автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Исследование и разработка технологии белкового концентрата на основе гидролизата белков молока

На правах рукописи

Борисова Галина Витальевна

ИССЛЕДОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БЕЛКОВОГО КОНЦЕНТРАТА НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТА БЕЛКОВ МОЛОКА

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

18 АПР ¿013

Кемерово - 2013

005057512

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном

образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ФГБОУ ВПО Кем ТИПП).

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Просеков Александр Юрьевич

Официальные оппоненты: Харитонов Дмитрий Владимирович,

доктор технических наук, Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности, заместитель директора

Лисин Петр Александрович,

доктор технических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет им. П.А. Столыпина», профессор кафедры «Технология и оборудование пищевых производств»

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

научно-исследовательский институт

детского питания Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита диссертации состоится «22» марта 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 212.809.01 в ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» по адресу: 650056, г. Кемерово, бульвар Строителей, 47, ауд. 4-я лекц. ауд. тел./факс: (8-384-2)39-68-88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». С авторефератом можно ознакомиться на официальных сайтах ВАК Минобрнауки РФ ('http://vak.ed.gov.ru') КемТИПП (http://www.kemtipp.ru).

Автореферат разослан «20» февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, у

кандидат технических наук, доцент Кригер Ольга Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Питательные потребности организма не всегда могут быть удовлетворены обычной пищей. Зачастую болезнь, травма, недомогание способствуют дефициту питательных веществ. Ухудшение самочувствия, остановка процесса лечения и значительный рост осложнений -это лишь некоторые последствия неправильного питания. В группу особого риска входят пациенты с хроническими заболеваниями, дети и пожилые люди, поскольку они наиболее часто испытывают сложности с потреблением и усвоением пищи. В связи с этим большое внимание уделяется специализированным продуктам лечебного назначения, которые являются крайне важными для поддержания здоровья, а иногда даже жизненно необходимыми. Продукты специального назначения предназначены для систематического употребления в составе пищевых рационов, которые позволяют сохранить и укрепить здоровье за счет наличия в их составе веществ, обладающих способностью оказывать благоприятный эффект на физиологические функции и процессы обмена веществ в организме.

Рацион, включающий в себя продукты питания, обладающие лечебными свойствами, такие как функциональные и специализированные продукты питания, способствуют благоприятному течению заболевания, повышению защитных свойств организма, активизирует течение анаболических процессов, что в конечном итоге ведет к восстановлению здоровья. Согласно литературным данным, при некоторых заболеваниях в рацион питания включают специализированные у: лечебные продукты, что является одним из методов, позволяющий предупреждать развитие тяжелых последствий болезни. К числу таких заболеваний относятся наследственные нарушения аминокислотного обмена, в том числе гистидинемия, фенилкетонурия, тирозинемия, алкаптонурия и другие. В основе генезиса заболеваний, обусловленных нарушением аминокислотного обмена, лежит избирательное снижение активности того или иного фермента, участвующего в метаболизме аминокислот, поступающих с пищей.

На данный момент активное выявление детей с такой патологией как гистидинемия только начинается и довольно быстро прогрессирует; при полном отсутствии фермента заболевание проявляется в первые месяцы жизни и нередко приводит к смертельному исходу. Профилактика заболевания основана на выявлении гетерозиготных носителей патологического гена с помощью нагрузочных тестов и на ранней биохимической диагностике патологии, то есть выявлении биохимического дефекта до возникновения клинических симптомов. Последнее осуществляется с помощью программы тотальных скринирующих исследований.

Степень проработки темы исследований. Исследования по созданию специализированных лечебных продуктов питания для детей с наследственным нарушением аминокислотного обмена обобщены в трудах Т.Э. Боровик, К.С. Ладо до, П.Ф. Крашенинина, В.И. Круглика и других ученых.

Анализ научных литературных данных показал, что для детей, больных гистидинемией, в других странах создаются специальные лечебные продукты питания по определённым технологиям, а в России подобных отечественных продуктов как таковых не существует, что является актуальным на данный момент.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы является исследование биотрансформации гистидина в гидролизатах молочных белков с использованием Ь-гистидин-аммоний-лиазы и разработка технологии белкового концентрата для специализированных продуктов лечебного назначения.

Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:

- провести сравнительную оценку по физико-химическим свойствам, химическому составу и биологической ценности белков растительного и животного происхождения;

- определить оптимальные параметры ферментативного гидролиза белков коровьего молока протеолитическими ферментами;

- исследовать кинетику процесса биотрансформации гистидина под действием Ь-гистидин-аммоний-лиазы;

- разработать технологию удаления транс-уроканиновой кислоты и аммиака из полученного гидролизата белков коровьего молока;

- разработать технологию молочно-белкового концентрата;

- исследовать состав и свойства молочно-белкового концентрата, разработать техническую документацию и дать оценку экономической эффективности.

Научная новизна работы:

- выявлено, что в процессе протеолитического гидролиза ферментным комплексом, состоящим из химотрипсина, карбоксипептидазы А, лейцинаминопептидазы и аланинаминопептидазы при фермент-субстратном соотношении 1:20 при температуре 50±1°С, активной кислотности среды 7,6 ±0,05 и продолжительности 8±0,05 ч происходит максимальное высвобождение гистидина из полипептидной цепи;

- установлено, что в ходе ферментативной реакции происходит интенсивное накопление конечных продуктов биотрансформации аминокислоты гистидина (транс-уроканиновой кислоты и аммиака);

- изучены кинетические процессы биотрансформации свободной циклической аминокислоты гистидина, содержащейся в гидролизате белков коровьего молока;

подобраны оптимальные технологические параметры очистки полученного гидролизата белков коровьего молока от продуктов биораспада циклической аминокислоты гистидин;

- показано, что при температуре 80±5°С в течение 1,5 ч наблюдается полное удаление аммиака из реакционной смеси;

установлена продолжительность хранения молочно-белкового концентрата, освобожденного от аминокислоты гистидин - 180 суток при температуре плюс 20±2 °С;

- рассчитана экономическая эффективность выработки продукции.

Практическая значимость работы. Исследованы закономерности ферментативного гидролиза белков коровьего молока протеолитическими ферментами, а также процесс биотрансформации гистидина под действием L-гистидин-аммоний-лиазы. Практическая ценность работы состоит в разработке технологии получения молочно-белкового концентрата без аминокислоты гистидин - для детей, больных гистидинемией. Подана заявка на выдачу патента (№ 2012146705 от 01.11.2012 «Способ получения функционального белкового продукта для больных гистидинемией»). В установленном порядке подготовлен комплект технических условий и технологических инструкций.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы», государственный контракт № 12.527.11.0008.

Методология и методы исследования. Отбор проб и подготовку их к анализу проводили по ГОСТ 26809, ГОСТ 9225. Массовую долю сухих веществ определяли по ГОСТ 30648.3. Плотность молока определяли молочным ареометром AMT - ГОСТ 3625. Для количественного и качественного определения аминокислотного состава использовали систему на базе высокоэффективного жидкостного хроматографа (аминокислотный анализатор) Aracus PMA GmbH. Содержание белка определяли на анализаторе общего азота (белка) «RAPID N ELEMENTAR», работающего по методу Дюма - сжигания пробы с регистрацией общего азота на детекторе теплопроводности. Для количественного определения массовой доли амминого азота использовали метод Лоури. В данном методе сочетаются две реакции. Первая - биуретовая реакция. Во второй реакции (собственно реакция Фолина) задействован реактив Фолина-Чокальтеу. Активную кислотность определяли по активности ионов водорода с помощью потенциометрического анализатора. Молекулярно-массовое распределение белков и пептидов в получаемых гидролизатах оценивали электрофоретическим способом в полиакриламидном геле (ПААГ) методом Лэмли. Просмотр и фотографирование гелей проводили на УФ-трансиллюминаторе ТСР-20М («Vilber Lourmat», США) при длине волны излучения - 312 нм. Аминокислотную последовательность образованных пептидов определяли с помощью автоматического секвенатора, работающего по методу Эдмана. Биотрансформацию гистидина проводили статическим методом в термостате с перемешиванием, при температуре 30±2°С и pH 7,50± 0,01 (фосфатный буфер). Массовую долю аммиака и транс-уроканиновой кислоты определяли методом капиллярного электрофореза с помощью системы «КАПЕЛЬ 105». Для определения водорастворимых витаминов использовали метод капиллярного электрофореза системы «КАПЕЛЬ 105». Определение жирорастворимых витаминов проводили методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией на хроматографе «Милихром»

со спектрофотометрическим детектором и спектральным диапазоном 190-360 нм. Очистку гидролизата с целью удаления транс-уроканиновой кислоты и аммиака проводили с помощью ротационного испарителя ИР-1ЛТ и ферментативной реакции в присутствии уроканиназы с каталитической активностью 100000 МЕ/мг белка. Массовую долю макро- и микроэлементов определяли методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии. Микробиологические показатели определяли в соответствии с СанПиН 2.3.4.551, СанПиН 2.3.2.1078, ГОСТ 9225, ГОСТ 10444.12, ГОСТ 10444.11, ГОСТ Р 50480.

Степень достоверности и апробация работы. Основные положения диссертации получили одобрение на научно-практических конференциях, в том числе: на Всероссийской конференции студентов и аспирантов «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (г. Кемерово,

2011 г.), Инновационном конвенте «Кузбасс: образование, наука, инновации» (г. Кемерово, 2011 г.), Всероссийской конференции с международным участием студентов, аспирантов и молодых учёных «Пищевые продукты и здоровье человека» (г. Кемерово, 2011 г.), VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Качество продукции, технологий и образования» (г. Магнитогорск, 2011 г.), III Международной научно-практической конференции «В мире научных открытий» (г. Москва,

2012 г.), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Пищевые продукты и здоровье человека» (г. Кемерово, 2012 г), IX Международной научно-практической конференции «Наука в современном мире» (г. Москва, 2012 г.), Международной молодёжной конференции «Биокаталитические технологии и технологии возобновляемых ресурсов в интересах рационального природопользования» в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы (г. Кемерово, 2012 г).

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ и 2 электронные работы, в том числе шесть статей в отраслевых журналах, рекомендованных ВАК: «Техника и технология пищевых производств», «Хранение и переработка сельхозсырья», «Молочная промышленность», «Современные проблемы науки и образования», «Фундаментальные исследования».

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение, аналитический обзор, организация, объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, результаты и выводы, список использованных источников и приложения. Основное содержание работы изложено на 108 страницах машинописного текста, содержит 33 таблицы и 22 рисунка. Список литературы включает 157 наименований.

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Теоретические и экспериментальные исследования проведены в соответствии с поставленными задачами на кафедре «Бионанотехнология»

Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». Общая схема проведения исследований приведена на рисунке 1._

Исследование и разработка технологии белкового концентрата на

основе гидролизата белков молока '

Анализ отечественной и зарубежной литературы, формулировка цели и задач __исследований

I

Сравнительная оценка физико-химических свойств, химического состава и биологической ценности белков растительного и животного происхождения - химический состав молока - молекулярно-массовое распределение белков молока - физические показатели молока - аминокислотный состав - массовая доля макро - и микроэлементов

| I

Определение оптимальных параметров ферментативного гидролиза белков коровьего молока протеолитическими ферментами --- - массовая доля гистидина - молекулярно-массовое распределение - динамика накопления свободных аминокислот

Исследование кинетики процесса биотрансформации гистидина под действием Ь-гистидин-аммоний лиазы | - скорость биотрансформации гистидина - остаточное содержание гистидина

| I

Разработка технологии удаления транс-уроканиновой кислоты и аммиака из полученного гидролизата белков коровьего молока - массовая доля транс-уроканиновой кислоты - массовая доля аммиака - параметры очистки - степень очистки

| 1 ---

Разработка технологии молочно-белкового концентрата - технологические параметры - органолептические показатели - физико-химические показатели - аминокислотный состав - массовая доля общего азота - микробиологические показатели

I

Практическая реализация результатов исследований

Рисунок 1 - Общая схема проведения исследований Весь цикл исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов. На

первом этапе для формулировки цели и задач собственных исследований проводили анализ доступной отечественной и зарубежной информации по теме диссертационного исследования.

На втором этапе изучали химические свойства и аминокислотный состав молока (зрелого женского, соевого и коровьего молока). Проводили сравнительный анализ белков в составе адаптированных специализированных смесей для детского питания.

На следующем этапе исследовали особенности гидролиза сывороточных белков и казеина системой пептидаз, состоящей из карбоксипептидазы А, лейцинаминопептидазы, химотрипсина и термолизина в различных вариациях; оценивали состав и физико-химические свойства полученных гомогенных систем. Для этого определяли массовую долю свободного гистидина, степень гидролиза, активную кислотность реакционной среды, молекулярно-массовое распределение пептидов, состав свободных аминокислот. Определяли рациональные параметры гидролиза сывороточных белков и казеина путем варьирования температуры, продолжительности процесса, режимы биотехнологической обработки, комбинацию специально подобранных ферментов, обеспечивающих удаление гистидина из полипептидной цепи и фермент-субстратное соотношение.

Четвертый этап посвящен изучению последовательностей аминокислот в высвобождаемых фрагментах при выбранных параметрах гидролиза с помощью автоматического секвенатора, работающего по методу Эдмана. Метод основан на обработке исследуемого образца фенилизотиоцианата.

Пятый этап посвящен изучению кинетики процесса биотрансформации гистидина в гидролизатах сывороточных белков и различных фракций казеина с помощью фермента Ь-гистидин-аммоний-лиазы. Изучение кинетики проводили в условиях регуляции скорости с помощью различных физико-химических факторов в процессе формирования массива экспериментальных данных из серии опытов. При этом кинетические параметры определяли, используя уравнение Михаэлиса-Ментен.

На последующих этапах разрабатывали технологию удаления продуктов биотрансформации гистидина (транс-уроканиновой кислоты и аммиака) из полученных гидролизатов. Определяли рациональные параметры процесса очистки полученных гидролизатов, оценивали влияние температуры и продолжительности обработки на степень очистки. Определяли массовую долю продуктов биотрансформации в реакционной среде.

На заключительном этапе разрабатывали технологию молочно-белкового концентрата для получения специализированных лечебных продуктов для больных гистидинемией, исследовали его состав и свойства, определяли продолжительность хранения.

При выполнении диссертационной работы использовали стандартные, общепринятые и оригинальные методы исследований, к которым можно отнести физико-химические (экстракция, диализ, ионообменная хроматография, электрофорез, спектроскопия), биохимические, микробиологические, органолептические и другие.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С целью определения биологической ценности белков молока животного и растительного происхождения проводили исследования по определению физико-химических свойств и их аминокислотного состава (таблица I).

Таблица 1 - Химический состав соевого молока в сравнении с зрелым женским молоком и коровьим молоком_

Наименование Соевое молоко Зрелое женское молоко Коровье молоко

Массовая доля воды,% 95,70±5,74 90,00±5,40 87,00±5,22

Массовая доля белка, % 3,35±0,20 1,25±0,08 3,31±0,20

Масссовая доля жира, % 1,00±0,06 2,50±0,15 4,00±0,24

Массовая доля безазотистых экстрактивных веществ, % - 6,00±0,36 5,00±0,30

Массовая доля золы, % - 0,25±0,02 0,70±0,04

Проанализировав таблицу 1, можно сделать вывод, что общее количество белков в зрелом женском молоке составляет 1,00-1,30%, что в 2-3 раза ниже, чем в коровьем молоке. В растительном молоке массовая доля белка достигает 3,35%. Также растительное и животное молоко отличаются содержанием воды. Так, например, результаты исследований показали, что массовая доля воды в зрелом женском молоке составляет 90,00%, что на 3,00% больше, чем в коровьем молоке, но на 5,50% меньше, чем массовая доля воды в соевом молоке.

Белки являются ценным источником питания для детей и ценность его определяется содержанием входящих в него незаменимых и заменимых аминокислот. С целью определения биологической ценности проводили исследования качественного и количественного аминокислотного состава в белках молока растительного и животного происхождения (таблица 2). Таблица 2 - Содержание аминокислот в белках молока

Наименование Содержание, %

аминокислоты белок соевого молока казеин сывороточные белки

1 2 3 4

Алании 2,89±0,17 3,0±0,18 5,3±0,32

Аргинин 4,10±0,25 4,1±0,25 5,2±0,31

Аспарагиновая кислота 5,13±0,31 7,1 ±0,43 9,7±0,58

Валин 4,81 ±0,29 6,2±0,37 8,0±0,48

Гистидин 2,91 ±0,18 3,1±0,19 3,7±0,22

Глицин 2,59±0,16 2,7±0,16 4,1 ±0,25

Глутаминовая кислота 14,82±0,89 10,4±0,62 12,15±0,73

Изолейцин 4,03±0,24 4,3±0,26 5,1 ±0,31

1 2 3 4

Лейцин 3,82±0,23 6,3±0,38 7,33±0,44

Лизин 6,11±0,34 5,7±0,34 6,68±0,40

Метионин 0,01±0,0006 5,2±0,31 1,89±0,11

Пролин 15,20±0,91 11,3±0,68 2,50±0,15

Серин 2,67±0,16 4,3±0,26 4,9±0,29

Тирозин 9,41±0,57 9,3±0,56 3,6±0,22

Треонин 3,99±0,24 3,8±0,23 6,82±0,41

Триптофан 3,43±0,21 1,3±0,078 4,71±0,28

Фенилаланин 12,01±0,72 11,6±0,69 9,58±0,57

Цистин 2,07±0,12 0,30±0,02 2,84±0,17

Всего 100 100 100

Результаты таблицы 2 показали, что в сывороточных белках и казеине по сравнению с белком соевого молока содержатся все незаменимые аминокислоты, такие как валин, аргинин, лейцин, метионин и др., причём некоторые из них в сывороточных белках по содержанию увеличены в 2-4 раза по сравнению с казеином. В белке соевого молока в малых количествах содержится такая незаменимая аминокислота как метионин, массовая доля которой достигает 0,01%.

С целью максимального удаления гистидина из полипептидной цепи белковых молекул с помощью ферментативного гидролиза получены девять гидролизатов.

В сравнительном анализе путём влияния технологических условий процесса реакции гидролиза белков коровьего молока действием ферментным комплексом, состоящим из эндопептидазы - химотрипсина и экзопептидаз -карбоксипептидазы А, лейцинаминопептидазы и аланинаминопептидазы, определены оптимальные параметры ферментативного гидролиза, позволяющие целенаправленное биотрансформирование полипептидной цепи молекулы белка с целью высвобождения гистидина (рисунок 2).

Рисунок 2 - Изменение массовой доли свободного гистидина в процессе гидролиза белков молока химотрипсином, карбоксипептидазой А, лейцин-аминопептидазой и аланинами-нопептидазой при соотношении «фермент - субстоат»: 1 - 1:80; 2

- продолжи-

Анализ результатов показал, что при

1:40; 3 - 1:20; тельность гидролиза 4±0,05; Щ|-продолжительность гидролиза 8±0,05; ^-продолжительность гидролиза"24±0,05. продолжительности гидролиза

извлечения гистидина из полипептидной цепи. Так, при соотношении «фермент-субстрат» 1:20 и 1:40 это значение достигает 2,51 мг/100 г и 2,93 мг/100 г белка, что выше в 1,3 и 1,6 раз, чем при фермент-субстратном соотношении 1:80. При соотношении «фермент-субстрат» 1:20 массовая доля гистидина достигает 3,30 мг/100 г белка, что является максимальной точкой извлечения гистидина из полипептидной цепи молочных белков - 100%.

Далее проведён анализ определения молекулярно-массового распределения в полиакриламидном геле, а также изучена динамика накопления свободных аминокислот при различных соотношениях «фермент-субстрат» (рисунок 3).

1:20 М_

Рисунок 3 — Электрофорез в полиакриламидном геле гидролиза молочно-белковой смеси химотрип-сином, карбоксипептидазой А, аланинаминопептидазой и лейцинами-нопептидазой при соотношениях «фермент-субстрат» 1:20-1:80 при продолжительности гидролиза: 1 4±0,05, 2 - 8±0,05, 3 - 24±0,05 ч, температуре 50±1°С и активной

_ — ___ ... _ кислотности 7,6±0,01.

М 1 2 3 1 2 3 123М

Для определения кинетических процессов биотрансформации свободного циклического гистидина, локализованного в гидролизате белков коровьего молока изучали условия влияния различных физико-химических факторов на скорость ферментативной реакции (рис. 4). В качестве субстрата выступал свободный гистидин, содержащийся в гидролизате белков коровьего молока.

Рисунок 4 - Кривая зависимости скорости ферментативной реакции от массовой доли субстрата

Результаты исследований показывают, что скорость

■ 0.3 а я

I ее

до.:-/; ферментативной реакции пропор

и 4 \__II циональна массовой доле цикли-

о юоо :ооо зооо 4000 5000 бооо -ооо зооо 9000 ческой аминокислоте. Макси-Миссовяядоля субстритя. ммоль мальная скорость ферментатив-

ной реакции (1,23 ммоль/мин) наблюдалась при массовой доле гистидина 6000,00 ммоль.

Дальнейшие исследования направлены на изучение накопления продуктов ферментативной реакции биотрансформации гистидина под действием Ь-гистидин-аммоний-лиазы до конечных продуктов. Результаты

накопления свободного транс-уроканиновой кислоты и аммиака в ходе биотрансформации гистидина представлены на рисунке 5.

а)

в)

з «

б)

Рисунок 5 — Динамика накопления конечных продуктов (транс-уроканиновой кислоты и аммиака) метаболизма гистидина под действием Ь-гистидина-аммоний-лиазы, в течение: а - 2±0,05 ч; б - 4±0,05 ч; в - 8±0,05 ч; 1 гистидин; 2 - аммиак; 3 - транс-уроканиновая кислота

Анализ результатов свидетельствует о том, что в ходе ферментативной реакции происходит интенсивное накопление конечных продуктов биотрансформации аминокислоты гистидина (транс-уроканиновой кислоты и аммиака). Так, массовая доля исходного компонента ферментативной реакции за 2±0,05 ч протекания процесса биотрансформации ферментом составила 70,8% от первоначального значения, за 4±0,05 ч - 33,06%, а при 8±0,05 ч реакции массовая доля гистидина достигает своего минимального значения и составляет 0,5%.

На заключительном этапе подбирали оптимальные условия удаления из полученного гидролизата белков коровьего молока конечных продуктов распада гистидина (транс-уроканиновой кислоты и аммиака). На рисунке 6 представлена динамика удаления свободного аммиака из реакционной смеси гидролизата белков коровьего молока.

Рисунок 6 - Динамика удаления свободного аммиака из реакционной смеси гидролизата белков коровьего молока: 1 - при | 1.5- \ 60±5°С; 2 - при 70±5°С; 3 - при

80±5°С

30 45 60 "5 Продолжительность, мин

Анализ результатов исследований, представленных на рисунке 6, показал, что чем выше продолжительность и температура процесса удаления аммиака, тем ниже массовая доля свободного аммиака в реакционной среде. Так, при температуре 60±5°С массовая доля свободного аммиака снижается до 25,7%, при 70±5°С - до 13,1%. Однако уже при проведении процесса при температуре 80±5°С в течение 1,5 ч наблюдается полное удаление аммиака из реакционной смеси, что позволяет использовать данные технологические параметры очистки при разработке технологии молочно-белкового концентрата для функциональных продуктов питания специального назначения, соответствующего требованиям действующих стандартов.

В таблице 3 представлено содержание продуктов биотрансформации в полученном гидролизате белков коровьего молока.

Таблица 3 - Массовая доля транс-уроканиновой кислоты и свободного аммиака до и после стадии очистки

Наименование показателя Значение, мг/100 г

до очистки после очистки

Транс-уроканиновая кислота 4,03±0,03 0,001±0,0001

Аммиак 3,71 ±0,05 0,001±0,0001

параметры очистки полученного гидролизата белков коровьего молока от продуктов биораспада циклической аминокислоты гистидина, обеспечивающие их полное удаление из реакционной смеси и позволяющие использовать полученные гидролизаты в качестве молочно-белкового концентрата с целью дальнейшего его применения при производстве специализированных продуктов, предназначенных для питания больных гистидинемией.

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МОЛОЧНО-БЕЛКОВОГО КОНЦЕНТРАТА

Разработана техническая документация на молочно-белковый концентрат «Здоровый малыш» (ТУ 9197-178-020683315-12).

На рисунке 6 приведена технологическая схема производства продукта. Технологический процесс состоит из следующих основных взаимоперетекающих процессов: подготовка сырья; составления композиции (сывороточные белки и казеин), в соотношении 60:40; созревание смеси и регулирование среды до рН 7,6; пастеризация при 90±1°С, в течение 20 с последующим охлаждением до 50°С; приготовления гидролизной смеси; ферментативный гидролиз; выдержка при 50±1°С в течение 0,5 ч; инактивация ферментного комплекса; охлаждение молочно-белкового гидролизата; удаление побочных компонентов реакции гидролиза на ротационном испарителе; сушка до массовой доли влаги не более 14%; охлаждение до 20°С, фасовка и хранение.

Рисунок 6 - Технологическая схема производства молочно-белкового концентрата «Здоровый малыш», освобожденного от аминокислоты гистидин Нормируемые органолептические и физико-химические показатели молочно-белкового концентрата «Здоровый малыш» представлены в таблице 4. Молочно-белковый концентрат «Здоровый малыш» должен храниться

при температуре 20±2°С не более 180 суток с момента окончания технологического процесса.

Таблица 4 - Нормируемые органолептические и физико-химические показатели

Показатель Молочно-белковый концентрат «Здоровый малыш»

Органолептические показатели

Консистенция Мелкий сухой порошок. Допускается наличие легко рассыпающихся комочков

Внешний вид Цвет молочно-белый без оттенков

Вкус и запах Чистый, молочный, без посторонних привкусов и запахов

Физико-химические показатели

Массовая доля влаги, % , не более 14,00±0,84

Массовая доля аминокислот, % 97,30±5,84

Массовая доля общего азота, % 13,00±0,78

Массовая доля гистидина, г/100 г белка, не более 0,0005

ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Проведена сравнительная оценка физико-химических свойств, химического состава и биологической ценности белков растительного и животного происхождения. Определено, что биологически полноценными являются белки животного происхождения и приближёнными по качественному и количественному составу аминокислот к зрелому женскому молоку по сравнению с растительными белками. Биологическая ценность казеина несколько ограничивается дефицитом цистина, массовая доля 0,30%, вместе с тем казеин содержит высокое количество фенилаланина 11,6%. В сывороточных белках баланс дефицитных серосодержащих и других незаменимых аминокислот лучше, чем в казеине.

2. Установлено, что в процессе протеолитического гидролиза ферментным комплексом, состоящим из химотрипсина, карбоксипептидазы А, лейцинаминопептидазы и аланинаминопептидазы при фермент-субстратном соотношении 1:20 при температуре 50±1°С, активной кислотности среды 7,6 ±0,05 и продолжительности 8±0,05 ч, происходит максимальное высвобождение гистидина из полипептидной цепи, массовая доля которого составила 3,30 мг на 100 г белка.

3. Установлено, что в ходе ферментативной реакции гидролиза происходит интенсивное накопление конечных продуктов биотрансформации аминокислоты гистидин (транс-уроканиновой кислоты и аммиака).

4. Изучены кинетические процессы биотрансформации свободного гистидина, содержащегося в гидролизате белков коровьего молока. Рассчитана

константа Михаэлиса-Ментена для ферментативной реакции, ее значение составила 1451 мкмоль при максимальной скорости процесса 1,23 мкмоль/мин.

5. Подобраны оптимальные технологические параметры очистки полученного гидролизата белков коровьего молока от продуктов биораспада циклической аминокислоты гистидина. Так, при температуре 80±5°С в течении 90 мин наблюдается полное удаление аммиака из реакционной смеси.

6. На основании результатов исследований разработана технология получения молочно-белкового концентрата, освобожденного от аминокислоты гистидин «Здоровый малыш». Определены органолептические и микробиологические показатели молочно-белкового концентрата «Здоровый малыш», которые свидетельствуют о его безопасности применения в производстве специализированных продуктов лечебного назначения.

7. Установлена продолжительность хранения - 180 суток при температуре 20±2 °С. Рассчитана ожидаемая экономическая эффективность выработки продукции. На новые продукты разработана техническая документация (ТУ 9197-178-020683315-12). Новизна технического решения изложена в заявке на выдачу патента РФ № 2012146705 «Способ получения функционального белкового продукта для больных гистидинемией». Опытные образцы выработаны в производственных условиях малого инновационного предприятия ООО «МКС».

По материалам диссертации опубликованы следующие работы: Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Борисова, Г.В. Разработка технологии удаления продуктов биотрансформации гистидина из гидролизатов казеина / Г.В. Борисова, О.В. Бессонова, А.Ю. Просеков // Техника и технология пищевых производств. -

2011.-№4.-С. 23-27.

2. Борисова, Г.В. Особенности целенаправленного удаления гистидина из казеина / Г.В. Борисова, О.В. Бессонова, А.Ю. Просеков // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2011. - № 11. - С. 28 - 29.

3. Просеков, А.Ю. Особенности удаления гистидина из казеина / А.Ю. Просеков, Г.В. Борисова, О.В. Бессонова // Молочная промышленность. -

2012,-№4.-С. 57-58.

4. Борисова, Г.В. Выбор ферментных препаратов с целью получения гидролизатов молочной сыворотки с низкой аллергенностью / Г.В. Борисова, М.В. Новосёлова, О.Н. Бондарчук, Ю.С. Малова // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 11 (часть 5). - С. 1164-1167.

5. Новосёлова, М.В. Подбор параметров ферментативного гидролиза казеина / М.В. Новосёлова, Г.В. Борисова, Бондарчук О.Н., Малова Ю.С. // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 6. - С. 1173-1177.

6. Бессонова, О.В. Ферментативный гидролиз молочного белкового концентрата // О.В. Бессонова, О.О. Бабич, Г.В. Борисова, И.Е. Драгунов // Молочная промышленность. - 2012. - №6. - С. 43-44.

Материалы конференций, конгрессов, симпозиумов, семинаров

7. Мудрикова, О.В. Практические аспекты молекулярно-генетического анализа в пищевой промышленности / О.В. Мудрикова, Г.А. Аветисян, Г.В. Борисова // Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи 18-22 октября 2010 г. Проведение научных исследований под руководством приглашенных исследователей в 2010 году. - Кемерово 2010. - С.21-25.

8 Борисова, Г.В. Особенности питания больных гистидинемией / Г.В. Борисова, О.В. Бессонова // Материалы IV Всероссийской конференции с международным участием студентов, аспирантов и молодых учёных «Пищевые продукты и здоровье человека». - Кемерово, 2011. - С. 5-6.

9. Борисова, Г.В. Принципы питания больных с нарушением аминокислотного обмена // Материалы VI Всероссийской конференции научно-практической конференции с международным участием «Качество продукции, технологий и образования». - Магнитогорск, 2011. - С. 248-250.

10. Борисова, Г.В. Кинетика процесса биотрансформации гистидина в белковых гидролизатах / Г.В. Борисова, О.В. Бессонова // Материалы Инновационного конвента «Кузбасс: образование, наука, инновации». -Кемерово, 2011. - С. 65-67.

11. Борисова, Г.В. Динамика накопления продуктов реакции в процессе биотрансформации гистидина / Г.В. Борисова, О.В. Бессонова // Материалы конференции «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук». -Кемерово, 2011.-С. 102-103.

12. Борисова, Г.В. Молочные продукты нового поколения в рационе детского питания / Г.В. Борисова, О.Н. Бондарчук // Материалы III Международной научно-практической конференции «В мире научных открытий». - М., 2012. - С. 129 - 132.

13. Борисова, Г.В. Технология производства молочного белкового эквивалента для больных гистидинемией / Г.В. Борисова, О.В. Бессонова // Материалы международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Пищевые продукты и здоровье человека». - Кемерово, 2012. - С. 7 - 8.

14. Борисова, Г.В. Разработка рецептуры молочного белкового эквивалента для больных гистидинемией / Г.В. Борисова, О.В. Бессонова // MATERIALS of 1— International scientific - practical conference «MODERN PROBLEMS OF BIOMATERIALS, NANOMATERIALS AND NANOMEDICINE». - Семей, 2012. - С. 28-29.

15. Бондарчук, О.Н. Актуальность производства функциональных продуктов питания на основе гидролизатов белков молока / О.Н. Бондарчук, A.A. Терехов, Г.В. Борисова // Материалы IX Международной научно-практической конференции «Наука в современном мире». - М., 2012 - С 186 -188.

16. Борисова, Г.В. Полифункциональные добавки на основе гидролизатов казеина молока / Г.В. Борисова, О.Н. Бондарчук // Материалы III

Международной научно-практической конференции «В мире научных открытий». - Москва, 2012. - С. 132 - 134.

17. Борисова, Г.В. Альтернативный подход к получению продуктов для больных гистидинемией с использованием биоинформационных технологий / Г.В. Борисова, Л.С. Солдатова // Материалы международной молодёжной конференции «Биокаталитические технологии и технологии возобновляемых ресурсов в интересах рационального природопользования» в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы. - Кемерово, 2012. - С.21 - 25.

Подписано в печать 06.02.2013. Формат 60x86/16. Тираж 70 экз. Объем 1,1 п.л. Заказ № Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. 650056, г. Кемерово, б-р Строителей, 47. Отпечатано в лаборатории множительной техники КемтТИППа. 650002, г. Кемерово, ул. Институтская, 7