автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка биологически активной добавки на основе пробиотических культур, лизоцима и лактоферрина для обогащения молочной продукции

На правах рукописи

0065351** ^

РОГОЖИНА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ НА ОСНОВЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР, ЛИЗОЦИМА И ЛАКТОФЕРРИНА ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических

активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук .

1 7 ОКТ 2013

Москва 2013

005535124

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (с присоединенным ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»).

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Ганина Вера Ивановна

доктор технических наук, профессор Кочеткова Алла Алексеевна ФГБУ «НИИ питания» РАМН, руководитель лаборатории технологии новых специализированных продуктов профилактического действия

кандидат технических наук Эрвольдер Тамара Михайловна ЗАО «Партнер», начальник инновационных разработок

отдела

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии)

Защита диссертации состоится «Об» ноября 2013 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 006.025.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 119021, Россия, г. Москва, ул. Россолимо,7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИПБиВП.

Автореферат разослан «04» октября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета. /У

кандидат технических наук /^/'"Харламова Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

В Распоряжении Правительства РФ №1873-р от 25.10.20 Юг. «Основы государственной политики в области здорового питания населения на период до 2020 года» поставлена задача развивать «производство пищевых продуктов, обогащенных незаменимыми компонентами, продуктов функционального назначения, диетических (лечебных и профилактических) пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище». Это обусловлено тем, что в настоящий период, более чем у трети населения, обнаруживается снижение иммунологической резистентности организма; наблюдаются случаи острых инфекционных заболеваний, в т.ч. заболеваний желудочно-кишечного тракта; отмечается появление синдрома хронической усталости и снижается работоспособность и др. Одним из путей оздоровления населения и поддержания его в активной форме является потребление продуктов питания профилактической направленности.

Теоретические и практические основы названных выше направлений представлены в научных трудах отечественных и зарубежных ученых: С.И. Артюховой, Н.Б. Гавриловой, М.В. Гернет, Л.В. Голубевой, Г.А. Донской, И.А. Евдокимова, А.И. Жаринова, JI.A. Забодаловой, З.С. Зобковой, Г.С. Комоловой, A.A. Кочетковой, JI.A. Оганесян«, |О.Е. Овчинниковой] И.А. Рогова, С.А. Рябцевой, В.Ф. Семепихиной, H.A. Тихомировой, И.В. Толокновой, В.Д. Харитонова, А.Г. Храмцова, В.П. Шидловской, Т.М. Эрвольдер, S.A. Gonzälez-Chäveza, В. Lönnerdal, W.-S. Kim, K.-I. Shimazaki и других.

Расширение линейки новых продуктов с направленными функциональными свойствами, а также повышение эффективности действия существующих продуктов относится к одной из актуальных проблем современной пищевой биотехнологии. Однако существующие технологические приемы, используемые при производстве молочных продуктов, приводят к инактивации или значительному снижению исходного содержания биологически активных веществ в молочном сырье. В этой связи рациональное использование сырьевых ресурсов, более глубокая и полная их переработка, а также поиск новых подходов сохранения биологически активных веществ в готовой продукции являются приоритетными направлениями в науке и технологии.

Полагаем, что одним из направлений решения данной проблемы может быть применение в питании биологически активных компонентов, которые мягко воздействуют на организм и повышают его сопротивляемость к негативным факторам. К таким соединениям относят биологически активные белки молока, которые обладают целым рядом уникальных функций: противоинфекционной, иммуномодуляторной, противовоспалительной, антиоксидантной, регенеративной и другими. Пробиотические бактерии - естественные обитатели кишечника

человека, - не только способствуют нормализации микрофлоры кишечника, но и выполняют в организме ряд других функций, влияющих на обмен веществ, укрепление иммунитета, улучшение общего самочувствия и др.

В этой связи актуальными представляются исследования в области более широкого использования пробиотических культур и биологически активных белков молока для получения продуктов профилактической направленности.

Цель настоящей работы - разработать биологически активную добавку, состоящую из природных GRAS (Generally recognized as safe) - компонентов, на основе изучения взаимодействия пробиотических культур, лизоцима и лактоферрина для обогащения молочной продукции.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Теоретически и экспериментально обосновать состав биологически активной добавки.

2. Изучить действие разных доз лизоцима и лактоферрина на штаммы пробиотических бактерий.

3. Определить антагонистическую активность штаммов пробиотических бактерий различных таксонов совместно с модельной композицией лизоцима, лактоферрина в отношении патогенных и условно-патогенных тест-культур.

4. Разработать рецептуры и схему биотехнологии биологически активной добавки.

5. Обосновать сроки годности БАД на основании изучения показателей качества и безопасности.

6. Показать пути ей применения в технологии ферментированных молочных продуктов и провести промышленную апробацию.

Научная новизна

• Теоретически и экспериментально обоснован состав биологически активной добавки, включающей пробиотические культуры (Bifidobacterium adolescentis BGV-11 (ВКПМ Ас-1742), L.fermenum LFM-2 (ВКПМ В-10368), Lactobacillus rhamnosus LC-52GV (ВКПМ В-9475), Lactobacillus plantarum ГВИ-1 (ВКПМ-8556), Lactobacillus acidophilus АСТ-41 (ВКПМ В-9644) или Lactobacillus acidophilus 887, Str.thermophilus СТ-95 (ВКПМ В-7646) и биологически активные вещества молока - лизоцим и лактоферрин.

• Получены математические зависимости, адекватно описывающие интегральное поведение групп пробиотических штаммов как при их стимулировании, так и при ингибировании лизоцимом и лактоферрином. Определены рациональные концентрации лизоцима и лактоферрина для введения в состав биологически активной добавки, которые составляют 75,0±1,0 г на 1000,0 г БАД и 500,0±20,0 г на 1000,0 г БАД соответственно.

• Выявлен синергетический эффект при совместном действии изученных штаммов пробиотических культур и установленных концентраций лизоцима и

лактоферрина в отношении ингибирования роста условно-патогенных микроорганизмов E,coli 0147 и Staph.aureus 209-Р.

• Выявлены зависимости изменения показателей качества и безопасности в условиях хранения и обоснован срок годности БАД.

• Обоснованы методологические подходы использования разработанной БАД в технологии ферментированных молочных продуктов профилактической направленности.

Практическая значимость.

• Разработаны рецептуры и технологическая схема получения БАД различного состава.

• Разработаны технические условия ТУ 9222-00...-58693373-2011 и ТИ на напиток низколактозный из сыворотки с применением штамма термофильного молочнокислого стрептококка с высокой ß-галактозидазной активностью.

• В условиях ОАО «Тульский молочный комбинат» проведена производственная проверка применения БАД при выработке низколактозного напитка из сыворотки, что подтверждено положительным актом.

• Результаты исследований внедрены в учебный процесс: использованы в дисциплине «Биотехнологические процессы в производстве молока и молочных продуктов» - разработаны и опубликованы Методические указания к выполнению лабораторных работ для студентов направления 260200.68 Продукты питания животного происхождения.

Работа выполнялась в рамках Гранта Президента Российской Федерации по государственной поддержке ведущих научных школ Российской Федерации HLLI-3245.01.4 «Разработка новых пищевых технологий с участием живых систем на основе нетрадиционных подходов к управлению их жизнедеятельности и обеспечению качественных показателей готовой продукции».

Апробация.

Результаты исследований обсуждены и получили одобрение на Международных научных конференциях: VII международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2008), Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (Москва, 2009), Международной научно-практической конференции «Инновационные технологии и оборудование в молочной промышленности» (Воронеж, 2010), И Международной конференции Российского Химического общества имени Д.И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов» (Москва, 2010), VIII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2010), VII

5

Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), Международной научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2011), IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2011).

Результаты исследований были доложены на II Международной конференции Российского Химического общества имени Д.И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов», 2010, получен диплом II степени; IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», 2011, получена грамота.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах по перечню ВАК, 1 методическое указание для студентов.

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, объектов и методов исследования, экспериментальной части, содержащей 4 главы, выводов, библиографического списка, приложений. Основной текст работы изложен на 122 странице машинописного текста, содержит 41 таблицу и 38 рисунков. Библиография представлена 136 источниками, в том числе 70 зарубежных авторов, количество приложений - 9.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснованы актуальность, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследований.

В первой главе «Системный анализ состояния проблемы» проведен анализ научно-технической литературы. Проанализировано современное состояние рынка продуктов функционального назначения. Рассмотрены: свойства и физиологическое значение биологически активных белков молока и пробиотических культур для организма человека; тенденции по усилению и сохранению биологических активных веществ в продуктах питания; направления разработки биотехнологии новых и совершенствованию существующих технологий обогащенных молочных продуктов.

Во второй главе «Объекты и методы исследований» представлена информация об объектах и методах исследований, применяемых в работе.

Исследования проводили на кафедре «Технология молока и молочных продуктов» и в лаборатории ПНИЛЭФМОП МГУПП.

Объектами исследований являлись: пробиотические культуры из коллекции МГУПП Lactobacillus acidophilus АЕ-5 (ВКПМ В-8153); L.acidophilus АСТ-41 (ВКПМ В-9644); L.acidophilus АСТ-44 (ВКПМ В-9647); новый штамм

6

L.acidophilus 887; L.fermenum LFM-2 (ВКПМ B-10368); L.plantarum ГВИ-1(ВКПМ-8556); L.rhamnosus LC-52GV (ВКПМ B-9475); B.adolescentis BGV-11 (ВКПМ Ac-1742); молочнокислые термофильные стрептококки Str. thermophilus CT-13 (ВКПМ B-7983) и Str.thermophilus CT-95 (ВКПМ B-7646); коммерческий препарат - куриный лизоцим; коммерческий препарат - лактоферрин; лактоферрин, выделенный из молочного сырья; разработанные БАД и обогащенные ими молочные продукты.

В работе использованы стандартные методы исследований: препаративные - ультрафильтрация, катионообменная хроматография; аналитические -спектрофотометрический, турбодиметрический, йодометрическое титрование, электрофорез белков в ПААГ; микробиологические методы. Изучение токсичности биомодулей проводили на инфузориях с помощью прибора БиоЛаТ. Эксперименты проводили в 3-5 -кратной повторное™.

Статистическую обработку данных проводили с использованием методов математической статистики.

В соответствии с поставленной целью и задачами исследований была разработана схема организации и проведения исследований (рис.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В третьей главе «Изучение взаимодействия пробиотических культур с лизоцимом» приведены результаты собственных исследований по подбору штаммов для введения в БАД с лизоцимом. Основными критериями при отборе штаммов служили технологические и антагонистические свойства в отношении наиболее типичных возбудителей кишечных инфекций, устойчивость штаммов к лизоциму. К одним из важнейших технологических свойств относят развитие культур в питательной среде, которое оценивали по количеству клеток. Для более оперативного учета количества клеток пробиотических бактерий в создаваемых модельных композициях с лизоцимом были выявлены зависимости развития культур в стандартной прозрачной жидкой среде MRS и построены калибровочные кривые.

Изучение развития пробиотических культур в системе совместно с различными концентрациями лизоцима показало, что его действие на пробиотические культуры является штаммозависимым, то есть определяется родовой и видовой характеристикой самого штамма, а также его генетическими и биохимическими свойствами.

Анализ проведенных исследований показал, что наибольшую устойчивость к лизоциму проявляли штаммы: L.acidophilus АСТ-41, L.acidophilus 887, L.fermenum LFM-2, L.plantarum ГВИ-1, L.rhamnosus LC-52GV, B.adolescentis BGV-11.

Рисунок 1 - Схема организации и проведения исследований

Анализ результатов изучения антагонистической активности создаваемых модельных систем с лизоцимом показал, что данное свойство пробиотических культур зависит от концентрации лизоцима, а также определяется специфическими свойствами самого штамма (Таблица 1 и 2).

Таблица 1 - Антагонистическая активность пробиотических штаммов при культивировании с _лизоцимом по отношению к E.coli 0147

Концентрация лизоцима, мкг/см"1

№ Наименование штамма контроль (0,0) 50,0 75,0 100,0

Диаметр зоны ингибирования, мм

1 L.acidophilus АСТ-4] 11,5±0,5 11,0±0,5 10,0±0,5 9,0i0,5

2 L.acidophilus АЕ-5 10,0±0,5 9,0±0,5 8,5±0,5 8,5±0,5

3 L.acidophilus 887 11,0±0,5 11,5±0,5 12,5±0,5 11,5±0,5

4 L.plantarum ГВИ-1 11,0±0,5 12,0±0,5 12,5±0,5 12,5±0,5

5 L.fermenum LFM-2 10,0±0,5 11,0±0,5 12,0±0,5 11,5±0,5

6 L.rhamnosus LC-52GV 12,0±0,5 12,7±0,6 13,5±0,5 13,0±0,5

7 B.adolescentis BGV-11 13,0=t0,5 13,0±0,6 13,0±0,5 13,0±0,5

Таблица 2 - Антагонистическая активность пробиотических штаммов при культивировании с лизоцимом по отношению к Staph.aureus 209-Р_

№ Наименование штамма Концентрация лизоцима, мкг/см3

контроль (0,0) | 50,0 | 75,0 | 100,0

Диаметр зоны ингибирования, мм

1 L.acidophilus АСТ-41 12,0±0,5 11,0±0,5 10,5±0,5 10,0±0,5

2 L.acidophilus АЕ-5 10,0±0,5 9,0±0,5 8,5±0,5 8,5±0,5

3 L.acidophilus 887 11,5±0,5 11,0±0,5 10,5±0,5 9,0±0,5

4 L.plantarum ГВИ-1 10,0±0,5 11,5±0,5 11,8±0,б 12,0±0,5

5 L.fermenum LFM-2 8,0±0,5 10,5±0,5 11,5±0,5 11,0±0,5

б L.rhamnosus LC-52GV 11,0±0,5 12,0±0.5 12,5±0,5 13,0±0,5

7 B.adolescentis BGV-11 11,5±0,5 13,0*0,5 13,5±0,5 13,1 ±0,56

В результате проведенных исследований выявлен синергетический эффект ингибирования тест-культур E.coli 0147 модельными системами, включающими лизоцим и штаммы: L.fermenum LFM-2, L.plantarum ГВИ-1, L.rhamnosus LC-52GV, L.acidophilus 887. Синергетический эффект ингибирования по отношению к Staph.aureus 209- Р был отмечен в модельных системах, состоящих из лизоцима и штаммов L.fermenum LFM-2, L.plantarum ГВИ-1, L.rhamnosus LC-52GV, B.adolescentis BOV-11.

Антагонистическая активность модельной системы, состоящей из комплекса отобранных штаммов (L.acidophilus 887 , L.plantarum ГВИ-1, L.fermenum LFM-2, L.rhamnosus LC-52GV, B.adolescentis BGV-11) и лизоцима с рациональной концентрацией 75 мкг/см"1 представлена на рисунке 2.

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Диаметр зоны ингибирования, мм

0 Staph.aureus □ E.coli

Рисунок 2 - Антагонистическая активность комплекса пробиотических штаммов и лизоцима с концентрацией 75 мкт/см (2) по отношению к E.coli 0147 и Staph.aureus 209-Р

Разрабатываемые БАД предполагалось использовать в ферментированных видах молочных продуктов, в биотехнологии которых основным процессом является гидролиз молочного сахара - лактозы под действием фермента ß-галактозидазы. Бифидобактерии и некоторые штаммы лактобацилл обладают слабой р-галактозидазной активностью, но вступают в симбиотические отношения с термофильным молочнокислым стрептококком. В этой связи предполагали, что эффективность действия такого симбиоза будет выше, если применять штамм Str. thermophilus с высокой ß-галактозидазной активностью.

Были проведены исследования по изучению ß-галактозидазной активности штаммов пробиотических бактерий и молочнокислого термофильного стрептококка. Сравнительная характеристика изучаемых штаммов пробиотических бактерий и Str.thermophilus по индексу лактозосбраживающей активности приведена в таблице 3.

Таблица 3 - Сравнительная характеристика штаммов пробиотических бактерий и молочнокислого термофильного стрептококка по индексу лактозосбраживающей активности

Наименование вида и штамма бактерий Индекс лактозосбраживающей активности

Str.thermophilus СТ-95 (исходный) 1,00

Str.thermophilus СТ-95 (селекционированный) 1,30

L.acidophilus АСТ-41 0,70

L.acidophilus АЕ-5 0,72

L.acidophilus 887 0,52

L.plantarum ГВИ-1 0,61

L.fermenum LFM-2 0,60

L.rhamnosus LC-52GV 0,67

B.adolescentis BGV-11 0,41

Результаты анализа научно-технической литературы послужили основанием для изучения возможности усиления у биообъектов лактозосбраживающей

активности путем воздействия физических факторов низкой интенсивности. В качестве физического фактора низкой интенсивности использовали акустическое воздействие. В результате проведенных исследований была увеличена ß-галактозидазная активность штамма Str.thermophilus СТ-95, при одновременном сохранении его технологических свойств (время образования сгустка, консистенция молочного сгустка, органолептические и микробиологические показатели). Показано, что использование селекционированного штамма Str.thermophilus СТ-95 при сбраживании молочного сырья, в т.ч. молочной сыворотки, позволяет снижать количество лактозы на 30% (Рисунок 3). Полученные результаты были реализованы в технологии напитка низколактозного из молочной сыворотки, на который разработаны Технические условий и Технологическая инструкция, утвержденные руководством университета. Выявлено, что селекционированный штамм Str. thermophilus СТ-95 симбиотически сочетается со штаммом B.adolescentis BGV-11 и отобранных штаммов лактобацилл.

□ Количество несброженной лактозы Ш 5йм11епгюрЫ1из СТ-95 (исх.)

ВБимЬегторЬПиз СТ-95 (селекц.)

Рисунок 3 - Снижение содержания лактозы в молочной сыворотке при сбраживании штаммами 51г. ЛегторЬПиэ СТ-95

Для обоснования рациональных концентраций лизоцима исходные экспериментальные данные были разделены на группы по признаку реакции штамма на вносимое вещество. Выделенные группы данных были объединены .в статистические массивы, дальнейшая математическая обработка которых сводилась к аппроксимации данных полиномами различного порядка методом наименьших квадратов с помощью программного обеспечения «ТаЫеСигуе21) у.5.01», входящего в состав пакета прикладных программ «ЗУЭТАТ».

В результате такой аппроксимации получены математические зависимости, адекватно описывающие интегральное поведение групп штаммов как при их стимулировании, так и при ингибировании лизоцимом.

Для установленных коэффициентов модели стимулирования/ингибирования микроорганизмов лизоцимом и предельно допустимого уровня снижения активности штаммов ингибируемой группы не более 15% была определена рациональная концентрация лизоцима, которая составила 75±1 мкг/см3.

Таким образом, проведенные исследования позволили обосновать состав биологически активной добавки - это штаммы Bifidobacterium adolescentis BGV-11 (ВКПМ Ac-1742), Lactobacillus rhamnosus LC-52GV (ВКПМ B-9475), Lactobacillus fermentum LFM-2 (ВКПМ B-10368), Lactobacillus plantarum ГВИ-1 (ВКПМ-8556), Lactobacillus acidophilus ACT-41 (ВКПМ B-9644) или Lactobacillus acidophilus 887, молочнокислый термофильный стрептококк Str.thermophilus CT-95, и лизоцим с концентрацией 75±1 мкг/ см3.

В четвертой главе «Изучение взаимодействия пробиотических культур с лактоферрином» исследовали влияние лактоферрина на жизнедеятельность молочнокислых пробиотических культур и бифидобактерий.

Коровий лактоферрин выделяли из сырого обезжиренного молока методом ионообменной хроматографии на катионообменнике «Macro Prep СМ-Support», а в качестве контроля использовали коммерческий препарат фирмы Sigma-Aldrich. На хроматограмме было получено два пика. Выделенные фракции подвергали исследованию на наличие лактопероксидазной активности. В белковой фракции 1 отмечалось наличие ярко-зеленой окраски по сравнению с реактивом ABTS, что является доказательством присутствия в образце белка лактопероксидазы, в белковой фракции 2 изменение окраски не происходило, что свидетельствовало об отсутствии лактопероксидазы в данной фракции. Проведено электрофоретическое исследование выделенных белковых фракций, полученная при этом электрофоре[рамма представлена на рисунке 4.

На рисунке 4 видна линия на уровне 80 кДа, что соответствует молекулярной массе лактоферрина (дорожка № 2). На уровне 78 кДа (дорожка № 1) видна линия, соответствующая молекулярному весу лактопероксидазы. Выход лактоферрина из 1 литра обезжиренного молока составил 74,44 мг.

Таким образом, на основании электрофоретического исследования полученных белковых фракций, был выделен лактоферрин, свободный от примесей. Выделенный лактоферрин расфасовывали в пенициллиновые флакончики по 2 мл и лиофильно высушивали для хранения с целью применения в дальнейших исследованиях.

1 2 3 Кда

jms iis>+s

...... 4t.O

«да-

Лув

2 U

«жттт-

4

Рисунок 4 - SDS-электрофорез в ПААГ выделенных белковых фракций: I -белковая фракция 1; 2 -белковая фракция 2; 3 - маркерные белки Из научно-технической литературы известно, что лактоферрин может иметь различную степень насыщенности железом. Действие лактоферрина на пробиотические культуры определяется его насыщенностью железом и концентрацией, а также специфическими особенностями клеток штамма. Однако имеется мало сведений о том, лактоферрин с какой степенью насыщенности железом может ингибировать развитие пробиотических микроорганизмов. В.этой связи проведены исследования по получению разных форм лактоферрина и их влиянию на изучаемые штаммы пробиотических культур. В результате исследований показано, что разные формы лактоферрина не оказывали отрицательного воздействия на развитие изученных штаммов пробиотических культур. Антагонистическая активность по отношению к тест-культурам E.coli 0147 и Staph.aureus 209-Р (Таблица 3 и 4) в модельных системах с лактоферрином имела тенденцию повышения по сравнению с контролем. Это позволяет нам сделать заключение о возможности совместного применения изученных штаммов пробиотических бактерий с лактоферрином.

Таблица 3 - Антагонистическая активность штаммов пробиотических культур в модели с

лактоферрином (апо-форма) по отношению к E.coii Q147

№ Наименование штамма Концентрация лактоферрина, мкг/ см1

Контроль (0) | 200,0 | 500,0 | 1000,0

Диаметр зоны ингибирования, мм

1 L.acidophilus АСТ-41 П,3±0,6 11,5±0,5 11,5±0,5 11,5±0,5

2 L.acidophilus АЕ-5 8,0±0,5 8,0±0,5 8,5±0,5 8,5±0,5

3 L.acidophilus 887 12,3±0,6 12,5±0,5 12,0±0,5 11,5±0,5

4 L.plantarum ГВН-1 11,7±0,6 12,8±0,6 12,8±0,6 12,8±0,6

5 L.fermenum LFM-2 10,3±0,6 11,0±0,5 11,0±0,5 10,5±0,5

6 L.rhamnosus LC-52GV 11,6±0,6 11,7±0,6 11,8±0,6 11,9±0,6

7 B.adolescentis BGV-11 12,6±0,6 12,6±0,6 12,6±0,6 11,8±0,6

Таблица 4 - Антагонистическая активность штаммов пробиотических культур в модели с _лактоферрином (апо-форма) по отношению к Staph.aureus 209-Р _

№ Наименование штамма Концентрация лактоферрина, mkt/cm3

Контроль (0) | 200,0 ! 500,0 | 1000,0

Диаметр зоны ингибировання, мм

1 L .acidophilus АСТ-41 12,3-4=0,6 11,8±0,6 11,8±0,6 11,8±0,6

2 L.acidophilus АЕ-5 9,5±0,5 9,5±0,5 9,0±0,5 8,0±0,5

3 L.acidopliilus 887 12,5±0,5 12,5±0,5 12,0±0,5 11,5±0,5

4 L.plantarum ГВИ-1 12,3±0,6 12,6±0,6 12,9±0,6 12,8±0,6

5 L.fermenurn LFM-2 9,0±0,5 9,0±0,5 9,0±0,5 10,0±0,5

6 L.rhamnosus LC-52GV 11,8±0,6 12,5±0,5 13,0±0,5 12,8±0,6

7 В.adolescentis BGV-11 13,0±0,5 13,3±0,6 14,0±0,5 13,3±0,6

При обосновании рациональных концентраций лактоферрина экспериментальные данные обрабатывали аналогичным способом, что и с лизоцимом. Для установленных коэффициентов модели

стимулирования/ингибирования микроорганизмов лактоферрином и предельно допустимого уровня снижения активности штаммов ингибируемой группы не более 5% была определена рациональная концентрация лактоферрина, которая составила 500±20 мкг/см'.

Таким образом, в ходе проведенных исследований экспериментально обоснован состав БАД, которая включает пробиотические штаммы Bifidobacterium adolescentis BGV-11 (ВКПМ Ac-1742), Lactobacillus rhamnosus LC-52GV (ВКПМ B-9475), Lactobacillus fennentum LFM-2, Lactobacillus plantarum ГВИ-1(ВКПМ-8556), Lactobacillus acidophilus ACT-41 (ВКПМ B-9644) или Lactobacillus acidophilus 887, молочнокислый термофильный стрептококк Str.thermophilus CT-95, и лактоферрин с концентрацией 500 mkt/cmj.

Антагонистическая активность разработанной БАД по отношению к E.coli 0147 и Staph.aureus 209-Р приведена на рисунке 5.

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Диаметр зоны ингибировання, мм

ИвСарИ.аигеиз ОЕ.соП

Рисунок 5-Антагонистическая активность комплекса пробиотических штаммов и лактоферрина с концентрацией 500 мкг/см3 по отношению к Е.соИ 0147 и 51арЬ.аигеи5 209-Р

В пятой главе «Разработка технологической схемы БАД и характеристика свойств» представлены разработанные рецептуры, характеристика показателей и технологическая схема получения БАД.

В таблице 5 представлены разработанные рецептуры БАД различного состава.

Таблица 5 - Рецептуры БАД различного состава (на 1000 г)

Компонент БифиЛакто-ЛЦ БифиЛакто-ЛФ БифиЛакто-ЛФ-ЛЦ

Bifidobacterium adolescentis BGV-11 (ВКПМ Ас-1742) 350,0 175,0 175,0

Lactobacillus fermentum LFM-2 100,0 50,0 50,0

Lactobacillus rhamnosus LC-52GV (ВКПМ B-9475) 100,0 50,0 50,0

Lactobacillus plantaram ГВИ-КВКПМ-8556) 100,0 50,0 50,0

Lactobacillus acidophilus ACT-41 (ВКПМ B-9644) или Lactobacillus acidophilus 887 100,0 50,0 50,0

Str.thermophilus CT-95 100,0 50,0 50,0

Лизопим 150,0 - 75,0

Лактоферрин - 575,0 500,0

Итого, г 1000,0 1000,0 1000,0

Расход, г на 1 тонну 500,0 870,0 1000,0

Разработанные БАД представляют собой однородную порошкообразную массу молочно-кремового цвета, равномерного по всей массе порошка, с массовой долей влага 4,06±0,04%,. Микробиологические показатели БАД представлены в таблицах 6 и 7.

Содержание токсичных элементов в БАД не превышало допустимых уровней, установленных в СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» (пункт 1.2.9).

Таблица 6 - Микробиологические показатели БАД

Наименование показателя Значение показателя Показатели, нормируемые по СанПиН 2.3.2.1078-01

Количество жизнеспособных клеток бифидобактерий в 1,0 г на конец срока годности, КОЕ (9,5±0,5)*109 Не менее 107

Количество жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий, в 1,0 г на конец срока годности, КОЕ, (4,6±0,7)*10к' Не менее 10®

Содержание дрожжей и плесневых грибов в 1,0 г, КОН Не обнаружены Не более 5

Бактерии группы кишечных палочек в 1,0 г Не обнаружены Не допускаются

S. aureus в 1,0 г Не обнаружены Не допускаются

Патогенные микроорганизмы,' в т.ч. сальмонеллы, в 10,0 г Не обнаружены Не допускаются

Микроскопический препарат Грамположительные палочки различной длины, расположенные отдельно и в коротких цепочках, а также разветвленные, раздвоенные, булавовидные, лопатовидные и грамположительные кокки, расположенные отдельно, попарно и в цепочках. Клетки неподвижны, спор и капсул не образуют.

Морфология колоний на среде контроля Выпуклые, непрозрачные, белые, а также ракетоподобные колонии и в виде усеченной пирамиды белого или серого цвета. Мелкие колонии округлой формы на поверхности среды, и глубинные колонии чечевицеобразной формы.

Биотестирование БАД проводили на инфузориях Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis. с использованием пробора БиоЛаТ, который автоматически подсчитывает клетки инфузорий. Выявлено, что БАД не оказывают отрицательного воздействия на инфузории, и, следовательно, нетоксичны.

По результатам проведенных исследований было предложено технологию осуществлять в 2 этапа: получение отдельных компонентов и их смешивание. Технологическая схема производства БАД «БифиЛакто-ЛФ-ЛЦ» представлена на рисунке 6. В зависимости от состава БАД включает те или иные операции.

I ЭТАП. Получение отдельных компонентов БАД

II ЭТАП. Смешивание полученных отдельных компонентов БАД в определенных соотношениях (пробиотическне культуры + лактоферрин + лизоцим)

Рисунок 6 - Схема производства БАД

Для обоснования сроков годности БАД изучали: органолептические, физико-химические, микробиологические показатели, антагонистическую активность по отношению к условно-патогенным микроорганизмам, активность лизоцима и железосвязывающую способность лактоферрина. Температура хранения БАД составляла 4±2°С и минус 18±2°С.

В таблицах 8 и 9 представлены результаты изменения количества клеток и массовой доли влаги в процессе хранения при температурах минус 18±2°С и

4±2"С.

Таблица 8 - Изменение количества клеток и массовой доли влага в процессе хранения _БАД при температуре минус 18±2°С_

Месяц Количество клеток, 12 КОЕ/см3 Массовая доля влаги, %

Бифидобактерии Молочнокислые палочки Термофильный молочнокислый стрептококк

фон 10,22 ±0,04 10,84 =ь 0,02 10,78 ±0,04 4,15±0,05

1 10,19 ±0,03 10,82 ±0,06 10,77 ±0,04 4,15±0,05

2 10,14 ±0,04 10,78 ± 0,03 10,74 ±0,04 4,15±0,06

3 10,11 ±0,04 10,74 ±0,04 10,73 ± 0,03 4,15±0,05

4 10,06 ±0,03 10,72 ± 0,04 10,70 ±0,05 4,20±0,05

5 10,03 ±0,06 10,69 ±0,03 10,67 ±0,04 4,20±0,06

6 9,98 ± 0,03 10,65 ± 0,04 10,66 ± 0,06 4,20±0,05

7 9,93 ± 0,04 10,63 ±0,03 10,65 ±0,04 4,20±0,05

8 9,90 ± 0,04 10,60 ±0,03 10,62 ±0,04 4,20±0,06

9 9,88 ± 0,04 10,58 ±0,04 10,60 ±0,04 4,20±0,05

Таблица 9 - Изменение количества клеток и массовой доли влаги в процессе хранения БАД при

температуре 4±2°С

Месяц Количество клеток, % КОЕ/см3 . Массовая доля влаги,%

Бифидобактерии Молочнокислые палочки Термофильный молочнокислый стрептококк

фон 10,22 ±0,04 10,84 ±0,02 10,78 ±0,04 4,15±0,05

1 9,84 ± 0,03 10,56 ±0,04 10,55 ±0,03 4,15±0,05

2 9,43 ± 0,04 10,23 ±0,03 10,26 ±0,04 4,15±0,05

3 9,05 ± 0,04 9,99 ± 0,04 10,05 ±0,04 4,15±0,04

4 8,68 ± 0,06 9,62 ±0,04 9,79 ±0,04 4,20±0,05

5 8,27 ± 0,04 9,35 ± 0,03 9,53 ± 0,03 4,20±0,05

6 7,88 ± 0,04 9,04 ±0,05 9,28 ± 0,06 4,20±0,05

7 7,49 ± 0,04 8,74 ± 0,06 9,03 ± 0,05 4,20±0,04

Результаты изучения одного из важнейших показателей БАД антагонистической активности после 6 месяцев хранения представлены на рисунках 7 и 8.

□ Контроль 0Е.со11

Рисунок 7 - Антагонистическая активность БАД после 6 месяцев хранения при температуре минус 18±2"С по отношению к тест-культуре Е.соИ 0157: 1 -«БифиЛакто»; 2 - «БифиЛакто-ЛЦ»; 3 —«БифиЛакто-ЛФ»; 4 - «БифиЛакто-ЛФ-ЛЦ»

17 т

□ Контроль (начало хранения) 0 Staph.aureus

Рисунок 8 - Антагонистическая активность БАД после 6 месяцев хранения при темпепрутуре минус 18±2"С по отношению к тест-культуре Staph.aureus 209-Р: 1 -«БифиЛакто»; 2 -«БифиЛакто-ЛЦ»; 3 -«БифиЛакто-ЛФ»; 4 - «БифиЛакто-ЛФ-ЛЦ» Анализ результатов комплекса изученных показателей БАД позволили обосновать срок её годности, который составляет при температуре 4±2°С - не более 3 месяцев, а при минус 18±2° - 6 месяцев.

В шестой главе «Разработка путей применения БАД для обогащения молочной продукции» были проведены исследования по применению БАД в технологии ферментированных молочных продуктов на примере получения ряженки обогащенной и напитка из сыворотки низколактозного.

Для определения этапа применения БАД в технологии ряженки обогащенной, её добавляли: на этапе внесения закваски, через 2 часа после ферментации, через 3 часа после ферментации, после окончания ферментации. Результаты определения титруемой кислотности и органолептических показателей в готовом продукте представлены в таблице 10.

Таблица 10 - Показатели качества ряженки с Б АД

№ Образец Титруемая кислотность, Т Консистенция Органолептические показатели

1 Контроль 58±2°Т Однородная, в меру вязкая Вкус и запах чистые, кисломолочные

2 Внесение БАД одновременно с закваской 68±3°Т Однородная, вязкая Вкус и запах чистые, кисломолочные, вкус кислый

3 Внесение БАД через 2 часа после заквашивания 66±2°Т Однородная, вязкая Вкус и запах чистые, кисломолочные, вкус с легкой кислинкой

4 Внесение БАД через 3 часа после заквашивания 63±2°Т Расслаивающаяся, с отделением сыворотки Вкус и запах чистые, кисломолочные, вкус слегка кислый

5 Внесение БАД по окончании сквашивания 60±1°Т Однородная, в меру вязкая Вкус и запах чистые, кисломолочные

Полученные данные свидетельствуют о том, что характер сгустка у образцов 2,3,5 практически не изменялся по сравнению с контрольным образцом. У образца 4 наблюдали отделение сыворотки. Вкус и запах продукта изменялся в зависимости от этапа внесения БАД: чем раньте её вносили, тем более кислым вкусом характеризовался продукт. Это обусловлено присутствием в БАД штаммов ацидофильных бактерий, которые являются более сильными кислотообразователями по сравнению с болгарской палочкой, которая может применяться в составе закваски для ряженки в определенном соотношении с Str. thermophilus. Следует отметить, что титруемая кислотность сгустков не превышала допустимых значений, указанных в ГОСТ Р 52094 -2003 «Ряженка». Внесение БАД в процессе ферментации приводило к получению продукта с менее однородной консистенцией. Таким образом, в зависимости от способа получения ряженки, БАД следует вносить: при применении термостатного способа производства - на этапе внесения закваски, а при резервуарном - после образования сгустка в процессе его охлаждения и перемешивания. Во всех образцах количество молочнокислых бактерий и бифидобактерий отвечало требованиям ФЗ №88 «Технический регламент па молоко и молочную продукцию» и дополнениям ФЗ №163.

Результаты изучения основных показателей качества образцов ряженки с БАД в процессе хранения при температуре 4±2°С приведены в таблице 11 (для контрольного образца), для опытных - в таблице 12, а органолептических показателей на рис.10.

Таблица 11 - Показатели качества ряженки с типовой закваской

№ п/п Контролируемый показатель Срок хранения

0 суток 5 суток 10 суток 15 суток 20 суток

1 Активная кислотность, ед. рН 4,75±0,02 4,96*0,02 4,84*0,01 4,80*0,01 4,80*0,01

2 Титруемая кислотность, °Т 60*2 65±2 71*2 74±1 76±1

3 Количество термофильного молочнокислого стрептококка, КОЕ/см3 8,45*0,11 8,36*0,12 8,30*0,10 8,20*0,11 8,14*0,11

4 Дрожжи, плесени, КОЕ в 1г 0 0 0 0 0

5 БГКП, в 1 г не обнаружено

Таблица 12 - Показатели качества ряженки с БАД «БнфиЛакто-ЛФ-ЛЦ»

№ п/п Контролируемый показатель Срок хранения

0 суток 5 суток 10 суток 15 суток 20 суток

1 Активная кислотность, ед. рН 4,72*0,02 4,60*0,02 4,50*0,01 4,50*0,01 4,50*0,01

2 Титруемая кислотность, °Т 60±2 68*2 75*2 80*1 83±1

3 Количество молочнокислых палочек, 1а КОЕ/см3 8,34*0,11 8,33*0,12 8,31*0,11 8,31*0,11 7,65*0,12

4 Количество термофильного молочнокислого стрептококка, ^ КОЕ/см3 8,90*0,11 8,90*0,11 8,70*0,12 8,68*0,11 8,67*0,12

5 Количество бифидобактерий, \% КОЕ/см3 7,50*0,12 7,43±0,П 7,25*0,12 7,21*0,11 6,85*0,10

б Дрожжи, плесени, КОЕ в 1г 0 0 0 0 0

7 БГКП, в 1 г не обнаружено

Вкус п аромат

«юифша» > |

Рисунок 10 - Органолептические показатели ряженки через 20 суток хранения К-ряженка с традиционной закваской (контрольный образец); 1- ряженка с БАД Показано, что органолептические показатели ряженки с традиционной закваской и ряженки с БАД практически не отличались. В то же время применение БАД в биотехнологии ряженки позволяет получать продукт, обогащенный пробиотическими бактериями, лизоцимом и лактоферрином, которые обусловливают профилактические свойства. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что ряженка с БАД и ряженка с традиционной закваской (контроль) по органолептическим, физико-химическим и микробиологическим показателям отвечали требованиям ФЗ № 88 и ГОСТ Р 52094 -2003 «Ряженка» на протяжении 20 суток хранения.

При внесении БАД БифиЛакто-ЛФ-ЛЦ в сывороточный напиток низколактозный органолептические, физико-химические и микробиологические показатели отвечали требованиям ФЗ № 88 и ТУ на напиток сывороточный низколактозный на протяжении 8 суток хранения (Таблица 13).

Таблица 13 - Показатели качества напитка низколактозного из молочной сыворотки «Яблочный» обогащенного БАД «БифиЛакто-ЛФ-ЛЦ»_

№ п/п Контролируемый показатель Срок хранения

0 суток 5 суток 8 суток

1 Активная кислотность, ед. рН 4,70±0,10 4,60±0,10 4,50±0,10

2 Титруемая кислотность, °Т 60±1 68±2 79±2

3 Количество молочнокислых палочек, ^ КОЕ/см3 8,34±0,13 8,33±0,12 8,31 ±0,11

4 Количество термофильного молочнокислого стрептококка, КОЕ/см"1 8,80±0,13 8,80±0,12 8,70±0,12

5 Количество бифидобактерий, ^ KOE/cмJ 7,40±0Д 1 7,33±0,П 7,25±0,11

6 Дрожжи, плесени, КОЕ/г 0 0 0

7 БГКП, в 1 г не обнаружено

Разработанная технология ферментированного напитка из сыворотки низколактозного с БАД проверена в промышленных условиях на ОАО «Тульский молочный комбинат», что подтверждено актом. Результаты показали возможность реализации предложенной биотехнологии напитка сывороточного низколактозного в промышленности. Применение БАД приводило к снижению лактозы на 43% (рисунок 12), обогащению пробиотическими бактериями и биологически активными белками. Это позволяет рекомендовать напиток для питания людей не только с пониженной активностью фермента лактазы, но и в качестве профилактики возникновения желудочно-кишечных заболеваний.

□ Количество несброженной лактозы

И Напиток из сыворотки с типовой закваской

лактозы в напитках из молочной сыворотки

□ Количество несброженной лактозы

□ Напиток из сыворотки с БАД

Рисунок 12 - Снижение содержания

Схема производства напитка сывороточного низколактозного приведена на рисунке 13.

Таким образом, разработанную БАД можно применять как при создании новых низколактозных молочных продуктов, так и для получения обогащенных кисломолочных продуктов профилактической направленности.

ВЫВОДЫ

1. Теоретически и экспериментально обоснован состав новых биологически активных добавок на основе штаммов пробиотических культур, молочнокислого термофильного стрептококка и природных биологически активных белков: лизоцима и лактоферрина.

2. Показано, что действие лизоцима на пробиотические культуры является штаммозависимым. Определена рациональная концентрация лизоцима, вносимая в биомассу пробиотических бактерий, которая составила 75,0±1,0 г на 1000,0 г БАД.

©

-И40-- закваска, внесение БАД

-М74-- сыворотка творожная, подсырная несепарированная -И75- - сыворотка творожная, подсырная нежирная -И76-- напиток из сыворотки

-мво-- внесение компонентов (плодово-ягодный сироп)

0- температура 0- кислотность 0- фосфатаза 0- время 0-КМАФАнМ БГКП

А - группа чистоты

органолептические показатели 0- массовая доля сахарозы

микроскопический препарат са-масса

0- упаковка.«маркировка 0- другие группы микроорганизмов

Рисунок 13 - Технологическая схема производства напитка низколактозного из молочной сыворотки с применением БАД

3. Доказано, что применение нового штамма термофильного молочнокислого стрептококка с высокой р-галактозидазной активностью совместно с бифидобактериями и другими изученными штаммами молочнокислых пробиотических бактерий увеличивает активность их развития в молочных продуктах и способствует снижению массовой доли лактозы на 43%.

4. Выявлено, что действие лактоферрина на пробиотические культуры определялось его концентрацией, а также специфическими особенностями клеток штамма. Определена рациональная концентрация лактоферрина. вносимого в биомассу пробиотических бактерий, которая составила 500,0±20,0 г на 1000,0 г БАД.

5. Выявлен синергетический эффект при совместном использовании изученных штаммов пробиотических культур, установленных концентраций лизоцима и лактоферрина в отношении ингибирования роста условно-патогенных микроорганизмов E.coli 0147 и Staph.aureus 209-Р.

6. Разработаны рецептуры, технологическая схема на биологически активные добавки. Выявлены закономерности изменения показателей качества и безопасности в условиях хранения и обоснован срок годности БАД, который составляет при температуре хранения 4±2°С - не более 3 месяцев, а при минус 18±2° - 6 месяцев.

7. Разработаны рекомендации по применению БАД для получения обогащенной ряженки профилактического назначения. В промышленных условиях показана возможность реализации разработанной биотехнологии напитка низколактозного из сыворотки, обогащенного пробиотическими бактериями и биологически активными белками.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Ким И.В. Аспекты повышения биобезопасности животного сырья / И.В. Ким, Т.Н. Рогожина. - Материалы VII международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» - М.: МГУПБ, 2008 - С.4-5.

2. Ким, И.В. Определение пробиотического потенциала некоторых представителей рода Lactobacillus / И. В. Ким, Джинтендра Упадхяя, Т.Н. Рогожина // Материалы международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания». - М.: МГУПБ, 2009. -С.192.

3. Ганина, В.И. Разработка технологии кисломолочного низкокалорийного напитка / В.И. Ганина, д.т.н., Т.Н. Рогожина, Е.Н. Терешина // Переработка молока. - №5. - 2009. - С.34-35.

4. Рогожина, Т.Н. Новые аспекты применения биологически активных белков молока в продуктах питания / Т.Н. Рогожина, В.И. Ганина, д.т.н., проф.,

B.B. Орлова // Сборник материалов международной научно-практической конференции «Инновационные технологии и оборудование в молочной промышленности». - Воронеж. -2010. - С. 171 -172.

5. Рогожина Т.Н. Создание модуля пробиотических культур с лизоцимом для функциональных продуктов питания / Т.Н. Рогожина, В.И. Ганина // 11 Международная конференция Российского Химического общества имени Д.И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов». - М. - 2010. - С. 340-341.

6. Орлова В.В. Перспективные пути повышения биологической ценности и пищевой безопасности продуктов питания / В.В. Орлова, Т.Н. Рогожина // Материалы VIII международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - М.: МГУПБ. -2010. -С.73-75.

7. Ганина В.И. Разработка комплекса пробиотических культур с минорными белками молока для функциональных продуктов питания / Ганина В.И., Комолова Г.С., Рогожина Т.Н., Орлова В.В. // VIÍ Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». -М. -2011. - С. 170-171.

8. Рогожина Т.Н. Изучение влияния лизоцима на пробиотические микроорганизмы / Рогожина Т.Н., Орлова В.В., Ганина В.И. // Материалы международной научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии». - Часть 2. - Ставрополь. - 2011. - С.64-66

9. Рогожина Т.Н. Инновационные пути повышения функциональных свойств продуктов питания / Рогожина Т.Н., Ганина В.И. // Материалы IX международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - М.: МГУПБ. - 2011. - С.30-31.

10. Рогожина Т.Н. Пробиотические культуры и биологически активные белки молока - новый функциональный комплексный компонент/ Т.Н. Рогожина, В.И. Ганина, Г.С. Комолова // Молочная промышленность - 2012. - №5 - С.30-31.

11. Рогожина Т.Н. Полифункциональная биологически активная добавка для молочной продукции / Т.Н. Рогожина, В.И. Ганина, Г.С. Комолова, Е.А. Гущина // Техника и технология пищевых производств. - 2012. - №2. - С. 135-138.

12. Ганина В.И. Биотехнологические процессы в производстве молока и молочных продуктов/ Ганина В.И., Рогожина Т.Н. // МУ к лабораторным работам для студентов, обучающихся по направлению 260200.68 - Продукты питания животного происхождения, магистерская программа «Биотехнология молока и молочных продуктов». - М.:МГУПП, 2013.

13. Ганина В.И. Экспертиза качества биоряженки для профилактического питания/ В.И. Ганина, Т.Н. Рогожина, Л.А. Борисова, Е.А. Гущина // Технология и товароведение инновационных пищевых продуктов. - 2012 - №6. - С.43-48.

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" Подписано к печати 03.10.2013г. Формат 60x84/16. Бумага "Офсетная №1" 80г/м:. Печать трафаретная. Усл.печ.л. 1,625. Тираж 100. Заказ 636.

WWW.FRANTERA.COM

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

04201363157 На правах рукописи

РОГОЖИНА Татьяна Николаевна

РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ НА ОСНОВЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР, ЛИЗОЦИМА И ЛАКТОФЕРРИНА ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических

активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель -ГАНИНА Вера Ивановна доктор технических наук, профессор

МОСКВА 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................5

1 .СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ СОСТОЯНИЯ ПРОБЛЕМЫ.........................................10

1.1. Анализ рынка функциональных продуктов питания......................................10

1.2. Биологически активные белки молока.............................................................11

1.2.1. Краткая характеристика биологически активных белков молока..........11

1.2.2. Факторы, влияющие на биологически активные белки при производстве молочных продуктов.....................................................................23

1.3. Пробиотические микроорганизмы...................................................................25

1.3.1. Микроорганизмы, используемые в продуктах питания..........................25

1.3.2. Продукты жизнедеятельности пробиотических микроорганизмов.......28

1.4. Перспективные пути получения молочных продуктов, обогащенных функциональными компонентами...........................................................................31

1.4.1. Применение микрокапсулированной формы пробиотических микроорганизмов...................................................................................................31

1.4.2. Совместное применение компонентов, обладающих функциональными свойствами, в технологии молочной продукции...............................................33

2.1. Объекты исследования.......................................................................................36

2.2. Методы исследования........................................................................................36

2.2.1. Препаративные методы...............................................................................36

2.2.2 Аналитические методы................................................................................40

2.2.3. Микробиологические методы исследования............................................45

2.2.4. Биохимические методы...............................................................................46

2.2.5. Определение органолептических показателей.........................................46

2.2.6. Приготовление питательных сред и реактивов для проведения исследований..........................................................................................................47

2.2.7. Математическая обработка экспериментальных данных.......................48

3. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР С ЛИЗОЦИМОМ...............................................................................................................49

3.1. Контроль технологических свойств штаммов.................................................49

3.2 Исследование пробиотических свойств нового штамма L.acidophilus 887... 50

3.3 Изучение влияния лизоцима на пробиотические культуры..........................52

3.3.1 Определение оптической плотности питательной среды при развитии пробиотических культур.......................................................................................52

3.3.2 Определение влияния лизоцима на развитие штаммов пробиотических культур на среде MRS...........................................................................................54

3.3.3 Определение влияния лизоцима на развитие штаммов пробиотических молочнокислых палочек на среде - обезжиренное молоко..............................57

3.3.4 Исследование антагонистической активности пробиотических культур в модельных композициях с лизоцимом по отношению к тест-микроорганизмам E.coli 0147 и Staph.aureus 209-Р...........................................60

3.4 Изучение сочетаемости штаммов молочнокислого термофильного стрептококка, обладающего высокой ß-галактозидазной активностью с бифидобактериями....................................................................................................63

4. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР С ЛАКТОФЕРРИНОМ.....................................................................................................69

4.1. Выделение лактоферрина..................................................................................69

4.2. Изучение влияния лактоферрина на пробиотические бактерии...................71

4.3 Исследование антагонистической активности пробиотических

культур в отношении тест-микроорагнизмов Е. Coli 0147 и Staph.aureus 209-Р в модельных системах с лактоферрином...................................................................83

5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ БАД И ХАРАКТЕРИСТИКА ИХ СВОЙСТВ................................................................................................................91

6. РАЗРАБОТКА ПУТЕЙ ПРИМЕНЕНИЯ БАД ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ........................................................................................97

6.1 Применение БАД «БифиЛакто-ЛФ-ЛЦ» для обогащения ряженки..............97

6.2 Применение Б АД «БифиЛакто-ЛФ-ЛЦ» для обогащения напитка сывороточного низколактозного............................................................................100

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК........................................................................108

ПРИЛОЖЕНИЯ.................................................................................123

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы.

В Распоряжении Правительства РФ №1873-р от 25.10.2010г. «Основы государственной политики в области здорового питания населения на период до 2020 года» поставлена задача развивать «производство пищевых продуктов, обогащенных незаменимыми компонентами, продуктов функционального назначения, диетических (лечебных и профилактических) пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище». Это обусловлено тем, что в настоящий период, более чем у трети населения, обнаруживается снижение иммунологической резистентности организма; наблюдаются случаи острых инфекционных заболеваний, в т.ч. заболеваний желудочно-кишечного тракта; отмечается появление синдрома хронической усталости и снижается работоспособность и др. Одним из путей оздоровления населения и поддержания его в активной форме является потребление продуктов питания профилактической направленности.

Теоретические и практические основы названных выше направлений представлены в научных трудах отечественных и зарубежных ученых: С.И. Артюховой, Н.Б. Гавриловой, В.И. Ганиной, М.В. Гернет, Л.В. Голубевой, Г.А. Донской, И.А. Евдокимова, А.И. Жаринова, Л.А. Забодаловой, З.С. Зобковой,

И.И.Ионовой, Г.С. Комоловой, A.A. Кочетковой, Л.А. Оганесянц, O.E.

Овчинниковой,) И.А. Рогова, С.А. Рябцевой, В.Ф. Семенихиной, H.A. Тихомировой, И.В. Толокновой, В.Д. Харитонова, А.Г. Храмцова, В.П. Шидловской, Т.М. Эрвольдер, S.A. Gonzälez-Chäveza, В. Lönnerdal, W.-S. Kim, К.-I. Shimazaki и других.

Расширение линейки новых продуктов с направленными функциональными свойствами, а также повышение эффективности действия существующих продуктов относится к одной из актуальных проблем современной пищевой биотехнологии. Однако современные технологические приемы, используемые при производстве молочных продуктов, приводят к инактивации или значительному

снижению исходного содержания биологически активных веществ в молочном сырье. В этой связи рациональное использование сырьевых ресурсов, более глубокая и полная их переработка, а также поиск новых подходов сохранения биологически активных веществ в готовой продукции являются приоритетными направлениями в науке и технологии.

Полагаем, что одним из направлений решения данной проблемы может быть применение в питании биологически активных компонентов, которые мягко воздействуют на организм и повышают его сопротивляемость к негативным факторам. К таким соединениям относят биологически активные белки молока, которые обладают целым рядом уникальных функций: противоинфекционной, иммуномодуляторной, противовоспалительной, антиоксидантной, регенеративной и другими. Пробиотические бактерии — естественные обитатели кишечника человека, - не только способствуют нормализации микрофлоры кишечника, но также обладают рядом других функций, влияющих на обмен веществ, укрепление иммунитета, улучшение общего самочувствия и другими.

В этой связи актуальными представляются исследования в области более широкого использования пробиотических культур и биологически активных белков молока для получения продуктов профилактической направленности.

Цель настоящей работы - разработать биологически активную добавку, состоящую из природных GRAS - компонентов, на основе изучения взаимодействия пробиотических культур, лизоцима и лактоферрина для обогащения молочной продукции.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Теоретически и экспериментально обосновать состав биологически активной добавки.

2. Изучить действие разных доз лизоцима и лактоферрина на штаммы пробиотических бактерий.

3. Определить антагонистическую активность штаммов пробиотических бактерий различных таксонов совместно с модельной композицией лизоцима, лактоферрина в отношении патогенных и условно-патогенных тест-культур.

4. Разработать рецептуры и схему биотехнологии биологически активной добавки.

5. Обосновать сроки годности Б АД на основании изучения показателей качества и безопасности.

6. Показать пути её применения в технологии ферментированных молочных продуктов и провести промышленную апробацию.

Научная новизна

• Теоретически и экспериментально обоснован состав биологически активной добавки на основе пробиотических культур (Bifidobacterium adolescentis BGV-11 (ВКПМ Ac-1742), L.fermentum LFM-2 (ВКПМ B-10368), Lactobacillus rhamnosus LC-52GV (ВКПМ B-9475), Lactobacillus plantarum ГВИ-1 (ВКПМ-8556), Lactobacillus acidophilus ACT-41 (ВКПМ B-9644) или Lactobacillus acidophilus 887, Str.thermophilus CT-95 (ВКПМ B-7646)) и биологически активных веществ молока - лизоцима и лактоферрина.

• Получены математические зависимости, адекватно описывающие интегральное поведение групп пробиотических штаммов как при их стимулировании, так и при ингибировании лизоцимом и лактоферрином. Определены рациональные концентрации лизоцима и лактоферрина для введения в состав биологически активных добавок, которые составляют 75,0±1,0 г на 1000,0 г БАД и 500,0±20,0 г на 1000,0 г БАД соответственно.

• Выявлен синергетический эффект при совместном действии изученных штаммов пробиотических культур и установленных концентраций лизоцима и лактоферрина в отношении ингибирования роста условно-патогенных микроорганизмов E.coli 0147 и Staph.aureus 209-Р.

• Выявлены зависимости изменения показателей качества и безопасности в условиях хранения и обоснован срок годности БАД.

• Обоснованы методологические подходы использования разработанной БАД в технологии ферментированных молочных продуктов профилактической направленности.

Практическая значимость.

• Разработаны рецептуры и технологическая схема получения БАД различного состава.

• Разработан проект технических условий ТУ 9222-00.. .-58693373-2011 и ТИ на напиток низколактозный из сыворотки с применением штамма термофильного молочнокислого стрептококка с высокой р-галактозидазной активностью.

• В условиях ОАО «Тульский молочный комбинат» проведена производственная проверка применения БАД при выработке низколактозного напитка из сыворотки, что подтверждено положительным актом.

• Результаты исследований внедрены в учебный процесс: использованы в дисциплине «Биотехнологические процессы в производстве молока и молочных продуктов» - разработаны и опубликованы Методические указания к выполнению лабораторных работ для студентов направления 260200.68 Продукты питания животного происхождения.

Работа выполнялась в рамках Гранта Президента Российской Федерации по государственной поддержке ведущих научных школ Российской Федерации НШ-3245.01.4 «Разработка новых пищевых технологий с участием живых систем на основе нетрадиционных подходов к управлению их жизнедеятельности и обеспечению качественных показателей готовой продукции».

Апробация.

Результаты исследований обсуждены и получили одобрение на Международных научных конференциях: VII международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2008), Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (Москва, 2009), Международной научно-практической

конференции «Инновационные технологии и оборудование в молочной промышленности» (Воронеж, 2010), II Международной конференции Российского Химического общества имени Д.И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов» (Москва, 2010), VIII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2010), VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), Международной научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2011), IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2011).

Результаты исследований были доложены на II Международной конференции Российского Химического общества имени Д.И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов», 2010, получен диплом II степени (Приложение 1); IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», 2011, получена грамота (Приложение 2).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах по перечню ВАК, 1 методическое указание для студентов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, объектов и методов исследования, экспериментальной части, содержащей 4 главы, выводов, библиографического списка, приложений. Основной текст работы изложен на 122 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу и 38 рисунков. Библиография представлена 136 источниками, в том числе 70 зарубежных авторов, количество приложений - 9.

1.СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ СОСТОЯНИЯ ПРОБЛЕМЫ

1.1. Анализ рынка функциональных продуктов питания Функциональные продукты питания и напитки в настоящее время являются одним из самых быстрорастущих сегментов пищевой промышленности на мировом рынке. Так, согласно отчетам «Центра инвестиционно-промышленного анализа и прогноза», до 2015 года ожидается ежегодный устойчивый рост спроса на продукты здорового питания в США, Японии, Великобритании, Франции, Германии, Италии и Испании - от 4 до 6%. При этом, прирост объемов потребления продуктового рынка в развитых странах не будет превышать 1%.

В связи с тем, что средний возраст населения в развитых странах увеличивается, а проблема лишнего веса становится все более острой, ситуация в индустрии здоровых продуктов питания характеризуется стабильностью, несмотря на продолжающуюся неустойчивость в экономике. По всему миру потребители предъявляют все более высокие требования к питанию, отдавая предпочтение продуктам, улучшающим состояние желудочно-кишечного тракта, поддерживающим иммунную систему и здоровье сердечно-сосудистой системы, регулирующим вес.

В России наблюдается та же тенденция. В последнее десятилетие, ввиду роста числа хронических заболеваний и установления их причинной связи с несбалансированным питанием, к пищевым продуктам стали относиться как к эффективному средству для поддержания физического и психического здоровья, а также снижения риска возникновения многих заболеваний. Все большее число потребителей понимают, что приверженность к здоровым продуктам питания в конечном итоге способствует снижению риска заболеваний, поэтому россияне приобретают продукты и напитки со специальными свойствами.

Ожидается, что растущий спрос на здоровые продукты питания продолжится в России до 2014 года. Устойчивый рост объемов потребления показывают продукты, обогащенные пробиотиками, пребиотиками, растительными стеролами и пищевыми волокнами.

Повышающийся спрос на функциональные и обогащенные продукты питания способствует значительному росту потребности в физиологически функциональных ингредиентах, к которым относят: аминокислоты, пептиды, нуклеиновые кислоты, гликозиды, цитамины, органические кислоты, лектины, различные фитосоединения и другие [66]. По мере накопления научных данных спектр функциональных ингредиентов постоянно увеличивается.

Поскольку молоко - это продукт, предназначенный для вскармливания новорожденного организма, в молоке присутствуют функциональные ингредиенты, представляющие большой интерес для использования в качестве отдельных БАД.

1.2. Биологически активные белки молока

Молоко - это не только ценнейшее сырье при производстве продуктов питания, но и кладезь природных веществ, таких как витамины, ферменты, микро-и макронутриенты, иммуноглобулины и другие биологически активные вещества.

Следует отметить, что биологическая ценность молока определяется главным образом белками. При этом сывороточные белки хар�