автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Разработка промышленной технологии микробного препарата пектинэстеразы

г ь ^ -'!

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ДЕЛАМ НАУКИ И ВЫСШЕЙ ШКОЛЫ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

; На правах рукописи

АХВЛВДИАНИ Зураб.Гурамович

УДК: 577.154.35:582.282

РАЗРАБОТКА ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ МИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА ПЕКТШЭСТЕРАЗИ

Специальность 03,18.10 - Технология витаминных, ферментных и белковых препаратов, чая и таЗака.

Автореферат на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного Знамени технологическом институте пищевой промышленности

Научный руководитель: |д.т.н., профессор К.А. Калундац'

Официальные оппоненты:

доктор технических наук Траубенберг С.Е. кандида* технических наук Павлова Н.М.

Ведущая организация: ВНИИ пищевой биотехнологии

Защита состоится Си-Р 1991 ГОда в __

часов на заседании специализированного Совета К 063.51.04. Нос ковского ордена Трудового Красного Знамени технологического ин ститута пищевой промышленности. Адрес института: 125080, Москв Волоколамское шоссе, II.

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат технических наук, доцент

А.И. Саде

^.ТРТЕй» <

5.;! гзппгз

.ТАОД

ссртацг.й | 0Б[ЦДЯ ХДРА1ЯЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. В основных направлениях экономического и социального развития СССР отмечается необходимость ускоренного развития и увеличения производства продукции гидробиологического синтеза, в том числе ферментов. Изучение процессов биосинтеза ферментов у микроорганизмов обусловлено основополагающей ролью биокатализаторов в интенсификации технологических процессов в пищевой промышленности. Одной из вазнейзих задач, поставленной продовольственной програш-гай перед научным подразделением Агропромышленного комплекса,является комплексная переработка плодоовощного сырья н возникай? проблемы, связанные с рациональны}.! и малоотходным использованием сельскохозяйственного сырья, отходов его переработки, расширенным производством продуктов пищевой промышленности.

Особое место закмуате ферменты печтодитического комплекса, действующие на пектиновые пе^есгва.

Благодаря своим мелирующим свойствам пектин находит широкое применение во многих отраслях кондитерской» пицеяонцентратдай промышленности. Однако все более актуальным становится его применение в лечебных и профилактических целях. Для этих целей наиболее целесообразно использовать пектин с меньшей степенью эте-рификации.

Существуют различные способы понижения степени этерифика-ции: химический и ферментативный с использовашем фермента пек-тинэстерази (ПЭ).. Химические методы воздействия вызывав? частичную деградации пектина, разрушая его структуру. Ферментативный способ выгодно отличается от химического и освобожден от указан-

■о

ного недостатка. Однако в настоящее зремя микробиологическая

проьавшенность не выпускает препаратов псетиностерааы. Поэтому задаче получения пектингетсрази ьккробкологкчоского происховде-ш;я представляется весып актуальной.

Цель к задачи ксслсдогания. Цель дошюй работы состояли б разработке «гехиолошг какробного. препарат«. пек-пшосгсрази, практически ¡ю содержащей ирпигсоИ разгяшазгцей. ецп,о-полнгал&хур:и:й-

_ 1

зы (ецдо-ПГ).

Исходя из цслсП работы были поставлена к рзленц следующие задачи:

- внбор штиаа шкрооргшшвиа, наиболее продуктивного ло синтезу пектинестсразк;

- конс-труироьанпь состава питательно!; с роди с использованием в качестве ее компонентов цторичшве ресурсов сельского хозяйства и пищевой проышжонности;

- разработка глубинного культивирования продуцента пектии-эстеразы;

- разработка рацноналыгых методов ввделения и концентрирования пектинзетор&зы;

- изучение условий ингибировадак полигалактуронази, присутствующей в пектолитическоц комплексе, при сохранении ПЭ-актив-ности;

* , - характеристика очищенного ферментного препарата пектин-эстеразы;

- разработка технологической схемы производства препарата пиктинэстеразк.

.'ручная новизна. Впервые- разработана технология препарата п^ктинэстеразь" микробного происхождения;

- г;,бра и шкрэскопический гриб

ссуцествяяягрй направленный биосинтез псктинзстеразы;

- сконструирована питательная срэда для глубинного кульга» зарозапл, обсспетапизая наиыеньаао соотиопйою ПГ/ПЭ;

- разработаны оффвэтяшко услозия очистки петгтшюсюразы от полигалаэтурокасы истодом щелочной денатурации; •

- изупзга физ'кга-жгягозгкно озойсгза па;гг:!нс<стеразн.

íLJISi?i2£3L?i = Разработанная -тсашолокш прсиззод-' сява отаздешю?! позтшюстзр&оы била апробирована з условиях Пос-ховсхого ommroro завода BISS5 плщсвоЗ биотехнолокгл. Пслуасш . сгсгхчсдэ яартпн препаратов.

Получгно рэзрсзогао о мзззр^.щгос?« .•т.польчри:к.ст арепярата ночтапзстера'зи ара произведена** гогтомототеилпровгнзюг« ясктана. ' Ориснгаровочшй эжиюггшзгяпй ©fóair? от шгедрогпш aoranuracispa-аы состазллет I512C0 руб/т лродуацшь

Лпробзппд работн. Глтсрлэлн дпссортоцни нзло.-'.гин п 5 оиуб-л:пюпашшх работах, список которух лралагазтся.

Структура и объем рзботн. Лзссэргсцкошая работа содергап ззсдзниа, обзор литературы, описшяэ ««тйрлаЕОз я ?;етодоз лгело-довшпш, иэлозсяяо рс-зультатоа и их обсуздгдоо. вигодц. птяигого-

гая, список лстератури, ютпеяяай 241 nanj«?HOB¡xrao, я то« « •

,Л9 113 на ииострзиних лзтяах. Работа яоло»г:та :;а 243 стрзгп-iísüc иялшопасаого текста,' .топеграрозо:« 15 рсуикия :s га таблицам. «•

Обзор л:ггертгури. В сО'зоро латорзх'ур*.; нрнпгдеки продуцент« для пйлуютлл похтожггаческлх ijcyicsrroi;, тихи ппгагзлыяк ср?д и услолл;} аудмазяр.иай:?:: чг:: по-

зорляоотпоя.:» глубинном аулиизпротг.яа. дс:со

составе пектолитических ферментных препаратов, выпускаемых в СССР и за рубежом, описаны условия очистки пектолитических ферментов ц уделено особое внимание очистке от"1 полигалактуроназы.

Даш биохимические характеристики рада ферментных препаратов пектолитического действий и сравнительные данные о свойствах очищенных пектинэстеразных препаратов, получаемых за Рубеком.

В разделе "Материалы и методы исследования", приведены описания методик8 использованных в экспериментальных исследованиях. Объектами исследований являлись штамш мицолиалышх грибов - про. дуцентов пектолитических ферментов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования. Анализ литературных данных показал перспективность использования микроскопических грибов рода ^рог^ё&Ж , являвшихся продуцентами промышленных пектолитических прз..аратов, содержаирж пектинзстеразу и" Р. , синтезирующий по литературным данным преиму-ществошю пектинзстеразу в комплексе пектолитических ферментов.

Для оценочной характеристики продуцента был введен ковффи-циест, показывающий пркыееь ПГ-активностк в препаратах пектин-

■о

естсразио При выборе штаммов ориентировались на максимальную продуцирующую способность пектинэстеразы при минимальной ПГ-ак-гивкостн. Исхода из этого в качестве продуцента пектиностеразы был выбран шт&ми Л М-45. -

Изучение и разработка оптимального состава пнтатепькой средк. При разработке рациональной питательной среды для культивирования отобранного продуцента было исследовано влияние источников углерода, неорганических и органических источников азота,

а ?а:с.о отделышх ндкроэломзнтоз па биосшгаоз пвктолитзгеескпх ферментов полнгалактуронагы п локтшгзстораз::,,

Исследовали влпяшго различных Сахаров (глхкогп, галактозы, каниозн, сахарозы, лактозы) при концентрации 0,5 - 4,0 % при вво-дошш з сроду Чапека-Докса. Показано, что максимальная активность пактшюсторазц достлгаотся на сродо, гдо в качество источника углерода была использовала лактоза в концентрации 1-5/5, 0,2 - 0,22 адДи и соотношенио ПГ/ЙЭ • Ю3 = 4,8 ~ 4,5.

На коделышх средах последовали влияние свокловичного и яблочного пектинов индукторов поктшаз па биосинтез пок?о.тат:пескнх ферментов.

Из результатов исследований (табл. I) зздно, что поктшш, пепользуе'.ио в качество лоточников углерода в питательной с радо по сравпотгэ с псслздоватшмн сахарамп в болкзей степени позволяют интенсифицировать блоелнтез локтолптичеекпх ферментов.

Таблица I

Влпянио свокловичного и яблочного покгшт ла. биосинтез шктолитпческих ферментов црн кулъткв:фсвак:гл Л ■ ^ссШил м-15

Щ Копцент-ц/п рация пектина, % Свекловичный пектин ПГ'103, ПЭ, од/мл од/мл пг/пэ, • ю3 Яблочнш! пектин ПГ*Юа, ПЭ, ед/ия од/мл пг/пэ; • ю3

I 0,20 2,4 ОД 24 2,0 0,25 8,0

2' 0,40 2,8- 0,3 9,3 2,3 0,4 5,8

3 0,60 ' 3.4 * 0,6 5,7 2,8 0,6 4,7

4 0,70 3,6 0,7 5,1 3\0 0,8 3,8

5 0,80 3,8 0,8 4,8 3,1 0,9 3,4

6 о; 90 3,9 0,9 4,3 3,3 1.0 3,3

7 0,95 4,0 1.0 4,0 3,4 1,1 3.1

8 1,00 . 4,0 1,0 4,0 ■ 3,4 1.1 3.1

9 1,10 4,0 1.0 4,0 ■ 3,4 1.0 3,4

Наилучшие результаты получены при использовании свекловичного к яблочкого пектина в концентрации 0,95 %. Указанные концентрации пектинов в питательной среде позволяют получить активность пектинзстеразы в культуральной жидкости в случае яблочного пектина 1,1 ед/ыл, при соотношении ПГ/ПЭ'Ю3 « 3,09, а в случае свекловичного пектина соответственно 1,0 ед/мл при соотношении ПГ/ПЭ.Ю3 - 4,0.

Учитывая, что в составе питательных сред пектин не может применяться из-за его дефицита н дорогой цены, провели поиск источников пектина, имеющих дешевую цену и являющихся вторичными материальными ресурсами» Такими источниками могут быть свекловичный жом, яблочные выжимки, картофельная мезга.

Показано, что введение в питательную среду яблочных выжимок или свекловичного жома вместо пектина позволяют интенсифицировать накопление пектинзстеразы в культуральной жидкости (рис. 1). 1.&£тшьная^1стн5с7ь~п0тс?^стэраэы"11аблюда&твд прп вводешш в качестве источника углерода яблочных въсшдок в.концентрации 9,5£п составляет 1,9 ед/ыл при сротпошв1ШИ ПГ/ПЭ* 10^-3,34.

При введении в питательную среду свекловичного жома и картофельной мезги максимальная активность пектинзстеразы достигает 1,5 е„-/мл и 0,8 ед/мл соответственно при концентрации свек-»

ловг.чного жома 5,8 % и картофельной мезги 10 %. Соотношение ПГ/ПЭ-Ю3 с увеличением концентрации пектинсодержащего сырья в питательной среде уменьшается. Таким образом, для интенсификации биосинтеза пектинзстеразы в питательную среду необходимо вводить яблочные выжимки в концентрации 9,5 %.

С целью наиболее полного извлечения пектина при получении

эедПг^, snojui

П9"10ь

пэ Je^U ^i sa/MAÏ i'

1 Z 5 А

6 7 3 9 ,<0

• - '7c

Ряс. Накоиленко пектолнтичеетах фср/.геитог.

на гштатольшк срадах, отходи производства

яблочнио вижмки

&гртофэльнал мозга ' свеглов;гчшл дам

экстрактов не яблочки;: вшшмок н свекловичного х;ога гидролиз псктшюсдержшцего сырья проводили пектофоетиднног. ИОзс в концентрации 0,01 % при температуре 40° С при естественно:.: рН суспензии* .Действие ферментов прекращали кипячением. В среду вносили только фильтрат гидрэлнеата (табл. 2).

Таблица 2

Влияние ферментативной обработки яблочных втажок и свекловичного кома н.. биосинтез пектолитических фоу-квагаиЛ^«^ М-45

Наш ¡снование Ерс-мя экстракта пщг-с-лиза,ч рн кулыу-ральной .чвдкости Сухой вес ¡¿шалил, г/100ыл ПГ^Ю" СД/.'К ПЭ. ед/'мл

Свекловичный бег гидр. • 3,9 3,2 5,0 1,5

жом клец. I 3,5 3,2 о «- 5 к. 1,8

'/о 2 3,9 3,3 5,4 е. о

3 4,0 1 о 5,8 2,4

4 4,0 3,3 0,1 2,6

4,0 3,2 6,2 2,5

6 4,0 3,2 6,2 . 2,4

7 4,0 3,2 0,2 2,4

П(':;о*ч.м!-:о визпм- без гидр. 3,6 4,0 3,0 1,9

"я п коми,. 9,Гъ I 3,6 4,0 3,8 2,3

с. 3,6 4,0 3,0 2,7

■-> 3,6 4,8 3,8 3,0

4 3,6 4,7 3,8 2,9

5 3,7 4,7 3,9 2,9

6 3,7 4,0 3,9 2,8

. 7 3,8 4,8 3,9 2,0

В табл. 2 приведено влияние глубина"гидролиза пэктина, содержащегося в свекловичном коме и яблочных выжимках, препаратом поктоД-оотчдян ГЮх на синтез неполитических $эрмен-

товА (оеисСт М-45. В результата гидролиза пектина, содержащегося в свекловичном жоме и яблочных выжимках, происходит расщвпло1ше пектиновых веществ и образование пезкомолекулярнкх фрагментов, являющихся игиукторами биосинтеза пектолитичес-кпх ферлентов,. Увеличение времени гидролиза свыше 5-6 ч. приводило к снижению количества растваримого пектина и к -увеличению продуктов его распада, в том числа редуцирующих веществ.

Сравнение различных углеводных источников питания - гидро-лизатов яблочных выжимок", картофельной мезги и свекловичного жопа показало, что повыденное накопление пектинэстеразы наблюдается на среде, содержащей 9,5 % яблочных вшсимок, гидролизопанних в течение 3 ч (3 ед/мл) против 2,6 ед/мл пектинэстеразы при культивировании на средо, содержащей 5,8 % 4-х часового гидролизата свекловичного жома и 2,1' ед/мл пектинэстеразы при культивировании на среде, содержащей 10 % 4-х часового гццролизта картофельной мезги.

С целью установления источника неоргашиеского азота, позволявшего при культивировании продуцента получить в культураль-иой жидкости максимальную активность пектинэстеразы, культивирование осуществляли на среде,где в качество источника углерода » *

был использован гидролизам яблочных выжимок в концентрации 9,5% и минеральные соли Г

В табл^ 3 представлены результаты исследований по влиянию различных неорганических историков азота на биосинтез пектоли-тических ферментов продуцентом пектинэстеразы при глубинном культивировании. Видно, что для интенсивного накопления пектинэстеразы в состав питательной среды надо вводить при этом достигается максимальный уровень пектинэстеразы при шним&льной

CD

Í4 СО

сЛ

со

о

¿Г4 о

го

о

IÜ

со

3 tf*

S

го

i .fr.

го

à rô"*

ooo ооо ооо ооо ооо ооо ооо

го го м Ol о д

со го го о "to о

СО со со « «

и H о

и нч О О *М Й

СО ГО СО <• «* ■ф

H СП W

M M H СП О k'N

ГО M M "to CD СП

СО Cil M

о о о

со со м

со м м •ф

О W

ЛЭ ГО M Ol О if.

СО со со

сэ сл о

л»

о "со M

го со го ООО

СЛ Л. ¿i.

ГО ГО M сл о д

со со со

M Ч M

со со со сл о сэ

<У> СО <1

МММ СО M M

ГО ГД M «üii

Cl Cl oí

Л í. Й M M M

м со м œ о «з

МММ

сл là.

M го M сл о ^

•г» ^ Л ■ч? о о

Ы А U

сэ го "о

со со со W ст д

м го м

M M M

a о л

>îb >£>• iN 4J "<J <?

Дь ^

O M M

s

ОЛ со

M M M

Cl

со со со O O Cl

со со со о о о

СО СО СО M СО M

о м о о о <г

МММ СО |S» lb-

л- со со

■ о к гп •a о ti •¡es

ö о к

о S g й о я S о чоко р о п с

0-5

•п a m

О I

Яй Д

о г; о

о о о о s >-J it >-l re1-" - SB

I

И

Ш"

к в ~

о

О №

н? - г

К О I

л н

£3

- К!

о ¡г;

а V к

- о о о

с*

'i'-g

с

g5

о

(3

о И

и

и

г Й

d а

о о

о Ъ S "i

сг> о *=Л о

В С3

р я

¿3

s

>

л ° & §

ю

1 ~ и

»

Ol со

>-з

р

СЛ.

fc)

П0Л1ГПШЭ коэйпцпонта ПГ/ПЭ* Ю3» Устакоплэпо, что соль

слолуог вводить в донцзитрациз 0,2 % по азоту пл. ■йспэ гпдролпзата яйлочшсс й1пл?.5ов.(Э,5£) о дсбаплашюм М^О^ в количество 0,05?"

В качество источников оргипгезского азота исслсдовали куку-руз1шй пзссграет, экстра;«? солодовых ростков, питого дроааш, кор-г-овпз дро:."?л!, пздкштты пишгас и кормовых дроахой, гвдрелиеаг

Опкгн показали, тго на исследовашплс «:сто«шков органического азота цзнСолоз язлясхся гидролиза? лиделил

Д ¡о

Гцпрслкэ ?глцолия проводил« фермеига'Л!, прот^упй/ияги при кульггшппсйтлги ¡тродуцзта псктгшгстсрази л тсте'шэ 3 и 115:1 тгм-поратуро 40°С. Вшгоц формсетя в виде куль?уралмюЛ щцксот;- сос-завляст:пешшзстераза - 4,4 од/мл и полигаластуроназа - 4,6 ад Да. |

Таким образом, сконструированная пчмтельлан среда потооля-ацая поучить пакеяиальиое количество ПО-активности при уль-вааль-но:', соотношении ПГД1Э-Ю3 при глубинном "ультивиропанип

М-45 состоит из следув'чих ко:яюнентоз: гидролпзат яблочных пшяпдж 9,5 гидролиза? пщелия продуцента Л. Й-45-10 %-} (УН4)2Ь?04-0,1 %у Ма504~0,05 %.

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАЛИ Параметра;,-и процесса культивирования, злиязщя-З! на биосинтез феривнтов, является следувэде показатели: количество посевного материала, начальное значение рН среди, тзмюратура, уроззы аорации раог.ипаачейся культуру,, продол-л?ель:гость хультйз.грования

Были исследованп вид л доличестаи посевного материала, показано, что для получения высокоактивно;! пектиностсрази яр;; ::улг>-

П

тивировании Ц-45 необходимо использовать посевной

материал в виде водной суспензии конидий в количестве 0,3-0,45?, выращенных в поверхностных условиях в течение 7 суток. Количест-

о

во конидий в I мл водной суспензии I • 10 .

Как показали опыты по влиянию исходной рН на биосинтез пектинэстеразы при глубинном способе выращивания при величине рН в пределах 3,0-4,0 отмечен наиболее интенсивный биосинтез эвдо-полигалактуроназы. Так активный синтез эццо-полигалактуроназы наблюдался при величине рН питательной среды на уровне 3,7. Для того, чтобы осуществлялся активный биосинтез пектинэстеразы, необходимо, чтобы величина начального рН питательной среды была на уровне 4,5. При величине рН 4,5 наблвдается самое благоприятное соотношение активностей полигалактуроназы и пектинэстеразы.

Наилучшие результаты получены при дробном температурном режиме культивирования, а именно,в период засева 40°С, с 0,5 до 6 часов от начала засева 37°С, с 6 до 72 часов 30-32 °С.

При исследовании влияния аэрации и перемешивания на биосинтез пектинэстеразы, максимальная активность получена при выращи-г ванни продуцента Ы-45 при дробном режиме аэрации в

ферментере, а именно: 0-36 часов I объем воздуха /объем культуры в мин.; , 36-72 часов 0,8 объемов воздуха /объем культуры в пин. .

Была исследована динамика биосинтеза данного фермента с целыз определения продолжительности культивирования. Опыты показали, что фермент пектинэстераза накапливается после 20 ч и достигает максимального значения к 72 ч (рис. 2).

Поли!'алактуроназа достигает максимума накопления активности к 96 ч, после этого уровень полигалактуроназы снижается.

пз гадз-

ц/м А

7

-10

6 9

5- 8

7

4

5

3-

А

2- 3

2

А

0 1

пг, .

Е^/млчо*

96 -Г08 Г-ЧАС

ВРЕМ* КУАЬТИИЛРОЬЛЦИЯ.

Рпс. 2. Динамика накоплеппя ПЭ п ИГ пр" глубинном культивировании

ШДЗЛЕШЕ И ОЧИСТКА ПЕКГИНЭСТЕРЛШ Исследование н разработка промышленных способов выделения, концентрирования и очистки пектинэстеразы из культур, выращенных глубинным способом в нашей стране,проводятся впервые.

Отделение биомассы проводили традиционными способами. В лабораторных условиях фильтрацией через бельтинг на воронке Бвхне-ра или центрифугированием при 3000 об/мин о течение 15-20 мин.

Концентрирование культуральной жидкости проводили в лабораторной вакуум-выпарной установке при температуре Я0-32°С до концентрации сухих веществ 14 %.

При построении схемы очистки основное внимание было удсгено разработке метода удаления ферментов аолигалактуронаэного комп-

13

локса псотшзстерази« Анализ литературных данных показал, что

пектинэстераза по сравнения с полягалактуроназой более устойчива

*

в полочной зоне рН= Бьи выбран способ избирательной денатурации под действием рН. Бапо исследовано влияние яошоратуры и длительности оксповицин на полноту оселзделпя полигалактуроназного комплекса {•габл. 4). Следует отазтитъ, что существенное влитию па Еффэжгивкосгь удаления полнгалактуроназного комплекса оказывает правильная последовательность приемов фильтрации-нейтрализации фермзнтпого раствора. Нейтрализация раствора до рН 4,0 посла отделения ииакяизнровапшго белка позволяет дополнительно освободиться от 2,5-3 % ПГ-ашншгостн,,

Таблица 4

БЛПЯШО 5С1318р»Тура и длительности СКСП00ИЦ5Ш на акзизгас-гь квктолиг'гавсках фермэгооз з иощеиграте культурзлыюй яидкестц (ссдср.глжо сухих зеществ 14 %)

Щ Время Тсшература, Остаточная активность, •%

и/л инкубации, оп —-————-——-

час эццо-ЯГ ПЭ

1*1 6 0,80 56

2 I £0-22 0,70 ' 50

3 1 - 30 0,40 48

4 1 40 0,10 40

5 2 6 0,60 . 48

6 2 20-22 0,50 ' 45

7 2 30 0,50 44 4 2 40 0,17 38

Показано, что температура влияет на процесс мнгибирорания фзруентов. Наилучшие показатели по остаточной ПГ-активности 0,15-0,7 % реализуется при тетерлтуро 4С°С. Однако при отом темпера-гурном режима наблюдается значительная потерт ПЭ-активности

£0 'X). По сочетонта показателей условий щелочного шока и coli

отнопсшшк пойигалактуроисеноП и псЕткизстсразной активностей п препарата бил ЕЬ'брэ.и рацкокаяыкП режц денетурс-ции: длетель-ность I час и тсгясраяурщгй нетерзал 6-2-0°С.

Дта разработгш рационального регшз спиртового осаздения псктинсстсрасы из ферментного раса кора» подучешюго после щелочного пока, били проведена кселсдовсшш по влюшга конценгрзщи этилового спирта в сшси ка полноту ссаэдеши пектолнтичоских ферментов (р:;с. 3).

100'

¡30

со

АО

20

П9

/ /

® """"""" йГ

■

*

.71 72 75 74 15 76 77 78 79 80 25 3,0 3,5 Ар

Об % спит

0Б.СГ1КП*. 05. УСТЮГА

Рис. 3. Влияние концентрации этилового спирта в смеси на полноту осаздеяия асктологических ферментов. Установлено, что для осаждения пектинэст^разы из ферментного раствора достаточно 3-х объемов старта, при этих условиях наблюдается фракционирование ферментоз пектолитического комплекса. Выход пектинэстсразы состазляет 95-СС %, л полигал.ь::т^рон.".ги

30-35 %.

В результате исследований разработана,схема получения препаратов пектинэстераэы различной степени чистоты из культураль-ной жидкости Л ^ое&аЬы Ы-45. Характеристика стадий препарата пектинэстераэы представлена в табл. 5.

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПЕКТИНЭСТЕРАЗД

Дня точной характеристики и правильной оценки действия пектинэстеразы бил определен температурный и рН оптимум. Полученные результаты представлены на рис. 4.

Максимум активности проявляется четким пиком при рН 5,5. Анализ полученных результатов и литературных данных (Павлова Н. и др., 1982) показал, что рН-оптимум препарата, полученного по данно.й технологии сдвинут в щелочную сторону, что можно объяснить условиями ввделения фермента, в частности щелочной обработкой фррмектно 'о раствора.

Максимальная .активность пектинзстеразы проявляется при температуре 30°С. Дальнейшее повышение температуры резко снижает активность фермента. Полная потеря активности фермента происходит при тешературэ 60°С.

Доя описания потребительских характеристик препарата пектин-естерази были исследованы терш- и рН-стабильность. Динамика инактивации при различных значениях. рН приведена на рис. 5.

За первый час инкубирования пектинэстеразная ¡активность растет, достигая максимального значения 140 $*от исходной рН 5 и 130 % при рН б. Зги данные коррелируют с результатами наследований по рН-от..цуму (максимальная активность пектинэстераэы при рН 5,5). Вероятно, в этом случае достигается коиформационная бел-когччл структура наиболее .благоприятная для взаимодействия с суб-

стратой. Прн рН 4 не наблюдается какого-либо снижения ферментативной активности.

На рис» б показаны результаты исследований по терыостабиль-юсяи паитингстеразы. йзрыекг лабилен при тешературе 30°С аа 4¡,5 часа он теряет до 30 % от первоначальной активности, при тешературз 40°С в течешю 1,5 часов теряет 60 %, а при 60°С за 45 шшут происходит полная инактивация фермента.

Наблюдается фаза температурной активности пектннзстерази.

30°С увеличивается активно ать'53 1,8 раза по сравнении о.Еоходаоаьчвреа". 2 часа, при 40°С - б 1,7 раза, через 40 минут; Таким обрагом, пик максимальной активности сдвигается в сторону увшгсзгая теиператури. При увеличении теыяературы увеличивается скорость всах рзакций, и ь перзуо очэрздь скорость активации.. Тех5 при тешературе 60°0 максимальная активность проявляйся черзз 5 ыннут, при 50°С через 20 мицут, при 40°С через 40 шшут, однако, одноврэмгшо растет и скорость инактивации. Следовательно своего максимума тераоактивация достигает только при теыле-ратурз 30°С, ворсятао, в- данном случае достигается оптицум соотнесений активации-инактивации пектинэстерааы.

В результате исследований била изложена технологическая схема производство ферментного препарата пектинэстеразы с использованием глубин;»го метода культивирования продуцента.

Технологическая схема вкличает в себя следующие основные ага.пы:

- подготовка и стерилг1ация питательной среды;

- кулътивитюванио Л. ¡,'-45 глубинным способом:'

- отделение биоиасси сепарированием;

- концентрироеане культуральной жвдкасти на вакуум-выпар-нэй установке;

ПРОЦЕССУАЛЬНАЯ СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСШХ ПШСГОЖГИЧЕСКИХ 8ЕРМЕЖШХ ПРЕПАРАТОВ И ПШШШЭСТЕРАШ

I Компоненты питательной I среды

I пщролизот ябл.выжимок

! О 9 О с/о,

пэдролизат мщелия 10 % | (,У114)211Р04 -0,1% - 0,05 %

Г

Посевной материал

Ткудьтивирование 72 ч|

Уицелий Ц— Фильтрация или сепарирование (куль-[. —:- туральнал жидкость, с.в. 1,5%) р

т

Вакуумконцеттарование (концентрат с.в. 14-15 %)

-5ГЗ-

Распылительное высушивание

Пектофоетидин ГЗх

Нодщелачивание (до рН Н-12, 1-2 ч)

Сепарирование или центрифугирование^—^Осадок

т

Подкисление, (рН 4,0-4,5)

Этиловый спирт

Спиртовое осаядение (рН. 4-4,5) Водоспирговая смесь 75-78 % об

Распылитель^ ное высуши вание

<*7

ь ^Сепарирование или центрифугирова- МВодноспиртовая!

- ]ние___Г>' смесь на рек-

1--" ~~ ткфикацир |

Пектофое-тидин ГЮх

Лиофильное высушивание

ПЕКГйНЭСТЕРАЗА

м а

Таблица 5

таСШЛОГИЧЭСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СТАДИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА "ПЕКГИНЭСТЕРАЗА"

Щ Продукт Содьр- Вес, Выход АКТИВНОСТЬ ИТ/

и/л жание г по '-—-——-—----——-— ... ———=— тп3

с.в., весу, Пектинэстераэы Полигалактуроназы 1и

ед/ил ед Быход.% ед/ия ед Выход

по по по по

стад, исход. стад, исход.•

I. Культу-

ральная жидкость

1,5 100 100 4 400000 100 100,0 5-Ю3 5-Ю8 100 100 1,3

2. Концентрат культураль-

ной жвдкос- л л

ти 14 10 93,3 28,8 28,8 72 72,0 375-10^ 375*10ь 75 75 1,3

3. СерментныЯ раствор после щелочного • А р шока 10 9,6 64 15,6 149760 52 37,4 78 75-Ю4 0,2 . 0,15 0,005

4. Лиофили- . , . -

зированный ' ' :

препарат ПЭ после спир-то-осажде- •

х 96 200 13,3 584.Ii II68I3 78 29,2 3075 61,5-Ю4 82 0,12 0,005

"А/г Е4./Г

МИНЕГАЛкЧЫЕ СОЛИ

Рис. 7.

Технологииекая схема производства препаратов поктофоетвдина ГЗх, пектофоэтиднна ГГОх и пок-тинэстеразы.

I - реактор дал приготовления гндроли'зата яблочных вшшлок; 2 - реактор для' приготовления . гвдролиьата мицелия; 3 - смеситель; 4 - стерилизатор; 5 - ферментер; 6 - инакулятор; 7 - сепаратор; 8 - вакуум-выпорная установка; 9 - реактор для щелочной обработки; 10 - холодильник;

II - установка для непрорывного осавдения ферментов-пз раствора этанолом; 12 - холодильник; ■ 13 - сублимационная оуяшлка; 14 - сборник для раствора НО ; 15 - сборник для раствора ОН; 16 - распылительная судалка.

- мгибировапи'е полмгалактуроназного комплекса щелочной обработкой ;

» ' '

- вздвяшшз пектышетзразы осазденисм этанолом;

- лксфкяъное высушизшно осадка.

ВЫВОДЫ

1. Выбран штаги A, -^o&Úcfós Ы-45, являющийся активным продуцентом, пектиазстеравьи

2. Разработана технология получения препарата пэхтинзетара-зЫ при глубинной культивировании Л. foeùdit* îi-45. ,

3. Сконструирована питательная ерзда для глубинного кульги-дзгаовашя Л. JfC-dicàx Ы-45, содераащая гадролнза» яблочше: выхммэк ЭГБ %, гцяродизат ищется -ji. ^cciùàcS М-45 - ÏO

gHFO^ - 0,1 llïSo^ - 0,05 %. Установлено, что бгшепктеэ пзктинзетерази мещуцнруёгел введением в ерзду пектинзетеразного шздуязора - ябло«пак вшамок и дополнитолышх источников азота в вадэ экстракта солодовых рост::ов5л:;бо гвдролизата грибного улцолия. 4

' 4. Определены роц'ло^азыгиэ услов::л кудьтнвироваши ;

М-45, обеспэчнвггчиа наилучзее соотношэнпз ЛГ/НЭ • активностей в культуральной ходкости: дефреронцировашшй tcisio-ратурлып ражи - тс-лзература засеза 43°С, к 6 часу-температура v сбегается до 37°С; с 6 пасоз до конца культивирования подцергш-васгся 20-22°С. Pesai аэрация: перзаз 36 часов - 1 гР зоздуха/ы3. •час, до хогща хулып1з:11)оьл.т1л"0,0 iP з'оадуха «час; продолгеггель-. £;ость культиаарованпя 45-41 часоз; рН ергдо 4,5 при засезэ„ При культивировании Д., ф^Уи^Ъ М-45 в опквазировамп« условиях на подобранной питательной сродо удглось достигнуть, повшоссш . пекткнм.уерллкой ?.кт».оности в 5,5 раз по сравнен;® с базовые зд-

риангоы и активность пектиигс?сргзы составляет 4,5 - 6,2 ед/ид, активность полигалактуроиазы - 5-105 - 6,7«Ю3 ед/ш„

5. Разработан роккм ннгибировагаш фернежов полигалаотуро-пазного комплекса методом щолошюй обработта при экстремальном значении рН 11-12, обоспечлппвщий ккакткЕгщта полкгагагагуроназы на 93,5 - 92,7 % от исходного количества, при сохранении пкгиш-сстсразкрй активности до 60 %,

С. Отработаны ускоскя щцегенкя препарата псзетппгстсраги оргапкческикп раствормтолгпс!. Усгепэвлепо,' что наиболее целесообразно ос&тдеинс проводить етило.пел спиртом при концентрат *Бодао-сш:рговой скоси 75 - 78 %.

7. Наработан в опытно-проиуялега: к условиях препарат очищенной пектнпэстеразн.

8. Изучеш флзико-хигсгтескио и биохгаггческис характеристики пекткнгстерозы, полученной по разх чботашгай технологии. Опре-делегш рН и температурная стабильность, рЯ и температурные опти-ыуш, молекулярная касса и изоэлектрнческвя точка.

9. Экономическая эффективность от применения пектинэсте-

разы составит 154200 руб/т продукции.

Осноыше полокенйя диссертации излоаены в следующих работах:

1. Ахвледааш! З.Г., Калуншщ К.А., Микроорганизмы - продуцента пектипэстеразы. - Ден. в АгроШШТЭИяищопром 19.04.89, й 2046.

2. Ахвледиани З.Г., Калуншщ К.А. Питательные среды дога культивирования продуцентов фермента пектипэстеразы. - Деп. в АгроНИИТЭИ пищепром 19.04.89, й 2045.

3. Ахвледиани 5.Г.г Сад ока А. И., Староотша И.Н. Использование вторичных материальных расуроои для конструирования питательных срэд при бпосшгеозв пекшгостерази. - Материалы научно-технической коифсргнцпн "БцБ- 90й, Тамбов, 1990.

*

4. Ахвледцашд 8.Г., Старостш1а ИЛ1«С Садова АЛ1. Культивирование микроскопического гриба -4. /й&Ъ^щ 0 целью биосинтеза фер-пента пектпиэстер&зн. -'Тозисы Всесоюзной научно-практической конференции г.Черновцы, 12-16 ноября 1990 г.

5. Ахвледиани З.Г. Использование и разработка способов выделения, концентрирования ц очистки поктинэсторазц. - Деп. в АгроНИИТЭИ пищепром, 1990, & 7.