автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии биойогурта, обогащенного лактоферрином

На правах рукописи

Мишина Анна Викторовна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БИОЙОГУРТА, ОБОГАЩЕННОГО ЛАКТОФЕРРИНОМ

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных, рыбных

продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

0034Э212Ь

Москва 2010

003492125

Работа выполнена в Государственном научном учреждении

Всероссийский научно-исследовательский институт молочной

промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии)

Научный руководитель:

доктор технических наук, заслуженный работник пищевой индустрии РФ Зобкова Зинаида Семеновна

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Семенихина Вера Филатовна

кандидат технических наук Шергина Ирина Александровна

Ведущая организация:

Северо-Кавказский государственный технический университет

у, 1АУ

Защита состоится «И.» марта 2010г. в /¿7 часов на заседании Диссертационного совета ДМ 006.021.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии (ГНУ ВНИМИ им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии) по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, 26.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять в адрес ученого секретаря объединенного Диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИМИ им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии.

Автореферат разослан и размещен

на сайте www.vniimp.ru « » февраля 20 Юг.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук, старший научный сотрудник

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Создание функционального питания, обеспечивающего поддержание и активизацию жизненно важных функций человека, повышение общей сопротивляемости организма агрессивным условиям окружающей среды является одной из важнейших задач современной молочной промышленности. Теоретические и практические положения получения функциональных молочных продуктов разработаны Покровским

A.A., Липатовым H.H. (ст.), Липатовым H.H. (мл.), Зобковой З.С., Роговым И.А., Волгаревым М.Н., Тутельяном В.А., Уголевым A.M., Харитоновым В.Д., Радаевой И.А., Спиричевым В.Б., Шатнюк Л.Н., Королевой Н.С., Семенихиной

B.Ф., Храмцовым А.Г. Тихомировой H.A., Богдановой Е.А. и др.

Развитие технологий функциональных молочных продуктов неразрывно связано с поиском новых видов сырья, различных функциональных ингредиентов и технологических добавок, композитных упаковочных и контактирующих с продукцией материалов, а также технологических решений по увеличению сроков годности продукции.

Учитывая значительный интерес к проблемам глубокого фракционирования компонентов молока, ряд биологически активных белков, таких как лактопероксидаза, лактоферрин, ангиогенин, лизоцим, стали в последнее время предметом научных изысканий. Эти белки являются компонентами антибактериального комплекса, благодаря которому в свежевыдоенном молоке в течение 20-24 ч не размножаются бактерии. Однако количество и активность защитных белков резко снижаются в процессе технологической обработки молока. Поэтому извлечение защитных веществ из молочного сырья с использованием щадящих режимов и обогащение ими молочных продуктов, позволило бы придать последним новые функциональные свойства и стойкость в хранении.

Попытки получения биологически активных защитных белков до настоящего времени сводились к комплексному извлечению этих белков в основном из вторичного молочного сырья. В этой связи известны работы Комоловой Г.С., Тихомировой H.A., Овчинниковой O.E., Ильиной A.M. и др.

Наибольшего внимания среди биологически активных белков заслуживает лактоферрин (ЛФ). Благодаря наличию широкого спектра биологических свойств различного характера (оказывает антибактериальное, антивирусное действие; влияет на развитие воспалительного процесса; активирует синтез ДНК для обновления и построения новых клеток; регулирует содержание ионов железа в крови и др.) этот белок представляет собой перспективный функциональный ингредиент для молочных продуктов.

Проблемами получения монопрепаратов ЛФ из молочного сырья занимались зарубежные ученые Bear A., Querinjean Р. Однако все существующие способы извлечения ЛФ, основанные на хроматографии с предварительными этапами обезжиривания молока и высаливания балластных белков, характеризуются сложностью и длительностью.

На российском рынке в настоящее время представлены дорогостоящие препараты высокоочищенного ЛФ импортного производства, предназначенные для биохимических, медицинских исследований, а также для фармацевтической промышленности. Обеспечить молокоперерабатывающие предприятия такими препаратами ЛФ в необходимых количествах для обогащения молочных продуктов не представляется возможным. Кроме того, практически отсутствуют технологии кисломолочных продуктов, обогащенных ЛФ, которые можно было бы предложить для предприятий молочной промышленности.

В связи с изложенным, разработка научно-практических основ извлечения ЛФ из отечественного молочного сырья и технологии функциональных кисломолочных продуктов, обогащенных ЛФ, является актуальной.

Работа выполнена в ГНУ ВНИМИ при поддержке Гранта молодых ученых ассоциации «Университетский комплекс прикладной биотехнологии» за 2008г. Работа в 2008г. удостоена диплома лауреата премии III степени на конференции-конкурсе научно-инновационных работ молодых ученых и специалистов «Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» Россельхозакадемии. В 2009г. в конкурсе «Эстафета поколений», приуроченном к 80-летию ВНИМИ, работа заняла 1 место в номинации лучшая поисково-экспериментальная работа.

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы является разработка научно-практических основ извлечения лактоферрина из молочного сырья и технологии биойогурта, обогащенного лактоферрином.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- разработать наиболее воспроизводимый в условиях предприятий молочной промышленности метод количественного определения лактоферрина;

- научно обосновать выбор молочного сырья для применения его в качестве источника лактоферрина;

- разработать технологию извлечения лактоферрина из сырого молока;

- исследовать состав и свойства лактоферрина, выделенного из сырого молока; определить дозу лактоферрина для обогащения им биойогурта;

- разработать технологию биойогурта, обогащенного лактоферрином; исследовать его органолептические, физико-химические, микробиологические и структурные характеристики;

- провести апробацию технологии извлечения лактоферрина и технологии биойогурта, обогащенного лактоферрином, в промышленных условиях.

Научная новизна. Получены данные количественного содержания лактоферрина в отечественном молочном сырье. Впервые сборное сырое молоко выбрано в качестве промышленного источника лактоферрина.

Разработана технология извлечения лактоферрина, позволяющая выделять его непосредственно из сырого коровьего молока со степенью

извлечения 90% и сохранять при этом физико-химические показатели исходного молока.

Впервые установлена доза лактоферрина, составляющая 500 мг/л молока, при которой проявляются его антимикробные по отношению к бактериям группы кишечных палочек и бифидогенные по отношению к Bifidobacterium adolescentis МС-42 свойства.

Установлены количественные и качественные закономерности положительного влияния лактоферрина на характеристики биойогурта, обогащенного лактоферрином.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований доказана возможность реализации принципа «из молока в молоко» с целью получения обогащенного кисломолочного продукта с пролонгированным сроком годности. Разработан метод количественного определения лактоферрина в молоке и молочных продуктах. Разработаны две новые технологии - извлечение лактоферрина из сырого молока и производство обогащенного биойогурта. Для широкой реализации разработана необходимая техническая документация - ТУ 9224-468-00419785-09 «Белок молочный сывороточный «Лактоферрин» и ТУ 9222-469-00419785-09 «Биойогурт «Лактоферрель», обогащенный лактоферрином», которые находятся в стадии согласования.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной научно-практической конференции: «Биотехнология:; Вода и пищевые продукты», г. Москва 2008г.; на VII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биотехнологическая безопасность населения», г. Москва, 2008г.; на конференции-конкурсе научно-инновационных работ молодых учёных и специалистов «Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» Россельхозакадемии, г. Москва, 2008г.

Основные положения выносимые на защиту. Метод количественного определения лактоферрина в молоке и молочных продуктах. Технология получения отечественного лактоферрина. Технология нового вида продукта -биойогурта, обогащенного лактоферрином, с увеличенным в 4 раза сроком годности. Новый фактический материал по составу и свойствам лактоферрина и биойогурта, обогащенного лактоферрином.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ и подана заявка на изобретение № 2008151488 от 25.12.2008г. «Способ получения лактоферрина из молочного сырья».

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, методической части, экспериментальной части, выводов, списка использованной литературы (158 наименований источников, в том числе 47 работ зарубежных авторов) и приложений.

Работы изложена на 158 страницах машинописного текста, включающего 18 таблиц, 2_1 рисунок.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулирована цель работы, ее научная новизна и практическая значимость.

Глава 1 Состояние вопроса и задачи исследований. Проведен анализ научно-технической и патентной литературы по вопросам, связанным с основными направлениями обогащения молочных продуктов функциональными ингредиентами. Дана общая характеристика функциональных ингредиентов, представленных как на отечественном, так и на зарубежном рынке. Установлено, что особое внимание в последнее время уделяется антибактериальным защитным веществам молока, таким как лактоферрин, лактопероксидаза, лизоцим, ангиогенин и др. Увеличение сроков годности молочных продуктов за счет обогащения антибактериальными веществами, количество и биологическая активность которых снижается в ходе технологических процессов, является одной из главных задач молочной промышленности. При этом целесообразна разработка таких технологий извлечения антибактериальных веществ, которые бы в максимальной степени сохраняли биологические свойства последних. Определенный интерес по своим функциональным свойствам и возможности получения из молочного сырья представляет антибактериальный белок - лактоферрин (ЛФ). Однако в литературе не удалось найти данных о рациональных способах извлечения ЛФ из определенных источников молочного сырья, отсутствует доступный в условиях предприятий молочной промышленности метод контроля этого белка в молочном сырье. Не удалось обнаружить исчерпывающей информации об антимикробных и бифидогенных свойствах ЛФ, а также способах его использования в производстве функциональных кисломолочных продуктов.

На основании проведенного обзора литературы сформулированы цели и задачи исследований.

Глава 2 Организация проведения эксперимента. Методы и объекты исследований. Представлена схема проведения эксперимента (рис.1), даны характеристики объектов исследований, изложены методы исследований.

Экспериментальная часть работы проведена в лабораториях ГНУ ВНИМИ, Институте биохимии им. А.Н. Баха, Институте белка РАН г. Пущино. Опытную проверку разработанной технологии осуществляли на базе научно-экспериментального участка НПФ "Гамма" г. Пущино и в производственных условиях ОАО "Компания Продвижение".

Объектами исследований являлись: молоко коровье сырое сборное; молозиво; молоко пастеризованное; сыворотка молочная творожная; коммерческий и полученный опытным путем лактоферрин; опытный образец биойогурта с массовой долей жира 3,2%, обогащенного лактоферрином; контрольный образец - аналогичный по составу биойогурт без добавления лактоферрина; закваска для биойогурта, состоящая из термофильного молочнокислого стрептококка и болгарской палочки с добавлением бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis МС-42.

Изучаемые показатели: 1 - массовая доля лактоферрина, мг/л; 2 - связывающая способность сорбента, г/л; 3 - соотношение молокохорбент; 4 - скорость адсорбции и элкэирования, см/ч; 5 — концентрация элюирующего раствора, моль/л; 6 - физико-химические и микробиологические показатели лактоферрина; 7 — степень извлечения лактоферрина, %; 8 — физико-химические показатели сырого молока до и после извлечения лактоферрина; 9 — количество бифидобактерий, КОЕ/см3; 10 - БГКП, колиформы/см3; 11 - аминокислотный состав; 12 - массовая доля жира, %; 13 -массовая доля белка, %; 14 - активная кислотность, рН; 15 - титруемая кислотность, °Т; 16 -молочнокислые микроорганизмы, КОЕ/см3; 17 - дрожжи, плесени, КОЕ/см3; 18 -S .aureus в 1 см ; 19

- патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы в 25 см3; 20 — L. monocytogenes в 25 см'; 21

— эффективная вязкость, Пахе.

Рис. 1 Схема проведения исследований

s

Физико-химические показатели в сыром молоке, нормализованной смеси и готовом продукте определяли стандартизованными методами: массовую долю влаги и сухого вещества ускоренным методом высушивания - по ГОСТ 3626-73; массовую долю жира кислотным методом - по ГОСТ 5867-90; массовую долю белка методом Къельдаля . - по ГОСТ 23327-98; титруемую кислотность - по ГОСТ 3624-92; активную кислотность потенциометрическим методом - по ГОСТ 26781-85; плотность - по ГОСТ 3625-84. Массовую долю СОМО рассчитывали путем вычитания м.д.жира из м.д.сухих веществ.

В качестве нормируемых микробиологических показателей полученного препарата лактоферрина и готового продукта определяли бактерии группы кишечных палочек - по ГОСТ 9225-84 (для биойогурта), по ГОСТ Р 52816-2007 (для лактоферрина); дрожжи и плесени - по ГОСТ 10444.12-88; молочнокислые микроорганизмы - по ГОСТ 10444.11-89; бифидобактерии - по ГОСТ Р 5133199; патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы — по ГОСТ Р 528142007; коагулазо-положительные S.aureus - по ГОСТ 30347-97 (для биойогурта), по ГОСТ 10444.2-94 (для лактоферрина); бактерии L. monocytogenes - по ГОСТ Р 51921-2002 (для биойогурта).

Для количественного определения лактоферрина (ЛФ) в молоке и молочных продуктах был разработан метод, основанный на твердофазном неконкурентном иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием поликлональных антител. В качестве твердой фазы использовали 96-ти луночные полистироловые планшеты (Медполимер, Россия). Для регистрации оптической плотности окрашенных растворов использовали спектрофотометр для планшетов «MicrotaxRider» (Австрия). Для получения поликлональных антител проводили иммунизацию кроликов породы шиншилла препаратом коровьего лактоферрина (Sigma-Aldrich, США) с чистотой 99%. Пробы крови у животных отбирали на 27-й, 34-й, 41-й и 48-й дни после первой инъекции. Из антисыворотки иммунизированных кроликов выделяли аффинно очищенные поликлональные антитела к коровьему ЛФ с использованием аффинного сорбента, содержащего молекулы коровьего ЛФ. Для оценки надежности разработанного метода определяли точность ИФА, т.е. отклонение по отношению к истинному значению. Смысл определения точности ИФА состоял в сравнении данных, полученных разработанным методом, с теоретическими расчетами. При этом в качестве препарата для сравнения использовали образец коровьего лактоферрина (Sigma-Aldrich, США) с чистотой 99%.

Степень чистоты ЛФ, выделенного из сырого молока, определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия с использованием маркерных белков.

При проведении работ по установлению оптимальной дозы ЛФ, при которой в значительной степени проявляются его антимикробные свойства, в качестве тест-культуры использовали бактерии группы кишечных палочек (БГКП), контроль которых осуществляли в соответствии с ГОСТ - 9225-84. При изучении бифидогенных свойств ЛФ количество жизнеспособных клеток Bifidobacterium adolescentis МС-42 определяли согласно ГОСТ Р 51331-99. В

опытах использовали предварительно очищенные микрофильтрацией стерильные водные растворы ЛФ.

Оценку органолептических показателей биойогурта проводили сенсорным методом. Эффективную вязкость биойогурта определяли методом ротационной вискозиметрии на вискозиметре Брукфильда модель RVDV-II+. Аминокислотный состав ЛФ и продукта с ЛФ, а также коммерческих препаратов сывороточных белков (Sigma-Aldrich, США) определяли методом ионообменной хроматографии на аминокислотном анализаторе LC-5000 (фирма "Biotronik", Германия). Расчет содержания аминокислот в анализируемом растворе произведен автоматически с помощью "Chromatopac C-R3A" (фирма "Shimadzu", Япония). Для оценки сбалансированности аминокислотного состава ЛФ и изучаемого продукта использовали методику Липатова Никиты Николаевича. Микроструктурный анализ ЛФ и биойогурта, обогащенного ЛФ, проводили при помощи светового микроскопа "Axiolmager А Г'- Германия (биойогурт), просвечивающего электронного микроскопа "ЕМ-410"- Нидерланды (биойогурт) и атомно-силового микроскопа "ФемтоСкан" -Россия (ЛФ).

Повторность опытов при оптимальном режиме была 3-5 кратная. При математической обработке экспериментальных данных был применен регрессионный анализ, реализованный с помощью стандартных'пакетов программ "Microsoft Exel", "Statistica 6,0" и "Mathcad Professional 2000",.

Глава 3 Разработка метода количественного определения лактоферрина в молоке и молочных продуктах и выбор промышленного ресурса получения лактоферрина. С целью контроля содержания лактоферрина (ЛФ) в молоке и молочных продуктах был разработан метод, наиболее воспроизводимый в условиях предприятий молочной промышленности.

Анализ литературных и патентных данных позволил сделать вывод, что существующие до настоящего времени способы количественного определения ЛФ в различных биологических объектах основаны на современных высокочувствительных методах неконкурентного или конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием моноклональных или антивидовых антител, получение которых является длительным и дорогостоящим процессом. Поэтому для разработки доступного метода количественного определения ЛФ в молоке и молочных продуктах нами были использованы более простые в получении поликлональные антитела.

При разработке метода количественного определения ЛФ в молоке и молочных продуктах были проведены исследования включающие следующие основные этапы: иммунизация кроликов для получения поликлональных антител к коровьему ЛФ; выбор варианта твердофазного ИФА с использованием поликлональных антител и его адаптация применительно к молочному сырью; апробация метода.

Забор крови кроликов, иммунизированных коровьим ЛФ, для получения специфической иммунной сыворотки осуществляли в пик иммунного ответа —

на 41 день после первой иммунизации. Далее из полученной антисыворотки с использованием аффинного сорбента, содержащего молекулы ЛФ получали аффинно очищенные поликлональные антитела к коровьему ЛФ.

. Из множества вариантов твердофазного ИФА с применением поликлональных антител, для молока и молочных продуктов нами был выбран неконкурентный метод. Сущность неконкурентного метода заключается в следующем: иммобилизованные антитела инкубируют с образцом молочного сырья, содержащего ЛФ. После инкубации образец удаляют и добавляют конъюгат ЛФ с биотином, который взаимодействует со свободными антигенсвязывающими центрами антител. Далее проводят инкубацию с ферментом экстравидин щелочная фосфатаза. После удаления избытка фермента, в лунки планшета вносят субстрат 4-нитрофенилфосфат, который окисляется с образованием красителя. Интенсивность окраски в данном варианте анализа будет обратно пропорциональна концентрации ЛФ в анализируемом образце. Неконкурентный метод позволяет предотвратить влияние биологической жидкости (молоко) на активность ферментной метки биотина, так как процессы их инкубации разделены.

При отработке выбранного метода ИФА применительно к молочному сырью нами установлены: оптимальная концентрация антител при сорбции на планшеты - 0,01 мг/мл; оптимальный диапазон концентраций ЛФ в контрольных пробах - 11-750 нг/мл; оптимальная концентрация конъюгата ЛФ с биотином - 0,02 мг\мл; оптимальное разведение фермента экстравидин щелочной фосфатазы - 1:500; оптимальная концентрация субстрата - 1 мг/л; временные параметры различных стадий анализа, а также степень разведения исходных образцов молозива (в 1000 раз), сырого и пастеризованного молока (в 100-300 раз), сыворотки (в 100 раз), направляемых на анализ. В результате проведенной работы неконкурентный метод ИФА с использованием поликлональных антител был адаптирован для количественного определения ЛФ в молоке и молочных продуктах. Получена типичная калибровочная

'»-405 нм

Рис. 2 Калибровочная кривая количественного определения лактоферрина в молоке и молочных продуктах методом твердофазного неконкурентного иммуноферментного анализа с использованием поликлональных антител

Адаптированный метод был апробирован для определения содержания ЛФ в сборном сыром молоке (рис. 3-А), молозиве (рис. 3-Б), пастеризованном молоке (табл. 1) и творожной сыворотке.

Наибольшее содержание ЛФ в молоке наблюдалось с февраля по апрель и составляло в среднем 117,93±5,27 мг/л. Содержание ЛФ в сыром молоке за год составляло в среднем 100,33±16,4 мг/л. В молозиве максимальное содержание ЛФ отмечали в первый день после отела.

440 400 360 320 280 240 200 160 120 80 40 О

^ 440

3 400 (О

| 360 а

а. 320 ш

§ 280 Ь

га 240

Ж 200

§: 160 к

Я 120

ш

о

о 80 га

2 40

о

Месяцы Дни после отела "

Л Б

Рис. 3 Содержание лактоферрина в сборном сыром молоке (А) и молозиве (Б)

Результаты исследования влияния основных режимов пастеризации сырого молока на сохранность ЛФ, показали, что после пастеризации сырого молока при температуре (78±2)°С содержание нативного ЛФ уменьшается в среднем на 25%. Пастеризация при температуре (92±2)°С вызывает уменьшение содержания нативного белка примерно на 50% (табл.1).

Таблица 1

Влияние тепловой обработки молока на содержание нативного лактоферрина_

Месяц Массовая доля лактоферрина, мг/л

Сырое молоко Пастеризованное молоко, (78±2)°С Пастеризованное молоко, (92±2)°С

январь 107,8±2,2 82,1+4,4 53,5±1,2

февраль 122 ¿±1,8 96,7+4,3 65,1+1,7

март 119,6±4,89 87,6±3,7 62,3±1,7

апрель 112,0±2,1 83,7±3,4 56,3±1,7

май 105,6*1,8 80,0±3,6 53,7±3,8

июнь 101,9±2,2 73,6±3,6 47,7±1,1

июль 85,6±5,7 61,3±4,2 41,2±2,8

август 64,9±5,7 48,8±5,4 32,4±3,2

сентябрь 80,9±2,8 62,1±3,0 40,5±3,1

октябрь 97,3 ±2,6 71,6±3,1 48,9±2,2

ноябрь 100,2±1,4 74,9±3,4 48,2+2,4

декабрь 105,9+1,3 81,7+2,6 53,6±2,3

среднее 10043±16,4 75,36*13,1 50^30±9г3

Содержание лактоферрина в сыворотке, полученной при производстве творога, составляет в среднем 61,4 мг/л или 52% от исходного содержания в сыром молоке. Данный момент объясняется воздействием тепловой обработки (пастеризации) на сырое молоко, и тем, что часть белка (около 23% от содержания в сыром молоке) задерживается с казеином и остается в твороге.

Таким образом, нами был разработан и апробирован доступный в условиях перерабатывающих предприятий метод количественного определения ЛФ в молоке и молочных продуктах, основанный на твердофазном неконкурентном ИФА с использованием поликлональных антител к коровьему ЛФ. Аналитические характеристики разработанного метода были следующими: чувствительность анализа - 11 нг/мл; точность - 97,5 %; длительность 4-5 ч.

На основании анализа содержания лактоферрина в молозиве, сыром, пастеризованном молоке, сыворотке, а также с учетом промышленных ресурсов заготовляемого молока в качестве источника ЛФ было выбрано сырое молоко.

Глава 4 Разработка технологии извлечения лактоферрина из молочного сырья в лабораторных условиях. Для извлечения ЛФ из сырого молока нами был модифицирован метод хроматографического выделения ЛФ из коровьего молока, предложенный японскими исследователями. Сущность метода, взятого за основу, заключается в предварительном обезжиривании молока, удалении казеина, лактоальбумина, лактоглобулина с последующим фракционированием ЛФ методом хроматографии. Недостатком такого способа является существенное изменение состава исходного молока.

Перед нами стояла задача максимального извлечения ЛФ из сырого молока с сохранением физико-химических показателей последнего. Поэтому сущность модификации свелась к замене сорбента. Вместо карбоксиметил-тойпеарл (СагЬохушеФуЬТоуореаг!) с размером гранул 60 мкм была выбрана сульфопропилсефароза биг биде (БиКЬргору! БерЬагс^е В1еВеаё5) с размером гранул 200 мкм. Крупные гранулы позволили легко пропускать исходное сырое молоко через колонку без ее засорения. Поэтому предварительный этап удаления жира и высаливания белков, предусмотренный в методе, взятом за основу, нами был исключен.

Для максимального извлечения ЛФ из сырого молока необходимо было установить оптимальное соотношение молокогсорбент. Поэтому дальнейшие исследования были направлены на определение связывающей способности выбранного сорбента. Для этого, сырое молоко, концентрация ЛФ в котором составляла 110 мг/л, пропускали с различной скоростью через колонку с БР-ЗерЬагове, предварительно уравновешенную натрий-фосфатным . буфером с рН=6,5. Количество ЛФ, связанного сорбентом, определяли по разности содержания ЛФ в исходном и прошедшем через колонку молоке. Связывающую способность выражали как количество белка, связанного единицей объема сорбента (г ЛФ/л сорбента):

£- Шх-Мг) К

где М] - содержание ЛФ в исходном сыром молоке, г/л;

М2 - содержание ЛФ в молоке после прохождения через колонку, г/л; Ум - объем молока, направляемого на колонку, л; "^сорбента - объем сорбента, л

Математически обработанные результаты исследований адсорбции ЛФ сорбентом из сырого молока, при различной скорости потока представлены в виде мультипликативной поверхности (рис.4).

Рис. 4 Профиль насыщения сорбента SP-Sepharose Big Beads лактоферрином из сырого

молока при рН=6,5

Анализ полученной графической зависимости показал, что связывающая способность сульфопропилсефарозы составляет 30 г ЛФ/ 1 л сорбента. При этом оптимальная скорость потока молока составляет 300 см/ч. Таким образом, на основании установленной связывающей способности сорбента для максимально возможного извлечения ЛФ из 1 л сырого молока необходимо 3,3 мл сорбента.

Режим элюирования ЛФ был определен на примере хроматографии 3 л стандартного буферного раствора коммерческого препарата этого белка с известной концентрацией (ПО мг/л), в линейном градиенте концентрации хлорида натрия 0,1-1,ОМ в 0,05 натрий-фосфатном буфере с pH равным 6,5 (рис. 5-А). Скорость процесса элюирования — 300 см/ч. Объем фракций составлял 5 мл.

График элюирования показал, что пик выхода ЛФ наблюдается при концентрации хлорида натрия равной 0,6М.

Таким образом, проведенные эксперименты позволили установить оптимальные условия для извлечения ЛФ из сырого молока:

1. соотношение сорбент : молоко - 1 : 303;

2. адсорбция ЛФ на колонке с сорбентом SP-Sepharose Big Beads, уравновешенной 0,05 М натрий-фосфатным буфером с рН равным 6,5. Скорость прохождения молока через колонку 300 см/ч.

3. элюирование ЛФ с колонки в линейном градиенте концентрации хлорида натрия ОД - 1,0М в 0,05 М натрий-фосфатном буфере с рН равным 6,5. Сбор фракций, содержащих ЛФ, при концентрации NaCl равной 0,6М. Скорость элюирования 300 см/ч.

/ :

А

» и 1 /

А У 1 |

у 1 \ / ! \ :

у' _

л 33

за 5

ж

37 £

/

X

/

у' 2

/ А

/

V___

35 | я

J.JT7 С

3

4

3S J

Е

SS »

г » I а Ii s и i я ЭОДржцпи

V С % Ъ "3 23 s ш фракции

- 280 нм

А Б

Рис. 5 График изменения оптической плотности фракций элюата при хроматографии стандартного раствора лактоферрина (А) и сырого молока (Б) на SP-Sepharose Big Beads в линейном градиенте концентрации хлорида натрия 0,1-5-1,ОМ в 0,05М натрий-фосфатном буфере с рН=6,5. Колонка 1,6x5см. Скорость элюирования 300 см/ч

На рис.5-Б представлен график элюирования, являющийся типичным примером хроматографического выделения ЛФ из сырого молока с учетом внесенных нами модификаций. Фракции, входящие в состав пика 2, объединяли и направляли на ультрафильтрацию для обессоливания и концентрирования, и далее на микрофильтрацию для обеззараживания, в результате чего был получен препарат ЛФ в жидкой форме - стерильный водный раствор ЛФ с массовой долей ЛФ 4,8%. Полученный препарат ЛФ по микробиологическим показателям соответствовал нормам, установленным СанПин 2.3.2.1078-01 для БАД.

Для определения молекулярной массы полученного нами ЛФ, водный раствор белка после микрофильтрации подвергали лиофильной сушке и проводили электрофорез в полиакриламидном ®геле. Результаты электрофореза показали, что исследуемый нами препарат белка гомогенен (чистота ЛФ -95±0,5%) и имеет молекулярную массу (77,4±0,25)кДа, что соответствует известным ранее литературным данным, и подтверждает то, что выделенный нами белок является лактоферрином.

Возможности атомно-силового микроскопа позволили определить размеры частиц мицеллы выделенного ЛФ. На рис.6 представлено двух-, трехмерное изображение и профиль поверхности мицеллы ЛФ, размер которой

составляет около 63 нм (рис. 6-Б). Изображение мицеллы ЛФ позволяет различить в ней 2 субъединицы (рис. 6-А, стрелки А и В), что соответствует представлениям о пространственной структуре мицелл данного сывороточного белка, полученной ранее при помощи рентгеноструктурного анализа и подтверждает то, что выделенный нами белок является лактоферрином.

ми-

Линия 1: <1х = 62,74 нм

А Б В

Рис. 6 Изображение мицеллы лактоферрина полученное с помощью атомно-силового микроскопа: А- двумерное изображение;

Б- профиль поверхности мицеллы; В- трехмерное изображение

После элюирования ЛФ колонку с сорбентом промывали 2,ОМ ШО в объеме равном пяти объемам колонки (5Ук) для удаления белков, 1,0М N3011 (2Ук) для удаления липопротеинов, 70%-ным этанолом (2Ук) для удаления жиров. Далее проводили регенерацию сорбента 2,ОМ №С1 (5 Ук), затем колонку уравновешивали натрий-фосфатным буфером с рН=6,5 (5 Ук).

Одной из сопутствующих задач при получении ЛФ являлось максимальное сохранение свойств сырого молока после извлечения из него ЛФ. Было установлено, что физико-химические показатели сырого молока существенно не изменяются и его можно использовать для дальнейшей переработки и производства молочных продуктов.

Таким образом, после изменений внесенных в метод, предложенный японскими исследователями, нами был получен стерильный водный раствор ЛФ с массовой долей ЛФ равной 4,8%. Степень извлечения ЛФ из сырого молока была увеличена на 15% по сравнению с показателями, полученными при получении ЛФ согласно существующему методу, и составила 90%. Установлено, что внесенные изменения позволили существенно упростить и сократить минимум на 4 ч процесс получения ЛФ, не нанося ущерба степени чистоты ЛФ. Общая схема разработанной нами технологии извлечения ЛФ представлена на рис.7.

КЛАССИЧЕСКАЯ

СЫРОЕ МОЛОКО t=(5±2) С

Сепарирование

казеин ■4-

лактоальбумин

лактоглобулин

фип^рят

X

обезжиренное молоко

Подкисление до рН=4,6. Центрифугирование

сыворотка

Нейтрализация до рН=6,8. Центрифугирование ^ нейтрализованная сыворотка

Осаждение (NH4)2S04 до 50% насыщения

Т фильтрат

Осаждение (NH4)2S04 до 80% насыщения У фракция белков, содержащая ЛФ

ФРАКЦИИ. СОДЕРЖАЩИЕ ЛФ

УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИЯ (50 кДа) МИКРОФИЛЬТРАЦИЯ (0.2 мкм)

КОНЦЕНТРИРОВАННЫЙ РАСТВОР ЛФ

В ПРОДУКТ

РАЗРАБОТАННАЯ АВТОРОМ

Катионообменная хроматофафия (сорбент Carboxvmethvl-TovoDearl)

АДСОРБЦИЯ ЛФ* Сорбент уравновешенный

* 5V. 0.05 М натрий-фосфатным буфером с рН=7,7

ЭЛЮИРОВАНИЕ ЛФ" 20V.0.2+0.6 М NaCI в 0.05М натрий-фосфатном буфере с рН= 7.7 Сбор Фоакиий с ЛФ при 0.4 М NaCI 5 V« 2,0 М NaCI; 10 V, Н2Од„„; 2V, 1,0 М NaOH; 10 V, Н2Одист.; 2 V, 70% этанола; 10 V, Н2Олист. 5V. 2.0 М NaCI

+

ПРОМЫВАНИЕ СОРБЕНТА

-+- РЕГЕНЕРАЦИЯ СОРБЕНТА

Катионообменная хроматография (сорбент Sulfooropvl Sepharose Big Beads^

АДСОРБЦИЯ ЛФ" Сорбент уравновешенный 5V, 0,05 М натрий-фосфатным буфером с рН=6.5

ЭЛЮИР08АНИЕ ЛФ"

ПРОМЫВАНИЕ СОРБЕНТА

20V.0.1 +1.0 М NaCI

в 0.05М натрий-фосфатном буфере с рН= 6.5. Сбор фракций с ЛФ при 0.6 М NaCI

5 V, 2,0 М NaCI; 10 V,H2Oa«,.; 2V, 1,0 М NaOH; 10 V, НгОдист.; 2 V, 70% этанола; 10 V, Н2Опист.

РЕГЕНЕРАЦИЯ СОРБЕНТА

5V, 2,0 М NaCI

ФРАКЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЛФ

УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИЯ (50 кДа) МИКРОФИЛЬТРАЦИЯ (0,2 мкм)

МОЛОКО БЕЗ ЛФ

©

КОНЦЕНТРИРОВАННЫЙ РАСТВОР ЛФ

В ПРОИЗВОДСТВО

В ПРОДУКТ

ПРЕИМУЩЕСТВА РАЗРАБОТАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ

1. ОТСУТСТВУЕТ ТРУДОЕМКИЙ ЭТАП ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ МОЛОКА (А) В РЕЗУЛЬТАТЕ ЧЕГО СОКРАЩАЕТСЯ ПРОЦЕСС ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЛАКТОФЕРРИНА min НА 4 ч

2. УВЕЛИЧИВАЕТСЯ СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЛАКТОФЕРРИНА С 75 ДО 90%

3. ПОСЛЕ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЛАКТОФЕРРИНА СЫРОЕ МОЛОКО СООТВЕТСТВУЕТ ТРЕБОВАНИЯМ КАЧЕСТВА И БЕЗОПАСНОСТИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

' ЛФ - ЛАКТОФЕРРИН

Рис. 7 Сравнительная характеристика классической и разработанной автором технологий извлечения лактоферрина

Глава 5 Исследование биотехнологических свойств лактоферрина.

Рассмотрены вопросы, касающиеся установления доз ЛФ, при которых проявляются его антибактериальные и бифидогенные свойства по отношению к тем микроорганизмам, которые характерны в условиях молочного производства, а также проведен анализ сбалансированности аминокислотного состава ЛФ.

Антимикробные свойства ЛФ по отношению к бактериям группы кишечных палочек (БГКП) изучали в условиях смоделированного процесса производства молока пастеризованного, принудительно обсемененного БГКП. Полученные экспериментальные данные (табл. 2) свидетельствуют о том, что антибактериальное действие ЛФ по отношению к БГКП проявляется при дополнительной дозе белка 500 мг/л молока и сохраняется с увеличением дозы.

Таблица 2

Влияние лактоферрина на развитие бактерий группы кишечных палочек

в пастеризованном молоке

Дополнительная доза лактоферрина в пастеризованном молоке, мг/л Масса продукта (г), в которой обнаружены БГКП (колиформы)

фон через 12 ч на 1-е сутки на 5-е сутки на 10-е сутки

0 - контроль 0,00001 0,00001 0,00001 0,000001 0,000001

100 0,00001 0,00001 0,00001 0,000001 0,000001

200 0,00001 0,00001 0,00001 0,00001 0,000001

300 0,00001 0,00001 0,00001 0,00001 0,000001

400 0,00001 0,0001 0,001 0,00001 0,000001

500 0,00001 0,001 - - -

600 0,00001 0,001 - - -

700 0,00001 0,001 - - -

800 0,00001 0,01 - - -

С целью изучения бифидогенных свойств ЛФ, проводили исследования по культивированию бифидобактерий штамма Bifidobacterium adolescentis МС-42 в стерилизованном молоке, содержащем дополнительные дозы ЛФ в интервале от 0 (контрольный образец) до 800 мг/л. Результаты исследований представлены на рис. 8.

Анализ полученных графических зависимостей (рис.8 А, Б) показывает, что добавление ЛФ в молоко способствовало увеличению скорости наращивания клеток штамма Bifidobacterium adolescentis МС-42. Оптимальная доза ЛФ, при которой отмечена наибольшая активность бифидобактерий, составляет 500 мг/л молока, при этом отмечено наименьшее время образования плотного сгустка (24 ч), уровень бифидобактерий в этот момент составлял 1-108 КОЕ/см при кислотности (66±2)°Т. В молоке без добавления ЛФ роста бифидобактерий и увеличения кислотности не наблюдалось.

Из литературных данных установлено, что для роста бифидобактерий необходимы такие аминокислоты как валин, аргинин, пролин, серии, а также аспарагиновая и глутаминовая кислоты.

1—1 67Е

S25

□ 7 7-_-

(ИЗ ¡725

□ 6 75

о 526

1 " 575

;525

'Л 75

1375

Врел

Б

Рис. 8 Изменение количества клеток штамма Bifidobacterium adolescentis МС-42 (А) ] титруемой кислотности (Б) в процессе ферментации молока с лактоферрином

Результаты исследования аминокислотного состава ЛФ, в сравнении с другими сывороточными белками, представлены в табл. 3. Способность ЛФ стимулировать рост бифидобактерий объясняется высоким содержанием в его составе валина, пролина, серина, глутаминовой кислоты.

Таблица 3

Аминокислотный состав сывороточных белков_

Аминокислота Содержание, г/100г белка

лактоферрин (3-лакто-глобулин а-лакто-альбумин альбумин сыворотки крови

Алании 4,96±0,1 6,20±0,2 1,65+0,1 4,55±0,4

Глицин 3,58±0,4 1,17±0,01 2,51 ±0,1 1,32±0,05

Аспарагиновая кислота 9,38±0,2 9,56±0,4 14,69±0,6 7,99±0,4

Глутаминовая кислота 11,1310,1 16,01+0,5 10,13±0,5 12,10+0,5

Лизин 6,35+0,2 9,55+0,4 9,04+0,5 9,39+0,5

Гистидин 1,93±0,2 1,34±0,1 2,28+0,2 2,93+0,2

Треонин 4,23+0,3 4,86+0,2 4,32+0,3 4,25+0,3

Цистеин+цистин 3,40±0,4 2,85±0,1 5,03±0,4 4,40+0,3

Метионин 1,10+0,2 2,68±0.1 0,78+0,02 0,58±0,01

Валин 5,43±0,2 4,86+0.2 3,69±0,3 4,33+0,2

Пролин 4,03±0,3 3,44+0.2 1,18+0,1 3,50+0,1

Триптофан 2,67+0,1 1,59+0,1 5,50±0,4 0,51+0,02

Лейцин 7,54+0,1 13,07+0,6 9,04+0,5 9,02±0,4

Изолейцин 2,48+0,1 5,11+0,3 5,34+0,4 1,90+0,1

Серии 5,06±0,3 4,19±0,3 3,77±0,2 3,08±0,2

Аргинин 6,62±0,3 2,43+0,1 0,94+0,04 4,33+0,3

Фенилаланин 5,15±0,3 2,93+0,1 3,54±0,3 4,84+0,3

Тирозин 4,14±0,2 3,18+0,1 4,24+0,3 3,74+0,3

ИТОГО 89,18±0,100 95,02+0,175 87,67±0,176 82,76±0,155

Результаты оценки сбалансированности аминокислотного состава ЛФ и других сывороточных белков представлены в табл. 4. Приведенный в табл. 4

комплекс показателей свидетельствует о высокой биологической ценности ЛФ. По соответствующим расчетам установлено, что по усвояемости ЛФ уступает только (3-лактоглобулину, усвояемость которого на 16,4% выше. Самую низкую усвояемость имеет альбумин сыворотки крови - 45,6%, что на 22% ниже усвояемости лактоферрина.

Таблица 4

Сбалансированность аминокислотного состава сывороточных белков

Наимено- Сумма Мини- Коэф- Избыточ- Сопос- Усвояемость

ваниие незаме- маль- фициент ность тавимая незаме-

нимых ный утили- незамени- избыточ- нимых

амино- скор, тар- мых ность, г/100 г белка амино-

кислот г/100г белка ности аминокислот, г/100 г белка кислот, г/100 г белка

лактоферрин 42,49 62,0' 0,52 20,21 32,6 67,4

(3-лакто- 50,68 97,1L 0,69 15,73 16,2 83,8

глобулин

а-лакто-альбумин 50,52 74,0е 0,52 24,03 32,5 67,5

альбумин 42,96 47,5' 0,39 25,85 54,4 45,6

сыворотки крови

1 Скор шш нзолейцин; Скор min валин

Таким образом, наличие антибактериальных по отношению к БГКП, бифидогенных свойств у ЛФ, а также его достаточно высокая биологическая ценность, позволили рекомендовать этот белок для обогащения биойогурта.

Глава 6 Разработка технологии биойогурта, обогащенного лактоферрином, в лабораторных условиях. С целью разработки технологических параметров производства биойогурта, обогащенного лактоферрином, за основу была принята научно обоснованная доза ЛФ, равная 500 мг/л, при которой в продукте выявлены антимикробные и пребиотические свойства.

Согласно разработанному нами способу извлечения ЛФ из сырого молока получен стерильный водный раствор ЛФ с массовой долей ЛФ равной 4,8%. Поэтому для достижения в биойогурте выбранной дозы лактоферрина, составляющей 500 мг/л, необходимо на 1 т биойогурта внести Юл полученного водного раствора ЛФ.

На основании исследований влияния пастеризации молока при температуре (92±2)°С на сохранность нативного ЛФ, изложенных в главе 3, внесение ЛФ до пастеризации нецелесообразно, так как приведет к значительной потере биологической активности белка. При добавлении ЛФ в сквашенное молоко могут возникнуть трудности, связанные с равномерным распределением белка в сгустке. Поэтому ЛФ добавляли в пастеризованную и охлажденную до (40±2)°С нормализованную смесь до заквашивания.

В процессе сквашивания было отмечено, что ЛФ не оказывает ингибирующего действия на процесс развития микрофлоры закваски. Продолжительность сквашивания биойогурта, обогащенного ЛФ, и контрольного образца биойогурта без ЛФ составляла 4,5 ч.

Учитывая, что ЛФ обладает антимикробными свойствами по отношению к БГКП, представляло интерес определить его влияние на срок годности продукта. Для этого в образцах биойогурта с ЛФ и без него, упакованных в герметичную тару, в течение 20 суток определяли физико-химические, микробиологические, органолептические показатели согласно Методическим указаниям Минздрава РФ (МУК 4.2.1847-04).

Было установлено, что в процессе хранения биойогурта, обогащенного ЛФ, наблюдается менее интенсивное нарастание кислотности по сравнению с контрольным образцом. Средняя величина этого показателя на 20-е сутки хранения продукта, обогащенного ЛФ, составляла (135±4)°Т, продукта без ЛФ - (99+3)°Т.

Как следует из рис. 9, на 20-е сутки хранения в биойогурте, обогащенном ЛФ, количество молочнокислых микроорганизмов составляло 6-107, бифидобактерий - 4-Ю6 КОЕ/см3, что соответствовало требованиям ФЗ №88 «Технический регламент на молоко и молочную продукцию», в отличие от биойогурта без ЛФ, в котором количество бифидобактерий было ниже, чем 10б КОЕ/см .

I 8

ш 7

О 7

о> 6

15

20

фон 5 10 Продолжительность хранения, сутки 0 биойогурт (контроль) □биойогурт, обогащенный лакгоферрином

£ га ю о Ч х

■а

£ Ш ш о

5 *

фон 5 10 15 20 Продолжительность хранения, сутки □биойогурт (контроль) □биойогурт, обогащенный лакгоферрином

Рис. 9 Изменение содержания молочнокислых микроорганизмов и бифидобактерий в процессе хранения

Было установлено, что на протяжении всего срока хранения контрольного и опытного образцов биойогурта отсутствовали патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы в 25 см3, Б.аигеиз - в 1,0 см3, БГКП -в 0,1 см3 продукта. Кроме того, в образце биойогурта, обогащенного ЛФ, на протяжении 20 суток хранения отсутствовали дрожжи и плесневые грибы. В

продукте без ЛФ дрожжи и плесневые грибы были обнаружены на 20-е сутки хранения в количестве более 50 КОЕ/см3.

Следует отметить, что в процессе хранения не наблюдали ухудшение органолептических показателей опытного образца биойогурта с ЛФ. Органолептические показатели контрольного образца в процессе хранения были снижены.

Кроме того, в контрольных и опытных образцах биойогурта изучались реологические свойства, в частности эффективная вязкость. Следует отметить, что на протяжении всего периода хранения реологические характеристики опытного образца с ЛФ превосходили аналогичные показатели контрольного варианта. Величина эффективной вязкости биойогурта с ЛФ свежевыработанного и на 20-е сутки хранения составляла соответственно (7577) и (80-87) Пахе, что примерно на 20% больше, чем у образца без ЛФ. Кроме того, структура продукта, обогащенного ЛФ, на протяжении всего периода хранения оставалась плотной, ровной и не наблюдалось отделения сыворотки, в отличие от образца без ЛФ.

Таким образом, на основании полученных результатов исследований можно сделать вывод, что срок годности биойогурта, обогащенного ЛФ, может быть увеличен по сравнению с контрольным образцом биойогурта без ЛФ с 5 до 20 суток без использования дополнительных приемов по увеличению сроков годности биойогурта.

Общая оценка сбалансированности аминокислотного состава биойогурта, обогащенного ЛФ, в сравнении с контрольным образцом представлена в табл. 5.

Таблица 5

Сбалансированность аминокислотного состава биойогурта и биойогурта,

обогащенного лактоферрином

Наименование продуктов Сумма незаменимых аминокислот г/100г белка Минимальный скор, Коэффициент утилитарности Избыточность незаменимых аминокислот, г/100 г белка Сопоставимая избыточность, г/100 г белка Усвояемость незаменимых аминокислот, г/100 г белка

Биойогурт (контроль) 41,42 59.9 0,517 19,99 33,4 66,6

Биойогурт, обогащенный лактоферрином 41,53 60,7 0,526 19,68 32,4 67,6

* Скор гшп валин

Из табл. 5 следует, что усвояемость биойогурта, обогащенного ЛФ (67,6%) несколько выше усвояемости контрольного образца (66,6%).

В связи с тем, что накопление свободных аминокислот в кисломолочных продуктах имеет положительное значение, было проведено исследование состава свободных аминокислот в контрольном и опытном образцах биойогурта в процессе хранения. Установлено, что биойогурт, обогащенный

ЛФ, имеет в своем составе несколько большее количество свободных аминокислот, чем контрольный образец. Так в продукте, обогащенном ЛФ, содержание свободных аминокислот на 20-е сутки хранения составляло 2380,5210,452 мг/100 г продукта, в контрольном образце - 2260,53+0,451 мг/100 г продукта.

С целью определения особенностей строения молочно-белкового сгустка биойогурта, обогащенного ЛФ, проводили электронно-микроскопические исследования. При помощи просвечивающего электронного микроскопа было установлено, что в пространственной сетке, образованной мицеллами казеина, расположены немногочисленные участки с более компактной и плотной структурой, образованные частицами ЛФ.

Как видно из микроскопического препарата, полученного при помощи светового микроскопа и представленного на рис. 10, микрофлора контрольного образца (слева) не формирует крупных агрегационных образований и распределена равномерно по всей массе продукта. В биойогурте, обогащенном лактоферрином, микрофлора распределена тоже равномерно, однако наблюдаются немногочисленные участки скопления молочнокислых микроорганизмов. Это связано с тем, что микрофлора ассоциируется с ЛФ, который богат аминокислотами серином, глицином, аланином, тирозином, метионином, валином, необходимыми в первую очередь, по данным Королевой Н.С., для развития болгарской палочки и термофильного молочнокислого стрептококка.

Рис. 10 Распределение микрофлоры биойогурта (слева) и биойогурта, обогащенного лактоферрином (справа), увеличение х 40

Глава 7 Разработка промышленных технологий извлечения лактоферрина и биойогурта, обогащенного лактоферрином.

Технологические параметры извлечения лактоферрина (ЛФ) из сырого молока и производства биойогурта, обогащенного ЛФ, разработанные в лабораторных условиях, были апробированы на базе научно-экспериментального участка НПФ "Гамма" (г. Пущино) и в производственных условиях ОАО "Компания Продвижение".

Органолептические, физико-химические и микробиологические показатели препарата ЛФ, полученного в лабораторных и промышленных

условиях были аналогичны. Стерильный концентрированный водный раствор ЛФ далее использовали для выработки биойогурта.

В промышленных условиях были подтверждены режимы и параметры производства биойогурта, обогащенного лактоферрином, установленные ране в лабораторных условиях. Срок хранения продукта с ЛФ выработанного в промышленных условиях, определенный в соответствии с МУК 4.2.1847-04, составил 20 суток.

На основании полученных результатов разработана комплексная схема технологического процесса извлечения ЛФ из сырого молока и производства биойогурта, обогащенного лактоферрином (рис. 11) и техническая документация на производство лактоферрина (ТУ 9224-468-00419785-09 "Белок молочный сывороточный "Лактоферрин") и биойогурта, обогащенного ЛФ (ТУ 9222-469-00419785-09 "Биойогурт "Лактоферрель", обогащенный лактоферрином")

Е1 - емкость для сырого молока

Е2 - емкость для сливок

ЕЗ - емкость для обезжиренного молока

Е4 - емкость для нормализации молока

Р - резервуар для кисломолочных напитков

Об - обезжиренное молоко

Сл - сливки

НМ - нормализованное молоко

1 - насос центробежный

2 - уравнительный бачок

3 - перистальтический насос

4 - хроматографическая установка

5 - фильтрационная установка (ультрафиль-

трационный+микрофильтрационный модули)

6-асептический резервуар для хранения стерильного раствора лактоферрина

7 - подогреватель молока

8 - сепаратор спивкоотд елитель

9- пластинчатая пастеризационно-охладительная установка

10- гомогенизатор

11 - выдерживатель

12- насос для вязких молочных продуктов

13- установка охладительная пластинчатая

для кисломолочных продуктов

14- насос для закваски

Рис. 11 Принципиальная комплексная схема получения лактоферрина и производства биойогурта4* Лактоферрель", обогащенного лактоферрином

Проведен расчет ожидаемой экономической эффективности от внедрения

новой технологии, в соответствии с которым дополнительная прибыль от

реализации биойогурта, обогащенного ЛФ, составляет 1630 руб./т в год при

объемах годового выпуска продукта 6 тыс. тонн (в ценах 2009г).

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод количественного определения лактоферрина в молоке и молочных продуктах с использованием твердофазного неконкурентного иммуноферментного анализа на основе поликлональных антител к коровьему лактоферрину. Точность метода составляет 97,5%, чувствительность - 11 нг/мл, продолжительность анализа - 4-5ч.

2. Обоснован выбор молочного сырья для использования его в качестве источника лактоферрина. С целью получения максимального количества лактоферрина в промышленных условиях рекомендовано использовать сборное сырое молоко.

3. Разработана технология извлечения лактоферрина из сырого молока. При этом соотношение сорбента SP-Sepharose Big Beads к сырому молоку составило 1:303; скорость потока молока - 300 см/ч; рН процесса адсорбции -6,5; элюирование в линейном градиенте концентрации хлорида натрия 0,1 - 1,0М в 0,05 М натрий-фосфатном буфере с рН=6,5; скорость элюирования - 300 см/ч; сбор фракций, содержащих лактоферрин, при концентрации хлорида натрия равной 0,6М - позволившие увеличить степень извлечения лактоферрина с 75 до 90%.

4. Предложена новая схема переработки сырого молока, поступающего на предприятия, заключающаяся в предварительном извлечении из него лактоферрина и последующем направлении этого сырого молока на производство молочных продуктов.

5. Установлены антимикробные по отношению к бактериям группы кишечных палочек и бифидогенные по отношению к Bifidobacterium adolescentis МС-42 свойства лактоферрина, проявляющиеся при дополнительной дозе белка равной 500 мг/л молока. Данная доза рекомендована для обогащения биойогурта.

6. Разработана технология биойогурта, обогащенного лактоферрином. На основании результатов исследований органолептических, физико-химических, микробиологических и реологических показателей в процессе хранения обоснован срок годности биойогурта, обогащенного лактоферрином, составляющий - 20 суток, в сравнении с контролем без ЛФ, имеющим срок годности - 5 суток.

7. Проведена апробация технологии извлечения лактоферрина и технологии биойогурта, обогащенного лактоферрином; разработана техническая документация на производство лактоферрина и биойогурта, обогащенного лактоферрином ("Белок молочный сывороточный "Лактоферрин" ТУ 9224468-00419785-09 и "Биойогурт "Лактоферрель", обогащенный лактоферрином" ТУ 9222-469-00419785-09). Дополнительная прибыль от

реализации биойогурта, обогащенного ЛФ, составляет 1630 руб./т в год при объемах годового выпуска продукта 6 тыс. тонн.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Мишина A.B. О роли антибактериальных факторов молока в повышении его стойкости / З.С. Зобкова, A.B. Мишина, В.В. Смолянинов, Г.В. Шехватова // Молочная промышленность.- 2007.-№8.-с. 37 — 38.

2. Мишина A.B. Антимикробные свойства лактоферрина / З.С. Зобкова, A.B. Мишина, A.B. Бегунова // Молочная промышленность.- 2007,-№10.-с. 60.

3. Мишина A.B. Количественный иммуноферментный метод определения лактоферрина в молочных продуктах / З.С. Зобкова, A.B. Мишина, В.В. Смолянинов, Г.В. Шехватова // Молочная промышленность.- 2008.-№3.-с. 62-63.

4. Мишина A.B. Наночастицы лактоферрина в молочных продуктах // Материалы Международной научно-практической конференции: "Биотехнология. Вода и пищевые продукты". (Москва, 11-13 _ марта, 2008г.) М.: ЗАО "Экспо-биохим-технологии", РХТУ им.' Д.И. Менделеева, 2008.-с.131.

5. Мишина A.B. Минорные фракции сывороточных белков как основа для создания новых видов функциональных продуктов // Материалы Международной научно-практической конференции «Совершенствование технологий производства продуктов питания в свете государственной программы развития с-х на 2008-2012 гг." 18-19 июня 2008 г. г. Волгоград, часть 2 - Переработка с-х сырья и пищевая технология. - М.: Из-во Вестник РАСХН., 2008.- с. 133 - 136.

6. Мишина A.B. О бифидогенных свойствах лактоферрина / З.С. Зобкова, A.B. Мишина, A.B. Бегунова // Молочная промышленность.- 2008.-№7.-с. 64-65.

7. Мишина A.B. Антибактериальные вещества сырого молока и стойкость молочных продуктов в хранении / З.С. Зобкова, A.B. Мишина // Материалы Международной научно-практической конференции посвященной 90-летию Омского госудраственного аграрного университета: "Современные технологии производства продуктов питания: состояние, проблемы и перспективы развития",- Омск: "Вариант-Омск", 2008.- с.73-76.

8. Мишина A.B. Влияние технологических параметров обработки молока-сырья на количественный состав лактоферрина// Сборник докладов Конференции - конкурса научно-инновационных работ молодых ученых и специалистов за 2008г. "Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции Россельхозакадемии".- Москва: ООО "Полиграф", 2008.-c.78-8!.

9. Мишина A.B. Реологические показатели кисломолочного продукта с лактоферрином / З.С. Зобкова, A.B. Мишина // Молочная промышленность,- 2009.-№2.-с. 74 - 75.

Ю.Мишина A.B. Технология экстрагирования лактоферрина из сырого молока / З.С. Зобкова, A.B. Мишина, В.В. Смолянинов, Г.В. Шехватова // Молочная промышленность.-2009.-№ 12-С.21 -22.

П.Мишина A.B. Наночастицы лактоферрина в производстве функциональных молочных продуктов/ З.С. Зобкова, A.B. Мишина // Хранение и переработка сельхозсырья.-2009.-№12 - с.49-52.

12. Мишина A.B. О биологической ценности сывороточного белка лактоферрина / З.С. Зобкова, A.B. Мишина // Научное обеспечение молочной промышленности (ВНИМИ - 80 лет): Сб. науч. трудов. М.: ГНУ ВНИМИ, 2009.- с. 162-167.

13. Мишина A.B. Аминокислотный состав кисломолочного продукта, обогащенного лактоферрином / З.С. Зобкова, A.B. Мишина // Научное обеспечение молочной промышленности (ВНИМИ - 80 лет): Сб. науч. трудов. М.: ГНУ ВНИМИ, 2009.- с.168-175.

14. Мишина A.B. Микроструктура наночастиц сывороточного белка лактоферрина и кисломолочного продукта, обогащенного лактоферрином / З.С. Зобкова, A.B. Мишина // Научное обеспечение молочной промышленности (ВНИМИ - 80 лет): Сб. науч. трудов. М.: ГНУ ВНИМИ, 2009.- с. 176-181.

Подписано в печать:

26.01.2010

Заказ № 3233 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1.1 Молочные продукты как основа рационального питания.

1.2 Функциональные молочные продукты, обогащенные функциональными ингредиентами.

1.3 Способы создания кисломолочных продуктов с длительными сроками годности.

1.4 Функциональные свойства сывороточных белков.

1.5 Способы выделения сывороточных белков из молочного сырья.

1.6 Иммунологический анализ белковых веществ.

1.6.1 Иммунологический анализ лактоферрина.

1.7 Обоснование выбора направления и задачи исследований.

Глава 2. ОРГАНИЗАЦИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Организация работы и объекты исследований.

2.2 Методы исследований.

Глава 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛАКТОФЕРРИНА В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ И ВЫБОР ПРОМЫШЛЕННОГО РЕСУРСА ПОЛУЧЕНИЯ ЛАКТОФЕРРИНА.

3.1 Отработка метода иммуноферментного анализа лактоферрина применительно к молочному сырью.

3.2 Апробация метода иммуноферментного анализа лактоферрина в различных видах молочного сырья.

3.2.1 Исследование количественных критериев лактоферрина в сыром молоке и молозиве.

3.2.2 Определение количественного состава лактоферрина в пастеризованном молоке.

3.2.3 Исследование количественного состава лактоферрина в молочной сыворотке.

Глава 4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЛАКТОФЕРРИНА

ИЗ МОЛОЧНОГО СЫРЬЯ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ.

4.1 Выбор оптимальных условий извлечения лактоферрина из сырого молока.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ЛАКТОФЕРРИНА.

5.1 Исследование антимикробных свойств лактоферрина.

5.2 Влияние доз лактоферрина в молоке на рост бифидобактерий.

5.3 Определение аминокислотного состава лактоферрина.

Глава 6. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БИОЙОГУРТА, ОБОГАЩЕННОГО ЛАКТОФЕРРИНОМ, В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ.

6.1 Обоснование дозы и режимов внесения лактоферрина в биойогурт.

6.2 Исследование органолептических, физико-химических, микробиологических и реологических показателей биойогурта, обогащенного лактоферрином.

6.3 Определение аминокислотного состава биойогурта, обогащенного лактоферрином.

6.3.1 Исследование количественного состава свободных аминокислот в процессе хранения биойогурта, обогащенного лактоферрином.

6.4 Исследование микроструктуры биойогурта, обогащенного лактоферрином.

Глава 7. РАЗРАБОТКА ПРОМЫШЛЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЛАКТОФЕРРИНА И БИОЙОГУРТА, ОБОГАЩЕННОГО

ЛАКТОФЕРРИНОМ.

7.1 Апробация технологии извлечения лактоферрина из сырого молока и технологии биойогурта, обогащенного лактоферрином, в промышленных условиях и разработка технической документации.

ВЫВОДЫ.

С целью обеспечения эффективности работ в области технического регулирования производства и оборота молока и продуктов его переработки введен в действие с 17 декабря 2008г. Федеральный закон №88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию". Настоящий Федеральный закон устанавливает объекты технического регулирования (молоко и молочная продукция); требования безопасности к ним; правила идентификации данных объектов; требования к терминологии, упаковке, маркировке молока и молочной продукции. Содержит правила и формы оценки соответствия объектов технического регулирования Федеральному закону.

Одной из важнейших задач современной пищевой технологии является создание функционального питания, обеспечивающего поддержание и активизацию жизненно важных функций человека, повышение общей сопротивляемости организма агрессивным условиям окружающей среды (33, 34, 67, 73, 82, 93).

Особую роль в функциональном питании ученые отводят молочным продуктам, способствующим оптимизации микроэкологического статуса организма человека, полагая, что именно нормобиоценоз является залогом иммунобиологической стабильности, и потенциально, здоровья в целом.

Теоретические и практические положения получения функциональных молочных продуктов разработаны Покровским А.А., Липатовым Н.Н. (ст.), Липатовым Н.Н. (мл.), Зобковой З.С., Роговым И.А., Волгаревым М.Н., Тутельяном В.А., Уголевым A.M., Харитоновым В.Д., Радаевой И.А., Спиричевым В.Б., Шатнюк Л.Н., Королевой Н.С., Семенихиной В.Ф., Храмцовым А.Г. Тихомировой Н.А., Богдановой Е.А. и другими.

В настоящее время российский рынок функциональных молочных продуктов интенсивно развивается. Основную часть продаж и популярность среди потребителей составляют йогурты. В период с 2007 по 2009 гг. производство этого продукта возросло на 185,5 тыс.т и составило в 2009г. около 790,0 тыс.т.

Современный этап развития технологий функциональных молочных продуктов, в том числе йогурта, требует применения всё большего количества новых видов сырья, различных функциональных ингредиентов и технологических добавок, композитных упаковочных и контактирующих с продукцией материалов, а также технологических решений по пролонгированию сроков годности продукции (26, 32, 88).

Одним из приоритетных направлений в производстве функциональных молочных продуктов является применение полифункциональных ингредиентов. В данном направлении особый интерес представляют белковые препараты животного происхождения - сывороточные белки (68, 71,99).

С физиологической точки зрения сывороточные белки являются наиболее полноценными, так как в них присутствуют в оптимальном количестве такие незаменимые для организма аминокислоты как триптофан, метионин, лизин, цистеин, гистидин. По сравнению с другими белками сочетание этих аминокислот в сывороточных белках является одним из лучших (44, 48, 74, 91, 100).

В состав сывороточных белков входят фракции глобулярных белков, которые выполняют важные биологические функции. Так лактопероксидаза, лактоферрин, лизоцим, панкреатическая рибонуклеаза, ангиогенин являются компонентами антибактериального комплекса молока. Благодаря им в свежевыдоенном молоке в течение определенного периода (20-24ч), называемого "бактерицидной фазой", не размножаются бактерии (22). Крайне непродолжительный период бактерицидной фазы объясняется недостаточным количеством этих антибактериальных защитных веществ, содержащихся в молоке и разрушающихся под воздействием тепловой обработки, применяемой при производстве молочных продуктов. Усиление бактерицидных свойств молочных продуктов за счет обогащения их защитными веществами, выделенными из молочного сырья с использованием щадящих режимов, позволило бы увеличить сроки годности молочных продуктов без использования синтетических консервантов.

Особый интерес из перечисленных сывороточных белков представляет лактоферрин. Благодаря наличию широкого спектра биологических свойств различного характера (оказывает антибактериальное, антивирусное действие; влияет на развитие воспалительного процесса и иммунную реакцию организма; активирует синтез ДНК для обновления и построения новых клеток; регулирует содержание ионов железа в крови и др.) этот белок представляет собой перспективный функциональный ингредиент для молочных продуктов (41, 133, 152).

В настоящее время российский рынок представлен импортными дорогостоящими препаратами высокоочищенного лактоферрина, предназначенными для биохимических, медицинских исследований, а также для фармацевтической промышленности. Обеспечить молокоперерабатывающие предприятия таким препаратом в необходимых количествах для обогащения молочных продуктов не представляется возможным. Кроме того, практически отсутствуют технологии кисломолочных продуктов, обогащенных лактоферрином, которые можно было бы преложить для предприятий молочной промышленности.

Таким образом, идею извлечения лактоферрина из отечественного молочного сырья и внесение его в кисломолочные продукты также как выделение лактулозы из молочной сыворотки и добавление ее в продукты можно назвать "из молока в молоко". Разработка технологии извлечения антибактериального белка лактоферрина позволит предложить новые схемы переработки молока и изготовление из него функциональных кисломолочных продуктов, в том числе йогурта, с антибактериальными свойствами, стойких в хранении.

Целью настоящей диссертационной работы является разработка научно-практических основ извлечения лактоферрина из молочного сырья и технологии биойогурта, обогащенного лактоферрином.

Научная новизна работы. Получены данные количественного содержания лактоферрина в отечественном молочном сырье. Впервые сборное сырое молоко выбрано в качестве промышленного источника лактоферрина.

Разработана технология извлечения лактоферрина, позволяющая выделять его непосредственно из сырого коровьего молока со степенью извлечения 90% и сохранять при этом физико-химические показатели исходного молока.

Впервые установлена доза лактоферрина, составляющая 500 мг/л молока, при которой проявляются его антимикробные по отношению к бактериям группы кишечных палочек и бифидогенные по отношению к Bifidobacterium adolescentis МС-42 свойства.

Установлены количественные и качественные закономерности положительного влияния лактоферрина на характеристики биойогурта, обогащенного лактоферрином.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований доказана возможность реализации принципа «из молока в молоко» с целью получения обогащенного кисломолочного продукта с пролонгированным сроком годности. Разработан метод количественного определения лактоферрина в молоке и молочных продуктах. Разработаны две новые технологии - извлечение лактоферрина из сырого молока и производство обогащенного биойогурта. Для широкой реализации разработана необходимая техническая документация — ТУ 9224-46800419785-09 «Белок мблочный сывороточный «Лактоферрин» и ТУ 9222469-00419785-09 «Биойогурт «Лактоферрель», обогащенный лактоферрином», которые находятся в стадии согласования.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод количественного определения лактоферрина в молоке и молочных продуктах с использованием твердофазного неконкурентного иммуноферментного анализа на основе поликлональных антител к коровьему лактоферрину. Точность метода составляет 97,5%, чувствительность - 11 нг/мл, продолжительность анализа - 4-5ч

2. Обоснован выбор молочного сырья для использования его в качестве источника лактоферрина. С целью получения максимального количества лактоферрина в промышленных условиях рекомендовано использовать сборное сырое молоко

3. Разработана технология извлечения лактоферрина из сырого молока. При этом соотношение сорбента SP-Sepharose Big Beads к сырому молоку составило 1:303; скорость потока молока - 300 см/ч; рН процесса адсорбции -6,5; элюирование в линейном градиенте концентрации хлорида натрия 0,1 - 1,0М в 0,05 М натрий-фосфатном буфере с рН-6,5; скорость элюирования - 300 см/ч; сбор фракций, содержащих лактоферрин, при концентрации хлорида натрия равной 0,6М -позволившие увеличить степень извлечения лактоферрина с 75 до 90%

4. Предложена новая схема переработки сырого молока, поступающего на предприятия, заключающаяся в предварительном извлечении из него лактоферрина и последующем направлении этого сырого молока на производство молочных продуктов

5. Установлены антимикробные по отношению к бактериям группы кишечных палочек и бифидогенные по отношению к Bifidobacterium adolescentis МС-42 свойства лактоферрина, проявляющиеся при дополнительной дозе белка равной 500 мг/л молока. Данная доза рекомендована для-обогащения биойогурта

6. Разработана технология биойогурта, обогащенного лактоферрином. На основании результатов исследований органолептических, физико-химических, микробиологических и реологических показателей в процессе хранения обоснован срок годности биойогурта, обогащенного лактоферрином, составляющий - 20 суток, в сравнении с контролем без ЛФ, имеющим срок годности - 5 суток

7. Проведена апробация технологии извлечения лактоферрина и технологии биойогурта, обогащенного лактоферрином; разработана техническая документация на производство лактоферрина и биойогурта, обогащенного лактоферрином ("Белок молочный сывороточный "Лактоферрин" ТУ 9224-468-00419785-09 и "Биойогурт "Лактоферрель", обогащенный лактоферрином" ТУ 9222-469-00419785-09). Дополнительная прибыль от реализации биойгурта, обогащенного ЛФ, составляет 1630 руб./т в год при объемах годового выпуска продукта 6 тыс. тонн.

1. Абдулина Е.Р. К вопросу о переработке молочной сыворотки/ Мат. II Всерос. научно-техн. конф. "Современные достижения биотехнологии". Ставрополь, 2002. - т.2. - с. 67-68.

2. Артюхова С.И., Лашина Н.В. Использование пробиотиков в биотехнологии домашнего сыра для функционального питания: Монография.- Омск: Изд-во ОмГТУ, 2005. с.3-14.

3. Банникова Л.А, Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Микробиологические основы молочного производства: Справочник/ Под ред. канд. тех. наук Я.И.Костина. — М.: Агропромиздат, 1987. — 400с.

4. Батурин А.К., Мендельсон Г.И. Питание и здоровье: проблемы XXI века//Пищевая промышленность.- 2005.- №5.- с.105-107.

5. Беленький Н.Г. Методические рекомендации по определению биологической ценности продуктов животного происхождения.- М.: ВАСХНИЛ, 1976.- с.75.

6. Белки: Том 1. Химия белковых веществ/ Под ред. Г. Нейрата, К. Бейли, пер. с англ. З.З.Высоцкий. М: Изд-во иностранной литературы, 1956.-с. 23.

7. Биологически активные вещества молока/ A.M. Шалыгина, Н.А. Тихомирова, И.И. Ионова и др. М.: АгроНИИТЭиПП, 1997.- 16с.

8. Бифидобактерии:' биология, роль в жизнедеятельности человека и животных. Производство бифидосодержащих продуктов/ А.В. Гудков, С.А. Гудков, М.Я. Козловская и др. Углич: ВНитс, 1999. - 64с.

9. Бифидобактерии и использование их в молочной промышленности: Обзорная информация/ Л.В.Красникова, И.В.Салакова, В.И.Шаробайко и др.- М.: АгроНИИТЭИММП.- 1991.- 32с.

10. Бифидокефир — лечебно-профилактический продукт/ А.В.Молокеев, В.И.Байбаков, Т.Л.Карих и др.// Пищевая промышленность.-1998.-№3.-с.61-62.

11. Бренц М.Я., Козлов В.Н. Молочные продукты, полезные всем. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. — 128с.

12. Брык М.Т., Голубев В.Н., Чагаровский А.П. Мембранная технология в пищевой промышленности,- Киев: Урожай, 1991.- 224с.

13. Василевская Л.С., Охняковская Л.Г. Физиологические основы проблемы питания// Вопросы питания.- 2002.- №2.- с.42-45.

14. Волгарев М.Н. О нормах физиологических потребностей человека в пищевых веществах и энергии: ретроспективный анализ и перспективы развития// Вопросы питания.-2000.- №4.- с.3-7.

15. Волосникова И.В., Шендеров Б.А. Холестеринмодифицирующая активность лактобацилл и продукта питания направленного действия in vitro и in vivo// Тезисы конференции "Дисбактериозы и эубиотики".-Москва, 1996.- с.9.

16. Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии. —М.: МГУД995.- 288с.

17. Воробьева Н.В. Иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез: Теория и практика. Учебное пособие для Вузов,- Изд-во научный мир, 2006.- 80 с.

18. Гаврилова Н.Б. Современные аспекты технологии молочных и молокосодержащих продуктов с пролонгированными сроками хранения.- Омск: Вариант-Омск, 2007.- с.29-50.

19. Гельдыш Т.Г. Продукты для повышения адаптивных возможностей организма// Пищевая промышленность.- 2005.- №2.- с.58-59.

20. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов/ М.: Легкая и пищевая промышленность.- 1984.-344с.

21. Гринин А.С., Рыбаков С.С. Радиоиммунологический анализ.- М.: Энергоатомиздат, 1984.- 121 с.

22. Девени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды, белки/ Пер. с англ. А.Н.Маца, под ред. и с предисл. Р.С.Незлина.- М.:Мир, 1976.-C.18-23.

23. Детские молочные продукты, обогащенные иммуноглобулинами: Обзорная информация/ С.В.Соболева, Е.Ю.Златник, Г.П.Шаманова и др.- М.: АгроНИИТЭИММП, 1991.-20с.

24. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. М.: Грантъ, 2002.-294с. 1

25. Доценко В.А. Теоретические и практические проблемы питания здорового и больного человека// Вопросы питания.- 2004.- №6.- с.36-39.

26. Евдокимов И.А. Синбиотические молочные продукты//Молочная промышленность.- 2004.- №4.- с.41-42.

27. Евдокимов И.А., Абдулина Е.Р. Мембранные технологии в молочной промышленности// Переработка молока.- 2001.-№4.-с.10-11.

28. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика иммуноферментного анализа.- М.: Высш. шк., 1991.- 288с.

29. Забодалова Л.А., Степанова Л.И. Кисломолочные напитки с улучшенными свойствами// Пищевая промышленность.- 2006.- №4.-с.66-67.

30. Зобкова З.С. Технологические и технические решения повышения стойкости в хранении биоактивных молочных продуктов// Молочная промышленность.- 2005.- №3.- с.38-43.

31. Зобкова З.С. Функциональные цельномолочные продукты// Молочная промышленность.- 2006.- №3.- с.46-52.

32. Зобкова З.С. Функциональные молочные продукты// Молочная промышленность.- 2006.- №4.- с.68-70.

33. Зобкова З.С. Пищевые волокна// Молочная промышленность.- 2006.-№10.- с.ЗО.

34. Зобкова З.С. Особенности технологии термизированных (пастеризованных) сквашенных молочных продуктов// Молочная промышленность.- 2006.- №12.- с.41-44.

35. Иммунологические методы/ Под ред. Г. Фримеля, Пер с нем. А.П. Тарасова. М.: Медицина, 1987. -с. 73-96, 128-148, 162-170.

36. Иммуноферментный анализ / Т. Т. Нго, Г. М. Ленхофф, А. Яклич и др.; Под ред. Т. Т. Нго, Г. Ленхоффа; Пер. с англ. С. В. Калугера, А. Л. Остермана; Под ред. А. М. Егорова.- М.: Мир, 1988 444 с.

37. Иммуноферментный анализ для диагностики туберкулеза животных. Приготовление реагентов тест-системы и методика постановки реакции: Метод, рекомендации/ ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных, Моск. НИИ туберкулеза: Омск, 1990. 11 с.

38. Канышкова Т.Г., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Лактоферрин и его биологические функции // Биохимия.- 2001.-том 66; вып.1,- с.5-13.

39. Караваев Б.Е. Способ получения, физико-химические и иммунохимические свойства лактоферрина коров: Автореф. дис. канд. биол. наук/Моск. вет. акад. им. К.И.Скрябина. М., 1984.

40. Келли A.JL, Фокс П.Ф. Нативные ферменты молока// Молочная промышленность.- 2007.- №8.- с.32-33.

41. Кисиль Н.Н., Тер-Саркисян Э.М. Аминокислотные смеси из белков творожной сыворотки// Молочная промышленность.- 2006.- №12.- с.48-49.

42. Косиковский Ф.В., Браун Д.П., Рост микроорганизмов, вызывающих порчу кисломолочных продуктов, расфасованных в среде инертного газа// Труды XVIII Международного конгресса по молочному делу. — М.: Пищевая промышленность.- 1972.- с.273.

43. Кочеткова А.А. Функциональные продукты в концепции здорового питания// Пищевая промышленность.- 1999.- №3. с.4-5.

44. Кочеткова А.А., Тужилкин В.И. Функциональные пищевые продукты: некоторые технологические подробности в общем вопросе// Пищевая промышленность.- 2003.- №5.- с.8-10.

45. Кравченко Э.Ф., Волкова Т.А. Использование молочной сыворотки в России и за рубежом// Молочная промышленность.- 2005.- №4.- с.56-58.

46. Кривоносова А.В., Хамагаева И.С., Раднаева Р.Б. Биотехнологический потенциал пропионовокислых бактерий// Молочная промышленность.-2007.-№ 11.- с.30-31.

47. Лактоферрин: свойства и применение/ Е.Н.Бейкер, Х.М.Бейкер, Н.Кун, Р.Д.Кидд//Молочная промышленность.- 2006.- № 2.- с.38-39.

48. Ламберт Д.С. Использование лактопероксидазы для консервирования молока//Молочная промышленность.- 2003.- №3.- с.51.

49. Меллентин Дж. Америка открывает функциональные продукты// Молочная промышленность.- 2007.- №10.- с.70.

50. Новое в производстве молока с увеличенным сроком хранения/ М.А. Барбашина, А.Н. Пономарев, Г.П. Шуваева и др.// Молочная промышленность.- 2005,- № 8.- с.56-57.

51. Новые методы иммуноанализа/ М.Тертон, Д.Р.Бангхем, К.А.Колкотт и др.; Под ред. У.П.Коллинз; Пер. с англ. С.А.Еремина, В.И.Тишкова; Под ред. А.М.Егорова.-М.: Мир. Редакция литературы по химии, 1991.-280с.

52. Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации. Методические рекомендации MP 2.3.1.2432-08.

53. Методические рекомендации по применению метода иммуноферментного анализа для выявления ротавируса и специфических антител.- М.: ВАСХНИЛ. Отделение ветеринарии, 1984. 11 с.

54. Онипко В.Д. Молоко: обыкновенное чудо. Рецепты здоровья. СПб: ИД "Весь", 2003.- 128с.

55. Онищенко Г.Г. Качество продуктов питания: Гигиенические требования, стандарты качества// Вопросы питания.- 2004.- №6.- с.9-13.

56. Панфилова И.Е. Молоко и здоровье. 2-е изд., перераб. и доп. — Мн.: Уроджай, 1985.- 159с.

57. Петров Р.В. Иммунология.- М.: Медицина, 1987.-е. 60.

58. Питание в борьбе за выживание/ В.А. Тутельян, Б.П. Суханов, М.Г. Гаппаров, В.А. Кудашева, М.: ИКЦ "Академика", 2003.- 448с.

59. Пищевая химия/ Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А. и др./ Под ред. А.П. Нечаева.- СПб.: ГИОРД, 2004.-е. 560-605.

60. Пищевые волокна в продуктах питания/ Л.Г.Ипатова, А.А.Кочеткова, А.П.Нечаев и др.// Пищевая промышленность.-2007.-№5.-с.8-10.

61. Политика здорового питания/ Покровский В.И., Романенко Г.А., Княжев В.А. и др.- Новосибирск: Сибирское университетское издательство,2002.- 344с.

62. Получение и использование белков подсырной сыворотки: Обзорная информация/ П.Ф. Крашенинин, В.М. Богданов, А.Г. Храмцов и др.-М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1973.-c.4-10.

63. Прилепина И.А. Результаты применения бифидо- и лактосодержащих препаратов, биологически активной добавки "Наринэ' в амбулаторных исследованиях // Мат. 1-го Всерос. Конгресса "Питание детей XXI век".- Москва, 2000.- с. 127.

64. Применение иммуноферментного анализа в медицине: Тез. докл. респ. науч. конф., 28-29 ноября 1989г./ Редкол.: Л.Т. Малая (отв. ред.) и др.-Харьков: Б.и., 1989-128 с.

65. Производство и использование белков молочной сыворотки в лечебно-диетическом питании: обзорная информация/ А.Г. Храмцов, Г.И. Молчанов, В.Е. Жидков, Л.В. Лунькова.- М.: АгроНИИТЭИПП. Сер. Молочная промышленность.- 1993.- 32с.

66. Рогов И.А. Синбиотики в технологии продуктов питания.- М.: МГУПБ, 2006.-217с.

67. Рогов И.А., Титов Е.И., Тихомирова Н.А. Глубокая переработка молока на основе нанотехнологий для получения биопрепаратов// Хранение и переработка сельхозсырья.-2003.- №11.- с.51-53.

68. Рогов И.А, Титов Е.И., Тихомирова Н.А. Нанотехнология биопрепарата "Милканг" на основе глубокой переработки молочного сырья// Пищевые ингредиенты: сырье и добавки.- 2006.- №2.- с.78-80.

69. Рогожин В.В. Биохимия молока и молочных продуктов: Учебное пособие.- СПб: ГИОРД, 2006. с.35-40.

70. Свириденко Ю.Я. Научное обеспечение промышленной переработки молочной сыворотки// Молочная промышленность. -2006.- № 6.-С.18-19.

71. Семенихина В.Ф., Сундукова М.Б. Использование бифидобактерий при выработке детских кисломолочных продуктов// Молочная промышленность.- 1980. №3. - с.33-34.

72. Соколовский В.П., Вольфан Г.Г. Пищевая и лечебная ценность молока и молочных продуктов.- М.: Пищевая промышленность, 1968. — 80с.

73. Состав и свойства молока как сырья для молочной промышленности: Справочник/ Н.Ю. Алексеева, В.П. Аристова, А.П. Патратий и др./ Под ред. канд. тех. наук Я.И. Костина. М.: Агропромиздат, 1986.- 239с.

74. Спиричев В.Б., Шатнюк JI.H., Позняковский В.М. Обогащение пищевых продуктов витаминами и минеральными веществами. Наука и технология/ Под общ. ред. В.П. Спиричева.- Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004.- с.3-12 (548с.)

75. Стейнметц М., Стефан Д., Дастурникц Г. Иммунологические методы исследований: Монография.- М.: Мир, 1988.- 530 с.

76. Тамим А.И., Робинсон Р.К. Йогурт и аналогичные кисломолочные продукты: научные основы и технологии/ Пер. с англ. под науч. ред. Л.А. Забодаловой. СПб: Профессия, 2003. - 664с.

77. Технология упаковочного производства/ Т.И. Аксенова, В.В. Ананьев, Н.М. Дворецкая и др./ Под общей ред. Э.Г. Розанцева. М.: Колос, 2002.-183с.

78. Тихомирова Н.А. Природный и рекомбинантный ангиогенин. Свойства и количественный анализ: Монография.-М: Пищевая промышленность, 1999.- с.4-22.

79. Тихомирова Н.А. Технология продуктов функционального питания. -М: ООО "Франтера", 2002.- 213с.

80. Тихомирова Н.А. Нанотехнология и биотехнология продуктов функционального питания на молочной основе// Молочная промышленность.- 2005,- №5. с.74-75.

81. Тихомирова Н.А., Г.С.Комолова, И.И.Ионова. Биологически активные белки молока: Учеб. пособие для студентов вузов по направлению260300 Технология сырья и продуктов животного происхождения, для специальностей 260303, 260100.- М.гМГУП, 2004.-80с.

82. Токаев Э.С., Баженова Е.Н., Мироедов Р.Ю. Сывороточные белки для функциональных напитков// Молочная промышленность.- 2007.- №10.-с.55-56.

83. Тутельян В.А. Нутрициология как основа современной диетологии// Материалы I Съезда диетологов и нутрициологов "Диетология: проблемы и горизонты". — М., 2006.- с. 5-7.

84. Тутельян В.А., Княжев В.А. Реализация концепции государственной политики здорового питания населения России: научное обеспечение// Вопросы питания.- 2000.- №3.- с.4-7.

85. Тутельян В.А., Спиричев В.Б., Шатнюк JI.H. Коррекция микронутриентного дефицита — важнейший аспект концепции здорового питания населения России// Вопросы питания,- 1999.- №1.-с.3-11.

86. Уголев A.M. Теория адекватного питания и трофология,- СПб.: Наука,1991.-С.141-155.

87. Уильяме К., Сэндерс Т. Связь между здоровьем и потреблением белка, углеводов и жира //Вопросы питания.- 2000.-№3.- с.54-57.

88. Федоренко Б.Н. Основы мембранной биотехнологии.-М.: МТИПП,1992.-91с.

89. Фрампольская Т.В. Бифидобактерии и их использование в технологии молочных продуктов: Учебное пособие. — Краснодар: Изд-во КРИА, 2000. 40с.

90. Химия пищи: Кн.1: Белки, структура, функции, роль в питании/ И.А.Рогов, Л.В.Антипова, Н.И.Дунченко, Н.А.Жеребцов.-М.: Колос, 2000.-382 с.

91. Храмцов А.Г. Молочная сыворотка.- М.: Агропромиздат, 1990.-240с.

92. Храмцов А.Г. Российская лактулоза — XXI век. Научные основы, производство и использование/ Под общей ред. Храмцова А.Г. М.: МИИТ, 2000. - 110с.

93. Храмцов А.Г., Абдулина Е.Р., Евдокимов И.А. Микрофильтрация молочного сырья: Обзорная информация.-М.: АгроНИИТЭИММП, 1991.-C.21-26.

94. Храмцов А.Г., Нестеренко П.Г. Технология продуктов из молочной сыворотки: Учебное пособие. М.: ДеЛи принт, 2004. - 587с.

95. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса// Вопросы питания.- 1999.-№2.- с.32-39.

96. Шендеров Б.А. Медицинская и микробная экология и функциональное питание, в 3-х томах.- М.: Грантъ, 2001.

97. Шендеров Б.А., Труханов А.И. Продукты функционального питания: современное состояние и перспективы их использования в восстановительной медицине// Вестник восстановительной медицины.-2002.- №1. с.38-42.

98. Щербакова Э.Г. Лизоцимсодержащие композиции в составе лечебного питания детей// Хранение и переработка сельхозсырья.-2006.- №4.-с.52-56.

99. Энтеральное питание в комплексной терапии и профилактике заболеваний/ Т.С.Попова, А.Е.Шитопалов, Г.Ю.Сажников// Вопросы питания,- 2004.-№ 3.- с.7-11.

100. Юркина Э.А. Набор реагентов для количественного определения лактоферрина в сыворотке крови человека «Лактоферрин-стрип»// Новости «Вектор-Бест».-1997.-№5.-с. 15-16.

101. Яковлев А.Т., Зыкин Л.Ф., Рыбкин B.C. Иммуноферментный анализ в микробиологии/ Под. Ред. Н.Г. Тихонова.-Саратов: Изд-во Сарат. Унта, 1990.- 108 с.

102. Antibacterial effects of bovine lactoferrin against udder pathogens/ T.Kutila, S.Pyorala, H.Saloniemi, L.Kaartinen// Acta. Vet. Scand.-2003.-Vol.44.- №1.- P.35-42.

103. Bear A., Oroz M., Blanc B. The use of the micro-complent fixation as a tool for study of heat-induced modification of whey proteins// Milchwissenshaft-1976.- Vol.31,- №11.- P.649-652.

104. Broihier K. Milking and nutritional market new application abound for milk and whey// Food Processing.- 1999.- Vol.60. №3. - P.41-43.

105. Chandan R.C. Enhancing market value of milk by adding cultures// J.Dairy Sci.- 1999. Vol.83. - №10. - P.2245-2256.

106. Choi H.K., Vasavada P.C. and Marth E.H. Inactivation of milkborne patogens with microwave energy// J.Daiiy Sci.- 1992.- Vol.75.- P. 130.

107. Cordon W.G., Ziegler Y., Basch J.J. Isolation of an iron-binding protein from cow's milk//Biochim. Biophys. Acta.-1962.-Vol.60.- №2,- P.410-411.

108. Deeprose J. Cover Story: Dairy Ingredients// International Food Ungredients.-2000.-№3. P.7-10.

109. Dupont D. et al. Determination of bovine lactoferrin concentrations in cheese with specific monoclonal antibodies// Int. dairy J.-2006.- Vol. 16.-issue 9.-p. 1081-1087.

110. Ellison R.T., Gieht T.J. Killing of gram-negative bacteria by lactoferrin and lisozime // J.Clin. Invest.- 1991. Vol.88. - P.1080-1091.

111. Fook L.J., Fuller R., Gibson G.R, Prebiotics, probiotics and human gut microbiology/ZInter Dairy J. 1999. - Vol.9. - №1. -P.53-61.

112. Geilman W.G., and Schmidt D.E. Physical characteristics of frozen desserts made from ultrafiltered milk and various carbohydrates// J.Dairy Sci.- 1992.-Vol.75. P.2670-2675.

113. Hill R.O., Zadov J.J. The precipitation of whey proteins with water soluble polymers //New Zeland I Sci and Tech. 1978. - Vol.13. - P. 61-64.

114. Holcomb J.E., Frank J.F., Mcgregor J.U. Viability of Lactobacillus acidofillus and Bifidobacterium bifidum in soft-serve frozen yogurt// Cult.Dairy ProdJ. 1991. - Vol. 26(3). - P.4-5.

115. Huang Chienjung. Production of yogurt using Bifidobacteria/ZDairy Sci.Abstracts. 1995. - Vol.57. - №4. -P.451.

116. Isolation and characterization of porcine milk lactoferrin/ Chu R.M.; Wang S.R.; Weng C.N.; Pursel V.G.// Am.J.veter.Res.- 1993.- Vol. 54.-№ 7. p. 1154-1159.

117. Jankowska A., Reps A., Prozek A., Krasovska M. Applyng high pressure to yogurt preservation// Proceedings of the 17th Forum Applied Biotechnology, Parts I and II, 18-19 September 2003, Universitet Gent, Belgium, P.477-480.

118. Kumar R., Sarkar S., Misra A.K. Effect of nisin on the quality of dahi// J.Daiting Fd.Home Sci.- 1998.- Vol.17.- P. 13-24.

119. Kussendrader ' K.D., Van Hooijdonk A.C. Lactoperoxidase: physicochemical properties, occurrence, mechanism of action and applications// Brit. J. of Nutrition.- 2000.- Vol.84.- P. 19-25.

120. Laemli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T-4//Nature.- 1970.- Vol.227.- P. 680-685.

121. Lactoferricin of bovine origin is more active then lactoferricins of human, murine and caprine origin/ Vorland L.H., Vlvante H.5 Andersen J., Haukland//Scand.J.Infect.Dis.-1998.-Vol.30.-P.513-517.

122. Lactoferrin an iron-binding protein in neutrophonic leucocytes/ Masson P.L., Hermans J.F., Schone M.D., Schole E// J. Exp.Med.- 1969.- Vol. 130.-№26.- p. 643-654.

123. Lonnerdal В., Iyer S. Lactoferrin: molecular structure and biological function// Annu.Rev.Nutr. -1995.- Vol.15.- P.93-110.

124. Maheshwari R.K. Bhatia K.L. Lactoferrin concentration in buffalo mastitis milk//Indian J. anim. Sc.- 1990.- T. 60.- № 12. p. 1512-1513.

125. Masson P.L., Hermans J.F., Dive C. An iron-binding protein common to many external secretion// Clin. Chim. Acta.- 1966.-Vol.14.- №3.- p. 735739.

126. Ordonez G.A., Jeon I .J., Roberts H.A. Manufacture of frozen yogurt with ultrafiltered milk and probiotic lactic acid bacteria// J. of Food Processing and Preservation. 2000.- Vol. 24.- №2.- P. 163-175.

127. Orsin N. The antimicrobial activity of lactoferrin: current status and perspectives// Biometals.-2004.-Vol. 17.-P. 186-196.

128. Pakkanen R., Aalto J. Growth factors and antimicrobial factors of bovine colostrums // Int. Dairy J.- 1997.-Vol.7.- P.285-297.

129. Paz M.T., Queip'o Y., Nunez de Villavicencio M. Extendihg the shelf-life of an aromatized yogurt// Alimentaria.-2002.- Vol.39.- P.39-42.

130. Potter D. Positive Nutririon-Making it Happen//Food Ingredients Europe.

131. Conference Processing.-1995.- p. 180.

132. Rasic Y.L., Kurmann I.A. Bifidobacteria and their role. Microbiological, nutritional-physiologal, medical and technological aspects and bibliography.- Borknauser Verlag, Rasel. Boston. Stuttgart, 1983.- 1222p.

133. Rejman J.J.; Hurley W.L.; Bahr J.M. Enzyme-linked immunosorbent assays of bovine lactoferrin and a 39-kilodalton protein found in mammary secretions durins involution// J. Dairy Sc.-1989.- T. 72.- № 2. p. 555-560.

134. Reps A., Warminska-Radyko i., Krzyzewska A., Tomasik J. Effect of high pressure on Streptococcus salivarius subsp. Thermofillus// Milkchwiss.-2001.- Vol.56.-P.131-133.

135. Roberfroid M.B. Prebiotics and probiotics: are they functional foods ?//Am. J.Clin.Nutr.- 2000.- Vol.71.- (Suppl.6).- P. 1682s-1987s.

136. Russele Panline. Yogurt and fermented milks a changing area// Milk Ind Int. 1996.- Vol.98.- №11- p.5A-6A, 8A-9A.

137. Sarkar S.P. Shelf-life extension of cultured milk products// Nutrition and Food Science.- 2006.- Vol.36.- №1.- P.24-31.

138. Sarkar S.P., Dave J.M., Sannabhadti S.S. Effect of thermization of misti dahi on shelf-life and Beta-D-galactosidase activity// Indian J.Dairy Sci.-1992.- Vol.45.- P.135-139.

139. Sarkar S.P., Misra A.K. Role of lactoperoxidase system on preservation of milk// Indian J.Dairy Sci.- 1994.- Vol.47.- p.809-819.

140. Schanbacher F.L., Smith K.L. Electroimmunodiffusion on cellulose acetate: a rapid metod for analyses of bovine lactoferrin in chromatography// An. Biochem.- 1974.-Vol.59.- №1.- p. 235-247.

141. Schanbacher F.L, Talhouk R.S., Murray F.A. Biology and origin of bioactive peptides in milk// Livestock Food Sci.-1997.-Vol 50.- P.105-123.

142. Stadhouders J, Van Dijk R. Heat pasteuriseren van yogurt// Nizo-Mededeling.-1973.- Vol.7.- P.63-76.

143. Steijns Jan M., van Hooijdonk A.C.M. Occurrence, structure, biochemical properties and technological characteristics of lactoferrin// British Journal of Nutrition.- 2000.-Vol.84.- Suppl. l.-P. sll-sl7.

144. United States Patent № 4087559, МГЖ A23C9/12 (20060101); A23C9/123 (2006101). Fermented milk containing viable bifidobacteria/ M.Masahiko, M.Mitsuo, N.Kei, S.Kiyohiro, I.Takashi № 05/735412; заявл. 26.10.1976: опубл. 02.05.1978.

145. Var I., Sahar N., Kabak В., Golge O. The effects of natamicin on the shelf-life of yogurt// Arcniv fur lebensmittelhygiene.-2004.-Vol.55.- P.7-9.

146. Yalow RS. Radioimmunoassay// Annu Rev Biophys Bioeng.- 1980.- №9.-p. 327.

147. Yang I.S., Wu S.C., Wang S.R. Serum and milk lactoferrin concentration and the correlation with some blood components in lactating sows// Res.in veter. Sc.- 2000.- Vol. 69.-№ 1. p. 95-97.

148. Yoshida S., Wei Z., Shinmura Y., Fukunaga N. Separation of lactoferrin-a and -b from bovine colostrums// J.Dairy Sci.-2000.-Vol.83.-P.2211-2215.

149. Zeimer C.J., Gibson G.R. An overview of probotics, prebiotics and synbiotics in the functional food concept perspectives and future strategies// Inter. Dairy J. 1998. - Vol. 8 - №5/6. - P.437-479.