглой до овальной ровные края гладкий матовая красно-розовый

Rhodosporidium infirmominiatum Y1569 1,0x10,0 от круглой до овальной ровные края гладкий матовая красно-розовый

Debaryomyces robertsiae Y3392 2,8x8,0 от круглой до овальной неровные края складчатый матовая белый

Saccharomyces cerevisiae Y1127 5,0x12 от круглой до цилиндрической ровные края гладкий блестящая кремоватый

Tilletiopsis washingtonensis Y1650 1,0x17,0 круглой до цилиндрической неровные края складчатая матовая кремовый

Torulopsis apícola Y566 2,0x6,0 от круглой до овальной ровные края гладкий блестящая желтовато-кремовый

Примечание. Консистенция всех штаммов пастообразная.

dX(t) dt

= Mx-AxX(t),X(t0) = X0; (1)

j^D{t) + X\t)~ X{t)]+2Ax[D{t) + X\t)-X{t)]=2nx ■X(t), D(t0) = D0 (2)

где цх и Лх - интенсивность рождения и гибели популяции в единицу времени; (д - момент времени, в который начинается фаза активного (экспоненциального) роста биомассы.

Если Р(0 - концентрация целевого продукта из модели Людекинга - Пай-ри, то, учитывая уравнение (2), для количества синтезируемого продукта имеем:

а1 £»

где уР — средний выход продукта, отнесенный к образовавшейся биомассе, мг/г; Зр - коэффициент, определяющий долю продукта, выделяемого погибшими членами популяции, мг/(см3-ч).

Таким образом, модель представляется системой трех дифференциальных уравнений, решение которых имеет следующий вид:

X(t)=£L +

Мх

-¿И'-'о).

; D(t) = (I — е~Лх')

+ У .

Т~ 0

V х

(4)

Р(0 = rP(X(t) - Х0) + SP(t -tQ) + P0.

Пусть /0, !, - моменты времени, с которых начинается и заканчивается фаза экспоненциального роста периодического процесса культивирования, t2 — момент времени, начиная с которого гибель начинает преобладать над рождением членов популяции. По разработанной методике на интервале от t0 до t] (рассматривая процесс чистого рождения) определяли среднюю скорость рождения цх,от г, до t2 - среднюю скорость гибели Лх членов популяции в единицу времени.

Можно считать, что ур = 0,63 мг/г, усредненное значение параметра -8Р = 0,1 мг/(см3-ч) (если считать параметр 8Р незначимым, т.е. равным 0, то ошибка расчета для образцов рассматриваемых штаммов составляла от 5 до 12%). Полученные результаты для рассмотренных штаммов пигментных дрожжей приведены в таблице 8 и на рисунке 4. По количеству вырабатываемого белка можно выделить штаммы Y1565, Y2770 и Y1650.

Таблица 8 - Параметры моделирования периодического процесса

Штамм to Mx Лх h Гр

Tilletiopsis washingtonensis Y1650 0,5 2,599 2,0 0,183 6,0 0,63 0,08

Rhodotorula lactose Y2770 0,5 2,103 2,0 0,188 6,0 0,63 0,21

Rhodosporidium diobovatum Y1565 4,5 1,090 10,0 0,053 16,0 0,63 0,16

Aureobasidium pullulons Y863 2,0 1,655 3,0 0,154 6,0 0,63 0,14

Tremella foliacea Y1624 7,0 2,065 9,0 0,211 15,0 0,63 0,02

Candida glabrata Y2813 6,0 1,130 10,0 0,121 15,0 0,63 0,04

в) Продолжительность, ч

1

¡

AAA

.-'А* _____ ------- ----

я а о Ы

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0

Продолжительность, ч

Продолжительность, ч Продолжительность, ч

Рисунок 4 - Зависимость биомассы (а, б, в) дрожжей и белка (г) от продолжительности культивирования: 1 - экспериментальные данные, 2 - X(t),

3, 4 - X{t) ± D(t) , 5 - экспериментальные данные, 6 - P(t) ('- образец Y1650,

"- Y2770, "'- Y863)

Дня окончательного выбора активного штамма-продуцента PAL воспользовались обобщающей характеристикой Qe(t) (производительность целевого продукта, определяющая количество вещества, расщепляемого количеством фермента, содержащегося в образце единичного объема, с активностью в этом же объеме) (рисунки 5, 6). Явным лидером уже в первый час культивирования был образец штамма Y863. Увеличение продолжительности культивирования более 2 ч нецелесообразно, поскольку это приводит к увеличению затрат и уменьшению производительности. Проведение трех циклов по 2 ч позволит получить в 1,39 раза больше белка наибольшей активности, чем при одном цикле в 6 ч, активность которого почти в 1,5 раза меньше.

Проведенное моделирование позволило изучить процесс ферментации, сформулировать рекомендации по выбору штаммов микроорганизмов, обладающих при прочих равных условиях большей «производительностью». В дальнейших исследованиях будем использовать Aureobasidium pullulons Y863 для биосинтеза PAL.

Глава 5. Моделирование и оптимизация технологического процесса получения PAL. Проводили сравнительную оценку способов организации (с перемешиванием и без, с аэрацией и без) процесса периодического культивирования пигментных дрожжей (Aureobasidium pullulans Y863) в ферментёре с питательной средой, рекомендованной ГосНИИГенетика (NaCl - 0,5%, глюкоза -20%, дрожжевой экстракт - 5%, пептон - 10%), в сочетании с дополнительными компонентами (стимуляторы роста биомассы и/или синтеза PAL) на протяжении до 8 ч при температуре 26°С, рН 7,0.

В качестве дополнительных компонентов варьировали источники углерода (глютаминовая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота) и азота (L-фенилаланин, L-тирозин, DL-изолейцин). При составлении рецептуры питательной среды культивирования продуцента PAL применили дисперсионный анализ для изучения влияния факторов X и У (стимуляторов роста биомассы и белка, соответственно) на результативный признак (количество вырабатываемого PAL в единице раствора, значение его активности и производительности) целевого продукта. Полученные результаты легли в основу технологии получения ферментного препарата PAL.

а)

м '

аз и я

б)

S W

Ч)

а

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

►

л

tii!

Продолжительность, ч

Рисунок 5 - Зависимость активности белка от продолжительности культивирования:

Продолжительность, ч

Рисунок 6 - Изменение производительности целевого продукта от продолжительности его биосинтеза:

1 - штамм Y1650; 2 - штамм Y2770; 3 - штамм Y863

Массовую доля L-фeнилaлaнинa, L-тиpoзинa и DL-изoлeйцинa варьировали от 0 до 1%, глютаминовой, янтарной и лимонной кислоты от - 0 до 4%. Значимость линейных эффектов X, Г и их совместного влияния проверяли критерием Фишера с уровнем значимости 0,95. Всего было составлено 15 новых смесей для культивирования Aureobasidium ри11и1апз У863 (начальная концентрация биомассы 2,34 г/дм3, содержание белка - 3,95 мг/ см3).

С увеличением продолжительности культивирования Aureobasidium риШйапз У863 влияние содержания в питательной среде биологически активных добавок смещается в сторону содержания индуктора биосинтеза. Более важную роль в процессе биосинтеза играет не количество биологически активных добавок, а тот индуктор, с которым их используют. Янтарная кислота в большинстве случаев тормозила биосинтез вне зависимости от используемого индуктора. В состав

синтетической питательной среды для культивирования Aureobasidium pullulons Y863 включили в качестве источника азота L-тирозин. Дополнительное внесение источников углерода для подобранного состава питательной среды не требуется.

Содержание тирозина (варьировали от 0,5 до 5 г/дм3) в субстрате определяли при культивировании в прежних условиях на протяжении 6 ч. Увеличение содержания тирозина от 0,5 до 5 незначительно изменяет концентрацию биомассы и белка (прирост не более 20%), активность белка возрастает от 1,54 до 2,24 раз (рисунок 7). Для всех образцов на начальном временном этапе наблюдалось увеличение активности белка с последующим уменьшением. Наибольшее значение достигалось через 3 ч культивирования (содержание тирозина 0,5, 1,0 и 5,0 г/дм3) и составляло от 45 до 67% от начального. Наилучшие результаты из рассмотренных получены в средах с содержанием тирозина от 2,0 до 5,0 г/дм3.

Моделирование процесса культивирования Aureobasidium pullulons Y863 в среде с добавлением тирозина (2,0 или 5,0 г/ дм3) позволило определиться с составом субстрата.

а)

m

а

S

б)

•а-----¿Т-ТФ-

И V-

W и"

СУ Л

------N

г-~4 '"H

у

1 2 3 4: • 1 02 ©3 ->4 ®5 Продолжительность, ч

12 3 4 OI о2 »3 *4 *5 Продолжительность, ч

Рисунок 7 - Изменение активности (а) и производительности (б) целевого продукта биосинтеза при культивировании Aureobasidium ри11и1ат У863 в среде с содержанием тирозина: 1 - 0,0 г/ дм ; 2 - 0,5 г/ дм3; 3 - 1,0 г/ дм3; 4 - 2,0 г/ дм ; 5 - 5,0 г/ дм3

Воспользовались моделью (5) с добавлением зависимости содержания компонентов субстрата, скорость уменьшения которого прямо пропорциональна числу популяции и обратно пропорциональна средней доле потребляемого субстрата на члена популяции, тогда

а/ ш

где у3 - среднее потребление субстрата, отнесенное к образовавшейся биомассе, г/г; д5 = у3 ■ /лх - коэффициент, определяющий часть субстрата, не потребленного погибшими членами популяции в единицу времени, г/ч.

По разработанной методике определили параметры моделей (4) и (5), значения которых представлены в таблице 9. Результаты моделирования представлены на рисунках 8, 9.

6К

1 _ !___: 1 :

в)

Продолжительность, ч

Продолжительность, ч

Продолжительность, ч

♦ 7

а 5 -6

Продолжительность, ч Рисунок 8 - Изменение концентрации биомассы (а), белка (б), тирозина (в) при культивировании Aureobasidium pullulons Y863 в среде с добавлением тирозина 2,0 г/дм3: 1 - экспериментальные данные (биомасса); 2 - X{t) ;

3, 4 - X(t) ± ^D(t) ; 5 - экспериментальные данные (белок); 6 - P(t) ; 7 -экспериментальные данные îthdo-

б)

С? А fr

я

<L> g 2

о «

0

_____

Продолжительность, ч

0 1 2 3 4 5 6

а 5 -6

Продолжительность, ч

Рисунок 9 - Изменение концентрации биомассы (а) и белка (б), тирозина (в) при культивировании Aureobasidium pullulans Y863 в среде с добавлением тирозина 5,С г/дм3: 1 - экспериментальные данные (биомасса); 2 - X(t); 3, 4 - X(t) ± 4Ш) \ 5 - экспериментальные данные (белок); б - P(t); 1 - экспериментальные данные (тирозин), 8 - S(t)

Учитывая физический смысл параметров ¡лх и Хх, из образцов можно выделить последний, характеризующийся наибольшей скоростью прироста биомассы, однако и скорость гибели членов популяции наибольшая. Поэтому процессы, протекающие в среде с содержанием тирозина 2,0 и 5,0 г/дм3, можно считать приблизительно одинаковыми.

Таблица 9 — Значения параметров моделирования периодического процесса культивирования пигментных дрожжей в среде с добавлением Ь-тирозина_

Концентрация тирозина, г/дм3 h Мх Хх Ур ¿я Ys

0,0 0,0 0,8296 0,1264 0,49 0,1 - -

2,0 0,0 1,3630 0,1590 0,58 0,1 0,00 0,24

5,0 0,0 1,6480 0,2494 0,59 0,1 0,00 0,22

Увеличение концентрации тирозина в питательной среде более 2,0 г/дм3 приводит к уменьшению активности белка до 8%, а производительность по белку увеличивается более чем на 30%.

Для получения белка наибольшей активности (без учета затрат) рекомендуется проводить культивирование в течение 4 ч в питательной среде с добавлением тирозина в концентрации 2,0 г/дм3, «максимум продукции и качества, минимум затрат» и 3 ч в среде с добавлением тирозина 5,0 г/дм3 (рисунок 10).

а)

15

S 12

и

а, н я о =г в о

>— >—(

1 у <

Y

У н г; г----1 к-—-А

И г "1

1,5

1 1 "я

1>2 о

м

0,9 jf

б)

0,6

я н

к <

&

"¡А Я6

I

яо

<L>

=г к

о «

г

<

___— ,

лГ — т 1 ;

1,5 1.2 0,9 0,6 0,3 0

0 1 2 3 4 5 Продолжительность, ч

S о

Ш

о Я в а

В

<

0 1 2 3 4 5 6 Продолжительность, ч ai Д2 оз

Рисунок 10 - Изменение концентрации биомассы, белка и его активности при культивировании Aureobasidium pullulans Y863 в среде с добавлением тирозина 2,0 г/дм3 (а) и 5,0 г/дм3 (б): 1 - белок, 2 - биомасса, 3 - активность

Для определения значений технологических параметров процесса (число оборотов мешалки, скорость подачи воздуха, продолжительность) воспользовались экспериментальными исследованиями по схеме ПФЭ-23 для получения представления о влиянии факторов W, V на целевую функцию Z (активность и количество PAL) (таблица 10).

Показатель Фактор Нижний уровень Верхний уровень Единица варьирования

Перемешивание, об/мин W 0 300 50

Аэрация, дм3/мин V 0 15 5

Продолжительность культивирования, ч Т 0 6 1

Получены следующие уравнения регрессии: 2Х = 0,05727 - 0,0003Ж + 0.0028Г + 0,0953т7 + 0,0000^ + 0.0005ГГ +

+ 0,00405КГ - О.ШОУУУТ, г2 = 2,6889 + 0,0061Ж + 0,0605Г + 0,8090Г - 0,0006ИГ + 0,0017ЯТ -

-0,0171^+0,0002^^77.

По критерию Стьюдента в этих уравнениях незначимыми оказались по четыре коэффициента. Коэффициенты критерия Фишера меньше теоретических, поэтому уравнения с вероятностью 0,95 не противоречат описанию связи выделенных факторов. На качество и количество вырабатываемого фермента наибольшее влияние оказывают скорость перемешивания Ж среды культивирования и продолжительность культивирования Г - как самостоятельно, так и в совокупности. Увеличение продолжительности процесса биосинтеза и скорости перемешивания среды культивирования позволяет увеличить и качество, и количество вырабатываемого белка, в то время как характер влияния количества вводимого воздуха как самостоятельно, так и в совокупности с другими факторами не однозначен (рисунок 11). Культивирование с перемешиванием и аэрацией на протяжении 5 ч приводит к значительному увеличению активности и количества синтезируемого белка (по активности до 29%, по количеству до 40%). Увеличение продолжительности процесса до 6 ч привело к увеличению количества белка до 23%, но уменьшило его активность.

а) 75

"Я . <

.U 1,5 (Ц

•а 1.25

н

о

§ I я

Ь 0.75 %

0,5

i .-«"-•' г— и—я

J г*"' >--------< )— v

л р V

,1 /'.i i г"*'

г'"*

б)

2 3 о i о 2 '

&

В О

я

X

о

а

2.3 2

1,7

1.4 1,1 0,8

f f1*"- ........

.V / i------ ______4 и

i/' л 1

4 ■ '"У/ i Д 2 A3

V 1

Продолжительность, ч

Продолжительность, ч

Рисунок 11 - Влияние режима организации процесса культивирования на активность (а), концентрацию белка (б): 1-^ = 0 об/мин, V = 0 дм3/мин; 2 -Ш = 100 об/мин, V = 10 дм3/мин; 3 - Ж = 300 об/мин, V = 15 дм3/мин

При организации процесса биосинтеза PAL придерживались следующей технологической схемы: культивирование продуцента в ферментёре объёмом 5 дм3 при температуре 26±1°С, pH 7,0, в течение 5 ч с интенсивным перемешиванием (100 об/мин) и принудительной подачей воздуха (10 дм3/мин).

Для разработки технологии выделения и очистки L-фенилаланин-аммоний-лиазы изучали влияние высоких концентраций солей (NaCl, KCl и (NH4)2S04) на активность очищенного препарата PAL. Установили, что в исследуемых условиях активность значительно ингибировалась на 26-48% и 26-44%, соответственно для солей NaCl и KCl, присутствия которых желательно избегать в реакционной смеси.

Далее исследовали влияние параметров очистки PAL на ее удельную активность. Схема очистки представлена в таблице 11, при которой удельная активность фермента увеличивается в 10,7 раз и составляет 3,0 Е/мг белка.

_Таблица 11 - Схема очистки PAL

Стадия очистки Удельная активность, Е/мг Активность, Е/см3 Белок, мг/см3 Объем, см3 Сумм, активность, Е Сумм, белок, мг Выход, %

Экстракт 0,28 4,20 15,00 95 399,00 1425,00 100

I дробное осаждение сульфатом аммония 0,92 18,40 20,00 20 368,00 400,00 99

II осаждение сульфатом аммония 2,02 10,91 5,40 18 196,34 97,20 67

Гидрофобная хроматография 3,00 9,00 3,00 22 198,00 66,00 67

Глава 6. Оптимизация параметров иммобилизации

Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы. Сравнение химического состава и физических свойств частиц оксида железа Ре203 и Ре304 приведено в таблице 12. Носителем для иммобилизации фермента выбраны наночастицы Ре304, удельная поверхность которых (35,7 м2/г) в 10 раз превышает удельную поверхность наночастиц Ре203 (3,155 м2/г).

Таблица 12 - Свойства наночастиц Fe2C>3 и Fe3Q4

Оксид железа Диаметр частиц, нм Удельная поверхность, м2/г Массовая доля примесей, %

Al Si С

FejOj 53,7±0,4 3,155 ±0,110 0,62±0,01 1,67±0,03 1,10±0,02

Fe304 75,3±9,3 35,700±1,100 0,75±0,02 3,00±0,05 0,04±0,01

Изучали влияние способа иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на частицы Fe304 (метод тиофенового ацетилирования, карбодиимидный и адсорбционный методы) на PAL (рисунок 12).

J'i

кЧ ^ >

II ' ■

i / 1 ч /KfA. / 3 ^^

Т*"""*

|

30

90

Рисунок 12 - Зависимость PAL -активности Aureobasidium pullulans Y863 от температуры при различных способах иммобилизации:

1 - нативный фермент. Способ иммобилизации:

2 - тиофенового ацетилирования,

3 - карбодиимидный,

4 - адсорбционный

Температура, °С

Установлено, что нативный и иммобилизованный фермент имеют различные оптимальные температуры действия (рисунок 12). Оптимум температуры смещен на 3±1°С в случае иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на немодифицированные наночастицы и на 5±1°С для фермента, иммобилизованного на наночастицы Рез04, функционализированные тиофеновыми группами или карбодиимидом, по сравнению с нативным ферментом. Кроме того, для фермента, иммобилизованного на наночастицы Рез04, модифицированные тиофеновыми группами, при температуре выше 75±1°С сохраняется приблизительно 75% удельной активности, в то время как нативная PAL практически полностью инактивируется.

Выяснили, что PAL активна в пределах значений рН от 6,0 до 8,0 (рисунок 13), значение рН для проявления активности нативной и иммобилизованной PAL одинаково и лежит в пределах от 6,5 до 7,5.

ГЛ я 3

.о

Щ

£ 2J5

о

аз 03

К

h

я О

и

<и 1

&

. Ж* 2 1

3 \V --ш

I

i...- 'ч.

7

рН

10 и

Рисунок 13 - Зависимость PAL -активности Aureobasidium pullulans от значений рН буфера (инкубация 4 ч), при различных способах иммобилизации:

1 - нативный фермент. Способ иммобилизации:

2 - тиофенового ацетилирования,

3 - карбодиимидный,

4 - адсорбционный

Из таблицы 13 следует, что максимальная активность PAL (94% от на-тивного препарата) сохраняется после иммобилизации фермента, на наночасти-цах Fe304 методом тиофенового ацетилирования. Установлено, что иммобилизованный фермент после пятикратного использования в реакции с образованием транс-коричной кислоты сохраняет 85%, 69% и 27% активности PAL, иммобилизованной методом тиофенового ацетилирования, карбодиимидным и адсорбционным методами, соответственно, что является дополнительным свидетельством эффективности ковалентного взаимодействия PAL с наночастицами оксида железа.

Таблица 13 — Характеристики L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах Fe3Q4 с использованием физического и химических способов

Наночастицы Fej04 Содержание белка в иммобилизованном препарате, мкг/мг частиц Удельная активность препарата, Е/мг Активность иммобилизованного препарата, % от нативного

Нефункционализированные 15,00±0,75 1,62±0,08 54,00±3,12

Функционализированные тиофеновыми группами 55,00±3,34 2,82±0,15 94,00±5,56

Функционализированные карбодиимидом 27,00±1,62 2,28±0,14 7б,00±4,5б

Результаты изучения кинетических характеристик процесса, катализируемого иммобилизованной PAL (таблица 14), свидетельствуют о том, что при иммобилизации фермента величина максимальной скорости (Vmax) возрастает, а значение константы Михаэлиса-Ментен (Км) уменьшается. При этом, чем выше сродство PAL и наноразмерного носителя, тем больше значение Vraax и меньше значение Км.

Таблица 14 - Кинетические параметры нативной и иммобилизованной PAL

Способ иммобилизации фермента Vmax, моль / (mhhcmj) Км, ммоль

Нативная Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза 3,974±0,05б 0,485±0,021

Методом тиофенового ацетилирования 4,335±0,061 0,412±0,016

Карбодиимидным методом 4,123±0,058 0,430±0,017

Адсорбционным методом 4,098±0,057 0,456±0,018

Термодинамические характеристики сорбции PAL на поверхности изучали расчетом предельной сорбции на магнитном носителе (для температур 5, 24 и 45°С) из уравнения Ленгмюра в прямолинейной форме. По полученным константам сорбции вычислили величины изменения энтальпии (АН) и изобарно-изотермического потенциала (AG) сорбционного процесса. Результаты представлены в таблице 15.

Таблица 15 - Основные термодинамические характеристики иммобили-

зации PAL на наночастицы Fe3Q4

Способ иммобилизации Нефункционализи-рованные наночастицы Fe3Ü4 Наночастицы РезС>4, ( зункционализированные

карбодиимидом тиофеновыми группами

Температура, °С 5 5 5

24 24 24

45 45 45

Величина сорбции, мг/г частиц 31,2 123,8 224,5

12,3 76,5 167,9

2,6 44,0 119,8

Константа сорбции, 10° 530,12 786,56 956,4

327,81 504,7 665,7

210,73 423,7 325,8

ДН, кДж/моль 23,91 55,4 70,9

Дв, кДж/моль 53,84 22,8 -35,4

17,08 17,7 -45,3

13,68 11,0 -73,5

ДЭ, Дж/моль-К 62,28 86,5 112,4

33,61 53,4 69,7

31,84 48,1 34,3

Динамика активности нативной и иммобилизованной PAL в процессе хранения отражена в таблице 16. Полученные данные свидетельствует о том, что иммобилизованная PAL в течение длительного времени сохраняет более высокую активность, чем нативная. За 8 мес хранения при 4°С или 6°С в 0,15 моль трис-HCI буфере (рН 8,8) нативная PAL теряет 50% своей активности, то-

гда как иммобилизованная химическими способами сохраняет практически первоначальный уровень активности фермента (не менее 69%).

Таблица 16 - Активность нативной и иммобилизованной PAL в процессе хранения (Е/мг белка) _

Способ иммобилизации Продолжительность хранения, мес

0 3 4 6 8

Нативный фермент 3,00±0,12 2,77±0,11 2,13±0,08 1,88±0,07 1,45±0,0б

Адсорбционный 1,62±0,07 1,44±0,06 1,35±0,05 1,23±0,05 1,12±0,05

Тиофенового ацетилирования 2,82±0,11 2,78±0,11 2,76±0,11 2,74±0,11 2,71 ±0,11

Карбодиимидный 2,28±0,09 2,16±0,09 2,08±0,08 1,99±0,08 1,94±0,08

Лучшие качества показала PAL, иммобилизованная на наночастицы оксида железа методом тиофенового ацетилирования.

Глава 7. Разработка технологии лиофилизации PAL. Для определения рационального режима лиофилизации PAL изучали ее теплофизические свойства. Результаты представлены в таблице 17. Теплофизические характеристики PAL в значительной степени определяются содержанием и состоянием в ней влаги. Теплопроводность фермента при замораживании возрастает приблизительно в 4 раза и составляет 2,18 Вт/(м-К). При обезвоживании теплопроводность сухого препарата увеличивается приблизительно в 6 раз и составляет 3,36 Вт/(м'К). Теплоемкость при замораживании уменьшается приблизительно в 2 раза и составляет 1979 Дж/(кг-К), при обезвоживании уменьшается незначительно. Температуропроводность при замораживании препарата возрастает в 9 раз, а при обезвоживании увеличивается только на 20% и составляет 11,97 и 14,94 м2/с, соответственно.

Состояние Температуропроводность, м2/с (±5%) Теплопроводность, Вт/(м-К) (±5%) Плотность, кг/м3 (±2%) Массовая теплоемкость, Дж/(кг-К) (±5%)

Жидкий препарат (г = 18±1° С) 1,37 0,56 1013 4166

Замороженный препарат (г = -24±1° С) 11,97 2,18 920 1979

Сухой препарат (1 = 20±1° С) 14,94 3,36 1192 1888

Изучали влияние замораживания на сохранение активность PAL (таблица 18). Установили, что при однократном цикле замораживания - размораживания потери активности фермента составили 12 %.

Изучено влияние растворителей (трис-HCl, трегалоза 0,5%, поливилил-пирролидон 0,5%) в процессе замораживания на активность PAL (таблица 19).

Таблица 18 - Влияние замораживания на активность PAL

Состояние Удельная активность, Е/мг Потери активности, %

До замораживания 3,00±0,15 0

После размораживания 2,64±0,12 12±0,6

Наилучшим стабилизатором активности PAL при лиофилизации является 0,5%-ный раствор D-трегалозы, который не приводит к потере активности фермента.

Таблица 19 - Влияние растворителей на активность PAL в процессе

замораживания

Образец Удельная активность, Е/мг белка Потеря активности, %

До сушки (контроль) 2,99±0,15 0

Трис-НС1 2,58±0,12 13,80±0,11

Трегалоза 0,5% 3,00±0,16 0

Поливилилпирролидон 0,5% 2,83±0,15 5,30±0,26

Исследовали зависимость криоскопической температуры фермента от концентрации белка в препарате (рисунок 14). При изменении концентрации белка в препарате от 3,5 до 7,5 мг/см3 его криоскопическая температура изменяется на 0,3-0,6°С; от 7,5 до 11,5 мг/см3- 0,6-1,3°С.

а и

И о

К

S S.

8 I

I 1

и н

-з

i 2

К ' р-г".

-------- 1

г '

<

■г'

■

Рисунок 14 - Зависимость криоскопической температуры PAL от концентрации белка: 1 - расчетное значение; 2 - эксперимент

3,5

6,5

9,5

Концентрация белка, мг/см

Исследовано влияние уровня стабилизации температуры высохшего слоя на продолжительность лиофилизации. Установлено, что с повышением уровня стабилизации температуры высохшего слоя увеличивается количество влаги, удаленной в период лиофилизации, и уменьшается количество влаги, удаленной в период прогрева (рисунок 15). Температура, равная 20-40°С, является рекомендованной для организации процесса сушки PAL, поскольку интенсифицируется удаление влаги ферментного препарата и сокращается продолжительность сушки.

Продолжительность лиофильной сушки PAL осуществляли при различных значениях температуры сушки: 20±1°С, 30±1°С и 40±1°С (рисунок 16).

Выбрана продолжительность лиофильной сушки фермента 6 ч при температуре 20±1°С, поскольку повышение температуры сушки фермента от 20±1 до 40±1°С приводит к увеличению ее продолжительности более чем на 10 ч.

О 36 12

1« 180 216 252 '283 Г<А 333 УЛ

и

о «

&

С S а> Н

i

✓ 2

/ i 3

! / / Л

] / (

1 / /

/ / /

Рисунок 15 - Зависимость температуры высохшего слоя PAL от температуры сушки: 1-40±ГС;

2 - 30±1°С;

3 - 20±1°С

Продолжительность сушки, мин

18

15

Й 12

я 1=1 о Ч о п, С

Рисунок 16 - Продолжительность лиофильной сушки PAL в зависимости от температуры сушки 'Ш - температура сушки 20±1°С; □ — температура сушки 30±1°С; зи - температура сушки 40±1°С

20 30 40

Температура сушки, °С

Таким образом, определены оптимальные параметры процесса лиофилизации ферментного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы: продолжительность процесса - б ч; плотность теплового потока - 9,2 кВт/м2; остаточное давление -250±10 Па. Установили, что наилучшим стабилизатором активности PAL при лиофилизации обладает 0,5%-ный раствор D-трегалозы.

Глава 8. Разработка технологии получения специализированных молочных продуктов и практическая реализация результатов исследований.

Проведенный цикл комплексных экспериментальных и теоретических исследований послужил предпосылкой для создания новых видов специализированных продуктов питания с использованием L-фенилаланин-аммоний-лиазы. Технология включает в себя ферментативную обработку молочного сырья энзиматической системой, состоящей из эндо- и экзопептидаз с целью максимального удаления фенилаланина из полипептидной цепи с последующей биотехнологической обработкой L-фенилаланин-аммоний-лиазой, обеспечивающей биотрансформацию фенилаланина в соединения, не оказывающие токсического действия на организм больного, и, тем самым, уменьшение его содержания в молочном эквиваленте до

0,001%. Данный молочный эквивалент может быть основной для создания целого ряда специализированных молочных продуктов для больных фенилкетонурией (молочных, белковых и пр.). Технологические принципы получения белкового эквивалента продукта, предназначенного для лечения больных фенилкетонурией, легли в основу ряда патентов и других документов.

Основные научно-технические разработки, полученные при выполнении работы, показаны в таблице 20.

Таблица 20 - Научно-технические разработки, полученные при выполнении работы

№ п/п Вид документа Наименование документа Номер документа и дата Место и дата внедре-ниия

Специализированные продукты

1 Патент РФ Способ получения белкового эквивалента продукта, предназначенного для лечения больных фенилкетонурией 2376893 от 27.12.2009 ООО «Биотек», 11.05.2012 г.

2 Патент РФ Биологически активный пептид, полученный из молочного белка 2415943 от 10.04.2011 ООО «Биотек», 20.09.2013 г.

3 Патент РФ Способ получения поверхно-стно-моди фицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ 2425879 от 10.08.2011 ООО «Биотек», 16.01.2012 г.

4 Патент РФ Способ производства мультиферментного препарата 2437935 от 27.12.2011 ООО «Инновационно-исследовательский центр», 05.07.2012 г.

5 Патент РФ Способ иммобилизации Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах 2460790 от 10.09.2012 ClusterNanoTech LTD (Англия), лицензионный договор №4/13 от 20.12.2013 г.

6 Технические условия Технология производства белковых продуктов для больных фенилкетонурией: Фелинфри 9197-145020683152012 от 28.01.2013 ClusterNanoTech LTD (Англия), 20.12.2013 г.

7 Технологическая инструкция Технология производства белковых продуктов для больных фенилкетонурией: Фелинфри 9197-145020683152012 от 28.01.2013 ClusterNanoTech LTD (Англия), 20.12.2013 г.

Ферментный препарат

8 Технические условия Производство Ь-фенилаланин-аммоний- лиазы 9291-14402068315-2011 от 27.07.2011 ClusterNanoTech LTD (Англия), 20.12.2013 г.

9 Технологическая инструкция Производство Ь-фенилаланин-аммоний- лиазы 9291-14402068315-2011 от 27.07.2011 ClusterNanoTech LTD (Англия), 20.12.2013 г.

10 УМК по направлению 240700 «Биотехнология» Рабочие программы, курс лекций, лабораторные работы ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности», 10.02.2014 г.

И Методика Методика идентификации 01.00114/ Институт молекуляр-

микроорганизмов, обладающих L-фенилаланин-аммоний-лиазной активностью 104-21-12 от 16.09.2013 ной биологии (ИМБ) Национальной академии наук Республики Армения (HAH РА), 10.02.2014 г.

12 Рецептуры Рецептуры питательных сред для культивирования пигментных дрожжей 01.01264/ 212-21-11 от 16.09.2013 Институт молекулярной биологии (ИМБ) Национальной академии наук Республики Армения (HAH РА), 10.02.2014 г.

13 Методики Методики выделения и очистки PAL 01.00106/ 006-21-11 от 10.10.2013 Институт молекулярной биологии (ИМБ) Национальной академии наук Республики Армения (HAH РА), 10.02.2014 г.

14 Методика Методика иммобилизации PAL на наночастицы оксида железа 01.00107/ 007-21-11 от 31.10.2013 ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет», 09.09.2013 г.

15 Методика Методика лиофилизации PAL 01.00108/ 008-21-11 от 05.11.2013 ООО «Хладотехника», 10.02.2014 г.

16 Свидетельство Методика определения коричной кислоты и ее солей методом капиллярного электрофореза в алкогольных и газированных безалкогольных напитках, гидролизатах молочных белков 01.00225/ 205-21-11 от 19.04.2011 ClusterNanoTech LTD (Англия), 20.12.2013 г.

17 Свидетельство Программа моделирования периодического процесса культивирования пигментных дрожжей 2014611451 от 03.02.2014 г. Институт молекулярной биологии (ИМБ) Национальной академии наук Республики Армения (HAH РА), ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности», 10.02.2014 г.

Основная часть технологических разработок прошла апробацию на предприятиях биотехнологической и пищевой промышленности: в Институте молекулярной биологии (ИМБ) Национальной академии наук Республики Армения (HAH РА), ЗАО «Хладотехника», ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» и внедрены в производство в Англии (ClusterNanoTech LTD) путем трансфера технологий в рамках лицензионного договора №4/13 от 20.12.2013 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. На основании анализа результатов собственных исследований разработана биотехнология специализированных молочных продуктов с использованием L-фенилаланин-аммоний-лиазы, сущность которой заключается в ферментативной обработке молочного сырья энзиматической системой, состоящей из эндо- и экзопептидаз с целью максимального удаления фенилаланина из полипептидной цепи с последующей биотехнологической обработкой L-фенилаланин-аммоний-лиазой, обеспечивающей биотрансформацию фенилаланина в соединения, не оказывающие токсического действия на организм больного, и, тем самым, уменьшение его содержания в молочном эквиваленте до 0,001%. Раскрыты технологические параметры получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы и специализированных продуктов на ее основе, исследованы биотехнологические процессы, обеспечивающие формирование их органолеп-тических, физико-химических и микробиологических показателей.

2. Разработана технология получения направленных гидролизатов белков молочной сыворотки, предназначенных для получения продуктов для больных фе-нилкетонурией. Подобрана энзиматическая система: алкалаза, карбоксипептидаза А, лейцинаминопегггидаза в соотношении 1:1:1, обеспечивающая максимальное удаление фенилаланина из полипептидной цепи белков молочной сыворотки. Подобраны оптимальные параметры процесса гидролиза: температура 50±1°С, продолжительность 90 мин, соотношение фермент-субстрат 1:25, рН среды 7,00±0,01.

3. Разработана стратегия скрининга пигментных дрожжей, отличающихся высоким уровнем синтеза PAL, и проведено филогенетическое позиционирование выбранных штаммов-продуцентов L-фенилаланин-аммоний-лиазы. Создана ПЦР-тест система для идентификации гена pal пигментных дрожжей. Выбраны следующие универсальные праймеры: прямой Ral2F (5'- CCGAYAACCCYCTSATMGA-3' и обратный праймер RalR (5— ATGCCCTCGTCGTCCTTGACCTTGA-3'. Установлены оптимальные параметры проведения процесса амплификации: 95±1°С, 60±1 с, 30 циклов (95±1°С, 30±1 е.; 64±1°С, 30 с; 72±1°С; 60±1 с).

4. Проведено прямое секвенирование ПЦР-фрагментов исследуемых штаммов. Установлено, что штаммы Aureobasidium pullulans Y863, Bullera alba Y1581, В. piricola Y1577, Candida glabrata Y2813, C. maltosa Y242, Cryptococcus laurentii Y227, Cr.macerans Y2763, Cystofilobasidium capitatum Y1852, Debaryo-myces castellii Y968, D. robertsiae Y3392, Dioszegia hungarica Y3208, D.sp. Y3320, Geotrichum klebahnii Y3053, Phqffia rhodozyma Y1668, Rhodosporidium diobovatum Y1565, Rh. infirmominiatum Y1569, Rhodotorula glutinis Y77, Rh. lactosa Y2770, Rh. rubra Y1193, Saccharomyces cerevisiae Y1127, S. kluyveri Y2559, Sporobolomyces holsaticus Y991 содержат ген pal. Анализ сходства нуклеотид-ных и аминокислотных последовательностей гена pal изучаемых и референтных штаммов из базы данных GenBank для некоторых видов показал 93-97% принадлежность последовательностей к генам pal. Установлено, что клетки выделенных дрожжей имеют круглую, овальную и цилиндрическую форму, размеры «взрослых» клеток - от 1,0 до 8,0 мкм по ширине и достигают 17 мкм в длину у

продолговатых клеток.

Выявлены штаммы, обладающие наибольшей PAL-активностью: Aureoba-sidium pullulons Y863, Rhodosporidium injirmominiatum Y1569, Candida glabrata Y2813, C. maltose Y242, Debaryomyces robertsiae Y3392, Rhodosporidium diobo-vatum Y1565, Rhodotorida lactose Y2770, Saccharomyces cerevisiae Y1127, Tille-tiopsis washingtonensis Y1650, Torulopsis apicola Y566, Tremella foliacea Y1624, Rh. rubra Y1193, Debaryomyces castellii Y968. На основании моделирования процесса биосинтеза PAL пигментными дрожжами сформулированы рекомендации выбора активного продуцента PAL. Показано, что штамм Aureobasidium pullulons Y863 обладает, при прочих равных условиях, большей PAL-активностью по сравнению с другими штаммами продуцентами.

4. Разработана технология получения PAL. Сформирован состав питательной среды: NaCl (0,5%), глюкоза (20%), дрожжевой экстракт (5%), пептон (10%), тирозин (0,2%). Выявлено, что рекомендуемыми параметрами периодического культивирования в ферментёре объёмом 5 дм3 являются: температура 26±1°С, рН 7,0, продолжительность процесса 5 ч, интенсивное перемешивание (100 об/мин) и принудительная подача воздуха (10 дм3/мин). При этом достигается концентрация белка не менее 9,45 г/дм3 и активность L-фенилаланин-аммоний-лиазы не менее 1,61 Е/см3.

5. Разработана методика очистки L-фенилаланин-аммоний-лиазы из клеток Aureobasidium pullulons Y863, включающая дробное осаждение сульфатом аммония и гидрофобную хроматографию. При гидрофобной хроматографии фермент элюируется двумя пиками. 70% фермента эллюируется в первой фракции с удельной активностью 3,0 Е/мг белка, и около 30% фермента с удельной активностью 2,4 Е/мг белка - во второй фракции.

6. Разработана технология получения иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы, включающая следующие стадии: химическая функционализа-ция наночастиц Рез04 тиофеновыми группами; отмывка наночастиц Рез04 от остатков продуктов реакции; высушивание наночастиц Fe304; иммобилизация PAL на функционализированные наночастицы Fe304; высушивание иммобилизованного препарата; хранение и реализация препарата. Технология лиофилиза-ции PAL, обеспечивающая максимальное сохранение ее активности, определяется продолжительностью процесса 6,0±0,1 ч; плотностью теплового потока 9,2 кВт/м2; остаточным давлением 250±10 Па. Установлено, что наилучшим стабилизатором активности PAL при лиофилизации обладает 0,5%-ный раствор D-трегалозы.

8. Сформулированы и экспериментально подтверждены технологические принципы получения специализированных молочных продуктов с использованием L-фенилаланин-аммоний-лиазы, предназначенных для питания больных фе-нилкетонурией. Созданы оригинальные технические решения (новизна подтверждена патентами РФ), которые прошли апробацию на предприятиях отрасли.

Основные публикации по материалам диссертации: Монографии

1. Бабич, О.О. Технология получения биологически активных пептидов из белков молока / О.О. Бабич, О.В. Козлова, И.С. Разумникова. - Кемерово: Кузбассвузиздат, 2011. - 120 с.

2. Бабич, О.О. Биотехнология L-фенилаланин-аммоний-лиазы / 0.0 Бабич-Новосибирск: Наука, 2013. - 199 с.

Статьи, индексируемые в Scopus и Web of Science

3. Prosekov, A.Yu. Determination of cinnamic acid by capillary zone electrophoresis using ion-pair reagents / A.Yu. Prosekov, O.V. Mudrikova, O.O. Babich // Journal of Analytical Chemistry. - 2012,- V.67.- № 5,- C. 474-477.

4. Recombinant L-phenylalanine ammonia lyase from Rhodosporidium toruloides as a potential anticancer agent / O.O. Babich, V.S. Pokrovsky, N.Yu. Anisimova, N.N. Soko-lov, A.Yu. Prosekov // Biotechnology and Applied Biochemistry- 2013 - V.60 - №3-P. 316-322.

5. Babich, O.O. Effect of lyophilization conditions of recombinant L-phenylalanine-ammonia-lyase on enzyme properties / O.O. Babich, L.S. Dyshlyuk, A.Y. Prosekov // Middle-East Journal of Scientific Research.- 2013 - №15 (10).- P. 1455-1459.

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК

6. Биологически активные пептиды из белков молока / О.В. Козлова, И.С. Разумникова, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Молочная промышленность,- №9,- 2010.- С. 68-69.

7. Сухих, С.А. Технология выделения и очистки L-фенилаланин-аммоний-лиазы / С.А. Сухих, О.О. Бабич, JI.C. Солдатова // Достижения науки и техники АПК,- №9,- 2010.- С. 78-80.

8. Бабич, О.О. Биологически активные ферментативные гидролизаты / О.О. Бабич, О.В. Козлова // Молочная промышленность - 2011.— № 12 — С. 71—71.

9. Бабич, О.О. Клонирование и экспрессия гена L-фенилаланин-аммоний-лиазы в Escherichia coli и выделение рекомбинантного белка / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, И.С. Разумникова // Техника и технология пищевых производств,- 2011.- №1С. 8-13.

10. Бабич, О.О. Особенности биотрансформации фенилаланина в технологии продуктов питания для больных фенилкетонурией / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, И.С. Разумникова // Техника и технология пищевых производств — 2011 — №2.-С. 103-109.

11. Бабич, О.О. Клонирование и экспрессия гена pal и характеристика L-фенилаланин-аммоний-лиазы / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, А.Ю. Просеков // Биотехнология - 2011.- №4- С. 31-39.

12. Выделение, очистка и некоторые свойства рекомбинантной L-фенилаланин-

аммоний-лиазы Rhodosporidium tortdoides, экспрессированной в клетках Е. coli / О.О. Бабич, JI.C. Солдатова, И.С. Разумиикова, А.Ю. Просеков // Фундаментальные исследования - 2011№8 - С. 597-602.

13. Бабич, О.О. Сравнительная оценка адсорбционного и глутаральдегидного методов иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на частицах Fe304 / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, А.Ю. Просеков // Фундаментальные исследования,- 2011.- №8,- С. 672-677.

14. Изменение протеолитической активности иммобилизованного фермента хи-мотрипсина в процессе хранения / JI.C. Солдатова, О.О. Бабич, Е.В. Короткая, М.Г. Курбанова // Хранение и переработка сельхозсырья- 2011.— №11.- С.41-43.

15. Бабнч, О.О. Особенности биотрансформации фенилаланина в технологии продуктов питания для больных фенилкетонурией / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, И.С. Разумникова // Техника и технология пищевых производств.- 2011 — Т.21.-№2.-С. 103-108.

16. Просеков, А.Ю. Опыт кафедры «Бионанотехнология» Кемеровского технологического института пищевой промышленности в области биотехнологии получения рекомбинантных ферментных препаратов / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, Л.С. Солдатова // Техника и технология пищевых производств.— 2012 - Т.З.- № 26 - С. 102-111.

17. Просеков, А.Ю. Определение коричной кислоты методом зонного капиллярного электрофореза с использованием ион-парных реагентов / А.Ю. Просеков, О.В. Мудрикова, О.О. Бабич II Журнал аналитической химии - 2012.— Т.67.-№ 5 - С. 531.

18. Бабич, О.О. Оптимизация параметров лиофилизации рекомбинантной L-фенилаланин-аммоний-лиазы / О.О. Бабич, С.А. Сухих, Л.С. Солдатова, А.Ю. Просеков // Технологии живых систем - 2013 - Т. 10 - № 1,- С.028-034.

19. Ферментативный гидролиз молочно-белкового концентрата / О.В. Бессонова, О.О. Бабич, Г.В. Борисова, И.Е. Драгунов // Молочная промышленность-

2012,-№ 12,-С. 55-56.

20. Бабич, О.О. Изучение свойств свободной и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы из Rhodosporidium tortdoides на силохроме С-80 / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук,- 2012.- Т. 14,- № 1,- С. 279-282.

21. Особенности получения иммобилизованного протеолитического фермента на основе наночастиц Рез04 для молочной промышленности / Л.С. Солдатова, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая // Хранение и переработка сельхозсырья.- 2012,- № 8.- С. 47-50.

22. Ostroumov, L.A. Usege of milk production waste for obtaining functional food products for baby and dietetic nutrition / L.A. Ostroumov, A.Y. Prosekov, O.O. Babich, I.S. Milenteva, A.I. Linnik, M.M. Sutormina // European Journal of Natural Histoiy.-

2013,-№ 2,-C. 41-45.

23. Бабич, О.О. Оптимизация параметров лиофилизации рекомбинантной L-фенилаланин-аммоний-лиазы / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, А.Ю. Просеков // Технология живых систем,- 2013 - Т. 10,- №1.- С. 28-34.

24. Особенности ферментативного гидролиза молочного белкового концентрата

эндои экзопептидазами / О.В. Бессонова, О.О. Бабич, Г.В. Борисова, И.Е. Драгунов //Хранение и переработка сельхозсырья-2013-№ 1.-С. 33-35.

25. Остроумов, JI.A. Оценка состава и физико-химических свойств ферментативных гидролизатов казеина / ДА. Остроумов, О.О. Бабич, И.С. Милентьева // Вестник ВСГТУ,- 2013.-№ 1.-С. 82-85.

26. Бабич, О.О. Оптимизация лиофилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы / О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Биомедицинская химия - 2013,- Вып.6 - Т.59-Стр. 682-692.

27. Бабич, О.О. Очистка целевого белка и иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы оксида железа / О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Нанотехнологии и наноматериалы.- 2013 - №3 - С. 55-59.

28. Бабич, О.О. Моделирование непрерывного биотехнологического процесса получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы / О.О. Бабич, А.Ю. Просеков, Л.С. Солдатова // Известия высших учебных заведений: Серия Химия и химические технологии - 2013 - Т.56 - Вып. 4- С. 106-109.

Научные труды институтов

29. Особенности использования L-тирозин-аммоний-лиазы в технологии продуктов специального назначения / А.В. Дороганова, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Продукты питания и рациональное использование сырьевых ресурсов: сборник научных работ,- Кемерово, 2009 - Выпуск 20 - С. 27-28.

30. Babich, О.О. Expression of recombinant L-phenylalanine ammonia-lyase in Escherichia coli / O.O. Babich, L.S. Dushlyuk, I.S. Milent'eva // Foods and Raw Materials.- 2013,- V.I.-№1.-P. 48-53.

31. Babich, O.O. Study of physicochemical and thermal properties of L-phenylalanine ammonia-lyase / O.O. Babich, E.V. Ulrih // Foods and Raw Materials.-2013,-Vol. 1 (№2).-P. 50-56.

32. Antitumor activity of recombinant L-phenylalanine ammonia lyases / O.O. Babich, M.V. Novoselova, V.S. Pokrovsky, N.Yu. Anisimova, N.N. Sokolov, A.Yu. Prosekov // Biological Journal of Armenia.- 2013,- V.l (65).- P. 47-49.

33. Investigation of Itf gene expression in periplasm of e.coli cells 118 / M. Novoselova, O. Babich, L. Dyshlyuk, A. Prosekov // Biological Journal of Armenia.-2013,-V.l (65).-P. 118-119.

Материалы зарубежных симпозиумов, конгрессов, конференций

34. Солдатова, Л.С. Свойства L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах Fe304 / Л.С. Солдатова, О.О. Бабич // Международная научная студенческая конференция 2011: сборник научных работ.- Новосибирск, 2011.-С. 95.

35. Babich, О.О. Receiving L- phenylalanine-ammonia-lyase from cell E. coli and study its catalytic activity / O.O. Babich, M.V. Novoselova, A.J. Prosekov // Science, Technology and Higher Education: materials of the international research and practice conference - Westwood, 2012 - P. 335-338.

36. Babich, O.O. The Selection of L-phenylalanine ammonia-lyase lyophilization parameters / O.O. Babich, A.J. Prosekov, M.V. Novoselova // European Applied Sciences: modern approaches in scientific researche: 3rd International scientific conference.- Hamburg, 2013.- P. 8-9.

37. Optimization of freeze starters for direct inoculation parameters / A.Y. Prosekov, O.O. Babich, S.A. Suhih, S.J. Noskova // European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches: 4rd International scientific conference." Hamburg, 2013,-P. 142-143.

38. Babich, O.O. The main aspects of immobilization of L-phenylalanine ammonia-lyase on iron oxide nanoparticles I O.O. Babich, L.S. Dyshljuk, A.Y. Prosekov // European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches: 4rd International scientific conference-Hamburg, 2013 - P. 77-78.

39. Babich, O.O. Peculiarities of the recombinant enzyme L-phenylalanine ammonia-lyase / O.O. Babich // Applied Sciences and technologies in the United States and Europe: common challenges and scientific findings: Papers of the 1st International Scientific Conference.- New York, 2013 - P.175-176.

40. Babich, O.O. Development of chromatographic system for allocation and cleaning of L-phenylalanine ammonia-lyase received by genetic engineering / O.O. Babich, L.S. Dyshljuk, A.Y. Prosekov // Research Journal of International Studies.* 2013,- №6(13).- P.24-26.

41. Babich, O.O. Designing of L-phenylalanine-ammonia-lyase strain-producer on the basis of cells Escherichia coli / O.O. Babich, A.Y. Prosekov // Theoretical & Applied Science «World of Science»: materials of the International Scientific Practical Conference - Hamburg - 2013 - P.65-68.

42. Babich, O.O. The main aspects of immobilization of L-phenylalanine ammonia-lyase on iron oxide nanoparticles / O.O. Babich, L.S. Dyshljuk, A.Y. Prosekov // European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches, proceedings of the 4th International scientific conference.- Stuttgart: ORT Publishing - 2013 - P. 77-78.

Материалы российских симпозиумов, конгрессов, конференций

43. Разработка технологии иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на ферромагнитные наночастицы / JI.C. Солдатова, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи - Белгород - 2009,- С. 7-8.

44. Нанокомпозитный материал для иммобилизации и фракционирования ферментов в биотехнологии / JI.C. Солдатова, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Наукоемкие технические технологии-2009: сборник тезисов докладов III Молодежной научно-технической конференции,- Москва, 2009- С. 84.

45. Солдатова, JI.C. Особенности получения нанокомпозитных материалов для иммобилизации и фракционирования биологических веществ в молекулярной биологии, генной инженерии и пищевой промышленности / JI.C. Солдатова, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Второй международный конкурс работ молодых ученых в области нанотехнологий: сборник тезисов докладов участников.— Москва, 2009.-С. 810-811.

46. Метод Дюма как способ контроля концентрации белка при получении иммобилизованных ферментов для молочной промышленности / Л.С. Солдато-ва, О.О. Бабич, A.B. Крупин // Инструментальные методы для исследования живых систем в пищевых производствах: материалы всероссийской конференции с элементами научной школы - Кемерово, 2009,- С. 83-86.

47. Солдатова, Л.С. Применение поверхностно-модифицированных наночастиц РезОд для иммобилизации биомолекул / Л.С. Солдатова, О.В. Мудрикова, О.О. Бабич, Н.С. Величкович // IX Конференция молодых ученых «Актуальные проблемы современной неорганической химии и материаловедения: нанохимия, наноматериалы и нанотехнологии: тезисы докладов - Звенигород, 2009- С. 50.

48. Бабич, О.О. Особенности экспрессии гена L-фенилаланин-аммоний-лиазы Rhodosporidium toruloides в клетках Е. coli / О.О. Бабич, И.С. Разумникова, А.Ю. Просеков // Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности: сборник трудов десятой международной научно-практической конференции - Санкт-Петербург, 2010 - С. 27-28.

49. Получение L-фенилаланин-аммоний-лиазы с целью разработки технологии продуктов питания для больных фенилкетонурией / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, А.Ю. Просеков // Современная наука: теория и практика: сборник научных работ - Ставрополь, 2010.- С. 403—406.

50. Особенности получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы Rhodosporidium toruloides в клетках Е. coli / О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Научно-практические аспекты развития современной техники и технологий в условиях курса на инновации: сборник трудов I всероссийской научно-практической (заочной) конференции.- М.: Издательско-полиграфический комплекс НИИРРР, 2010,-С. 6-8.

51. Бабич О.О. Разработка технологии очистки рекомбинантной L-фенилаланин-аммоний-лиазы // Наука и современность - 2011: Наука и современность - 2011: сборник докладов VIII международной научно-практической конференции.- Новосибирск: Издательство НГТУ.- 2010 — С. 17-21.

52. Бабич, О.О.Разработка технологии получение L-фенилаланин-аммоний-лиазы и изучение возможности ее использования в технологии продуктов питания для больных фенилкетонурией / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, И.С. Разумникова // Инновационность и многоуровневый менеджмент в современном Российском обществе: всероссийская научно-практическая конференция - Волгоград, 2011,-С. 304-307.

53. Бабич, О.О. Выбор оптимальных значений лиофилизации ферментного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы / О.О. Бабич // Наука в современном мире: материалы VIII международной научно-практической конференции - М.: Издательство «Перо», 2011.- 26-28.

54. Бабич, О.О. Определение каталитической активности фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы, полученной для производствапродуктов питания больных фенилкетонурией / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, С.А. Сухих // Молодежная наука - пищевой промышленности: материалы II международной научной конференции.- СевКавГТУ, 2011.- С. 4-7.

55. Бабич, О.О. Изучение влияния температуры лиофилизации на свойства L-фенилаланин-аммоний-лиазы / О.О. Бабич, И.С. Разумникова // Современное состояние естественных и технических наук: материалы II международной научно-практической конференции.- Москва, 2011- С. 18-20.

56. Бабич, О.О. Изучение стабильности фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы в процессе замораживания и оттаивания / О.О. Бабич, С.А. Сухих, И.С. Разумникова // Современное состояние естественных технических наук: материалы II Международной научно-практической конференции.- Москва, 2011.- С. 21-23.

57. Бабич, О.О. Особенности лиофилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы // Современные достижения биотехнологии» и международного научно-практического семинара Феномен молочной сыворотки: синтез науки, теории и практики: сборник материалов международной научно-технической конференции- Ч. 2.- Москва, 2011.- С. 4-5.

58. Бабич, О.О. Основные этапы экспрессии L-фенилаланин-аммоний-лиазы Rhodosporidium toridoides в клетках Е. coli II Современное состояние естественных и технических наук: материалы III Межднародной научно-практической конференции.- М.: Издательство «Спутник+», 2011С. 24—26.

59. Бабич, О.О. Основные принципы очистки рекомбинантной L-фенилаланин-аммоний-лиазы // Актуальные вопросы современной науки: материалы XII Международной научно-практической конференции.- М.: Издательство «Спутник +», 2011- С.160-163.

60. Измерение активности L-фенилаланин-аммоний-лиазы, выделенной из Rhodosporidium toridoides с целью создания функциональных и специализированных продуктов питания / О.О. Бабич, И.С. Разумникова, С.А. Сухих, Ю.С. Малова // Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности: материалы 4-й всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием,- Бийск, 2011,- С. 258-261.

61. Бабич, О.О. Основные принципы измерения каталитической активности L-фенилаланин-аммоний-лиазы, выделенной методом клонирования // Актуальные проблемы естественных наук: материалы международной заочной научно-практической конференции - Новосибирск, 2011.- С. 7-10.

62. Измерение активности L-фенилаланин-аммоний-лиазы, выделенной из Rhodosporidium toruloides с целью применения ее в пищевой промышленности для создания функциональных и специализированных продуктов питания / О.О. Бабич, И.С. Разумникова, С.А. Сухих, Ю.С. Малова // Материалы 4-ой всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием - Бийск: Издательство Алтайского государственного технического университета, 2011- С. 258-261.

Патенты РФ

63. Патент № 2376893 РФ, МПК A23L 1/305. Способ получения белкового эквивалента продукта, предназначенного для лечения больных фенилкетонурией /

А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, J1.A. Остроумов; патентообладатели - А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, JT.A. Остроумов; заявл. 04.06.2008; опубл. 27.12.2009 - Бюл. №36.

64. Патент № 2415943 РФ. Биологически активный пептид, полученный из молочного белка / О.В. Козлова, И.С. Разумникова, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков, М.Г. Курбанова; патентообладатели - О.В. Козлова, И.С. Разумникова, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков, М.Г. Курбанова, заявл. 16.02.2010; опубл. 10.04.2011,-Бюл. №10.

65. Патент № 2425879 РФ. Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, JI.C. Солдатова; заявитель и патентообладатель Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, заявл. 16.02.2010; опубл. 10.08.2011 г.-Бюл. №16.

66. Патент № 2437935 РФ. Способ производства мультиферментного препарата / A.B. Крупин, О.О. Бабич, С.А. Сухих, А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая; заявитель и патентообладатель ООО «Инновационно-исследовательский центр», заявл. 10.09.2009; опубл. 27.12.2011 г.- Бюл. №36.

67. Патент № 2460790 РФ. Способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, Л.С. Солдатова; заявитель и патентообладатель Кемеровский технологический институт пищевой промышленности; заявл. 06.07.2010; опубл. 10.09.2012-Бюл. №25.

Отчеты по НИОКР

76. Молекулярное клонирование и экспрессия гена pal, обеспечивающего биотрансформацию фенилаланина с целью разработки технологии получения продуктов питания для лечения больных фенилкетонурией / С.А. Сухих, О.О. Бабич // Научно-технический отчет №02201050595 по государственному контракту №П1701,- Кемерово, 2009.- 46 с.

77. Молекулярное клонирование и экспрессия гена pal, обеспечивающего биотрансформацию фенилаланина с целью разработки технологии получения продуктов питания для лечения больных фенилкетонурией / С.А. Сухих, О.О. Бабич // Научно-технический отчет №02201056337 по государственному контракту №П1701,-Кемерово, 2010.- 81 с.

78. Разработка технологии получения продуктов питания для больных наследственными нарушениями аминокислотного обмена / И.С. Разумникова, О.О. Бабич // Научно-технический отчет №02201056857 по государственному контракту № 16.740.11.0239.- Кемерово, 2010,- 81 с.

79. Разработка альтернативных подходов получения продуктов для больных наследственными нарушениями аминокислотного обмена с использованием методов биоинформатики и математического моделирования / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, И.С. Милентьева, С.А. Сухих // Научно-технический отчет №02201356197 по соглашению №14.В37.21.0565. - Кемерово, 2012. -114 с.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

pal - ген L-фенилаланин-аммоний-лиазы PAL - фермент L-фенилаланин-аммоний-лиаза X □ концентрация биомассы, г/дм3 Р □ концентрация PAL, г/дм3 t □ продолжительность, ч

,и □ удельная скорость роста по модели Людекинга-Пайри, ч'1

а □ константа растущих ассоциатов по модели Людекинга-Пайри, г/г

р □ константа нерастущих ассоциатов по модели Людекинга-Пайри, г/(г-ч)

Птах - максимальная удельная скорость роста, ч'1

K¡ — константа ингибирования PAL, г/дм3

S - концентрация фенилаланина, г/дм3

Рт - максимальная концентрация PAL, г/дм3

Ks— константа лимитирования фенилаланина, г/дм3

D — скорость разбавления, ч"1

S/— концентрация фенилаланина в поступающем потоке, г/дм3

Ътах - максимальная удельная скорость утилизации фенилаланина, г/(г-ч)

P¡ - предельная концентрация PAL, г/дм3

Чртах - максимальная удельная скорость производства PAL, г/(г-ч)

Qp - продуктивность, г/(дм3-ч)

Км~ константа Михаэлиса, ммоль

Vmax- максимальная скорость реакции, моль / (мин-см3)

ДН - изменение энтальпии, кДж/моль

AG — изменение изобарно-изотермического потенциала, кДж/моль AS - изменение энтропии, Дж/моль-К Г - величина сорбции, мг/г частиц К - константа сорбции, 10'3

Подписано в печать 26.02.2014. Формат 60x86/16. Тираж 120 экз. Объем 2,5 п.л. Заказ № 20 Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. 650056, г. Кемерово, б-р Строителен, 47. Отпечатано в лаборатории множительной техники Кемеровского технологического института пищевой промышленности

650002, г. Кемерово, ул. Институтская, 7 _

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»

(ФГБОУ ВПО КемТИПП)

05201450868 На правах рукописи

Бабич Ольга Олеговна

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЙ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Ь-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ

05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов

и холодильных производств 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора технических наук

Научный консультант:

Лауреат премии Правительства РФ в области науки и техники, доктор технических наук, профессор Просеков Александр Юрьевич

Кемерово 2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................... 6

ГЛАВА 1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР............................................. 14

#

1.1 Особенности строения и свойства L-фенилаланин-аммоний-лиазы......... 14

1.2 Научные и практические аспекты получения

L-фенилаланин-аммоний-лиазы..........................................................27

1.3 Прикладное использование L-фенилаланин-аммоний-лиазы..................69

1.4 Обоснование основных направлений исследований, их цель и задачи......77

ГЛАВА 2 ОРГАНИЗАЦИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ................................................ 80

é

2.1 Организация выполнения работы......................................................... 80

2.2 Объекты исследований........................................................................... 84

2.3 Используемое оборудование....................................................... 89

2.4 Методы проведения исследований........................................................... 90

ГЛАВА 3 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НАПРАВЛЕННЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ БЕЛКОВ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ........................................................................................................119

щ. 3.1 Выбор ферментов для проведения направленного гидролиза

белков молочной сыворотки............................................................. 119

3.2 Изучение технологических режимов и условий проведения направленного ферментативного гидролиза белков молочной сыворотки..... 125

3.3 Изучение функциональных свойств направленных гидролизатов

белков молочной сыворотки...............................................................140

3.4 Заключение по третьей главе.........................................................145

ГЛАВА 4 СКРИНИНГ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПИГМЕНТНЫХ

# ДРОЖЖЕЙ, ПРОДУЦИРУЮЩИХ L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗУ, И ИХ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ

ХАРАКТЕРИСТИКИ..................................................................... 149

4.1 Разработка ПЦР-системы для идентификации гена pal пигментных

дрожжей...................................................................................... 149

4.2 Анализ нуклеотидного состава гена pal у выбранных штаммов дрожжей 154

4.3 Изучение фенотипических особенностей и биохимических свойств

щ выбранных культур........................................................................ 162

4.4 Выбор штамма суперпродуцента L-фенилаланин-аммоний-лиазы........... 165

4.5 Заключение по четвертой главе.............................................................. 186

ГЛАВА 5 МОДЕЛИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ.........................................190

5.1 Подбор компонентов и оптимизация питательной среды для культивирования Aureobasidium pullulans Y863...................................... 190

5.2 Исследование влияния параметров культивирования пигментных дрожжей на качественные показатели продукта биосинтеза..................... 203

5.3 Разработка технологии выделения и очистки L-фенилаланин-аммоний-лиазы..........................................................................219

5.4 Заключение по пятой главе.................................................................... 225

ГЛАВА 6 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ НА НАНОЧАСТИЦЫ.........227

# 6.1 Сравнительная характеристика химического состава и физических

свойств частиц оксида железа Fe203 и Fe304............................................................ 228

6.2 Оптимизация концентраций конденсирующих агентов, используемых при иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на частицы Fe203, функционализированные тиофеновыми и сложноэфирными группами...... 236

6.3 Изучение физико-химических свойств нативной и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы..........................................................239

6.4 Технологическая схема получения иммобилизованной

^ L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы Fe304............................ 251

6.5 Заключение по шестой главе..........................................................253

ГЛАВА 7 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ЛИОФИЛИЗАЦИИ Ь-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ.........................................255

7.1 Изучение теплофизических характеристик Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы..........................................................256

7.2 Исследование влияния процесса замораживания на активность Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы..........................................................258

7.3 Определение криоскопических температур L-фенилаланин-аммоний-лиазы..........................................................260

^^'Моделирование процессов кристаллизации влаги при замораживании ферментного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы............................262

7.5 Изучение влияния параметров лиофилизации на ее продолжительность... 270

7.6 Изучение кинетики процесса лиофильной сушки

L-фенилаланин-аммоний-лиазы..........................................................278

7.7 Заключение по седьмой главе..................................................................285

ГЛАВА 8 ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ................................................ 288

8.1 Способ получения белкового эквивалента продукта, предназначенного... для лечения больных фенилкетонурией................................................ 288

8.2 Способ выделения и очистки фермента............................................290

8.3 Способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах................................................................................ 293

8.4 Способ лиофилизации фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы..... .... 296

8.5 Ферментный препарат L-фенилаланин-аммоний лиаза..................... 297

8.6 Оценка цитотоксичности L-фенилаланин-аммоний-лиазы Aureobasidium pullulans Y863 in vitro............................................................................... 301

8.7 Заключение по восьмой главе.......................................................... 303

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................... 305

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 3 08 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................. 310

ПРИЛОЖЕНИЯ........................................................................................... 356

Приложение А. Нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов

штаммов микроорганизмов................................................................357

Приложение Б. Копии государственных контактов и соглашений на

выполнение научно-исследовательских работ по теме диссертации..............363

Приложение В. Документы на ферментный препарат

~«Фенилаланин-аммоний-лиаза»...........................................................440

Приложение Г. Патенты на изобретения................................................441

Приложение Д. Нормативная документация (ТУ, ТИ)..............................446

Приложение Е. Экспертное заключение на технические условия

«Ферментный препарат Ь-фенилаланин-аммоний лиаза»........................ 450

Приложение Ж. Методики проведения исследовательских работ................451

Приложение К. Акт результатов испытаний оксида железа - носителя для

иммобилизации ферментов................................................................456

Приложение Л. Акт апробации иммобилизованного препарата

Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы...........................................................459

Приложение М. Акты внедрения результатов НИР в производство............. 461

Приложение Н. Акт внедрения результатов научно-исследовательской

работы в производственный процесс....................................................467

Приложение П. Акт внедрения НИР в образовательный процесс................ 468

Приложение Р. Акт внедрения результатов НИР в образовательный процесс 469

Приложение С. Свидетельство об аттестации методики измерений............. 470

Приложение Т. Свидетельство о государственной регистрации программы

для ЭВМ.......................................................................................471

Приложение У. Лицензионный договор................................................472

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Промышленное производство продуктов специализированного питания жизненно необходимо больным в критических и хронических состояниях, в т.ч. при нарушении функции пищеварения. Основу таких продуктов, как правило, составляют гидролизаты белков с различной степенью гидролиза, зачастую являясь единственно возможным средством при терапевтическом воздействии, обеспечивающем полноценное развитие детей и жизнедеятельность взрослых с различной патологией.

К таким патологиям относится фенилкетонурия - наследственное заболевание, вызванное нарушением перехода фенилаланина (незаменимой аминокислоты) в тирозин и приводящее к задержке психического развития и тяжелым поражениям центральной нервной системы.

Количество фенилаланина в питании таких больных должно быть строго нормировано с учетом возраста больного, что, как правило, достигается потреблением специализированных продуктов. Одним из направлений получения таких продуктов является использование L-фенилаланин-аммоний-лиазы (PAL) (КФ 4.3.1.5), которая катализирует реакцию обратимого дезаминирования L-фенилаланина до безопасных для организма соединений: транс-коричной кислоты и аммиака.

PAL является ключевым продуктом метаболизма фенилпропаноидов в растениях и грибах, где вовлечена в биосинтез вторичных метаболитов (флавонои-дов, фуранокумаринов, компонентов клеточный стенки) и существует в виде множественных изоформ. Она обнаружена в активной форме в водорослях, акти-номицетах, 12 видах базидиомицетов, разрушающих древесину. Среди микроорганизмов, обладающих PAL-активностью, известны некоторые штаммы красных дрожжей Rhodotorula, Rhodosporidium и Sporobolomyces и два представителя ак-тиномицетов - продуцентов митомицина.

Данный фермент находит применение и как самостоятельный продукт в терапии и/или диагностике больных фенилкетонурией и как вспомогательный продукт в производстве продуктов питания специального назначения, а также в биотехнологическом производстве L-фенилаланина из транс-коричной кислоты, для подавления роста злокачественных клеток, стимулирования роста растений и т.д.

Все вышесказанное подтверждает актуальность работы.

Степень разработанности. Существенный вклад в создание и освоение технологии получения специализированных продуктов питания внесли Г.Б. Гаврилов, Н.Б. Гаврилова, В.И. Ганина, Н.И. Дунченко, И.А. Евдокимов, В.И. Круглик, К.С. Ладодо, Л.А. Остроумов, А.Н. Петров, В.О. Попов, Г.Ю. Сажинов, В.А. Тутельян, В.Д. Харитонов, И.С. Хамагаева, А.Г. Храмцов; ферментного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы - В.И. Муштаев, М. Jason Mac Donald, H. Orum, O.F. Rasmussen.

Разработка новых и усовершенствование существующих технологий получения ферментного препарата PAL требует нахождения новых, более интенсивных источников его сверхсинтеза, что невозможно без изучения генетических особенностей уже известных продуцентов. В базах данных генетических последовательностей (EMBL и GeneBank) обнаружено только 26 последовательностей генома микроорганизмов, обладающих PAL-активностью. Поэтому актуальны поиск микроорганизмов, обладающих L-фенилаланин-аммоний-лиазной активностью, на основе анализа генетических последовательностей их генома, разработка технологий получения и использования L-фенилаланин-аммоний-лиазы в производстве специализированных молочных продуктов.

Отдельные этапы работы выполнены в рамках:

- ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме «Молекулярное клонирование и экспрессия гена pal, обеспечивающего биотрансформацию фенилаланина с целью разработки технологии получения продуктов питания для лечения больных фенилкетонурией», государственный контракт № П1701;

- ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме «Разработка технологии получения продуктов питания для больных наследственными нарушениями аминокислотного обмена», государственный контракт № 16.740.11.0239;

- ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме «Разработка альтернативных подходов получения продуктов для больных наследственными нарушениями аминокислотного обмена с использованием методов биоинформатики и математического моделирования», соглашение № 14.В37.21.0565;

и при финансовой поддержке:

- гранта Президента Российской Федерации МД-48.2009.4, договор №02.120.11.48-МД по теме «Биохимический и геномный анализ экспрессии гена pal с целью получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы в связи с созданием продуктов питания для больных фенилкетонурией»;

- аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 года)», задание № 2.1.2/3566 по теме «Разработка биотехнологии получения специфических ферментов, продуцируемых микроорганизмами»;

- Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина (г. Москва, договор № 154/1 от 23.03.2012 г.).

Цель и задачи исследования. Целью работы является развитие существующих и создание новых биотехнологий специализированных молочных продуктов с использованием L-фенилаланин-аммоний-лиазы.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- разработать технологию получения направленных гидролизатов белков молочной сыворотки, предназначенных для производства продуктов питания для больных фенилкетонурией;

- сформировать стратегию скрининга пигментных дрожжей, отличающихся способностью к синтезу L-фенилаланин-аммоний-лиазы, и изучить фенотипиче-

ские особенности и биохимические свойства штаммов-продуцентов L-фенилаланин-аммоний-лиазы;

- разработать технологию получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы, осуществить выбор штамма ее суперпродуцента, подобрать компоненты и оптимизировать состав питательной среды для его культивирования, изучить влияние параметров процесса периодического культивирования выбранного штамма на выход L-фенилаланин-аммоний-лиазы и ее активность, разработать технологию выделения и очистки полученного ферментного препарата;

- разработать технологию иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы и исследовать основные физико-химические, биохимические и каталитические свойства нативной и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы;

- разработать технологию лиофилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы, обеспечивающую максимальное сохранение ее активности в процессе хранения;

- использовать установленные закономерности для разработки технических документов на ферментный препарат и специализированные молочные продукты на его основе, а также внедрения результатов исследования в промышленности, в т.ч. путем трансфера технологий.

Научная новизна. Разработана технология получения целенаправленных гидролизатов белков молочной сыворотки, обеспечивающая максимальное удаление фенилаланина из полипептидной цепи.

Проведен молекулярно-функциональный скрининг группы пигментных дрожжей, из которых выделено 19 новых продуцентов L-фенилаланин-аммоний-лиазы {Aureobasidium pullulans Y863, Bullera alba Y1581, Bullera piricola Y1577, Candida glabrata Y2813, C. maltosa Y242, Cryptococcus laurentii Y227, Cr. macerans Y2763, Cystofûo bas idium capitatum Y1852, Debaryomyces castellii Y968, D. robertsiae Y3392, Dioszegia hungarica Y3208, Dioszegia sp. Y3320, Geotrichum klebahnii Y3053, Phaffia rhodozyma Y1668, Rhodosporidium diobovatum Y1565, Rh. infirmominiatum Y1569, Rh. glutinis Y77, Rh. lactosa Y2770, Rh. rubra Y1193, Sac-charomyces cerevisiae Y1127, 5". kluyveri Y2559, Sporobolomyces holsaticus Y991,

Tilletiopsis washingtonensis Y1650, Torulopsis apícola Y566, Tremella foliacea Y1624, Tr. mesenterica Y1625).

Установлена корреляция между генетической организацией штаммов микроорганизмов и их биосинтезом L-фенилаланин-аммоний-лиазы.

На основе методов случайных процессов, дисперсионного анализа и полного факторного эксперимента исследованы закономерности периодического глубинного культивирования пигментных дрожжей и биосинтеза PAL с использованием модели Людекинга-Пайри, выделен высокоактивный продуцент PAL - штамм Aureobasidium pullulans, для него определен компонентный состав субстрата, теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены режимы ферментации PAL.

Разработаны методики организации биосинтеза, выделения и очистки, иммобилизации на наноносителях и лиофилизации PAL, позволяющие не только получить фермент, превосходящий по качеству существующие аналоги, но и гарантировать его сохранность на протяжении более восьми месяцев.

Исследованы состав, свойства и хранимоспособность новых видов специализированных молочных продуктов с использованием PAL, предназначенных для питания больных фенилкетонурией.

Практическая значимость. На основе теоретических и экспериментальных исследований сформулированы требования к технологическим процессам, связанным с получением продуктов питания для больных фенилкетонурией: параметры и условия гидролиза белков молочной сыворотки, обеспечивающие максимальное удаление фенилаланина из полипептидной цепи; параметры и условия периодического культивирования Aureobasidium pullulans Y863; биосинтеза, выделения и очистки, иммобилизации на наноносители, лиофилизации PAL, направленного гидролиза молочного сырья. Техническая новизна разработанных технологических решений подтверждена патентами РФ № 2376893 «Способ полу