автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка способа получения белкового концентрата, содержащего ангиогенин, из молочного ультрафильтра

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Ультрафильтрат как побочное сырье молочного производства.

1.1.1. Баромембранные методы переработки вторичного молочного сырья.

1.1.2. Использование молочного ультрафильтрата.

1.2. Белки молочного ультрафильтрата.

1.2.1. а-лактальбумин и (3-лактоглобулин.

1.2.2. Минорные низкомолекулярные белковые соединения.

1.2.2.1. Ангиогенин - полифункциональный биологически активный белок.

1.2.2.2. Другие белки и пептиды.?.

Актуальность. Известно, что в цельном молоке содержится комплекс функционально значимых микронутриентов, в том числе белковой природы (ферменты, гормоны, факторы роста). В 1988 г. в коровьем молоке был открыт полифункциональный белок - ангиогенин, относящийся к семейству панкреатических рибонук-леаз. Белок обладает уникальной ферментативной активностью. Ангиогенин участвует в механизме поддержания гомеостаза систем организма. В свете результатов недавних исследований есть основание рассматривать ангиогенин в качестве возможного фактора пассивного иммунитета, который передается с молоком от матери к потомству. Исследование механизмов физиологического действия ангио-генина позволило наметить перспективу использования нового белка, как в биотехнологии, так и в медицинской практике: на его основе могут быть созданы биологически активные пищевые добавки, а также новые продукты различного функционального назначения.

С 90-х г. проводятся активные исследования ангиогенина молока на кафедре «Технология молока и молочных продуктов» Московского государственного университета прикладной биотехнологии совместно с институтом биохимии им. А.Н. Баха РАН под руководством акад. РАСХН Рогова И.А. За это время разработано два способа количественного определения ангиогенина: метод конкурентного взаимодействия и метод иммуноферментного анализа, благодаря которым стали возможными исследования по содержанию ангиогенина в различных видах молочного сырья. В диссертационных работах Тихомировой H.A. и Ионовой И.И. показано, что ангиогенин в значительных количествах содержится во вторичном молочном сырье, в том числе и ультрафильтрате. Белковые концентраты, содержащие ангиогенин, а также чистый препарат ангиогенина можно получать из молочного ультрафильтрата, являющегося побочным продуктом молочной промышленности, в состав которого входит как ангиогенин, так и другие низкомолекулярные белки, обусловливающие биологическую ценность молока.

В связи с этим актуальным является получение из молочного ультрафильтрата композиции биологически активных белков, включающей ангиогенин.

Данная научная проблема отвечает требованиям современной науки в фундаментальном и прикладном значении и соответствует «Основам политики РФ в области развития науки и технологий на период до 2010 г. и дальнейшую перспективу».

Исследования, представленные в диссертации, выполнены в рамках Федеральной программы Миннауки РФ, Межотраслевой и Межвузовской Научно-технических программ Минобразования РФ, представляющих приоритетные направления развития науки и техники РФ, а также проекта Российского фонда фундаментальных исследований и базируются на достижениях отечественных школ прикладной биотехнологии, биохимии и нутрициологии, представленных отечественными учеными: О.В. Большаковым; К.К. Горбатовой; Н.К. Журавской; Г.С. Комоловой; H.H. Липатовым (ст.); H.H. Липатовым (мл.); Н.П. Мертвецовым; И.А. Радаевой; И.А. Роговым; H.A. Тихомировой; Э.С. Токаевым; В.А. Тутелья-ном; В.Д. Харитоновым; А.Г. Храмцовым; А.П. Чагаровским; В.П. Чагаровским; A.M. Шалыгиной; В.П. Шидловской и др., а также зарубежными: M.D. Bond; Р. Maes; J.F. Riordan; R. Shapiro; DJ. Strydom; B.L. Vallee et. al.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка рационального способа получения из молочного ультрафильтрата белкового концентрата, содержащего биологически активное вещество - ангиогенин, для его использования в пищевых и медицинских целях.

На основании поставленной цели сформирована рабочая гипотеза, в основе которой лежит предположение, что имеющиеся в цельном молоке низкомолекулярные биологически активные белки в процессе мембранной обработки молока могут не задерживаться мембраной и попадать в ультрафильтрат. Особый интерес представляет ангиогенин. Согласно рабочей гипотезе из молочного ультрафильт6 рата можно получать биологически активный обогащенный ангиогенином белковый концентрат и чистый ангиогенин, которые могут быть использованы в качестве основы для получения биологически активных добавок к пище и лекарственных препаратов широкого спектра действия.

В соответствии с рабочей гипотезой определены основные задачи исследований:

Изучить возможность использования молочного ультрафильтрата для получения природного ангиогенина.

Разработать рациональные способы выделения из молочного ультрафильтрата белкового концентрата, содержащего ангиогенин, а также получить чистый препарат ангиогенина.

Исследовать состав и свойства опытных образцов белкового концентрата, содержащего ангиогенин.

Исследовать влияние технологических факторов на активность белкового концентрата.

Исследовать биологическое действие полученного белкового концентрата на животный организм.

Научная новизна. Получены новые фактические данные по биологически активным низкомолекулярным белкам молочного ультрафильтрата. Из ультрафильтрата получен белковый концентрат, представляющий собой композицию биологически активных низкомолекулярных белков, таких как панкреатическая рибонуклеаза (пРНКаза), ангиогенин, лизоцим и др. Разработаны два способа получения белкового концентрата из молочного ультрафильтрата (БК-УФ): осаждением сульфатом аммония и на основе баромембранных методов, позволяющих выделить белки в биологически активном виде. Охарактеризован состав и свойства полученного этими способами БК-УФ. Установлено влияние технологических факторов на его активность. Исследованиями in vivo показано положительное влияние белкового концентрата из молочного ультрафильтрата на 7 организм животных. Из БК-УФ выделен чистый препарат нативного ангиогенина и проведены его предклинические исследования.

Практическая значимость. На баромембранный способ получения биологически активного белкового концентрата из молочного ультрафильтрата, как представляющий научную новизну и важное народно-хозяйственное значение, получено положительное решение по заявке на патент № 2001118616/13 от 16.01.03. (приоритет от 06.07.2001.).

На основе полученных данных разработана нормативная документация на производство «Концентрата низкомолекулярных сывороточных белков молока» (ТУ 9229-039-02068640-02).

Полученные результаты исследований используются в проведении учебного процесса по дисциплинам: «Научные основы производства продуктов питания»; «Физика и химия молока»; «Технология продуктов лечебно-профилактического питания»; в курсовом и дипломном проектировании; учебно-исследовательской работе студентов.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены и обсуждены на третьей и четвертой международных научно-технических конференциях «Пища. Экология. Человек» (г. Москва, 1999, 2001), межвузовской научно-технической конференции «Перспективные направления научных исследований молодых ученых северо-запада России» (г. Вологда, 1999), школе-конференции молодых ученых «Горизонты физико-химической биологии» (г. Пущино, 2000), научно-практическом симпозиуме «Принципы и способы лабораторного обеспечения внебольничной помощи и актуальные проблемы лабораторной медицины» (г. Москва, 2001), научно-технической конференции «Технология живых систем» (г. Москва, 2002).

1. Экспериментальными исследованиями установлено в ультрафильтра те, полученном при выработке творога, содержание биологически активных веществ: пРНКазы - 5,00 ± 0,35 мг/л; ангиогенина -- 2,25 ± 0,11 мг/л и лизо цима - 1,65 ± 0,09 мг/л, что составляет соответственно около 70 %, 80% и

80%) от их уровня в исходном молоке и обоснована возможность его исполь зования для получения белкового концентрата, включающего эти белки.2. Разработаны два способа получения белкового концентрата из молоч ного ультрафильтрата (БК-УФ): осаждением сульфатом аммония и на основе баромембранных методов, на который утвержден проект НД. Выход ангио генина, пРНКазы и лизоцима из молочного ультрафильтрата в белковый кон центрат, независимо от способа его получения, составляет около 95%.3. Установлено, что белковые концентраты, полученные двумя способа ми, имеют одинаковый состав и физико-химические свойства. В состав бел ковых концентратов входят белки с молекулярной массой около 14, 18 и 30 кДа, а также пептиды, молекулярные массы которых ниже 14 кДа, при этом наиболее выражены полосы белков соответствующих молекулярным массам 14 и 18 кДа. В белковых концентратах установлено содержание биологиче ски активных белков - ангиогенина, пРНКазы и лизоцима, составляющее:

0,200 ± 0,010 %; 0,350 ± 0,015 % и 0,110 ± 0,006 % от общего белка соответ ственно, при этом показано, что ангиогенин преимущественно содержится в глобулиновой белковой фракции. I

4. Исследовано влияние основных технологических факторов на актив ность ангиогенина в составе белкового концентрата из молочного ультра фильтрата. Установлено, что температурная обработка белкового концентра та и низкие значения рН оказывают инактивирующее действие на активность (рН) от 5-и до 3-х инактивируется от 10 до 50 % ангиогенина соответственно.5. Установлено в опытах in vivo положительное влияние перорально вводимого белкового концентрата на организм животных, находящихся в со стоянии стресса. Так у животных получавших белковый концентрат не на блюдалась инволюция тимуса и увеличивалась концентрация лизоцима в сы воротке крови.6. Разработан способ получения из белкового концентрата (БК-УФ) чис того препарата ангиогенина, выход которого при этом составляет 61 %.Предклиническими исследованиями установлено положительное действие выделенного препарата чистого ангиогенина на воспалительную реакцию, а также стимуляцию местного иммунного ответа.

1. Абдулина Е.Р., Евдокимов И.А., Абдулина Т.Н. Баромембранные методыв технологической схеме выработки нативного фосфоказеината // Сб. научи, тр. Ставроп. гос. техн. ун-т. Сер. "Продовольствие". - Молоч. промть. - 1998. - вып. 1. - 28-34.

2. Адлер Ю.П., Маркова Е.В., Громковский Ю.В. Планированиеэксперимента при поиске оптимальных условий. - М: Наука. — 1976. 279с.

3. Алексеева И.И., Куриненко Б.М., Клейнер Г.И., Скуя А.Ж., ПензиковаГ.А., Орешина М.Г. Сравнительное изучение противовирусной активности панкреатических и микробных РНК-аз // Антибиотики. - 198?. - № 7. - С . 527-532.

4. Альперович Д.В., Кесельман Э.В., Шепелев А.П. Взаимосвязь неспецифических антимикробных факторов молока // Микробиол. эпидеммиол. и иммунология. - 1994. - - № 3. - с. 120-124.

5. Андреева В.И., Гьошева Б., Гершев Г., ГрозеваЛ., Чорбанов Б. Приложение на пермеат при производството на млечнокисели продукти // Науч. трудове. Висш. ин-т по хранителна и вкусова промишленост. - Пловдив. - 1998. - Т. 43. - свитък 1. - 237-241.

6. Безбородова С И . Рибонуклеазы // Прикладная биохимия и микробиология. - 1991. - Т. 27. - Вып. 3. - 308-326.

7. Безбородова С И . , Бородаева Л.И., Панкова Л.Н. Способность низшихгрибов синтезировать внеклеточные РНК-азы // Микробиология. - 1968. Т. 37. - № 1 . - С . 10-14.

8. Брок Т. Мембранная фильтрация. Пер. с англ. - М.: Мир. - 1987. - 464 с.

9. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов. - М.: Колос.1997.-288 с.

10. Гурова Н.В., Кожоев Б.Ш. Экологически безопасные белковые препараты(белковые изоляты): Технология их получения и прменение в продуктах лечебно-профилактического питания // Инж. Экология. - 1997. - № 6. - 29-34.

13. Дыкало Н.Я., Кравченко Э.Ф., Конаныхин A . B . , Гаврилов Г.Б., БетрозовО.И., Волкова Т.А. Переработка молочной сыворотки с применением мембранных методов разделения.: Обзорная информация. - М.: ЦНИИТЭИмясомолпром. - 1984. - 41 с.

16. Елисеева Л . С , Мертвецов Н.П. Реакция на антигенную информацию вусловиях повышенного уровня ангиогенина // Бюлл. экс. биол. и медицины. - 1997. - Т 123. - № 4. - 427-430.

17. Попова И.И. Разработка способа количественного определения биологически активного вещества - ангиогенина в молочном сырье // Автореф. дисс. на соискание уч. степени к.т.н. - М.: МГУПБ. - 1998. - 19 с.

21. Комолова Г.С., Федорова Т.В. Ангиогенин молока // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38. - № 3. - 1-11.

22. Крусь Г.Н., Тиняков В.Г., Фофанов Ю.Ф. Технология молока иоборудование предприятий молочной промышленности. - М.; Агропроми з д а т . - 1986.-280 с,

23. Куриненко Б.М., Лепдинская И.Б., Варламов В.П., Куриненко Б.М. Нуклеазы микроорганизмов. - Казань.: Изд-во КГУ. - 1991. - 153-230.

24. Куриненко Б.М., Нехорошкова З.М., Булгакова Р.Ш. Стимуляция рибонуклеазами неспецифических факторов защиты в организме экспериментальных животных // Антибиотики и химиотерапия. - 1995. - Т. 40. - № 7. - 30-34.

25. Мертвецов Н.П., Стефанович Л.Е. Ангиогенин и механизм ангиогенеза.Новосибирск.: Наука. СО РАН. - 1997. - 78 с.

26. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука. - 1985. - 536 с.

28. Полянский К.К., Долниковский В.И. Применение обратного осмоса в молочной промышленности.: Обзорная информация. - М.: АгроНИИТЭИ М М П . - 1990.-48 с.

30. Рекламные проспекты фирмы «ВИММ-БИЛЛЬ-ДАНН».

34. Тихомирова H.A. Мат. всес. конф. Пробиотики и пробиотическиепродукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека. - М.: Государственная концепция. Политика здорового питания в России. - 1999. - 31-33.

35. Тихомирова H .A . Научные и практические основы получения измолочного сырья биологически активного вещества ангиогенина: Автореф. дне. док. техн. наук. - М.: МГУПБ. - 2000. - 48 с.

36. Тихомирова H.A. , Федорова Т.В. Научные основы производства продуктов питания.: Метод, указ. - М.: МГУПБ. - 2001. - 37 с.

38. Федорова T.B. Влияние температуры на активность препаратов бычьегоангиогенина из молочного ультрафильтрата // «Пища. Экология. Человек» Тезисы докладов четвертой Международной научно-технической конференции. - М.: МГУПБ. - 2001. - 69.

39. Федорова Т.В., Попова И.И. Электрофоретическое исследование белковмолочного ультрафильтрата // «Горизонты физико-химической биологии» Тезисы докладов школы-конференции молодых ученых. - Пущино. 2 0 0 0 . - С . 93.

42. Фетисов Е.А. , Чагаровский А.П. Мембранные и молекулярно-ситовые методы переработки молока. - М.: Агропромиздат. - 1991. - 272 с.

44. Храмцов А.Г., Абдулина Е . Р . , Евдокимов И.А. Использование микрофильтрации для биологической стабилизации молочной сыворотки // Изв. вузов. Пищ. технология. - 1997. - № 1. - 37-39.

45. Храмцов А.Г., Абдулина Е.Р., Евдокимов И.А. Микрофильтрация молочного сырья.: Обзорная информация. — М.: АгроНИИТЭИММП. - 1991. 40 с.

46. Храмцов А.Г., Нестеренко П.Г. Рациональная переработка и использование белково-углеводного молочного сырья. - М.: Молоч. пром-ть. - 1998. - 102 с.

47. Чагаровский А.П., Гришин М.А. Переработка ультрафильтрата молочного сырья.: Обзорная информация. - М.: АгроНИИТЭИмясомолпром. 1987.-32 с.

48. Чагаровский А.П., Гришин М.А., Чагаровский В.П., Круглик В.И., АлиевИ.А., Иванова Л.Н., Ьачурина Т.П. Ультрафильтрационная обработка молочного сырья и тенденция дальнейшей ее переработки.: Обзорная информация. - М.: ЦНИИТЭИмясомолпром. - 1986. - 57 с.

50. Шидловская В.П. Ферменты молока. - М.: Агролромиздат. - 1985. - 152с.

51. ХЦедушнов Д.Е. Применение мембранной фильтрации в молочной промышленности.: Обзорная информация. - М . : АгроНИИТЭИММП. - 1992. - 2 9 с.

54. Bâcher T., Konigsfeldt P. WPI by microfiltration of skim milk // Europ. DairyMag. - 2000. - JNo 5 . - P . 14-16.

57. Bond M.D. , Strydom D.J. Amino acid sequence of bovine angiogenin // Biochemistry. - 1989. - V . 28. - № 14. - P. 6110-6113.

61. Brandsma R.L. , Rizvi S.S.H. Depletion of vv^ hey proteins and calcium by microfiltration of acidified skim milk prior to cheese making // J. Dairy Science. 1999. - V . 82. - № 10. - P. 2063-2069.

63. Cheryan M . Ultrafiltration handbook. - Lancaster.: Technomic publ. Co.1986.-375 p.

70. Fox E .A . , Riordan J.F. Molecular biology of angiogenin: Molecular Biology ofthe Cardiovascular sistem. - Philadelphia.: Copyright Lea Febirger. - 1990. P. 139-154.

71. Godovac-Zimmermann J., Braunitzer G. Modern aspects of the primary structure and function of ß-lactoglobulins // Milchwissenschaft. - 1987. - V . 42. № . 5. - P. 294-297.

73. Hallahan T.W., Shapiro R., Vallee B .L . Dual site model for the organogenicactivity of angiogenin // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S .A. - 1991. - V . 88. - № 6. - P. 2222-2226.

75. Hatzi E., Badet J. Expression of receptor for human angiogenin in vascularsmooth muscle cells // Eur. J. Biochem. - 1999. - V . 260. - № 3. - P. 825-832.

77. Hülsen U . Alternative heat treatment processes // Europ. Dairy Mag. - 1999.№ 3 . - P . 20-24.

81. Kozikowski W., Chojnowski W., Zuraw J., Przybylowicz K . The nutritionalvalue of protein in whey protein concentrates manufactured by different methods // Technologia alimentorum. - 1998. - JVb 30. - P. 59-70.

86. Lee H.S., Lee I.S., Kang T.C., Jeong G.B. , Chang S.I. Angiogenin is involvedin morphological changes and angiogenesis in the ovary // Biochem. and Biophys. Res. Commun. - 1999. - V . 257. - № 1. - P. 182-186.

114. Sawyer L . , Brownlow S., Polikarpov 1., Wu S-Y. P-lactoglobulin: Structuralstudies, biological clues // Int. Dairy Journal. -1998. - V . 8. - JS« 2. - P. 65-72.

118. Shugar D. The measurement of lysozyme activity and the ultra-violet invactivation of lysozyme // Biochira. Biophys. Acta. - 1952. - V . 8. - № 3. - P. 302309.

120. Soncin F., Shapiro R., Fett J.W. A cell-surface proteoglycan mediates humanadenocarcinoma FIT-29 cell adhesion to human angiogenin // J. Bio l . Chem. 1994. _ V . 269. - № 12. - P. 8999-9005.

122. Strydom D.J. The angiogenins // Cell . Mo l . Life Sei. - 1998. - V . 54. - № 8.P. 811-824.

127. Wang Q., Al len J.C., Swaisgood H.E. Binding of vitamin D and cholesterol toß-lactoglobulin // J. Dairy Sei. - 1997. - V . 80. - № 6. P. 1054-1059.