автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии биологически активного препарата на основе защитного комплекса молока и куриного лизоцима

На правах рукописи

ОВЧИННИКОВА ОЛЬГА ЕВГЕНЬЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЗАЩИТНОГО КОМПЛЕКСА МОЛОКА И КУРИНОГО ЛИЗОЦИМА

Специальность 05.18.04 - Технология мясных, молочных, рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

3 0 омтго

Москва 2008

003450957

Работа выполнена на кафедре «Технология молока и молочных продуктов» ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии».

Научный руководитель

Доктор биологических наук, профессор Комолова Галина Сергеевна

Официальные оппоненты:

Доктор технических наук, профессор Токаев Энвер Саидович

Кандидат технических наук, ст.н.с. Шидловская Виктория Павловна

Ведущая организация

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия (ГНУ ВНИИМС)

Защита диссертации состоится « 26 » ноября 2008 г. в /3 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.149.01 при ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии».

Автореферат разослан «*££_» с^г-еЯ)-*2- 2008 г.

Автореферат размещен на сайте vvww.msaab.ru «-¿¿у> р/^г^ЯЬ 2008 I

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат технических наук, профессор

А.Г. Забашта

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Современная пищевая технология оставляет человеку все меньше шансов на сохранение биологически активных компонентов в продуктах повседневного потребления, как правило, подвергающихся сложной многостадийной обработке. В последние годы в отечественной отраслевой науке особое место отводится технологиям безотходной переработки молока, предусматривающим не только наиболее полное извлечение из сырья основных макро, но и микро- и нанокомпонентов, являющихся биологически активными факторами, роль которых в механизме поддержания гомеостаза организма весьма значима. Известно, что комплекс белковых веществ является одним из определяющих факторов биологической ценности натурального молока, делая его не только продуктом питания, но и основным компонентом, определяющим устойчивость организма к неблагоприятным условиям.

Актуальным считается использование в технологиях пищевых продуктов биологически активных белков животного происхождения, в частности, особое внимание уделено наиболее используемому для этих целей лизоциму куриного яйца. В последние два десятилетия лизоцим активно используется в производстве продуктов детского и лечебно-профилактического питания. Кроме того, в свете результатов недавних исследований, начинается использование сывороточных белков молока, особый интерес среди которых представляют физиологически значимые катионные белки защитного комплекса молока: лактопероксидаза, лактоферрин, лизоцим, ангиогенин, панкреатическая рибонуклеаза. Недостатком существующих технологий является получение и использование очищенной формы отдельных белков молока, в то время как в природе они существуют в комплексе и функционально взаимосвязаны, проявляя зачастую синергетический эффект. В нативном виде комплекс биологически активных белков может быть выделен из молочного сырья. Среди катионных белков коровьего молока важная роль в защите организма принадлежит лизоциму, значимый уровень которого, в отличие от других белков, сохраняется только в бактерицидной фазе молока. Между тем, это не только сам по себе полифункциональный белок, но и в композиции с другими катионными белками образует защитный белковый комплекс молока, оказывая влияние на их активность. В промышленности практическое применение получил препарат куриного лизоцима, по своим свойствам гомологичный молочному лизоциму. На сегодняшний день сочетание лизоцима с другими биологически активными белками животного происхождения применяется в основном в производстве косметических препаратов и БАД для специального питания узких групп населения. Технологии их производства, как правило, не учитывают взаимное влияние компонентов этих комплексов в готовом продукте.

В этой связи безусловный интерес представляет возможность получения природного комплекса защитных белков молока в сочетании с куриным лизоцимом, в качестве основы высокоэффективных биологически активных препаратов широкого спектра действия и продуктов лечебно-

профилактической направленности с их применением.

Исследования, представленные в диссертационной работе, базируются на достижениях отечественных и зарубежных школ прикладной биотехнологии, биохимии и нутрициологии, представленных в трудах ученых: К.К. Горбатовой, Г.С. Комоловой, H.H. Липатова, Н.П. Мертвецова, И.А. Рогова, H.A. Тихомировой, В.А. Тутельяна, А.Г. Храмцова, A.M. Шалыгиной; В.П. Шидловской, M.D. Bond; K.D. Kussendrager; P.Maes; R.Shapiro; D.J. Strydom; Shimazaki; B.L. Valle и других.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка технологии биологически активного препарата на основе композиции защитного комплекса молока и куриного лизоцима для дальнейшего использования в качестве активной основы многокомпонентных продуктов лечебно-профилактической направленности.

В соответствии с поставленной целью последовательно решались следующие задачи:

• Обосновать выбор белковой основы биологически активного препарата;

• Получить из коровьего молока и проанализировать белковую фракцию, входящую в состав защитного комплекса молока, изучить возможность ее совместного использования с куриным лизоцимом,

• Обосновать параметры технологии получения и рациональные режимы хранения биологически активного препарата на основе сывороточных катионных белков защитного комплекса молока и куриного лизоцима в жидкой и сухой формах;

• Исследовать органолептические, физико-химические, микробиологические, технологические свойства и биологическую ценность препарата;

• Определить токсичность и физиологическую активность препарата в эксперименте на животных;

• Провести апробацию препарата в технологии производства молочных продуктов в лабораторных и промышленных условиях, изучить показатели качества и безопасности обогащенных им продуктов;

• Разработать проект нормативной документации на производство биологически активного препарата на основе защитного комплекса молока и куриного лизоцима.

Научная новизна работы состоит в следующем:

• Показана возможность и целесообразность использования защитного комплекса катионных белков молока в композиции с белком немолочного происхождения - куриным лизоцимом, обеспечивающих лечебно-профилактическую направленность разработанного препарата;

• Научно и экспериментально обоснованы параметры технологии биологически активного препарата (БАП) на основе защитного комплекса катионных белков молока и куриного лизоцима, обеспечивающие высокий уровень сохранности нативности компонентов;

• Получены новые данные о взаимозащитном действии биологически активных компонентов препарата в процессе хранения;

• Установлено, что в составе композиционного БАП при нагревании (до температур 40-65°С) происходит повышение биологической активности компонентов;

• Выявлена высокая биологическая ценность разработанного БАП:

- повышенное в сравнении с эталоном ФАО/ВОЗ содержание всех незаменимых аминокислот;

- антимикробное действие комплексного белкового препарата в отношении условно-патогенной микрофлоры;

- исследованиями in vivo показаны безопасность и положительное влияние БАП на выносливость к физическим нагрузкам и переносимость животными стрессовых воздействий.

Практическая значимость.

• На способ получения комплекса катионных сывороточных белков молока -одной из составляющих биологически активного композиционного препарата -получен патент RU № 2318406 от 10.03.2008 г. На разработанный препарат «МОБЕЛИЗ» подано заявление на выдачу патента на изобретение per. № 2008109043 от 12.03.2008;

• Разработан способ получения биологически активного препарата на основе композиции защитного комплекса молока и куриного лизоцима (БАП «МОБЕЛИЗ»);

• Разработан проект нормативной документации (ТУ,ТИ) на производство биологически активного препарата «МОБЕЛИЗ»;

• Обоснован способ обогащения БАП «МОБЕЛИЗ» молочных продуктов, что позволит расширить ассортимент продуктов детского и лечебно-профилакического питания и увеличить возможности рационального использования молочного сырья;

• Показана возможность применения разработанной технологии производства БАП в рамках безотходной переработки молочного сырья;

• Проведена опытная выработка питьевого молока и йогурта, обогащенных БАП «МОБЕЛИЗ» в условиях лабораторного и промышленного производства.

• Результаты работы внедрены в учебный процесс: Разработаны и изданы методические указания к выполнению лабораторных и учебно-исследовательских работ для студентов, обучающихся по направлению 260300

- технология сырья и продуктов животного происхождения, 260100 -технология продуктов питания.

• Работа выполнялась в рамках аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008)» по проекту «Развитие биотехнологических принципов создания многокомпонентных продуктов лечебно-профилактической направленности, обогащенных биологически активными веществами, оптимизация процесса их вакуумной сушки для обеспечения длительных сроков хранения». Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены и обсуждены на научно-технической конференции «Технологии живых систем» (Москва, 2004 г.); Международной научной конференции студентов и молодых

ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2005, 2006, 2007 г.); научных чтениях с международным участием, посвященных 100-летию со дня рождения П.Ф. Дьяченко (Москва, 2006); конференции «Проблемы совершенствования холодильной техники и технологии. Энергосбережение» (Москва, 2006); Четвертом Московском международный конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007); научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных и прикладных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий» (Углич, 2007).

Получен грант в рамках конкурса на проведение молодыми учеными, аспирантами и студентами исследований в научных и научно-педагогических коллективах организаций Ассоциации МГУПБ (Москва, 2006). Работа отмечена дипломом ¡I степени конкурса научных работ молодых ученых на V Юбилейной школе-конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации» (Москва, 2007), а также дипломом и золотой медалью на 6-ой специализированной выставке «Мир биотехнологии» (Москва, 2008). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, 1 методические указания для студентов. Практическая значимость подтверждена патентом RU № 2318406 от 10.03.2008 г.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объектов и методов исследования, изложение результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 213 наименование, в том числе 88 иностранных авторов, 7 приложений. Основной текст работы изложен на 195 страницах машинописного текста, включает 26 таблиц, 47 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность, научная новизна и практическая значимость работы, сформулирована цель исследования.

В первой главе «Современное состояние и перспективы создания новых биологически активных комплексов на основе белков молока» проведен анализ научно-технической и патентной литературы по вопросам, касающимся получения БАД из природных источников, их применения в технологиях продуктов питания с целью оздоровления, профилактики, лечения и снижения риска развития заболеваний. Проанализированы принципы разработки БАД на основе белков животного происхождения. Систематизированы свойства биологически активных сывороточных белков молока, перспективных для получения добавок и препаратов целевого назначения, рассмотрены современные способы их выделения из молочного сырья.

Во второй главе «Объекты и методы исследований» изложены обоснование выбора исходных компонентов композиционного препарата, организация проведения эксперимента, используемые в работе методы

исследований.

Объектами исследования являлись: комплекс катионных сывороточных белков молока (КСБМ), выполняющий защитную функцию, композиционный препарат, включающий этот комплекс и лизоцим куриного яйца (к-ЛЦ), молочные продукты, обогащенные белковым композиционным препаратом.

В ходе экспериментальных исследований были использованы: препаративные методы выделения и фракционирования белков из животного сырья; аналитические методы определения ангиогенина, лактоферрина, панкреатической рибонуклеазы, лактопероксидазы, лизоцима; метод электрофореза белков в ПААГ; микробиологические методы исследования; методы консервирования белков молока.

Исследование безопасности и физиологической активности полученного белкового препарата проводили на лабораторных животных (крысы линии Вистар).

Повторность опытов на всех этапах выполнения работы 3-5 кратная.

Обработку экспериментальных данных проводили с использованием методов математической статистики.

В качестве основы алгоритма проведения эксперимента в соответствии с анализом научно-технической литературы и патентной информации на предмет перспективности получения и использования препаратов на основе композиций биологически активных белков из сырья животного происхождения, а также в соответствии с поставленной целью и задачами исследований была разработана схема организации и проведения исследований (рис.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В третьей главе «Получение и характеристика компонентов разрабатываемого биологически активного препарата (БАП)» в соответствии с поставленной целью были получены и охарактеризованы компоненты разрабатываемого композиционного препарата, условно названного БАП «МОБЕЛИЗ» - комплекс катионных сывороточных белков молока (КСБМ) и куриный лизоцим (к-ЛЦ). Разработан способ, позволяющий получать близкий по составу к защитному комплексу концентрат КСБМ, включающий такие биологически значимые белки, как лактопероксидаза (ЛП), лактоферрин (ЛФ), панкреатическая рибонуклеаза (пРНКаза), ангиогенин (АНГ) и лизоцим (ЛЦ) с достаточно высоким выходом компонентов (-70-90%) (табл.1, рис.2).

В целом, из-за высокого выхода биологически активных белков молока в катионную фракцию, ее состав в значительной мере отражает состав защитного белкового комплекса молока вне бактерицидной фазы.

Анализ состава полученного белкового комплекса КСБМ свидетельствует о том, что наиболее представительными по содержанию компонентами фракции КСБМ являются близкие по своим свойствам лактопероксидаза и лактоферрин. Общее содержание панкреатических рибонуклеаз (пРНКазы и АНГ) в 5 и 3 раза ниже по сравнению с ЛП и ЛФ соответственно. При этом соотношение пРНКазы и АНГ внутри группы составляет 80% и 20% соответственно.

Рисунок 1. Схема проведения исследований

Таблица 1. Состав фракции КСБМ

Белок Содержание мг/мг белка*

ЛФ 0,323*0,015

ЛП 0,561 ±0,030

пРНКаза 0,085±0,005

АНГ 0,028±0,001

лц 0,003±0,0002

* - в расчете на ) мг общего белка

8,5% пРНКаза

2.8% ангиогенин

0,3% лизоцим

32,3% лаюоферрин

Рисунок 2. Соотношение компонентов в фракции КСБМ, %

За 100% принято общее содержание белка в катионной фракции

Однако компоненты КСБМ неодинаковы по активным дозам. Так, ангиогенин -высокоактивный белок, проявляет биологическое действие уже в пикограммовых дозах, что значительно превосходит величины активных доз других белков комплекса КСБМ.

В коровьем молоке вне бактерицидной фазы присутствуют только следы, содержащегося в значительных количествах в женском молоке фермента лизоцима - полифункционального белка, играющего значимую роль в механизмах поддержания гомеостаза организма. Лизоцим (ЛЦ) - белок, известный как фактор не только физиологически активный сам по себе, но и способный в комплексе с другими защитными белками оказывать на некоторые из них активирующее действие.

В связи с этим, в качестве второй составляющей разрабатываемого препарата использовали получаемый нами из белка куриного яйца лизоцим (к-ЛЦ). Анализ препарата свидетельствует об электрофоретической чистоте и высоком уровне его ферментативной активности.

Известно, что компоненты разрабатываемого препарата обладают целым рядом уникальных свойств, что позволяет рассматривать их в качестве активной основы принципиально новых БАП полифункциональной направленности.

При определении необходимой дозы потребления композиционного БАП, как непосредственно препарата, так и в составе обогащенных им пищевых продуктов, учитывалось: содержание компонентов в цельном парном коровьем молоке, а также уже известные как физиологически активные дозировки, используемые в технологии обогащения лизоцимом и отдельными катионными сывороточными белками молока функциональных продуктов питания.

В четвертой главе «Технологические аспекты производства и применения биологически активного препарата на основе защитного комплекса молока и куриного лизоцима» освещены основные моменты исследования совместимости компонентов разрабатываемого препарата, технологии

получения композиционного БАП, обоснованы и приведены рациональные параметры его производства, консервирования и хранения.

С целью получения жидкой формы композиционного препарата «МОБЕЛИЗ» определяли совместимость его белковых компонентов. Для этого белки растворяли в используемых обычно в технологиях получения жидких форм биологически активных препаратов водные среды: физиологическом растворе (рН 6,7), дистиллированной воде (рН 5,5), калийфосфатном буфере (рН 6,2) в соотношениях КСБМ : к-ЛЦ = 1:1, 1:2, 2:1. При определении дозы отдельных белков в составе композиционного БАП руководствовались нормами их содержания в комплексе КСБМ цельного «парного» молока и дозировками к-ЛЦ, которые определены как эффективные для лечебно-профилактической цели и используются в технологии получения функциональных пищевых продуктов.

Органолептические, физико-химические показатели, биологическую активность белков определяли в исходных (КСБМ и к-ЛЦ) и композиционном препаратах сразу после растворения и в течение 1, 3, 12, 24, 48, 72, 168 часов хранения при температурах плюс 20±2С'С и плюс 4±2°С. Исследования показали, что сразу после составления белковой композиции не происходит изменений органолептических показателей и активности компонентов по сравнению с соответствующими показателями в растворах препаратов КСБМ и к-ЛЦ.

Установлено, что при комплексовании КСБМ с к-ЛЦ компоненты полученного композиционного БАП (жидкая форма) способны проявлять взаимное защитное действие в процессе хранения, способствуя продлению сроков сохранности биологической активности компонентов. Взаимозащитный эффект зависит от: характера среды, температуры и соотношения компонентов композиционного БАП. Наиболее выраженный эффект наблюдался при соотношении КСБМ : к-ЛЦ = 1:2 в физиологическом растворе при температуре хранения плюс 20±2°С (таблица 2). Эти показатели и были приняты за основу при разработке технологии производства БАП «МОБЕЛИЗ».

Для обоснования сроков хранения исследовали биологическую активность компонентов БАП в процессе хранения при плюс 4±2°С и плюс 20±2°С в двух вариантах: 1) растворы БАП перед хранением подвергали холодной стерилизации (микрофильтрации); 2) растворы БАП перед хранением не подвергались каким-либо асептическим процедурам.

При хранении жидкой формы БАП после микрофильтрации при обоих рассматриваемых температурных режимах белки сохраняются лучше, чем без проведения указанной процедуры (рисунок 3). На основании полученных результатов были выбраны сроки хранения БАП «МОБЕЛИЗ»: при температуре плюс 4±2°С - до 3 суток в случае «нестерильного» хранения и до 14 суток в случае хранения после холодной стерилизации; при температуре 20±2°С - до 12 часов в случае «нестерильного» хранения и до 1 суток после холодной стерилизации.

Очевидно, что для обеспечения длительных сроков хранения БАП необходимо применение процедур консервирования.

Таблица 2 - Время 50%-ной сохранности биологической активности белков в препаратах КСБМ, к-ЛЦ и композиционном БАП при храпении

Наиме- Варианты Время, часы

нование КСБМ/ КСБМ-кЛЦ КСБМ-кЛЦ КСБМ-кЛЦ

белка к-ЛЦ (1 1) (2 1) (12)

ДВ 3,0±0,15 6,15±0,31 * 3,9±0,19 11,65±0,58*

1= +20°С КФБ 5,25±0,26 11,0±0,55* 10,65±0,53* 14,4±0,72*

С? ФР 7,05±0,35 13,2±0,66* 9,75±0,49* 15,3±0,77*

ь: ДВ 19,8±0,99 32,4±1,62* 23,4±1,17 44,5±2,23*

1 = +4°С КФБ 21,6±1,08 42,0±2,1 * 30,0±1,5* 52,8±2,64*

ФР 28,1±1,40 51,2±1,02* 36,2± 1,81* 67,2±3,36*

ДВ 68,4±3,4 88,3±4,4* 76,8±3,8 96,5±4,8*

а 1=+20°С КФБ 76,0±3,8 97,0±4,8* 88,8±3,5* 105,6±5,3*

.3 ФР 81,6±4,1 100,8±5,0* 91,2±4,5 115,2±5,8*

£ ДВ 144±7,2 > 168* > 168* > 168*

I = +4°С КФБ > 168 > 168 > 168 > 168

ФР > 168 > 168 > 168 > 168

дв 66,0±3,3 90,3±4,52* 79,2±3,9* 100,0±5,1*

1= +20°С КФБ 78,7±3,9 100,8±5,0* 91,2±4,6* 113,8±5,69*

ФР 82,08±4,1 108,0±5,4* J 96,1 ±4,8* 124,8±6,24*

ДВ 98,4±4,9 114,7±5,7* 109,5±5,5* 127,2±6,36*

1 = +4°С КФБ 110,1±5,1 120,1±6,0* 110,4±5,5* 129,6±6,46*

ФР 113,3±5,7 126,5±5,7* 115,2±5,8* 139,2±6,96*

ДВ 21,7±0,9 29,7±1,8* 25,1 ±1,7 44,57±2,2*

1= +20°С КФБ 24,0±1,2 35,4±2,1* 27,5±1,6 55,1±3,31*

ФР 26,3±1,6 39,5±1,9* 36.6±1,4* 60,0±3,6*

дв 133,0±7,9 144,0±7,2* 139,2±6,9* > 168*

1 = +4°С КФБ 134,4±5,3 159,3±9,5* 142,5±8,5* > 168*

ФР 138,7±6,9 164,6±8,2* 158,7±11,1* > 168*

ДВ 18,9±1,1 32,0±1,9* 26,9±2,1* 48,0±3,4*

* ¡= +20°С КФБ 20.3±1,0 45,7±2.2* 44,3±2,6* 52,6±2,6*

ФР 23,7±1,2 50,4±2,0* 42,3±2,9* 59,5±3,4*

дв 91,2±5,4 117,1±7,0* 110,4±5,5* 132,0±5,1*

* 1 = +4°С КФБ 100,3±6,0 122,4±6,1* 116,5±6,9* 139,2±7,0*

ФР 105,6±7,4 129,1±7,8* 121,7±6,1 * 148,8±5,9*

ДВ - дистиллированная вода (рН = 5,6-5,7), КФБ - калийфосфатный буфер (рН = 6,2-6,3), ФР - физиологический раствор (рН = 6,6-6,7)

* статистически достоверные различия по сравнению с КСБМ и к-ЛЦ (в случае к-ЛЦ) (р<0,05) при одинаковых условиях хранения (температура и среда) ** в качестве контроля служил раствор препарата к-ЛЦ

Было изучено влияние таких приемов консервирования как замораживание и лиофильная сушка.

Установлено, что эффект «замораживание - оттаивание» на компоненты БАП в значительной мере зависит от скорости обоих процессов. При однократном медленном замораживании достигаемом при температуре минус 25±5°С - условии образования крупных кристаллов льда, имела место значительная потеря активности белков БАП.

14 24 2 1 24 1 ' 12 24 2 24 ' 24 7 24 |0 24 1 4 24 2! 24

чаш , ч«ш

1 1 12 24 2 24 1 24 7 24 10 24 14 24 21 24 ( 1 24 2 24 1 24 7 24 10 24 14 24 21 24

-, чаш , , часы

0-2

ЭЛП ИпРНКаи 0АНГ ВЛФ 13 к-ЛЦ

Рисунок 3 - Динамика изменения биологической активности компонентов БАП «МОБЕЛИЗ» в процессе хранения «нестерильного» (а) и после холодной стерилизации (б) раствора БАП при температуре плюс 4±2°С (1) и плюс 20±2°С (2)

По оси абсцисс - время хранения (часы;;

По оси ординат - биологическая активность компонентов (%).

За 100 % принято значение активности белков в исходном препарате

Сверхбыстрое замораживание (при минус 196±2°С), сопровождающееся образованием мелких кристаллов льда, оказывает меньшее отрицательное воздействие на структуру белков, что отражается на сохранности их нативности. Существенное значение имеет также скорость оттаивания, повышение которой с увеличением температуры вызывает снижение нативности всех белков БАП. Минимальные изменения биологической активности БАП «МОБЕЛИЗ» наблюдались в случае использования сочетания быстрого замораживания (минус 196±2°С) и медленного оттаивания (плюс 4±2°С). При этом белки по степени сохранности после «замораживания-оттаивания» следует расположить в порядке убывания так: ЛФ > пРНКаза > к-ЛЦ > АНГ > ЛП. Применение замораживания в качестве способа консервирования препарата целесообразно только для его хранения в течение 6 месяцев с учетом последующего снижения активности компонентов БАП в результате оттаивания.

Использование для консервации БАП лиофильной сушки (температуры: замораживания - минус 35±2°С, сублимации - от минус 22±2°С до минус 30±2°С, досушки - не выше 35±2°С) показало только незначительное снижение биологической активности компонентов БАП по сравнению с исходными показателями (не более чем на 3%). Экспериментально установлено, что сроки хранения препарата в лиофилизированной форме при температурах: плюс 20±2°С, плюс 4±2°С, минус 25±2°С составляют соответственно 6, 18 и 24 месяца. Полученные результаты позволяют считать лиофилизацию наиболее приемлемым способом консервирования препарата.

В результате проведенных исследований обоснованы параметры, положенные в основу промышленной технологии биологически активного препарата «МОБЕЛИЗ» (рисунок 4).

Рису но к 4 - Схема технологического процесса производства БАП «МОБЕЛИЗ»

Разработанная схема технологического процесса была положена в основу проекта технической документации на БАП «МОБЕЛИЗ».

В пятой главе «Характеристика и физиологические свойства препарата «МОБЕЛИЗ» приведены данные исследования органолептических, физико-химических, микробиологических показателей и биологической ценности разработанного БАП. Установлены его свойства положительно влиять на устойчивость к стрессовому воздействию и переносимости физических нагрузок животными.

Разработанная технология получения препарата позволяет достичь высокого уровня его качества (таблица 3).

Таблица 3 - Показатели безопасности и качества БАП «МОБЕЛИЗ»

Показатель „ Нормируемые по Полученные СаиПнН 2.3.2.1078-01

Органолептические показатели

Внешний вид, консистенция Таблетки или сыпучий однородный порошок Допускается присутствие небольших комочков, легко рассыпающихся при механическом воздействии

Цвет, вкус, запах Цвет молочно-белый равномерный по всей массе порошка Вкус сладковатый, без запаха

Физико-химические показатели

Массовая доля влаги, % 3,50±0,05 не более 5

Растворимость,сек 48±5 не более 60

Кислотность восстановленного продукта, рН 6,6 - 6,8 -

Микробиологические показатели

КМАФАнМ, КОЕ/г i,5*102 Не более 5x104

Содержание дрожжей и плесневых грибов в 1,0 г БАП, КОЕ Не обнаружены Не более 20

Бактерии группы кишечных палочек в 1,0 г БАП Не обнаружены Не допускаются

S aureus в 0,1 г БАП Не обнаружены Не допускаются

Патогенные микроорганизмы, в тч сальмонеллы, в 25,0 г БАП Не обнаружены Не допускаются

Результаты исследования аминокислотного состава и аминокислотного скора БАП «МОБЕЛИЗ» в сравнении с «идеальным» белком представлены в таблице 4. Рассчитанный аминокислотный скор, свидетельствует о том, что БАП «МОБЕЛИЗ» является биологически полноценным белковым

препаратом, так как содержит по сравнению с «идеальным» белком повышенное количество незаменимых аминокислот.

Таблица 4 - Аминокислотный состав БАП «МОБЕЛИЗ»

Незаменимые, Содержание Амино- Заменимые, Содержание

в том числе: (г/100 г белка) кислотным скор,% в том числе: (г/100 г белка)

Лизин 9,9 180 Глицин 10,7

В алии 9,1 182 Аргинин 9,8

Фенил аланин+ 11,2 186 Алании 12,5

Тирозин

Изолейцин 6,1 150 Гистидин 3,5

Лейцин 14,5 207 Аспарагиновая кислота 12.4

Метионин+ Цистин 8.7 249 Аспарагин 9,8

Триптофан 3,1 310 Серии 11,2

Треонин 24.0 600 Глутамин 4,2

Пролин 8,7

В состав БАП «МОБЕЛИЗ» входят белки, обладающие разной антимикробной специфичностью. Так. действие большинства белков концентрата КСБМ наиболее выражено в отношении грамотрицательной микрофлоры, а к-ЛЦ - грамположительной. Было изучено влияние композиционного препарата на жизнеспособность условно-патогенной микрофлоры на примере БГКП (Е.соН) и Э.аигеиз. Динамика роста исследуемых бактерий в присутствии физиологических доз БАП «МОБЕЛИЗ» (225 мкг/мл) представлена на рисунке 5.

ш О

И контроль (без БАП) 0 опыт {с БАП)

Продолжительность культивирования, ч

О 2 4 24

Продолжительность культивирования, ч

О

Рисунок 5 - Влияние БАП «МОБЕЛИЗ» на развитие Е.соН (а) и Б. аигеиь (б) в процессе культивирования

Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат вызывает снижение количества жизнеспособных клеток тест-культуры. Характер антимикробного действия БАП «МОБЕЛИЗ» на грамположительную и грамотрицательную тест-культуру различен. В отношении Е.соП действие компонентов БАП наиболее выражено при двухчасовом культивировании с последующим снижением степени подавления развития микроорганизма, тогда как в отношении З.аигеия максимальное ингибирование роста наблюдается в более поздние сроки и в период 4-24 часов культивирования рост остается сниженным. Таким образом, комплексный биологически активный препарат «МОБЕЛИЗ» обладает антимикробным действием в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных условно-патогенных микроорганизмов, в связи с чем, он может рассматриваться в качестве эффективного антимикробного средства с более широким спектром действия, чем его составляющие компоненты (КСБМ и к-ЛЦ).

Как уже отмечалось, перечень свойств катионных белков, входящих в состав БАП «МОБЕЛИЗ», свидетельствует об их полифункциональности. Одним из важнейших свойств компонентов БАП является участие в механизмах регуляции иммунитета животного организма в нормальных и экстремальных условиях существования, что позволяет рассматривать его в качестве основы целевых препаратов-парафармацевтиков, направленных на поддержание гомеостаза организма.

В качестве адекватной модели оценки физиологоческой активности БАП «МОБЕЛИЗ» изучали его влияние при пероральном приеме на резистентность животного организма к стрессовым воздействиям. Исследование проводили на самцах белых крыс линии «Вистар». В соответствии с выбранной моделью исследования крыс делили на экспериментальные группы. Каждая группа включала по 20 особей в возрасте три недели.

Проводили оценку влияния БАП на адаптивные реакции животного организма при действии стрессовых раздражителей в сочетании с гиподинамией, достигаемой подвешиванием животных по 18 ч ежедневно в специальных разработанных нами жилетах.

В качестве критериев оценки физиологического состояния животных определяли массу тела, абсолютную и относительную массу органов, длину тела и хвоста, состояние кожного покрова, поведенческие реакции, уровень лизоцима в крови, работоспособность в постстрессовый период по продолжительности бега.

В ходе эксперимента существенных различий в реакциях, проявляемых в процессе адаптации животных по поведенческим признакам и грубых морфологических нарушений не наблюдалось. Исследование морфологических характеристик животного организма показало, что у крыс экспериментальных групп не наблюдается существенных различий по показателям: абсолютной и относительной массы органов (кроме тимуса), длине тела и хвоста. Что касается массы тела, по сравнению с интактным контролем у животных, подвергавшихся жестким стрессовым воздействиям (контроль и опыт II) она несколько снижена, однако у крыс, принимавших препарат «МОБЕЛИЗ» в меньшей степени, чем у

животных соответствующей контрольной группы.

Выносливость крыс, в рационе которых присутствовал БАП «МОБЕЛИЗ», как после однократно, так и дважды испытываемого стресса была в -18 и ~9 раз выше по сравнению с соответствующими контрольными группами. Вторичное применение к животным, в рационе которых присутствовал БАП (опыт II), условий стресса (через 3 дня после первого трехдневного стрессового периода) приводит к снижению показателей работоспособности в 2 и 4 раза по сравнению с соответствующими показателями у животных однократно испытываемых условия стресса (опыт I) и животными интактного контроля. Физическая выносливость крыс контрольных групп по сравнению с животными группы интактного контроля была значительно снижена, что свидетельствует о существнном влиянии применяемого стрессового воздействия на физическое состояние животного организма. Наличие в рационе питания крыс БАП «МОБЕЛИЗ» обеспечивает более быстрое протекание процесса адаптации в постстрессовый период.

У крыс, подвергавшихся стрессовым воздействиям, масса тимуса -лимфоидного органа, отражающего глубину стрессовой реакции, была ниже, чем у животных группы интактного контроля. Тем не менее, у крыс опытных групп, получавших БАП «МОБЕЛИЗ», масса тимуса была на -45% выше по сравнению с животными соответствующих контрольных групп (рисунок 6-а). У животных, однократно испытывающих стрессовое воздействие (I опыт) масса тимуса на -39% выше чем у животных дважды подвергавшимся аналогичным стрессовым условиям (И-ой опыт), похожая тенденция наблюдалась и в соответствующих контрольных группах, в период адаптации у которых происходила значительная инволюция тимуса.

Содержание лизоцима - показателя природной резистентности организма -в сыворотке крови животных, испытывающих стрессовые воздействия (I и II контрольные группы), по сравнению с животными интактного контроля, снижено. У животных, получавших алиментарным путем БАП «МОБЕЛИЗ» (опыт I и II), этот показатель остается на более высоком уровне (рисунок 6-6). Максимальное расходование защитных резервов животными наблюдается у животных, дважды испытывающих стрессовое воздействие.

Результаты полученные при исследовании как массы тимуса, так и уровня лизоцима в крови свидетельствуют о том, что используемые в работе стрессовые воздействия, не вызывая серьезных патологических изменений, сопровождаются расходованием защитных резервов организма, наиболее выраженные при удвоении стрессовой нагрузки. Присутствие в рационе крыс БАП «МОБЕЛИЗ» повышает устойчивость организма к стрессовым воздействиям.

Рассчитанный интегральный показатель хронической интоксикации для основных жизненно важных внутренних органов не выявил каких-либо значимых различий между животными опытной группы, в рационе которых присутствовал БАП «МОБЕЛИЗ» в дозировке, превышающей рекомендуемую в 10 раз, и животными группы интактного контроля, находящимися на общевиварном рационе питания.

01 К2 02 группы животных

01 К2 02

группы животных

а О

Рисунок 6 - Влияние БАП «МОБЕЛИЗ» в рационе крыс на массу тимуса (а) и уровень лизоцима в сыворотке крови (б) на фоне стрессового воздействия

01-1 опытная группа - крысы на фоне общевиаарного рациона получали алиментарным путем 225 мкг БАП в течение 21 дня, единожды испытывали стрессовое воздействие в сочетании с гиподинамией в течение трех дней;

К1 — I контрольная группа - то же что и в 1-ой опытной группе, но животные не получали БАП;

02 - II опыт - крысы на фоне обшевиварного рациона получали алиментарным путем 225 мкг БАП в течение 21 дня, стрессовое воздействие в сочетании с гиподинамией испытывали дважды в течение трех дней с интервалом 3 дня;

К2 - (1 контроль - то же что и во 11-ой опытной группе, но животные не получали

БАП:

Кн - интактный контроль - крысы находились на общевиварном рационе питания, но во время «подвешивания» животных других групп были лишены воды и пиши.

Введение БАП в рацион животных опытной группы обеспечивает повышение показателя прироста массы тела по сравнению этим показателем у животных группы интактного контроля.

Оценку влияния БАП «МОБЕЛИЗ» на физическую выносливость лабораторных животных к скоростной нагрузке проводили по результатам измерения продолжительности бега животных в третбане. В соответствии с выбранной моделью исследования животных делили на экспериментальные группы по 20 особей в каждой.

У животных ежедневно испытывающих физические нагрузки на фоне потребления БАП по сравнению с крысами соответствующей контрольной группы и интактного контроля наблюдается тенденция повышения прибавки в весе и увеличения продолжительности бега (рисунок 7), что свидетельствует о положительном влиянии БАП «МОБЕЛИЗ» на показатели развития и работоспособности животного организма.

Оценивая действия разработанного препарата «МОБЕЛИЗ» на животный организм по исследуемым показателям можно заключить о том, что он является биологически безопасным при значительной физиологической активности, направленной на поддержание гомеостаза организма.

Рисунок 7 - Влияние перорального приема крысами БАП на продолжительность их бега О - опыт — животные ежедневно в течение 7 дней получали дозированную физическую нагрузку. В первый день длительность бега составляла 5 мин., в последующие дни продолжительность нагрузки увеличивали на 1 мин. Сразу после проведения нагрузки крысам вводили исследуемый БАП;

К - контроль - то же, что и в опытной Группы животных группе но животные не получали БАП;

Кн - интактный контроль -

животные находились на обще-виварном рационе и не подвергались никаким физическим нагрузкам.

В шестой главе «Влияние технологических факторов производства молочных продуктов на биологическую активность БАП «МОБЕЛИЗ» приведены результаты по влиянию тепловых режимов (нормализации, гомогенизации, пастеризации, стерилизации) и закисления среды (закваска) на нативность компонентов БАП, в жидкой форме композиционного препарата и в составе молочного сырья, а также по влиянию компонентов БАП на качественные показатели готовых молочных продуктов в ходе их получения и хранения.

Нагревания растворов БАП проводили последовательно с соблюдением режимов ступенчатой тепловой обработки молочного сырья. При тепловой обработке режимами нормализации БАП в жидкой форме, в том числе в составе молока, выявлен заслуживающий особого внимания факт активации биологической активности входящих в состав композиционного препарата белков. Возможно это связано с какими-то вызванными нагреванием изменениями в структурной организации белковых молекул. Последующее нагревание до температуры гомогенизации приводит к некоторому снижению биологической активности белков БАП, но для большинства белков препарата она остается близкой к исходной (до обработки) (рисунок 8).

Применяемые при производстве молочных продуктов температурные воздействия на этапе пастеризации (74±2°С) вызывают дальнейшее снижение биологической активности всех белков препарата, тогда как по сравнению с исходными значениями (до обработки) остаются на достаточно высоком уровне. Небольшое снижение биологической активности при жестких условиях пастеризации (92±2°С), применяемой в технологии получения кисломолочных продуктов, отмечено только для ангиогенина и лактопероксидазы. Обработка БАП (жидкая форма) и молока с БАП температурой в режиме стерилизации способствовала значительной потере нативности ЛП, АНГ, ЛЦ. Уровень активности пРНКазы и ЛФ и в этом случае оставался достаточно высоким

5 JJ

я; 30

I 25 £

0 20 | 15

9

? 10

1 5

(рисунок 8). По степени термоустойчивости белки БАП следует расположить в следующем порядке: пРНКаза > лактоферрин >лизоцим > ангиогенин > лактопероксидаза.

И нормализация

(Т=45°С)

0 пастеризация

92°С)

В стерилизация

(Т=135°С)

пРНКаза

к-ЛЦ

Белки БАП

Рисунок 8 - Влияние режимов тепловой обработки БАП «МОБЕЛИЗ» (жидкая форма) на биологическую активность входящих в него белков

за 100 % принята биологическая активность белков до температурной обработки.

Согласно схеме технологического процесса выработки кисломолочных продуктов после пастеризации и охлаждения до температуры заквашивания в молоко вносится закваска. В процессе сквашивания происходит снижение рН среды с 6,7 до 4,6-4,9. При этом вызванные предшествующим тепловым воздействием изменения в структуре белков, вероятно, усугубляются, что и выражается в снижении биологической активности белков (рисунок 9).

Полученные данные указывают на необходимость при разработке технологий получения молочных продуктов, обогащенных композиционным БАП «МОБЕЛИЗ», учитывать не только инактивирующее действие высоких температур пастеризации и стерилизации, но и при производстве кисломолочных продуктов закисление среды в результате сквашивания.

В плане изучения влияния БАП «МОБЕЛИЗ» на изменение качественных показателей обогащенных им молочных продуктов проводили опытную выработку пастеризованного молока и йогурта.

По органолептическим, физико-химическим показателям пастеризованное молоко и йогурт, обогащенные БАП, отвечали требованиям соответствующего действующего нормативного документа.

Готовые продукты исследовали на сохранность по показателям: органолептическим, титруемой кислотности, содержанию мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (^ КОЕ/г).

Рисунок 9 - Влияние режимов тепловой обработки с последующим закислением среды при производстве кисломолочных продуктов на биологическую активность белков БАП «МОБЕЛИЗ» (жидкая форма)

За 100% принята активность белков БАП до обработки.

ЛП ЛФ пРНКаза АНГ к-ЛЦ

Белки БАП

0 подогрев до температуры нормализации (45Т)

И подогрев до температуры пастеризации(92°С)

0 охлаждение до температуры заквашивания и изменение рН (6,7—>4,9)

Исследования показали, что моделирование бактерицидной фазы молока путем введения БАП «МОБЕЛИЗ» в пастеризованное молоко способствует максимальному проявлению антимикробного эффекта компонентами препарата в течение 3 суток хранения при температуре 6°С. При последующем хранении антимикробное действие белков БАП «МОБЕЛИЗ» снижается, вероятно, за счет снижения биологической активности из-за нарастания в среде кислотности. В целом, подавление развития микрофлоры в пастеризованном молоке, обогащенном БАП, способствует его сохранности без изменений в течение 5 дней при температуре 6°С.

На примере йогурта показано, что внесение БАП «МОБЕЛИЗ» в состав молочного сырья при производстве кисломолочных продуктов на стадии заквашивания не ингибирует рост полезной микрофлоры закваски в процессе сквашивания. Добавление БАП после завершения процесса сквашивания способствует незначительному, в отличие от пастеризованного молока, подавлению развития микрофлоры готового продукта в процессе хранения. Вероятно, это связано со снижением проявления белками БАП биологической активности в результате смещения рН в кислую сторону. Очевидно, что введение БАП «МОБЕЛИЗ» в кисломолочные продукты, следует проводить после завершения процесса сквашивания.

Полученные результаты исследования свидетельствуют о перспективности применения БАП «МОБЕЛИЗ» в качестве биологически активной основы молочных продуктов лечебно-профилактической направленности.

выводы

1. Разработан новый биологически активный композиционный препарат (Б АП «МОБЕЛИЗ») на основе катионных сывороточных белков коровьего молока и куриного лизоцима с более широким спектром физиологической активности, чем составляющие его компоненты в жидкой и сухой формах.

2. Из коровьего молока получена белковая фракция катионных сывороточных белков, включающая: лактопероксидазу, лактоферрин, пРНКазу, агиогенин, лизоцим. По содержанию этих белков ее состав (за исключением лизоцима) близок к формуле защитного белкового комплекса молока.

3. Экспериментально обоснована совместимость комплекса катионных сывороточных белков молока с выделенным из белка куриного яйца лизоцимом. Разработаны рациональные параметры технологии получения и хранения композиционного препарата. Наиболее благоприятными условиями для сохранности биологической активности всех компонентов препарата являются:

• использование в качестве биологически нейтральной среды для растворения физиологического раствора (рН 6,7);

• соотношение компонентов КСБМ : к-ЛЦ = 1:2.

4. Установлено, что компоненты композиционного препарата полностью сохраняют биологическую активность:

• в жидкой форме: без соблюдений правил асептики - при температуре плюс 4±2°С - до 3 суток, при 20±2°С - до 12 часов; с соблюдением правил асептики - при температуре плюс 4±2°С - до 14 суток, при 20±2°С - до 1 суток;

• в сухой форме: при температуре плюс 20±2°С - до 6 месяцев, при плюс 4±2°С - до 18 месяцев, при минус 25±2°С - до 24 месяцев;

• в замороженном виде: до 6 месяцев.

5. Установлено взаимозащитное действие компонентов препарата, позволяющее увеличить период проявления ими биологической активности и сроки хранения препарата в жидкой форме.

6. При пероральном введении животным препарат нетоксичен и обладает целым радом свойств защитного характера: способствует повышению устойчивости к стрессовым воздействиям и выносливости к физическим нагрузкам.

7. Показана высокая биологическая ценность разработанного препарата: повышенное в сравнении с эталоном ФАО/ВОЗ содержание всех незаменимых аминокислот.

8. Выявлено антимикробное действие препарата в отношении грамположительной и грамотрицательной условно-патогенной микрофлоры.

9. Исследованиями влияния технологических факторов производства молочных продуктов на активность компонентов композиционного препарата показано, что:

• при нагревании до температур нормализации (40-45°С) наблюдается эффект увеличения биологической активности белков;

• последующая температурная обработка режимами гомогенизации (60-65°С) приводит к снижению биологической активности компонентов препарата, однако до уровня превышающего значения до тепловой обработки;

• повышение температур до значений, соответствующих режимам пастеризации и стерилизации, а также закисление среды, имеющее место при производстве кисломолочных продуктов, приводят к значительной потере биологической активности белков композиционного препарата.

10.В результате проведения в условиях промышленного производства опытной выработки установлено, что в молочных продуктах, обогащенных композиционным препаратом «МОБЕЛИЗ», полностью сохраняется его биологическая активность и высокий уровень качества готовых продуктов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Лепихина, O.E. Оценка уровня изменения содержания лактопероксидазы и иммуноглобулина G в промышленных технологиях переработки молока / O.E. Лепихина, Г.С. Комолова // Технология живых систем: материалы научно-технической конференции. - М.: МГУПБ, 2004. - С. 50-53.

2. Лепихина, O.E. Активность катионных сывороточных ферментов молока в составе композиции с С-лизоцимом в процессе хранения / O.E. Лепихина, Г.С. Комолова // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы IV Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2005. - С. 5-6.

3. Лепихина, O.E. Зависимость активности лактопероксидазы в составе композиции белков защитного комплекса молока и куриного лизоцима от технологических параметров производства молочных продуктов / O.E. Лепихина, Г.С. Комолова // Сборник материалов научных чтений с международным участием международным участием, посвященных 100-летию со дня рождения П.Ф. Дьяченко: научное издание. - М..МГУПБ, 2006. - С.52-54.

4. Лепихина, O.E. Изменение активности панкреатических рибонуклеаз в составе композиции ферментов защитного комплекса молока при производстве молочных продуктов / O.E. Лепихина, И.И. Щербакова, Г.С. Комолова // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы V международной научной конференции студентов и молодых ученых, М.: МГУПБ, 2006. - С. 17-19.

5. Лепихина, O.E. Влияние условий замораживания и лиофильной сушки на сохранность ферментов защитного комплекса молока в составе композиции с куриным лизоцимом / O.E. Лепихина, Г.С. Комолова, О.М. Степовая // Сборник научных трудов. Проблемы совершенствования холодильной техники и технологии. Энергосбережение. Выпуск 3, М.: МГУПБ, 2006. - С.60-62.

6. Тихомирова, H.A. Разработка биологически активной композиции на

основе сывороточных катионных белков молока и куриного лизоцима / H.A. Тихомирова, O.E. Лепихина, И.И. Щербакова, Г.С. Комолова // Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: Материалы конгресса. - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им.Д.И.Менделеева, 2007 - часть 2, С.214.

7. Семенов Г.В. Сублимационная сушка в технологии промышленного производства БАД на основе композиции катионных белков молока / Г.В. Семенов, O.E. Лепихина, Г.С. Комолова // Сборник материалов научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных и прикладных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий», г.Углич, ГНУ ВНИИМС Россельхозакадемия, 2007. - С.313-315.

8. Лепихина, O.E. Изучение влияния режимов тепловой обработки на нативность ферментов защитного комплекса молока в составе обогащенного комплексным препаратом «КСБМ-кЛЦ» питьевого молока / O.E. Лепихина, Г.С. Комолова // Материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - М.-.МГУПБ, 2007. - С. 144.

9. Щербакова И.И. Электрофоретическое исследование влияния тепловой обработки на содержание апо-лактоферрина в составе белковой фракции молочной сыворотки / И.И. Щербакова, O.E. Лепихина, Г.С. Комолова // Материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - М.:МГУПБ, 2007. - С. 144.

10. Лепихина, O.E. Разработка технологии получения биологически активного препарата на основе сывороточных белков молока и куриного лизоцима / O.E. Лепихина, H.A. Тихомирова, Г.С. Комолова // Сборник материалов V Юбилейной школы-конференции «Высоко-эффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации», М.: МГУПП, 2007. С. 88-92.

П.Рогов, И.А. Способ получения БАД из низкомолекулярных катионных белков молока и полученная этим способом БАД / И.А. Рогов, Е.И. Титов, Г.В. Семенов, H.A. Тихомирова, Г.С. Комолова, И.И. Ионова, O.E. Лепихина. Патент RU № 2318406 С 1 /10.03.2008. Бюл.№7. - 6 с.

12. Семенов, Г.В. Сохранность термолабильных БАД на основе ферментных защитных систем молока / Г.В. Семенов, O.E. Лепихина, Г.С. Комолова // Молочная промышленность, № 1,2008. - С. 82-83.

13. Лепихина, O.E. Влияние технологических факторов производства молочных продуктов на нативность биологически активных белков комплекса «Катионные белки молока + куриный лизоцим» / O.E. Лепихина, H.A. Тихомирова, Г.С. Комолова // Хранение и переработка сельхозсырья, № 5, 2008. - С.40-42.

14.Тихомирова, H.A. Хроматография сывороточных белков молока / H.A. Тихомирова, Г.С. Комолова, O.E. Овчинникова // МУ к выполнению

лабораторных и учебно-исследовательских работ для студентов по направлению 260300,260303,260100, 260116. М.: МГУПБ, 2008.-48 с.

15. Овчинникова, O.E. Антимикробные свойства нового биологически активного препарата «МОБЕЛИЗ» / O.E. Овчинникова, Г.С. Комолова // Молочная промышленность, № 9, 2008. - С. 69-70.

Список сокращений:

БАП - биологически активный препарат;

КСБМ - катионные сывороточные белки молока;

к-ЛЦ - куриный лизоцим;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ЛП - лактопероксидаза;

ЛФ - лактоферрин;

пРНКаза - панкреатическая рибонуклеаза;

АНГ- ангиогенин.

Автор выражает сердечную признательность сотрудникам научно-учебного отдела биохимических проблем экологии и коллективу вивария УРАН Институт биохимии им А Н Баха за помощь в организации проведения биологического эксперимента, а также коллективу ОАО «Молококомбинат «Гусь-Хрустапьный» за помощь в проведении опытно-промышленных испытаний

Подписано в печать 16.10.08. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ 07/27.

ООО «Полисувенир», 109316, Москва, ул. Талалихина, 33 Тел. 677-03-86

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ НОВЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БЕЖОВ МОЛОКА.

1.1 Теоретические основы создания биологически активных добавок к пище.

1.2 Технологические основы производства биологически активных добавок к пище. Принципы разработки рецептур

БАД и требования к их производству.

1.3 Биологически активные сывороточные белки молока.

1.4 Современные способы получения биологически активных белков из молочного сырья.

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Объекты исследований. Постановка эксперимента.

2.2 Обоснование выбора исходных компонентов композиционного препарата.

2.3 Методы исследования.

2.3.1 Препаративные методы.

2.3.2 Подготовка и контроль качества сырья для получения катионных сывороточных белков молока (КСБМ).

2.3.3 Аналитические методы.

2.3.4 Электрофорез белков в ПААГ.

2.3.5 Микробиологические методы.

2.3.6 Холодная стерилизация растворов белковых препаратов.

2.3.7 Лиофильная сушка.

2.3.8 Контроль качества препарата.

2.3.9 Методы моделирования технологических факторов производства молочных продуктов.

2.3.10 Условия проведения экспериментов с животными.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 3 ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПОНЕНТОВ РАЗРАБАТЫВАЕМОГО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПРЕПАРАТА (БАП).

3.1 Оценка качества исходного сырья.

3.2 Получение и характеристика компонентов композиционного препарата.

3.2.1 Комплекс катионных сывороточных белков молока (КСБМ).

3.2.2 Куриный лизоцим (кЛЦ).

ГЛАВА 4 ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОИЗВОДСТВА И ПРИМЕНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЗАЩИТНОГО КОМПЛЕКСА МОЛОКА И КУРИНОГО ЛИЗОЦИМА.

4.1 Определение совместимости компонентов композиционного БАП «МОБЕЛИЗ» в жидкой форме.

4.2 Прикладные аспекты разработки технологии получения

БАП «МОБЕЛИЗ».

ГЛАВА 5 ХАРАКТЕРИСТИКА И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА «МОБЕЛИЗ».

5.1 Изучение показателей качества БАП «МОБЕЛИЗ».

5.2 Исследование биологической ценности БАП «МОБЕЛИЗ».

5.3 Исследование антимикробного действия БАП «МОБЕЛИЗ».

5.4 Изучение показателей безопасности и физиологической активности БАП «МОБЕЛИЗ».

ГЛАВА 6 ВЛИЯНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПРОИЗВОДСТВА МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ КОМПОНЕНТОВ БАП «МОБЕЛИЗ».

6.1 Режимы тепловой обработки.

6.2 Кислотность среды.

6.3 Характеристика молочных продуктов, обогащенных БАП «МОБЕЛИЗ».

6.3.1 Питьевое молоко.

6.3.2 Йогурт.

ВЫВОДЫ.

Современная пищевая технология оставляет человеку все меньше шансов на сохранение биологически активных компонентов в продуктах повседневного потребления, как правило, подвергающихся сложной многостадийной обработке.

Красноречивыми примерами являются сыроделие и производство творога, отправляющие в отходы ценнейшие биологически активные белки молока, среди которых особенно значимыми являются: иммуноглобулины, лактоферрин, лактопероксидаза, ангиогенин, пРНКаза, лизоцим. Следует отметить, что безвозвратная потеря этих компонентов происходит не только при выделении казеиновой фракции молока, но и при различных способах сушки или стерилизации молочных продуктов, широко применяемых в молочной промышленности.

Между тем, именно эти белки придают натуральному молоку ряд важнейших свойств, делая его не только продуктом питания, но и основным фактором, определяющим устойчивость организма к неблагоприятным условиям, будь то бактериальная или вирусная инфекция, радиация или ксенобиотики химической природы.

В связи с этим в последние годы в отечественной отраслевой науке особое место отводится технологиям безотходной переработки молока, предусматривающим не только наиболее полное извлечение из сырья основных макро, но и микрокомпонентов, являющихся биологически-активными факторами, роль которых в механизме поддержания гомеостаза организма весьма значима. На их основе могут быть получены принципиально новые продукты различного функционального назначения, в том числе продукты направленного лечебного действия [1-2].

В отечественной и зарубежной практике практическое применение получили два способа выделения сывороточных белков молока - с помощью методов мембранной технологии (ультрафильтрации) и кислотно-тепловой коагуляции. Такие способы обработки исключают возможность получения низкомолекулярных, термолабильных катионных биологически активных белков молока. В качестве перспективных способов получения катионных белков молока рассматриваются методы ионообменной хроматографии, позволяющие получать фракции белков высокой степени очистки.

Известно, что в молоке биологически активные белки существуют в комплексе, функционально взаимосвязаны и способны проявлять в организме ряд защитных функций. Особое место среди них занимает лизоцим, который оказывает влияние на активность катионных белков молока, участвует в механизмах противоинфекционной защиты организма, переваривании, цитотоксичности, макрофаговой активности. Однако в коровьем молоке, по сравнению с женским, лизоцима недостаточно. В связи с этим, в последние годы лизоцим активно используется в производстве продуктов детского и лечебно-профилактического питания. В промышленности практическое применение получил препарат куриного лизоцима, по своим свойствам гомологичный лизоциму человека. На сегодняшний день сочетание лизоцима с другими биологически значимыми ферментами животного происхождения применяется в основном в производстве косметических препаратов и БАД для специального питания узких групп населения. Технологии их производства, как правило, не учитывают взаимное влияние компонентов этих комплексов в готовом продукте.

В связи с этим актуальной является разработка технологии получения композиций биологически активных белков животного происхождения на основе катионных белков молока и лизоцима куриного яйца, учитывающая: природное соотношение компонентов композиции; взаимное влияние биологически активных компонентов композиции; технологические характеристики; биологическую безопасность; технологичность - возможность дальнейшего использования в технологиях получения молочных продуктов лечебно-профилактической направленности, специального питания, а также БАД широкого спектра действия; техническую, социальную эффективность применения композиционного препарата.

Решению вышеуказанных проблем посвящена данная работа. Основной объем исследований выполнен в рамках Аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008 гг.)».

В соответствии с вышеизложенным, целью работы является разработка технологии биологически активного препарата на основе композиции защитного комплекса молока и куриного лизоцима для дальнейшего использования в качестве активного ингредиента многокомпонентных продуктов лечебно-профилактической направленности.

В соответствии с поставленной целью предусматривается решение следующих задач:

- Обосновать выбор белковой основы биологически активного препарата;

- Получить из коровьего молока и проанализировать белковую фракцию, входящую в состав защитного комплекса молока, изучить возможность ее совместного использования с куриным лизоцимом;

- Обосновать параметры технологии получения и рациональные режимы хранения биологически активного препарата на основе сывороточных катионных белков защитного комплекса молока и куриного лизоцима в жидкой и сухой формах;

- Исследовать органолептические, физико-химические, микробиологические, технологические свойства и биологическую ценность препарата;

- Определить токсичность и физиологическую активность препарата в эксперименте на животных;

- Провести апробацию препарата в технологии производства молочных продуктов в лабораторных и промышленных условиях, изучить показатели качества и безопасности обогащенных им продуктов;

- Разработать проект нормативной документации на производство биологически активного препарата на основе защитного комплекса молока и куриного лизоцима.

Основными структурными элементами диссертационной работы являются: введение, аналитический обзор отечественной, зарубежной научно-технической литературы и патентной информации, 6 глав основной части, выводов, библиографического списка и приложений.

выводы

1. Разработан новый биологически активный композиционный препарат (БАП «МОБЕЛИЗ») на основе катионных сывороточных белков коровьего молока и куриного лизоцима с более широким спектром физиологической активности, чем составляющие его компоненты в жидкой и сухой формах.

2. Из коровьего молока получена белковая фракция катионных сывороточных белков, включающая: лактопероксидазу, лактоферрин, пРНКазу, агиогенин, лизоцим. По содержанию этих белков ее состав (за исключением лизоцима) близок к формуле защитного белкового комплекса молока.

3. Экспериментально обоснована совместимость комплекса катионных сывороточных белков молока с выделенным из белка куриного яйца лизоцимом. Разработаны рациональные параметры технологии получения и хранения композиционного препарата. Наиболее благоприятными условиями для сохранности биологической активности всех компонентов препарата являются:

• использование в качестве биологически нейтральной среды для растворения физиологического раствора (рН 6,7);

• соотношение компонентов КСБМ : к-ЛЦ = 1:2.

4. Установлено, что компоненты композиционного препарата полностью сохраняют биологическую активность:

• в жидкой форме: без соблюдений правил асептики - при температуре плюс 4±2°С — до 3 суток, при 20±2°С - до 12 часов; с соблюдением правил асептики - при температуре • плюс 4±2°С - до 14 суток, при 20±2°С - до 1 суток;

• в сухой форме: при температуре плюс 20±2°С — до 6 месяцев, при плюс 4±2°С - до 18 месяцев, при минус 25±2°С - до 24 месяцев;

• в замороженном виде: до 6 месяцев.

5. Установлено взаимозащитное действие компонентов препарата, позволяющее увеличить период проявления ими биологической активности и сроки хранения препарата в жидкой форме.

6. При пероральном введении животным препарат нетоксичен и обладает целым радом свойств защитного характера: способствует повышению устойчивости к стрессовым воздействиям и выносливости к физическим нагрузкам.

7. Показана высокая биологическая ценность разработанного препарата: повышенное в сравнении с эталоном ФАО/ВОЗ содержание всех незаменимых аминокислот.

8. Выявлено антимикробное действие препарата в отношении грамположительной и грамотрицательной условно-патогенной микрофлоры.

9. Исследованиями влияния технологических факторов производства молочных продуктов на активность компонентов композиционного препарата показано, что:

• при нагревании до температур нормализации (40-45 °С) наблюдается эффект увеличения биологической активности белков;

• последующая температурная обработка режимами гомогенизации (60-65°С) приводит к снижению биологической активности компонентов препарата, однако до уровня превышающего значения до тепловой обработки;

• повышение температур до значений, соответствующих режимам пастеризации и стерилизации, а также закисление среды, имеющее место при производстве кисломолочных продуктов, приводят к значительной потере биологической активности белков композиционного препарата.

10.В результате проведения в условиях промышленного производства опытной выработки установлено, что в молочных продуктах, обогащенных композиционным препаратом «МОБЕЛИЗ», полностью сохраняется его биологическая активность и высокий уровень качества готовых продуктов.

заключение от