автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Разработка технологии дрожжей полигалактуроназы и ее применение

: од

1 5 грц

' ' ГОСКОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ __ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ _

На правах рукописи НГУЕН ЛА АНЬ .

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ДРОЖЖЕВОЙ ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

05.18.10 - Технология витаминных, ферментных и белковых препаратов, чая и табака

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

МОСКВА- 1995

Работа выполнена на кафедре " Биотехнология, экология и сертификации пищевых продуктов" Московской государственной академии пищевых производств.

Научные руководители: \

доктор биологических наук, профессор И.М. Грачева кандидат технических наук С.С. Покровская Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор И.А.Попадич кандидат технических наук Л.В.Югова Ведущее учреждение:

ВНИИпшцевой биотехнологии

Защита диссертации состоится " 1)5" " 1995г.

в часов на заседании Специализированного Совета К 053.51.04 Московской государственной академии пищевых производств.

Просим Вас принять участие в работе ученного Совета или прислать отзыв (в 2-х экземлярах, заверенных печатью учреждения) по адресу : г. Москва, 125080, Волоколамское шоссе, д.И, МГАПП, ученному секретарю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГАПП.

Автореферат рослал "05" " [и&лЦЛ 1995г.

Секретарь Специализированного Совета

к.т.н., доцент О.И. Тихомирова

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время пектолитические ферментные препараты находят все более широкую сферу применения в разли»лшх отраслях промышленности , в сельском хозяйстве, я науке и медицине. Полигалактуроназа (К.Ф.3.2.1.15, поли(1,4-с<-0-галактуронид) - гликаногидролаза ), катализирующая гидролиз 1,4-«-0-галактозидуро1шдш>1х связей в галактуро-нанах, продуцируется многими микроорганизмами .

В данный момент большинство пектолигаческих ферментных препаратов, выпускаемых как в России, так и зарубе-жом имеют грибное и реже бактериальное происхождение. При необходимости целенаправленного использования пектиназ, эти препараты вызывают ряд трудностей из-за того, что они содержат, помимо полкгалактуроназы, пектинэстеразу, протеиназы, целлюлазы, гемицеллюлазы и ряд других сопутствующих ферментов. Все отрасли, применяющие пектолитические ферментные препараты, особенно при производстве соков и вин постоянно предъявляют повышенные требовашш к чистоте и составу используемых ферментных препаратов.' Именно эти требозаши создали необходимость разработать новый ферментный препарат полкгалактуроназы высокой степени чистоты, не содержащий пехтинэстеразы т.к. присутствие этого фермента в препаратах неизбежно приводит к образованию в реакционной среде метилового спирта, что недопустимо в виноделии и особенно при производстве соков. Однако, выделение полигалактуроназы из сложного комплекса белков, содержащихся в технических препаратах, требует проведение трудоемкой, многоступенчатой очистки вплоть до использования хроматографических методов разделения и счистки. Использование такой многоступенчатой очистки приводит к резкому удорожанию препаратов и невозможности их промышленного производства и применения, т.к. это экономически не выгодно.

Известно, что количество синтезируемых гидролитических ферментов у дрожжевых культур значительно меньше,

чем у грибных культур и бактерий. Но в тоже время известно, что отличительной особенностью некоторых штаммов дрожжей рода К1иууеготусез является то, что они активно образуют пек-тиназы, содержание которых может достигать 80-90% от всей суммы белков клетки. Так установлено, что белок, обладающий эндо-полигапактуроназной активностью составляет около 90% от общей суммы белков, секретируемых дрожжами в культураль-ную жидкость. Однако до настоящего времени, несмотря на очевидную перспективность применения, дрожжевые пектолитичес-кие ферменты изучены менее пектиназ других микроорганизмов. Поэтому представляется интересным, важным и актуальным исследование дрожжей с позиции поиска среди них продуцентов ферментов, предназначенных для соковой и винодельческой промышленности.

Цель и задачи работы. Целью работы являлся поиск активного продуцента полигалактуроназы среди дрожжевых культур, разработка условий его культивирования и последующего применения полученного ферментного препарата.

В соотвесгвии с этим необходимо было решить следующие задачи: " .

_ выделить активный продуцент полигалактуроназы среди дрожжей;

_ исследовать и оптимизировать условия биосинтеза полигалактуроназы; -

_ исследовать влияние состава питательной среды на биосинтез полигалактуроназы, и провести оптимизацию состава -питательной среды;

_ изучить свойства полученного препарата полигалактуроназы;

_ провести апробацию препарата дрожжевой полигалактуроназы в соковой и винодельческой промышленности.' .

Научная новизна. Основываясь на данных литературы, было отобрано 27 дрожжевых культур, возможных продуцентов поли-

галактуроназы и не синтезирующих пектинэстеразы. При скрининге этих культур была выделена культура, обладающая способностью к сверхсинтезу внеклеточной полигалагауроназы без сопутствующей лекптэстеразы _ это штамм Zygofabospoгa тагаапа ВКМ У-848.

Разработаны условия культивирования, обеспечивающие максимальный выход фермента. Установлена оптимальная питательная среда для глубииого культивирований этого микроорганизма. Получен ферментный препарат полигалагауроназы и впервые осуществлена апробация данного дрожжевого иоли-галактуроназного препарата в производстве соков и вин.

Показана возможность создания мультиэнзимвой композиции (МЭК) на основе изучаемого фермента.

Пратгпгческая ценность. Проведенные исследования послужили основой для разработки технологии нового препарата дрожжевой лолигалатстуроназы.

В качестве основного компонента питательной среды для биосинтеза пслигалактуроназы использована молочная сыворотка _ это очень.,важно, т.к. создаются селективные условия для получения нового ферментного препарата с одновременным рациональным использованием трудно утилизируемого Еторнчного сырья молочной промышленности. Разработаны также условия получения и использования гидролизата крахмала, сравнительно дешевого компонента среды, который в тоже время позволяет значительно повысить биосинтез полигалагауроназы микроорганизмом. ,

Дрожжевой ферментный препарат был проверен в условиях опытно-производственной базы Института винограда н вина "Магарач". Испытания показали, чтс он не уступает по своим свойствам препарату пектиназы "Пектофоетидин ШОх", который в данный момент применяется в производстве соков и вин, а даже его превосходит, т.к. в нем отсутствует пехтинэстераза, что позволяет исключить. накопление в соках и винах метилового спирта.

Апробация работы и публикация. Работа дважды заслушивались. на межкафедральдам коллоквиуме МГАПП (1993;1994г.).

По теме диссертации опубликованы три статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы , методической и экспериментальной частей, выводов, списка использованной литературы и приложений.

Диссертационная работа изложена на 185 страницах машинописного текста, содержит 34 таблиц, 11 рисунков и 3 приложения. Список литературы включает 235 наименований отечественных и зарубежных авторов.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

]Зо введение обоснована актуальность темы и направление исследований.

В обзоре литературы дано представление о пектиновых веществах. Проводятся данные о пектолитических ферментах и их продуцентах, и также об особенностях их биосинтеза и получения. Изложены аспекты применения ферментных препаратов пектиназ. - "

В результате анализа данных литературы установлено, что в настоящее время недостаточно освещены вопросы дрожжевой полигалактуроназы и ее применения. С учетом этого обоснованы цель и задачи настоящего исследования.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили чистые культуры дрожжей, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РФ (ВКМ), во ВНИИсктез-белок, Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН РФ (ИБФМ, г. Пущино на Оке), ВНИИГщролиз (г. С.Петербург), Институте винограда и вина "Магарач" (г. Ялта), а также из коллекции кафедры " Биотехнология, экология и сертификация пшцевых продуктов" МГАПП.

Активность полигалактуроназы определяли вискознметри-ческкм методом (Лифшцц Д.Б. и др., 1974). За единицу активности полигалактуроназы принято количество фермента, которое при температуре 30°С и pH 5,0 катализирует гидролиз одного мг пектовой кислоты в минуту со снижением вязкости раствора на 20%.

Для получения глюкозного сиропа из крахмала, применялся метод ферментативного гидролиза крахмала С Лайур Т.А., 1978). Содержание глюкозы определяли с помощью модифицированного ферроцианидного варианта глюкооксидазяого метода (Щербухин В.Д., 1970). Содержание Сахаров определяли по методу Шомодн-Нельсона (Клесов A.A. и др., 1980). Пектинэстеразную активность определяли по титрованию свободных карбоксильных групп ( Kertesz Z.I., 1951).

При разработке сбалансированного состава питательной среды использовали план полного факторного эксперимента ПФЭ 2*( Грачев Ю.П.; 1979).

Электрофоретические исследования фермента проводили по методу Дэвкса (Davis B.J.,1954) и Орнпгтейн (Ornstein L., 1964) в модификации. Сафонова В.И. и Сафоновой М.П. (1969).

Все опыты проводили не менее, чем в 3 - 5 повторностях. Результаты, представленные в работе, являются средними арифметическими величинами.

Для исследования дрожжевых культур применяли следующие питательные среды:

Среда 1 (г/л): глюкоза - 30; дрожжевой экстракт - 0,5; минеральные соли среды Ридера :(NH4^SOv - 3,0; MgSOt ,7Н2 О-0,7:NaCl - 0,5; КНгРОг 1,0; К2НРОгЗВр - 0,1; рН-3,5.

Среда 2: пастеризованное виноградное сусло с массовой концентрацией Сахаров 16 г/100 см ; pH - 3,5.

Среда 3 (г/л): молочная сыворотка - 20; минеральные соли среды Ридер: (NEßSO., - 3,0; MgS04,7Нр - 0,7; NaC] - 0,5; КН2РО^ - 1,0; К2НР04 .ЗНг0 - 0,1; pH- 3,5.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Выбор продуцентов, обладающих высокой способностью к биосинтезу внеклеточной полигалактуроназы, среди дрожжей рода ЮиууеготусеБ.

С целью выявлений активного продуцента полигалактуроназы было проверено 27 штаммов, относящихся к 3 видам рода Юиууеготусея.

Все культуры выращивали в пробирках с 5-тью мл питательной среда при 28- 30° С в течение 5 суток при анаэробных условиях. Для выращивания использовали среды Ио1 и N02.

Результаты этих опытов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Сравнение способности дрожжевых культур к биосинтезу внеклеточной полигалактуроназы.

Наименование культуры по классификации Лоддер Активность фермента, ед ПГ/мл,на средах

...... -. Not No2

Kluyveromyces africanus 246 0 0

К. marxianus v. lactic BKM У- 868 0 0

К. marxianus BKM У- 876 0 0

К. marxianus v.bulgaricus BKM У- 1242 0 0

К. marxianus v.dobzhansni BKM У-1293 0 0

K.marxianus v.phaseolosporus ВКМУ-1296 0 0

K.marxianus v.drosophillarum ВКМУ-1302 0 0

K. marxianus v.vanudenii BKM У- 1535 0 0

K. marxianus v.wikenii BKM У- 1545 0 0

Продолжение таблицы 1

Наименование культуры по классификации Активность фермента,ед ПГ/мл, на средах

Лоддер Кудряцева Ыо1 N02

Ииууего- РаЬоэрога йэдШз 54 80 24

тусез Р. ^аяШг ВКМ У-126 128 58

Т. ВКМ У-429 230 36

Б. йа^Шв ВКМ У-490 21-0 36

Р. &адШз ВКМ У-431 140 42

Б. Гга^Ь ВКМ У-1335 220 100

Р. йайШБ ВКМ У-577 80 16

КЬууего- Р.тасес1о1иеш1$ ВКМ У-480 600 110

тусеБ Р. тасес1ошеп515 ВКМ У-486 275 150

татапиэ Р. тасеёогцеш15 ВКМ У-1148 280 86

Р. тасе{Ьше1Ш5 ВКМ У-1187 260 105

Р. тасейошепш ВКМ У-1188 240 130

Худс^аЬозрога шатала 160 44 -

ВСБ У- 619

Ъ. шатала ИБФМ У- 609 210 55

Ъ. шатала ВКМ У- 832 .600 540 -

Ъ. татапа ВКМ У- 833 185 68

Ъ. татапа ВКМ У- 595 128 46

Ъ. татапа ВКМ У- 848 660 600

Наибольшую способность к биосинтезу политалактуроназы по данным табл.1 проявляли следующие культуры : РаЬозрога ГгаёШв ВКМ У-429, Р.тасесЬтеш15 ВКВ У-480, ВКМ У-486, ВКМ У-1148, Р.^Пб ВКМ У-1335, ZygofaЬospora шатала ВКМ У- 832, ВКМ У- 848. Среди этих семи штаммов дрожжевая культура г.злагаапа ВКМ У-848 накапливала наивысшее количество- фермента в культуральиой жидкости на обоих средах. Культуральная жидкость провёрялась на присутствие в ней пектин зстеразы, которая не была найдена. Электр офсретически показано, что полигалактуроназа, выде./шеиая штаммом 2.тагх!ала ВКМ У-848 во внешнюю среду составляет'основную часть секретируемых белков. В результате

проведенных работ нами был выбран штамм дрожжей 2.талиапа В КМ У-848 в качестве продуцента полигалактуроназы.

Именно этот штамм (2.шатала В КМ У-848) послужил основой настоящего исследования, проведенные эксперименты позволили создать новую технологию по производству дрожжевой полигалактуроназы и разработать условия ее применения.

4.2 Изучение и оптимизация условий культивирования, обеспечивающих максимальный уровень синтеза полигалактуроназы дрожжами г.тагаапа ВКМ У-848.

При определении оптимальных условий культивирования тагаапа ВКМ У-848 исследования проводились на среде №> 3. Во избежание потерь ценных питательных веществ при воздействии высоких температур на молочную сыворотку, стерилизацию осуществляли в сравнительно мягком режиме при 0,05 МПа в течение 30 минут.

На такой же среде изучали влияние рН среды, температуры культивирования, условий .аэрации среды на рост культуры, а главное на биосинтез ею внеклеточной эндополигалактуроназы.

4.2.1.Влияние температуры, рН среды и аэрации на биосинтез полигалактуроназы дрожжами 2.шатана.

На биосинтез фермента большое влияние оказывают условия жизнедеятельности микроорганизма. Биосинтез полигалактуроназы изучали в интервале температуры от 27°- 40° С. Было показано, что максимум накопления активности фермента в культуральной жидкости наблюдается при температуре 30-34 С. Это позволяет делать вывод о том, что наша культура относится по какой-то мере к термотолерантным микроорганизмами. Также установлено, что оптимальным значением рН среды является 3,3-3,5.

Известно, что дрожжи являются факультативными анаэробами и изучаемый нами продуцент относится, именно, к этому типу микроорганизмов. С целью выяснения того, в результате

какого обмена веществ идет синтез внеклеточной полигалахтуро-назы, мы культивировали дрожжи при разной степени аэрации среды , при ее перемешивании или в анаэробных условиях. В результате эксперимента установлено, что наиболее высокие значения активности наблюдается тогда, когда осуществлялось выращивание продуцента в анаэробных условиях, при брожении, при заполнении сосуда питательной среды почти польностью (коэффициент заполнения 0,9), в то же время необходимо отметить, что образование биомассы в аэробных условиях значительно больше, чем в анаэробных. С целью ускорения процесса биосинтеза за счет увеличения интенсивности роста клеток был поставлен опыт, в котором первые сутки культуру выращивали на качалке, затем ферментацию вели в анаэробных условиях. Однако при этом наблюдали резкое снижение биосшггеза фермента. Таким образом, было установлено, что продуцент следует выращивать при ограниченном доступе воздуха с самых первых часов культивирования.

4.2.2. Подбор условий получения посевного материала.

Подготовка посевного материала является одним из важных этапов технолопш получения ферментного препарата. Из экспериментальных данных установлено, что целесообразно использовать 2-х суточный посевной материал, находящийся в состоянии активного роста в количестве 1,5% по отношению к объему среды.

4.2.3. Изучение динамики роста культуры и накопления ею внеклеточной полигалактуроназы.

Динамика роста микроорганизма и биосинтез им полигалактуроназы представлена на рис. 1.

Из рисунка видно, что достаточно интенсивный синтез фермента имеет место уже в самом начале экспонециальной фазы, а максимальное накопление эндополигалактуроназы завершается в конце стационарной фазы роста продуцента, приблизительно в интервале времени от 3,3 до 4 суток. Таким образом, экспериментально доказано, что способностью синтезировать полетал ал-

Рис. 1. Динамика роста и биосинтеза полигалактуроназы ' дрожжами Ъ. тапаапа.ВКМ У-848: 1 .полигалаетуроназная активность в культуральной жидкости.2.биомасса продуцента

туроназу обладают только молодые активно растущие клетки дрожжи Ъ. таоаапа.Способность дрожжей Ъ. таицапа выделять и сохранять активность фермента в течение длительного периода выгодно отличает их от микроскопических грибов, у которых уже через несколько часов после достижения максимума наблюдается значительное снижение активности пектолитическнх ферментов в культуральной жидкости.

В результате проведенных опытов выбрана оптимальная длительность культивирования 4 суток.

4.2.4. Влияние других факторов на биосинтеза полигалахтуропазы.

Нами было исследовало штибнрующее действие различных металлов (сплавов,.стали нескольких марок, железа) на биосинтез фермента. В каждую колбу вносили пяаспшку металлов, соотношение площали контакта когорта с «здемг?*?*. 1штателы:-2х

сред моделировали условия имеющее место в ферментере. В модельных опытах было показано, что присутствие в среде ионов тяжелых мсталлон сильно тормозит синтез фермента, уровень активности которого в присутствии металлов составлет лишь 10% - 54% от контрольного эксперимента.

Наблюдаемый эффект послужил основанием для более глубокого изучения наблюдаемого явления. С этой целью мы исследовали влияние некоторых микроэлементов (Со\ Ъп, Мп Си+, Ре\ Са*), которые вносились в питательные среды в виде солей незначительными дозами ( от 10 до 10*%). Было отмечено, что все исследованные катионы за исключением Са^ снижали биосинтетическую способность культуры по отношению к полигалактуроназе. При этом активность полнгалактуроназы составляет лишь от 20% до 87% от контрольного опыта. Ионы Бе и Со являются самыми сильными ингибиторами. А внесение Са в питательную среду в количестве 10"г % повышало уровень биосинтеза фермента приблизительно на 30%.

Таким образом было установлено, что изучаемая нами культура дрожжи Ъ. шатана ВКМ У-848 является очень чувствительной к катионам металлов. В результатае проведенных работ было рекомендовано проводить культивирование дрожжей в эмалированных ферментерах. Необходимо также контролировать уровень солей Регн и Сог* в используемой водопроводной воде.

4.3. Влияние состава питательной среды на биосинтез полигалактуроназы.

4.3.1. Влияние фактров роста и источника углерода на биосинтез полигалактуроназы.

В качестве факторов роста и индукторв биосинтеза проверяли следующие вещества: тиамин, янтарную кислоту, пектин, галактуроновую кислоту и лактозу, в концентрациях от 0,0001% до 0,05%. Показано, что тиамин и лактоза существенно янтеси-фицируют процесс биосинтеза. Присутствие в среде пектина и

галактуроновой кислоты не влияло на интенсивность биосинтеза эндололигал актуроназы, что позволяет говорить о конститутивной природе этого фермента.

В качестве источников углерода был испытаны глюкоза (табл.2), лактоза (табл.3) и некоторые виды молочной сыво-роткн.(табл.4).

Таблица 2

Влияние глюкозы на биосинтез полигалактуроназы дрожжами гуйо/аЬоирога талаапа В КМ У-848

Содержание гдвкозы в 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

среде,%

ЛхтетностьПГ.ед/мл 258 469 590 678 825 611 618 561 540 59

±10 ¿40 140 ±52 ±30 ±33 ±20 ±10 ±40 ±45

% от махстмума ПГ 313 56(3 71£ 828 100 741 749 68,0 6^5

Таблица 3

. Влияние лактозы на биосинтез полигалактуроназы. дрожжами Zygofabospora шатала В КМ У-848

Содержание лактозы в среде, % 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

АгшвностъПГ.ел/мл 337±25 529142 701130 515*20 425ь20 387^10

% от хдгсхкуха ПГ 48,1 75,5 100,0 73,5 60,6 55,2

В опытах с лактозой выращивали культуру на фоне среды, содержащий 0,5% глюкозы, 0,1% дрожжевого автолизата плюс соли среды Рид ер. Представленные в таблицах 2 и 3 данкые свидетельствуют о том, что наиболее высокая активность полигалагтуроназы наблюдается при культивировании дрожжей на средах с содержанием глюкозы 4-5% или лактозы 1%.

Известно, что молочная сыворотка является лактозосодер-жащим источником. В среднем молочная с: . кротка содержит до

48-52% сухих веществ молока, таким образом, представляет собой продукт, включаздий практически все составные части молока: лактозу, белки, жир, соли и т.д., но в ином соотношении. Нами было изучено влияние вида молочной сыворотки и ее концентрации в среде на биосинтез полигалактуроназы нашим продуцентом ( табл.4 )

Таблица 4

Влияние вида молочной сыворотки и ее концентрации в среде на биосинтез полигалактуроназы дрожжами 2у§о£аЬо$рога талиапа ВКМ У-848

Вид сыворотки, высушен- Концентрация молочной Активность ПГ,

ной распылением сыворотки в среде, % ед/кл

0,5 580 ±20

Подсырная, Уфа 1,0 1100 ±60

1,5 1680 ± 57

2,0 1860 ± 98

2.5 1920 ± 103

Подсырная, Ставтрополь 1,0 860 ± 40

' ■ 0,5 ' 420 ± 35 '

1,0 806 ± 20

Творожная, 1,5 1109 ±70

Ставрополь 2,0 1450 ± 56

2,5 1530 ± 56

3,0 1482 ± 50

4,0 1140 ± 27

Из полученных данных можно сказать, что биосинтез фермента значительно отличается на разных молочных сыворотках. Вероятнее всего это связано с качеством молока, условиями кормления жнзотных н технологией производства молочного продукта. В нашем случае наиболее предпочтительной для биосинтеза полигалактуроназы являлзсь подсырная молочная сыворотка уфимского производства, добавляемая в среду в количестве 2 - 2,5%.

4.3.2 Оптимизация состава питательной среды с использованием математических методов планирования экспериментов

В качестве оптимизируемых факторов в составе исходной среды были избраны глюкоза, лактоза, дрожжевой автолизат и молочная сыворотка. При постановке опытов использовался план полного факторного эксперимента ПФЭ 2к . Не будучи уверенными, что все эти факторы будут входить в состав питательной среды, мы выбрали следующие диапазоны изменения концентрации этих компонентов: глюкозы_ от 0 до 4%, дрожжевого автолизата_ от 0 до 0,1%, лактоза _ от 0 до 2%, молочной сыворотки _ от 0 до 2,5%. В результате проведения опытов отмечено, что наличие нулевых значений результатов в нескольких опытах из 16 опытов заставило вас отказаться от дальнейшей обработки и формализации всех полученных данных. Кроме того, выход фермента в опытах, где присутствует молочной сыворотки 2,5%, резко выше, чем в опытах, где ее не было. Это без сомнения показывало, что молочная сыворотка играет роль главного фактора, влияющего на накопление фермента в культуральной жидкости. Мы решили осуществить оптимизацию процесса по остальным трем 'факторам при постоянном значении чевертого фактора молочной сыворотки в 2,5%. При атом использовали опыты, составившие ПФЭ Т. Были обозначены безразмерные концентрации: х1_ глюкозы, х2_ дрожжевого автолизата, хЗ_ лактозы.

Критерием оценки влияния различных факторов на процесс биосинтеза полигалактуроназы служила активность этого фермента ( у, ед/мл). В результате статистической обработки данных получено уравнение регрессии, которое "адекватно описывает процесс:

у - 1488,9 + 71,21x1 + 208,94x2 + 114,01x1x2 + 75,01x2x3

Для расчета программы оптимизации с учетом межфакторного взаимодействий линеаризовали уравнение и использовали процедуру Бокса-Уилсона. Нами была получена следующая рациональная среда по факторам 1, 2 и 3: глюкоза - 4%;

дрожжевой автолизат - 0,1%; лактоза - 0%; молочная подсырная сыворотка -.2,5%.

Следующим этапом является оптимизация в питательной среде молочной сыворотки. Был проведен одиофакторный эксперимент при значении молочной сыворотки от 1,0 до 3,0% с интервалом варирования А~0,5% при неизменном вышеопределенном содержании глюкозы, дрожжевого автолизата и солей среды Ридер. Результаты эксперимента представлены в табл. 5.

Акт ГО",г--:-г-—

ta/н» j !

■ I - * /гч

20Q0--1- < -:-/\-

1800---—--f--V-

1600 ---•-/-

И00------—У-•--

I2D0---j—-:-

1000 -1-——'-

у : ^__

О QS № ts ДО Ù J.0 Ù молочная сыворотка, %

Рис2.Кривая регрессии биосинтеза фермента

В результате обработки экспериментальных данных, получили апроксимирующую зависимость, которая адекватно описывает процесс (рис.2): у = 1935,7 + 482,8х - 124,5xN 77,Зх

Решив уравнение, получили х=1,002, т.е оптимальное содержанке молочной сыворотки составляет 2,5%. Так как значения выхода фермента при концентрации молочной сьшороткн от 2,0% до 2,5% незначимо отличаются друг от друга (доьериталь-ная ошибка £ (у1-у2)=*261ед/мл) то из эхоноггпеских сообро-зсенпй за оптимальное содержание молочной шлгоооткн можно взять не 2,5% а 2%, что приносот • зесокую вшхзду ri сч-зт зкокомш! субстрата.

ТаблицаЗ

U Содержание Активность

мол. сыворотки ПГ,ед/мл

% X У

1 1,0 -2 1121,8

2 1,5 -1 1281,2

3 2,0 0 2122,6

4 2,5 +1 2092,1

5 3,0 +2 1815,8

О

4.3.3. Исследование влияния различных источников

крахмала на биосинтез фермента дрожжами 2. тапаапа

В связи с тем, что глюкоза является дорогостоящим компонентом среда, поэтому в этом разделе нами был изучен биосинтез фермента дрожжами Ъ. талаапа на средах, где попытались заменить глюкозу более дешевым и доступным сырьем - гидролизатом крахмала (рис.3)

Рис.3.Биосинтез полигалактуроназы дрожжами Ъ. тапаапа ВКМ У-848 на гидролизатах крахмала:!-картофельный крахмал; 2-кукурузный крахмал.

Как видно из рис.3, максимальное накопление полигалактуроназы в обоих случаях достигнуто при концентрации глюкозы в добавляемом гидролиза-^ от 4% до 5% в пересчете к массе питательной среды. Отмечено, что на падролизате картофельного крахмала при 4,67% глюкозы в среде полнгалактуроназная активность составляет 4374 ед/мл, что в 2,0 раза выше, чем на оптимизированной среде на основе чистой глюкозы, определенной в передыдущем разделе. Для гидролизата

кукурузного крахмала при 4,31% глюкозы и это соответственно составляет 3287ед/мл и 1,5 раза выше, чем на чистой глюкозе.

Эти результаты подтолкнули нас к новой попытке провести опыты на гидролизатах кукурузной и рисовой муки с ожэданием получить такие же высокоактивные культуралыше жидкости при концентрации глюкозы в питательных средах в диапазоне от 4% до 5,6%, получаемые за счет гвдролизатов муки, т.е. использовать возможность применить еще более дешевый источник легкоусвояемого углерода (табл.6).

Таблица 6

Биосинтез полигалактуроназы дроясжами Z. шатала на гидролизатах кукурузной и рисовой муки

Тип источника углерода Концентрация глюкозы в к.ж,% Активность ПГ в к.ж., ед/мл

3,75 2965 ±80

кукурузная мука 4,50 3052 ±75

. .. 5,60 .. .2604 ±103

3,50 2944 ±50

рисовая мука 4,00 3225 ± 75

4,67 3332 ±90

5,60 2912 ± 112

Полученные данные подтверждают оптимальную дозу глюкозы в диапазоне 4-5%, но полигалактуроказная активность на гидролизатах обоих видов муки видимо ниже, чем на гидролизатах чистого крахмала.

Таким образом для получения высокой активности полигалактуроназы с помощью дрожжей Ъ. татаала В КМ У-848 нами рекомендовано применение питательной среды следующего состава,% : глюкоза в виде гидролиззта картофельного крахмала - 4; молочная подсырная сыворотка - 2; дрожжевой аятолизат -0,1 и соли среды Рид ер. На этой среде активность фермента

составляет 4333 ед/мл, что в 2,6 раза выше активности, чем на исходной среде N03.

4.4 Влияние дрожжевой полигалактуроназы на выход сусла и его осветления.

Известно, что пектолитические ферментные препараты используются в соковой и винодельческой прмышленшсти с целью облегчения процесса прессования, они способствуют увеличению как общего выхода сусла так и самотечной фраюши. Нами была проведена ферментативная обработка мезги винограда сорта Каберне. Раствор фермента добавляли в мезгу винограда из расчета 2000, 4000 и 6000 единиц активности на кг сырья, т.е 0,0007; 0,0013 и 0,0020% соответственно. Смесь мез-га с ферментом выдерживали при 35+2° С в течение 4 часов. После того определяли выход самотека, общего сусла и содержание фенольных веществ ( табл. 7).

Таблица 7

Влияние ферментативной обработки мезги на выход

сусла и содержание фенольных веществ

Доза внесения 'препарата Увеличение выхода сусла, % Содержание фенольных веществ, мг/л %% увеличения фенольных веществ

ед/ кг % общего самотека

контроль _ 650

2000 0,0007 1,5 11,0 ' 725 11,5

4000 0,0013 0,6 8,0 700 7,7

6000 0,0020 0,5 7,0 700 7,7

Как видно из таблицы 7, обработка мезги винограда сорта Каберне добавлением 2000 ед. дрожжевой полигалактуроназы на кг дает наибольший выход как сока самотека, так и общего сусла и повышение содержания фенольных веществ. В результате проведения испытаний технологического действия дрожжевой пек-

тиназы на виноградную мезгу, было показано что ферментный препарат проявляет мацерирующее действие, выражающееся в увеличении выхода сусла и повышении в нем концентрации фенолышх веществ.

Для изучения осветляющей способности дрожжевой пек-тиназы и возможности обработки сока композицией ферментных препаратов мы проводили ферментивнуто обработку свежеполу-ченного сусла из винограда сортов Ркацители, Подарок Магара-ча, Первенец Магарача различными дозами препаратов в интервале температур 16 -37°С в течение 1,5 -16 часов. Основным критерием технологической эффективности ферментативного воздействия служила скорость фильтрации осветленного сусла. Результаты проведенных испытаний представлены в табл.8,9,10.

Таблица 8

Обработка ферментными препаратами сусла

винограда сорта Ркацители

м Варианты обработки сусла Тем-ра выдержки, С Время осветления, час Скорость фильтрации

Наименовние препаратов• Доза фер-нента,ед/л -

мл/мин %уведич.

1 Контроль - 35±2 1,5г 2 0,60 100

г Дрожж.певтиназа(ДП) '500 35±2 1,5т 2 2,47 411,7

5 Пекгофетидин ШОх 500 35±2 1,5.2 2,87 478,3

н ДП и ПоликанесцинГ20х 250 и250 35±2 1,5т 2 2,97 495,0

S ДП 1000 35+2 1,5т 2 2,93 488,3

« Пектофотидан ШОх 1000 35±2 1,5т 2 3,20 533,3

7 ДП и ПоликанесцилПОх 500 и500 35±2 l,5f 2 3,40 566,7

г ДП 2000 35±2 1,5:2 3,00 500,0

3 ДП 1000 18±2 16 2,07 345,0

10 ДП и Поликанесции ПОх 500 и500 18±2 16 2,87 478,3

м ДП - 2000 18±2 16 2,20 366,7

« ДП и Поликанесцин Г20х 1000 и1С00 18±2 16 3,27 545,0

с ДП 4000 18±2 16 2,87 478,3

ч> ДП и Поликанесцин Г20х 2000 «2000 18*2 16 3.37 561,7

Таблица 9

Обработка ферментными препаратами сусла винограда сорта "Подг рок-Магарача", при температуре выдержки 35Й°С, за 2 часа

№ Варианты обработки сусла Доза фер- Скорость фильтраций

л/п наименовние препаратов мента, ед/л мл/мин %увелич.

< Контроль 0,33 100

2 Пектофетидан ШОх 500 1,33 400

3 Дрожжевая пектиказа (ДП) 500 1,20 360

♦ ДП и Поликанесцин Г20х 250 к 250 1,53 460

Пекгофоетидин ШОх - ' 1000 1,80 540

В ДП 1000 1,67 50С

7 ДП и Поликанесцин Г20х 500 и 500 2,03 601

Таблица 10

Обработка Ферментными препаратами сусла винограда сорта "Перв( нец Магарача", при температуре выдержки 35±20С, за 2 часа

ММ <\/п Варианта обработки сусла наименовние препаратов Доза фермента, сд/л Скорость фильтрации

мл/мин %увелич.

1 Контроль 0.53 100,0

2 Пектофетидан ШОх 500 2,40 450,0

5 Дрожжевая пектиназа (ДП) 500' 2,27 425,0

1 ДП и Поликанесцин Г20х 250 и 250 2,47 462,5

5 Пектофоетидин ПЮх 1000 2,60 487,5

6 ДП 1000 2,47 462,5

7 ДП к Поликанесцин Т20х 500 к 500 2,80 525,0

В результате экспериментов, проведенных в опытно-прои: водственных условиях (табл.8,9,10) установлено, что яроце< осветления сусла винограда всех сортов происходит акткгаго » всех вариантах. Об этом свидетельствует повышенна скорост фильтрации сусла в 3,5 до б раз по сравнению с контролем, одинаковых условиях обработки ттспол7>зоваиие Пектофоепщш ПЮх даст незначительно лучше результаты по сравнению дрожжевой лектиназой, но уступает мультизнзимкой композкщ дрожжевой полигалактуроназы и Поликанесцина Г20х.

Позитивные результаты опытно-промышленных испытаний нашего препарата подтверждены актами, которые приведении в приложениях диссертации.

Известно, что присутствие пектигостеразы в пектолити-ческих ферментных препаратах грибного присхождения приводит к образованию метанола при обработке мезги и сусла (Наниташвили Т.С.,1972г.; Датунашвили E.H. и др.,1980г.; Ми-келадзе Р.В., 1969г.). Из первого раздела экспёриментальной части известно, что наш ферментный препарат содержит в себя только лолнгалактур оназу. Таким образом использование разработанного нами препарата в виноделии перспективно, т.к. технологические его свойства мало отличимы от грибных препаратов, используемых в виноделии, а по составу его комплекса ферментов он намного опережает другие препараты, т.к. позволяет избавиться от увеличения в сусле метанола. В перспективе нами также предложена . мультиэнзимная композиция дрожжевого полигалактуроназного препарата с высокоочшценным Поликанесцином Г20х, которые благоприятно воздействуют на скорость фильтрации сусла и на количество отделяемого сока.'

4.5. Получение ферментного препарата полигалактуроназы

По технологической схеме, предложенной Грибауске-не В.Ю. и др. (1987г.), была выделена дрожжевая полигалактуроназа. Схема включает в себя следующие стадии : 1- отделение культур альнон жидкости от биомассы центрифугированием; 2 - осаждение фермента ацетоном; 3 -растворение осадка кратным объемом дистиллированной водой;

4 - центрифугирование л отделение раствора фермента от осадка;

5 - высушивание препарата в вакуумной сушилке и 6 -измельчение и упаковка на стендовой, установке .

Нами был получен в лабораторных условиях ферментный препарат с полигалакгуроназной активностью 500 ООО ед/г препарата.

ВЫВОДЫ

1. Среди продуцентов пектолитических ферментных препаратов, дрожжи в последнее время представляют большой интерес и перспективу. Выявлены семь штаммов дрожжей - активных продуцентов внеклеточной полигалакгуроназы : РаЫкрога Гга^НБ ВКМ У-429, F.macedonieлsis ВКВ У-480, ВКМ У-486, ВКМ У-1148, ВКМ У-1335, губоГакирога шатала ВКМ У-832, ВКМ У- 848. Установлена целесообразность выбора штамма Zygofabospora шатала ВКМ У-848, как самого высокопродуктивного продуцента.

2. Разработаны условия культивирования, обеспечивающие максимальный уровень биосинтеза полигалактуроназы выбранным штаммом Ъу^Лакоярота. шатала ВКМ У-848, заключающиеся в следующем: а) рН среды 3,3 -3,5; б) температура культивирования 30ь- 34°С; в) возраст посевного материала 48 часов, дозировка 1,5 - 1,7%; д) длительность культивирования 3,3 - 4 суток; е) культивирование анаэробное.

3. Исследовано влияние ионов металлов та биосинтез фермента. Установлено, что присутствие пластинки из железа или из сплавов стали различных марок в питательной среде снижает синтез фермента. Также отмечено, что внесение микроэлементов ( Со\ Za , Мп*, Си\ Ре*) в дозах от 10"гдо Ю"г% значительно угнетает образование фермента. Ионы Ре1 и Со* являются самыми сильными ингибиторами. Обратный эффект наблюден при внесении с!', при этом биосинтез фермента заметно повышается, приблизительно на 30%.

4. Проверено влияние фактороз роста и других соединений (тиамин, янтарная кислота, пектин, галактуроковая кислота, лактоза) -на биосинтез фермента. Присутствие в калом количестве тиамина и лактозы в питательной среде способствует повышению в кулыуральной жидкости активности полигалактуроназы, в то же время присутствие пектина, янтарной кислоты, галактуроновой кислоты не влияет на ее биосинтез.

5. Выявлено, что глюкоза в количестве 4 - 5% и лактозы в количестве 1%, как источник углерода, необходимы для биосинтеза и выделения ферментам в культуральную жидкость. Замена лактозы более распространенным лактозосодержагцим сырьем _ молочной подсырной сывороткой (в количестве 2 -. 2,5%) показывает целесообразность включения ее в состав питательной среды. Сопоставление разных молочных сывороток показало, что подсырная молочная сыворотка .является более предпочтительной по сравнению с другими.

6. Оптимизирована среда для дрожжевой культуры Ъ. шатана В КМ У-848, которая имеет следующий сосхав(%): молочная сыворотка _ 2; глюкоза _ 4; дрожжевой автолнзат _ 0,1; соли среды Ридер: (Ш^О,- 0,3; МбБО,/7НгО - 0,07; МаС1 - 0,05; КН2РО,- 0,1; Кг НРО^ ,ЗНг О - 0,01, которая обеспечивает активность в культуральной жидкости не менее 2000-2100 ед/мл.

7. Изучено культивирование дрожжей на гидролизатах различного крахмал осодержащего сырья. Выявлено, что на среде, содержащей пщролизат картофельного крахмала ( в пересчете на глюкозу) - 4%, молочную сыворотку - 2%, дрожжевой авто-"лнзат - 0,1% и соли срёды Ридер биосинтез' полнгалактуроназы дрожжами наиболее высок. При этом количество фермента в культуральной жидкости возрастает в 2 с липшем раза по сравнению с культивированием на вышеприведенной оптимизированной среде, достигая 4333 ед/мл.

8. Доказана эффективность применения дрожжевой полнгалактуроназы в первичном виноделии. Достигнуто увеличение выхода сусла и скорость его осветления, результаты подтверждены актами.

Обработка мезга винограда сорта Каберне с добавлением дроясжевого препарата из расчета 2000 ед/кг винограда дает увеличение выхода сока самотека н общего сусла приблизительно на 11%, и содержание фенольных веществ такзге несколько возрастает.

Обработка сока различных сортов винограда дрожжевой полигалактуроназой, Пектофоетидином ШОх и композицией дрожжевого фермента с Поликанесцином Г20х дозами 500 -2000 ед/мл при 35±2"С или 1000 - 4000 ед/л при 18±2°С повышает скорость фильтрации от 3,5 до 6 раз.

Установлено, что дрожжевой препарат полигалактуроназы не уступает Пектофоетидину ШОх по технологической эффективности, но имеет существенные преимущества из-за отсутствия в комплексе пектинэстеразы. Показана возможность создания МЭК дрожжевой полигалактуроназы с Поликанесцином Г20х, которая эффективнее и активнее, чш имеющийся Пектофоетидин ШОх.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Нгуен Ла Ань, Покровская С.С., Грачева И.М., Бутова С.К. Изучение и оптимизация условий культивирования, обеспечивающих максимальный уровень биосинтеза полигалактуроназы дрожжами Zygofabospora marxiana' В KM Y-848. Депон. в ВИНИТИ, 1994г.

2. Нгубн Ла Ань, Грачева И.М., Покровская СГС., Грачев'Ю.П., Бутова С.Н. Оптимизация состава питательной среды для культивирования Zygofabospora marxiana В KM Y-848. Дспон. в ВИНИТИ, 1994г.

3. Нгуен Ла Ань, Грачева И.М., Покровская С.С. Выбор продуцента эвдополигалактуроназы и пути повышения ее активности. Тезисы на конференции. РМО, 1993г.