автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Исследование и разработка технологии молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания

На правах рукописи

□и34 ( (

Бабич Ольга Олеговна

ИССЛЕДОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МОЛОЧНОГО БЕЛКОВОГО ЭКВИВАЛЕНТА ДЛЯ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных, рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

7 4 СЕН 2

Кемерово 2009

003477405

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ГОУ ВПО КемТИПП)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Просеков Александр Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Осинцев Алексей Михайлович

кандидат технических наук Сиваков Василий Михайлович

Ведущая организация: ГУ «Ярославский государственный институт

качества сырья и пищевых продуктов»

Защита диссертации состоится «19» октября 2009 г в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д212.089.01 в ГОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» по адресу: 650056, г. Кемерово, бульвар Строителей, 47. тел/факс (3842) 73-40-07.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КемТИПП. С авторефератом можно ознакомиться на официальном сайте ГОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (http://avtorefdiss.kemtipp.ru/protect).

Автореферат разослан «15» сентября 2009 г

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время насчитывается около 60 наследственных заболеваний, связанных с нарушением обмена аминокислот. Наиболее распространенным таким заболеванием является фенилкетонурия. В его основе лежит нарушение активности фермента фенилаланин-4-гидроксилазы, осуществляющей превращение фенилаланина в тирозин. Данное заболевание (при несвоевременном лечении) довольно быстро прогрессирует и приводит к тяжелым поражениям центральной нервной системы и инвалидизации больного.

До настоящего времени единственным эффективным методом лечения фенилкетонурии является диетотерапия, построенная по принципу резкого ограничения количества фенилаланина, поступающего с пищей. С этой целью из рациона исключают продукты с высоким содержанием соответствующей аминокислоты. Адекватной заменой их служат специализированные продукты на основе смеси аминокислот или белковые эквиваленты с минимальным содержанием фенилаланина. В Российской Федерации имеется государственный заказ на обеспечение детей, страдающих фенилкетонурией, специальным питанием для предотвращения развития у них умственной отсталости. Подобная реабилитационная деятельность со стороны государства в несколько раз дешевле, чем пожизненное пенсионное обеспечение таких больных и содержание их в стационарных учреждениях.

Традиционная технология получения продуктов для лечения таких больных основана на селективной адсорбции или мембранном фракционировании частичных гидролизатов белка. Расщепление полипептидной цепи молекулы белка проводят протеазами, при этом степень гидролиза достигает 30-60%, что не обеспечивает полного удаления фенилаланина из полипептидной цепи. В результате проведения последующей стадии - адсорбции или мембранного фрак-ционорования не является достаточно эффективным, поскольку при этом могут быть удалены молекулы фенилаланина, находящиеся исключительно в свободном состоянии. Кроме того, на поверхности сорбента остается значительное количество аминокислот, что вызывает необходимость подбора соответствующих элюентов для их удаления с поверхности, а в последующем ведет к дополнительному обогащению синтетическими аминокислотами полученных гидролизатов до физиологических потребностей организма больного.

Вклад в практическое освоение технологии продуктов специализированного питания для больных фенилкетонурией внесли К.С. Ладодо и В.И. Круглик. Однако проблема разработки технологии отечественных ферментативных гидролизатов белка с низким содержанием фенилаланина продолжает сохранять свою актуальность. В связи с этим необходимо разрабатывать новые подходы к получению таких продуктов, которые будут более экономичными по Сравнению с существующими, обеспечат полное удаление фенилаланина из реакционной смеси.

Работа выполнена в рамках Федеральных целевых программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 -2013 годы» и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

Цель и задачи исследований. Целью является исследование и разработка технологии биотрансформации фенилаланина из белков молока и разработка технологии молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания. кй',мг

Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:

• изучить особенности гидролиза казеина эндо- и экзопептидазами (химот-рипсином, субтилизином, эластазой, термолизином, карбоксипептидазой А, лейцинаминопептидазой), оценить состав и физико-химические свойства полученных систем;

• изучить последовательность аминокислот в высвобождаемых фрагментах гидролизатов казеина при рациональных параметрах гидролиза;

• изучить кинетику процесса биотрансформации фенилаланина с помощью Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы (ФАЛ);

• разработать технологию удаления продуктов биотрансформации фенилаланина (аммиака и транс-циннамовой кислоты) из полученных гидролизатов;

• разработать технологию белкового эквивалента для продума-специально-го назначения, исследовать его состав и свойства.

Научная новизна работы:

- исследована и разработана технология биотрансформации фенилаланина в гидролизатах казеина, полученных с использованием ферментных препаратов экзо- и эндопептидаз;

- изучены особенности гидролиза казеина эндо- и экзопептидазами; определены рациональные условия целенаправленного гидролиза казеина, обеспечивающего максимальное высвобождение фенилаланина (до 100%) из полипептидной цепи казеина: температура 50±2°С, фермент-субстратное соотношение (термолизин, карбоксипептидаза А, лейцинаминопептидаза) 1:50, продолжительность процесса 8±0,05 ч;

- определена последовательность аминокислот в высвобожаемых фрагментах при рациональных параметрах гидролиза; ю,

- получены гидролизаты, содержащие пептиды, состоящие из 3-12 остатков аминокислот с молекулярной массой от 0,3 до 1,5 кДа;

- изучена кинетика процесса биотрансформации фенилаланина с помощью ФАЛ; определена константа Михаэлиса (1725 цМ) и максимальная, скорость процесса биотрансформации (1,2 цМ/мин), установлены рациональные параметры проведения процесса биотрансформации: температура 30±2°С, рН среды 8,0±0,01, продолжительность 8±0,05 ч;

- разработана технология удаления продуктов биотрансформации фенилаланина (аммиака и транс-циннамовой кислоты) из полученных гидролизатов;

- определен состав и физико-химические свойства молочного эквивалента, установлена продолжительность хранения.

Практическая значимость работы. На основании результатов исследования разработана технология молочного белкового эквивалента для специализированного питания. Новизна технических решений подтверждена патентом на

полезную модель №71903 и патентом на изобретение №2341109.

Апробация работы. Основные положения диссертации получили одобрение на итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007, 2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов; на школе-семинаре по результатам IV Всероссийского конкурса инновационных проеявдд студентов, аспирантов и молодых ученых по инновационному малому предпринимательству по приоритетным направлениям развития науки и высоких технологий», г. Москва; на первом научно-практическом симпозиуме «Научная молодежь - биотехнологии России» (Пущино, 2008); на X Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2008); на международной научно-практической конференции «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); на XXIV Всероссийской конференции научно-исследовательских работ «Национальное Достояние России» (Москва, 2009); на Всероссийской конференции «Научный потенциал-ХХ1» (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе четыре статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложений, подтверждающих практическую значимость результатов/

Содержание работы изложено на 115 страницах, включая 36 таблиц и 29 рисунков. Список литературы включает 151 наименование.

ОРГАНИЗАЦИЯ ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТЫ

Теоретические и экспериментальные исследования проведены в соответствии с поставленными задачами в Научно-образовательном центре Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». Общая схема проведения исследований приведена на рис. 1.

Весь цикл исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов. На первом этапе для формулировки цели и задач собственных. исследований проводили анализ доступной отечественной и зарубежной информации по теме диссертационного исследования.

На втором этапе изучали особенности гидролиза казеина эндо- и экзопеп-тидазами (химотрипсин, субтилизин, эластаза, термолизин, карбоксипептидаза А, лейцинаминопептидаза); оценивали состав и физико-химические свойства полученных систем (массовая доля свободного фенилаланина, степень гидролиза, рН, молекулярно-массовое распределение пептидов, состав свободных аминокислот).

Рис. 1. Общая схема проведения исследований

Варьируя параметры технологического процесса (температура и продолжительность), режимы биотехнологической обработки, комбинацию специально подобранных ферментов, обеспечивающих удаление фенилапащщ. р полипептидной цепи и фермент-субстратное соотношение, определяли рациональные параметры гидролиза казеина.

Третий этап посвящен изучению последовательностей аминокислот в высвобождаемых фрагментах при выбранных параметрах гидролиза методом МЛЬИ-ТОБ. Суть метода заключается в разделения ионов по соотношению масса/заряд.

Четвертый этап посвящен изучению кинетики процесса биотрансформации фенилаланина в белковых гидролизатах с помощью Ь-фенилаланина-аммоний-лиазы в условиях регуляции скорости с помощью различных физико-химических факторов в процессе формирования массива экспериментальных данных из серии опытов. При этом кинетические параметры определяли, используя уравнение Михаэлиса-Ментен.

На последующих этапах разрабатывали технологию удаления продуктов биотрансформации фенилаланина (аммиака и транс-циннгмовои' кислотьт) из полученных гидролизатов. Подбирали параметры процесса очистки полученных гидролизатов, оценивали влияние температуры и продолжительности обработки на степень очистки. Определяли массовую долю продуктов биотрансформации в реакционной смеси.

На заключительном этапе разрабатывали технологию молочного белкового эквивалента для больных фенилкетонурией, исследовали его состав и свойства, определяли продолжительность хранения.

При проведении исследований использовали общепринятые, стандартные и оригинальные методы биохимического, хроматографического, физико-химического, структурно-механического анализа с использованием последних достижений науки и техники.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ,,

Исследование закономерностей удаления фенилаланина из полипептидных цепей казеина

С учетом поставленной цели использовали энзиматическую систему, состоящую из экзо- и эндопептидаз. В качестве эндопептидазы использовали один из нижеперечисленных протеолитических ферментов: химотрипсин, термолизин, субтилизин или эластазу. В качестве экзопептидазы использовали карбоксипеп-тидазу А и лейцинаминопептидазу. Результаты экспериментов показаны в табл. 1.

По результатам проведенных исследований выяснили, что максимальное удаление фенилаланина из полипептидной цепи молекулы казеина достигается в результате проведения ферментативного гидролиза с помощью энзиматической системы, состоящей из трех ферментов: термолизина, карбоксипептидазы А и лейцинаминопептидазы (температура 50±1°С, фермент-субстратное соотношение 1:50 и продолжительность процесса 8±0,05 ч). Подобранные условия дейст-

вия ферментных препаратов использованы далее при изучении процесса биотрансформации фенилаланина с помощью Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы.

Таблица 1

Зависимость степени извлечения фенилаланина от фермент-субстратного _соотношения и продолжительности гидролиза казеина

Аминокислота Массовая доля в казеине, г/100 белка Массовая доля свободного фенилаланина при фермент-субстратном соотношении и продолжительности^, ч

1:100 1:50 1:25

4± ±0,05 8± ±0,05 24± ±0,05 4± ±0,05 8± ±0,05 24± ±0,05 4± ±0,05 8± ±0,05 24± ±0,05

химотриспин + карбоксипептидаза А + лейцинаминопептидаза

фенилаланин 5,8±0,29 ■ 1,19± ±0,06 1,46± ±0,10 2,99± ±0,15 1,87± ±0,11 1,89± ±0,10 2,03± ±0,12 4,05± ±0,20 4,41± ±0,21 5,80± ±0,24

термолизин + карбоксипептидаза А + лейцинаминопептидаза

фенилаланин 5,8±0,29 3,25± ±0,16 3,64± ±0,21 3,92± ±0,19 2,09± ±0,11 2,31± ±0,12 2,40± ±0,13 4,96± ±0,29 5,12±|5,58± ±0,30 ±0,39

субтилизин + карбоксипептидаза А + лейцинаминопептидаза

фенилаланин 5,8±0,29 3,19± ±0,16 1,40± ±0,26 5,80± ±0,29 2,42± ±0,15 3,21± ±0,19 *,30± ±0,26 3,67± ±0,22 *,50± ±0,27 5,23± ±0,36

эластаза + карбоксипептидаза А + лейцинаминопептидаза

фенилаланин 5,8±0,29 3,27± ±0,16 4,83± ±0,24 5,61± ±0,34 5,18± ±0,31 5,80± ±0,35 5,80± ±0,33 4,28± ±0,21 5,08± ±0,30 5,80± ±0,34

В целях доказательства того, что весь фенилаланин при выбранных параметрах процесса гидролиза освобожден из полипептидной цепи, проведен более детальный анализ пептидных профилей и определена аминокислотная последовательность полученных фрагментов методом МАЬШ-ТОР с помощью хромато-масс-спектрометра. Результаты полученных исследований представлены на рис. 2 и в табл.2.

Анализ данных, представленных на рис. 2 и в табл. 2, свидетельствует о том, что в составе полученных фрагментов полностью отсутствует фенилаланин, что позволяет использовать подобранные параметры гидролиза для изучения процесса биотрансформации фенилаланина в гидролизатах с помощью Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы.

термолизином, карбоксипептидазой А и лейцинаминопептидазой

Таблица 2

Характеристика пептидов, образовавшихся в результате гидролиза с использованием термолизина, карбоксипептидазы А и лейцинаминопептидазы

№ Молекулярная Порядок расположения Аминокислотная

пика масса, Да в полипептиднои цепи последовательность

1 2 3 4

1 1197 55-64 ЬвКОЮЗЕБТ

2 763 100-104 КЕОУРБ

3 915 205-210 ЕШЕКТТ

4 972 81-88 вввШУР

5 914 22-28 квдоьрд

6 773 185-190 отдуто

7 705 118-122 КУКУР

8 683 179-182 \VYYV

9 616 195-199 БОГРЫ

10 642 125-129 Е1УРЫ

11 385 173-176 АУР

12 585 145-148 ООКЕ

13 443 161-163 УРЕ

14 439 92-94 ЕОК

15 416 17-19 РКН

16 368 48-50 вКЕ

Примечание. А - аланин; N - аспарагин; Б - аспарагиковая кислота; О - глутамин; Е - глутаминовая кислота; в - глицин; Н - гистидин; I - изолей-цин; Ь - лейцин; К - лизин; Р - пролин; Б - серин; Т - треонин; - трипотофан; У - тирозин; V - валин

Характер распределения свободных аминокислот в полученных гидроли-затах представлен на рис. 3 и в табл. 3.

: ь ? :-х лк ! л1 ИЩА А1 г Ц.1 11. А

• 1 2 3 4 5 67 8 9 1011 12 13 14 15 16

Рис. 3. Хроматографический профиль свободных аминокислот, полученных в результате гидролиза казеина термолизином, карбоксипептидазой А и лейцинами-нопептидазой при температуре 50±1°С, продолжительности гидролиза 8±0,05 ч и фермент-субстратном отношении 1:50: 1 - аспарагин; 2 - серии; 3 - треонин; 4 -глутаминовая кислота; 5 - глицин; 6 - аланин; 7 - цистеин; 8 - метионин; 9 - изо-лейцин; 10 - лейцин; 11 - тирозин; 12 - фенилаланин; 13 - гистидин; 14 - лизин; 15 - аммиак; 16 - аргинин

Таблица 3

Динамика накопления свободных аминокислот в результате обработки термолизином, карбоксипептидазой А и лейцинаминопептидазой

Аминокислоты, г/100 г Казеин Содержание свободных аминокислот в гидролизате

1 2 3

Незаменимые 44,7 36,30

валин 5,10 4,87

изолейцин 6,14 4,86

лейцин 10,65 10,65

лизин 8,70 4,69

метионин 3,40 3,39

треонин 4,26 1,75

триптофан 0,65 0,29

фенилаланин 5,80 5,80

Заменимые 55,30 34,21

аланин 5,39 3,83

аргинин 4,40 3,42

аспарагиновая кислота 3,30 1,63

гистидин 3,30 2,89

глицин 2,41 0,92

глутаминовая кислота 12,89 7,89

Продолжение табл. 3

1 2 3

пролин 10,97 4,28

серин 3,84 1,08

тирозин 7,40 -тт

цистеин 1,40 1,23

Всего 100 70,51

Изучение кинетики процесса биотрансформации фенилаланина с помощью Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы

Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза характеризуется наиболее высокой специфичностью к фенилаланину по сравнению со всеми остальными ферментами его метаболизма. Общая схема процесса биотрансформации фенилаланина представлена на рис. 4.

но

н

»А

Рис. 4. Общая схема биотрансформации фенилаланина

В связи с этим в ходе исследований изучена кинетика процесса биотрансформации фенилаланина в белковых гидролизатах в условиях регуляции скорости с помощью различных физико-химических факторов. Дня этого в процессе формирования массива экспериментальных данных из серии опытов изучали влияние константы Михаэлиса и продолжительности ферментативной обработки с учетом оптимальных параметров, необходимых для работы фермента (рН среды и температура), на скорость биотрансформации фенилаланина в гидролизатах. Полученные рациональные параметры в дальнейшем были использованы при разработке технологии молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания.

Кинетические параметры реакции биотрансформации фенилаланина определяли, используя уравнение Михаэлиса-Ментен, описывающее зависимость скорости реакции, катализируемой ферментом, от концентрации субстрата и фермента. В процессе исследований установлена константа Михаэлиса, численное значение которой составило 1725 цМ. При этом максимальная скорость ферментативной реакции составила 1,2 цМ/мин. Подобные данные (Кш =1731 цМ, Уш =1,35) получены и другими исследователями в процессе изучения действия Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы в модельных условиях. Известно, что Кт может несколько варьировать, в зависимости от соотношения изоформ фенилаланина, вида буфера и присутствия в реакционной среде регуляторов ферментативной активности.

Таким образом, рациональными параметрами проведения процесса биотрансформации фенилаланина в гидролизатах казеина с помощью Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы являются: температура 30±2°С, рН среды 8,0±0,01, продолжительность 8±0,05 ч.

Разработка технологии удаления продуктов биотрансформации фенилаланина из полученных гидролизатов

Разработана технология удаления продуктов биотрансформ&щр фенилаланина (аммиака и транс-циннамовой кислоты) из полученных гидролизатов. Рациональными условиями для удаления аммиака являются: температура 80±5°С, давление 0,75 МПа, продолжительность процесса 1,5±0,05 ч. Рациональными условиями для удаления транс-циннамовой кислоты является: температура 2±2°С, при продолжительности процесса 1,5±0,05 ч. Динамика очистки гидролизатов от продуктов биотрансформации представлена на рис. 5 соответственно.

а)

•атагг

б)

«¡а?

мин

мин

а)

б)

йрГт

мин

мин

Рис. 5. Динамика очистки гидролизатов от продуктов биотрансформации (1 - аммиак; 2 - транс-циннамовая кислота): а - до очистки; б - после очистки

В табл. 4 представлено содержание продуктов биотрансформацйи в полученных гидролизатах.

Таблица 4

Наименование Значение, г/100 г

до очистки после очистки

Аммиак 3,45±0,05 0,001±0,0001

Транс-циннамовая кислота 2,35±0,03 0,001±0,0001

В результате анализа данных, представленных в табл. 4, можно сделать вывод о том, что подобранные параметры очистки обеспечивают снижение массовой доли продуктов биотрансформации из реакционной смеси с 3,45±0,05 до 0,001±0,0001 для аммиака и с 2,35±0,03 до 0,001±0,0001 для трщщгциннамовой кислоты и позволяют использовать полученные гидролизаты в качестве молочного белкового эквивалента при производстве специализированных продуктов, предназначенных для питания больных фенилкетонурией.

Дальнейшие исследования направлены на разработку технологии молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания, предназначенных для питания больных фенилкетонурией.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ССЛЕДОВАНИЙ

На основании результатов исследований разработана технологическая схема получения молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания, представленная на рис. 6.

Органолептические и физико-химические показатели молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания представлены в табл. 5.

Таблица 5

Органолептические и физико-химические показатели молочного белкового эк-

вивалента для специализированных продуктов питания

Наименование показателя Характеристика

Внешний вид и консистенция Мелкий сухой порошок. Допускается наличие легко рассыпающихся комочков. В восстановленном виде - однородная жидкость

Цвет Белый с кремовым оттенком

Запах и вкус Чистые, свойственные свежей молочной смеси, со специфическим привкусом

Массовая доля сухих веществ, % не менее 96

Массовая доля фенилаланина, г /100 г белка, не более 0,001

Ферментативный гидролиз, при I = 50+2°С; т = 8±0,05 ч; рН 7,5; _фермент-субстратное соотношение 1:50_

Инактивация фермента 1 =95±2"С, т = 30 с

Биотрансформация фенилаланина, при I = 30±2°С; т = 8±0,05 ч; _рН 8,0; Кт=1725 рМ, Ут =1,2 цМ/мин_

_Инактивация фермента, при 1 =95±2°С, т = 30 с _

--1-г^ас^чртчт----—

Удаление аммиака, при 1 = 80±5°С; т = 1,5+0,05 ч; давление 0,75 МПа

| Удаление транс-циннамовой кислоты, при 1 = 2±2"С; х = 1,5+0,05 ч |

Пастеризация, при 1 =96±2иС, х = 60 с

Сгущение до массовой доли сухих веществ 40-45%

Сушка 1 воздуха на входе 175±5°С, на выходе 90±5иС

Фасование, упаковка, хранение

Рис. 6. Технологическая схема производства молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания

В табл. 6 представлен аминокислотный состав молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания.

__Таблица 6

Аминокислота г/100 г белка Аминокислота г/100 г белка

1 2 3 4

Незаменимые 37,59±0,31 Заменимые 56,61±0,49

валин 5,10±0,05 аланин 5,39±0,05

изолейцин 6,14±0,03 аргинин 4,40±0,08

лейцин 10,65±0,08 аспарагиновая кислота 2,90±0,09

лизин 8,27±0,04 гистидин 3,30±0,02

метионин 3,40±0,07 глицин 2,41 ±0,03

треонин 3,13±0,03 глутаминовая кислота "'Т2;35±0,05

Продолжение табл. 6

1 2 3 4

триптофан 0,90±0,01 пролин 10,97±0,04

фенилаланин 0,001±0,001 серин 6,09±0,05

тирозин 7,40±0,08

цистеин 1,40±0,03

Данные табл. 6 свидетельствуют о том, что предложенная технологическая схема позволяет получить молочный белковый эквивалент даяспециализи-рованных продуктов питания, удовлетворяющий существующим требованиям.

Биологическая ценность молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания показана в табл. 7.

Таблица 7

Биологическая ценность молочного белкового эквивалента для специализиро-

ванных продуктов питания (Х±т; т<0,05)

Незаменимые аминокислоты Шкала РАОЛУНО, мг/1 г белка Аминокислотный скор(%)

Валин 50,00 102,00

Изолейцин 40,00 153,50

Лейцин 70,00 152,14

Лизин 55,00 118,14

Метионин + цистин 35,00 ""ТО4

Треонин 40,00 78, 25

Триптофан 10,00 90,0

Фенилаланин + тирозин 60,00 123,33

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что биологическая ценность белка в молочном белковом эквиваленте для специализированных продуктов питания весьма высока. Если учесть, что используемый метод анализа содержания аминокислот обладает погрешностью ±5-10%, то вполне можно считать исследуемый белок полноценным.

ВЫВОДЫ

1. Исследована и разработана технология биотрансформации фенилаланина в гидролизатах казеина, полученных с использованием ферментных препаратов экзо- и эндопептидаз (химотрипсина, субтилизина, эластазы, термолизина, карбоксипептидазы А, лейцинаминопептидазы) и разработана технология молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания.

2. Изучены особенности гидролиза казеина эндо- и экзопептидазами. Определены рациональные условия целенаправленного гидролиза казеина, обеспечивающего максимальное высвобождение фенилаланина (до 100%) из полипептидной цепи казеина: температура 50±2°С, фермент-субстратное соотно-

шение (термолизин, карбоксипептидаза А, лейцинаминопептидаза) 1:50, продолжительность процесса 8±0,05 ч.

3. Определена последовательность аминокислот в высвобожаемых фрагментах при рациональных параметрах гидролиза. Получены гидролизаты, содержащие пептиды, состоящие из 3-12 остатков аминокислот с молекулярной массой от 0,3 до 1,5 кДа.

4. Изучена кинетика процесса биотрансформации фенилаланина с помощью ФАЛ. Определена константа Михаэлиса (1725 цМ) и максимальная скорость процесса биотрансформации (1,2 цМ/мин). Определены рациональные параметры проведения процесса биотрансформации: температура 30±2°С, pH среды 8,0±0,01, продолжительность 8±0,05 ч.

5. Разработана технология удаления продуктов биотрансформации фенилаланина (аммиака и транс-циннамовой кислоты) из полученных гидролизатов. Рациональными условиями для удаления аммиака являются: температура 80±5°С, давление 0,75 МПа, продолжительность процесса 1,5±0,05 ч. Рациональными условиями для удаления транс-циннамовой кислоты является: температура 2±2°С, при продолжительности процесса 1,5±0,05 ч. Данные параметры обеспечивают снижение массовой доли продуктов биотрансформации из реакционной смеси с 3,45±0,05 до 0,001 ±0,0001 для аммиака и с 2,35±0,03 до 0,001±0,0001 для транс-циннамовой кислоты.

6. Разработана технология молочного белкового эквивалента для. специализированных продуктов питания. Новизна технического решения подтверждена патентом РФ №2341109. Определен состав и физико-химические свойства молочного эквивалента, установлена продолжительность хранения.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы: Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Практические аспекты контроля фенилаланина в молочных продуктах и способ его удаления / Л.А.Остроумов, А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, Е.А Якимова // Молочная промышленность.- 2007.- №9.- С. 71-72.

2. Остроумов, Л.А. Гидролиз концентрата сывороточных белков экзо- и эндо-пептидазами / Л.А. Остроумов, А.Ю. Просеков, О.О. BatHfW Молочная промышленность.- 2008.- №12.- С. 23-26.

3. Просеков, А.Ю. Применение биокатализа в производстве препаратов функционального назначения / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич // Вестник Крас-ГАУ.- Вып. 6,- 2008,- С. 166-172.

4. Протеолитические ферменты для модификации функциональных свойств молочно-белковых систем / С.Е. Димитриева, Р.Х. Галиева, А.Ю. Просеков, О.О. Бабич // Хранение и переработка сельхозсырья.- 2009.- №6,- С. 46-48.

Материалы конференций, конгрессов, симпозиумов, семинаров

5.Просеков, А.Ю. Создание технологий и аппаратурного оформления молочных продуктов нового поколения / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, В.Г. Буд-рик // Современные аспекты молочного дела в России: Сборник материалов научно-практической конференции,- Вологда: Департамент продовольственных ресурсов, торговли и услуг Вологодской области, 2007.- С. 67-68.

6. Разработка технологии биокаталитической сорбции аминокислот из белков с связи с созданием продуктов питания для больных фенилкетонурией / А.Ю. Просеков, Л.А. Остроумов, О.О. Бабич и др. // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»: Сборник тезисов докладов - М.: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 2008. - С. 19-20.

7. Просеков, А.Ю. Научные и практические аспекты получения целенаправленных гидролизатов молочных белков функционального назначения / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич // В кн. «Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов 11-15 мая»,-Новосибирск, 2008.- С. 504.

8. Просеков, А.Ю. Особенности получения смеси аминокислот из белков молочной сыворотки / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока: Сборник научных трудов с международным участием.- Вып. 5.- Барнаул, 2008.- С. 161-165.

9. Просеков, А.Ю. Инновационная технология молочных продуктов, предназначенных для лечения больных фенилкетонурией / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич // Технология и продукты здорового питания: Материалы II Международной научно-практической конференции.- Саратов: ИЦ «Наука», 2008,- С. 107-110.

10. Просеков, А.Ю. Научное обоснование и разработка моделей, алгоритмов и технологии продуктов питания, предназначенных для питания больных фенилкетонурией / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич // Материалы Пятого Московского международного конгресса.- Часть 2.- 2009,- С.44-45,

П.Бабич, О.О. Биотехнологическая обработка молочных систем в связи с использованием в технологии продуктов специального назначения // Реализация государственной программы развития сельского хозяйства и регулирование рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия: инновации, проблемы, перспективы: Материалы международного научно-технического форума Омского государственного аграрного университета,- Омск: Изд-во ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2009.- С.226-228.

Сборник научных трудов института

12. Особенности питания детей, больных фенилкетонурией / А.Ю. Просеков, A.C. Шебукова, О.О. Бабич // Вестник Кемеровского технологического института пищевой промышленности,- Вып. 5.- Кемерово: КемТИПП, 2007,- С. 83.

Патенты

13. Патент на полезную модель (Россия) № 71903 Российская" Федерация, МПК B01D 53/02. Аппарат по сорбции аминокислот / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, A.C. Шебукова, Ю.В. Голубцова, С.А. Равнюшкин, И.С. Ра-зумникова; заявитель и патентообладатель - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Кемеровский технологический институт пищевой промышленности.-№2007144148/22; заявл. 27.11.2007; опубл. 27.03.2008.- Бюл. № 9.

14. Патент (Россия) №2341109 Российская Федерация, МПКА23Ь 1/29. Способ получения пищевого продукта для больных фенилкетонурией / А.Ю. Просеков, A.C. Шебукова, О.О. Бабич, Ю.В. Голубцова; заявитель и патентообладатель - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Кемеровский технологический институт пищевой промышленности.- №2007132518/13; заявл. 28.08.2007; опубл. 20.12.2008.-Бюл. №9.

Подписано в печать 09.09.2009. Формат 60x86/16. Тираж 80 экз. Объем 1,1 п.л. Заказ № 160 Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. 650056, г. Кемерово, б-р Строителей, 47. Отпечатано в лаборатории множительной техники КемтТИППа. 650010, г. Кемерово, ул. Красноармейская, 52

ВВЕДЕНИЕ.

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1. Особенности обмена веществу больных наследственными нарушениями аминокислотного обмена.

1.2. Современные аспекты питания детей больных фенилкетонурией.

1.3. Реакции метаболизма фенилаланипа и их свойства.

Одним из основных фактором, определяющим здоровье человека, является питание, которое должно не только удовлетворять потребности организма в пищевых веществах и энергии, но и выполнять профилактические и лечебные цели. В последние годы во всем мире особое внимание уделяется созданию специализированных и лечебных продуктов. Это продукты специального назначения, предназначенные для систематического употребления в составе пищевых рационов, сохраняющие и укрепляющие здоровье за счет наличия в их составе веществ, обладающих способностью оказывать благоприятный эффект на физиологические функции и процессы обмена веществ в организме. Кроме того, специализированные и лечебные продукты играют важную роль в предотвращении возникновения различных заболеваний и укреплении здоровья.

Правильно организованное питание с включением специализированных и лечебных продуктов способствует благоприятному течению болезни, повышению защитных свойств организма, активизирует течение анаболических процессов, что в конечном итоге, ведет к восстановлению здоровья. При некоторых заболеваниях применение рационов с включением специализированных и лечебных продуктов является единственным методом, позволяющим предупреждать развитие тяжелых последствий болезни. К числу таких заболеваний относятся наследственные нарушения аминокислотного обмена.

В настоящее время насчитывается около 60 наследственных заболеваний, связанных с нарушением обмена аминокислот. Наиболее распространенным таким заболеванием является фенилкетонурия. В его основе лежит нарушение активности фермента фенилаланин-4-гидроксилазы, осуществляющего превращение фенилаланина в тирозин. Образовавшийся блок на пути превращения фенилаланина в тирозин приводит к накоплению и выведению продуктов аномального метаболизма, а также к развитию дисбаланса других аминокислот. При этом развивается значительный дефицит очень важной аминокислоты тирозина, который приводит к нарушению образования биологически активных веществ и гормонов. Данное заболевания (при несвоевременном лечении) довольно быстро прогрессирует и приводит к тяжелым поражениям центральной нервной системы и инвалидизации больного.

До настоящего времени единственным эффективным методом лечения фенилкетоиурии является диетотерапия, построенная по принципу резкого ограничения количества фенилалапина, поступающего с пищей.

В Российской Федерации имеется государственный заказ на обеспечение детей, страдающих фенилкетонурией, специальным питанием для предотвращения развития у них умственной отсталости. Подобная реабилитационная деятельность со стороны государства в несколько раз дешевле, чем пожизненное пенсионное обеспечение таких больных и содержание их в стационарных учреждениях.

Из анализа отечественной и зарубежной литературы можно сделать вывод о том, что работы, посвященные получению гидролизатов для больных фенилкетонурией, относительно немногочисленны. В России большой вклад в практическое освоение технологии продуктов специализированного питания для больных фенилкетонурией внесли К.С. Ладодо и В.И. Круглик.

Во всех случаях степень элиминации фепилаланина относительно невелика (как правило, его остаточное содержание составляет порядка 0,5% по массе белка). Согласно современной концепции питания больных фенилкетонурией данная степень элиминации фенилаланина является недостаточной, поэтому неудивительно, что продукты на основе таких гидролизатов оказываются на данном этапе неконкурентоспособными по сравнению с продуктами, предназначенными для питания таких больных, полученными исключительно за счет смеси синтетических аминокислот, в то время как белки молока являются естественным источником природных аминокислот, наиболее адаптированных к физиологическим особенностям детского организма.

Традиционная технология получения продуктов для лечения таких больных основана на селективной адсорбции или мембранном фракционировании частичных гидролизатов белка. Расщепление полипептидной цепи молекулы белка осуществляют протеазами, при этом степень гидролиза достигает 30-60%, что не обеспечивает полного удаления фенилаланина из полипептидной цепи. В результате проведение последующей стадии - адсорбции или мембранного фракционирования не является достаточно эффективным, поскольку при этом могут быть удалены молекулы фенилаланина, находящиеся исключительно в свободном состоянии. Кроме того, на поверхности сорбента остаётся значительное количество аминокислот, что вызывает необходимость подбора соответствующих элюентов для их удаления с поверхности, а в последующем - к дополнительному обогащению синтетическими аминокислотами полученных гидролизатов до физиологических потребностей организма больного. В связи с этим, проблема разработки технологии отечественных препаратов с низким содержанием фенилаланина продолжает сохранять свою актуальность.

При выполнении работы необходимо исследовать закономерности удаления фенилаланина из полипептидных цепей казеина, оценить состав и физико-химические свойства полученных систем, определить последовательность аминокислот в высвобождаемых фрагментах при рациональных параметрах гидролиза, изучить кинетику процесса биотрансформации фенилаланина с помощью Ь-фснилаланин-аммопий-лиазы, разработать технологию удаления продуктов биотрансформации фенилаланина из полученных гидролизатов, разработать технологию белкового эквивалента для продукта специального назначения, исследовать его состав и свойства, определить продолжительность храпения.

Работа выполнена в рамках Федеральных целевых программ «Научные и научпо-педагогическис кадры инновационной России на 2009 -2013 годы» и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Исследована и разработана технология биотрансформации фенилалапи-на в гидролизатах казеина, полученных с использованием ферментных препаратов экзо- и эндопептидаз (химотрипсина, субтилизина, эласта-зы, термолизина, карбоксипептидазы А, лейцинаминопептидазы) и разработана технология молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания.

2. Изучены особенности гидролиза казеина эндо- и экзопептидазами. Определены рациональные условия целенаправленного гидролиза казеина, обеспечивающего максимальное высвобождение фенилаланина из полипептидной цепи казеина: температура 50±2°С, фермент-субстратное соотношение (термолизин, карбоксипептидаза А, лейцинаминопепти-даза) 1:50, продолжительность процесса 8,00±0,05 ч.

3. Определена последовательность аминокислот в высвобожаемых фрагментах при рациональных параметрах гидролиза. Получены гидролиза-ты, содержащие пептиды, состоящие из 3-12 остатков аминокислот с молекулярной массой от 0,3 до 1,5 кДа.

4. Изучена кинетика процесса биотрансформации фенилаланина с помощью Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы. Определена константа Михаэлиса (1725 мкмоль даО и максимальная скорость процесса биотрансформации (1,2 мкмоль/дм3мип). Определены рациональные параметры проведения процесса биотрансформации: температура 30±2°С, рН среды 8,00±0,01, продолжительность 8,00±0,05 ч.

5. Разработана технология удаления продуктов биотрапсформации фенилаланина (аммиака и трапс-ципнамовой кислоты) из полученных гидро-лизатов. Рациональными условиями для удаления аммиака являются: температура 353±5 К, давление 0,75 атм., продолжительность процесса 1,50±0,05 ч. Рациональными условиями для удаления транс-циннамовой кислоты является: температура 275±2 К, при продолжительности процесса 1,50±0,05 ч. Данные параметры обеспечивают полное удаление продуктов биотрансформации из реакционной смеси с 3,45±0,05 до 0,0010±0,0001 для аммиака и с 2,35±0,03 до 0,0010±0,0001 для транс-циннамовой кислоты.

6. Разработана технология молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания. Новизна технического решения подтверждена патентом РФ №2341109. Определен состав и физико-химические свойства молочного эквивалента, установлена продолжительность хранения.

1. Алексеева, НЛО. Современные дос тижения в области химии белков молока / Н.Ю. Алексеева, IO.B. Павлова, Н.И. Шишкин // Обзорная информация. Серия «Молочная промышленность».- М.: АгроНИИТЭ-ИММП, 1988.- 32 с.

2. Аналитические методы белковой химии: Сборник статей / Под ред. В. П. Ореховича.- М.: Изд-во иностранная литература, 1963.- 643 с.

3. Антипова, JI.B. Прикладная биотехнология / JI.B. Антипова, И.А. Глотова, А.И. Жаренов,- Воронеж, 2000.- 332 с.

4. Антонов, В.К. Химия протеолиза,- М.:Наука, 1983.- 367 с.

5. Арбатская, Н.И. Молочпо-белковые концентраты казециты для детского и диетического питания / Н.И. Арбатская, JI.H. Анохина // М: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1985.- 27 с.

6. Асатиани, B.C. Биохимический анализ. В 2-х ч. 4.2 / B.C. Асатиани.- 2-е изд. перераб. и доп.- Тбилиси: Грузмедгиз, 1955.- 475 с.

7. Асатиани, B.C. Методы биохимических исследований: руководство для врачей-лаборантов и биохимиков/ B.C. Асатиани.- М.: Медгиз, 1956.- 471 с.

8. Беккер, М.Е. Введение в биотехнологию: Пер. с латыш.- М.: Пищевая промышленность, 1978.- 231 с.

9. Бендер, М. Биоорганическая химия ферментативного катализа / М. Бендер, Р. Бергерон, М. Комияма: Пер. с англ.- М.: Мир, 1987.- 352 с.

10. Ю.Березов, Т.В. Биоорганическая химия / Т.В. Березов, Б.Ф. Коровин.- М.: Медицина, 1990.- 380 с.

11. Биотехнология. Принципы и применение: Пер. с англ. / Под. ред. И. Хиггинса, Д. Беста и Дж. Джонса.- М.: Мир, 1988.- 480 с.

12. Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кп. 8: Инженерная энзимология / И. В. Береэнн, А. А. Клёсов, В. К. Швядас и др.- М.: Высшая школа, 1987,- 143 с.

13. Большаков, О.В. Государственная политика в области здорового питаиия // Молочная промышленность.- 1999.- №6,- С.5-6.

14. Бушуева, Т.В. Сравнительная оценка использования специализированных продуктов "Тетрафен" и "Фенил-Фри" в диетотерапии детей, больных фепилкетонурией / Т.В. Бушуева, О.Д. Вржесинская, В.М. Коден-цова и др. // Вопросы питания. 1998,- №2,- С. 14-18.

15. Быков, В.А. Биотехнология. Производство белковых веществ / В.А. Быков, М.Н. Манаков, В.И. Панфилов // М: Высшая школа, 1987.- 140 с.

16. Вопросы организации диетологической помощи детям, больным фе-нилкетопурией / Д.И. Зелинская, К.С. Ладодо, Е.П.Рыбакова и др. // Вопросы питания,- 1998,-№2,- С.12-14.

17. Галь, Э. Электрофорез и разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи: Пер. с англ.- М.: Мир, 1982.- 448 с.

18. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. СанПиН 2.3.2.1078-01,- М.- Минздрав РФ.- 2002,- 164 с.

19. Голубцова, Ю. В. Исследование и разработка технологии полуфабриката с пониженным содержанием фелилаланина : диссертация . кандидата технических наук: 05.18.04.- Кемерово.- 2008,- 124 с.

20. Горбатова, К.К. Физико-химические и биохимические основы производства молочных продуктов.- М.: ГИОРД, 2003.- 352 с.

21. Готтшалк, А. Казенны овцы, козы и человека. Гликопротеины.- М.: Мир, 1969.- Т.2.-300 с.

22. Громова, Л.В. Влияние пептидов, входящих в состав гидролизатов казеина, па всасывание глюкозы и воды в тонкой кишке крыс / Л.В. Громова, М.Л. Иоффе // Физиологический журнал им. И.М.Сеченова.-1993,- Т.79.- № 6,- С.73-79.

23. Гаурович, Ф. Химия и функции белков.- М.: Мир, 1965. 530 с.

24. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак: Пер. с англ.- М.: Мир, 2002,- 589 с.

25. Диетотерапия наследственных нарушений аминокислотного обмена / Е.П. Рыбакова, Т.В. Бушуева, К.С. Ладодо и др. // Вопросы детской диетологии,- 2005.- Т.З.- №1.- С. 1 1-17.

26. Диксон, М. Ферменты. В 3-х т. Т.1 / М. Диксон, Э.Уэбб: Пер. с англ.-М.: Мир, 1982.-392 с.

27. Досоп, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, X. Элиот, К.

28. Джонс,- М.: Мир, 1991,- 544 с.

29. Дудепков, А. Я. Биохимия молока и молочных продуктов / А.Я. Дудеп-ков, Ю.А. Дуденков,- М.: Пищевая промышленность, 1972.- 160 с.

30. Дьяченко, П.Ф. Исследование белков молока // Труды ВНИМИ, 1959.-Вып. 19.- С.28-32.

31. Дэвени, Т. Аминокислоты, пептиды и белки / Т. Дэвепи, Я. Гергей: Пер с англ.- М.: Мир.- 1976.- 364 с.

32. Дюга, Г. Биоорганическаи химия. Химические подходы к механизму действия ферментов / Г. Дюга, К. Пенни: Пер.с англ.- М.: Мир, 1983,- 512 с.

33. Зсмляпухип, A.A. Практикум по биохимии,- Воронеж, 1975,- 140 с.

34. Ипихов Г.С. Методы анализа молока и молочных продуктов / Г.С. Ини-хов, Н.П. Брио.- М.: Пищевая промышленность, 1971.- 424 с.

35. Ишмаметьева, М.В. Молочные продукты функционального питания / М.В. Ишмаметьева, Г.А. Донская // Пища. Экология. Человек: Сборник трудов 6 международной научно-технической конференции МГУПБ,-М., 2003.- С.71 -72.

36. Калинин, Ф.Л. Справочник по биохимии / Ф.Л. Калинин, В.П. Лобов,

37. В.Н. Жидков.- Киев: Наукова Думка, 1971.- 780 с.

38. Каталог «Специализированные продукты питания для детей с различной патологией» / Под ред. К.С. Ладодо М., 2000.- 154 с.

39. Комиееаренко С. В. Физико-химические и биологические свойства белков молока// Вопросы питания, 1983,- № 1.- С.6-11.

40. Комплексное лечение фенилкетопурии с учетом коррекции нарушений обмена катехоламиповых нейромедиаторов / М.Б. Курбатов, Е.А. Николаева, J1.A. Троецкая // материнство и детство.- 1992.- С.5-7.

41. Копылова, Н.В. Фенилкетонурия: классификация, диагностика, диетотерапия // Вопросы детской диетологии.- 2004,- Т.2.- №6.- С. 31-46.

42. Копылова, Н.В. ФКУ вчера, сегодня, завтра / Н.В. Копылова, А.Д. Бай-ков, A.A. Ходунова,- М., 2004,- 47 с.

43. Костюченко, A.JI. Энтеральное искусственное питание в интенсивной медицине / АЛ. Костюченко, Э.Д. Костин, A.A. Курыгии.- СПб, 1996,- 330 с.

44. Кочеткова, A.A. Функциональные ингредиенты и концепция здорового питания / A.A. Кочеткова, И.Н. Нестерова // Вопросы питания.- 2002,-№2.- С.4-7.

45. Крашенинин, П.Ф. Совершенствование технологии и улучшение качества молочных продуктов детского и диетического питания. // ВНИИКИ молочной промышленности, 1988,- 265 с.

46. Крашенинин, П.Ф. Технология детских и диетических молочных продуктов. Справочник / П.Ф. Крашенинин, Л.Н. Иванова, Г.П. Шаманова.-Агропромиздат, 1988.- 231 с.

47. Кремер, Л.К. Влияние тепловой обработки на белки обезжиренного молока / Л.К. Кремер, А.Р. Матесон, Ж. Берри // XXI Международный молочный конгресс. Краткие сообщения. М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1982.- Т.1, Кн.2,- С.155.

48. Крашенинин, П.Ф. Сухие концентраты и гидролизаты молочных белков / П.Ф. Крашенинин, Г.Ю. Сажинов, В.И. Круглик // Молочная промышленность.- 1993.- №3,- С.4.

49. Ладодо, К.С. Результаты клинической апробации новых отечественных продуктов для больных фенилкетонурией / К.С. Ладодо, Е.П. Рыбакова, Т.В. Бушуева и др. // Педиатрия,- 1999,- №6,- С.5 1-55.

50. Ладодо, К.С. Руководство по лечебному питанию детей,- М.: Медицина, 2000,- 384 с.

51. Ладодо, К.С. Специализированные продукты питания для детей с различной патологией / К.С. Ладодо, ГЛО. Сажинов,- М.: 2000.- 200 с.

52. Липатов, H.H. Некоторые аспекты моделирования аминокислот ной сбалансированности пищевых продуктов // Пищевая и перерабатывающая промышленность,- 1986,- №4,- С.49-52.

53. Лонцип, М. Основные процессы пищевых производств / М. Лонцин, Р. Мерсон,- М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983.- 384 с.

54. Мачихип, Ю.А. Инженерная реология пищевых материалов / Ю.А. Мачи-хип, С.А. Мачихин. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981.- 212 с.

55. Методы и средства анализа пищевого сырья и продуктов / Е.В. Глебова, Э.Н. Ким, Е.П. Лаптева и др. / Под ред. Э.Н. Кима: Учебное пособие -Владивосток: Дальрыбвтуз, 2004,- 253 с.

56. Мецлср, Д. Биохимия.- М.: Мир, 1980,-Т. 2.- 608 с.

57. Модификация белков молока сельскохозяйственных животных с использованием трансгенеза: биотехнологические возможности, проблемы и перспективы / Л.С. Попов, С.Г. Кадулии, И.Л. Гольдман и др. И Биотехнология.- 2000.- № 5.- С.3-18.

58. Мохно, Г.Н. Переработка молока,- Улан-Удэ: Издательство ВСГТУ, 2000.- 440 с.

59. Мосолов, В.В. Протеолитические ферменты.- М.: Наука, 1971,- 414 с.

60. Мощипский, Г1. Получение знзиматических гидролизатов казеина, обедненных фенилалапипом / П. Мощипский, Я Идзяк // Прикладная биохимия и микробиология,- 1993.- Т. 29.- № 3.- С.398-403.

61. Мухина, Ю.Г. Специализированные продукты лечебного питания: характеристика и применение у детей раннего возраста / Ю.Г. Мухина, А.И. Чубарова // Вопросы детской диетологии, 2004,- Т.2,- №5.- С.76-80.

62. Научно-технические основы биотехнологии молочных продуктов нового поколения: Учебное пособие / А.Г. Храмцов, Б.М. Синельников, И.А. Евдокимов и др.- Ставрополь, 2002.- 118 с.

63. Неклюдов, А.Д. Получение белковых гидролизатов с заданными свойствами / А.Д. Неклюдов, С.М. Навашин // Прикладная биохимия и микробиология.- 1985.-Т. 21.-№1.- С.3-17.

64. Нечаев, А.П. Пищевая химия / А.П. Нечаев, С.Е. Траубенберг, A.A. Ко-четкова,- СПб.: ГИОРД, 2001.- 592 с.

65. Новый отечественный продукт Афенилак 0-12 в диетотерапии детей первого года жизни, больных фенилкетонурией / Т.В. Бушуева, К.С.

66. Ладо до, Е.П. Рыбакова и др. // Вопросы современной педиатрии.- 2003.-Т.2.- №4.- С.83-86.

67. Нормы физиологических потребностей в пищевых веществах и энергии для различных групп населения СССР.- М., 1991.- 25с.

68. Нутритивная поддержка больных в критических состояниях / Т.С. Попова, А.Е. Шестопалов, Т.Ш. Тамазашвили и др.- М.: «М-Вести»,-2002.-320 с.

69. Овчинников, А. И. Биохимия молока и молочных продуктов / А.И. Овчинников, К.К. Горбатова,- JL: ЛГУ, 1974,- 256 с.

70. Осинцев, A.M. Развитие фундаментального подхода к технологии молочных продуктов: Монография.- Кемерово: КемТИПП, 2004.- 152 с.

71. Особенности производства различных видов казеина непрерывным способом / В.Ф. Далинин, Р.И. Павлова, A.B. Перепечко и др. //.Обзорная информация,- М.: АгроНИИТЭИММП, 1987.- 32 с.

72. Остерман, Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983.- 304 с.

73. Остерман, J1. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультра центрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981.-288 с.

74. Остерман, Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Под. ред. Г.П. Георгиев,- М.: Наука, 1985,- 536 с.

75. Пептиды. Основные методы образования пептидных связей / Под ред. Э.Гросс, И. Майенхофер, М: Мир, 1983.- 280 с.

76. Пи в и ей ко, Т.Н. Ферментативные способы приготовления белковых гидролизатов с использованием препаратов различной специфичности / Т.Н. Пивненко, Л.М. Эпштейн, IO.M. Позднякова и др. // Вопросы питания,- 1997.- №5.- С.34-38.

77. Повышение эффективности производства и использования молочно-белковых концентратов. / О.И. Копева // Труды ВНИИ молочной промышленности, 1985.- 71 с.

78. Покровский, A.A. Атакуемость белков пищевых продуктов протеоли-тическими ферментами in vitro / A.A. Покровский, И.Д. Бртапов // Вопросы питания,- 1965,- № 3,- С.38-44.

79. Покровский, A.A. Физиолого-биохимические основы разработки продуктов детского питания // М.: Медицина, 1991.- 171с.

80. Проектирование специальных молочных продуктов для детей / О.И. Башкиров, C.B. Симоненко, Т.А. Антипов и др. // Молочная промышленность,- 2007,- №6,- С.48-51.

81. Практикум по биохимии: учеб. пособие / Под ред. С.Е.Северина, Г.А.Соловьевой.,- 2-е изд., перераб. и доп.- М.: Изд-во МГУ, 1989.- 509 с.871 фактическая химия белка: Пер. с англ. / Под ред. А. Дарбре.- М.: Мир, 1989.- 623 с.

82. Продукты специализированного лечебного питания / И.А. Рогов, Э.С. Токаев, Т.С. Попова и др. // Обзорная информация. Серия «Молочная промышленность»,- М.: АгроНИИТЭИММП, 1991.- 36 с.

83. Просеков, А.Ю. Современные аспекты производства продуктов питания,- Кемерово: Кузбассвузиздат АСТШ - Университеты России 2005.- 370 с.