автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Технология получения биологически активного комплекса "иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза" из вторичного молочного сырья

На правах рукописи

003483857

ИЛЬИНА АННА МИХАЙЛОВНА

ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА «ИММУНОГЛОБУЛИН-ЛАКТОФЕРРИН-ЛАКТОПЕРОКСИДАЗА» ИЗ ВТОРИЧНОГО МОЛОЧНОГО СЫРЬЯ

05.18.07 — Биотехнология пищевых продуктов

|1 ЗпОл2

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва 2009

003483857

Работа выполнена на кафедре «Технология молока и молочных продуктов» ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» и научно-учебном отделе биохимических проблем экологии Института биохимии им А.Н.Баха РАН.

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор

Защита диссертации состоится «09» декабря 2009 г. в 11-00 часов на заседании Диссертационного совета Д212.149.01 при ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии».

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Автореферат размещен на сайте www.msaab.ru «_» • 2009 г.

Официальные оппоненты:

Комолова Галина Сергеевна

Доктор технических наук, старший научный сотрудник

Бобренёва Ирина Владимировна

Кандидат технических наук, доцент

Острецова Надежда Геннадьевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Воронежская государственная

технологическая академия» (ВГТА)

Ученый секретарь Диссертационного сове1 кандидат технических наук, профессор

А.Г. Забашта

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Ухудшение здоровья населения, связанное с ростом вторичных иммунодефицитных состояний определяет необходимость повышения неспецифической резистентности здоровых и больных людей, улучшения функционирования естественных систем детоксикации и механизмов обеспечения иммунобиологической реактивности организма. Это становится возможным за счет использования в питании физиологичных безвредных природных соединений и их сочетаний, действие которых направлено на коррекцию поврежденных функций обеспечения гомеостаза. Биологически активные белки — полифункциональные естественные факторы защиты живых организмов, участвующие в регуляции многих физиологических и иммунологических функций, полностью отвечают данным требованиям.

В молоке биологически активные белки, каждый из которых обладает целым рядом уникальных свойств, существуют в комплексе и за счет синергетического взаимодействия образуют полифункциональный защитный фактор. Однако в настоящее время практическое применение находят в основном монопрепараты на основе очищенной формы отдельных сывороточных белков, что ограничивает их функциональные возможности и позволяет создавать продукты и БАД только для специального питания узких групп населения. Сочетание биологически активных белков молока с учетом взаимного влияния компонентов может обеспечивать возможность создания высокоэффективных биологически активных препаратов и продуктов лечебно-профилактической направленности широкого спектра действия. Переработка молочного сырья с целью получения биологически активных веществ с сохранением их биологической активности является перспективным направлением развития биотехнологии. Особый интерес среди биологически активных защитных факторов молока представляют лактопероксидаза и лактоферрин — полноценные по аминокислотному составу и характеризующиеся высокой биологической активностью сывороточные белки, а также специфические защитные факторы молока — иммуноглобулины.

В связи с этим актуальной является разработка технологии получения комплекса биологически активных белков молока с учетом природного соотношения компонентов, их взаимного влияния, биологической активности и безопасности, перспективности его применения в качестве основы БАД и продуктов лечебно-профилактической направленности, а также эффективного способа получения разработанного комплекса, входящего в схему безотходной переработки молочного сырья.

Научной базой представленного исследования явились фундаментальные работы отечественных (И.А. Рогова, В.А. Тутельяна, А.Г. Храмцова, Г.С. Комоловой, Н.А. Тихомировой, А.М. Шалыгиной) и зарубежных ученых.

Целью настоящей работы является разработка технологии получения биологически активного комплекса «иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза» из молочного сырья, предназначенного для создания на его основе продуктов лечебно-профилактической направленности.

В соответствии с поставленной целью определены основные задачи исследований:

• Экспериментально обосновать компонентный состав комплекса «иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза» с учетом совместимости и функциональной взаимосвязи компонентов по тестам их биологической активности.

• Получить готовый комплекс в жидкой и сухой формах и изучить его физико-химические свойства, питательную ценность и биологическую активность по показателям: антимикробное действие, антиоксидантная активность.

• В экспериментах с животными исследовать токсичность и влияние при пероральном приеме разработанного комплекса на устойчивость к стрессовым воздействиям.

• Провести изучение и обосновать условия и сроки хранения комплекса.

• Разработать технологию получения комплекса из молочного сырья в рамках схемы его безотходной переработки.

• Провести апробацию комплекса в технологии производства молочных продуктов, на примере стерилизованного молока, в лабораторных и промышленных условиях.

• Разработать проект технической документации на производство биологически активного комплекса на основе лактоферрина, лактопероксидазы и иммуноглобулина.

Научная новизна работы.

Научная новизна представленной работы состоит в следующем:

• Обоснован состав и соотношение компонентов нового полифункционального комплекса «Л-ПФИ» (лактопероксидаза, лактоферрин, иммуноглобулин), полученного в нативном виде из молочного сырья.

• Установлены зависимости биологической активности компонентов «Л-ПФИ» от условий и сроков хранения комплекса.

• Обнаружен синергизм в действии компонентов комплекса «Л-ПФИ» по таким значимым показателям, как антиоксидантная активность и антимикробное действие.

• Показано, что разработанный комплекс при пероральном приеме повышает устойчивость животного организма к стрессовым воздействиям и физическим нагрузкам.

• Теоретически и экспериментально обоснована целесообразность обогащения молочных продуктов биологически активным комплексом «Л-ПФИ» для повышения их биологической ценности.

Практическая значимость работы

• Разработанная технология получения комплекса «Л-ПФИ» может быть одним из направлений безотходной переработки молочного сырья. Она предусматривает получение биологически активных белков в нативном виде

при сохранности качества исходного сырья, которое может быть использовано в дальнейшем для производства широкого ассортимента молочных продуктов.

• Разработан проект технической документации (ТУ, ТИ) на производство биологически активного комплекса БАП «Л-ПФИ» из вторичного молочного сырья.

• Проведена опытная промышленная выработка стерилизованного молока, обогащенного «Л-ПФИ», показавшая возможность использования разработанного комплекса для повышения биологической ценности молочных продуктов.

• Подана заявка на патент на способ получения биологически активного комплекса «Л-ПФИ» (лактопероксидаза, лактоферрин, иммуноглобулин) из вторичного молочного сырья и полученный этим способом БАП. Регистрационный номер заявки 2009122405 от 11.06.2009 г.

• Полученные результаты исследований внедрены в учебный процесс: разработаны и изданы учебно-методические указания к выполнению лабораторных работ для студентов, обучающихся по направлению 260100 — Технология продуктов питания по дисциплине «Биологически активные вещества сырья животного происхождения».

Работа выполнялась в рамках аналитических ведомственных целевых программ: «Развитие научного потенциала высшей школы (2007-2008)» по проекту «Исследование апо-лактоферрина коровьего молока — источника биологической основы препаратов-парафармацевтиков», «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010)» по проекту «Исследование минорных биомолекулярных белковых веществ молока и композиций на их основе, оценка биотехнологических свойств, показателей качества и безопасности, разработка прикладных основ использования».

Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на: научных чтениях с международным участием, посвященных 100-летию со дня рождения П.Ф. Дьяченко (Москва, 2006 г.); научно-технической конференции «Технология живых систем» (Москва, 2008 г.); II Всероссийской научно-практической конференции детских диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2008 г.); III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности» (Воронеж, 2009 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, 1 методическое указание для студентов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, объектов и методов исследований, экспериментальной части, содержащей 4 главы, выводов, библиографического списка, приложений. Основной текст работы изложен на 152 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 36 рисунков. Библиография представлена 181 источниками, в том числе 109 зарубежных авторов, количество приложений — 5.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследований.

В первой главе «Обзор литературы» проведен анализ научно-технической и патентной литературы. Рассмотрены свойства биологически активных белков молока. Проанализированы современное состояние рынка продуктов функционального назначения, информация об ассортименте функциональных продуктов и БАД на основе сывороточных белков молока, предназначенных для различных групп населения.

Во второй главе «Организация эксперимента. Объекты и методы исследований» представлена информация о стандартных и оригинальных методах исследований, применяемых в работе.

Объектами исследований являлись: комплекс биологически активных белков молока, включающий лактоферрин, лактопероксидазу, иммуноглобулине, обогащенное им стерилизованное молоко. В медико-биологических исследованиях физиологической активности комплекса использовали крыс-самцов линии Вистар в возрасте трех недель.

В работе использованы методы: препаративные — ультрафильтрация, катионнобменная хроматография; аналитические — спектрофотометрический (определение ферментативной активности лактопероксидазы), турбодиметрический (определение ферментативной активности лизоцима), амперометрический (определение антиоксидантной активности комплекса и его компонентов), метод ИФА (определение биологической активности лактоферрина и иммуноглобулина G), электрофорез белков в ПААГ. Антимикробную активность изучали на тест-штаммах энтеропатогенных тест-микробов: Escherichia coli АТСС 25922 и Staphylococcus aureus АТСС 6538 из коллекции НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи. Изучение токсичности и влияния комплекса на физическую выносливость и резистентность к стрессовым воздействиям проводили на экспериментальных моделях in vivo — белых крысах-самцах, в соответствии с МУК 2.3.2.721.-98 «Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище». Медико-биологические исследования проводились в виварии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Эксперименты проводились в 3-5 кратной повторности.

Статистическую обработку данных проводили с использованием методов математической статистики и нейросетевого моделирования.

В соответствии с поставленной целью и задачами исследований была разработана схема организации и проведения исследований (рис. 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В третьей главе «Основные аспекты создания и хранения комплекса на основе биологически активных сывороточных белков молока: лактоферрина, лактопероксидазы и иммуноглобулина» проведены исследования совместимости компонентов комплекса, рассмотрены факторы, влияющие на

Постановка цели п задач исследования

I Этап

II Этап

III Этап

IV Этап

Рис. 1. Схема проведения исследований 1

сохранность его компонентов, обоснованы условия и сроки хранения комплекса.

Взаимодействие белковых компонентов при создании комплексов в жидких средах зависит от их физико-химических свойств. В модельных экспериментах была изучена биологическая активность компонентов комплекса «иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза», обозначенного как «JI-ПФИ», в водных средах, широко используемых в фармакологии, медицине и пищевой промышленности: 0,05 М калийфосфатный буфер рН = 6,2-6,3; дистиллированная вода рН = 5,5-5,8; 0,09 % физиологический раствор с рН, близким к значениям данного показателя коровьего молока (6,6-6,7).

В исследуемые среды вносили лактопероксидазу, лактоферрин и иммуноглобулин G (коммерческие препараты) в соотношении, соответствующем среднему показателю, установленному для свежевыдоенного коровьего молока.

Для подбора режимов хранения разработанного комплекса в модельных экспериментах было проведено исследование влияния различных факторов (температура, асептические и неасептические условия, время хранения) на нативность компонентов комплекса «JI-ПФИ». Комплексы хранили от 3 до 168 часов при температурах плюс 20±2°С и плюс 4±2°С как без соблюдения правил асептики в открытой емкости, так и с соблюдением асептических условий.

На основании полученных данных было рассчитано время 50 % инактивации (Mj0) биологической активности компонентов комплекса (табл. 1).

Установлено, что при хранении компоненты модельного комплекса (в жидкой форме) не только не оказывают отрицательного влияния друг на друга, но и проявляют взаимное защитное действие. Наиболее выраженное взаимозащитное действие как лактопероксидазы, так и лактоферрина наблюдалось в физиологическом растворе. Вероятно, это связано с тем, что это изотонический раствор с рН, близким к рН молока, в котором защитный комплекс функционирует in vivo. Что касается иммуноглобулина G, то пролонгированию срока его хранения способствовала среда калийфосфатного буфера по сравнению с остальными применяемыми средами.

Важным фактором, влияющим на сохранность компонентов в процессе хранения, является соблюдение правил асептики. Так, хранение комплексов в асептических условиях способствовало пролонгированию их сроков хранения в среднем на 14-30 %.

В наибольшей степени в процессе хранения происходило изменение активности лактопероксидазы, в связи с этим она была выбрана в качестве тест-системы для проведения дальнейших исследований.

Для обеспечения увеличения сроков хранения жидкого комплекса изучали возможность включения в состав композиции фермента — лизоцима, который не только обладает консервирующим эффектом, но и способен усиливать антимикробное действие белков катионной фракции молока. Анализ данных указывает на перспективность применения лизоцима в качестве

консервирующего агента с целью пролонгирования сроков хранения жидкой формы комплекса сывороточных белков,

Таблица 1

И50 биологической активности белков в составе комплекса «Л-ПФИ» в неасептических условиях.

Лактопероксидаза

Вид среды И50, часы

1 = +4±2°С г = +20±2°С

Дистиллированная вода 21,5±1,9 5±0,4

Физиологический раствор 30,1±2,1 7,9±0,3

Калийфосфатный буфер, рН = 6,2-6,3 24,5±1,7 6,3±0,4

Лактоферрин

Дистиллированная вода 122,5±6,8 20,7±1,4

Физиологический раствор 148,б±8,7 2б±1,8

Калийфосфатный буфер, рН = 6,2-6,3 130,8±7,2 22,3±1,6

Иммуноглобулин в

Дистиллированная вода 59,1±2,б 46,4±2,3

Физиологический раствор 66±3,9 51,5±2,4

Калийфосфатный буфер, рН = 6,2-6,3 75,7±3,3 58±3,0

Одним из путей повышения хранимоспособности белковых комплексов является применение лиофилизации. Было проведено изучение влияния режимов лиофильного высушивания на нативность компонентов комплекса в процессе хранения. Показано, что при применяемых режимах лиофилизации (предварительное замораживание высушиваемых материалов до температуры минус 20-25 °С в среде жидкого азота с последующим удалением замороженной части влаги в вакууме при температуре минус 20±4°С и температурой досушки плюс 37±2°С) потеря активности компонентов не превышает 13 %.

Было установлено, что сроки хранения «Л-ПФИ» в сухой форме составляют: при температуре плюс 20±2°С — до шести месяцев; при температуре плюс 4±2°С — до 12 месяцев.

Высокий уровень ферментативной активности и отсутствие существенных изменений органолептических, физико-химических и микробиологических показателей в процессе хранения сухой формы комплекса позволяют говорить о целесообразности применения лиофилизации в качестве эффективного способа его консервирования.

В четвертой главе «Изучение биологических свойств и показателей безопасности комплекса «Л-ПФИ»» приведены данные исследования физиологической активности и токсического действия, биологической ценности, антиоксидантной и антимикробной активности созданного комплекса.

БАП "Л-ПФИ" ! 1 ■ | 1

.-.я- —1 1

Иммуноглобулин б I 1 ; 1 1 !

Лактоферрин I

Лактопероксидаза

О 50 100 150 200 250

Антиоксидантная активность, мг/г

Концентрации монопрепаратов:

лактоферрин — 21 мг/л;

лактопероксидаза — 29 мг/л;

иммуноглобулин в — 530 мг/л.

Измерения проводили на приборе Цвет Яуза-01-АА

Рис. 2. Проявление синергизма по антиоксидантной активности компонентами комплекса «Л-ПФИ»

Сывороточные белки обладают различным уровнем антиоксидантой активности (АОА) (рис. 2). Наибольшей АОА характеризуется лактоферрин, что можно объяснить способностью белка связывать железо и препятствовать реакции регенерации двухвалентного железа. Это приводит к ингибированию образования свободных радикалов — гидроксилрадикалов и супероксидных ионов. Наименьшим уровнем АОА характеризовались иммуноглобулины.

Сравнение суммарной антиоксидатной активности монопрепаратов сывороточных белков с уровнем данного показателя для комплекса свидетельствует о наличии синергетического эффекта при комплексовании белков.

Характер антиоксидантных свойств комплекса позволяет относить его к сисТёмам экзогенных антиоксидантов, поддерживающих уровень свободнорадикальных процессов в организме на безопасном для биологических структур уровне.

Компоненты созданного комплекса обладают широким спектром антимикробного действия. Так, иммуноглобулины обеспечивают антибактериальную защиту за счет действия комплемент-зависимого лизиса микробной клетки, лактоферрин — за счет способности снижать

резистентность микробных клеток к токсическому действию производных кислорода, изменять проницаемость наружной мембраны, создавать и поддерживать дефицит железа, лактопероксидаза — за счет образования бактерицидных нестабильных медиаторов (SCN, HOSCN, H02SCN, H03SCN). При этом лактоферрин и лактопероксидаза проявляют значительную активность в отношении грамотрицательной микрофлоры, иммуноглобулины — в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов.

Была изучена антимикробная активность монокомпоиентов и комплекса в отношении тест-штаммов E.coli и S.Aureus. Исследование влияния сывороточных белков на E.coli (рис. За) показало, что все изученные монокомпоненты комплекса оказывали ингибирующее действие на развитие клеток. В опытных образцах отмечено достоверное (р < 0,05) снижение количества клеток тест-культуры по сравнению с контролем в первые часы культивирования. Полученные результаты дают основание предполагать, что внесение монопрепаратов исследуемых белков в среду культивирования тест-штамма приводило не только к ингибированию развития клеток E.coli, но и вызывало их гибель, что в наибольшей степени проявлялось в течение первых трех часов культивирования. По прошествии этого периода остаточная микрофлора развивалась медленнее, чем в контроле. При этом наибольшей активностью в отношении тест-культуры E.coli обладала лактопероксидаза, наименьшей — иммуноглобулин.

Изучение комплекса показало, что он обладает большей антимикробной активностью по сравнению с суммарным действием всех входящих в него компонентов (р < 0,05), что позволяет говорить о наличии синергетического эффекта.

Время культивирования, Время культйзирования,

часы часы

а б

Рис. 3. Влияние монопрепаратов: лактопероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулина G и комплекса «JI-ПФИ» на развитие тест-штаммов Е. Coli (а) и S.Aureus (б) в процессе их культивирования

□ "Л-ПФИ" Р ЛФ

□ ЯП ет

□ иго £

В контроль 9

О!

р < 0,05

D "Л-ПФИ1 □ ИГ G ВЛФ и ЛП

О контроль р < 0,05

В случае с S.aureus (рис. 36) имеет место задержка роста микроорганизмов под воздействием как монокомпонентов, так и комплекса. В

течение первых трех часов культивирования в опытных образцах наблюдается логарифмическая фаза, в то время как в контроле происходит активный рост числа клеток. В опытных образцах, содержащих монокомпоненты, в процессе культивирования отмечается замедленный рост бактерий, что позволяет говорить об их бактериостатическом эффекте. Что касается комплекса, то он не только замедляет размножение клеток, но и вызывает их гибель, что дает основание говорить о бактерицидном эффекте комплекса. При сравнении суммарной антимикробной активности монокомпонентов и комплекса, так же как и в случае с E.coli, отмечен синергизм их действия.

Таким образом, комплекс вызывает гибель и замедляет рост грамотрицательных (Escherichia coli) и грамположительных (Staphylococcus aureus) бактерий.

Анализ аминокислотного состава «Л-ПФИ» показал, что по содержанию большинства незаменимых аминокислот комплекс превосходит «идеальный белок» (рис. 4).

ю

9 8 7 б 5 4 3 2 1 0

1- 5 - —

rf- sS

1 4 b I 1 H

1 4 —,— 1 1

2 3 4 5 6 7

Аминокислота Н идеальный белок Ш комплекс «Л-ПФИ»

Ось абсцисс — наименование аминокислоты:

1 — Изолейцин; 5 — Фенилаланин + Тирозин;

2 — Лейцин; 6 — Треонин;

3 — Лизин; 7 — Триптофан;

4 — Метионин + Цистин; 8 — Валин.

Ось ординат — содержание аминокислоты, г/100г белка

Рис. 4. Сравнительный анализ аминокислотного состава комплекса «Л-ПФИ» с «идеальным» белком

Для исключения возможного негативного действия разработанного комплекса на животный организм проводили изучение его токсичности на экспериментальных моделях — белых крысах-самцах. Крысы, находящиеся на общевиварном пищевом рационе, в течение 21 дня перорально получали с пищей исследуемый комплекс в десятикратной дозировке, в то время как животные контрольной группы его не получали.

Исследование по морфологическим показателям не выявило внешних проявлений патологических или воспалительных процессов во внутренних органах животных. На основании полученных данных был рассчитан интегральный показатель хронической интоксикации (ИПХИ), который не выявил каких-либо значимых различий у животных опытных и контрольной групп. Полученные данные свидетельствует о том, что десятикратное увеличение рекомендуемой физиологически эффективной дозы разработанного комплекса не оказывает токсичного действия на животный организм.

В экспериментах по изучению устойчивости животных к стрессовому воздействию участвовали крысы-самцы в возрасте трех недель с массой тела 80±2,3 г, которые были разделены на три группы. Экспериментальное наблюдение проводилось в течение 21 дня.

В первую группу (I) входили животные интактного контроля, которые содержались на общевиварном пищевом и питьевом рационе. Животные второй группы (II) содержались на том же рационе, но подвергались стрессовому воздействию в сочетании с гиподинамией в течение трех дней. Стрессовое воздействие создавали путем ежедневного подвешивания крыс в фиксированном положении по 18 часов ежедневно.

Животных третьей группы (III) подвергали тому же воздействию, что и животных второй группы, но на фоне общевиварного рациона они ежедневно в течение 21 суток получали исследуемый комплекс перорально в дозе 200 мкг.

В ходе эксперимента и после его окончания все животные выживали. Не отмечалось клинических отклонений в их состоянии. Существенных различий по поведенческим признакам по сравнению с контрольной группой не наблюдалось.

Изучение устойчивости животных к физическим нагрузкам, проводимое по продолжительности бега в третбане, показало, что используемое в работе стрессовое воздействие в значительной мере снижало способность животных к бегу вплоть до потери способности к движению. Введение в рацион питания комплекса «Л-ПФИ» повышало устойчивость животных к стрессовым воздействиям. Животные, в рационе которых присутствовал комплекс, выдерживали скоростную нагрузку в течение 12-15 минут, что составило 60-70 % продолжительности бега крыс контрольной группы. Животные, входившие в третью группу, адекватно реагировали на внешние раздражители (свет, шум), но они были вялыми, передвигались с неохотой. У животных второй группы присутствовали реакции на сильные внешние раздражители, хотя и заторможенные.

У крыс опытных групп по сравнению с контрольной группой не наблюдалось существенных различий по таким показателям, как длина тела и хвоста, абсолютной и относительной массе внутренних органов: почек, печени, селезенки, сердца, легких, головного мозга.

Важным показателем, отражающим глубину стрессовой реакции животного организма, является масса тимуса. Было установлено, что под влиянием стрессового воздействия происходило снижение массы тимуса у

животных опытных групп, однако у крыс, получавших комплекс (группа III), эффект был ниже, чем у крыс интактного контроля (рис. 5а). При введении в рацион питания комплекса «Л-ПФИ» масса тимуса оказалась в два раза выше, что свидетельствует о повышении устойчивости животных к стрессовому воздействию.

Известно, что значимым показателем природной устойчивости организма к неблагоприятным условиям внешней среды является уровень лизоцима в крови животных. Он отражает состояние реактивности защитных механизмов, что объясняется тесной связью лизоцима с системой фагоцитирующих клеток.

Ось абсцисс — группы животных: интактный контроль (1), опыт II (2), опыт III (3).

Ось ординат — абсолютная масса тимуса, г (а).

Ось ординат — концентрация лизоцима в сыворотке крови, мкг/мл (б) Рис. 5. Влияние приема крысами исследуемого комплекса

на массу тимуса (а) и на уровень лизоцима в сыворотке крови (б)

Как следует из данных, приведенных на диаграмме (рис, 56), уровень лизоцима в сыворотке крови животных опытных групп по сравнению с группой интактного контроля снижен в значительно меньшей мере у крыс, принимавших комплекс. Таким образом, на основании полученных данных по показателям устойчивости животных к стрессовым воздействиям, комплекс «Л-ПФИ» способствует повышению их иммунного статуса.

В пятой главе «Производство комплекса «Л-ПФИ» из вторичного молочного сырья» приводится экспериментальное обоснование процесса промышленного получения комплекса в составе схемы безотходной переработки молочного сырья.

С целью подбора источника получения компонентов биологически активного комплекса «Л-ПФИ» было изучено их содержание во вторичном молочном сырье. Из представленных данных (табл. 2) видно, что исследуемые биологически активные белки присутствуют во вторичном молочном сырье в различных концентрациях.

Различия по содержанию нативных биологически активных белков обусловлено технологическими факторами, применяемыми при производстве молочных продуктов.

Поскольку в обезжиренном молоке присутствуют все входящие в комплекс «Л-ПФИ» активные белки, оно может считаться наиболее перспективным источником их выделения.

С учетом проведенных исследований была разработана технологическая схема производства комплекса «Л-ПФИ» (рис. 6), которая может быть использована в рамках схемы безотходной переработки молочного сырья. Данная технология предусматривает получение комплекса в промышленных условиях на базе действующего предприятия по переработке молочного сырья. Следует отметить, что разработанный способ производства комплекса «Л-ПФИ» предполагает включение его в схему безотходной переработки молочного сырья.

Таблица 2

Содержание лактопероксидазы, лактоферрина и иммуноглобулина б в обезжиренном молоке и различных видах сыворотки.

№ Вторичное молочное сырье Содержание белков, мг/л

ЛП ЛФ ИГй

1 Обезжиренное молоко 27,30±3,25 22,63±2,68 487,23±54,41

2 Сыворотка подсырная («творог зерненный») отсутствует 8,11±6,25 380,45±45,98

3 Сыворотка подсырная (твердый сыр голландской группы) отсутствует 13,54±1,51 411,05±35,40

4 Сыворотка подсырная (сыр «Адыгейский») отсутствует 6,72±3,59 410,00±31,71

5 Сыворотка творожная (производство кварка методом УФ) отсутствует следы 43,00±3,5б

6 Творожная сыворотка (линия Я9-ОПТ) отсутствует 0,89±0,38 34,52±2,83

В лабораторных условиях по вышеописанной схеме проводились опытные выработки компонентов и комплекса «Л-ПФИ» из различных видов молочного сырья. При использовании разработанной технологической схемы получения комплекса «Л-ПФИ» наибольший выход биологически активных белков в нативном виде имеет место из обезжиренного молока. Он составляет до 91 % для иммуноглобулина в.

Анализ качества и безопасности является одним из основных этапов разработки новых видов биологически активных пищевых добавок.

Разработанный комплекс «Л-ПФИ» был проанализирован на соответствие требованиям действующего СанПиН 2.3.2.2351-08. Результаты исследований представлены в таблицах 3-5.

Анализ полученных результатов свидетельствует о соответствии характеристик требованиям действующих СанПиН 2.3.2.2351-08, что свидетельствует о его высоком качестве и безопасности применения, как для непосредственного употребления в пищу, так и в технологиях получения продуктов питания.

Проведены исследования основных функциональных свойств комплекса.

При изучении антиоксидантной активности не обнаружено достоверных различий в характеристике препарата, произведенного в лабораторных условиях по предложенной схеме, и образца, полученного из коммерческих препаратов (рис. 7).

Исследование антимикробной активности комплекса, полученного из обезжиренного молока, показало, что он также обладает высоким уровнем бактерицидного действия. Показано, что он вызывает гибель и замедляет рост грамотрицательных (Escherichia coli) и грамположительных (Staphylococcus aureus) бактерий.

О 50 100 150 200 250

Антиоксидантная активность, мг/г

Ось абсцисс — антиоксидантная активность, мг/г;

Ось ординат — биологически активные композиции:

1 — комплекс из коммерческих монопрепаратов;

2 — комплекс «Л-ПФИ»

Рис. 7. Антиоксидантная активность комплекса «Л-ПФИ» и комплекса из коммерческих монопрепаратов

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что комплекс «Л-ПФИ», полученный из различных источников, имеет идентичный уровень биологической активности.

На основе вышеизложенных данных можно сделать вывод, что полученный по разработанной схеме из вторичного молочного сырья комплекс «Л-ПФИ» обладает высокой биологической активностью, что позволяет

♦Ультрафильтрация с применением полисулъфонамидных мембран с селективностью пор

100 кДа и давлении 0,3-0,8 мПа. **Ультрафильтрацня с применением полисульфонамидных мембран с селективностью пор

30 кДа и давлении 0,3-0,8 мПа. ***Микрофильтрация с применением керамических мембран с селективностью пор

0,2 мкм и давлении 0,05-0,2 мПа. Пермеат I — лактоза, минеральные вещества, белки с молекулярной массой < 1 ООкДа. Пермеат II — лактоза, минеральные вещества, белки с молекулярной массой < 30кДа

Рис. 6. Схема получения комплекса «Л-ПФИ» в жидкой и сухой форме

рассматривать его в качестве основы БАД и продуктов лечебно-функциональной направленности.

Таблица 3

Органолептические показатели комплекса «JI-ПФИ»

Наименование показателя Показатели комплекса Показатели^ нормируем^ по СанПиН 2.3.2.2351-08

Внешний вид, консистенция Сыпучий однородный порошок. Допускается присутствие небольших комочков, легко рассыпающихся при механическом воздействии

Цвет, вкус, запах Цвет молочно-белый равномерный по всей массе порошка. Вкус сладковатый, без запаха

Таблица 4

Физико-химические показатели комплекса «Л-ПФИ»

Наименование показателя Показатели комплекса Показатели, нормируемые по СанПиН 2.3.2.2351-08

Массовая доля влаги, % 4,3±0,04 не более 5

Растворимость, сек 52±6 не более 60

Активная кислотность восстановленного продукта, рН, ед. 6,6-6,8 —

Таблица 5

Микробиологические показатели комплекса «Л-ПФИ»

Наименование показателя Показатели комплекса Показатели, нормируемые по СанПиН 2.3.2.2351-08

КМАФАнМ, КОЕ/г 3x103 не более 5x104

Содержание дрожжей и плесневых грибов в 1,0 г препарата, КОЕ не обнаружены не более 20

Бактерии группы кишечных палочек в 1,0 г препарата не обнаружены не допускаются

S. aureus в 0,1 г препарата не обнаружены не допускаются

Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, в 25,0 г препарата не обнаружены не допускаются

В шестой главе «Обогащение стерилизованного молока комплексом «Л-ПФИ»» на примере стерилизованного молока рассматривается возможность повышения биологической ценности продуктов питания за счет введения в их состав разработанного комплекса.

В таблице приведены данные о количественном содержании лактоферрина, лактопероксидазы и иммуноглобулина в в молочных продуктах массового потребления, в том числе предназначенных для детского питания (табл. 6).

Таблица 6

Содержание лактопероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулина (7 в жидких молочных продуктах

№ Наименование продукта Концентрация, мг/л

ЛП ЛФ ИГй

1 Молоко стерилизованное «Домик в деревне», 1,5 % * 3,62±0,29 243,25±23,08

2 Молоко стерилизованное «Можайское», 1,5 % • * следы

3 Молоко пастеризованное «Останкинское», 3,2 % * 13,11±2,36 384,71±41,11

4 Кефир «Домик в деревне», 1 % * 3,88±0,41 47,83±5,90

5 Кефир «Настенька», 2,5 % 2,96±0,31 42,74±3,33

6 Йогурт питьевой «Мечта», 1 % • 4,01±0,53 76,3б±6,41

7 Молоко стерилизованное «Агуша» с витаминами, 3,2 % * 4,24±0,38 176,6±19,21

8 Молоко стерилизованное «Тема» с кальцием для детей от 3 лет, 3,2 % * 5,04±0,45 211,83+21,90

9 Кефир детский «Агуша» с 8 месяцев, 3,2 % * 3,62±0,45 38,53±4,58

10 Кефир детский «Тёма» с 8 месяцев, 3,2 % * 4,47±0,32 41,23±4,81

11 Йогурт детский «Агуша» с 8 месяцев, 3,2 % * 8,14+0,76 36,79±4,22

12 Йогурт детский «Тёма» с 8 месяцев, 2,8 % —* 6,56±0,58 42,28+5,01

— отсутствует.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии лактопероксидазы в жидких молочных продуктах. Значительное снижение активности лактопероксидазы имеет место после температурной обработки, как при режимах пастеризации, так и стерилизации. Кроме того, высокотемпературное воздействие на этапе пастеризации усугубляется последующим изменением рН среды в результате сквашивания при производстве кисломолочных продуктов, что в свою очередь приводит к ее полной инактивации, в том числе в детских молочных продуктах.

Иммуноглобулин и лактоферрин менее чувствительны к технологическим факторам, чем лактопероксидаза, но и для них отмечается значительное снижение уровня в исследованных продуктах. В стерилизованном молоке содержится незначительное количество иммуноглобулина в и лактоферрина. Четкие различия обнаружены между уровнем иммуноглобулина О в молоке и кисломолочных продуктах. Критическим условием в этом случае является снижение рН среды при сквашивании молока.

Исследования образцов кефира, производимого для массового потребления, показали очень низкое содержание сывороточных белков. Лактопероксидаза в исследованных образцах не была обнаружена.

Творог и домашний сыр, являясь белковыми концентратами, характеризуются относительно высоким содержанием сывороточных белков по сравнению с другими молочными продуктами (табл. 7).

Таблица 7

Содержание лактопероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулина С в твороге

№ Наименование продукта Концентрация, мг/100г

ЛП ЛФ иге

1 Творог классический «Простоквашино», 9 % следы 9,32±0,90 7,47±0,75

2 Творог зернёный «БуаИа» 7 % следы 11,20±1,06 8,91±1,08

3 Творог «Благода», 5 % следы 6,86±0,55 1,13 ±0,27

4 Творог зернёный «Рузский», 4 % следы 12.41il.ll 7,70±0,78

5 Творог детский классический «Агуша» с 6 месяцев, 4,5 % ф 10,36+0,14 5,19±0,46

6 Творог детский классический «Тёма» с 6 месяцев, 5 % * 9,01 ±0,70 5^6,83

— отсутствует.

Возможно, это обусловлено тем, что при производстве высокобелковых молочных продуктов особое внимание уделяется этапам технологического

процесса, направленным на максимальное увеличение выхода белковых веществ в сгусток.

В целом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии или весьма низком содержании биологически активных, чувствительных к технологическим факторам сывороточных белков коровьего молока, необходимых для удовлетворения потребностей в них различных групп населения и, прежде всего, детей. Потеря биологически активных белков, входящих в защитный комплекс молока, в процессе технологической обработки резко снижает пищевую и биологическую ценность продуктов.

Эффективным способом решения этой проблемы является обогащение продуктов питания комплексами биологически активных сывороточных белков.

Как показано выше, наименьшее содержание биологически активных компонентов наблюдается в стерилизованном молоке. В связи с этим предложен способ обогащения стерилизованного молока комплексом биологически активных белков молока «Л-ПФИ». По рекомендованной технологической схеме целесообразно проводить внесение комплекса «Л-ПФИ» в охлажденное стерилизованное молоко после высокотемпературной обработки. При внесении комплекса «Л-ПФИ» в стерилизованное молоко качество продукта по его органолептическим и физико-химическим показателям не ухудшалось. Компоненты комплекса «Л-ПФИ» при внесении в продукт, сохраняя свою активность, придавали ему функциональные свойства.

Полученные данные позволяют рекомендовать комплекс для введения в состав БАД и продуктов функционального назначения с целью повышения их биологической ценности для направленного поддержания гомеостаза организма.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология нового полифункционального биологически активного комплекса на основе лактопероксидазы, лактоферрина и иммуноглобулина, выделенных из коровьего молока, которая позволяет более эффективно использовать компоненты молочного сырья. Выявлен синергизм в действии его компонентов.

2. Научно и экспериментально обоснованы состав и соотношение компонентов, с учетом их биологической активности и функциональной взаимосвязи.

3. Установлено, что комплекс «Л-ПФИ» обладает антибактериальной и антиоксидантной активностями и высокой биологической ценностью.

4. Показано отсутствие токсического эффекта на животный организм при пероральном приеме разработанного комплекса, а также, что комплекс обладает высокой физиологической активностью, выраженной в способности повышать устойчивость животного организма к стрессовым воздействиям и выносливость к физическим нагрузкам.

5. Изучена динамика изменения биологической активности компонентов комплекса «Л-ПФИ», на основании которой обоснованы условия и сроки его хранения. Установлено, что более рациональным способом консервирования комплекса «Л-ПФИ» является лиофильное высушивание, способствующее пролонгированию сроков хранения комплекса: при температуре плюс (20±2)°С — до шести месяцев; при

. температуре плюс (4±2)°С — до 12 месяцев.

6. В условиях промышленности апробирована технология обогащения стерилизованного молока биологически активным комплексом «Л-ПФИ». Введение в состав стерилизованного молока комплекса «Л-ПФИ» не оказывало отрицательного влияния на органолептические и физико-химические показатели готового продукта, но позволяло повысить его биологическую ценность.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Ильина, A.M. Биологически активный препарат на основе композиции куриного лизоцима и лактопероксидазы из коровьего молока / A.M. Ильина, Г.С. Комолова // Сборник материалов научных чтений, посвященных 100-летию со дня рождения проф. Дьяченко: научное издание. — М.: МГУПБ, 2006. — С. 161-162

2. Ильина, A.M. Новый комплексный биологически активный препарат из белков молока / A.M. Ильина // Питание и здоровье: Материалы II научно-практической конференции детских диетологов. — М.: 2008. — С. 41

3. Ильина, A.M. Антимикробные свойства комплексного препарата «ЛП-ЛФ-ИГ G» из коровьего молока / А.М. Ильина // Питание и здоровье: Материалы II научно-практической конференции детских диетологов. — М.: 2008. — С. 40

4. Ильина, А.М. Исследование влияния комплексного препарата «ЛП-ЛФ-ИГ G» из коровьего молока на некоторые физиологические показатели животного организма / A.M. Ильина, Г.С. Комолова // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы IV международной научной конференции студентов и молодых ученых. — М.: МГУПБ, 2008. —С. 149-150

5. Ильина, A.M. Перспективы обогащения детских продуктов биологически активными белками молока / A.M. Ильина, Г.С. Комолова, O.E. Овчинникова // Пищевая промышленность, № 3, 2009. — С. 27-28

6. Ильина, A.M. Природный консервант — комплексный биологически активный препарат «лизоцим-лактопероксидаза» / A.M. Ильина, Г.С. Комолова // Хранение и переработка сельхозсырья, № 5,2009. — С. 12-14

7. Ильина, A.M. Композиционный препарат «лактопероксидаза, лактоферрин, иммуноглобулины» / A.M. Ильина, Г.С. Комолова // Молочная промышленность, № 6,2009. — С. 70

8. Ильина, A.M. Содержание иммуноглобулина G и лактопероксидазы в молочных продуктах / A.M. Ильина, Г.С. Комолова, O.E. Овчинникова // Молочная промышленность, № 8, 2009. — С. 50-51

9. Ильина, A.M. Изучение влияния условий хранения на активность компонентов сухой формы БАЛ «Л-ПФИ» / A.M. Ильина, Г.С. Комолова // Материалы III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности». — Воронеж: ВГТА, 2009. ■— С. 71-74

10. Комолова, Г.С. Биологически активные вещества сырья животного происхождения / Г.С. Комолова, И.И. Ионова, A.M. Ильина // МУ к лабораторным работам для магистрантов, обучающихся по направлению 260100 — Технология продуктов питания. Магистерские программы: 260116 — Биотехнология продуктов животного происхождения и 260106 — Пищевая микробиология. — М.: МГУПБ, 2008. — С. 27

Список сокращений:

АОА — антиоксидантная активность; БАД — биологически активная добавка; БАП — биологически активный препарат; ИГ G — иммуноглобулин G;

ИПХИ — индекс показателей хронической интоксикации; ИФА — иммуноферментный анализ; ЛП — лактопероксидаза;

Л-ПФИ — лактопероксидаза, лактоферрин, иммуноглобулин;

ЛФ — лактоферрин;

ПААГ — полиакриламидный гель;

УФ — ультрафильтрация.

Автор выражает сердечную признательность за помощь сотрудникам научно-учебного отдела биохимических проблем экологии и коллективу вивария Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, а также коллективу ОАО «Молочный комбинат «Воронежский» за помощь в проведении опытно-промышленных испытаний.

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" ОГР № 1067746281514 от 15.02.2006г. Москва, Талалихина, 33

Подписано к печати 22.10.2009г. Формат 60x84/16. Бумага "Офсетная №1" 80г/м2. Печать трафаретная. Усл.печ.л. 1,55 Тираж 100. Заказ 294.

WWW.FRANTERA.RU

Введение.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологически активные белки молока.

1.2. Биологически активные белки молока в составе БАД и пищевых продуктах лечебно-профилактической направленности.

1.3. Комплексные препараты на основе биологически активных белков молока.

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Постановка эксперимента.

2.2 Препаративные методы.

2.3. Аналитические методы.

2.4. Микробиологические методы.

2.5 Медико-биологические исследования.

ГЛАВА 3 ОСНОВНЫЕ АСПЕКТЫ СОЗДАНИЯ И ХРАНЕНИЯ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЖОВ МОЛОКА: ЛАКТОПЕРОКСИДАЗЫ, ЛАКТОФЕРРИНА И

ИММУНОГЛОБУЛИНА G.

3.1. Получение комплекса на основе иммуноглобулина, лактопероксидазы и лактоферрина в жидкой форме.

3.2 Применение лизоцима в составе комплекса в качестве природного консерванта.

3.3 Получение сухой формы комплекса иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза».

ГЛАВА 4 ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ БЕЗОПАСНОСТИ КОМПЛЕКСА «Л-ПФИ».

4.1. Антиоксидантная активность.

4.2. Антибактериальная активность.

4.3. Биологическая ценность.

4.4. Токсичность и физиологическая активность.

ГЛАВА 5 ПРОИЗВОДСТВО КОМПЛЕКСА «Л-ПФИ» ИЗ ВТОРИЧНОГО

МОЛОЧНОГО СЫРЬЯ.

5.1. Вторичное молочное сырье-источник компонентов комплекса «Л-ПФИ».

5.2. Технология получения комплекса «Л-ПФИ».

5.3 Изучение свойств комплекса «Л-ПФИ».

5.4 Изучение показателей качества и безопасности комплекса «Л-ПФИ»

ГЛАВА 6 ОБОГАЩЕНИЕ СТЕРИЛИЗОВАННОГО МОЛОКА КОМПЛЕКСОМ «Л-ПФИ».

6.1 Определение содержания иммуноглобулина G, лактоферрина и лактопероксидазы в молочных продуктах.

6.2 Разработка способа обогащения стерилизованного молока комплексом «Л-ПФИ».

6.3 Характеристика стерилизованного молока, обогащенного комплексом «Л-ПФИ».

ВЫВОДЫ.

Ухудшение состояния здоровья, связанное с ростом вторичных иммунодефицитных состояний, онкологических заболеваний, алиментарно-зависимых болезней, включая пищевую аллергию, дисбактериозы различного генеза и др., определяет необходимость повышения неспецифической резистентности здоровых и больных людей, улучшения функционирования естественных систем детоксикации и механизмов обеспечения иммунобиологической реактивности организма с использованием в питании физиологичных безвредных природных соединений и их сочетаний, действие которых направлено на коррекцию функций поврежденных звеньев обеспечения гомеостаза [64]. Биологически активные белки — полифункциональные естественные факторы защиты живых организмов, участвующие в регуляции многих физиологических и иммунологических функций, полностью отвечают данным требованьям.

Актуальным считается использование в технологии пищевых продуктов и БАД биологически активных белков молока, которые играют многообразную роль и выполняют защитную, антимикробную, регенерирующую, антиоксидантную, иммуномодуляторную, регуляторную и другие функции. Перспективным направлением развития биотехнологии является получение биологически активных веществ молока с сохранением их биологической активности из вторичных молочных ресурсов, которые содержат комплекс специфических (иммуноглобулины различных классов) и неспецифических (катионные сывороточные белки; лактопероксидаза, лизоцим, лактоферрин, нуклеазы др.) белковых защитных компонентов. Особый интерес среди неспецифических компонентов вызывают лактопероксидаза и лактоферрин — полноценные по аминокислотному составу и характеризующиеся высокой биологической активностью сывороточные белки [8]. Иммуноглобулины, представляя собой специфические защитные факторы молока, тесно связаны с неспецифическими и функционируют в комплексе с ними [75].

В молоке биологически активные белки, каждый из которых обладает целым рядом уникальных свойств, существуют в комплексе. Однако в настоящее время практическое применение находят в основном монопрепараты на основе очищенной формы отдельных катионных сывороточных белков, что ограничивает их функциональные возможности. Сочетание биологически активных белков молока с учетом взаимного влияния компонентов может обеспечивать возможность создания высокоэффективных биологически активных препаратов и продуктов лечебно-профилактической направленности широкого спектра действия. Применение таких препаратов, характеризующихся высокой биологической ценностью, сегодня рассматривается как наиболее легкий, физиологичный и доступный метод обеспечения иммунной защиты против вирусных и бактериальных инфекций, при лечении социально значимых гастроэнтерологических и онкологических заболеваний, с целью снижения побочного действия медикаментозной терапии и др.

В связи с этим актуальной является разработка технологии получения комплекса биологически активных белков молока с учетом природного соотношения компонентов, их взаимного влияния, биологической активности и безопасности, перспективности его применения в качестве основы БАД и продуктов лечебно-профилактической направленности, а также эффективного способа получения разработанного комплекса, входящего в схему безотходной переработки молочного сырья.

Целью настоящей работы является разработка технологии получения биологически активного комплекса «иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза» из молочного сырья, предназначенного для создания на его основе продуктов лечебно-профилактической направленности.

В соответствии с поставленной целью определены основные задачи исследований:

• Экспериментально обосновать компонентный состав комплекса «иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза» с учетом совместимости и функциональной взаимосвязи компонентов по тестам их биологической активности.

• Получить готовый комплекс в жидкой и сухой формах и изучить его физико-химические свойства, питательную ценность и биологическую активность по показателям: антимикробное действие, антиоксидантная активность.

• В экспериментах с животными исследовать токсичность и влияние при пероральном приеме разработанного комплекса на устойчивость к стрессовым воздействиям.

• Провести изучение и обосновать условия и сроки хранения комплекса.

• Разработать технологию получения комплекса из молочного сырья в рамках схемы его безотходной переработки.

• Провести апробацию комплекса в технологии производства молочных продуктов, на примере стерилизованного молока, в лабораторных и промышленных условиях.

• Разработать проект технической документации на производство биологически активного комплекса на основе лактоферрина, лактопероксидазы и иммуноглобулина.

Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, объектов и методов исследований, экспериментальной части, содержащей 4 главы, выводов, библиографического списка, приложений.

выводы

1. Разработана технология нового полифункционального биологически активного комплекса на основе лактопероксидазы, лактоферрина и иммуноглобулина, выделенных из коровьего молока, которая позволяет более эффективно использовать компоненты молочного сырья. Выявлен синергизм в действии его компонентов.

2. Научно и экспериментально обоснованы состав и соотношение компонентов, с учетом их биологической активности и функциональной взаимосвязи.

3. Установлено, что комплекс «JI-ПФИ» обладает антибактериальной и антиоксидантной активностями и высокой биологической ценностью.

4. Показано отсутствие токсического эффекта на животный организм при пероральном приеме разработанного комплекса, а также, что комплекс обладает высокой физиологической активностью, выраженной в способности повышать устойчивость животного организма к стрессовым воздействиям и выносливость к физическим нагрузкам.

5. Изучена динамика изменения биологической активности компонентов комплекса «Л-ПФИ», на основании которой обоснованы условия и сроки его хранения. Установлено, что более рациональным способом консервирования комплекса «Л-ПФИ» является лиофильное высушивание, способствующее пролонгированию сроков хранения комплекса: при температуре плюс (20±2)°С — до шести месяцев; при температуре плюс (4±2)°С — до 12 месяцев.

6. В условиях промышленности апробирована технология обогащения стерилизованного молока биологически активным комплексом «Л-ПФИ». Введение в состав стерилизованного молока комплекса «Л-ПФИ» не оказывало отрицательного влияния на органолептические и физико-химические показатели готового продукта, но позволяло повысить его биологическую ценность.

1. Альперович, Д.В. Взаимосвязь неспецифических антимикробных факторов молока / Д.В. Альперович, Э.В. Кесельман, А.П. Шепелев // Микробиология, эпидемиология и иммунобиология. — 1994. — №3. — С. 120-125

2. Бабина, С.Е. Лактоферрин как полифункциональная гидролаза молока человека: Автореф. Дис. на соиск. уч. степ. канд. хим. наук. / С.Е.Бабина // Ин-т хим. биол. и фунд. мед. СО РАН. — Новосибирск. — 2006. — 19 с.

3. Баранов, А.А. Лизоцим: теория и практика. / А.А. Баранов, В.Г.Дорофейчук // М.:Н. Новгород . — 1999. с.43-49

4. Баранов, А.А. Лизоцимсодержащие биосистемы для профилактики и лечения социально значимых болезней детского возраста / А. А. Баранов, Э. Г. Щербакова, В. Г. Дорофейчук и др. // Российский педиатрический журнал. — 2000. —N4. —С. 8-14

5. Барбашина, М.А. Разработка технологии молока питьевого пастеризованного длительного срока хранения с функциональными свойствами: Автореф. дис. на соиск. уч. степ. канд. техн. наук / М.А.Барбашина // Воронеж ; Воронеж, гос. технол. акад. — 2005. — 24 с.

6. Барбашина, М.А. Совершенствование технологии молока питьевого пастеризованного длительного срока хранения / М.А.Барбашина, А.Н.Пономарев, Г.П.Шуваева, О.С. Корнеева // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2005. — №1. с. 29-30

7. Бейкер, Е.Н. Лактоферрин: свойства и применение / Е.Н. Бейкер, Х.М. Бекер, Н. Кун, Р.Д. Кидц//Молочная промышленность. — 2006. — №2. — С.38-39

8. Бейкер, Е.Н. Лактоферрин-структура и свойства / Е.Н. Бейкер, Х.М. Бейкер, Н.Кун, Р.Д.Кидд // Молочная промышленность. — 2006. — №2. — с.38-39

9. Белизи, С. Антиоксидантные свойства лактоферрина из женского молока / С.Белизи, И.Н.Назарова, И.А.Климова, В.Н.Прокофьев, Н.В.Пушкина // Бюл. эксперим. биол. и мед. — 1999. — №5. — р.523-525

10. Ю.Буланов, Ю.Б. Химический состав продуктов, пищевая ценность /

11. Ю.Б.Буланов//М.: Тверь — 2003. с. 6-19.

12. П.Воробьев, А.А. Иммуномодуляторы: принципы классификации и стратегия применения в медицине / А.А.Воробьев // Вестник РАМН. — 2002. — №4. — С.22-28

13. Воробьев, А.А. Иммунореабилитация при инфекционно-воспалительных и соматических заболеваниях с использованием Трансфер Факторов / А.А.Воробьев // Методическое письмо. — Москва. — 2004. — 35с.

14. Гольдман, И.Л. Лактоферрин: свойства и перспективы биотехнологического производства / И.Л. Гольдман, Е.С. Захарова, Р.И. Якубовская, С.Г. Кадулин, Н.В. Гнучев // Биотехнология. — 1998. — №4.-С.З-16

15. ГОСТ 23327-78 Молоко. Методы определения общего белка

16. ГОСТ 23453-90 Молоко. Методы определения количества соматических клеток

17. ГОСТ 25101-82 Молоко. Метод определения точки замерзания

18. ГОСТ 25228-82 Молоко и сливки. Метод определения термоустойчивости по алкогольной проб

19. ГОСТ 26754-85 Молоко. Метод измерения температуры

20. ГОСТ 26781-85 Молоко. Метод измерения рН

21. ГОСТ 28283-89 Молоко коровье. Метод органолептической оценки запаха и вкуса.

22. ГОСТ 3623-73 Молоко и молочные продукты. Методы определения пастеризации

23. ГОСТ 3625-84 Молоко и молочные продукты. Методы определения плотности

24. ГОСТ 5867-90 Молоко и молочные продукты. Методы определения жира

25. ГОСТ 8218-89 Молоко. Метод определения чистоты

26. ГОСТ9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

27. Дорофейчук, В.Г. Механизмы защитной функции лизоцима, фундаментальное и прикладное значение / В.Г. Дорофейчук // Нижегор.мед.журнал. — 1996. — № 2. — С.9-13

28. Канышкова, Т.Г. Лактоферрин и его биологические функции / Т.Г.Канышкова, В.Н.Бунева, Г.А.Невинский // Ж. «Биохимия». — 2001. — Том бб.-Вып. 1 — С. 5-13

29. Комолова, Г.С. Ангиогенин молока (обзор) / Г.С. Комолова, Т.В. Федорова // Прикладная биохимия и микробиология. — 2002. — Т.38. — №3.-С.229-236

30. Крусь, Г. Н. Методы исследования молока и молочных продуктов// Г. Н. Крусь, А. М. Шалыгина, 3. В. Волокитина // Москва. — Колосс.- 2002. — с.366

31. Куриненко, Б.М. Стимуляция рибо-нуклеазами неспецифических факторов защиты в организме экспериментальных животных / Б.М.Куриненко, З.М.Нехорошкова, Р.Ш. Булгакова // Антибиотики и химиотерапия. — 1995. — Т. 40. — № 7. — С. 30-34

32. Пулина, М.О. Образование комплекса при взаимодействии церулоплазмина и лактоферрина. Автореф. Дис. на соиск. уч. степ. канд. биол. наук./ М.О. Пулина // НИИ эксперим. мед. РАМН. — Санкт-Петербург. — 2004. — 24 с

33. Соболева, С.В. Ростовский НИИ Микробиологии и паразитологии / Соболева С.В. //URL: http://lact.narod.ru (дата обращения 12.01.2009 )

34. Тамура, И. Производство лактоферрина / И.Тамура // Молочная промышленность. — 2006. — №2. — С.39-41

35. Тихомирова, Н.А. Биологически активные белки молока / Н.А. Тихомирова, Г.С. Комолова, И.И. Ионова //Москва. — 2004. — 80с.

36. Тутельян, В.А. Реализация концепции государственной политики здорового питания населения России: научное обеспечение / В.А. Тутельян, В.А. Княжев // Вопросы питания. — 2000. — №3. — С.4-7

37. Федорова, Т.В. Разработка способа получения белкового концентрата, содержащего ангиогенин, из молочного ультрафильтрата / Т.В. Федорова // Дис. на соискание ученой степени к.т.н. — МГУ ПБ. — 2004. — 23с.

38. Фиджеральд Д.Х. Синергизм лактоферрина и флуконазола в борьбе с кандидозом / Д.Х Фиджеральд // Медицинская газета, Medicus Amicus. — 2003. —№3, —С.6-9

39. Шалыгина, A.M. Биологически активные вещества молока / А.М Шалыгина, Н.А. Тихомирова, И.И Ионова, А.А Петухов, Г.С. Комолова // М.: АгроНИИТЭИПП. — 1997. — Вып.6. — 16с.

40. Шергина, И.А. Влияние лизоцима на качество сыров / И.А.Шергина,

41. B.А.Мордвинова // Ж. «Сыроделие и маслоделие». — 2004. — №5. — с.23-24

42. Шергина, И.А. Влияние лизоцима на развитие лактококков в сырах / И.А.Шергина // Ж. «Сыроделие и маслоделие». — 2005. — №2. — С.27-29

43. Шестенко, О.П. Ангиогенин и его роль в ангиогенезе / О.П. Шестенко, С.Д. Никонов, Н.П. Мертвецов. // Молекулярная биология. — 2001. — Т.35.1. C.349- 37171 .Шидловская, В.П. Ферменты молока / В.П.Шидловская // СПб., Гиорд. 2006. — 296с.

44. Щербакова, Э.Г. Лизоцимсодержащие композиции в составе лечебного питания детей / Э.Г.Щербакова // Ж. «Хранение и переработка сельхозсырья». — 2006. — №4. — С.52-56

45. Abd El-Gawad, I. A. Changes of lactoferrin concentration in colostrum and milk from different species. Egypt./ I.A.Abd El-Gawad, M.El-Sayed Elham, M.B.Mahfouz, A.M.Abd El-Salam // J. Dairy ScL . — 1996. — № 2. — P. 297308.

46. Abd El-Ghani, S. Natural thiocyanate content and optimum conditions for activation of lactoperoxidase system in raw buffalo milk / S.Abd El-Ghani, A.F.Sayed//Egypt. J. Dairy Sci. — 1997. — №2—.P.241-252

47. Aimutis, W.R. Bioactive properties of milk proteins with particular focus on anticariogenesis / J Nutr. — 2004. — №1,134 —.P. 989-995

48. Amornkul, Y. Utilization of microfiltration or lactoperoxidase system or both for manufacture of Cheddar cheese from raw milk. / Y.Amornkul, D.R.Henning // J Dairy Sci. — 2007. — №11 ;90(1 1). —.P.4988-5000

49. Andrews, A.T., Rapid analysis of bovine milk proteins by fast protein liquid chromatography / A.T. Andrews, M.D. Taylor, U. Merin // J Chromatogr — 1985-vol.348- 177-185

50. Arnold, D. Antiadenovirus activity of milk proteins: Lactoferrin prevents viral infection / D.Arnold, A.M. Di Biase, M.Marchetti, A.Pietrantoni, P.Valenti, L.Seganti, F.Superti // Antiviral Res. — 2002. — №2. —.P .153-158

51. Blel M. Improvement of a method for the measurement of lactoperoxidase activity in milk / J. Cazes, M.F. Guingamp, J.L. Gaillard // Int. Dairy J. — 2001. — №11. — p. 795-799

52. Cankaya, M. In vitro effects of some antibiotic drugs on bovine lactoperoxidase enzyme / M. Cankaya, M. Sisecloglu, O.Yoruk, H. Ozdemir // Turk J.Med.Sci. — 2006. — V.36(5).-P.301-306

53. Cazes, J. Chromatography theory / R.P.W. Scott //. — 2002.- P. 235-257

54. Chan, Li. E., Thermal Stability of Bovine Milk Immunoglobulin G (IgG) and the Effect of Added Thermal Protectants on the Stability / Li E. Chan, A. Kummer, J.N. Losso, D.D. Kitts, S. Nakai // Food Res Int J — 1995- № 28- P.9

55. Chen P.W. Detection of Lactoferrin in Bovine and Goat Milk by Enzyme-linlced Immunosorbent Assay / P.W. Chen, F. M. Chiahung // J. of Food and Drug Analysis —2004 —No. 2, P. 133-139

56. Chow, L.M. Kinetics of in Vitro Lactoferrin Deposition on Silicone Hydrogel and FDA Group II and Group IV Hydrogel Contact Lens Materials / L.M.Chow, L.N.Subbaraman, H.Sheardown, L.J.Jones // Biomater Sci Polym Ed. — 2009. — №20(l).-P.71-82.

57. Collin, R.; Development and validation of a nephelometric immunoassay for IgG in milk. /Prosser, C.; McLaren, R.; Thomson, M.; Malcolm, D. A// J. Dairy Res.-2002-vol. 69—.P 27-35.

58. Conesa, C., Determination of IgG levels in bovine bulk milk samples from different regions of Spain. / C. Conesa, M. Lavilla, L. Sanchez, M.D. Perez, L. Mata, P. Razquin, M. Calvo // Eur Food Res Technol J — 2005 — p 220 — 222

59. Dyer, A.R. In vitro and in vivo safety studies of a proprietary whey extract / A.R.Dyer, G.A.Burdock, I.G.Carabin, M.C.Haas, J.Boyce, R.Alsaker, L.C.Read // Food Chem Toxicol. — 2008. — №5;46(5). — P. 1659-65

60. Ebina, T. Passive immunizations mice and infants with colostrums containing antibodies to human rotavirus / T.Ebina, M.Ohta, Y.Kanamaru, Y.Yamamoto-Osumi, K.Baba // J. Med. Virol. — 1992.- № 38(2). — P. 117-23

61. Ekins, A. Lactoferrin receptors in Gram-negative bacteria: Insights into the iron acquisition process / A. Ekins, A.G. Khan, S.R. Shouldice, A.B. Schryvers// BioMetals.- 2004. — Vol. 17. — P. 235-243.

62. Ekstrand, B. Lactoperoxidase and lactoferrin / B.Ekstrand // In Natural

63. Antimicrobial Systems and Food Preservation — 1994. — P. 15-63

64. Everse, J. Peroxidases in chemistry and biology/ Everse J., Kathleen E. Everse, Matthew B. G.// CRC Press — 1991 P. 125

65. Flanagan, J.L. Role of lactoferrin in the tear film / J.L. Flanagan, M.D.Willcox // Biochimie. — 2008. — №7. — P.31.

66. Fox, P.F. Indigenous enzymes in milk: Overview / P.F. Fox, A.L. Kelly//Int. Dairy J.- 2006. — №6 —. P. 500-532

67. Funatogawa K. Use of Immunoglobulin Enriched Bovine Colostrum against Oral Challenge with Enterohaemorrhagic Escherichia coli 0157: H7 in Mice / Funatogawa K. et. al. //Microbiology and immunology. — 2002,- No. 11 P.761-766

68. Fweja, L.W. Alternative strategies for activation of the natural lactoperoxidase system in cows' milk: trials in Tanzania / L.W.Fweja, M.Lewis., A.S. Grandison // J Daily Res. — 2007. №11;74(4). — P.381-6

69. Gapper L. W. Analysis of bovine immunoglobulin G in milk, colostrum and dietary supplements: a review / D. E. J. Copestake; D. E. Otter, H. E. Indyk//

70. Analytical and Bioanalytical Chemistry — 2007.- №1 — P.93-109

71. Gonzalez-Chavez, S.A. Lactoferrin: structure, function and applications / S.A.Gonzalez-Chavez, S.Arevalo-Gallegos, Q.Rascon-Cruz // Int J Antimicrob Agents. — 2008. — № 10. — P.7

72. Gurtler, J.B. Inhibition of growth of Enterobacter sakazakii in reconstituted infant formula by the lactoperoxidase system / J.B.Gurtler, L.R.Beuchat // J Food Prot. — 2007. — №9; 70(9). — P.2104-10

73. Haberska, K. Activity of lactoperoxidase when adsorbed on protein layers / K.Haberska, O.Svensson, S.Shleev, L.Lindh, T.Arnebrant, T.Ruzgas // Talanta. — 2008. — №9;76(5). — P. 1159-64

74. Haddan, M.S. Preservation of raw milk by activation of the lactoperoxidase system/M.S. Haddan, S.A. Ibrahim, R.K. Robinson//Food Control. — 1996. — V.7.-P. 149-152.

75. Hirano, R. Lactoperoxidase effects on rheological properties of yougurt / R.Hirano, M.Hirano, M.Oooka, S.Dosako, I.Nakajima, K.Igoshi // J. Food Sci. — 1998.-№l.-P.35-38

76. Hooper, L.V. Angiogenins: a new class of microbicidal proteins involved in innate immunity. / L.V. Hooper, T.S. Stappenbeck, C.V. Hong, J.I. Gordon//Nature Immunology. — 2003 — №3- P. 269-273

77. Huang, S.W. Effect of lactoferrin on oxidative stability of corn oil emulsions and — liposomes / S.W.Huang, M.T.Satue-Gracia, E.N.Frankel, J.B.German // J. Agr. And Food Chem. — 1999. — №4. — P. 1356-1361

78. Khalid, S. Effect of activated lactoperoxidase system on the quality characteristics of yoghurt. / S. Khalid, T. Masud // Electron. J.Environ.Agric.Food Chem. (EJEAFChe). — 2004. — V.3(6). — P.777-783

79. Kim, W.S. Growth-promoting effects of lactoferrin on L. acidophilus and Bifidobacterium spp. / W.S.Kim, M.Ohashi, T.Tanalca, F.Kumura, G.Y.Kim, K.Kwon, J.S.Goh, K.Shimazaki // Biometals. — 2004. — № 3. — P.279-283

80. Klaas, D. Lactoperoxidase: physico-chemical properties, occurrence, mechanism of action and applications / D. Klaas, K. Kassendrager, A.C.M. van Hooijdonk // British Journal of Nutrition. — 2000. — V. 84. — P.519-523

81. Korhonen, H. Technological options for the production of health-promoting proteins and peptides derived from milk and colostrum / H.Korhonen, A. Pihlanto // Curr Pharm Des. — 2007. — №13(8). — P.829-43

82. Kruzel, M.L. Lactoferrin protects gut mucosal integrity during endotoxemia induced by lipopolysaccharide in mice / M.L.Kruzel, Y.Ilarari, C.Y.Chen, G.A. Castro // Inflammation. — 2000. — №1. — P.33-44

83. Kussendrager, K.D Lactoperoxidase: physico-chemical properties, occurrence, mechanism of action and applications / K.D. Kussendrager, А. С. M. Hooijdonk // British J. of Nutrition. — 2000 — Suppl. 1. — P. 19- 25

84. Kutta, H. Distribution of mucins and antimicrobial substances lysozyme and lactoferrin in the laryngeal subglottic region / H.Kutta, A.Wilier, P.Steven, L.Brauer, M.Tsokos, F.Paulsen // J Anat. — 2008. — №10;213(4). — P.473-81

85. Lebreton, J.P., Caprine immunoglobulin G, P-lactoglobulin, a-lactalbumin and serum albumin in colostrum and milk during the early post partum period / Joisel F, Boutleux S, Larmuzel B, Sauger F // — 1981 — Lait 61:465

86. Lee-Huang, S. Lysozyme and Rnase as anti-HIV components in beta-core preparations of human chorionic gonadotropin / S. Lee-Huang, P.L. Huang, Y. Sun, H. Kung, D.L. Blithe, H.C. Chen // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. — 1999.-V.96. — P.2678-2688

87. Leland, P.A. Ribonuclease A variants with potent cytotoxic activity / P.A.Leland, L.W.Shultz, B.Kim, R.T.Raines // PNAS USA. — 1998. — V. 95. — № 18.-P. 10407-10412

88. Levay, PF. Lactoferrin: a general review. / PF. Levay, M Viljoen // Hacmatologica. — .1995. — № 80. — P.252-1061

89. Levieux, D. Discussion of parameters of a semi-automated RID as applicable to quantification of IgG in milk/D. Levieux// Lait- 1991-71 — P.327

90. Leyton W. G. Analysis of bovine immunoglobulin G in milk, colostrum and dietary supplements: a review / Leyton W. G., David E. J., Copestake, Don E. O., Harvey E. I. // Springer Berlin — 2007 P. 93-109

91. Litman, G. Reconstructing immune phylogeny: new perspectives / G.Litman, J.Cannon, L.Dishaw // Nat Rev Immunol. — 2005. — №5 (11). — P.866-79

92. Lonnerdal, B. Nutritional roles of lactoferrin / B. Lonnerdal // — 2009. vol. 12, №3, P. 293-29

93. Loughran, N.B. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions / N.B.Loughran, B.O 'Connor, C.O'Fagain, M.J.O'Connell // BMC Evol Biol. — 2008. — №3. — P. 101

94. L0vstad, R.A. A kinetic study on the lactoperoxidase catalyzed oxidation of estrogens / R.A.L0vstad // Biometals. — 2006. — №12; 19(6). — P.587-92

95. Mayer. G. Immunology. The structure and function of immunoglobulins-antibodies /G. Mayer // Med. Microbiology — 2008 — P. 110-113

96. Mehanna, N.M. Preparation and use of lactoperoxidase system capsules to preserve milk at different temperatures / N.M.Mehanna, M.A.Moussa // SO Egypt. J. Dairy Sci. — 1999. — №2. — P.245-254

97. Mehraa, R. Milk immunoglobulins for health promotion / R.Mehraa, P.Marnilab, H.Korhonenb // International Dairy Journal. — 2006. — №16. — P.1262- 1271

98. Mulder, A.M. Bovine lactoferrin supplementation supports immune and antioxidant status in healthy human males / A.M.Mulder, P.A.Connellan, C.J.Oliver, C.A.Morris, L.M.Stevenson // Nutr Res. — 2008. — Sep;28(9). — P.583- 589

99. Murphy, M.E. In vitro antiviral activity of lactoferrin and ribavirin upon hantavirus / M.E.Murphy, H.Kariwa, T.Mizutani, K.Yoshimatsu, J.Arikawa, L.Takashima// Arch. Virol. — 2000. — №8. — P.1571-1582

100. Nagy, K. Controlled study of lactoperoxidase gel on oral flora and saliva in irradiated patients with oral cancer / K.Nagy, E.Urban, O.Fazekas, L.Thurzo,

101. E.Nagy // J Craniofac Surg. — 2007. — №9;18(5). — P.l 157-64

102. Naidu, A. S. Lactoferrin: natural, multifunctional, antimicrobial/ A. S. Naidu, Narian Naidu// CRC Press — 2000 P. 76

103. Naidu, S.A. Activated lactoferrin —- a new approach to meat safety / S A.Naidu // Food Technol. — 2002. — №3. — P.40-45

104. Nakada, M. Lactoperoxidase suppresses acid production in yoghurt during storage under refrigeration / M. Nakada, S. Dosako, R. Hirano, M. Oolca, I. Nakajima //International Daily Journal. — 1996. — V.6. — P.33-42

105. Nawin, C.M. Nucleases: molecular biology and applications/ C.M. Nawin, // Wiley-Interscience. — 2002. — p. 27-37.

106. Ndambi, O.A. Reducing Raw Bovine Milk Spoilage through the Lactoperoxidase System in the Western Highlands of Cameroon / OA. Ndambi,

107. F. Fonteh, P. Kamga, S. Mendi, H. Imele, M. Siegmund-Schultze //Deutsher Tropentag, Hohenheim «The Global Food&Product Chain». — October 11-13, 2005.

108. Norrby, K. Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF165.-mediated angiogenesis in the rat / K.Norrby, I.Mattsby-Baltzer, M.Innocenti, S.Tuneberg // Int. J. Cancer. — 2001. — №2. — P.236-240

109. Olson, K.A. Angiogenin is regulated in vivo as an acutephase protein / K.A.Olson, S.J.Verselis, J.W.Fett // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1998. — V.242.-№3.-P .480-483

110. Ozdemir, H. Purification of lactoperoxidase from bovine milk and investigation of the kinetic properties / H. Ozdemir, I. Aygul, I. Kufrevioglu // Prep, biochemistry and Biotechnology. — 2001. — V.31(2). — P. 125-134

111. Pakkanen, R. Growth factors and antimicrobial factors of bovine colostrums /

112. R.Pakkanen, J.Aalto // International Daily Journal. —V.7- P. 285-297

113. Perre, P.V. Protection of Newborns through Maternal Immunization. Transfer of antibody via mother's milk / P.V.Perre // Vaccine. — 2003. — V.21. — P.3374- 3376

114. Pierce, A. Advances in lactoferrin research / A.Pierce, D.Legrand // Biochimie.2008.-№10.-P.14

115. Rahman, M.M. Examination of bovine lactoferrin binding to bifidobacteria / M.M.Rahman, W.S.Kim, T.Ito, H.Kumura, K.Shimazaki // Prikl Biokhim Mikrobiol. — 2008. — №9 ,44(5) — P.529-32

116. Rodrigues, L. Lactoferrin and cancer disease prevention / L.Rodrigues, J.Teixeira, F.Schmitt, M.Paulsson, H.L.Mansson // Crit Rev Food Sci Nutr. — 2009.-Mar;49(3).-P.203-17

117. Rodriguez-Franco, D.A. Antimicrobial mechanisms and potential clinical application of lactoferrin: review/ Rodriguez-Franco DA, Vazquez-Moreno L, Ramos-Clamont Montfort G// Rev Latinoam Microbiol. — 2005. — №11,47(3-4)1. P. 102-111.

118. Sakai, S. Production of hydrogen peroxide by a small molecular mass compound in milk from Holstein cows with high and low milk somatic cell count / S.Sakai, E.Nonobe, T.Satow, K.Imakawa, K. Nagaoka // J Daily Res. — 2008. — №8, —P.335-339

119. Sassi, S.O. The resurrection of ribonucleases from mammals: from ecology to medicine/ S.O. Sassi, S.A. Benner// Ancestral Sequence Reconstruction. — 2007.5. —P. 208-225

120. Savci, Z. Enhancing keeping quality of raw cow's, sheep's and goat's milks by activation of the lactoperoxidase system / Z.Savci, E.Sezgin, Z.Yildirim // Milchwissenschaft. — 2002. — №1,- P. 13-15

121. Scarino, M.L. A sideways glance: Take it or leave it? The role of lactoferrin in iron sequestration and delivery within the body / M.L.Scarino. //Genes Nutr. — 2007. — Nov;2(2). —.P. 61-62

122. Seifu E., Antibacterial activity of the Iactoperoxidase system against food-borne pathogens in Saanen and South African Indigenous goat milk / E. Seifu, E. M. Buys, E. F. Donkin, I.M. Petzer // Food Control. — 2004. — №9- P.447-452

123. Severin, S. Milk Biologically Active Components as Nutraceuticals: Review/ S. Severin, X.Wenshui // Crit. Rev. Food Sci. Nutr.- 2005 №8.- P.645-656.

124. Swart, P.J. / P.J. Swart, M.E. Kuipers, C. Smith, R. Pawels, M. P. de Bethune, E. de Clerk, D. K. F. Meijer, J. G. Huisman // AIDS Res. Human Retrov.- 1996.-V.12.-P.769-775

125. Tamime, A. Y. Brined Cheeses/ A. Y. Tamime, M. Abd El-Salam Society of Dairy Technology. — 2006.- P.27-28

126. Tome, D. Physiological effects of milk protein components / D. Tome, H.Debabbi // Int. Dairy Jornal. — 1998. — N.8. — P.383-392

127. Turner, R.B. Passive immunization for prevention of rotavirus illness in healthy infants / R.B.Turner, D.K.Kelsey // Pediatr Infect Dis J. — 1993. — №12(9). —P.718- 722

128. Ushida, Y. Possible chemopreventive effects of bovine lactoferrin on esophagus and lung carcinogenesis in the rat / Y.Ushida, K.Sekine, T.Kuhara,

129. N.Takasuka, M.Hgo, M.Maeda, H.Tsuda // Jap. J. Cancer Res. — 1999. — №3. — P.262-267

130. Wada, L. The therapeutic effect of lactoferrin in the host infected with Helicobacter / L.Wada, Y.Aiba, K.Shimizu, A.Takagi, T.Miwa, Y.Koga // Scand.J. Gastroenterol. — 1999. — №3. — P.238-243

131. Ward, P.P. Lactoferrin: role in iron homeostasis and host defense against microbial infection / P.P.Ward, O.M.Conneely // Biometals. — 2004. — №17. — P.203-208

132. Weinberg, E.D. Human lactoferrin: a novel therapeutic with broad spectrum potential./ E.D. Weinberg, // J. Pharm Pharmacol. — 2001. — 0ct53(10). — P.1303-1310.

133. Younan, M. Lactoperoxidase-thiocyanate-hydrogen peroxide system to improve the storage of raw camel milk / M.Younan, Z.Farah, V.Galett // Milchwissenschaft. — 2006. — №4. — P.392-394.

134. Zagulski, T. Antibacterial system generated by lactoferrin in mice in vivo is primarily a killing system / T.Zagulski, P.Lipinski, A.Zagulska, Z.Jarzabek // Int.

135. J. Exp. Pathol. — 1998. — №2. — P.l 17-123

136. Zimecki, M. Milk-derived proteins and peptides of potential therapeutic and nutritive value / M.Zimecki, M.L.Kruzel // J Exp Ther Oncol. — 2007. — №6(2). — P.89-106

137. Zubeir, I.E.M.E Preservation of raw milk of Khartorum State (Sudan) by the lactoperoxidase system / I.E.M.E Zubeir, M.E.M. Hassen, O.Y. Sanaa // Int. J. Of Dairy Sci. — 2006 — № 2. — P. 155-160