автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка бактериального препарата на основе штамма-продуцента нитритредуктазы для снижения остаточного нитрита натрия в мясных продуктах

На правах рукописи

ЛАПТЕВ ИВАН АЛЕКСАНДРОВИЧ

РАЗРАБОТКА БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА НИТРИТРЕДУКТАЗЫ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ОСТАТОЧНОГО НИТРИТА НАТРИЯ В МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ

Специальность 05.18.07-Биотехнология пищевых продуктов (перерабатывающие отрасли АПК)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2008

003456633

Работа выполнена на кафедре «Технология мяса и мясных продуктов» Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (ГОУ ВПО МГУПБ)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

- доктор технических наук, профессор Владимир Васильевич Хорольский

- доктор технических наук, профессор Сергей Игоревич Хвыля

- кандидат биологических наук Патрушева Елена Викторовна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»

Защита диссертации состоится «18» декабря 2008 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.149.01. при ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33.

Автореферат разослан «17» ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат технических наук, профессор

У

2,

А.Г. Забашта

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Повышение качества, а, следовательно, безопасности выпускаемой продукции, является одной из важных задач, стоящих перед пищевой промышленностью. Эта задача в полной мере относится к мясному производству.

Пропаганда продуктов здорового питания обуславливает возрастающий к ним потребительский интерес, тем самым, вынуждает производителей все больше обращать внимание на качество выпускаемых продуктов питания.

В мире широко освещена проблема присутствия остаточного нитрита натрия в мясных продуктах и его негативного влияния на здоровье людей. На сегодняшний день вопрос о возможных путях снижения содержания нитрита натрия в мясных изделиях является весьма актуальным. Отсутствие веществ, способных функционально заменить нитрит натрия, не позволяет полностью исключить его из рецептур мясных продуктов, поэтому необходимо вести работы по изысканию способов снижения его остаточных концентраций.

Одним из основных приемов восстановления нитрита натрия в технологии мясопродуктов является использование различных денитрифицирующих стартовых культур, но ограничение по уровню вводимых микроорганизмов все же не позволяет получать продукты с полным отсутствием нитрита натрия. Это связано с недостаточно высоким уровнем синтеза фермента нитритредуктазы.

Благодаря развитию таких наук, как генетика и молекулярная биология, стало возможным получение микроорганизмов с заданными свойствами. Генная инженерия обладает хорошо разработанным инструментарием, что позволяет изменять протекание различных биохимических реакций в микроорганизмах согласно поставленным задачам. Технология рекомбинантных ДНК является перспективным способом, как для повышения экспрессии различных ферментов бактериальными штаммами, в частности, нитритредуцирующего белка, так и для инактивации нежелательных путей синтеза.

Теоретическим и практическим работам, основанным на фундаментальных исследованиях в области биотехнологии и генной инженерии, посвящены многочисленные научные труды отечественных и зарубежных ученых: Л.В. Антиповой, В.И. Ганиной, Г.Ф. Жукова, В.А. Лившица, H.H. Липатова (мл.),

A.Б. Лисицына, Л.Ф. Митасевой, И.А. Рогова, В.И. Соловьева, Е.И. Титова,

B.В. Хорольского, S. Erkkila, F. Götz, R. Cammack, R. Knowles, B. MacDonald, F. Niinivaara, R.P. Novick, J.A. Perigo, C.S. Tellefson, W.G. Zumft.

Данная работа была направлена на получение, с помощью генной инженерии, штамма микроорганизма активно редуцирующего нитрит натрия, исследование его способности восстанавливать нитрит натрия в модельной фаршевой системе, изучение целесообразности его применения в технологии мясных продуктов, в частности, вареных колбас.

Цель и задачи исследования

Целью работы является разработка бактериального препарата на основе штамма-продуцента фермента нитритредуктазы для снижения остаточного нитрита натрия в мясных продуктах.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• выбрать штамм из коллекции МГУПБ для создания штамма-продуцента фермента нитритредуктазы;

• получить штамм-продуцент фермента нитритредуктазы с применением генной инженерии;

• установить значения остаточных концентраций нитрита натрия в модельных фаршевых системах при использовании штамма-продуцента;

• оценить степень биологической безопасности штамма-продуцента in v/vo;

• разработать бактериальный препарат на основе штамма-продуцента фермента нитритредуктазы;

• разработать и утвердить нормативную документацию на бактериальный препарат;

• оценить эффективность использования штамма-продуцента фермента нитритредуктазы для снижения уровня остаточного нитрита при производстве мясных продуктов на примере вареных колбас;

• изучить влияние бактериального препарата на микробиологические, органолептические, химические и технологические показатели вареных колбас;

• разработать рецептуру и технологию вареной колбасы с использованием бактериального препарата, апробировать ее в производственных условиях и разработать проект нормативных документов на данный вид изделий.

Научная новизна работы ■Проведено сравнение нитритредукгазной активности штаммов Staphylococcus carnosus и Staphylococcus xylosus коллекции МГУПБ, и выбран штамм с максимальной денитрифицирующей активностью -Staphylococcus carnosus В-8953; ■ Путем генетических методов получен штамм-продуцент фермента нитритредуктазы на основе штамма Staphylococcus carnosus (thyA'). Показана важность наличия всех белковых продуктов нитритредуктазного оперона штамма Staphylococcus carnosus для активного восстановления нитрита;

• Установлено, что в модельных фаршевых системах штамм-продуцент полностью восстанавливает нитрит в количестве 3 мг на 100 г фарша за 6 ч, 5 мг/100 г - за 12 ч, 7,5 мг/100г-за 14 ч;

• Применение бактериального препарата на основе штамма-продуцента нитритредуктазы обеспечивает полное восстановление нитрита натрия в мясных изделиях.

Практическая значимость

• Проведены доклинические испытания штамма-продуцента S. carnosus L1A-96 in vivo на белых линейных мышах, в результате которых штамм был признан безопасным по показателям безвредности, токсичности, токсигенности и вирулентности;

• Штамм Staphylococcus carnosus LIA-96 депонирован по форме национального патентного депонирования в ВКПМ ГосНИИгенетика под номером В-9518;

• На основе штамма-продуцента фермента нитршредукгазы разработан бактериальный препарат «Биоцвет» для производства термически обработанных предварительно ферментированных мясных изделий, ТУ 9229-047-02068640-07, применение которого позволяет получать вареные колбасные изделия с полным отсутствием нитрита без снижения показателей качества;

• Установлен оптимальный уровень вводимого бактериального препарата «Биоцвет» - 100 г на 100 кг фарша во время посола мясного сырья при содержании клеток 109 КОЕ/г и оптимальные режимы посола (вакуумная мешалка, время посола - 6 часов, t = 8...12 °С);

• Проведены исследования органолептическлх, химических, микробиологических показателей опытных образцов вареных колбас. Установлено, что во всех образцах, кроме контрольного, отсутствуют ионы нитрита. При этом образец, приготовленный с добавлением 0,003% нитрита, не уступал контрольному по качественным характеристикам.

• В результате проведенных исследований и производственных испытаний в промышленных условиях ОАО «ИКМА» разработана рецептура и технология, а также проект нормативной документации на колбасу вареную «Экстра-М» первого сорта, ТУ 9213-...-02068640-08.

Апробация работы

Основные положения работы и результаты исследований были представлены на следующих конкурсах и конференциях:

Финалист конкурса на1 премию Георга Фридриха Хана, Немецко-Русский институт современных технологий пищевых продуктов и маркетинга (Санкт-Петербург, 2004).

Медаль за разработку штамма-продуцента фермента нитритредуктазы, полученная на конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007).

Победитель молодежного научно-инновационного конкурса «УМНИК 2007» (Пущино, 2007).

Диплом за разработку бактериального препарата «Биоцвет», полученный на конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2008).

Всероссийский конкурс на лучшие научные работы студентов по техническим наукам (проекты в области высоких технологий) и инновационным научно-образовательным проектам (Москва, 2004).

Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2006), II Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003,2005,2007,2008),

Научно-практическая конференция «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем» (Калининград, 2005), Международная конференция «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004), Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006), VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007).

Технология апробирована в промышленных условиях ОАО «ИКМА».

Публикации

По результатам исследований, изложенных в диссертационной работе, опубликовано 14 печатных работы, (в т.ч. статей в журналах, рекомендованных ВАК - 2, в других изданиях -11), 1 патент, лабораторный практикум.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, экспериментальной части с обсуждением результатов исследований, выводов, списка литературы, содержащего 103 источников, в том числе 95 работы зарубежных авторов, и приложений.

Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 47 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение.

Обозначена актуальность проблемы содержания остаточного нитрита натрия в готовых мясных изделиях, его влияния на здоровье людей; определено направление решения этой проблемы, сформулированы цели и задачи исследований.

Глава 1. «Литературный обзор».

В данном разделе представлен анализ научно-технической литературы об использовании нитрита натрия при производстве изделий из мяса, а именно: история применения, механизмы предотвращения микробиологической порчи и окислительных изменений липидов, корреляция с органолептическими свойствами готового продукта. Представлена информация о химическом аспекте формирования органолептических свойств, в том числе окраски, мясных продуктов при использовании нитрита натрия. Приведены данные о негативном влиянии на здоровье людей остаточного нитрита натрия и возможные способы его снижения. Подробно раскрыто участие микрофлоры в процессах восстановления ионов нитрита, в частности микроорганизмом Staphylococcus carnostis.

Глава 2. «Методика постановки эксперимента и методы исследований», в которой представлена схема проведения эксперимента (рис. 1), дана характеристика объектов исследований, указаны исследуемые показатели и изложены методы их определений.

В работе использовались следующие методы исследований:

1-14 - стандартные генетические методы (Маниатис Т. и др., 1984);

15 - получение мутантных штаммов, дефектных по гену thy А;

16 - приготовление компетентной культуры Staphylococcus carnosus для трансформации электропорацией; 17 - электропорация культуры S. carnosus; 18 - определение содержания нитрита натрия в бактериальной среде и мясных продуктах - по ГОСТ 29299; 19 - пероксидного числа - методом определения степени окисления жира, основанном на окислении йодисто-водородной кислоты пероксидами, содержащимися в жире, с последующим отгитровыванием йода тиосульфатом натрия; 20 - дистилляционный метод определения окислительных изменений с 2-тиобарбитуровой кислотой; 21 - определение кислотного числа; 22 - определение содержания нитрозопигментов - по методу Hornsey; 23 - органолептических показателей - по ГОСТ 9959; 24 - микробиологических показателей - по ГОСТ 9958; 25 - количества молочнокислых микроорганизмов - по ГОСТ 10444.11-89; 26 - влагосвязывающей способности - методом прессования по П. Грау и Р. Хама в модификации В. Воловинского и А. Кельман; 27 - величины рН -потенциометрическим методом; 28 - определение массовой доли влаги - по ГОСТ 9793; 29 - массовой доли белка - по ГОСТ 25011; 30 — массовой доли жира

- методом Сокслета по ГОСТ 26183; 31 - массовой доли золы - методом озоления и прокаливания исследуемого продукта; 32 - массовой доли хлорида натрия - по ГОСТ 26186; 33 - клинические испытания in vivo проводились в соответствии с санитарными правилами СП 3.3.2.561-96 в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Повторность опытов трех- и пятикратная, обработку экспериментальных данных проводили методами математической статистики.

Объектами исследований являлись:

- денитрифицирующие штаммы Staphylococcus carnosus (В-8950, В-8951 и В-8953) и Staphylococcus xylosus (В-8944 и В-8945) коллекции МГУПБ;

- плазмидные и хромосомные молекулы ДНК;

- штамм-продуцент фермента нитритредуктазы Staphylococcus carnosus LIA-96 (В-9518);

- фаршевые модельные системы, изготовленные с добавлением штамма-продуцента фермента нитритредуктазы;

- бактериальный препарат «Биоцвет», содержащий штамм-продуцент фермента нитритредуктазы (В-9518);

- опытные образцы вареных колбас, изготовленные с применением бактериального препарата «Биоцвет».

Рисунок I - Cxe.ua проведения эксперимента

Глава 3. Разработка систем селекции и экспрессии. Получение штамма-продуцента фермента нитритредуктазы.

Выбор штамма основан на его способности наиболее полно восстанавливать ионы нитрита в культуральной среде. Для этого был проведен скрининг штаммов сагпохих В-8950, В-8951 и В-8953 и 5. хуЬхиз В-8944 и В-8945. В результате исследования было установлено, что все штаммы 5. сатотх имеют приблизительно одинаковые, и ббльшие, чем у штаммов 5. хуЫиз, значения скорости утилизации нитрита натрия (рис. 2).

■ В-ЙЖ -Г-&Д945 1В-Ш50 -«-В-8Э51 B4SS3

Рисунок 2 - Утилизация нитрита натрия штаммалш S. carnosus и S. xylosus при культивировании в L-средепри t=20 °С

Исходя из полученных данных, для создания продуцента нитритредуктазы использовали штамм S. carnosus В-8953, который, в сравнении с другими штаммами S. carnosus, эффективнее утилизирует нитрит натрия.

У выбранного штамма S. carnosus В-8953 была проверена целесообразность замещения промотора нитритредуктазного оперона как способа увеличения количества мРНК и, соответственно, выхода фермента нитритредуктазы.

В связи с противоречивыми данными о роли белкового продукта гена n/rR, его влиянии на нитритредуктазную активность, было решено проводить замену промоторной части как гена nirR, так и гена sir А.

Для усиления транскрипции оперона был выбран ранее изученный промотор гена xylA штамма Staphylococcus xylosus с геном белка-регулятора xylR или без него. Наличие гена, кодирующего белок-регулятор позволяет контролировать уровень экспрессии целевого фермента, и таким образом, дает возможность избежать больших количеств белка, которые могут быть токсичными для клетки. Быстрый отбор трансформантов осуществляли за счет использования в качестве селективного маркера гена устойчивости к эритромицину егт из транспозона 917.

Клонирования в штаммах Staphylococcus carnosus проводили с помощью плазмиды pBTmcs, которая элиминируется из клетки при 38 °С. Плазмида pBTmcs была сконструирована на основе вектора pTVlts, она включает в себя термочувствительный репликон рЕ194 Is rep грамположительных бактерий, множество сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции, а так же селективный маркер - ген cat, отвечающий за устойчивость к хлорамфениколу (рис. 3).

Pst 1 (1)

Isda I(i)

Нтс 11 (4044) flAvaliiQ)

/№1(4043) \ I Xma I(io)

Sal 1(4042) \ \!/s<na\Uii

А*М (4036) вшпШ (4030]

АоЛЦ (14)

Я'рл1 (18)

£00241(24)

R! (26) pE194ts rep

Рисунок 3 - Карта плазмиды pVC-BTmcs

Отсутствие чужеродных генетических элементов является обязательным условием при использовании штамма в пищевой промышленности, поэтому в дальнейшем селективный маркер ген егт был замещен геном thy к, а промотор гена xylA более сильным промотором гена gap, которые были получены из штамма Staphylococcus carnosus В-8953. Введение конечной конструкции осуществлено в штамм 5. carnosus (thyА').

Общая схема получения штамма-продуцента фермента нитритредуктазы представлена на рисунке 4.

Первоначально для замещения промотора гена nirR через ряд клонирований были получены две плазмиды: pUC-nirC-Em-xyl-nirR и pUC-nirC-Em-dxyl-nirR (рис. 5 и 6).

Данные плазмиды состоят из вектора pUC19 и фрагмента для интеграции. Фрагменты для интеграции включают в себя два участка гомологии к хромосомным генам оперона nir, между которыми расположены селективный маркер (егт) и следующий за ним промотор гена xylA. Участки гомологии соответствуют последовательностям генов nirC и nirR. В плазмиде pUC-nirC-Em-xyl-nirR синтез белкового продукта гена xylA дополнительно находится под контролем белка-регулятора - гена дгу/R.

Аналогичным образом были сконструированы плазмиды pUC-nirR-Em-xyl-sirA и pUC-nirR-Em-dxyl-sirA для замещения промотора гена sir А.

10

Рисунок 4 - Схема получения штамма-продуцента фермента нитритредуктазы генно-

инженерными методами

Рисунок 5 - Карта плазмиды Рисунок б - Карта плазмиды

р VС-шгС-Ет-хуМгН риС-тгС-Ет-(1хуШгЯ

Фрагменты для интеграции из pUC19 далее были перенесены на вектор pBTmcs, полученные вектора названы pBT-Em-xyl-nirR, pBT-Em-dxyl-nirR, рВТ-Еш-xyl-sirA, pBT-Em-dxyl-sirA (рис. 7, 8).

Для замещения промоторов P„,rR и РЯ,А, четыре конечных вектора были трансформированы в компетентные клетки штамма S. carnostis, замена участка хромосомы фрагментом для интеграции происходит за счет двойного кроссинговера. После высева на селективную среду отбирают клетки, потерявшие селективный маркер плазмиды (cat), но сохранившие маркер, расположенный в интегративном фрагменте (егт).

рЕ194 ts rep

Риуиг-t

B1BI5I (4963)

nlfC-flank"'

Рисунок 7 - Карта плазмиды Рисунок 8 - Карта плазмиды

рВТ-Ет-хуШгЯ рВТ-Ет-вхуШгЛ

Наличие замены промоторов гена и/Ж или л/гА в полученных штаммах проверили с помощью ПЦР по парам праймеров пнС-Б - п№(соп{)^ и шгС-Е -зцАшгВ(сопО^, соответственно. Результат ПЦР представлен на рисунке 9. ЖТГ'Г"

. 4797 пн ■ 4217 пн

Рисунок 9 - Электрофорез ПЦР-продуктов с хромосом штаммов трансформированных плтмидами: 1-рВT-Em-xyl-sirA, 2-pBT-Em-xyl-nirR, 3-pBT-Em-dxyl-slrA, 4-pBT-Em-dxyl-nirR, М-маркер молекулярного eeat GeneRuler 1 kb

Поскольку удалось получить замещение промоторов Р„„я и ?шА, используя плазмиды без регуляции гена ху!А, т.е. нарабатываемый в большом количестве белок не является токсичным для клетки, исследование скорости утилизации нитрита натрия проводили на штаммах без регуляции нового промотора нитритредуктазного оперона. В случае замены промотора перед геном ш>Я штамм был назван 5. сагпояиз 1ЛА-12, а при замене перед геном лгА - 5. сагпо$ш 1ЛА-14.

Как видно из графика на рисунке 10, в анаэробных условиях штамм S. carnosus LIA-14 имеет нитритредуктазную активность значительно ниже чему у S. carnosus В-8953, что показывает важность белкового продукта гена nirR при восстановлении ионов нитрита натрия. По этой причине данный штамм и плазмиду pBT-dxyl-sirA не использовали в дальнейших исследованиях.

27.5

6 8 10 Время, час

-ВД953 -A -UA12

-ЦАг14

Рисунок 10 - Утилизация нитрита натрия штаммами S. camosus LIA-12, S. carnosus LIA-14 и S. carnosus (В-8953) при культивировании в L-cpede при t=20 °С

Напротив же, штамм S. carnosus LIA-12 полностью утилизировал нитрит натрия уже за 14 часов культивирования, в то время как контрольный штамм за 16 часов восстановил ионы нитрита до концентрации 5 мг/100 мл. Далее работу вели с плазмидой pBT-dxyl-nirR.

В связи с тем, что в промышленности неприемлемо использование в качестве селективного маркера гена устойчивости к антибиотику, ген егт в плазмиде pBT-dxyl-nirR заменили геном thy к с образованием вектора pBT-thyA-dxyl-nirR. Для того, чтобы микроорганизм не имел статуса «генетически модифицированного» допускается введение только собственного генетического материала, по этой причине промотор гена xylA в конечной конструкции заменили на ранее неизученный промотор гена gap (Pgap) из S. carnosus (В-8953). Полученная плазмида была названа pBT-thyA-gap-nirR (см. рису. 11).

рЕШПгар

Рисунок 11 -Карта плазмиды pBT-thyA-gap-nirR 13

После наработки в В. sublilis, плазмиду pBT-thyA-gap-nirR трансформировали в компетентные клетки мутантного штамма Staphylococcus carnosus LIA-25 (thyА"). Данный штамм не способен расти на среде GS без добавления тимидина. Трансформанты отобрали путем высева на среду GS без добавления тимидина. Колонии проверили путем ПЦР на наличие замены промоторов гена nirR по праймерам nirC-F - nirR(conf)-R (рис. 12).

пгг~п

I -»* J ' !

' IkM *

■ Д ' ^- 3200 ПН

2»

я* '

I j Рисунок 12- Электрофорез ПЦР-продукпт с хромосомы

1 ^ " '1 штамма S. carnosus LIA-25 трансформированного

t^,«v J плазмидой pBT-thyA-gap-nirR, где 1 - ПЦР фрагмент 3,2 тпн,

I ^ 1 М-маркер молекулярного eecaGeneRuler 1 kb

В результате интеграции мутантный штамм приобрел способность расти на среде без добавления тимидина в состав питательной среды. Схема процесса интеграции плазмиды pBT-thyA-gap-nirR изображена на рисунке 13. Полученный

Рисунок 13-Замена промоторной области гена тгЯ с помощью плазмиды рВТ-ЛуА-ёар-тгЯ

Оценки скорости утилизации нитрита натрия полученным продуцентом представлены в виде графика на рисунке 14. Как видно из графика, за 12 часов культивирования штамм 5. сагпозш 1ЛА-96 полностью утилизировал нитрит натрия, в то время как исходный штамм 5. саглсш« В-8953 только на 50%.

Время, час

—^-В-8953 —■—LIA-12 -ú.- LIA-96 Рисунок 14 - Утилизация нитрита натрия штаммами L1A-12, L1A-96 и В-8953при культивировании в L-cpede при t=20 "С Глава 4. Изучение нитритредуктазной активности штамма S. carnosus LIA-96 с использованием модельной фаршевой системы.

Для оценки нитритредуктазной активности полученного продуцента в мясных продуктах были использованы модельные фаршевые системы, состоящие из фарша (34% говядины 1 сорта + 64% свинины полужирной), глюкозы (2%), MgS04 (0,00035%) и нитрита натрия до конечных концентраций 3, 5, 7,5 мг на 100 г фарша. В качестве стартовой культуры использовали штаммы S. carnosus LIA-96 и S. carnosus В-8953 (контрольный), при их введении 2*10® клеток на 100 г фарша. Образцы выдерживали в анаэростате при 14 °С и отбирали пробы через равные промежутки времени. Динамика изменения концентрации нитрита натрия в образцах показана на рисунках 15,16 и 17, соответственно.

С повышением концентрации нитрита натрия наблюдается отдаление во времени начала активного'восстановления ионов нитрита при использовании контрольного штамма, в случае же применения штамма S. carnosus LIA-96 данное явление не наблюдается. Это связано с регуляцией промоторов PmrR и Pg4> оперона nir в штаммах, а так же с токсичностью нитрита при высоких его концентрациях. Поскольку сила промотора Pgap выше, следовательно, осуществляется более быстрое накопление белкового продукта nir-оперона и последующая редукция токсичного для клетки нитрита. В случае же Р,„, происходит постепенная активация синтеза белка и, следовательно, замедление начала активного роста бактерий.

Во всех образцах, в которых был добавлен штамм S. carnosus В-8953, не происходит полного восстановления нитрита натрия за 18 ч. При добавлении к образцам штамма 5. carnosus LIA-96 нитрит натрия не обнаруживается через 6 ч при его введении 3 мг на 100 г фарша и через 14 ч при введении 7,5 мг на 100 г, причем скорость его восстановления выше в сравнении с контролем. Предположительно, данная закономерность связана с постепенным снижением уровня активатора транскрипции нативного промотора P,„,R - нитрита, что приводит к уменьшению синтеза редуцирующего фермента штаммом S. carnosus В-8953.

О 2 4 в в 10 12 14 te te 20 Время, час

Рисунок 15 - Утилизация нитрита натрия 5*. са/ткши ЫА -96 и X сатозм В-8953 в фаршевой системе при введении нитрита натрия Змг на 100 г продукта

Время, час

Рисунок 16 - Утили зация нитрита натрия S. carnosus LIA -96 и S. carnosus В-8953 в фаршевой системе при введении нитрита натрия 5 мг на 100 г продукта

Время, час

Рисунок 17 - Утилизация нитрита натрия Sxarltosus ЫА-96 и З.сатозия В-8953 в фаршевой системе при введении нитрита натрия 7,5мг на 100 г продукта

16

Глава 5. Обоснование и разработка бактериального препарата «Биоцвет».

В результате доклинических испытаний in vivo на белых линейных мышах, проведенных в ГИСК им. J1.A. Тарасевича, штамм S. carnosus LIA-96 был признан безопасным по показателям безвредности, токсичности, токсигенности и вирулентности.

Исследование безвредности проводили введением перорально дозы 10" КОЕ/0,5 мл, в качестве контроля служила группа мышей, получавшей физиологический раствор. На окончание времени исследования состояние животных в разных группах не отличалось.

При определении острой и хронической токсичности микроорганизм вводился per os (перорально) в течение 7 и 30 сут (вводимая доза 104 КОЕ/0,5 мл). Гистология внутренних органов (миокарда, тимуса, легких, печени, селезенки, почек, кишечника, желудка, корня языка, головного мозга) проводилась на 1 и 7 сут после прекращения введения штамма. Были исследованы 4 группы животных (по 10 мышей в каждой): 1 - подопытная (вводились живые клетки), 2 -подопытная (инактивированные клетки), 3 - контрольная (физраствор) и 4 -интактная. При изучении вирулентности, общей токсичности и токсигенности вводили внутрибрюшинно (106, 107 и 108 КОЕ/0,5 мл) суспензию живых клеток, инактивированных клеток и культуральную среду, освобожденную от клеток центрифугированием, соответственно. Наблюдение за изменением поведения, внешнего вида и веса животных осуществляли в течение 5 сут. Сравнение проводилось с интактными и контрольными животными. Изменений у подопытных животных, по сравнению с контрольными и интактными, выявлено не было.

Штамм Staphylococcus carnosus LIA-96 находится на национальном патентном депонировании в ВКПМ ГосНИИгенетика под номером В-9518.

Молекулярно-генетическая экспертиза ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН бактериального препарата «Биоцвет» установила, что штамм 5. carnosus LIA-96 не является генетически модифицированным микроорганизмом, так как был получен путем перестройки собственного генетического материала без включения в его состав чужеродной ДНК. Показана фенотипическая и генотипическая стабильность данного штамма, а также отсутствие в геноме штамма S. carnosus LIA-96 генов (sea, seb, sec, sed, see, eta, etb, tst), кодирующих белки-токсины.

На основе штамма В-9518 разработан состав бактериального препарата «Биоцвет» для производства термически обработанных предварительно ферментированных мясных изделий (ТУ 9229-047-02068640-07).

Для приготовления закваски использовали обезжиренное молоко. Средой же для наращивания денитрифицирующих стафилококков служила сыворотка с добавлением буферных солей и витаминов. Наращивание культуры проводят после добавления к питательной среде 5-8 % бактериальной закваски. После получения биомассы проводят отделение денитрифицирующих стафилококков от питательной среды на продезинфицированной центрифуге.

В качестве протекторной среды для создания бактериального препарата применяли раствор, включающий стерильное обезжиренное молоко с 10% содержанием сухих веществ - 52,5%; водный раствор лимоннокислого натрия -15%; водную суспензию желатозы - 22%; водный раствор сахарозы - 10%; водный раствор никотиновой кислоты - 0,5%. Биомассу в асептических условиях смешивали в предварительно продезинфицированном смесителе с защитной средой в атмосфере азота или воздуха в соотношении 1:1.

Лиофилизацию проводят в лиофильной сушилке «ЛС - 1000» фирмы «Рго1пТеЬ» (Пущино) при рабочем давление в вакуумной камере сушилки 6,67 Па (5х10'2ммртст).

Содержание микроорганизмов в бактериальном препарате «Биоцвет» составляет не менее 109 КОЕ/г согласно СанПиН 2.3.2.1078-01, индекс 1.9.9.3.

Глава 6. Комплексное исследование вареных колбас, изготовленных с применением бактериального препарата «Биоцвет». Для оценки эффективности восстановления нитрита натрия в мясных продуктах были изготовлены опытные образцы вареных колбас с введением бактериального препарата «Биоцвет» и добавлением 3, 5 и 7,5 мг нитрита натрия на 100 г сырья (образцы № 2, 3 и 4 соответственно), согласно технологической схеме (рис. 18) и рецептуре колбасы «Молочная» 1 сорта ГОСТ Р 52196. Также был получен контрольный образец по традиционной технологии (образец № 1).

Подготовка сырья: обвалка, жиловка

Приготовление б/п «Биоцвет» + Подготовка №С1

Измельчение на волчке А«* р*т. =2-6 мм

Приготовление раствора NaN02

0,003% 0,005% 0,0075%

Посол сухой солью. Перемешивание и выдержка сырья в вакуум-мешалке в течение б часов при ЫЕ...12 °С

Составление фарша в кутгере

1 соответствии с рецептурой

Подготовка пряностей и материалов

Формование н вязка батонов

Рисунок 18 - Технологическая схема производства вареных колбас с применением бактериального препарата «Биоцвет»

После измельчения мяса на волчке к фаршу добавляли ЫаС1, нитрит натрия в заданной концентрации и бактериальный препарат. Образцы тщательно перемешивали в вакуумной мешалке и выдерживали при 8... 12 °С в течение б ч. Далее образцы выгружали в куттер и готовили колбасные изделия по стандартной технологии вареной колбасы «Молочная» 1 сорта.

У образцов вареных колбас были изучены органолептические и микробиологические характеристики, химический состав, технологические свойства, содержание ионов нитрита и нитрозопигментов, значения пероксидных, кислотных и тиобарбитуровых чисел (табл. 1).

Таблица 1 -Качественные харамперистики образцов вареных колбас

Наименование показателей Готовый продукт

Образец №1 (контроль) 0,0075% №1Ч02 Образец №2 («Биоцвет»+ 0,0075% №N01) Образец №3 («Бноцвет»+ 0,005% ^Ог) Образец №4 («Биоцвет»+ 0,003% КаМ)2)

Массовая доля нитрита натрия, % 0,0048 ±0,0002 0± 0,0002 0± 0,0002 0± 0,0002

Количество нитрозопигментов, % 68,15±0,47 79,43±0,47 77,38±0,63 68,87±0,66

Массовая доля влаги, % 65,70 ±0,34 67,10 ±0,48 66,9 ±0,45 67,20 ±0,54

Белок, % 18,80 ±0,38 18,20 ±0,36 18,25 ±0,29 18,25 ±0,38

Жир, % 9,80 ±0,15 9,20 ±0,23 9,25 ±0,21 9,20 ±0,17

Зола, % 3,2 ±0,07 2,96 ±0,08 2,95 ± 0,06 2,95 ± 0,07

Массовая доля соли, %, не более 2,2 ±0,13 2,15 ±0,10 2,14 ±0,09 2,14 ±0,12

Углеводы, % 3,47 ±0,03 3,40 ±0,01 3,37 ±0,03 3,38 ±0,01

Выход готового продукта, % 1 П,0±0,51 112,0±0,54 112,0±0,38 112,0±0,44

Активная кислотность 6,10±0,03 6,05±0,04 6,03±0,04 6,04±0,03

ВСС, % к массе продукта 62,57±0,25 64,32±0,19 64,5±0,22 63,76±0,20

Энергетическая ценность, кДж/ккал 741/180 708/172 710/173 708/172

Пероксидное число, %Зг 0,0062±0,0005 0,0061±0,0005 0,0061±0,0005 0,0062±0,00м

Кислотное число, мг КОН 0,9216±0,0012 0,9038±0,0014 0,912±0,0012 0,9158±0,0015

ТБЧ 0,092±0,001 0,088±0,001 0,089±0,001 0,092±0,001

Внешний вид 4,7 4,9 4,8 4,7

Цвет 4,5 4,9 4,8 4,5

Аромат 4,7 4,8 4,8 4,7

Консистенция 4,7 4,7 4,7 4,7

Вид на разрезе 4,6 4,6 4,6 4,6

Средняя оценка 4,64 4,78 4,74 4,64

Исследования содержания остаточного нитрита натрия показали полное отсутствие ионов нитрита (точность измерения ±0,0002%) в опытных образцах (№ 2, № 3, № 4) в сравнении с контролем (№ 1). Эти данные находятся в обратной зависимости с результатами опытов по определению содержания нитрозопигментов: образцы без остаточного нитрита натрия имели повышенное содержание нитрозопигментов.

Устойчивость к окислительной порче всех опытных образцов вареных колбас не отличается от контрольного образца по данным изучения пероксидных, тиобарбитуровых и кислотных чисел на пятые сутки хранения.

Рост влагосвязывающей способности опытных образцов предположительно вызван повышением количества гидрофильных центров белков за счет протеолитической деятельности микроорганизмов.

Значение выхода готового продукта в опыте больше на 1% чем у контроля, что связано с соответствующим увеличением ВСС.

Активная кислотность опытных вареных колбас несколько ниже значения рН контрольного образца. Можно предположить, что это вызвано образованием органических кислот в результате жизнедеятельности бактериальной культуры.

По органолептическим показателям опытные образцы, даже с минимальным введением нитрита натрия (0,003%), не уступали ни по одному пункту контрольному образцу.

Микробиологический анализ на пятые сутки хранения не выявил мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, бактерий группы кишечных палочек, сульфитредуцирующих клостридий, патогенных бактерий, сальмонелл, золотистого стафилококка. Санитарно-гигиенические показатели опытных образцов вареных колбас соответствовали требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01.

Результаты исследований показали, что действующим агентом в формировании органолептических свойств, отвечающим за антиокислительные свойства и противомикробный эффект является не сам нитрит, а его производное - оксид азота (II), что согласуется с литературными данными.

Применение бактериального препарата «Биоцвет» позволяет снизить уровень вводимого в рецептуру вареных колбас нитрита натрия с 0,0075% до значения 0,003% согласно данным проведенных исследований. При этом качество продукта не ухудшается в сравнении с продуктом, полученным традиционным способом. Исключается поступление в организм человека ионов нитрита в составе мясных продуктов за счет их полного восстановления.

Была разработана рецептура и технология вареного колбасного изделия -колбаса вареная «Экстра-М» 1 сорта с применением бактериального препарата «Биоцвет». Технология была апробирована в промышленных условиях ОАО «ИКМА» и получила одобрение со стороны дегустационной комиссии и специалистов отрасли. Предлагаемая технология может быть реализована в промышленных условиях без дополнительных капиталовложений.

Разработан проект нормативной документации на колбасу вареную «ЭкстраМ» 1 сорта, ТУ 9213-...-02068640-08.

Использование бактериального препарата «Биоцвет» несет следующие социальные и экономические эффекты:

• поможет обратить внимание потребителя на продукцию как на более качественную (вареные колбасы, выработанные с бакпрепаратом, обладают привлекательной окраской, хорошо выраженным ароматом и вкусом, не содержат нитрит);

• предотвратит образование канцерогенных соединений - нитрозоаминов и, как следствие, - снижение уровня онкологических заболеваний;

• применение бактериального препарата не требует покупки дополнительного оборудования и расширения производственных площадей;

• позволит отказаться от зарубежных бактериальных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Получен штамм Staphylococcus carnosus LIA-96 - продуцент фермента нитритредуктазы, превосходящий традиционно используемый по скорости и полноте восстановления ионов нитрита. За 12 ч культивирования данный штамм полностью утилизировал нитрит натрия в L-среде при 20 °С, в то время как исходный штамм - S. carnosus В-8953 только на 50%. Штамм Staphylococcus carnosus LIA-96 находится на национальном патентном депонировании в коллекции ВКПМ под номером В-9518.

2. Проведены доклинические испытания in vivo штамма S. carnosus В-9518, в результате которых штамм был признан безопасным по показателям безвредности, токсичности, токсигенности и вирулентности. Молекулярно-генетическая экспертиза бактериального препарата «Биоцвет», проведенная в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН установила, что штамм S. carnosus В-9518 не является генетически модифицированным микроорганизмом. Подтверждена стабильность фенотипических и генотипических признаков, установлено отсутствие генов, кодирующих белки-токсины.

3. На модельных фаршевых системах показана возможность применения штамма S. carnosus (В-9518) для снижения остаточного нитрита натрия в мясных изделиях. При добавлении к образцам штамма S. carnosus В-9518 нитрит не обнаруживался через 6 ч при его введении 3 мг на 100 г фарша, через 12 ч при 5 мг и через 14 ч при введении 7,5 мг на 100 г фарша.

4. На основе штамма S. carnosus (В-9518) разработан бактериальный препарат «Биоцвет» для производства термически обработанных предварительно ферментированных мясных изделий, ТУ 9229-047-02068640-07.

5. Проведены исследования качественных характеристик опытных образцов вареной колбасы с добавлением бактериального препарата «Биоцвет» и нитрита натрия в количестве 3 мг, 5 мг и 7,5 мг на 100 г сырья, результаты которых говорят о возможном снижении уровня вводимого нитрита натрия в вареных колбасах с 0,0075% до значения 0,003%. При этом качество продукта не ухудшается по сравнению с получаемым традиционным методом, а восстановление ионов нитрита происходит полностью.

6. Разработана рецептура вареной колбасы «Экстра-М» первого сорта с применением бактериального препарата «Биоцвет», а также технология ее

21

производства. Посол проводят в вакуумных мешалках при 8-12 °С в течение 6 ч после добавления к измельченному сырью бактериального препарата и нитрита натрия в количестве 100 г и 3 г на 100 кг, соответственно.

7. Разработан проект нормативной документации на производство вареной колбасы «Экстра-М» первого сорта с применением бактериального препарата «Биоцвет», ТУ 9213-...-02068640-08. Технология апробирована в промышленных условиях ОАО «ИКМА».

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Машенцева Н.Г. Перспективы разработки эффективных методов создания штаммов путем реорганизации генома микробных клеток с целью переориентации путей биосинтеза в направлении увеличения продуктивности органолептико-формирующих ферментов для интенсификации переработки мясного сырья в качественные продукты / Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский, И.А. Лаптев, Д.В. Ким // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы Второго Московского международного конгресса. - М., 2003. - С. 105.

2. Хорольский В.В. Создание безопасных мясопродуктов с использованием пробиотических культур / В.В. Хорольский, С.П. Синеокий, Н.Г. Машенцева, Ю.А. Рыбаков, И.А. Лаптев // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы: Сборник материалов международной конференции. - М., 2004. - С. 200.

3. Хорольский В.В. Возможность создания высокоэффективного штамма -продуцента фермента нитритредуктазы / В.В. Хорольский, С.П. Синеокий, Н.Г. Машенцева, Е.В. Юзбашев, И.А. Лаптев // Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК. - М.: Пищепромиздат, 2004. - С. 38 - 43.

4. Лаптев И.А. Клонирование и разработка систем экспрессии нитритредуктазного оперона штамма Macrococcas caseolyticus, используемого в мясной промышленности // Всероссийский конкурс на лучшие научные работы студентов по техническим наукам (проекты в области высоких технологий). Материалы итоговой конференции. - М.: МИЭМ, 2004. - С. 352-356.

5. Лаптев И.А. Создание штамма-суперпродуцента для снижения остаточного нитрита натрия в мясных изделиях / И.А. Лаптев, В.В. Хорольский, С.П. Синеокий, Н.Г. Машенцева // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы 3-го Международного конгресса. - М„ 2005. - С. 123.

6. Лаптев И.А. Создание высокопродуктивного штамма фермента нитритредуктазы для улучшения цветообразования мясных продуктов / И.А. Лаптев, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы V Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М., 2006. - С. 197-199.

7. Дорофеева Е.С. Поиск и изучение физиолого-биохимических и генетических свойств бактериоцин продуцирующих штаммов / Е,С. Дорофеева, Л.П. Блинкова, А.П. Батуро, Э.Е. Романенко, А.Ю. Леонова, Н.Г. Машенцева, И.А. Лаптев II

Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: материалы всероссийской научно-практическая конференции, - М., 2006. - С. 41.

8. Юзбашев Т.В. Трансформация мутанта по гену leuA мицелиального гриба Rhizopus oryzae гомологичным геном из Mucor circinelloides / T.B. Юзбашев, Т.И. Соболевская, И.А. Лаптев, Т.В. Выборная, Е.Ю. Тихонова, С.П. Синеокий // Биотехнология. - М., 2006. -№ 6. - С. 16-19.

9. Лаптев И.А. Получение штамма-продуцента фермента нитритредуктазы для использования в мясной промышленности / И.А. Лаптев, В.В. Хорольский, С.П. Синеокий, Н.Г. Машенцева // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы Четвертого Московского международного конгресса. - М., 2007. - С. 181.

10. Патент № 2333957 РФ. МПК C12N 1/21 C24R 1/44. Способ конструирования рекомбинантного штамма Staphylococcus carnosus / B.B. Хорольский, Н.Г. Машенцева, И.А. Лаптев; ГОУ ВПО МГУПБ.-№ 2007106027; Заявлено 20.02.2007; Опубликовано 20.09.2008, Бюл. №70.

И.Баранова Е.А. Использование в технологии мясных продуктов стартовых культур, синтезирующих бактериоцины / Е.А. Баранова, Н.Г. Машенцева, И.А. Лаптев, В.В. Хорольский, Е.С. Дорофеева, Л.П. Блинкова // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М., 2007. - С. 156-158.

12. Лаптев И.А. Высококачественные мясные изделия без остаточного содержания нитрита натрия / И.А. Лаптев, Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский, А.О. Семенышева, С.П. Синеокий // Мясная индустрия. - 2007. - № 12. - С.25-28.

13. Баранова Е.А. Иммобилизация штаммов-продуцентов бактериоцинов стартовых культур как средство повышения их жизнеспособности / Е.А. Баранова, Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский, Е.А. Блинкова, Е.С. Горбатко, И.А. Лаптев // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы международной научно-практической конференции. - М., 2008. - С. 49.

14. Горбатко Е.С. Микрококки как продуценты бактериоцинов, перспективных для получения консервантов биотехнологической продукции. / Е.С. Горбатко, Е.А. Блинкова, Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский, И.А. Лаптев, Е.А. Баранова // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы международной научно-практической конференции. - М., 2008. - С. 84

15. Хорольский В.В. Выделение и идентификация бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов для использования в производстве ферментированных мясных продуктов: лабораторный практикум / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, И.А. Лаптев, А.И. Семенышева - М.: МГУПБ, 2008. - 79 с.

16. Машенцева Н.Г. Технологическая инженерия денитрифицирующих стартовых культур, используемых в мясной промышленности / Н.Г. Машенцева, И.А. Лаптев, В.В. Хорольский, С.П. Синеокий // Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях. - М.: Пищепромиздат, 2008. - 267 с. - С. 3945.

Автор выражает искреннюю благодарность за ценные предложения, критические

замечания и методическую помощь, оказанную в подготовке диссертации Юзбашеву Тиграну Владимировичу, д.б.н., проф. Синеокому Сергею Павловичу, к.т.н. Машенцевой Наталье Геннадьевне, а также сотрудникам ГОУ ВПО МГУПБ и ФГУП ГосНИИгенетика.

Подписано в печать 14.11.08. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 07/43. МГУПБ. 109316, Москва, ул. Талалихина, 33. ООО «Полисувенир». 109316, Москва, ул. Талалихина, 33. Тел. 677-03-86

Основные обозначения и сокращения.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Применение нитрита натрия в производстве мясных продуктов.

1.2. N-нитрозоамины и другие побочные эффекты остаточного нитрита натрия в мясных продуктах.

1.3. Превращения нитрита натрия в мясных продуктах.j ^

1.4. Механизм проявления нитритом натрия антимикробных свойств.^

1.5. Механизм проявления нитритом натрия антиокислительных свойств.

1.6. Механизм образования окраски мясных продуктов.

1.7. Механизм формирования органолептических свойств мясных продуктов.

1.8. Способы снижения остаточного нитрита натрия. Бактериальная денитрификация.

1.9. Применение микроорганизмов в производстве мясных продуктов. Staphylococcus carnosus и его генетический аппарат денитрификации.

Цель и задачи исследования.

Глава 2. Методики постановки эксперимента и методы исследований.

2.1. Схема постановки эксперимента. Характеристика объектов исследования.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Выделение плазмиды из грамотрицательных микроорганизмов.

2.2.2. Выделение плазмиды из грамположительных микроорганизмов.

2- 2.3. Выделение хромосомной ДНК из прокариотических и эукариотических микроорганизмов.

2. 2.4. Очистка плазмидной и хромосомной ДНК в градиенте хлористого цезия.

2.2.5. Выделение фрагмента ДНК из легкоплавкой агарозы.

2.2.6. Закладка штамма на хранение в глицерине.

2.2.7. Приготовление компетентной культуры Е. coli для трансформации электропорацией.

2.2.8. Электропорация Е. coli.

2.2.9. Перенос по Саузерну.

2.2.10. Гибридизация по Саузерну.

2.2.11. Дотирование ДНК.

2.2.12. Рестрикция ДНК.

2.2.13. Щелочное дефосфорилирование ДНК.

2.2.14. Полимеразная цепная реакция.

2.2.15. Получение мутантных штаммов, дефектных по гену thy К. ' Приготовление компетентной культуры Staphylococcus carnosus для трансформации электропорацией.

2.2.17. Электропорация компетентной культуры Staphylococcus carnosus.

2.2.18. Определение содержания нитрита натрия в бактериальной среде и мясных продуктах.

2.2.19. Определение степени окисления жира по пероксидному числу.

2.2.20. Дистилляционный метод определения окислительных изменений с 2-тиобарбитуровой кислотой.

2.2.21. Определение кислотного числа.

2.2.22. Определение содержания нитрозопигментов мясных продуктах.

2.2.23. Оценка органолептических показателей.

2.2.24. Оценка микробиологических показателей.

2.2.25. Определение количества молочнокислых микроорганизмов.

2.2.26. Определение влагосвязывающей способности мясопродуктов.

2.2.27. Потенциометрический метод определения рН мясопродуктов.

2.2.28. Определение массовой доли влаги.

2.2.29. Определение массовой доли белка.

2.2.30. Определение массовой доли жира.

2.2.31. Определение массовой доли золы.

2.2.32. Определение содержания хлорида натрия.

2.2.33. Клинические испытания in vivo.

Глава 3. Разработка систем селекции и экспрессии. Получение штаммапродуцента фермента нитритредуктазы.

3.1. Выбор штамма для создания продуцента фермента нитритредуктазы.

3.2. Конструирование термочувствительного вектора pBTmcs для грамположительных микроорганизмов.

3.3. Получение штамма Staphylococcus carnosus (thyAT).

3.4. Получение в составе pUC19 конструкций для замещения промотора нитритредуктазного оперона.

3.4.1. Клонирование флангов для интеграции.

3.4.2. Клонирование промоторов.

3-4.3. Клонирование селективных маркеров.

3.4.4. Получение промежуточных конструкций.

3.4.5. Получение конечных конструкций.

3.5. Введение в составе pBTmcs конструкций для замещения промотора нитритредуктазного оперона.

3.6. Трансформация, получение интеграции плазмид для замещения промотора оперона nir и изучение нитритредуктазной активности клонов.

3.7 Замена селективного маркера в pBT-dxyl-nirR.

3.8. Замена промотора гена xylA в плазмиде рВТ.^

3-9. Трансформация, получение интеграции плазмиды pBT-thyA-gap-nirR и изучение нитритредуктазной активности клонов.

Глава 4. Изучение нитритредуктазной активности штамма S. carnosus LIAс использованием модельной фаршевой системы.

Глава 5. Разработка бактериального препарата «Биоцвет».

Глава 6. Комплексное исследование вареных колбас, изготовленных с применением бактериального препарата «Биоцвет».

Социальные и экономические эффекты от использования бактериального препарата «Биоцвет».

Повышение качества выпускаемой продукции является одной из важных задач, стоящих перед пищевой промышленностью. Эта задача в полной мере относится к мясному производству.

Пищевая ценность и качество продуктов, в том числе изделий из мяса, определяется не только содержанием в них белков, жиров, углеводов, витаминов и минеральных солей и других важных компонентов, но также отсутствием вредных веществ.

Для придания характерного цвета, улучшения вкусоароматических характеристик мясных продуктов, а также для предотвращения их бактериальной и окислительной порчи применяют нитрит натрия. Проявление нитритом данных свойств является результатом реакции его производного — оксида азота с различными соединениями мышечной ткани или жизненно-важными для микроорганизмов соединениями. Образование оксида азота (II) из нитрита зависит от таких параметров как: рН среды, температура, наличие восстановителей и денитрифицирующих микроорганизмов. Но даже при комплексном применении приведенных условий значительная часть добавляемого нитрита натрия остается неиспользованной и обнаруживается в готовом продукте.

Наличие свободного нитрита натрия в изделиях из мяса представляет собой некоторую опасность для здоровья человека, поскольку нитриты относятся к токсическим веществам, являются мутагенами и предшественниками канцерогенных нитрозаминов. Поэтому вопрос о возможных путях снижения содержания нитрита натрия в мясных изделиях имеет большое практическое значение.

Отсутствие на данный момент времени веществ, способных функционально заменить нитрит натрия, не позволяет исключить его из рецептур и делает необходимым вести работы по изысканию способов снижения остаточных концентраций нитрита.

Нами предложен микробиологический метод снижения уровня остаточного нитрита - применение бактериального препарата на основе генетически-модифицированного денитрифицирующего штамма Staphylococcus carnosus.

Выводы

1. Для получения мясных продуктов, не содержащих остаточные концентрации нитрита натрия, разработан штамм Staphylococcus carnosus LIA-96 - продуцент фермента нитритредуктазы, превосходящий традиционно используемый по скорости и полноте восстановления ионов нитрита. За 12 ч культивирования данный штамм полностью утилизировал нитрит натрия в L-среде при 20 °С, в то время как исходный штамм - S. carnosus В-8953 только на 50%. Штамм Staphylococcus carnosus LIA-96 находится на национальном патентном депонировании в коллекции ВКПМ под номером В-9518.

2. Проведены доклинические испытания in vivo штамма S. carnosus В-9518, в результате которых штамм был признан безопасным по показателям безвредности, токсичности, токсигенности и вирулентности. Молекулярно-генетическая экспертиза бактериального препарата «Биоцвет», проведенная в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН установила, что штамм S. carnosus В-9518 не является генетически модифицированным микроорганизмом. Подтверждена стабильность фенотипических и генотипических признаков, установлено отсутствие генов, кодирующих белки-токсины.

3. На модельных фаршевых системах показана возможность применения штамма S. carnosus (В-9518) для снижения остаточного нитрита натрия в мясных изделиях. При добавлении к образцам штамма S. carnosus В-9518 нитрит не обнаруживался через 6 ч при его введении 3 мг на 100 г фарша, через 12 ч при 5 мг и через 14 ч при введении 7,5 мг на 100 г фарша.

4. На основе штамма S. carnosus (В-9518) разработан бактериальный препарат «Биоцвет» для производства термически обработанных предварительно ферментированных мясных изделий, утверждена нормативная документация - ТУ 9229-047-02068640-07.

5. Проведены комплексные исследования опытных образцов вареной колбасы с добавлением бактериального препарата «Биоцвет» и нитрита натрия в количестве 3 мг, 5 мг и 7,5 мг на 100 г сырья. Результаты исследований говорят о возможном снижении уровня вводимого нитрита натрия в вареных колбасах с 0,0075% до значения 0,003%. При этом качество продукта не ухудшается по сравнению с получаемым традиционным методом, а восстановление ионов нитрита происходит полностью.

6. Разработана рецептура вареной колбасы «Экстра-М» первого сорта с применением бактериального препарата «Биоцвет», а также технология ее производства. Посол проводят в вакуумных мешалках при 8.12 °С в течение 6 ч после добавления к измельченному сырью бактериального препарата и нитрита натрия в количестве 100 г и 3 г на 100 кг, соответственно.

7. Разработан проект нормативной документации на производство вареной колбасы «Экстра-М» первого сорта с применением бактериального препарата «Биоцвет», ТУ 9213-.-02068640-08. Технология апробирована в промышленных условиях на ОАО «ИКМА».

1. Андухар Г., Риверон О. Влияние нитрата на вкус свиного мяса при посоле. Материалы международного симпозиума "Нитриты и качество мясных продуктов", Варна. 1981, с.93-97.

2. ВНИИМП. Научное обеспечение инновационных процессов в мясоперерабатывающей отрасли: Сборник докладов 8-й Международной научной конференции памяти В.М. Горбатова. Часть 1. М.: ВНИИМП, 2005. - 168 с.

3. Джорджевич В.В., Радович Н.И. Влияние нитритов на некоторые свойства мясных продуктов и значение отдельных факторов в их остаточном содержании. Материалы международного симпозиума "Нитриты и качество мясных продуктов". Варна. 1981, стр.54.

4. Журавская и др, "Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов", М: Агропромиздат, 1985. - 296 стр.

5. Костюковский Я.Л., Меламед Д.Б., Успехи современной химии., 1998 Т.57, стр. 626-655.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, 1984.

7. Рубенчик Б.Л. Профилактика загрязнения пищевых продуктов канцерогенными веществами, Киев: Здоровье, 1983. 160 стр.

8. Чиркина Т.Ф., Хлебников В.И. Роль пищевых добавок в повышении качества мясных консервов. ЦНИИТЭИ, 1986, обзорная информация.

9. Ahnert-Hilger В.Н. G, Molecular aspects of tetanus and botulinum neurotoxin poisoning, Prog. Neurobiol. 46(1995) 83-96.

10. Allen C.E., Foegeding E.A. Some lipid characteristics and interactions in muscle. Food Technology, 1981, vol.35. №5, p.253-257.

11. Archer D.L. et al., Evidence that ingested nitrate and nitrite are benefical to health, Journal of Food Protection, 2002, Vol. 65, №5. p.872-875

12. Barriere, C., Centeno, D., Lebert, A., Leroy-Se'trin, S., Berdague', J.L., Talon, R., 2001a. Roles of superoxide dismutase and catalase of Staphylococcus xylosus in the inhibition of linoleic acid oxidation. FEMS Microbiology Letters 201, 181- 185.

13. Binkerd E.F., The history and use of nitrate and nitrite in the curing of meat. Food Cosmet Toxicol. 1975 Dec;13(6):655-61.

14. Borawska M. et al., Roczniki Akademii Medycznej w Biafymstoku, The nitrate and nitrite contents in a whole day's hospital diet during the spring season, 1997, Vol.41, №2, p.202-209.

15. Dich J., Jarvinen R et al., Food Additives Contamination, Dietary intakes of nitrate, nitrite and NDMA in the Finnish Mobile Clinic Health Examination Survey, 1996, Vol.13, №5, p.541-552

16. Drapier J.C., Interplay between NO and Fe-S. clusters: Relevance to biological systems, Methods: A Companion to Methods Enzymol. 11 (1997) 319-329.

17. Cammack R., C.L. Joannou, Xiao-Yuan Cui, Claudia Torres Martinez, Shaun R. Maraj, Martin N. Hughes, Nitrite and nitrosyl compounds in food preservation, Biochimica et Biophysica Acta 1411 (1999) 475-488.

18. Christiansen L.N., R.B. Tompkin, A.B. Shaparis, R.W., Johnson, D.A. Kautter, Effect of sodium nitrite and nitrate on Clostridium botulinum growth and toxin production in a summer style sausage, J. Food Sci. 40 (1975) 488-490

19. Clarke M.J., J.B. Gaul, Chemistry relevant to the biological effects of nitric oxide and metallonitrosyls, Struct. Bonding 81 (1993) 147-181.

20. Cooke J.P., J. Dzau, A. Creager, Endothelial dysfunction in hypercholesterolemia is corrected by L-arginine, Basic Res. Cardiol. 86, (Suppl 2) (1991) 173181.

21. Cross, C. K., and P. Ziegler. 1965. Comparison of the volatile fractions from cured and uncured meat. J Food Sci 30:610-614.

22. Cui X.Y., C.L. Joannou, M.N. Hughes, R. Cammack, The bactericidal effects of transition metal complexes containing the NO group on the food-spoilage bacterium Clostridium sporogenes, FEMS Microbiol. Lett. 98 (1992) 67-70.

23. Dee G., C. Rice-Evans, S. Obeyesekera, S. Meraji, M. Jacobs, K.R. Bruckdorfer, The modulation of ferryl myoglobin formation and its oxidative effects on low density lipoproteins by nitric oxide, FEBS Lett. 294 (1991) 3842.

24. Dykhuizen R.S., A. Fraser, C. Duncan, C.C. Smith, M. Golden, N. Benjamin, C.Leifert, Antimicrobial effect of acidified nitrite on gut pathogens: importance of dietary nitrate in host defense. Antimicrob Agents Chemother. 1996 Jun; 40(6): 1422-5.

25. Dykhuizen R.S., A. Fraser, H. McKenzie, M. Golden, C. Leifert, N. Benjamin, Helicobacter pylori is killed by nitrite under acidic conditions, Gut 42 (1998) 334-337.

26. Ennahar, S., Sonomoto, K., Ishizaki, A., 1999. Class Ha bacteriocins from lactic acid bacteria: antibacterial activity and food preservation. Journal of Bioscience and Bioengineering 87, 705- 716.

27. Erkkila, S., Petaja, E., Eerola, S., Lilleberg, L., Mattila-Sandholm, T., Suihko, M.-L., 2001a. Flavour profiles of dry sausages fermented by selected novel meat starter cultures. Meat Science 58, 111-116.

28. Esterbauer H., J. Gebicki, H. Puhl, G. Jurgens, The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL, Free Radic. Biol. Med. 13 (1992)341-390.

29. Evan M. Hetrick, Jae Ho Shin, Nathan A. Stasko, C. Bryce Johnson, Daniel A. Wespe, Ekhson Holmuhamedov and Mark H. Schoenfisch, Bactericidal Efficacy of Nitric Oxide-Releasing Silica Nanoparticles, ACSNano, VOL. 2, NO. 2, 235-246, 2008.

30. Fang F.C., Nitric oxide and infection, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, 1999, 544 стр.

31. Feiner G. Meat products handbook: Practical science and technology. WOODHEAD PUBLISHING LIMITED, Cambridge, England, 2006.

32. Furukawa Т., H. Kohno, R. Tokunaga, S. Taketani, Nitric oxide-mediated inactivation of mammalian ferrochelatase in vivo and in vitro: possible involvement of the iron-sulphur cluster of the enzyme, Biochem. J. 310 (1995) 533-538.

33. Ganzle, M.G., Vogel, R.F., 2003. Studies on the mode of action of reutericyclin. Applied and Environmental Microbiology 69, 1305-1307

34. Girotti A.W., Mechanism of lipid peroxidation, Free Radic. Biol. Med. 1 (1985) 87-95.

35. Gorbunov N.V., A.N. Osipov, B.W. Day, B. Zayas-Rivera, V.E. Kagan, N.M. Elsayed, Reduction of ferrylmyoglobin and ferrylhemoglobin by nitric oxide: a protective mechanism against ferryl hemoprotein-induced oxidations, Biochemistry 34 (1995) 6689-6699.

36. Goss S.P., N. Hogg, B. Kalyanaraman, The effect of nitric oxide release rates on the oxidation of human low density lipoprotein, J. Biol. Chem. 272 (1997) 21647-21653.

37. Gotz F. Staphylococcus carnosus: a new host organism for gene cloning and protein production. Soc Appl Bacteriol Symp Ser. 1990;19:49S-53S. Review.

38. Halliwell В., J.M. Gutteridge, Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease, Biochem. J. 219 (1984) 1-14.

39. Haskin C.J., N. Ravi, J.B. Lynch, E. Munck, L. Que, Reaction of NO with the reduced R2 protein of ribonucleotide reductase from Escherichia coli, Biochemistry 34 (1995) 11090-11098.

40. Herring, H. K. 1973. Effect of nitrite and other factors on the physico-chemical characteristics and nitrosamine formation in bacon. Proc Meat Ind Res Conf, Amer Meat Inst Found, Chicago, IL. pp. 47-60.

41. Hogg N., B. Kalyanaraman, Nitric oxide and lipid peroxidation (review), Biochimica et Biophysica Acta 1411 (1999) 378-384.

42. Hornsey, H. C. 1956. "The colour of cooked cured pork. I. Estimation of the nitric oxide-haem pigments". J. Sci. Food Agric. 7:534-540.

43. Hotchkiss J.H., Cancer surveys, Preformed N-nitroso compounds in foods and beverages, 1989, Vol.8, №2, p.295-321.

44. Hudson J.A., Comparison of response-surface models for Listeria monocytogenes, Food Res. Int. 27 (1994) 53-59.

45. Hui Y. H., Meat Science and Applications, MARCEL DEKKER, INC. NEW YORK »BASEL, 2001.

46. Judge M.D., Chich J.J. Palatability of pregior and mechanically processed nitrite-free hams. J. Food Science, 1979, vol.44, №6, p.1775-1777.

47. Igene J.O., Pearson A.M. Role of phospholipids and triglycerides in warmed-over flavor development in meat model system. J. Food science, 1979, vol.44, №5 p.1285-1290.

48. Igene J.O., K.Yamauchi, Mechanisms by which nitrite inhibits the development of warmed-over flavour (WOF) in cured meat, Food Chemistry 18, (1985), 118.

49. Inoue S., S. Kawanishi, Oxidative DNA damage induced by simultaneous generation of nitric oxide and superoxide, FEBS Lett. 371 (1995) 86-88.

50. Kanner J., S. Harel, R. Granit, Nitric oxide as an antioxidant, Arch. Biochem. Biophys. 289 (1991) 130-136.

51. Kanner J., S. Harel, R. Granit, Nitric oxide, an inhibitor of lipid oxidation by lipoxygenase, cyclooxygenase and hemoglobin, Lipids 27 (1992) 46-49.

52. Knowles R., Denitrification, Microbiological reviews, 1982, Vol.46, №l,p.43-70.

53. Leroy F, Verluyten J, De Vuyst L. Functional meat starter cultures for improved sausage fermentation. Int J Food Microbiol. 2006 Feb 15;106(3):270-85. Epub 2005 Oct 5. Review.

54. Lovitt R.W., J.G. Morris, D.B. Kell, The physiology of Clostridium sporogenes NCIB 8053 growing in defined media, J. Appl. Bacteriol. 62 (1987) 81-92.

55. MacDonald B., Gray J.O. Role of nitrite in cured meat flavor: antioxidant role of nitrite. J. Food Science, 1980, vol.45, №4, p.893-897.

56. Marth E.H., Disease characteristics of Listeria monocytogenes, Food Technol. 42(1988) 165-168.

57. Montel, M.C., Masson, F., Talon, R., 1998. Bacterial role in flavour development. Meat Science 49 (Suppl. 1), 111 -123.

58. Neubauer H, Götz F. Physiology and interaction of nitrate and nitrite reduction in Staphylococcus carnosus. J Bacteriol. 1996 Apr;178(7):2005-9.

59. Neubauer H, Pantel I, Götz F. Molecular characterization of the nitrite-reducing system of Staphylococcus carnosus. J Bacteriol. 1999 Mar; 181 (5): 1481-8.

60. Niinivaara F., Über den Einfluss von Bacterienreinkulturen auf die Reifung und Umrötung der Rohwurst. Avta Agr. Fenn. 84, 128 pages, 1955.

61. Nickoloff J.A.(pe,aaKTop). 1995. "Electroporation Protocols for Microorganisms", 367 CTp.

62. O'Leary V., A. Graham, V. Darley-Usmar, D. Stone, The effect of lipid hydroperoxides on the copper dependent oxidation of low density lipoprotein, Biochem. Soc. Trans. 21 (1993) 89S.

63. Olesen, P.T., Stahnke, L.H., 2003. The influence of precultivation parameters on the catabolism of branched-chain amino acids by Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus. Food Microbiology 20, 621- 629.

64. Palli D et al., Red meat, family history and increased risck of gastric cancer with microsatellite instability. Cancer Research, 2001, Vol. 61, p.5415-5419, July 15.

65. Park J.W., H.K. Kim, Strand scission in DNA induced by S-nitrosothiol with hydrogen peroxide, Biochem. Biophys. Res. Commun. 200 (1994) 966-972.

66. Patel RP, McAndrew J, Sellak H, White CR, Jo H, Freeman BA, Darley-Usmar VM., Biological aspects of reactive nitrogen species. Biochim Biophys Acta. 1999 May 5; 1411(2-3):385-400.

67. Payne M.J., C. Glidewell, R. Cammack, Interactions of Iron-thiol-nitrosyl compounds with the phosphoroclastic system of Clostridium sporogenes, J. Gen. Microbiol. 136 (1990) 2077-2087.

68. Payne M.J., L.F.J. Woods, P. Gibbs, R. Cammack, Electron paramagnetic resonance spectroscopic investigation of the inhibition of the phosphoroclastic system of Clostridium sporogenes by nitrite, J. Gen. Microbiol. 136 (1990) 2067-2076.

69. Pearson A.M., Tauber F.W. 1984. Processed Meats. 2nd ed. Van Nostrand Reinhold Company, New York, NY.

70. Perigo J. A., T.A. Roberts, Inhibition of Clostridia by nitrite, J. Food Technol. 3 (1968)91-94.

71. Price, J. F., and B. S. Schweigert. 1987. The Science of Meat and Meat Products. 3rd ed. Food and Nutrition Press. Westport, CN.

72. Rao D.N.R., A.I. Cederbaum, Generation of reactive oxygen species by the redox cycling of nitroprusside, Biochim.Biophys. Acta 1289 (1996) 195-202.

73. Ross, R.P., Morgan, S., Hill, C., 2002. Preservation and fermentation: past, present and future. International Journal of Food Microbiology 79, 3- 16.

74. Roy B., M. Lepoivre, Y. Henry, M. Fontecave, Inhibition of ribonucleotide reductase by nitric oxide derived from thionitrites: reversible modifications of both subunits, Biochemistry 34 (1995) 5411-5418.

75. Sasaki Y h flp. 2004. "thyA as a selection marker in construction food-grade host-vector and integration systems for Streptococcus thermophilus". Applied and Environmental Microbiology, 70(3): 1858-1864 cTp.

76. Sen N.P., Webb K et al, IARC scientific publications, The confirmation of low levels of volatile nitrosamines by oxidation to nitramines, 1983 №45, p.499-508.

77. Schleifer K.H. and Fischer U. Description of a new species of the genus Staphylococcus: Staphylococcus carnosus. Int. J. Syst. Bacteriol., 1982, 32, 153-156.

78. Sjogren, J., Magnusson, J., Broberg, A., Schnu rer, J., Kenne, L., 2003. Antifungal 3-hydroxy fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14. Applied and Environmental Microbiology 69, 7554—7557.

79. Shepard S.E. et al., Food Chemistry Toxicology, Assessment of the risk of formation of carcinogenic N-nitroso compounds from dietary precursors in the stomach,1987, Vol.25, №1, p.91-108.

80. Stahnke, L.H., Hoick, A., Jensen, A., Nilsen, A., Zanardi, E., 2002. Maturity acceleration of Italian dried sausage by Staphylococcus carnosus— relationship between maturity and flavor compounds. Journal of Food Science 67, 1914-1921.

81. Stiles, M.E., Hastings, J.W., 1991. Bacteriocin production by lactic acid bacteria: potential for use in meat preservation. Trends in Food Science & Technology 2, 247-251.

82. Tarr H.L.A., Bacteriostatic action of nitrites, Nature 147 (1941) 417-418.

83. Tellefson C.S., Bowers J.A. Aroma, color and lipid oxidation of turkey muscle emulsion. J. Food Science, 1982, vol.47, №2, p.393-396.

84. Tjener, K., Stahnke, L.H., Andersen, L., Martinussen, J., 2004b. Growth and production of volatiles by Staphylococcus carnosus in dry sausages: influence of inoculation level and ripening time. Meat Science 67, 447-452.

85. Tompkin R.B., L.N. Christiansen, A.B. Shaparis, The effect of iron on botulinal inhibition in perishable canned cured meat, J. Food Technol.13 (1978) 521-527.

86. Tricker A.R. et al., Cancer surveys, Environmental exposure to preformed nitroso-compounds, 1989, Vol.8, №2, p.251-272.

87. Tricker A.R. et al., Mutation research, Carcinogenic N-nitrosamines in the diet: occurrence, formation, mechanisms and carcinogenic potential, 1991, Vol.259, №3, p.277-289.

88. Wasserman A. The nitrites nitrosamines situation. Food England, 1978, v.50, p.110-116.

89. Watts, B. M. 1954. Oxidative rancidity and discoloration in meats. Food Res 5:1-52.

90. Wieland K.P., Wieland B., Gotz F., A promoter-screening plasmid and xylose-inducible, glucose-repressible expression vectors for Staphylococcus carnosus.Gene. 1995 May 26;158(l):91-6.

91. Wogan M.J., Juedes G.N., Peroxynitrite-induced mutation spectra of pSP189 following replication in bacteria and in human cells. Mutat Res. 1996 Jan 17;349(1):51-61.

92. Woods L.F.J., J.M. Wood, P.A. Gibbs, The involvement of nitric oxide in the inhibition of the phosphoroclastic system in Clostridium sporogenes by sodium nitrite, J. Gen. Microbiol. 125 (1981) 399-406.

93. Woods L.F.J., J.M. Wood, A note on the effect of nitrite inhibition on the metabolism of Clostridium botulinum, J. Appl. Bacteriol. 52 (1982) 109-110.

94. Zumft W.G., Cell Biology and Molecular Basis of denitrification, Microbiology and molecular biology review, 1997, Vol.61, №4, p.533-616.

95. Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов1. ФГУПГосНИИГенетика

96. И Росс*», Мота, 117545,1-ый Дороижй проезд, 1,«ГУПГоеНИИГвиета ВКПМ: ft (095) 3151210; фис: (09S) 3151210; Эл. почп: vfcpmggenetRcs.ru;8953 . 16 .06.061. СПРАВКА

97. Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов

98. ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетика приняла на национальное патентное депонирование 10 декабря 2004г.культуру Staphylococcus camosus SPHC-108

99. Область применения ;антагонист бактерий группы кишечной палочки, сальмонеллы, протеи.

100. Депозитор: Московский Государственный Университет прикладной биотехнологии (МГУ 1 Lb)

101. КОЛЛЕКЦИОННЫЙ НОМЕР ВКПМ В-8953

102. Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов1. ФГУП Го с НИ И Генетика

103. О России, Моим, 117545,1-ыи Дорожный проезд, 1, и ГУПГосНИИ Генетта ВКГ1М; Я (095} 3(51210; фмс: (095) 3151210; Эт. почта; vtpmg&ewtta.iu;1. S518 . 10.11.061. СПРАВКА

104. Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов

105. ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетика приняла на национальное патентное депонирование 9 ноября 2006г.культуру Staphylococcus carnosus LIA-96

106. Область применения штамма: обладает антагонистической активностью по отношению к бактериям кишечной группы, сальмонеллы, протеи. Ароматообразуюший, денитрифицирующий

107. Депозитор: Московский Государственный Университет прикладной биотехнологии (МГУПБ)

108. КОЛЛЕКЦИОННЫЙ НОМЕР ВКПМ В-9518