автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Разработка технологии дрожжевой полигалактуроназы и ее применение

: од

" ГОСКОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ __ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ _

На правах рукописи НГУЕН ЛА АНЬ .

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ДРОЖЖЕВОЙ ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

05.18.10 - Технология витаминных, ферментных и белковых препаратов, чая и табака

Автореферат диссертации на соискаппе ученой степени кандидата технических наук

МОСКВА- 1995

Работа выполнена на кафедре " Биотехнология, экология и сертификация пшцевых продуктов" Московской государственной академии пищевых производств.

Научные руководители: \

доктор биологических наук, профессор И.М. Грачева кандидат технических наук С. С. Покровская Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор И.А.Попадич кандидат технических наук Л.В.Югова Ведущее учреждение:

ВНИИпищевой биотехнологии

Защита диссертации состоится " ¡)5~ " 1995г.

в {¿часов на заседании Специализированного Совета К 053.51.04 Московской государственной академии пищевых производств.

Просим Вас принять участие в работе ученного Совета или прислать отзыв (в 2-х экземлярах, заверенных печатью учреждения) по адресу : г. Москва, 125080, Волоколамское шоссе, д.И, МГАПП, ученному секретарю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГАПП.

Автореферат рослан " 05" " 1995г.

Секретарь Специализированного Совета к.т.н., доцент

О.И. Тихомирова

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время пектолитическне ферментные препараты находят все более широкую сферу применения в различных отраслях промышленности , в сельском хозяйстве, в науке и медицине. Полигалахтуроназа (К.Ф.3.2.1.15, поли(1,4-оЮ-галактуроннд) - гликанопщролаза ), катализирующая гидролиз 1,4-ц-В-галактозидуронидных связей в галактуро-канах, продуцируется многими микроорганизмами .

В данный момент большинство пектолнтических ферментных препаратов, выпускаемых как в России, так и зарубе-жом имеют грибное и реже бактериальное происхождение. При необходимости целенаправленного использования пектиназ, эти препараты вызывают ряд трудностей из-за того, что они содержат, помимо полигалактуроназы, пектинэстеразу, протеиназы, целлюлазы, гемицеллюлазы и ряд других сопутствующих ферментов. Все отрасли, применяющие пектолитическне ферментные препараты, особенно при производстве соков и внн постоянно предъявляют повышенные требования к чистоте и составу используемых ферментных препаратов.' Именно эти требования создали необходимость разработать новый ферментный препарат полигалактуроназы зысокой степени чистоты, не содержащий лехтинэстеразы т.к. присутствие этого фермента в препаратах неизбежно приводит к образованию в реакционной среде метилового спирта, что недопустимо в виноделии и особенно при производстве соков. Однако, выделение полигалактуроназы из сложного комплекса белков, содержащихся в технических препаратах, требует проведение трудоемкой, многоступенчатой очистки вплоть до использования хроматографических методов разделения и очистки. Использование такой многоступенчатой очистки приводит к резкому удорожанию препаратов и невозможности их промышленного производства и применения, т.к. это экономически не выгодно.

Известно, что количество синтезируемых гидролитических ферментов у дрожжевых культур значительно меньше,

чем у грибных культур и бактерий. Но в тоже время известно, что отличительной особенностью некоторых штаммов дрожжей рода Юиууеготусез является то, что они активно образуют пек-тиназы, содержание которых может достигать 80-90% от всей суммы белков клетки. Так установлено, что белок, обладающий эвдо-полигалактуроназной активностью составляет около 90% от общей суммы белков, секретируемых дрожжами в культураль-ную жидкость. Однако до настоящего времени, несмотря на очевидную перспективность применения, дрожжевые пектолитичес-кие ферменты изучены менее пекпшаз других микроорганизмов. Поэтому представляется интересным, важным и актуальным исследование дрожжей с позиции поиска среди них продуцентов ферментов, предназначенных для соковой и винодельческой промышленности.

Цель и задачи работы. Целью работы являлся поиск активного продуцента полигалактуроназы среди дрожжевых культур, разработка условий его культивирования и последующего применения полученного ферментного препарата.

В соотвествии с этим необходимо было решить следующие задачи:

_ выделить активный продуцент полигалактуроназы среди дрожжей;

_ исследовать и оптимизировать условия биосинтеза полигалактуроназы; -

_ исследовать влияние состава питательной среды на биосинтез полигалактуроназы, и провести оптимизацию состава питательной среды;

_ изучить свойства полученного препарата полигалактуроназы;

_ провести апробацию препарата дрожжевой полигалактуроназы в соковой и винодельческой промышленности.' •

Научная новизна. Основываясь на данных литературы, было отобрано 27 дрожжевых культур, возможных продуцентов поли-

галактуроназы и не синтезирующих пекпшэстеразы. При скрининге этих культур была выделена культура, обладающая способностью к сверхсинтезу внеклеточной полигалактуроназы без сопутствующей пекпшэстеразы _ это штамм Zygofabospoгa тагаапа ВКМ У-848.

Разработаны условия культивирования, обеспечивающие максимальный выход фермента. Установлена оптимальная питательная среда для глубиного культивирования? этого микроорганизма. Получен ферментный препарат полигалактуроназы и впервые осуществлена апробация данного дрожжевого поли-галаетуроиазного препарата в производстве соков и вин.

Показана возможность создания мультиэнзимвой композиции (МЭК) на основе изучаемого фермента.

Практическая ценность. Проведенные исследования послужили основой для разработки технологии нового препарата дрожжевой полигалактуроназы.

В качестве основного компонента питательной среды для бноезштеза пелигалактуроназы использована молочная сыворотка _ это очень, важно, т.к. создаются селективные условия для получения нового ферментного препарата с одновременным рацнокалышм использованием трудно утилизируемого вторичного сырья молочной промышленности. Разработаны также условия получения и использования гидролизата крахмала, сравнительно дешевого компонента среды, который в тоже время позволяет значительно повысить биосинтез полигалактуроназы микроорганизмом. ,

Дролохевой ферментный препарат был проверен в условиях опытно-производственной базы Института винограда и вина "Магарач". Испытания показали, что он не уступает по своим свойствам препарату пектиназы "Пектофоетидин ШОх", который в данный момент применяется в производстве соков и вин, а даже его превосходит, т.к. в нем отсутствует пекганэсгераза, что позволяет исключить. накопление в соках и винах метилового спирта.

Апробация работы и публикация. Работа дважды заслушивались. на межкафедральном коллоквиуме МГАПП (1993; 1994г.).

По теме диссертации опубликованы три статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы , методической и экспериментальной частей, выводов, списка использованной литературы и приложений.

Диссертационная работа изложена на 185 страницах машинописного текста, содержит 34 таблиц, 11 рисунков и 3 приложения. Список литературы включает 235 наименований отечественных и зарубежных авторов.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введение обоснована актуальность темы и направление исследований.

В обзоре литературы дано представление о пектиновых веществах. Проводятся данные о пехтолитических ферментах и их продуцентах, и также об особенностях их биосинтеза и получения. Изложены аспекты применения ферментных препаратов пехтиназ. ' " "'

В результате анализа данных литературы установлено, что в настоящее время недостаточно освещены вопросы дрожжевой полигалактуроназы и ее применения. С учетом этого обоснованы цель и задачи настоящего исследования.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили чистые культуры дрожжей, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РФ (ВКМ), во ВНИКсктез-белок, Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН РФ (ИБФМ, г. Пущино на Оке), ВНИИГвдролиз (г. С.Петербург), Институте винограда и вина "Магарач" (г. Ялта), а также из коллекции кафедры " Биотехнология, экология н сертификация пищевых продуктов" МГАПП.

Активность полигалактуроназы определяли вискозиметри-ческим методом (Лифшцц Д.Б. и др., 1974). За единицу активности полигалактуроназы принято количество фермента, которое при температуре 30°С и pH 5,0 катализирует гидролиз одного мг пектовой кислоты в минуту со снижением вязкости раствора, на 20%.

Для получения глюкозного сиропа из крахмала, применялся метод ферментативного гидролиза крахмала ( ЛаДур Т.А., 1978). Содержание глюкозы определяли с помощью модифицированного ферроцианидного варианта глюкооксидазного метода (Щербухин В.Д., 1970). Содержание Сахаров определяли по методу Щомоди-Нельсона (Клесов A.A. и др., 1980). .Пектинэстеразную активность определяли по титрованию свободных карбоксильных групп ( Kertesz Z.I., 1951).

При разработке сбалансированного состава питательной среды использовали план полного факторного эксперимента ПФЭ 2t Грачев Ю.П., 1979).

Электрофоретическне исследования фермента проводили по методу Дэвиса (Davis B.J.,1964) и Орнштейн (Ornstein L., 1964) в модификации. Сафонова В.И. и Сафоновой М.П. (1969).

Все опыты проводили не менее, чем в 3 - 5 повторностях. Результаты, представленные в работе, являются средними арифметическими величинами.

Для исследования дрожжевых культур применяли следующие питательные среды:

Среда 1 (г/л): глюкоза - 30; дрожжевой экстракт - 0,5; минеральные соли среды Ридера :(NHi,^SOv- 3,0; MgS0v.7H20-0,7;NaCl - 0,5; КНгРОг 1,0; К2НРС\.ЗНр - 0,1; pH - 3,5.

Среда 2: пастеризованное виноградное сусло с массовой концентрацией Сахаров 16 г/100 см ; pH - 3,5.

Среда 3 (г/л): молочная сыворотка - 20; минеральные соли среды Рид ер: (NH^SO, - 3,0; MgSO^ ,7Нр - 0,7; NaC] - 0,5; КН2РО, - 1,0; КгНР04.ЗНг0 - 0,1; pH - 3,5.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Выбор продуцентов, обладающих высокой способностью к биосинтезу внеклеточной полигалактуроназы, среди дрожжей рода Юиууеготусея.

С целью выявлений активного продуцента полигалактуроназы было проверено 27 штаммов, относящихся к 3 видам рода Ииууеготусез.

Все культуры выращивали в пробирках с 5-тъю мл питательной среды при 28- 30° С в течение 5 суток при анаэробных условиях. Для выращивания использовали среды Ыо1 и Мо2.

Результаты этих опытов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Сравнение способности дрожжевых культур к биосинтезу внеклеточной полигалактуроназы.

Наименование культуры по классификации Лодцер Активность фермента^ ПГ/мл,на средах

N01 Ыо2

Юиууеготусез ай-капиБ 246 0 0

К. тапиализ у.1асйс ВКМ У- 868 0 0

К. тапаавиБ ВКМ У- 876 0 0

К. шатания у.Ьи^апсиз ВКМ У- 1242 0 0

К. тапиапиБ у.сЬЬгЬап&п! ВКМ У- 1293 0 0

К.тапиапиз у.рЬаБеоЬзрогиБ ВКМУ-1296 0 0

К.татапиз у.скоюрЫПагит ВКМУ-1302 0 0

К. шатания у.уапиёепи ВКМ У- 1535 0 0

К. татапия у.теткелц ВКМ У- 1545 0 0

Продолжение таблицы 1

Наименование культуры по классификации Активность фермента,ед ПГ/мл, на средах

Лоддер Кудряцева N0! N02

К1иууето- РаЬохрога Гга^И^з 54 80 24

тусеэ К /га^Шг ВКМ У-126 128 58

Т. ЛадИм ВКМ У-429 230 36

Р. ЛадИ« ВКМ У-490 21-0 36

Р. {га^Шн ВКМ У-431 140 42

Р. &адЩ8 ВКМ У-1335 220 100

Р. {гавШв ВКМ У-577 80 16

КЬууего- Р.тасес1ошеш15 ВКМ У-480 600 110

тусег Р. тасесЬшегшз ВКМ У-486 275 150

татапи5 Р. тасесЬшег^ ВКМ У-1148 280 86

Р. шасеёошеп515 ВКМ У-1187 260 105

Р. тасесюше1ш5 ВКМ У-1188 240 130

гудоГаЬозрога шатала 160 44

ВСБ У- 619

Ъ. шатала ИБФМ У- 609 210 55

Ъ. шатала ВКМ У- .832 .600 540 -

Ъ. шатала ВКМ У- 833 185 68

г. шатала ВКМ У- 595 128 46

1. шатала ВКМ У- 848 660 600

Наибольшую .способность к биосинтезу полигалактуроназы по данным табл.1 проявляли следующие культуры : РаЬозрога йгайПЬ ВКМ У-429, Р.тасес1ошеш15 ВКВ У-480, ВКМ У-486, ВКМ У-1148, К^Ш ВКМ У-1335, ZygofaЬospoгa шатала ВКМ У- 832, ВКМ У- 848. Среди этих семи штаммов дрожжевая культура г.татапа ВКМ У-848 накапливала наивысшее количество- фермента в культуральной жидкости на обоих средах. Культуральная жидкость проверялась на присутствие в ней пектинэстеразы, которая не была найдена. Электрофсретически показано, что полигалактуроназа, выделяемая штаммом 2.татала ВКМ У-848 во внешнюю среду составляет • основную часть секретируемых белков. В результате

проведенных работ нами был выбран штамм дрожжей 1.тагх1апа В КМ У-848 в качестве продуцента полигалактуроназы.

Именно этот штамм (г.тапаапа В КМ У-848) послужил основой настоящего исследования, проведенные эксперименты позволили создать новую технологию по производству дрожжевой полигалактуроназы и разработать условия ее применения.

4.2 Изучение и оптимизация условий культивирования, обеспечивающих максимальный уровень синтеза полигалактуроназы дрожжами 2. шатала В КМ У-848.

При определении оптимальных условий культивирования г.татапа В КМ У-848 исследования проводились на среде N0 3. Во избежание потерь ценных питательных веществ при воздействии высоких температур на молочную сыворотку, стерилизацию осуществляли в сравнительно мягком режиме при 0,05 МПа в течение 30 минут.

На такой же среде изучали влияние рН среды, температуры культивирования, условий .аэрации среды на рост культуры., а главное на биосинтез ею внеклеточной эндополигалактуроназы.

4.2.1.Влияние температуры, рН среды и аэрации на биосинтез полигалактуроназы дрожжами г.шапаапа.

На биосинтез фермента большое влияние оказывают условия жизнедеятельности микроорганизма. Биосинтез полигалактуроназы изучали в интервале температуры от 27 - 40° С. Было показано, что максимум накопления активности фермента в культуральной жидкости наблюдается при температуре 30-34°С. Это позволяет делать вывод о том, что наша культура относится по какой-то мере к термотолерантным микроорганизмами. Также установлено, что оптимальным значением рН среды является 3,3-3,5.

Известно, что дрожжи являются факультативными анаэробами и изучаемый нами продуцент относится, именно, к этому типу микроорганизмов. С целью выяснения того, в результата

какого обмена веществ идет синтез внеклеточной голигалактуро-назы, мы культивировали дрожжи при разной степени аэрации среды , при ее перемешивании или в анаэробных условиях. В результате эксперимента установлено, что наиболее высокие значения активности наблюдается тогда, когда осуществлялось выращивание продуцента в анаэробных условиях, при брожении, при заполнении сосуда питательной среды почти польностью (коэффициент заполнения 0,9), в то же время необходимо отметить, что образование биомассы в аэробных условиях значительно больше, чем в анаэробных. С целью ускорения процесса биосинтеза за счет увеличения интенсивности роста клеток был поставлен опыт, в котором первые сутки культуру выращивали на качалке, затем ферментацию вели в анаэробных условиях. Однако при этом наблюдали резкое снижение биосинтеза фермента. Таким образом, было установлено, что продуцент следует выращивать при ограниченном доступе воздуха с самых первых часов культивирования.

4.2.2. Подбор условий получения посевного материала.

Подготовка посевного материала является одним из важных этапов технологии получения, ферментного препарата. Из экспе-, риментальных данных установлено, что целесообразно использовать 2-х суточный посевной материал, находящийся в состоянии активного роста в количестве 1,5% по отношению к объему среды.

4.2.3. Изучение динамики роста культуры и накопления ею внеклеточной полигалактуроназы.

Динамика роста микроорганизма и биосинтез им полигалактуроназы представлена на рис. 1.

Из рисунка видно, что достаточно интенсивный синтез фермента имеет место уже в самом начале экспонециальной фазы, а максимальное накопление эндополигалактуроназы завершается в конце стационарной фазы роста продуцента, приблизительно в интервале времени от 3,3 до 4 суток. Таким образом, экспериментально доказано, что способностью синтезировать полигалак-

Длительность культивирования, сутки Рис. 1. Динамика роста и биосинтеза полигалаюуроназы дрожжами Ъ. тапаапа.ВКМ У-848: 1.толигалактуроназная активность в культуральной жидкостн.2.биомасса продуцента

туроназу обладают только молодые активно растущие клетки дрожжи Т.. тапаапа.Способность дрожжей Ъ. шатана выделять и сохранять активность фермента в течете длительного периода выгодно отличает их от микроскопических грибов, у которых уже через несколько часов после достижения максимума наблюдается значительное снижение активности пектолтических ферментов в культуральной жидкости.

В результате проведенных опытов выбрана оптимальная длительность культивирования 4 суток.

4.2.4. Влияние других факторов на биосинтеза лолигалахтуроназы.

Нами было исследовало шггнбнрующее действие различных металлов (сплавов,, стали нескольких марок, железа) на биосинтез фермента. В каждую колбу вносили пластинку металлов, соотношение площади коитакта когорт с «клемг?«-': питатель?; >лх

сред моделировали условия имеющее место в ферментере. В модельных опытах было показано, что присутствие в среде ионов тяжелых металлов сильно тормозит синтез фермента, уровень активности которого в присутствии металлов составлет лишь 10% - 54% от контрольного эксперимента.

Наблюдаемый эффект послужил основанием для более глубокого изучения наблюдаемого явления. С этой целью мы исследовали влияние некоторых микроэлементов (Со\ 2п, Мп Си", Ре*4, Са+), которые вносились в питательные среды в виде солей незначительными дозами ( от 10 до 10*%). Было отмечено, что все исследованные катионы за исключением Са) снижали биосинтетическую способность культуры по отношению к полигалактуроназе. При этом активность полигалактуроназы составляет лишь от 20% до 87% от контрольного опыта. Ионы Бе и Со являются самыми сильными ингибиторами. А внесение Са в питательную среду в количестве 10~г % повышало уровень биосинтеза фермента приблизительно на 30%.

Таким образом было установлено, что изучаемая нами культура дрожжи Ъ. тага ада ВКМ У-848 является очень чувствительной к катионам металлов. В результатае проведенных работ было рекомендовано проводить культивирование дрожжей в эмалированных ферментерах. Необходимо также контролировать уровень солей Бе24 и Сог< в используемой водопроводной воде.

4.3. Влияние состава питательной среды на биосинтез полигалактуроназы.

4.3.1. Влияние фажтров роста и источника углерода на биосинтез полигалактуроназы.

В качестве факторов роста и индукторв биосинтеза проверяли следующие вещества: тиамин, янтарную кислоту, пектин, галактуроновую кислоту и лактозу, в концентрациях от 0,0001% до 0,05%. Показало, что тиамин и лактоза существенно интеси-фицируют процесс биосинтеза. Присутствие в среде пектина и

галактуроновой кислоты не влияло на интенсивность биосинтеза эвдополигалактуроназы, что позволяет говорить о конститутивной природе этого фермента.

В качестве источников углерода был испытаны глюкоза (табл.2), лактоза (табл.3) и некоторые виды молочной сыворотки.(табл.4).

Таблица 2

Влияние глюкозы на биосинтез полигалактуроназы дрожжами Zygofabospoгa шатала В КМ У-848

Содержание глюкозы в 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

среде,%

АпивностъПГ.ед/мл 258 469 590 678 825 611 618 561 540 59

±10 ¿40 ±40 ±52 ±30 ±33 ±20 ±10 ±40 ±4г

% от махсжиук» ПГ 313 56|$ 71,5 823 100 741 74^ 68^0 6^5 Ц

Таблица 3

. Влияние лактозы на биосинтез полигалактуроназы. дрожжами Zygofabospoгa шатала В КМ У-848

Содержание лактозы в среде, % 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Актив восгьПГ.ед/мл 337±25 529±42 70 ШО 515^20 425*20 387±10

У. от максимума ПГ 48,1 75,5 100,0 73,5 60,6 55,2

В опытах с лактозой выращивали культуру на фоне среды, содержащий 0,5% глюкозы, 0,1% дрожжевого автолизата плюс соли среды Рид ер. Представленные в таблицах 2 и 3 данные свидетельствуют о том, что наиболее высокая активность полигалапуроназы наблюдается при культивировании дрозжек на средах с содержанием глюкозы 4-5% или лактозы 1%.

Известно, что молочная сыворотка является лактозосодар-жащим источником. В среднем молочная с; ... ротка содержит до

48-52% сухих веществ молока, таким образом, представляет собой продукт, включащий практически все составные части молока: лактозу, белки, жир, соли и т.д., но в ином соотношении. Нами было изучено влияние вида молочной сыворотки и ее концентрации в среде на биосинтез полигалактуроназы нашим продуцентом С табл.4 )

Таблица 4

Влияние вида молочной сыворотки и ее концентрации в среде на биосинтез полигалактуроназы дрожжами 2уёо{аЬо5рота. тапаапа ВКМ У-848

Вид сыворотки, высушен- Концентрация молочной Активность ПГ,

ной распылением сыворотки в среде, % ед/кл

0,5 580 ±20

Подсырная, Уфа 1,0 1100 ± 60

1,5 1680 ± 57

2,0 1860 ± 98

2.5 1920 ± 103

Подсырная, Ставтрополь 1,0 860 ± 40

* • 0,5 ' 420 ± 35 '

1,0 806 ± 20

Творожная, 1,5 1109 ± 70

Ставрополь 2,0 1450 ± 56

2,5 1530 ± 56

3,0 1482 ± 50

4,0 1140 ± 27

Из полученных данных можно сказать, что биосинтез фермента значительно отличается на разных молочных сыворотках. Вероятнее всего это связано с качеством молока, условиями кормления животных и технологией производства молочного продукта. В нашем случае наиболее предпочтительной для биосинтеза полигалактуроназы лзлялчсъ подсырная молочная сыворотка уфимского производства, добавляемая в среду в количестве 2 - 2,5%.

4.3.2 Оптимизация состава питательной среды с использованием математических методов планирования экспериментов

В качестве оптимизируемых факторов в составе исходной среды были избраны глюкоза, лактоза, дрожжевой автолизах и молочная сыворотка. При постановке опытов использовался план полного факторного эксперимента ПФЭ 2 * . Не будучи уверенными, что все эти факторы будут входить в состав питательной среды, мы выбрали следующие диапазоны изменения концентрации этих компонентов: глюкозы_ от 0 до 4%, дрожжевого автолизата_ от 0 до 0,1%, лактоза _ от 0 до 2%, молочной сыворотки _ от 0 до 2,5%. В результате проведения опытов отмечено, что наличие нулевых значений результатов в нескольких опытах из 16 опытов заставило нас отказаться от дальнейшей обработки и формализации всех полученных данных. Кроме того, выход фермента в опытах, где присутствует молочной сыворотки 2,5%, резко выше, чем в опытах, где ее не было. Это без сомнения показывало, что молочная сыворотка играет роль главного фактора, влияющего на накопление фермента в культуральной жидкости. Мы решили осуществить оптимизацию процесса "по остальным Трем "факторам при постоянном значении чевертого фактора молочной сыворотки в 2,5%. При этом использовали опыты, составившие ПФЭ Г. Были обозначены безразмерные концентрации: х1_ глюкозы, х2_ дрожжевого автолизата, хЗ_ лактозы.

Критерием оценки влияния различных факторов на процесс биосинтеза полигалактуроназы служила активность этого фермента ( у, ед/мл). В результате статистической обработки данных получено уравнение регрессии, которое 4 адекватно описывает процесс:

у - 1488,9 + 71,21x1 + 208,94x2 + 114,01x1x2 + 75,01x2x3

Для расчета программы оптимизации с учетом межфакторного взаимодействий линеаризовали уравнение и использовали процедуру Бокса-Уилсона. Нами была получена следующая рациональная среда по факторам 1, 2 и 3: глюкоза - 4%;

дрожжевой автолизат - 0,1%; лактоза - 0%; молочная подсырная сыворотка -.2,5%.

Следующим этапом является оптимизация в питательной среде молочной сыворотки. Был проведен однофакторный эксперимент при значении молочной сыворотки от 1,0 до 3,0% с интервалом варирования А-0,5% при неизменном вышеопределенном содержании глюкозы, дрожжевого автолизата и солей среды Ридер. Результаты эксперимента представлены в табл. 5.

ТаблицаЗ

и Содержание Активность

мол. сыворотки ПГ.ед/кл

% X У

1 1,0 -2 1121,8

2 1,5 -1 1281,2

3 2,0 0 2122,6

4 2,5 +1 2092,1

5 3,0 +2 1815,8

ЛкгПГ,

ö/мя

20Q0

W X* молочная сыворотка, %

Рис2. Кривая регрессии биосинтеза фермента

В результате обработки экспериментальных данных, получили апроксимирующую зависимость, которая адекватно описывает процесс (рис.2): у = 1935,7 + 482,8х - 124,5Х1- 77,Зх

. Решив уравнение, получили х=1,002, т.е оштшальное содержанке молочной сыворотки составляет 2,5%. Так как значения выхода фермента при концентрации молочной сыворотки от 2,0% до 2,5% незначимо отличаются друг от друга (доверительная ошибка £-(у1-у2)=2б!ед/мл) то из эхопоп'этескнх сообро-женпй за оптимальное содержание молочкой сторонен можно взять не 2,5% а 2%, что приносит • весоную внгоду рп счет ЭКОНОМ1Ш субстрата.

О

4.3.3. Исследование влияния различных источников

крахмала на биосинтез фермента дрожжами Ъ. шатала

В связи с тем, что глюкоза является дорогостоящим компонентом среды, поэтому в этом разделе нами был изучен биосинтез фермента дрожжами Ъ. шатала на средах, где попытались заменить глюкозу более дешевым и доступным сырьем - гидролизатом крахмала (рис.3)

Рис.3. Биосинтез палигалактуроназы дрожжами Ъ. тала ала ВКМ У-848 на гвдролизатах крахмала:!-картофельный крахмал; 2-кукурузный крахмал.

Как видно из рис.3, максимальное накопление палигалактуроназы в обоих случаях достигнуто при концентрации глюкозы в добавляемом гидролиза-^ от 4% до 5% в пересчете к массе питательной среды. Отмечено, что на гвдролизате картофельного крахмала при 4,67% глюкозы в среде полигалактуроназная активность составляет 4374 ед/мл, что в 2,0 раза выше, чем на оптимизированной среде на основе чистой глюкозы, определенной в передыдущем разделе. Для лщролизата

С' . .

кукурузного крахмала при 4,31% глюкозы и это соответственно составляет 3287ед/мл и 1,5 раза выше, чем на чистой глюкозе.

Эти результаты подтолкнули нас к новой попытке провести опыты на гидролизатах кукурузной и рисовой муки с ожиданием получить такие же высокоактивные культуральные жидкости при концентрации глюкозы в питательных средах в диапазоне от 4% до 5,6%, получаемые за счет пщролизатов муки, т.е. использовать возможность применить еще более дешевый источник легкоусвояемого углерода (табл.6).

Таблица 6

Биосинтез полигалактуроназы дрожжами Ъ. шатала на гидролизатах кукурузной и рисовой муки

Тип источника углерода Концентрация глюкозы в к.ж,% Активность ПГ в к.ж., ед/мл

3,75 2965 ±80

кукурузная мука 4,50 3052 ±75

. .. 5,60 .. . 2604 ± 103

3,50 2944 ±50

рисовая мука 4,00 3225 ± 75

4,67 3332 ±90

5,60 2912 ±112

Полученные данные подтверждают оптимальную дозу глюкозы в диапазоне 4-5%, но полигалактуроназная активность на гидролизатах обоих видов муки видимо ниже, чем на гидролизатах чистого крахмала.

Таким образом для получения высокой активности полига-лактуроназы с помощью дрожжей Ъ. шатала В КМ У-848 нами рекомендовано применение питательной среды следующего состава,% : глюкоза в виде гидролизата картофельного хрзхмала - 4; молочная подсырная сыворотка - 2; дрожжевой автолизат -0,1 и соли среды Ридер. На этой среде активность фермента

составляет 4333 ед/мл, что в 2,6 раза выше активности, чем на исходной среде ЫоЗ.

4.4 Влияние дрожжевой полигалактуроназы на выход сусла и его осветления.

Известно, что пектолитические ферментные препараты используются в соковой и винодельческой прмьппленности с целью облегчения процесса прессования, они способствуют увеличению как общего выхода сусла так и самотечной фракции. Нами была проведена ферментативная обработка мезги винограда сорта Каберне. Раствор фермента добавляли в мезгу винограда из расчета 2000, 4000 и 6000 единиц активности на кг сырья, т.е 0,0007; 0,0013 и 0,0020% соответственно. Смесь мез-ги с ферментом выдерживали при 35±2°С в течение 4 часов. После того определяли выход самотека, общего сусла и содержание фенольных веществ ( табл. 7).

Таблица 7

Влияние ферментативной обработки мезги на выход

сусла и содержание фенольных веществ

Доза внесения "препарата Увеличение выхода сусла, % Содержание фенольных веществ, мг/л %% увеличении фенольных веществ

ед/кг V /о общего самотека

контроль 650

2000 0,0007 1,5 11,0 725 11,5

4000 0,0013 0,6 8,0 700 7,7

6000 0,0020 0,5 7,0 700 7,7

Как видно из таблицы 7, обработка мезги винограда сорта Каберне добавлением 2000 ед. дрожжевой полигалактуроназы на кг дает наибольший выход как сока самотека, так и общего сусла и повышение содержания фенольных веществ. В результате проведения испытаний технологического действия дрожжевой пек-

тиназы на виноградную мезгу, было показано что ферментный препарат проявляет мадерирующее действие, выражающееся в увеличении выхода сусла и повышении в нем концентрации фенольных веществ.

Для изучения осветляющей способности дрожжевой пек-тиназы и возможности обработки сока композицией ферментных препаратов мы проводили ферментивную обработку свежеполу-ченного сусла из винограда сортов Ркацители, Подарок Магара-ча, Первенец Магарача различными дозами препаратов в интервале температур 16 -37"0 в течение 1,5 -16 часов. Основным критерием технологической эффективности ферментативного воздействия служила скорость фильтрации осветленного сусла. Результаты проведенных испытаний представлены в табл.8,9,10.

Таблица 8

Обработка ферментными препаратами сусла винограда сорта Ркацители

tw % Варианты обработки сусла Тем-ра выдержки, С Время осветления, час Скорость фильтрации

Наименовние препаратов• Доза фермента, ед/л '

мл/мин %увелич.

i Контроль - 35±2 1,5т 2 0,60 100

z Дрожж.пекгиназа(ДП) '500 35±2 1,5; 2 2,47 411,7

s Пектофетидин ШОх 500 3512 1,5т 2 2,87 478,3

1 ДП и ПоликанесцинГ20х 250 и250 35±2 1,5т 2 2,97 495,0

s дп 1000 35+2 1,5т 2 2,93 488,3

« Псхтофотидин ШОх 1000 35±2 1,54 2 3,20 533,3

i ДП и ПоликанесципГ20х . 500 и500 35±2 1,54 2 3,40 566,7

г ДП 2000 35±2 1,5т 2 3,00 500,0

3 ДП 1000 18±2 16 2,07 345,0

<0 ДП и Поликанесции Г20х 500 и500 18±2 16 2,87 478,3

м ДП - 2000 18±2 16 2,20 366,7

12. ДП и Поликанесции Г20х 1000 и!000 18±2 16 3,27 545,0

13 ДП 4000 18±2 16 2,87 478,3

th ДП и Поликанесции Г20х 2000 и2000 18*2 16 3.37 561.7

Таблица 9

Обработка ферментными препаратами сусла винограда сорта "Пода рок-Магарача", при температуре выдержки 35Й°С, за 2 часа

Варианты обработки сусла Доза фер- Скорость фильтрации

л/л наименовние препаратов мента, ед/л мл/мин %твелич.

< Контроль 0,33 100

2 Пектофетидин ШОх 500 1,33 400

3 Дрожжевая пектиназа (ДП) 500 1,20 360

Н ДП и Поликанесцин Г20х 250 к 250 1,53 460

S Пектофоетидин ШОх • ' 1000 1,80 540

S ДП 1000 1,67 50С

7 ДП и Поликанесиин Г20х 500 к 500 2,03 601

Таблица 10

Обработка ферментными препаратами сусла винограда сорта "Перв( нец Магарача", при температуре выдержки 35±2°С, за 2 часа

NN л/л Варианты обработки сусла наименовние препаратов Доза фермента, ед/л Скорость фильтрации

мл/мин /оувелич.

1 Контроль 0.53 100,0

2 Пектофетидин ШОх 500 2,40 450,0

5 Дрожжевая пектиназа (ДП) 500 2,27 425,0

н ДП и Поликанесцин Г20х 250 и 250 2,47 462,5

5 Пектофоетидин ПЮх 1000 2,60 487,5

6 ДП 1000 2,47 462,5

7 ДП и Поликанесцин Г20х 500 к 500 2.80 525,0

В результате экспериментов, проведенных в опытно-лрои; водсгвекных условиях (табл.8,9,10) установлено, что лроце* осветления сусла винограда всех сортов происходит актк:л>а всех вариантах. Об этом свидетельствует повышение скорсхп фильтрации сусла в 3,5 до б раз по сравнению с контролем, одипазсовых условиях обработки ^пользование Пектофоетидш ШОх даст незлаадтельно лучше результата по сравнению дрожжевой пектиназой, но уступает мультиэнзимнок композкци дрожжевой полигалактуроназы и Поликанесцина Г20х.

Позитивные результаты опытно-промышленных испытаний нашего препарата подтверждены актами, которые приведении в приложениях диссертации.

Известно, что присутствие пектинэстеразы в пектолити-ческих ферментных препаратах грибного присхождения приводит к образованию метанола при обработке мезги и сусла (Нанитапшили Т.С.,1972г.; Датунашвили Е.Н. и др., 1980г.; Ми-келадзе Р.В., 1969г.). Из первого раздела экспериментальной части известно, что наш ферментный препарат содержит в себя только полигалактуроназу. Таким образом использование разработанного нами препарата в виноделии перспективно, т.к. технологические его свойства мало отличимы от грибных препаратов, используемых в виноделии, а по составу его комплекса ферментов он намного опережает другие препараты, т.к. позволяет избавиться от увеличения в сусле метанола. В перспективе нами также предложена . мультиэнзимная композиция дрожжевого полигалактуроназного препарата с высокоочшценным Поликанесцином Г20х, которые благоприятно воздействуют на скорость фильтрации сусла и на количество отдаляемого сока.'

4.5. Получение ферментного препарата полигалактуроназы

По технологической схеме, предложенной Грибауске-не В.Ю. и др. (1987г.), была выделена дрожжевая толигалактуроназа. Схема включает в себя следующие стадии : 1- отделение культур алькой жидкости от биомассы центрифугированием; 2 - осаждение фермента ацетоном; 3 -растворение осадка кратным объемом дистиллированной водой;

4 - центрифугирование и отделение раствора фермента от осадка;

5 - высушивание препарата в вакуумной сушилке и 6 -измельчение и упаковка на стендовой,установке .

Нами был получен в лабораторных условиях ферментный препарат с- полигалактуроназной активностью 500 ООО ед/г препарата.

ВЫВОДЫ

1. Среди продуцентов пектолитических ферментных препаратов, дрожжи в последнее время представляют большой интерес и перспективу. Выявлены семь штаммов дрожжей - активных продуцентов внеклеточной полигалактуроназы : РаЫкрога {гэ^Шб ВКМ У-429, Р-тасескшёшиБ ВКВ У-480, ВКМ У-486, ВКМ У-1148, Р.^Нб ВКМ У-1335, 2уёо£аЬозрога тапаапа ВКМ У-832, ВКМ У- 848. Установлена целесообразность выбора штамма 2узо£аЬо$рога тагх1апа ВКМ У-848, как самого высокопродуктивного продуцента.

2. Разработаны условия культивирования, обеспечивающие максимальный уровень биосинтеза полигалактуроназы выбранным штаммом Zygofabospoгa шатала ВКМ У-848, заключающиеся в следующем: а) рН среды 3,3 -3,5; б) температура культивирования 30°- 34°С; в) возраст посевного материала 48 часов, дозировка 1,5 - 1,7%; д) длительность культивирования 3,3 - 4 суток; е) культивирование анаэробное.

3. Исследовано влияние ионов металлов на биосинтез фермента.

Установлено, что присутствие пластинки из железа или из

сплавов стали различных марок в питательной среде снижает

синтез фермента. Также отмечено, что внесение микроэлементов

( Со\ Ътх , Мп\ Си\ Ре*) в дозах от 10"гдо 10г% значительно

2+

угнетает образование фермента. Ионы Ре и Со являются самыми сильными ингибиторами. Обратный эффект наблюден при внесении с* , при этом биосинтез фермента заметно повышается, приблизительно на 30%.

4. Проверено влияние факторов роста и других соединений (тиамин, янтарная кислота, пектип, галахтурсковая кислота, лактоза) -за биосинтез фермента. Присутствие в калом количестве тиамина и лактозы в питательной среде способствует повышению в культуральной жидкости активности полигалактуроназы, в то же время присутствие пектина, янтарной кислоты, галаиуроновой кислоты не влияет на ее биосинтез.

5. Выявлено, что глюкоза в количестве 4 - 5% и лактозы в количестве 1%, как источник углерода, необходимы для биосинтеза и выделения ферментаи в культуральную жидкость. Замена лактозы более распространенным лактозосодержащим сырьем _ молочной подсырной сывороткой (в, количестве 2 2,5%) показывает целесообразность включения ее в состав питательной среды. Сопоставление разных молочных сывороток показало, что подсырная молочная сыворотка .является более предпочтительной по сравнению с другими.

6. Оптимизирована среда для дрожжевой культуры Ъ. шатала В КМ У-848, которая имеет следующий состав(%): молочная сыворотка _ 2; глюкоза _ 4; дрожжевой автолизат _ 0,1; соли среды Ридер: (Ш^^О,- 0,3; ГУ^БО, .7НгО - 0,07; №01 - 0,05; КН2 РО^ - 0,1; Кг НРО^ .ЗН20 - 0,01, которая обеспечивает активность в культуральной жидкости не менее 2000-2100 ед/мл.

7. Изучено культивирование дрожжей на гидролизатах различного крахмалосодержащёго сырья. Выявлено, что на среде, содержащей пщролизат картофельного крахмала ( в пересчете на глюкозу) - 4%, молочную сыворотку - 2%, дрожжевой автолизат - 0,1% и соли среды Ридер биосинтез' полнгалакзуроназы дрожжами наиболее высок. При этом количество фермента в культуральной жидкости возрастает в 2 с липшем раза по сравнению с культивированием на вышеприведенной оптимизированной среде, достигая 4333 ед/мл.

8. Доказана эффективность применения дрожжевой полигалак-туроназы в первичном виноделии. Достигнуто увеличение выхода сусла и скорость его осветления, результаты подтверждены актами.

Обработка мезги винограда сорта Каберне с добавлением дрожжевого препарата из расчета 2000 ед/кг втшограда дает увеличение выхода сока самотека и общего сусла приблизительно на 11%, и содержание фенольных веществ такзсе несколько возрастает.

Обработка сока различных сортов винограда дрожжевой полигалактуроназой, Пектофоетиднном П10х и композицией дрожжевого фермента с Поликанесцином Г20х дозами 500 2000 ед/мл при 35±2"С или 1000 - 4000 ед/л при 18±2°С повышает скорость фильтрации от 3,5 до б раз.

Установлено, что дрожжевой препарат полкгалахтуроназы не уступает Пектофоетвдину ПЮх по технологической эффективности, но имеет существенные преимущества из-за отсутствия в комплексе пектинэстеразы. Показана возможность создания МЭК дрожжевой полигалактуропазы с Поликанесцином Г20х, которая эффективнее и активнее, чем имеющийся Пектофоетидин ПЮх.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Нгуен Ла Ань, Покровская С.С., Грачева И.М., Бутова С.К. Изучение и оптимизация условий культивирования, обеспечивающих максимальный уровень биосинтеза полигалактуропазы дрожжами гу§о£аЬо5рога талиапа В КМ У-848. Депон. в ВИНИТИ, 1994г.

2. Нгуен Ла Ань, Грачева И.М., Покровская СГС., Грачев' Ю.П., Бутова С.Н. Оптимизация состава питательной среды для культивирования 2уйо£аЬо5рога шатала ВКМ У-848. Делон, в ВИНИТИ, 1994г.

3. Нгуен Ла Ань, Грачева И.М., Покровская С.С. Выбор продуцента эндополигалактуроназы и пути повышения ее активности. Тезисы на конференции. РМО, 1993г.