автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка и исследование биохимических методов определения ферментативной активности хлебопекарных дрожжей и их применение в пищевой биотехнологии

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ (ВНИИПБТ)

На правах рукописи

АБРАМОВА ИРИНА МИХАЙЛОВНА

УДК 634:663.1

РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ аВШЕНГАГИВНОЙ АКТИВНОСТИ ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ДР08ЖЕЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ПИЩЕВОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

Специальность 05.18.07 "Технология Продуктов брожения, алкогольных и безалкогольных напитков"

АВТО-РЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 1992

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте пищевой биотехнологии (ВНИИПЕГ):

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущее предприятия -

доктор технических наук, профессор ЕИОВДЕВА. А.П.

кандидат технических наук ЧЕРЕДНИЧЕНКО B.C.

доктор технических наук, профессор ПОПАДИЧ И.А.

кандидат технических наук МЕНДЕЛЬСОН Л.Н.

Московский дрожжевой завод

Защита диссертации состоится и _1993

часов на заседании Специализированного Совета

K-020.63.0I во Всероссийском научно-исследовательском институте пищевой биотехнологии по адресу: 109033, Москва, Самокатная, Д. 46.

С диссертацией ыогно ознакомиться в библиотеке ВНИИПЕГ. Автореферат разослан

„¿У- ¿еыЩ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат технических наук

И.И.Бурачевский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы и.состояние вопроса. Основной задачей, стоящей перед пищевой промышленностью, в том числе и хлебопекарной, является обеспечение населения страны высококачественными пр{щукта-ии питания.

Эффективность технологических процессов хлебопечения в большой степени связана с биотехнологическими свойствами используемых дрож-Евй, главным образом, активностью ферментов.

Дрожжевая промышленность России вырабатывает, в основном, дрож-си прессованные и сухие. Некоторое увеличение выпуска хлебопекарных 1рожжей, за последние годы, на удовлетворяет потребность народного озяйства. Качество дрожжей, зачастую, является низким.

Одним из путей повышения эффективности дрожжевого производства вляется выдедение и внедрение в производство новых рас и штаммов, бладающих высокой ферментативной активностью. Особое место отводит-я КФЗ.2.1.20: <^-Д-глюкозид-глюкогвдролаэе (Х-глхжозидазе) и фер-ентам зимазного комплекса. Зимазный комплекс ферментов это сложная эрментативная система, объединенная одним названием - "зишза", ко-эрая включает более 20 ферментов, катализирующих различные частные закции процессов брожения, в том числе: КФ 2.7.1.1.АТФ:Д-гексоза-э-фосфатрансфераза (гексокиназа), КФ 2.7.1.П.АТФ:Д-фруктозо-6-зсфат 1-фосфотрансфераза (фосфофруктокиназа), К5 1,1.1.1.Алкоголь: Щ оксидоредуктаза (алкогольдегвдрогеназа) и другие.

Х-глюкозвдаза и ферменты зимазного комплекса обеспечивают устное ведение технологического процесса хлебопечения.

Таким образом, в технологической цепи получения высококачест-нных хлебопекарных дрожжей и использовании их в производстве :еба, ключевую роль играет объективная оценка об-глюкозвдазной и имазной" ферментативных активностей на основе быстрых, точных и

простых методов определения.

Большое значение имеет объективная оценка ферментативной активности дрожжей («С-глюкозидазной и "зимазной") при проведении научно-исследовательских работ, а также в процессе селекции дрожжей и поддержании их качества при хранении.

По мнению специалистов хлебопекарной и дрожжевой промышленности, а также научных работников, существующие методы определения оС-глюкозидазной и "зимазной" активностей, в том числе, включенные в ГОСТ 171-81 "Дрожжи хлебопекарные прессованные", не отвечают современным требованиям метрологии, не обладает достаточной точностью и воспроизводимостью и вызывают трудности при их использовании в производстве и научных исследованиях.

Из изложенного выше вытекает-актуальность и'-целесообразность разработки научно-обоснованных, точных и простых методов определения Х-глюкозвдазной и "зимазной" активностей хлебопекарных дрожжей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является создание точного и простого метода определения ферментативной (¿¿-глюко-зидазной и "зимазной") активности хлебопекарных дрожжей, позволяющего объективно оценивать их качество при производстве и применении, а также проведении работ по селекции для получения активных штаммов хлебопекаршх дрожжей.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- на основе анализа существующих методов определения оО-глюко-зидазной и ¡'зимазной" активностей дрожжей и современных инструментальных методов контроля виЗрать принцип нового метода определения ферментативной активности дрожжей;

- с учетом особенностей разрабатываемого метода отработать оптимальные условия проведения ферментативной реакции гидролиза субст-

ратов;

- провести комплексные исследования по определению точности, воспроизводимости, специфичности разработанного метода и дать его метрологическую оценку;

- установить корреляцию между применяемыми в настоящее время, и новыми методами характеристики об-глюкозвдазной и "зимазной" активностей! на основе,сравнительных испытаний различных дрожжей, а также, количественном.анализе продуктов гидролиза субстратов;

- провести широкую апробацию разработанного метода в условиях дрожжевых заводов;

- разработать параметры оценки качества дрожжей с применением разработанного метода;

- исследовать применимость разработанного метода для определения ферментативной активности спиртовых дрожжей и оценки биотехнологических свойств хлебопекарных дрожжей в процессе хлебопечения.

Научная1 новизна. Разработан унифицированный метод определения качества хлебопекарных дрожжей, предусматривающий определение 2-х показателей ферментативной активности (°6-глюкозидазной и" зимазной."), в котором за критерий оценки активности фермента принято изменение величины поляризации субстрата.

Впервые исследована зависимость мезду.изменением, поляризации субстрата и количеством ферментов дрожжей, введенных в реакцию, на. основе которой подобраны оптимальные физико-химические условия действия изучаемых ферментов (рН, ,15] и время проведения реакции).

Впервые установлено, что при гидролизе мальтозы с последующим; сбраживанием гликозы до этилового спирта и диоксида углерода о использованием: дрожжей. ЗжсЬэгОтусе? аге.У1$\<1Е , получаемых в аэробных условиях на мелассных средах, лимитирувдим процесс; ферментом является аС-глякозидаза. Это представляет научно-практический интерес для

решения технологических вопросов дрожжевого производства, а также для исследований в области направленной селекции штаммов З^СС -Ьаготусе$ сеге^/яге.

Впервые разработаны параметры оценки качества хлебопекарных дрожжей по их ферментативной (¡¿-глюкозидазной и "зимазной") активности с помощью разработанного поляриметрического метода.

Показана возможность применения разработанного метода для определения ферментативной активности чистых культур спиртовых дрожжей и оценки биотехнологических свойств дрожжей в процессе хлебопечения.

Метод определения «С-глюкозидазной активности защищен авторским свидетельством (# 1654336, опубл. 07.C6.9I в Б.И. * 21).

Практическая ценность работы. Разработанные поляриметрические методы определения ферментативной активности хлебопекарных дрожжей (по сС-глюкозидазной и "зимазной" активностям) дают возможность:

- более быстро и точно производить анажиз ферментативной активности дрожжей и объективно оценивать их качество при производстве и реализации в хлебопечении;

- более направленно вести работы по селекции штаммов дрожжей и с большой точностью и меньшей трудоемкостью производить оценку качества получаемых новых штаммов микроорганизмов;

- объективно определять.ферментативную активность чистых культур дрожжей в спиртовой промышленности;

- более точно оценивать, в денежном выражении, товарные качества хлебопекарных дрожжей.

Реализация результатов исследования. В результате проведенных исследований разработаны:

I. "Инструкция по определению активности «О-глюкозидазы (маль-тазы) хлебопекарных дрожжей поляриметрическим методом", утвержденная Главным управлением Государственных продовольственных ресурсов.

03.07.90;

2. "Инструкция по определению "зимазной" активности хлзбопекар-ных дрожжей поляримзтрическим методом", утвержденная директором ВНИИ пищевой биотехнологии 25.11.91.

Апробация работы. Разработанный метод определения ферментативной активности хлебопекарных дрожжей был испытан на Московском, Харьковском дрожжевых заводах. Петровском спиртовом комбинате, в лаборатории биохимии ПИБР Дагестанского научного центра АН, в Кемеровском технологическом институте пищевой промышленности и Московском технологическом институте пищевой промышленности, о чем свидетельствуют акты.

Основные результаты диссертации были доложены и обсуждены на Всесоюзном совещании работников дрожжевой промышленности (Руза, 1990 г.), Республиканской конференции "Разработка и внедрение высокоэффективных ресурсосберегающих технологий, оборудования и новых зидов пищевых продуктов в пищевую и- перерабатывающие отрасли АПК" [Киев, 1991 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в :ом числе I авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена в 145 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы, 3 диаграмма и 16 рисунков, состоит из введения, шести глав, выводов, списка спользованной литературы (238 источников и 41 приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы и определены задачи сследования.

Обзор литературы. Дана характеристика дрожжей, используемых в азных биотехнологических процессах. Рассмотрены особенности фер-

ментативного комплекса хлебопекарных и спиртовых дрожжей. Проанализировано действие хлебопекарных дрожжей при брожении мучных сред и изложены существующие способы повышения активности мальтазы. Показаны преимущества использования мальтазоактивных дрожжей в хлебопечении и важная роль фермента - ^-глюкозидазы в процессе тестоведения.

Исследованы существующие методы определения ферментативной активности хлебопекарных дрожжей -глюкозидазной и "зимазной"). При критическом рассмотрении известных в литературе' методов определения ферментативной активности дрожжей не было обнаружено достаточно точных и удобных методов для определения Х-глюкозидазной и "зимазной" активностей хлебопекарных дрожжей. Создание таких точных и объективных методов явилось целью настоящих исследований.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Разработка методов определения ферментативной активности хлебопекарных дрожжей (сС-глюкозидазной.и "зимазной")

Проведен детальный анализ инструментальных методов определения активности ферментов, обладающих простотой и объективностью оценки. Такими методами являются фотометрические, спектрофотометрические и интерферометрические (Полыгалина, 1986; Проскуряков, 1985). Главным их недостатком вяляется неспецифичность, поскольку определяется суммарное количество Сахаров.

В контроле дрожжевого, спиртового, крахмало-паточного, сахарного и кондитерского производства широко используются поляриметрические методы определения содержания углеводов (Бакушинская, 1984; Полыгалина, 1986). Они также нашли применение при определении активности ферментов: . амилаз солода и глюКоамилазной активности в культурах микроорганизмов. (Пономарева, 1982; Рухлядева,

1981).

Поляриметрические методы очень просты, удобны для выполнения в заводских лабораториях, обладают хорошей воспроизводимостью и точностью, требуют небольшого времени на проведение анализа. Этот метод определяет только оптически активные вещества и его специфичность была учтена нами при выборе субстратов. Выбор субстрата зависит также от цели исследования, природы анализируемого препарата фермента, доступности данного вещества и его специфичности для фермента.

Глюкоза является наиболее специфичным субстратом для определения активности ферментов зимазного комплекса и используется в этом качестве во всех известных нам методах определения активности "зи-мазы", в связи с чем она была выбрана в качестве субстрата.

При изучении использования различных известных субстратов для определения активности «¿-глюкозидазы была выбрана мальтоза, так как она является наиболее доступным и чаще всего используемым субстратом (Рухлядева, 1981; Павлюк, 1981; Пономарева, 1983). В наиболее распространенном в дрожжевой промышленности методе определения маль-тазной активности с помощью микрогазометра системы Елецкого,субстратом также является 10%-ный раствор мальтозы (Бакушинская, 1978).

Учитывая все вышесказанное, по нашему мнению, поляриметрический метод является наиболее перспективным для разработки ферментативной активности дрожжей (Х-глюкозидазной и "зимазной"), так как:

- позволяет быстро и точно, без дополнительной реакции, опреде-гать образующуюся глюкозу;

- специфичен, поскольку удельный угол вращения мальтозы и глю-;озы различен {[<£3 д° = 130,4° и 52,5° соответственно).

Изучение возможности применения поляриметрического метода для измерения скорости ферментативной реакции

Специфичность действия оС-глюкозидазы основана на том, чго динственным продуктом гидролиза мальтозы является глюкоза.

В основу метода определения "зимазной" активности хлебопекарных дрожжей положено определение скорости сбраживания субстрата (глюкозы) ферментами зимазного комплекса дрожжей по изменению его оптического вращения до и после действия ферментов.

На основании "Рекомендаций Международного биохимического союза..." основной предпосылкой измерения ферментативной активности принято предположение о наличии линейной зависимости между глубиной химического превращения субстрата и концентрацией введенного в реакцию фермента. На рис. I представлены результаты экспериментов, определяющих характер такой зависимости на примэре дрожжей $ассНаготу-СеЗ сеГЕУ/£/>3 е -821 при условиях, оптимальных для действия дрож-жевой,<^глюкозидазы СрН 6,8 и Ь= 35°С) и "зиыазы" (рН 4,6 и ¿ = = 35°С) (Фогарти, 1986, Коновалов, 1980). дП линейно растет от 1,88 4- 10,20°^ (при определении Х-глюкозидазной активности) и от 0,464- Х,550^ (при определении "зимазной" активности). лП,У '

1,4 ■ 11

■ Ю

■ 6

■ в

0,6 ■ ч

о,ч ■ 2

VI

1

/Ах

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 [п]г/33 см3

Рис.1. Зависимость изменения поляризации (дП) от концентрации дрожжей, введенных в реакцию: ( £ПЗ ): I - раствор мальтозы; П - раствор глюкозы.

Разработка условий для определения поляризации растворов

В поляриметрических методах определения углеводов, а также при анализе содержания ферментов применяют различные вещества для осветления растворов и осатсдения коллоидных и других, влияющих на анализ, соединений. Из ряда изученных осветлителей были выбраны растворы 30% сульфата цинка и 15% гексоцианоферрата (П) калия (осадитель Карреза). Установлено, что для осветления гидролизата необходимо добавление по I см3 указанных реактивов, и это количество не влияет на величин поляризации.

На основании исследований, для инактивации ферментов принят кислотный метод, являющийся быстрым и нетрудоемким.

В разработанном методе действие фермента прекращают добавлением I см3 5 н растворя соляной кислоты.

Из теории дисперсии оптического вращения известно, что удельный угол вращения плоскости поляризации оптически активных веществ увеличивается с уменьшением длины волны проходящего через раствор света. Для обеспечения более высокой точности поляриметрического метода измерение вращения плоскости поляризации гидролизатов рекомендовано проводить на автоматическом поляриметре А1-ЕПД со светофильтром, имею-цим максимум светопроцускания при А = 440 нм, в трубке длиной б-200 мм.

Выбор условий проведения ферментативных реакций

Исследовалось влияние на скорость ферментативной реакции: температуры, рН, концентрации субстрата, продолжительности инкубирования, :оотношения субстрат - фермент.

Температура. Как следует из представленных на рис.2 эксперимен-■альных данных - имеет место выраженный экстремум — = / (t )

Рис.2. Зависимость скорости гидролиза мальтозы (-) от температуры (i ) для дрожжей с различной еб-глюкозидазной активностью.

Активная кислотность. Вопросам определения оптимальной величины рН для действия ферментов Х-глюкозццазы и "зимазы" дрожжей SáCC-haromyces C£rQV¡Si¿16 посвящено большое количество работ отечественных и зарубежных авторов (Фогарти, 1986;/7latsUS3K3 , 1977).

Имеются достаточно убедительные данные об оптимуме рН для oC-глюкозвдазы - 6,8 и "зтазы" - 4,6. Эти величины приняты нами для включения в методики определения активностей.

Концентрация субстратов. Исследования были проведены для нескольких партий дрожжей с различной ферментативной активностью в диапазоне концентраций субстратов 2 + 12%.

Как видно из рис.3 для .¿-глюкозидазы имеет место практически прямолинейное возрастание скорости реакции в области малых концентраций мальтозы. При давльнейшем увеличении концентрации прирост скорости снижается и в диапазоне 10-12% практически изменяется незначи-

ю 11 <?Д

Рио.З. Зависимость скорости гидролиза мальтозы

—) от концентрации субстрата (£ ) для дрожжей с различной Х-глюкозидазной активностью

2 Ч 6 в Ю к $

Г °

Рис.4. Зависимость скорости сбраживания глюкозы ( - ) от концентрации субстрата (^ ) для дрожжей с различной "зи-мазной" активностью

тельно. Учитывая это обстоятельство, а также то, что указанные значения уже достаточно велики, и при более высоких значениях появятся определенные сложности методического и экономического характера, для включения в методик принята 10%-ная концентрация мальтозы.

Исследования оптимума концентрации глюкозы показали наличие ярко выраженного экстремума в области концентрации субстрата 5% (рис.4).

Время ферментации. В условиях оптимума температуры, рН, концентрации субстратов и для дрожжей различной активности определено оптимальное время инкубации (рис.5): для оС-глюкозидазы - 60 мин. и "зимазы" - 30 мин. При этсм обеспечивается постоянная скорость реак-

ции и достаточная точность измерения (¿П ^ 0,4°).

----- -ш р72мин

МА =Э6мжн ¿150мин

• /

о

15 30 45- б 0 75 ЯО %1аа Рис.5. Зависимость изменения поляризации (дШ от продолжительности реакции (Т) для дрожжей с различной ¿С-глюкозидазной активностью

Способ расчета и выражения </-глюкозидазной и "зимазной" активностей хлебопекарных дрожжей

В результате действия об-глюкозидазы хлебопекарных дрожжей на мальтозу, образующийся единственный продукт реакции - глюкоза, сбраживается "зимазой" дрожжей. Поэтоцу при разработке способа расчета Х-глякозидазной активности хлебопекарных дрожжей прежде всего выводилось соотношение между количеством прогидролизованной мальтозы и изменением поляризации. Формула расчета мальтазной активности имеет вид:

МСп

■0.0438 • Д П . Юь = 2,14 . А П . ед/г ( ! )

60 . 342 . а а

где: 0,0438 - количество прогидролизованной мальтозы в условиях разработанного метода (рН, Ь , соотношения фермент - субо-траг, длина трубки, продолжительность реакции), в I см3

инкубационной смеси, соответствующее изменению поляризации, .равноцу Io S, г; д П - изменение угла поворота плоскости поляризации, равное разности поляризации контрольного и опытного растворов,

60 - время действия фермента, мин.;

с

10 - коэффициент перевода г в мкг; 342,0 - молекулярная масса мальтозы (для перевода мкг в ммоли), г;

а - количество дрожжей- в инкубационной смеси, г.

По формуле (I) ведут расчет активности дрожжей с исходной влажностью W), далее пересчет величины активности <L -глюкозидазы ведут на влажность 75$ (в прессованных дрожжах) и на 8% (в сухих).

МСп = ИОп • (100 - 75)

с 100 - W

где: W - влажность поступивших на анализ исследуемых дрожжей, %.

За единицу активности сС-глюкозидазы принимается такое количество фермента, которое гидролизует до глюкозы с последующим ее сбраживанием I ммоль мальтозы при температуре 35°С при рН 6,8 в течение I мин.

Расчет "зимазной" активности хлебопекарных дрожжей основан на изменении угла поворота плоскости поляризации раствора глюкозы под действием "зимазы" при определенных условиях рН, температуры и времени инкубации. Расчет "зимазной" активности ведут по формуле:

ЗСп = 'Q.I09 . а П • Ю6 = 20,17 . ^ П ( 2 )

30 • а • 180,16 ~ а

где: 0,109 - количество сбродившей глюкозы э условиях разработанного метода (рН, температуры, соотношения фермэнт - субстрат, длины трубки, продолжительности реакции) в I см3 инкубационной смеси, соответствующее изменению поляризации, равно!,iy I0,? ; г;

30 - время действия фермента, мин;

180,16 - молекулярная масса глюкозы (для перевода мкг в ммоли), г.

Далее ведут пересчет активности с учетом влажнос»и (аналогично пересчету МСп).

За единицу активности "зимазы" принмеется такое количество фермента, под действием которого происходит сбраживание I ммоля глюкозы при температуре 35°С и рН 4,6 в течение I мин.

Методика проведения анализа

Для определения оС-глюкозодазной активности проводят ферментативную реакцию гидролиза мальтозы в выбранных условиях ( ¿ «> 35°С, рН = 6,8) в течение 60 мин., инактивируют фермент добавлением 5 н раствора соляной кислоты и осветляют раствором Карреза. Одновременно готовят контрольный раствор, в котором фермент инактивируют при комнатной температуре без последующего терыостатирования.

Опытный и контрольный гидролизаты охлаждал*, фильтруют и в фильтратах определяют поляризацию: Пк,- контрольного раствора и П0 -исследуемого, разность мевду которыми (Пк - П0) составляет изменение поляризации, а П. Значение д П не должно быть менее 0,4° . Активность рассчитывают, подставляя значение дП в уравнение (I).

Методика определения "зимазной" активности дрожжей остается той же, но в качестве субстрата используется'Е^-ный раствор глюкозы с рН 4,6, а время реакции - 30 мин. Расчет активности ведется по уравнению (2).

Проверка разработанных методов

Точность и воспроизводимость поляриметрических методов определения ферментативной активности были проверены при анализе различных партий дрожжей в лабораторных и производственных условиях на прибо-

рах различных марок {А1-Ы10, СЛ, СУ-3). Из таблицы I следует, что при определении Х-глюкозидазной активности в параллельных пробах отклонения от средней величины не превышали 4,12%, а "зимазной" - 3,075?; лишь при определении активности в дрожжах неудовлетворительного качества максимальная погрешность равна - 7,28%.

Таблица I

Воспроизводимость поляриметрических методов определения Х-глюкозидазной и "зимазной" активностей (п = 0,5 г/33 см3)

Наименование партии дрожжей { дП,° ! ! | МСп, } ед/г ! Относительная | ошибка,? ,Наимзнова-!дП,° (|Ние партии} '! 1 ! ЗСп, 1 ед/г ! Относи-;тельная. 1 ошибка,%

Партия I 1,42 6,08 -0,16 Партия 1У 0,19 7,66 -2,17

1,44 6,16 +1,15 0,20 8,07 +3,07

1,44 6,16 +1,15 0,20 8,07 +3,07

1,40 5,99 -1,64 0,18 7 ¿26' -7,28

1,42 6,08 -0,16 0,20 8.07 +3,07

X 6,09 X 7,83

Партия П 0,46 1,98 +2,06 Партия У 0,71 28,64 -0,35

0,45 1,92 -1,03 0,72 29,11 +1,25

0,43 1,86 -4,12 0,72 29,10 +1,25

0,46 1,98 +2,06 0,70 28,24 -1,74

0,46 1,98 +2,06 0,71 28,64 -0,35

х 1,94 х 28,74

Партия Ш 3,63 15,52 +0,12 Партия УП 1,50 60,59 +0,97

3,61 15,45 -0,32 1,49 60,01 ±0

3,63 15,52 +0,12 1,47 59,43 -0,97

3,64 15,58 +0,52 1,49 60,01 ±0

3,61 15,45 -0,32 .1,49 60,01 ±0

х 15,50 х 60,01

При проверке точности методов (табл.2) ввдно, что при различных соотношениях фермент - субстрат, значение дП изменяется пропорционально количеству введенных дрожжей; отклонения от средней величин* активности не превышали ±4,11%, тол&ко при определении низких здаче-

Таблица 2

Точность поляриметрических методов определения оС -глюкозидаз-ной и "зимазной" активностей

Образец дрожжей

Концент-| Измерение на А1-Е310 |

рация

Измерение на СУ-3,

!7п?г

МСп, {относит.} — |ошибка, %{

аП ,Т МСп , {относит. $ I ед/г |ошибка,%

Т

ед/г

Дрожжи Московской дрожжевой лаборатории

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

лаборатории

Дрожжи Ленинград- 0,2 ской дрожжевой о 4

0,6 0,8 1,0

Дрожжи Московского дрожжевого завода

0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1,99

4.00

5,97

7.97 9,92

1.01

1.98 2,96 3,98 4,87

0,41 0,60 0,82 0,98 1,19

21,29 21,40 21,29 21,32 21,23 21,31 10,81 10,59 10,56 10,65 10,42 10,61 2,19 2,14 2,19 2,10 2,12 х 2,15

-0,09 +0,42 -О,($9 +0,05 -0,38

+1,90 -0,19 -0,47 +0,38 -1,79

+1,86 -0,47 +1,86 -2,33 -1,40

2,0 4,0

5,9 7,9 9,9

1,0 1,9

3.0

3,9 4,8

0,4 0,6 0,8 0,9

1.1

21,40 21,40 21,04 21,13 21.19 х 21,23 10,70 10,17 10,70 10; 43 10.27 х 10,45 2,14 2,14 2,14 1,93 1,96 х 2,06

+0,80 +0,80 -0,89 -0,47 -0,19

+2,39 -2,68 +2,39 -0,19 -1,72

+3,88

+3,88

+3,88

-6,3

-4,85

г'/ЗЗ см3

Г7п5Г ! ^ '!

Дрожжи Московского дрожжевого завода

Дрожжи Дагестанские, шт. Г-73

0,2 0,4 0,5 0,8 1,0

0,4 0,5 0,8 1,0 1,2

0,29 0,57 0,72 1,14 1,45

0,31 0,39 0,62 0,77 0,91

Хп, {относит. дП,

ед/г {ошибка,Я?

---0,6 0,7 1,2 1,4

ЗСп ед/г

"[относит. I ошибка, %

29,25 28,74 29,04 28,74 29,25 29,00 15,63 15,73 15,62 15,53 15,30 х 15,56

+0,86 -0,90 +0,14 -0,90 +0,80

+0,45 +1,09 +0,45 -0,19 -1,67

0,3 0,4 0,6 0,8 0,9

30,26 30,26 28,24 30,26 28,24 х 29,45 15,13 16,15

15.13

16.14 15,12

х 15,53

+2,75 +2,75 -4,11 +2*75 -4,11

-2,58 +3,90 -2,58 +3,90 -2,64

ний ДП на визуальном сахариметре марки СУ-3 ошибка превысила 5%.

Сравнительные испытания мальтаэников системы Елецкого (диагр. I) показали наличие значительно больших ошибок (до 17%) как методу различными аппаратами, так и при опытах на одном мальтазнике. Принимая во внимание, что в дрожжевой промышленности и при проведении научных исследований этот метод является основным, была поставлена серия экспериментов, результаты которых представлены на рис.6. Эти данные показывают достаточно высокую корреляцию сравниваемых методик в широком диапазоне активностей дрожжей Л^сАзгО/пуйеЗ СВ~

геу/^'ае.

45 у ' О г б 10 ¿4 12> 22 . ЗСй,ед/г МСп,ед/г

Рис.6. Корреляция результатов определения "зимазной" и ¿-глюкози-дазной активностей газометрическим и поляриметрическим методами

Специфичность разработанных методов была подтверждена также приведенными ниже результатами экспериментов. Параллельно анализировали общее количество углеводов в фильтратах исследуемых сред до и после действия ¿-глюкозидазы на мальтозу колориметрическим (антроковым) и поляриметрическим методами. По изменению угла вращения проводили расчет на мальтозу с последующим пересчетом на глюкозу. Оба

МА

(мин)

160 Т

140 -

Точность определения а -глкжозидазнай ективности газометрическим методом на разных мальтазниках.

15.3*

10.3%

Диаграмма 1 12.2%

120

100 -

80 -

60 -

40

20

О +

партии дрожжей

1

1 - дрожжи Московского дрожжевого завода

2 - дрожжи Харьковского дрожжевого завода

3 - дрожжи Ливанского спиртового завода (обр.№1)

4 - дрожжи Ливенского спиртового завода (обр.№2)

5 - дрожжи Ливенского спиртового завода (обр.КЗ)

6 - дрожжи Ливенского спиртового завода (обр. £4)

□

мальтаэник

- мальтаэник К2 мальтазяик ЯЗ

- отнбсительная оиибка

метода показали одинаковые результаты (расхождения 1%), что позволило предположить отсутствие в растворах глюкозы и каких-либо других оптически активных веществ - продуктов гидролиза глюкозы. Для проверки этого предположения в реакционной смеси при действии дрожжей с разной ¿-глюкозидазной активностью определялось содержание глюкозы газохроматографическим и глюкозооксидазным методами. Во всех случаях обнаружены только следа глюкозы, то есть за время инкубации имеет место гвдролиз мальтозы до глюкозы и, далее, ее ферментативное разрушение. Исследования содержания спирта в гидролизатах методом Мартена показали, что его количество практически соответствует количеству прогидролизованной мальтозы и, соответственно, расчетному количеству глюкозы (табл. 3).

Таблица 3

Результаты определения содержания спирта в гидролизатах

№ ГдП,Г~МСп, Г Углеводы, г I Спирт, г

партии п } _„/_------1------1------------г--------

дрож- ,,прогвдро-{образовав-!рассчитанный по ¡практически жей | ¡лизован- ¡шаяся количеству обра- измеренный

• :ная маль-;глюкоза ¡зовавшейся глю- ¡(по марте-

{ | ¡тоза [ |козы ¡ну)

1 1,6 6,85 0,070 0,074 0,0378 0,0370

2 1,2 5,14 0,053 0,056 0,0286 0,0276

3 0,4 1,71 0,018 0,019 0,0097 0,0093

Принимая во внимание, что приведенные выше исследования поставлены с дрожжами различной ферментативной активности, можно констатировать:

- поляриметрический метод объективно характеризует активность ^-глвкозидазы;

- при гидролизе мальтозы с последующим сбраживанием глюкозы до этилового спирта и диоксида углерода с использованием дрожжей $асс-/? агОтуСВЗ сегемр/'зе , полученных в анаэробных условиях на

мелассных средах, лимитирующим процесс фермвгасм является оО-глюко-з ид аза.

На основании приведенных выше исследований можно также сделать вывод о специфичности определения "зимазной" активности поляриметрическим методом с использованием в качестве субстрата глюкозы.

Оценку воспроизводимости и достоверности разработанного метода проводили также с использованием методов математической статистики (Алесковский, 1988; Рухлядева, 1981). Обработка экспериментальных данных осуществлялась с использованием микрокомпьютера типа „ ffld --cintosti" . Для oC-глюкозвдазной активности СМСп) дрожжей отличного качества дисперсия (Д) составила 0,0298, стандартное отклонение (<?) ± 0,1727, коэффициент вариации (И^) 1,1075%, доверительный интервал ¿0,21, что говорит о достаточной точности методов. Коэффициент корреляции (f) для всех значений значительно меньше, чем его предельное значение следовательно, результаты измерения актив-

ности не зависят от типа прибора.

Методики выполнения измерений были аттестованы, что подтверждено свидетельством о метрологической аттестации № 002 от 28,11.90 и » 006 от 17.12.90.

Апробация поляриметрических методов в условиях производства и научно-исследовательских лабораторий.

Оценка поляриметрических методов проводилась на нескольких дрожжевых заводах страны, а также специалистами ВУЗов и НИИ. Изучалась применяемость методов для характеристики дрожжей на всех стадиях их культивирования, а также в оценке селекционируемых чистых культур. В прилагаемых к диссертации документах отмечены следующие положения: метод быстр, прост и удобен в исполнении, установлена взаимосвязь между поляриметрическим и газометрическим методом, относительная ошибка измерения не превышает ¿5% (за исключением одной партии с

низкой активностью — I 2 ед/г).

Для удобства и оперативности использования поляриметрических методов составлена взаимосвязанная с газоивтрическим; методом оценоч~ ная таблица градаций (групп) дрсяжеЯ по об-глюкозидазнсЖ и "зимазной" активносюпи

Таблица 4

Оценка качества хлебопекарных дрожжей

Качество Г«1 -глюкозидазная активность* "зимазная" актив-дрожжей ^ (МСп), ед/г j ность,(ЗСп), ед/г

Яеуцовлетвори-

гельнов МОшб 2 ЗСп 4 15

Удовлетворительное 2 < МСп ¿4 15 < ЗСп г» 35

Хорошее 4 <£ МСп ^ 8 35 < ЗСп ^ 55

Зтличноа; МСп> 8 ЗСп> 55

Использования. поляриметрических методов в хлебопекарном д спиртовом- производствах

На основании комплексных исследований с<-глюкозидазной(МСп) и 'зимазной" (ЗСп), активностей дрожжей поляриметрическим методом; в сочетании с изучением их биотехнологических свойств (по методике ШИПП) установлено, что определение ферментативной активности дрожгей. по

показателям (МСп и ЗСп) может дать объективную оценку микроорганизмам и может быть использован для прогнозирования технологического фэцвсса производства хлеба, а показатель -глюкозидазной активно— ¡ти служить критерием продолжительности тестоприготовления»'

Проведена лабораторная апробация применимости поляриметрического гатода дря оценки качества спиртовнх дрожжей. Параллельное исслвдова» гав дрожжей методами бродильных проб (Долнгалина, 1986) и поляримет-зичвским!показало их корреляцию (табл.'5), чем выше ферментативная, живность дрожжей, тем лучше технологические показатели зрелой ¡ражки о явной тенденцией к увеличению выхода этанола.

Таблица 5

Технологические показатели сбраживания сусла с помощью дрожжей, обладающих разной ферментативной активностью

"ту------№ бродильной пробы Показатели^ ' ! I '1-----1 1 П ! г---- 1 Ш !

I. С0£, г 14,63 15,05 13,67

2. Кислотность, °Д 0,35 0,38 0,38

3. Несброженные углеводы, г/100 мл 0,237 0,201 0,299

4. Общие углеводы, г/100 мл 0,348 0,294 0,443

5. Нерастворимый крахмал, г/100 мл 0,100 0,137 0,138

6. Выход спирта, дал/г 66,87 68,76 62,48

7. "Зимазная" активность дрожжей, ЗСп, ед/г 32,27 38,24 20,17

8. Мальтазная активность дрожжей, МСп, ед/г 6,37 6,93 4,28

*^ - Среднее значение из 7 параллельных значений

Принимая во внимание то, что разработанный метод более быстрый в исполнении и менее трудоемкий, можно рекомендовать его применение для оценки ферментативной активности спиртовых дрожжей при проведении работ в научно-исследовательских лабораториях.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны объективные поляриметрические методы определения оС-глюкозидазной и "зимазной" активностей хлебопекарных дрожжей, предназначенные для контроля качества дрожжей $асС бэготусе? СЁ-Г£\/1 УI' <3 е как в процессе их производства, так и применения в хлебопечении. Метод определения <^-глюкозидазной активности дрожжей защищен авторским свидетельством № 1654335.

2. Экспериментально показано, что разработанные методы обладают достаточной специфичностью, высокими точностью и воспроизводимостью, что подтверждено результатами математической обработки с использованием микрокомпьютера типа т;/7Тасм^овЬ и свидетельством о метрологической аттестации методики проведения измерения активности »С-глю-

козвда-зы и "зимазы". Относительная ошибка метода не превышает -9/о, систематическая погрешность - 1,3%.

3. Установлено, что при гидролизе мальтозы до глюкозы с последующим ее сбраживанием до этилового спирта и диоксида углерода с использованием дрожжей ЯассЬзготусе? сегг /¡з/ае , полученных в аэробных условиях на мелассных средах, лимитирующим процесс ферментом является (¿-глюкоз ид аза.

4. Для оперативного практического использования поляриметрических методов, на основании результатов сравнительных анализов определения ферментативной активности дрожжей ЗзссЬаготусея сегеп'я/ге газометрическим и поляриметрическим методами,разработаны критерии оценки их качества.

5. Независимая апробация разработанных методов в условиях производства и научно-исследовательских лабораторий подтвердили их воспроизводимость, точность, простоту и удобство для характеристики хлебопекарных дрожжей на всех стадиях их получения и в оценке селекционируемых чистых культур, о чем свидетельствуют акты.

6. Показано, что с применением поляриметрических методов определения Х-глюкозиД^ной и "зимазной" активностей дрожжей можно вести оценку качества хлебопекарных дрожжей в технологическом процессе приготовления хлеба, а по показателю «¿^глюкоз вдаз ной активности дрожжей прогнозировать продолжительность процесса созревания теста.

7. Установлено, что с помощью разработанных поляриметрических методов возможно оценивать ферментативную активность чистых культур дрожжей 'ЗдСсЬагОтуйез сегеу!£1де , используемых в производстве этанола. Показано влияние качества используемых дрожжей на показатели сбраживания сусла.

8. Использование разработанных поляриметрических методов в научных исследованиях и производственной практике позволит вести налрав-

ленную селекцию чистых культур, осуществлять быстрый и объективный контроль ферментативной активности дрожжей на всех стадиях их культи»-вирования со своевременным принятием корректирующих решений, прогнозировать и регулировать процессы хлебопечения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Абрамова И.М., Чередниченко B.C., Рухлядева А.П., Пискарева E.H., Воробьева Т.Г. Определение о(.-глюкозвдазной активности хлебопекарных дрожжей.// Пищевая промышленность. - I99I.-№ I. - с.69-70.

2. A.c. J? 1654336 СССР. Способ определения активности аыилоли-тических ферментов.// Чередниченко B.C., Рухлядева А.П., Абрамова И.М., Пискарева E.H., Воробьева Т.Г. Опубл. Б.И., 1991.- № 21.

3. Чередниченко B.C., Абрамова И.М., Рухлядева А.П., Пискарева E.H. Биохимический метод определения ферментативной активности хлебопекарных дрожжей.// Тезисы.- Киев; 1991, - с.143.

4. Абрамова И.М., Чередниченко B.C., 1^ухлядева А.П., Пискарева E.H. Поляриметрический метод определения о(.-глюкозидазной (мальтаз-ной) активности хлебопекарных дрожжей и его значение в повыпении эффективности использования дрожжей.// Тезисы. - Череповцы; 1991,-т.П.- с.128.

5. Абрамова И.М., Чередниченко B.C., Рухлядева А.П., Пискарева E.H. Проверка метода определения мальтазной активности дрожжей.// Пищевая промышленность. - 199I. - * 10. - с.95-96.

6. Чередниченко B.C., Абрамова И.М., Рухлядева А.П. Унифицированный метод характеристики качества хлебопекарных дрожжей.// Тезисы.- Москва, 1991.- ч.1. - с.13-14.

7. Чередниченко В., Абрамова И., рухлядева А., Пискарева Е. Оценка качества хлебопекарных дрожжей с помощью унифицированного метода определения ферментативной активности.// Международный сельско-