автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка бактериальной композиции для снижения содержания холестерина в ферментированных мясных продуктах

На правах рукописи

КОЛОТВИНА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА

РАЗРАБОТКА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ

Специальности 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических

активных веществ

05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Воронеж-2012

005056310

005056310

Работа выполнена на кафедре «Технология мяса и мясных продуктов» федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств» (ФГБОУ ВПО МГУПП)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

академик РАСХН, д.т.н., профессор Титов Евгений Иванович (ФГБОУ ВПО Московский

государственный университет пищевых производств)

доктор технических наук, профессор Кудряшов Леонид Сергеевич (главный научный сотрудник ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова РАСХН)

кандидат технических наук Молочников Михаил Владимирович (директор отдела «МЕАТ» Группа Компаний «Протеин. Технологии. Ингредиенты»)

ГНУ Всероссийский научно-

исследовательский институт

птицеперерабатывающей промышленности РАСХН

Защита диссертации состоится «25» декабря 2012 года в 13 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 212.035.04 при ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по адресу: 394036, г. Воронеж, проспект Революции, 19, ауд. 035.

Отзывы на автореферат (в двух экземплярах), заверенные гербовой печатью учреждения, просим направлять по адресу: 394036, г. Воронеж, пр. Революции, 19, ФГБОУ ВПО «ВГУИТ», ученому секретарю диссертационного совета Д 212.035.04.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Воронежского государственного университета инженерных технологий.

Автореферат размещен в сети Интернет на официальном сайте Министерства образования и науки РФ vak2.ed.gov.ru и на официальном сайге ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» http://www.vsuet.ru «23» ноября 2012 г.

Автореферат разослан «23» ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

на соискание ученой степени кандидата технических наук, . Т>

на соискание ученой степени доктора технических наук (ЖМ^" Ч В-С. Слободяник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работ

Согласно распоряжению Правительства Российской Федерации № 1873-р от 25 октября 2010 г. «Основы государственной политики Российской Федерации в области здорового питания населения на период до 2020 г» потребление пищевых продуктов, содержащих большое количество жира животного происхождения, приводит к росту избыточной массы тела и ожирению, распространенность которых за последние 8-9 лет возросла с 19 до 23 %, увеличивая риск развития сахарного диабета, заболеваний сердечно-сосудистой системы и других болезней. Максимальная суточная норма поступления холестерина в организм человека составляет 300 мг, только в мясе и мясных продуктах может содержаться в среднем 60-73 мг/100 г продукта. В связи с этим получение мясных продуктов с пониженным содержанием холестерина является актуальным и перспективным направлением современной мясной промышленности.

Имеются сведения (М. Juskiewicz, A.A. Lafraya, Н. Panfil-Kuncewicz, Е. Sekyl, М. Ziarno) о способности молочнокислых микроорганизмов, используемых в качестве заквасочных культур при производстве кисломолочных продуктов, в том числе йогуртов, снижать содержание холестерина в процессе производства продукта.

В настоящее время в мясной промышленности производство ферментированных мясных продуктов (сырокопченых и сыро вялельгх изделий) предусматривает целенаправленное использование биотехнологических методов, основанных на применении различных видов микроорганизмов. Теоретическим и практическим работам в области пищевой биотехнологии посвящены научные труды ряда ученых: JI.B. Антиповой, В.И. Галиной, A.A. Жаринова, Ю.Г. Костенко, J7.C. Кудряшова, H.H. Липатого мл., А.Б. Лисицына, Н.Г. Машенцевой, Л.Ф. Митасевой, И.А. Рогова, Е.И. Титова, В.В. Хорольского. Однако в доступных литературных источниках данных о влиянии микроорганизмов на уровень содержания холестерина в мясных продуктах не обнаружено.

Мясные продукты являются благоприятной средой для развития санитарно-показательной микрофлоры, поэтому при их производстве и хранении существуют высокие риски возникновения опасности для здоровья потребителя. Для гарантии безопасности мясопродуктов, не подвергающихся тепловой обработке, Институт питания РАМН обязательно рекомендует в технологиях их производства предусматривать добавление в рецептуру эффективных в отношении санитарно-показательной микрофлоры стартовых культур (Шевелева С.А., 2007). Все это требует от производителей поиска новых современных высокоспецифичных и чувствительных методов для оценки санитарно-гигиенической картпны мясных изделий, а также мониторинга динамики развития стартовых культур. Одним из таких методов является метод ПЦР в реальном времени. Наряду с этим возросшие потребительские требования к качеству готовой мясной продукции делают актуальным применение в производственном процессе систем и принципов управления качеством и безопасностью продукции.

Цель и задачи исследования

Целью работы является разработка бактериальной композиции, снижающей содержание холестерина при производстве сыровяленого продукта из свинины, с учетом обеспечения безопасности мясного продукта.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести скрининг стартовых культур из коллекции МГУПП, способных снижать содержание холестерина in vitro.

2. Выбрать штаммы с максимальными холестеринснижающими свойствами, сгруппировать их в бактериальную композицию и протестировать на отсутствие антагонизма внутри композиции.

3. Адаптировать метод ПЦР в реальном времени для прямой детекции санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур в мясном сырье и мясных продуктах, разработать способ пробоподготовкп мясных образцов, определить услозия выделения ДНК микроорганизмов.

4. Установить влияние бактериальной композиции на снижение содержания холестерина и уровня введения нитрита натрия при производстве сыровяленого продукта из свинины.

5. Провести комплексное исследование физико-химических, биохимических, микробиологических, в т.ч. методом ПЦР-РВ, и органолептических показателей сыровяленого мясного продукта с бактериальной композицией.

6. Разработать проект технической документации на сыровяленый меной продукт с бактериальной композицией.

7. Изучить риски, характерные для производства сыровяленого продукта из свинины с добавлением бактериальной композиции, влияющие на качество и безопасность готового продукта, и разработать предупреждающие действия для предотвращения рисков.

Научная новизна работы

• Установлено, что способность изученных стартовых культур снижать уровень холестерина in vitro является штаммоспецифичным признаком. Выявлены штаммы, обладающие максимальными холестеринсншкающими свойствами: Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus camosus 108, которые сгруппированы в бактериальную композицию с учетом отсутствия антагонизма между штаммами внутри композиции.

• Адаптирован метод ПЦР в реальном времени с флуоресцентной схемой детекции для идентификации санитарно-показательной микрофлоры и мониторинга стартовых культур, а именно подобраны методика выделения ДНК и тест-системы для идентификации ДНК микроорганизмов, проведена оптимизация разработанных тест-систем по температурному и временному профилю реакции.

• Разработан способ пробоподготовки исследуемых мясных образцов для их анализа методом ПЦР в реальном времени.

• Разработан олигонуклеотидный зонд на 16S рРНК ген дня выявления Staphylococcus carnosus методом ПЦР в реальном времени.

• Установлено, что введение бактериальной композиции, содержащей штаммы Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus carnosus 108, в технологию сыровяленого мясного продукта, обеспечивает снижение содержания холестерина в продукте на 21,4%.

Практическая значимость работы

• Разработана бактериальная композиция, снижающая содержание холестерина в сыровяленом продукте из свинины. Установлено, что введение бактериальной композиции позволяет интенсифицировать процесс сушки до 20 сут, а также способствует формированию насыщенного цвета, плотной структуры, придает специфический вкус, аромат готовому продукту, обеспечивает микробиологическую стабильность продукта и замедляет окислительные процессы.

• На типовых штаммах стартовых культур и мясном сырье, искусственно обсемененном санитарно-показательной микрофлорой, подтверждена чувствительность и специфичность разработанных тест-систем для идентификации ДНК микроорганизмов методом ПЦР в реальном времени.

• Разработан план ХАССП, обеспечивающий контроль и управление за всеми технологическими рисками при производстве сыровяленого продукта из свинины с использованием бактериальной композиции. Показано, что применение метода ПЦР-РВ

позволяет проводить своевременный контроль в ККТ № 2 (сушка), а введение бактериальной композиции - повысить микробиологическую безопасность в этой точке. Денитрифицирующий штамм Stapfrylococcus camosus 108, содержащийся в бактериальной композиции, дает возможность снизить введение нитрита натрия с рассолом до 0,03% и гарантировать безопасность в ККТ № 1.1 и 1.2 (приготовление и внесение в рассол раствора нитрита натрия).

• Разработано и опубликовано учебно-методическое пособие по идентификации санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур в мясных изделиях методами ПЦР в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией.

• Разработан проект технической документации на сыровяленый продукт из свинины с пониженным содержанием холестерина.

Работа выполнялась в рамках Гранта Президента Российской Федерации МД-3302.2012.4 «Поиск и идентификация биорегуляторов систем гомеостаза организма человека, входящих в состав функциональных продуктов питания».

Апробация работы

Основные положения работы и результаты исследований были представлены на следующих конкурсах и конференциях: VI, VII, IX Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007, 2008, 2011); Международная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); 11-ая Международная научная конференция памяти В.М. Горбатова «Тенденции и перспективы развития инновационных и информационных технологий перерабатывающей промышленности» (Москва, 2008); V, VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011); I Всероссийская студенческая научная конференция «Молодежная наука - пищевой промышленности России» (Ставрополь, 2009); 15-ая Международная выставка химической промышленности и науки «Химия -2009» (Москва, 2009); Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (Москва 2009); Международная научно-практическая конференция «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010); VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010); 13-ая Международная научная конференция, посвященная памяти Василия Матвеевича Горбатова и 80-летию ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии «Инновационные аспекты переработки мясного сырья и создания конкурентоспособных продуктов питания» (Москва, 2010).

Результаты работы отмечены дипломом на конкурсе проектов молодых ученых «Химия - 2009» (Москва, 2009); дипломом и медалью за научную работу по оценке безопасности мясных продуктов на основе видоспецифической ПЦР и ПЦР в реальном времени, представленную на конкурсе молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу в рамках VI международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); грамотой за участие в IX международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биолопгческая безопасность населения» (Москва, 2011).

Публикации

По результатам исследований, изложенных в диссертационной работе, опубликовано 19 печатных работ, в т.ч. статей в журналах, рекомендованных ВАК - 4; одно учебно-методическое пособие для студентов направления подготовки уровня магистратуры 260200 и 110500; получен патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, экспериментальной части с обсуждением результатов исследований, выводов, списка литературы, содержащего 149 источников, в том числе 79 работ зарубежных авторов, и 9 приложений. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 34 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность темы диссертационной работы и изложена ее общая характеристика.

Глава 1. «Обзор литературы». Представлен анализ научно-технической литературы по оценке способности молочнокислых бактерий снижать уровень холестерина в питательной среде in vitro и в ферментированных пищевых продуктах, описан механизм использования холестерина микроорганизмами в процессе их метаболизма. Перечислены основные аспекты производства ферментированных мясных продуктов. Освещены современные молекулярно-генетические методы, используемые для идентификации ДНК микроорганизмов. Показана возможность использования молекулярно-генетических методов для оценки санитарно-гигиенической картины мясных изделий. Обоснован выбор метода ПЦР в реальном времени и способа выявления продуктов амплификации в режиме реального времени. Рассмотрены основные вопросы управления качеством и безопасностью пищевых продуктов, приведены существующие методы оценки рисков и подходы к управлению рисками.

Глава 2. «Организация постановки эксперимента и методы исследований».

Представлена схема проведения эксперимента (рис. 1), дана характеристика объектов исследований, указаны исследуемые показатели и изложены методы их определений.

В работе использовались следующие методы исследований: 1 - определение массовой доли белка на полуавтоматическом приборе Kjeltec System 1002 «Tecator», Швеция; 2 - массовой доли влаги по ГОСТ Р 51479; 3 - массовой доли жира методом Сокслета по ГОСТ 23042; 4 - массовой доли золы по ГОСТ Р 53642; 5 - массовой доли хлорида натрия по ГОСТ 9957; 6 - величины рН потенциометр ическим методом (Журавская Н.К., 1985); 7 - массовой доли нитрита натрия по ГОСТ 29299; 8 - нитрозопигментов (Hornsey Н.С., 1956); 9 - активности воды на автоматическом анализаторе «Roremeter RM-Ю», Германия; 10 - степени окисления жира по перекисному числу по ГОСТ 8285; 11 - кислотного числа по ГОСТ Р 50457; 12 - органолешическая оценка по ГОСТ 9959; 13 - бактериологического анализа по ГОСТ 9958; 14 - выделение ДНК с использованием набора реагентов «АхуРгер Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit» производства компании «Axygen Scientific, Inc.», США;

15 - постановка ПЦР в реальном времени на амплификаторе «Rotor-Gene 3000»;

16 - содержания холестерина in vitro колориметрически по методу Златкиса-Зака;

17 - антагонистической активности методом перпендикулярных штрихов (Лысак В.В., 2002); 18 - массовой концентрации холестерина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на жидкостном хроматографе Knauer со спектрофотометрическим детектором К-2500, Германия; 19 - статистическая обработка экспериментальных данных (Журавская Н.К., 1985).

Объектами исследований являлись:

стартовые культуры Lactobacillus ciirvatus 1 (В-8889), 2 (В-8906), 102 (В-8900), 301-1 (В-8954), CDN (В-8948); Lactobacillus sakei 35 (В-8886), 45 (В-8896), 101 (В-8939), 103 (В-8932), 104 (В-8936), 105 (В-8905), 306-1 (В-8952); Lactobacillus casei 10 (В-8890), Lactobacillus plantarum 19 (В-8907), 100 (В-8899), 7К (В-2663), 22/2 (В-1615), 2П (В-1616), 31 (В-1617), 32 (В-1618); Pediococcus acidilactici 3 (В-8891), 8 (В-8897), 15 (В-8895), 25 (В-8892), 27 (В-8893), 33 (В-8903), 34 (В-8887), 38 (В-8902); Pediococcus pentosaceus 23 (В-8894Х 28 (В-8888), 31 (В-8901), 39 (В-8898), 106 (В-8935); Pediococcus claussenii 9 (В-8908)' Staphylococcus camosus 108 (В-8953), SAL-1 (В-8946), 96-2 (В-8947), Staphylococcus carnosus 301-2 (В-8950), 111-2 (В-8951); Staphylococcus xylosus 45 (В-8945), Р-1 (В-8944);

Рис. 1 Схема проведения эксперимента

санитарно-показательные микроорганизмы Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P (B-6646), Escherichia colt К 12 С 600 (B-1010), Proteus vulgaris ATCC 13315 (B-1667), Salmonella typhimurium LT2 (B-3533) и Listeria monocytogenes 766 из ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика и ГКПМ ГИСК им JI.A. Тарасевича;

бактериальные препараты Бактоферм T-SP и Бактоферм LL-1 производства компании «Христиан Хансен», Германия;

свинина в охлажденном состоянии (длиннейшая мышца спины) и сыровяленый мясной продукт, изготовленный с использованием бактериальной композиции.

Глава 3. «Исследование способности стартовых культур снижать уровень холестерина in vitro». Способность стартовых культур снижать уровень холестерина обусловлена деструкцией холестерина бактериями в процессе их метаболизма. Для подтверждения этого был проведен скрининг 41 штамма стартовых культур из коллекции МГУПП. Измерение содержания холестерина в среде осуществляли колориметрическим методом Златкиса-Зака, основанным на появлении красно-фиолетового окрашивания при взаимодействии холестерина с уксусной и серной кислотами в присутствии хлорного железа (рис. 2).

Staphylococcus xylosusP-l i | j I | j

Staphylococcus xylosus 45 ■ 4^ 4ч- и ■■ "¡»«^ ■ mm "'«■««■'» -

Staphylococcuscarnosus 111-2 ■ jr»■■ ^ j ■ ■ "

Staphylococcuscarnosus301-2 ■ ■■■

Staphylococcus carnosus 96-2 "«"j Staphylococcus carnosus SAL-1 I j

Staphylococcus carnosus 108 - "p - »««« -

Pediococcusdaussenii9 ' j ! j

Pediococcus pentosaceus 106 ■ «у 4м»>

Pediococcus pento saceus 39 ■ w ■ * |

Pediococcus pent© saceus 31 ■ * ■ ■■■ fm»mm

Pediococcus pentosaccus 28 ■ 4"® '••'■tt^ "1 Pediococcus pentosaceus 23 !

Pediococcus acidilactici 38 тН" 4"

Pediococcus acidilactici 34 W" A

Pediococcus acidilactici 33 "НЧ" .............

Pediococcus acidilactici 27 ,ffr4t

Pediococcus acidilactici 25 44т 4" ° ■ ■ ■ ■ Pediococcus acidilactici 15 " "" ■■■■■■■

Pediococcus acidilactici 8

Pediococcus acidilactici 3 4-j4- 4— ■ ■ - »w Lactobacillus plantarum 32 4" ■ ■ ■ ■ ■ ■

Lactobacillus plantarum 31 4^4«4и--Ц ■■4»«>

Lactobacillus plantarum 2П 44,<р"^и,,4,,в>

Lactobacillus plantarum 22/2 j j ■ 4*" "4" ■

Lactobacillus plantarum 7K TfT 4^ i ili4 жшшшр Lactobacillus plantarum 100 j j "p - — ""'"• "1

Lactobacillusplantaroro 19 i | 44ааси"""4*■7И"П1 Lactobacillus casei 10 4«

Lactobacillus sakei 306-1 4*4 f— -»44» Lactobacillus sakei 105 >mmJ* J4b шм mm** m «тш Lactobacillus sakei 104 ! I" Tf14*" " '"" "* Lactobacillus sakei 103 "И1 у"1

Lactobacillus sakei 101 44444"-H j j

Lactobacillus sakei 45 444 ^4 ■ —j j Lactobacillus sakei 35 44 4*" "j1 j ■ T " !

Lactobacillus curvatus CDN T^Tf^'*"!'

Lactobacillus curvatus 301-1 ТНТТ^" "r" "^"i™"

Lactobacillus curvatus 102 "f^Trfj"1 "Г™""^ j j j

Lactobacillus curvatus 2 i 1 J | »4

Lactobacillus curvatus 1 ! 1 ! I j i 1 ! ' —4H* i ! ;™H '

0 5 10 15 20 25 30 35

Снижение холестерина, % Рис. 2 Снижение холестерина стартовыми культурами

Установлено, что из 41 исследуемого штамма холестеринснижающей способностью не обладали всего 3 микроорганизма, остальные микроорганизмы снижали холестерин от 2,8% до 24,3%, при этом штамм Lactobacillus curvatus 1 снизил содержание холестерина в среде на 32%.

Учитывая полученные результаты, а также технологические свойства штаммов, обладающих максимальной холестеринснижающей способностью, были выбраны три штамма: Lactobacillus curvatus 1 (32%), Pediococcus pentosaceus 28 (22%), Staphylococcus carnosus 108 (15,2%), при этом штамм Staphylococcus carnosus 108 также обладает денитрифицирующей способностью, что позволит не только снизить содержание холестерина, но и получить продукт со стабильной окраской и с пониженным содержанием остаточного нитрита натрия в готовом продукте за счет более полного его восстановления до NO. Выбранные штаммы были сгруппированы в бактериальную композицию. В данной работе было принято соотношение штаммов 1:1:1 с учетом значимости технологических свойств каждого в отдельности штамма и их способности снижать содержание холестерина.

Для микроорганизмов, входящих в бактериальную композицию, необходимо учитывать способность культур сосуществовать между собой, не подавляя рост друг друга. Для изучения отсутствия антагонизма между этими штаммами использовался метод перпендикулярных штрихов (рис. 3).

а б

Рис. 3 Совместный рост штаммов стартовых культур:

Lactobacillus curvatus 1 (В-8889), Pediococcus pentosaceus 28 (В-8888) a Staphylococcus carnosus 108 (В-8953)

По активному и равномерному росту, отсутствию зон задержки роста микроорганизмов в области их соприкосновения, установлена возможность совместного использования этих штаммов в бактериальной композиции.

Глава 4. «Адаптация метода ПЦР в режиме реального времени для выявления санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур». Адаптация метода ПЦР-РВ заключалась в разработке способа пробоподготовки исследуемых мясных образцов, применении современных способов выделения ДНК, подборе и разработке тест-систем для идентификации ДНК микроорганизмов, оптимизации разработанных тест-систем по температурному и временному профилю реакции.

В работе предлагается новый подход, осуществляющий комплексное выявление как санитарно-показательной микрофлоры, так и стартовых культур в мясном сырье и готовых продуктах [патент № 2460801]

Разработанный подход позволяет упростить стадию обогащения исследуемых образцов за счет исключения использования двух скрининговых питательных сред для отдельного выявления санитарно-показательных микроорганизмов н стартовых культур в

мясных продуктах, а также обнаружить нормируемые в мясных продуктах Salmonella typhimurium и Listeria monocytogenes в пороговых дозах, соответствующих гигиеническим требованиям СанПиНа (отсутствие в 25 г продукта).

Для выделения ДНК из бактериальных клеток использовался набор реагентов «АхуРгер Bacterial Genomic DNA Mmiprep Kit» производства компании «Axygen Scientific, Inc.» (США).

На основе анализа литературных источников был осуществлен подбор видоспецифических праймеров и олигонуклеотидных зондов на консервативные 16S и 23S участки генов для выявления бактерий видов Lactobacillus curvatus, Staphylococcus carnosus и Pediococcus pentosaceus Специфичность разработанных праймеров и зондов была проверена с помощью программы BLAST on-line.

В связи с тем, что ранее исследований по выявлению Staphylococcus carnosus с помощью ПЦР-РВ не проводилось, была выбрана стратегия подбора олигонуклеотидного зонда, которая основана на компьютерном анализе нуклеотидных последовательностей 16S рРНК гена в базе данных GenBank с учетом выбранных праймеров. Последовательность зонда тестировали, используя on-line базу данных BLAST.

Для выявления Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus spp. и Listeria monocytogenes методом ПЦР с флуоресцентной детекцией результата в режиме реального времени применяли готовые наборы «КОЛИПОЛ-РВ», «СТАФИПОЛ-РВ», «ПРОТЕПОЛ-РВ» и «ЛИСТЕРОПОЛ-РВ» производства НПФ «Литех» (Россия). Для выявления Salmonella typhimurium использовали набор «АмплиСенс® Salmonella typhi-FL» производства ЦНИИ эпидемиологии (Россия).

Постановка ПЦР-РВ для выявления стартовых культур и санитарно-показательной микрофлоры проводилась на приборе Rotor-Gene 3000 производства «Corbett Research» (Австралия)

Подтверждение эффективности применяемой методики выделения ДНК и протоколов ПЦР-амнлификации осуществлялось на типовых штаммах стартовых культур: Staphylococcus carnosus 108, Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и мясном сырье с искусственным обсеменением санигарно-показательной микрофлорой: Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P, Escherichia coli К 12 С 600, Proteus vulgaris ATCC 13315, Salmonella typhimurium LT2, Listeria monocytogenes 766 (рис. 4).

1 1

J f j

п

/ i

/ / / h /

У/ & ........

a

1) Staphylococcus carnosus; 2) Lactobacillus cun'atus; 3) Pediococcus pentosaceus; 4) отрицательный контроль.

1) Salmonella typhimurium;

1) Staphylococcus aureus;

3) Escherichia coli;

4) Proteus vulgaris;

S) Listeria monocytogenes

6) отрицательный контроль.

Рис. 4 Результаты ПЦР-РВ при анализе ДНК типовых штаммов стартовых культур и санитарно-показательных микроорганизмов в мясном сырье с искусственным обсеменением 10

В ходе исследования ДНК штаммов стартовых культур и санитарно-показательной микрофлоры в контаминированном сырье в каждом случае были получены положительные результаты, т.к. в процессе амплификации регистрировали кинетические кривые, которые поднимались выше флуоресцентного шума с выходом на плато к концу реакции.

Следует отметить, мясное сырье (охлажденная свинина) было искусственно обсеменено микроорганизмами для того, чтобы показать, что тест-системы позволяют идентифицировать не только чистые культуры микроорганизмов, но и бактерии, содержащиеся непосредственно в сырье.

Полученные результаты подтверждают специфичность разработанных тест-систем и возможность использования коммерческих наборов для анализа мясных продуктов

Для относительной количественной оценки ДНК микроорганизмов был применен метод калибровочного графика. Этот метод предполагает построение калибровочных графиков с серией разведений ДНК микроорганизмов, которые впоследствии используются для определения концентрации микроорганизмов в экспериментальных образцах. Для создания калибровочных графиков были использованы 24-часовые жидкие культуры микроорганизмов с известным значением КОЕ/мл, полученные по стандарту мутности и подтвержденные в посевах на плотной среде. Результаты количественного анализа штаммов с концентрацией 103—109 КОЕ методом ПЦР-РВ представлены на рисунке 5-а на примере Escherichia coli.

Известно, что момент заметного усиления сигнала и отрыв его от базовой линии, так называемый пороговый цикл, зависит от исходного количества ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции. Рост кинетической кривой (рис. 5-а) детектируется приблизительно на 15 цикле для концентрации микроорганизма 109 КОЕ, и постепенно при снижении концентрации микроорганизма до 103 КОЕ, детекция продуктов реакции регистрируется на 35 цикле Подобная картина наблюдалась для всех штаммов исследуемых микроорганизмов.

На основании полученных кривых программа «Rotor Gene 3000» сама строит калибровочный график, показывающий зависимость концентрации ДНК от уровня флуоресценции, а также выдает цифровое значение цикла, соответствующее исследуемой концентрации. Количественный анализ результатов представлен на рисунке 5-6 на примере Escherichia coli.

/ / / ; =

iäüf / / \

• /j *J /ш* ' /'

1 / ; / ' / ■ / W/

/ С-— KbflipX^

J 10' 1(f

Конц/знтрация

график зависимости уровня флуоресценции от концентрации ДНК для Escherichia coli

анализ ДНК Escherichia coli концентрацией 103-10" КОЕ/мл

Рис. 5 Результаты анализа ДНК Escherichia coli ПЦР-РВ

Аналогичным способом были проанализированы все исследуемые микроорганизмы и установлена зависимость цикла от концентрации микроорганизмов (табл. 2).

Значения, представленные в таблице 1, позволят определять относительное количественное содержание микроорганизмов, присутствующих в экспериментальных

образцах.

Таблица 1

_Зависимость цикла от концентрации микроорганизмов_

Цикл амплификации для Концентрация, КОЕ/мл

10" 10" 10' 10" 10> 104 10

Escherichia coli 14,20 17,63 21,23 25,01 28,61 32,01 35,65

Staphylococcus aureus 15,50 19,51 23,63 26,88 30,70 34,52 38,34

Proteus spp. 12,39 15,50 19,38 23,06 26,72 30,42 33,57

Listeria monocytogenes 16,67 18,12 21,08 24,85 29,00 34,97 39,10

Salmonella typhimurium 13,89 17,66 21,28 24,75 31,46 33,01 37,12

Lactobacillus curvatus 11,56 15,83 19,15 22,25 26,61 32,30 35,82

Staphylococcus carnosus 17,03 20,20 24,01 26,38 29,11 35,01 39,30

Pediococcus pentosaceus 15,66 16,52 19,76 22,63 26,89 32,36 35,62

Таким образом был адаптирован метод ПЦР-РВ для идентификации стартовых культур видов Staphylococcus carnosus, Lactobacillus curvatus, Pediococcus pentosaceus и выявления санигарно-показательной микрофлоры: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus spp., Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes в контаминированном сырье. Показана специфичность и чувствительность метода и определена зависимость результата реакции от концентрации микроорганизма.

Глава S. «Оценка эффективности использования бактериальной композиции в технологии сыровяленого мясного продукта». Для исследования влияния бактериальной композиции на уровень содержания холестерина и апробации метода ПЦР-РВ были выработаны пять экспериментальных образцов сыровяленого мясного продукта из свинины.

Образец № 1 не содержал бактериальные культуры.

Образец № 2 содержал культуры импортных бакпрепаратов Бактоферм T-SP (Staphylococcus carnosus и Pediococcus pentosaceus) и Бактоферм LL-1 (Lactobacillus curvatus) компании «Христиан Хансен», Дания. Эти бакпрепараггы вносили в образец № 2 в количестве 109 КОЕ/г в соотношении 2:1 (таким образом видовой состав вносимых микроорганизмов образца № 2 соответствовал видовому составу микроорганизмов образцов № 3-5).

В образцы № 3-5 вносили полученную бактериальную композицию (Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus carnosus 108) в количестве 109 КОЕ/г и соотношении 1:1:1. Отличие между образцами состояло в том, что для образцов № 4 и 5 была снижена концентрация нитрита натрия в рассоле с 0,075 до 0,05 и 0,03%, соответственно. Это связано с тем, что в бактериальную композицию входит денитрифицирующий штамм Staphylococcus carnosus 108. Снижение концентрации нитрита натрия при условии более полного его восстановления до NO позволит повысить безопасность готового продукта.

В течение всего технологического процесса проводили исследование микробиологических и физико-химических показателей мясного сырья и образцов мясного продукта.

При исследовании микробиологических показателей мясного сырья классическим бактериологическим анализом установлено, что общая обсемененность охлажденной свинины находятся в пределах допустимых норм и соответствует требованиям СанПиНа 2.3.2.-1078.01, индекс 1.1.1.

Одновременно проводили контроль санитарно-гигиенического состояния мясного сырья методом ПЦР-РВ, который обнаружил присутствие Escherichia coli (рис. 6-а). Это можно объяснить тем, что даже при наличии в сырье клеток бактерий в следовом

количестве, которое невозможно выявить классическими микробиологическими методами, стадия обогащения позволяет повысить концентрацию микроорганизмов до уровня чувствительности метода ПЦР-РВ.

Полученные методом ПЦР-РВ результаты не являются основанием для выбраковки сырья, т к. классический микробиологический анализ не выявил наличие Escherichia coli, однако служат индикатором его санитарно-гигиенической картины и позволят своевременно предпринять меры для исключения развития санитарно-показательной микрофлоры в продукте. Бактерии видов Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Proteus spp. и Listeria monocytogenes методом ПЦР-РВ в мясном сырье выявлены не были.

Микробиологическая оценка образцов мясного продукта в течение всего технологического процесса проводилась с помощью классического микробиологического анализа, а также методом ПЦР-РВ. Для этого в процессе сушки в асептических условиях отбирали пробы по 25 г от каждого образца на 0, 5, 10, 15 и 20 сут.

S»

........у Г '

1 1 V

к / \

а

1) положительны}) котролъ. - Escherichia coli концентрацией 10®; 1) ноложнтельньш контрам, - Escherichia сой концентрацией 109;

2) Escherichia coli в мясном сырье; 2) положительный контроль - Escherichia coli концентрацией 10";

3) положительный контроль - Escherichia coli концентрацией 101; 3-7) Escherichia coli о процессе прошаодства обраша Vit на 0-20

4) отрицательный контроль сут сушки____

V

1) иоложительньш контроль - Escherichia coli ко.щентрацией 10»; U тлоипыьтЛ контроль - Escherichia coll концецтрмцеи 10 ;

2) положительный контроль - Escherichia соЧ конце.працней Н* 2) п„.™«о™ьнь,й „„шроль - Escherichia coli концентрации 10 . 3-7) Escherichia сой > процессе пром.одстаа образца Ш 3-D Escherichia соЧ. процессе орош.адс™ о6р«ц.МЗ ш, 0-20 су, на 0-20 сут сушки сушкп

Рис. 6 Результаты ПЦР-РВ

Как видно из рисунка 6-6, на 0 и 5 сутки в образце № 1 (не содержащем стартовые культуры) методом ПЦР-РВ было обнаружено присутствие Escherichia coli, такая же картина наблюдалась и на 10 сутки Однако к 15 суткам данные бактерии не были идентифицированы, это можно объяснить тем, что в процессе сушки мясного продукта происходит уменьшение содержания влаги и понижение величины рН, ингибирующие рост Escherichia coli. В образце №2 с культурами импортного производства регистрация Escherichia coli осуществлялась на 0 и 5 сутки, на 10 сутки бактерии вида Escherichia coli выявлены не были (рис. 6-в). Полученные результаты показывают, что образец № 2 имеет

наиболее благоприятную санитарно-гигиеническую картину по сравнению с образцом № 1, это обусловлено тем, что микроорганизмы, входящие в состав бактериальных препаратов импортного производства, обладают антагонистическими свойствами по отношению к санитарно-показательной микрофлоре. При исследовании образца № 3 методом ПЦР-РВ Escherichia coli была идентифицирована только на 0 сутки, в ходе дальнейшего анализа эти бактерии не были выявлены (рис. 6-г) Для образцов № 4 и 5 результаты были схожи с образцом № 3 (рисунки не приводятся).

Данные исследования иллюстрируют, что образцы № 1 и 2 уступают по санитарно-гигиеническому состоянию образцам № 3-5, это связано с тем, что стартовые культуры, входящие в состав разработанной бактериальной композиции, эффективнее ингибируют рост Escherichia coli.

Другие санитарно-показательные микроорганизмы видов Staphylococcus aureus, Proteus spp., Salmonella typhimurium и Listeria monocytogenes при производстве образцов мясного продукта методом ПЦР-РВ выявлены не были.

В ходе проведения классического микробиологического анализа в течение всего технологического процесса санитарно-показательной микрофлоры обнаружено не было. Образцы мясного продукта отвечали требованиям СанПиНа 2.3.2 -1078.01.

Для контроля развития стартовых культур на всем протяжении технологического процесса был проведен их мониторинг методом ПЦР-РВ с использованием видоспецифических тест-систем для исключения идентификации нежелательных близкородственных молочнокислых микроорганизмов, которые могут присутствовать в исходном сырье.

В образцах № 2-5 были выявлены стартовые культуры видов Lactobacillus curvatus, Staphylococcus carnosus и Pediococcus pentosaceus (рис. 7 на примере образца № 3).

/

/ / :

У J / ' У \ /

äay / /

У*1

Л

^ N

Чш/ / / /

Jkv х /

/ 7!^' , t /

Рис. 7 Результаты исследования методом ПЦР-РВ Lactobacillus curvatus (а), Staphylococcus carnosus (б), Pediococcus pentosaceus (в) в образце № 3 с 0 до 20 сут сушки

К X

Как видно из рисунка 7, присутствие стартовых культур видов Lactobacillus curvatus, Staphylococcus carnosus и Pediococcus pentosaceus детектируется на 5 сутки сушки, рост кривых свидетельствует о наличии этих микроорганизмов В процессе сушки наблюдается постепенное развитие стартовых культур в продукте, что позволяет

проследить динамику роста микроорганизмов и подтверждает эффективность анализа ПЦР-РВ. Аналогичные данные были получены для образцов № 2, 4 и 5.

В образце № 1 (без добавления стартовых культур) при исследовании методом ПЦР-РВ бактерии видов Lactobacillus curvatus, Staphylococcus carnosus и Pediococcus pentosaceus не были идентифицированы, это объясняется тем, что образец не содержал целевую ДНК этих микроорганизмов. Таким образом, доказано отсутствие влияния конкурентных молекул ДНК на результат ПЦР-анализа, которые не снижают специфичность разработанных тест-систем при исследовании стартовых культур в мясных продуктах.

Наряду с микробиологическим контролем были определены показатели рН и влаги сырья и образцов мясного продукта в процессе сушки. Результаты исследований показали, что введение молочнокислых микроорганизмов в мясное сырье приводит к интенсивному снижению величины рН (рис. 8-а) и обезвоживанию мясопродуктов (рис. 8-6).

Из полученных данных видно, что у образцов № 2—5 общая динамика процесса сушки совпадает Это, по всей видимости, обусловлено активностью стартовых культур — продуцентов молочной кислоты У образца № 1 (без стартовых культур) к 20 сут сушки было самое высокое содержание влаги и значение величины рН.

В процессе производства образцов мясного продукта был исследован показатель активности воды (aw), который характеризует физико-химическое состояние влаги в продукте и позволяет судить о его микробиологическом состоянии (рис. 8-в).

75

*

г

а «5

-»-(|в|ИМЯ|1 *

—•—образец 2 %

-♦-лбражиЗ ч 5S

——обрат* 4 я 50

обрами 5 8

1 4Ь 40

сырье в сут 5сут Юсут |5е?т 20сут

а

сырье Öcjt 5сут tDcyr IScyT 2Dcyi б

- образец 1 -образец2 —образец J -oßpateu4

— образец?

сырье в^гт 5сут Юсут 15су« ЭДсут

В

Рис. 8: а - Изменение величины pH в образцах мясного продукта в процессе производства; б - Динамика обезвоживания образцов мясного продукта в процессе производства; в - Динамика активности воды в образцах мясного продукта

в процессе производства

При сопоставлении результатов молекулярно-генетических исследований и показателей активности воды видно, что в мясном сырье рост Escherichia coli обнаружен при а„ = 0,957, это значение является оптимальным для жизнедеятельности многих санитарно-показательных микроорганизмов. В процессе производства мясного продукта происходит развитие стартовых культур, уменьшение содержания влаги в мясном сырье, снижение величины pH, что обуславливает снижение показателя активности воды. К 20 суткам сушки образцов мясного продукта рост санитарно-показательных

микроорганизмов обнаружен не был, а значение активности воды снизилось до 0,831 в образце № 1, 0,809 - в образце № 2 и 0,815-0,819 у образцов № 3-5; эти результаты дают основание полагать, что продукт является микробиологически стабильным.

В связи с тем, что основным функциональным свойством содержащейся в образцах № 3-5 бактериальной композиции является способность снижать уровень холестерина, в готовых продуктах было определено содержание холестерина методом ВЭЖХ Анализ образцов проводили с использованием хроматографической системы фирмы Кпаиег (Германия) со спектрофотометричесхим детектором К-2500 и программным обеспечением «Мультихром» (рис. 9).

В - образце № 2; С - образце X» 3.D- стандарт (холестерин) В образце № 1 было выявлено наибольшее количество холестерина, которое составило 620,9 мг/кг. В связи с тем, что образец № 1 не подвергался воздействию стартовых культур, эти результаты были взяты за основу.

В образце № 2 с импортными стартовыми культурами содержание холестерина составило 547,9 мг/кг, что на 11,7% ниже, чем у образца № 1. Для импортных стартовых культур изучение способности снижать содержание холестерина in vitro не входило в задачи данной работы, однако согласно данным ВЭЖХ очевидно, что введение бактериальных препаратов Бактоферм T-SP (Staphylococcus carnosus и Pediococcus pentosaceus) и Бактоферм LL-1 (Lactobacillus curvatus) уменьшило количество холестерина в готовом продукте. Это можно объяснить тем, что ферментные системы входящих в состав препаратов микроорганизмов способны активно деструктурировать холестерин, содержащийся в мясном сырье.

Для образца № 3 с бактериальной композицией, содержащей штаммы, обладающие максимальными холестеринснижающими способностями, количество холестерина составило 487,8 мг/кг, что показывает преимущество по сравнению с образцами № 1 и 2. Так в образце № 3 уровень холестерина на 21,4% ниже, чем в образце № 1 без стартовых культур и на 10,9% ниже, чем в образце № 2 с культурами импортного производства. Эти данные подтверждают эффективность бактериальной композиции и позволяют позиционировать данный продукт как продукт с функциональной направленностью.

По общему химическому составу исследуемые образцы не имели принципиальных отличий (табл. 2).

Таблица 2

Физико-химические показатели готового продукта

Показатели Массовая доля, %: Образец № 1 Образец №2 Образец №3 Образец №4 Образец №5

- влаги 45,40 ±0,52 42,20 ±0,50 43,33 ±0,68 43,40 ±0,51 43,35 ±0,49

- белка 30,40 ±0,41 30,75 ±0,42 30,10 ±0,44 29,90 ±0,43 30,11 ±0,40

- жира 16,65 ±0,45 19,25 ±0,44 18,69 ±0,49 18,95 ±0,47 18,99 ±0,46

- золы, в т.ч. - хлористого натрия 6,1 ±0,10 6,4 ±0,09 6,3 ±0,09 6,3 ±0,08 6,3 ±0,10

3,50 ±0,17 3,40 ±0,16 3,28 ±0,15 3,30 ±0,17 3,27 ±0,16

- нитрита натрия 0,0023 ±0,0002 0,0021 ±0,0002 0,0006 ±0,0002 0,0002 ±0,0002 Следа

Количество нитрозопигментов, % 81,4 ±0,09 82,2 ±0,09 88,5 ±0,08 83,6 ±0,08 80,7 ±0,08

Установлено, что за счет введения в рецептуру штамма Staphylococcus carnosus 108, обладающего денитрифицирующей активностью, в образце № 3 с традиционным уровнем введения в рассол нитрита натрия, существенно снижается массовая доля остаточного нитрита по сравнению с образцами № 1 и 2, при этом наблюдается максимальное содержание нитрозопигментов Несмотря на уменьшение количества введения нитрита натрия у образцов № 4 и 5, содержание нитрозопигментов в них не уступает контрольным образцам, в то же время у данных образцов резко снижается массовая доля остаточного нитрита натрия

Таким образом, применение бактериальной композиции, содержащей денитрифицирующий штамм Staphylococcus carnosus 108, позволяет снизить уровень вводимого в рассол нитрита натрия с 0,075% до 0,03%, при этом качество продукта не ухудшается в сравнении с продуктом, полученным без стартовых культур. Кроме того, за счет полного восстановления нитрита натрия исключается его поступление в организм человека, что придает продукту дополнительную безопасность.

При исследовании органолептических характеристик оценивали по 5-ти бальной системе внешний вид, вкус, цвет, аромат и консистенцию готовых мясных продуктов (рис. 10).

—•—образец 1 —•—образец 2 —»—образец 3 —w— образец4 —:^-обра.зец5

Вкус

Рис.10 Органолептическая оценка образцов мясного продукта

Коней стешдоя

Аромат

Внешний вид

Обща «оценка -

Цвет

Образец № 1 имел красноватый цвет на разрезе, приятный солоноватый вкус и слегка кисловатый аромат Образец № 2 характеризовался ярко выраженным кисловатым запахом, при этом цвет и вкус соответствовали требованиям, предъявляемым к данному виду продуктов. Образцы № 3-5 были схожи по органолептическим показателям и имели хороший внешний вид, приятный вкус и аромат. Различия наблюдались в интенсивности окраски этих образцов, так образец № 3 обладал самой интенсивной красно-розовой окраской, при этом у опытных образцов № 4 и 5 окраска соответствовала традиционной, чуть бледнее — у № 5.

Принимая во внимание, что сыровяленые мясопродукты относятся к группе изделий с длительным периодом хранения, была изучена динамика основных (микробиологических, органолептических, физико-химических) показателей после завершения технологического процесса с целью обоснования сроков хранения продукта при стандартных параметрах (1?=4±2 °С; ср=75±5 %) согласно методическим указаниям «Эпидемиологическая оценка обоснования сроков годности и условий хранения пищевых продуктов» МУК 4.2.184704.

Сравнительная оценка органолептических показателей готовых продуктов показала, что образцы с использованием стартовых культур, в том числе импортного производства, имели преимущество перед образцом № 1 в течение всего периода хранения практически по всем сенсорным характеристикам.

Изучение динамики потерь массовой доли влаги и величины рН позволило установить, что в процессе хранения в образцах сыровяленого мясного продукта наблюдалось незначительное изменение рН и влаги (рис. 11-а и б).

-образен! -образец2 -образецЗ -образец 4 -образец5

15с)Т ЗОсут 45еут

Изменение массовой доли влаги

5,6

5,5

-«-образец 1 с. я 5,4

—»-образец 2

образец 3 Í 5,3

образец 4 i

--'-образец 5 5,2

5,1

Осут 15еут ЗОсут 45 о г б

Изменение величины рН

ЗЭсут 45 .'vi

-oópaieill -обра lea 2

- образец 3

- образец 4 -образец 5

15сут Звсуз 4 5<?í

В Г

Динамика накопления Динамика увеличения

перекиспых соединений кислотны* чисел

Рис. 11 Исследование образцов сыровяленого мясного продукта в процессе хранения

Снижение величины рН в образцах со стартовыми культурами обусловлено, главным образом, образованием молочной кислоты в результате жизнедеятельности молочнокислой микрофлоры. Снижение рН у образца № 1 можно объяснить

деятельностью спонтанной молочнокислой микрофлоры, которая способна образовывать, помимо молочной кислоты, побочные продукты метаболизма (уксусную, масляную кислоты, этиловый спирт и др. вещества), негативно влияющие на органолептические показатели готового продукта Изменение рН среды до уровня, близкого к изоэлектрической точке мышечных белков, приводит к понижению их гидратации, чем объясняется потеря влаги в процессе хранения образцов мясного продукта.

Исследование процессов окисления лшщдов показало (рис. 11-в), что применение стартовых культур из коллекщш МГУПП ингибирует развитие окислительных процессов. Это объясняется тем, что используемые в бактериальной композиции микроорганизмы обладают антиоксидангными свойствами, а именно способностью ингибировать автоокисление аскорбиновой кислоты, связывать ионы Fe2+ и Си штаммы Lactobacillus curvatus 1 и Staphylococcus carnosus 108 обладают СОД-активностъю.

Сравнительная оценка выбранных показателей, а также данных микробиологического анализа, позволила сделать заключение, что гарантированное сохранение качества мясных продуктов, изготовленных с использованием бактериальной композиции, может быть обеспечено при хранении в вышеназванных условиях в течение 30 суток.

На основании выполненных исследований обоснована целесообразность использования бактериальной композиции для производства сыровяленого продукта из свинины, технологическая схема представлена на рис. 12. Данные результаты могут быть перенесены и на другие ассортиментные группы ферментированных мясных продуктов.

Комплексная оценка полученных результатов свидетельствует о том, что введение бактериальной композиции при производстве мясного продукта способствует снижению содержания холестерина в продукте на 21,4%, улучшению органолептических и микробиологических показателей. Кроме того, использование денитрифицирующего штамма Staphylococcus carnosus 108 позволит снизить содержание шприта натрия в рассоле до 0,03%.

Глава 6. «Применение системы ХАССП для обеспечения безопасности сыровяленого мясного продукта». Проведен анализ рисков, влияющих на безопасность готового сыровяленого продукта из свинины, и составлен план ХАССП, в котором отражены действия, направленные на снижение рисков.

При разработке плана ХАССП учитывалось влияние бактериальной композиции на снижение рисков в критических контрольных точках технологического процесса сыровяленого продукта из свинины (приготовление и внесение в рассол раствора шприта натрия (ККТ № 1.1 и 1.2) и сушка (ККТ № 2)). Так, денитрифицирующий иггамм Staphylococcus carnosus 108, содержащийся в бактериальной композиции, дает возможность снизить введете нитрита натрия с рассолом до 0,03% и понизить риск в ККТ № 1.1 и 1.2 (приготовление и внесение в рассол раствора нитрита натрия). Кроме того, способность стартовых культур, входящих в состав бактериальной композиции, ингибировать рост санитарно-показательной микрофлоры позволит снизить риски микробиологического характера в ККТ № 2 (сушка).

Следует отметить, для того чтобы повысить скорость и эффективность микробиологического анализа при контроле санитарно-показательной микрофлоры и роста стартовых культур, антагонистов санитарно-показательных микроорганизмов, в ККТ № 2, в контрольной карте ХАССП предлагается использовать современный высокотехнологичный метод ПЦР в реальном времени.

Таким образом, составлен план ХАССП, обеспечивающий контроль и управление за всеми технологическими рисками при производстве сыровяленого продукта из свинины с пониженным содержанием холестерина с учетом влияния бактериальной композиции на снижение рисков в ККТ и применения ПЦР в реальном времени в качестве инструмента для микробиологического контроля.

Подготовка сырья: разделка, обвалка, жилошса Посол

Шприцевание рассолом, массовая доля 6-8 % к массе сырья

Приготовление рассола (плотность 1,116 г/см3, массовая доля сахарного песка -2,5%, нитрита

натрия - 8,03%)

Вибромассирование в течение 60 мин со скоростью вращения 5 об/мин при частоте вибрации 40 Гц (вращение - 10 мин, покой - 5 мин) и 1 = 0 4 "С

Натирание посолочной смесью и прессование при Р= 0,5 МП а и I = 0-4 "С в течение 3 сут

Ж

Поднетливаиие шпагатом

Приготовление бактериальной композиции, состоящей из

штаммов 1мсЮЬасШт сигуаШя 1, Рейикоссия реп'охасеш 28, ЗШркугососсиз сагптиз 108 в количестве 109 КОК/г

Приготовление посолочной смеси для сухого посола: массовая доля хлорида натрия — 2,5%, сахарного песка - 0,2% к массе сырья

Сушка продукта:

стадия 1 4 = 6-8вС;т = 5сут;ч> = 92% стадия 21 = 8-10 °С; т = 5 сут; <р = 82% стадия 31 = 10 -12 "С; т = 10 сут; «¡> = 72% 1) = 0,5-0,8 м/с в течение всего процесса

Контроль качества готового продукта

Рис. 12 Технологическая схема производства сыровяленого продукта из свинины с использованием бактериальной композиции

При расчете экономической эффективности установлено, что за счет экономии на стоимости стартовых культур отечественного производства в сравнении с импортными бактериальными препаратами, а также с учетом социального эффекта от использования бактериальной композиции, дополнительный объем прибыли при производстве сыровяленого продукта из свинины с пониженным содержанием холестерина составит 42193,25 руб. на 1 т готовой продукции. Таким образом, данная технология является экономически целесообразной.

На основании проведепных исследований разработан проект технической документации на сыровяленый продукт из свинины с пониженным содержанием холестерина. Апробация разработанной технологии была проведена в условиях опытной станции ГОУ ВПО МГУПБ и ООО МПЗ «Рублевский».

ВЫВОДЫ

1. Разработана бактериальная композиция, содержащая штаммы Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus camosus 108 в соотношении 1:1:1, для снижения содержания холестерина при производстве сыровяленого продукта из свинины.

2. Установлено, что способность исследованных стартовых культур снижать уровень холестерина in vitro является штаммоспецифичным признаком. Выявлены штаммы, обладающие максимальными холестеринснижающими свойствами: Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus camosus 108, которые сгруппированы в бактериальную композицию с учетом отсутствия антагонизма между ними.

3. Адаптирован метод ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентной схемой детекции для идентификации санитарно-показательной микрофлоры и мониторинга стартовых культур, а именно разработан способ пробоподготовки исследуемых мясных образцов; подобраны методика выделения ДНК и тест-системы для идентификации ДНК микроорганизмов, в т.ч. разработан олигонуклеотпдный зонд на 16S рРНК ген для выявления Staphylococcus camosus.

4. На типовых штаммах стартовых культур и мясном сырье, искусственно обсемененном санитарно-показательной микрофлорой, подтверждены чувствительность и специфичность разработанных тест-систем для идентификации ДНК микроорганизмов методом ПЦР в реальном времени.

5. Показано, что внесение разработанной бактериальной композиции в рецептуру сыровяленого мясного продукта обеспечивает снижение содержания холестерина в продукте на 21,4% за счет метаболических особенностей стартовых культур.

6. Определена целесообразность использования бактериальной композиции при производстве сыровяленого мясного продукта. Установлено, что введение бактериальной композиции позволяет интенсифицировать процесс сушки до 20 сут, а также способствует формированию насыщенного цвета, плотной структуры, придает специфический вкус, аромат готовому продукту, обеспечивает микробиологическую стабильность продукта и замедляет окислительные процессы, при этом гарантированное сохранение качества мясных продуктов обеспечивается в течение 30 суток.

7. Разработан план ХАССП, обеспечивающий контроль и управление за технологическими рисками при производстве сыровяленого продукта из свинины с использованием бактериальной композиции. Показано, что применение метода ПЦР-РВ позволяет проводить своевременный контроль в ККТ № 2 (сушка), а введение бактериальной композиции - повысить микробиологическую безопасность в этой точке. Денитрифицирующий штамм Staphylococcus carnosus 108, содержащийся в бактериальной композиции, дает возможность снизить введение нитрита натрия с рассолом до 0,03% и гарантировать безопасность в ККТ № 1.1 и 1.2 (приготовление и внесение в рассол раствора нитрита натрия).

8. Разработан проект технической документации на производство сыровяленого продукта из свинины с пониженным содержанием холестерина Апробация технологии была проведена в условиях опытной станции ГОУ ВПО МГУПБ и ООО МПЗ «Рублевский».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Титов Е.И. Разработка типового плана ХАССП для производства мясного продукта [Текст] / Е.И. Титов, Л.Ф. Митасева, C.B. Колотвина, А.О. Соломко // М.: Все о мясе, 2011.-№4.-С. 54-58.

2. Колотвина C.B. Молекулярно-генетическне и физико-химические методы для характеристики санитарно-гигиенического состояния ферментированных мясных продуктов [Текст] / C.B. Колотвина, Н.Г. Машенцева, Е.И. Титов, Л.Ф. Митасева // М.: Биотехнология, 2011. - № 4. - С. 88-94.

3. Титов Е.И. Стартовые культуры, снижающие содержание холестерина, в мясных продуктах [Текст] / Е.И. Титов, C.B. Колотвина, Н.Г. Машенцева, А.И. Семёньппева, НгуенТхиМинь Кхань//М.: Мясная индустрия, 2012. -№ 2. - С. 22-25.

4. Колотвина C.B. Адаптация и оптимизация метода ПЦР в реальном времени для микробиологического анализа мясных продуктов [Текст] / C.B. Колотвина // М.: Биотехнология, 2012. 3. - С. 85-91.

Материалы конференций:

5. Абинскова C.B. К вопросу об использовании молекулярных методов при исследовании микробиологической обсемененности мясных продуктов [Текст] / C.B. Абинскова, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых. -М.: МГУПБ, 2007. - С. 163-165.

6. Абинскова C.B. Использование ПЦР-диагносшкн в качестве бактериологического анализа мясных продуктов [Текст] / C.B. Абинскова, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, В.В. Колотвин // Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», Москва, 2008. — С. 37.

7. Абинскова C.B. Исследование санитарно-гигиенического состояния мясных продуктов методом ДНК-типирования [Текст] / C.B. Абинскова, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, В.В. Колотвин, С.Г. Юзов // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы VII Международной научной конференции студентов и молодых ученых. -М.: МГУПБ, 2008. - С. 156-158.

8. Титов Е.И. Использование молекулярно-генетических методов при исследовании мясных продуктов в отношении санитарно-гигиенической безопасности [Текст] / Е.И. Титов, Н.Г. Машенцева, Л.Ф. Митасева, В.В. Колотвин, C.B. Абинскова // Тенденции и перспективы развития инновационных и информационных технологий перерабатывающей промышленности. Сборник докладов 11 Международной научной конференции памяти В.М. Горбатова. - М.: ВНИИМП им. В.М. Горбатова, 2008. -С. 138-142.

9. Абинскова C.B. Применение молекулярно-генетических методов в качестве контроля безопасности ферментированных мясных продуктов [Текст] /C.B. Абинскова, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, В.В. Колотвин // Материалы Пятого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009.-ч. 2.-С. 34-35.

10. Абинскова C.B. Использование методов ДНК-типирования при исследовании мясных продуктов в отношении санитарно-гигиенической безопасности [Текст] / C.B. Абинскова, Н.Г. Машенцева, В.В. Колотвин // Материалы I Всероссийской студенческой научной конференции «Молодежная наука - пищевой промышленности России», г. Ставрополь: СевКавГТУ, 2009. - С. 3.

11. Абинскова C.B. Использование молекулярно-генетических методов для определения санитарно-гигиенической безопасности продуктов питания [Текст] / C.B. Абинскова // Химия - 2009: Материалы 15-ой международной выставки химической промышленности и науки.-М.: ЦВК «Экспоцентр», 2009. - С. 34-35.

12. Абинскова C.B. Альтернативные подходы к бактериологическому анализу мясных изделий [Текст] / C.B. Абинскова, Е.И. Титов // Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания: Материалы Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2009. - С. 110-112.

13. Абинскова C.B. Применение молекулярно-генетических методов для контроля санитарно-показательной микрофлоры в мясных изделиях [Текст] / C.B. Абинскова, Е.И. Титов, Н.Г. Машенцева, Л.Ф. Митасева // Материалы Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов», Москва, 2010. - С. 507-508.

14. Абинскова C.B. Применение метода ПЦР-диагностики для санитарно-гигиенической оценки мясных продуктов [Текст] / C.B. Абинскова И Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010». -М.: ГК «Космос», 2010. -Т. 2. -С. 4-6.

15. Титов Е.И. Комплексный подход к обеспечению безопасности ферментированных мясных продуктов [Текст] / Е.И. Титов, C.B. Колотвина // Материалы 13-ой Международной научной конференции, посвященной памяти Василия Матвеевича Горбатова и 80-летию ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии «Инновационные аспекты переработки мясного сырья и создания конкурентоспособных продуктов питания». -М.: ВНИИМП им. В.М. Горбатова, 2010. -С. 153—154.

16. Колотвина C.B. Методика оценки безопасности мясных продуктов на основе видоспецифической ПЦР и ПЦР в реальном времени [Текст] / C.B. Колотвина, ' Е.И. Титов, Н.Г. Машенцева // Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». — М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им Д.И. Менделеева, 2011. -ч. 2. -С. 140-141

17. Колотвина C.B. Комплексный подход к созданию мясных продуктов профилактической направленности, снижающих риск возникновения сердечнососудистых заболеваний [Текст] / C.B. Колотвина, Е.И. Титов, Н.Г. Машенцева // Материалы IX международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - М.: МГУПП, 2011. -С. 144-147.

Изобретения:

18. Патент № 2460801 РФ. Способ выявления санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах [Текст] / Е.И. Титов, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, C.B. Колотвина - заявл. 15.04.2011; опубл. 10.09.2012. Бюл. №25. -7 с.

Другие публикации:

19. Рогов И.А. Идентификация санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур в мясных изделиях методами ПЦР в реальном времени и ПЦР с элекгрофоретической детекцией: учебно-методическое пособие для студентов направления подготовки уровня магистратуры 260200, 110500 [Текст] / И.А. Рогов, Е.И. Титов, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, C.B. Колотвина // М.: МГУПП, 2012. - 33 с.

Автор выражает искреннюю благодарность за помощь, оказанную в подготовке диссертации д.тм. Машенцевой Наталье Геннадьевне, к. т.н. Митасевой Людмиле Филипповне ФГБОУ В ПО МГУПП

Подписано в печать 22.11.2012. Формат 60 х 84 1/16 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 150 экз. Заказ № 246

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» (ФГБОУ ВПО «ВГУИТ») Отдел полиграфии ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» Адрес университета и отдела полиграфии: 394036, Воронеж, пр. Революции, 19

Введение.

Глава 1 Обзор литературы.

1.1 Перспективы производства функциональных пищевых продуктов

1.2 Проблема возникновения сердечно-сосудистых заболеваний.

1.3 Роль стартовых культур в снижении уровня холестерина в ферментированных мясных продуктах.

1.4 Особенности производства ферментированных мясных продуктов.

1.5 Современные подходы к оценке микробиологической безопасности мясных продуктов.

1.6 Области применения молекулярно-генетических методов в пищевой промышленности.

1.7 Применение молекулярно-генетических методов для оценки санитарно-гигиенической картины мясных продуктов.

1.8 Обоснование выбора способа выявления продуктов амплификации в режиме реального времени.

1.9 Внедрение систем управления качеством в производство мясных продуктов.

Питание - важнейший фактор, от которого зависит здоровье человека. Однако применение современных интенсивных технологий при производстве продуктов питания сопряжено со снижением качества продуктов, а иногда может привести к риску нанесения прямого вреда организму человека. Неправильное питание приводит к нарушению процессов обмена веществ в организме, ослаблению иммунитета, возникновению хронических заболеваний, преждевременному старению, в том числе является одним из важнейших факторов возникновения и развития сердечно-сосудистых заболеваний за счет употребления пищи, богатой холестерином. Поэтому в настоящее время создание функциональных мясных продуктов - основное направление современной пищевой промышленности, определяющее в будущем сохранение здоровья нации.

Наряду с этим, в настоящее время особо остро стоит проблема обеспечения высокого качества и безопасности пищевых продуктов, в частности мясных. Это обусловлено тем, что мясные продукты являются благоприятной средой для развития гнилостной микрофлоры, что приводит к их порче и возникновению риска для здоровья потребителя. К тому же наблюдается перенасыщение отечественного рынка различными видами мясных продуктов, что требует от производителей в условиях конкуренции поиска новых путей управления качеством и безопасностью продукции для удовлетворения возрастающих требований потребителя. Одним из способов решения этой проблемы является разработка и внедрение на предприятиях эффективной системы управления качеством и безопасностью мясных продуктов, направленной на оценку технологических рисков, управление рисками и их предотвращения.

Учитывая высокую вероятность загрязнения мясных продуктов санитарно-показательной микрофлорой, особенно актуален вопрос разработки методов экспресс-контроля микробиологического состояния мясных продуктов. При использовании бактериологических методов не 5 возможно своевременно оценить санитарно-гигиеническое состояние мясных продуктов, т.к. применение скрининговых селективных сред требует большой затраты времени, средняя продолжительность анализа при этом составляет 4-7 дней. В условиях современного производства зачастую необходима оперативность, поэтому не вызывает сомнений актуальность поиска и адаптации новых методов экспресс-анализа. Важно отметить, что наиболее востребованными на сегодняшний день являются молекулярно-генетические методы прежде всего потому, что направлены непосредственно на изучение ДНК и РНК клеток микроорганизмов, присутствующих в сырье и мясных продуктах, что характеризует их как высокоспецифические и чувствительные методы.

выводы

1. Разработана бактериальная композиция, содержащая штаммы Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus camosus 108 в соотношении 1:1:1, для снижения содержания холестерина при производстве сыровяленого продукта из свинины.

2. Установлено, что способность исследованных стартовых культур снижать уровень холестерина in vitro является штаммоспецифичным признаком. Выявлены штаммы, обладающие максимальными холестеринснижающими свойствами: Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus camosus 108, которые сгруппированы в бактериальную композицию с учетом отсутствия антагонизма между ними.

3. Адаптирован метод ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентной схемой детекции для идентификации санитарно-показательной микрофлоры и мониторинга стартовых культур, а именно разработан способ пробоподготовки исследуемых мясных образцов; подобраны методика выделения ДНК и тест-системы для идентификации ДНК микроорганизмов, в т.ч. разработан олигонуклеотидный зонд на 16S рРНК ген для выявления Staphylococcus camosus.

4. На типовых штаммах стартовых культур и мясном сырье, искусственно обсемененном санитарно-показательной микрофлорой, подтверждены чувствительность и специфичность разработанных тест-систем для идентификации ДНК микроорганизмов методом ПЦР в реальном времени.

5. Показано, что внесение разработанной бактериальной композиции в рецептуру сыровяленого мясного продукта обеспечивает снижение содержания холестерина в продукте на 21,4% за счет метаболических особенностей стартовых культур.

6. Определена целесообразность использования бактериальной композиции при производстве сыровяленого мясного продукта. Установлено, что введение бактериальной композиции позволяет интенсифицировать процесс сушки до 20 сут, а также способствует формированию насыщенного цвета, плотной структуры, придает специфический вкус, аромат готовому продукту, обеспечивает микробиологическую стабильность продукта и замедляет окислительные процессы, при этом гарантированное сохранение качества мясных продуктов обеспечивается в течение 30 суток.

7. Разработан план ХАССП, обеспечивающий контроль и управление за технологическими рисками при производстве сыровяленого продукта из свинины с использованием бактериальной композиции. Показано, что применение метода ПЦР-РВ позволяет проводить своевременный контроль в ККТ № 2 (сушка), а введение бактериальной композиции - повысить микробиологическую безопасность в этой точке. Денитрифицирующий штамм Staphylococcus carnosus 108, содержащийся в бактериальной композиции, дает возможность снизить введение нитрита натрия с рассолом до 0,03% и гарантировать безопасность в ККТ № 1.1 и 1.2 (приготовление и внесение в рассол раствора нитрита натрия).

8. Разработан проект технической документации на производство сыровяленого продукта из свинины с пониженным содержанием холестерина. Апробация технологии была проведена в условиях опытной станции ГОУ ВПО МГУПБ и ООО МПЗ «Рублевский».

1. Бастрыкин Д.В. Управление качеством на промышленном предприятии / Д.В. Бастрыкин, А.И. Евсейчев, Е.В. Нижегородов, Е.К. Румянцев, АЛО. Сизикин, О.И. Торбина, под ред. Б.И. Герасимова // М.: Изд. Машиностроение-1, 2006. 204 с.

2. Ботина С.Г. Идентификация промышленных штаммов молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования / С.Г. Ботина, Ю.Д. Цыганков, В.В. Суходолец // М.: Генетика, 2006. Т. 42. - № 12. - С. 1621-1635.

3. Бучинская А.Г. Разработка технологии вареной колбасы с использованием биотрансформированного сырья. Автореферат / А.Г. Бучинская // М.: МГУПБ, 2006. 24 с.

4. Горобчук Е.А. Совершенствование ветеринарно-санитарного контроля безопасности и качества производства мясных консервов. Автореферат / М.: МГУПБ, 2009. 22 с.

5. ГОСТ 8285-91 Жиры животные топленые. Правила приемки и методы испытания / Изд. Стандартинформ, 2005. 10 с.

6. ГОСТ Р 50457-92 Жиры и масла животные и растительные. Определение кислотного числа и кислотности / Изд. Стандартинформ, 2006. 6 с.

7. ГОСТ 9958-81 Колбасные изделия и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа / ИПК Издательство стандартов, 2008 14 с.

8. ГОСТ 9957-73 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины и говядины. Методы определения содержания хлористого натрия / ИПК Издательство стандартов, 2001 4 с.

9. ГОСТ 23042-86 Мясо и мясные продукты. Методы определения жира / Изд. Стандартинформ, 2003. 5 с.

10. ГОСТ Р 51479-99 Мясо и мясные продукты. Метод определения массовой доли влаги / Изд. Стандартинформ, 2006. 6 с.

11. ГОСТ Р 53642-2009 Мясо и мясные продукты. Метод определения массовой доли общей золы / Изд. Стандартинформ, 2010. 12 с.

12. ГОСТ 8558.1-78 Продукты мясные. Методы определения нитрита / ИПК Изд. Стандартов, 2003. 11 с.

13. ГОСТ 9959-91 Продукты мясные. Общие условия проведения органолептической оценки / Изд. Стандартинформ, 2006. 11 с.

14. ГОСТ 52349-2005. Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения. Введ. 01.07.2006. - М.: Стандартинформ, 2006. - 8 с.

15. ГОСТ Р 51705.1 2001 Системы качества. Управление качеством пищевых продуктов на основе принципов ХАССП. Общие требования. Введен 01.07.2001. - М.: Госстандарт России. Издательство стандартов, 2001. - 12 с.

16. ГОСТ Р ИСО 22000 2007 Системы менеджмента безопасности пищевой продукции. Требования к организациям, участвующим в цепи создания пищевой продукции. Введен 01.01.2008. - М.: Стандартинформ, 2007.-36 с.

17. Доронин А.Ф. Функциональное питание / А.Ф. Доронин, Б.А. Шендеров // М.: Изд-во «ГрантЪ», 2002. 295 с.

18. Дубровская В.И. Разработка технологии сыровяленых колбас их мяса птицы с использованием стартовой бактериальной культуры. Автореферат / В.И. Дубровская // М.: ВНИИМП имени В.М. Горбатова, 2006. 27 с.

19. Ершов Д.В. Разработка технологии синбиотического лиофилизованного бактериального препарата для производства мясных продуктов. Автореферат / Д.В. Ершов // М.: МГУПБ, 2004. 26 с.

20. Журавская Н.К. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов / Н.К. Журавская, JI.T. Алехина, JI.M. Отряшенкова // М.: Агропромиздат, 1985. 296 с.

21. Ивашов В.И. Оборудование для переработки мяса / В.И. Ивашов // Спб.: ГИОРД, 2007. 464 с.

22. Инструкция к набору реагентов «AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit» компании «Axygen Scientific, Inc.», 2011. Ver.: 1. - 7 с.

23. Клива де В. Блекберн (ред.) Микробиологическая порча пищевых продуктов / Спб.: Профессия, 2008. 784 с.

24. Корнелаева Р.П. Санитарная микробиология сырья и продуктов животного происхождения / Р.П. Корнелаева, П.П. Степаненко, Е.В. Павлова // М.: Полиграфсервис, 2006. - 407 с.

25. Костенко Ю.Г. Новые виды сырокопченых изделий / Ю.Г. Костенко, Д.А. Текутьева, А.И. Жаринов, Н.А.Соколова // М.: Мясная индустрия, 2000. -№2.-С. 25-26.

26. Красуля Q.H. Реализация системы ХАССП в технологии производства вкусо-ароматических добавок / О.Н. Красуля, Ю.С. Малофеева // М.: Мясная индустрия, 2006. № 3 - С. 32 - 35.

27. Кудряшов JI.C. Стандартизация, метрология, сертификация в пищевой промышленности. Учеб. / JI.C. Кудряшов, Г.В. Гуринович, Т.В. Рензяева // М.: ДеЛи принт, 2002. 302 с.

28. Лаптев И.А. Разработка бактериального препарата на основе штамма-продуцента нитритредуктазы для снижения остаточного нитрита натрия в мясных продуктах. Автореферат / И.А. Лаптев // М.: МГУПБ, 2008. 24 с.

29. Лысак В.В. Микробиология. Методические рекомендации к лабораторным занятиям, контроль самостоятельной работы студентов /В.В. Лысак, Р. А. Желдакова. // Минск: БГУ, 2002. 98 с.

30. Машенцева Н.Г. Теоретическое обоснование совершенствования промышленно-ценных свойств стартовых культур и их практическое применение в технологии мясных продуктов. Автореферат / Н.Г. Машенцева //М.: МГУПБ, 2008.-52 с.

31. Машенцева Н.Г. Функциональные стартовые культуры в мясной промышленности / Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский // М.: ДеЛи принт, 2008.-336 с.

32. Методические рекомендации MP 2.3.1.1915-04 «Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ». М.: Изд. ГОУ «Оренбург. Гос. Университет», 2004. - 36 с.

33. Минаев М.Ю. Методы ПЦР для определения сырьевых компонентов в готовой продукции / М.Ю. Минаев, Б.А. Лисицын, Т.А. Фомина // М.: Мясная индустрия, 2008. С. 36-37.

34. Петухов В.А. Нарушения функций печени и дисбиоз при липидном дистресс-синдроме Савельева: современный взгляд на проблему / В.А. Петухов, Л. А. Стернина, А.Е. Травкин // «Consilium Medicum», 2004. Том 6. -№ 6.

35. Рогов И.А. Технология мяса и мясных продуктов. Книга 1 / И.А. Рогов, А.Г. Забашта, Г.П. Казюлин // М.: КолосС, 2009. 565 с.

36. Рогов И.А. Технология мяса и мясных продуктов. Книга 2 / И.А. Рогов, А.Г. Забашта, Г.П. Казюлин // М.: КолосС, 2009. 711 с.

37. Руководство по эксплуатации для автоматического анализатора активности воды /М.: ООО «Стайлаб», 2003. 37 с.

38. Руководство Р 4.1.1672-03 Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище / Минздрав России, 2003.-239 с.

39. СанПиН 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов: Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - 2-е изд., исп - 143 с.

40. Семёнышева А.И. Разработка технологии рубленых полуфабрикатов из мяса птицы с использованием стартовых культур с антиоксидантными свойствами. Автореферат / А.И. Семёнышева // М.: МГУПБ, 2010. 26 с.

41. Соколов Д.М. Экспресс-тесты Singlepath для анализа патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах и сырье / Д.М. Соколов, И.В. Кашинцев, М.С. Соколов // М.: Мясная индустрия, 2010. № 12. - С. 50-53.

42. Степаненко И.Ю. Современные тест-системы для микробиологического контроля мясных продуктов / И.Ю. Степаненко // М.: Мясные технологии, 2006. № 10. - С. 58-59.

43. Текутьева Л.А. Разработка технологии сырокопчёных мясопродуктов на основе комплексного использования стартовых культур и дальневосточных бальзамов. Автореферат / Л.А. Текутьева // М.: ВНИИМП имени В.М. Горбатова, 2003. 22 с.

44. Фатьянов Е.В. Производство сырокопченых и сыровяленых колбас / Е.В. Фатьянов, Ч.К. Авылов. //М.: Эдиториал сервис, 2008. 168 с.

45. Хамидов Р.Н. Внедрение международной системы ХАССП на Ульяновском мясокомбинате / Р.Н. Хамидов, Ч.К. Авылов, Г.Н. Зеленов // М.: Мясная индустрия, 2006. № 3. - С. 26-30.

46. Чернуха И.М. ХАССП на предприятиях мясной промышленности России / И.М. Чернуха / ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии. М.: Мясные технологии, 2007. - № 4. - С. 48-50.

47. Шепелева Е.В. Пример разработки плана ХАССП для производства кефира / Е.В. Шепелева, А.П. Тетерук, Е.В. Митасева, И.С. Райдна // М.: Молочная промышленность, 2006. -№ 12. С. 15-22.

48. Amor K.B. Advanced molecular tools for the identification of lactic acid bacteria / K.B. Amor, E.E. Vaughan, W.M. de Vos // J. Nutr., 2007. Vol. 137. -P. 741-747.

49. Atamantchuk A.A. Risk factors of arterial hypertension in vibration disease patients in Moscow region / A.A. Atamantchuk, P.N. Liubtchenko, E.B. Shirokova // Med Tr Prom Ekol., 2011. № 8. - P. 21-26.

50. Bae J.M. Low cholesterol is associated with mortality from cardiovascular diseases: a dynamic cohort study in Korean adults / J.M. Bae, Y.J. Yang, Z.M. Li, Y.O. Ahn // J Korean Med Sei., 2012. Vol. 27(1) - P. 58-63.

51. Barriere C. Characterization of catalase and superoxide dismutase in Staphylococcus camosus 833 strain / C. Barriere, S. Leroy-Setrin, R. Talon // J Appl Microbiol., 2001. Vol. 91(3). - P. 514-519.

52. Barriere C. Characterization of the single superoxide dismutase of Staphylococcus xylosus / C. Barriere, R. Brückner, R. Talon // Appl Environ Microbiol., 2001. Vol. 67(9) - P. 4096^104.

53. Barter P. HDL-C: Role as a risk modifier / P. Barter // Atheroscler Suppl., 2011.-Vol. 12(3).-P. 267-270.

54. Blaiotta G. Identification and differentiation o {Staphylococcus camosus and Staphylococcus simulans by species-specific PCR assays of sod A genes / G. Blaiotta, A. Casaburi, F. Villani // Syst Appl Microbiol., 2005. Vol. 28(6). - P. 519-526.

55. Brashears M.M. Bile salt deconjugation and cholesterol removal from media by Lactobacillus casei / M.M. Brashears, S.E. Gilliland, L.M. Buck // Journal of Dairy Science, 1998. Vol. 81. - № 8. - P. 2103-2110.

56. Bulelzai M.A. Long time evolution of atherosclerotic plaques / M.A. Bulelzai, J.L. Dubbeldam // J Theor Biol., 2011. Vol. 297. - P. 1-10.

57. Casaburi A. Technological activities of Staphylococcus camosus and Staphylococcus simulans strains isolated from fermented sausages / A. Casaburi, G. Blaiotta, G. Mauriello, O. Pepe, F. Villani // Meat Sci., 2005. Vol. 71(4). - P. 643-650.

58. Cheng C.Y. Rapid quantification of Salmonella typhimurium inoculated to meat products by real-time PCR / C.Y. Cheng, J.R. Chi, S.R. Lin, C.C. Chou, C.C. Huang // Acta Vet Hung., 2009. Vol. 57(1). - P. 25-38.

59. Corbiere Morot-Bizot S. Monitoring of staphylococcal starters in two French processing plants manufacturing dry fermented sausages / S. Corbiere Morot-Bizot, S. Leroy, R. Talon // J Appl Microbiol., 2007. Vol. 102(1). - P. 238-244.

60. Dicks L.M. Use of bacteriocin-producing starter cultures of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus curvatus in production of ostrich meat salami / L.M. Dicks, F.D. Mellett, L.C. Hoffman // Meat Sci., 2004. Vol. 66(3). - P. 703-708.

61. Dilmi-Bouras A. Assimilation (in vitro) cholesterol by yogurt bacteria / A. Dilmi-Bouras // Ann Agric Environ Med, 2006. Vol. 13. - P. 49-53.

62. Farmer M. What about HDL-cholesterol? / M. Farnier // Rev Prat., 2011. -Vol. 61(8).-P. 1117-1120.

63. Fitzmaurice J. Detection of verotoxin genes VT 1 and VT 2 in Escherichia coli 0157:H7 in minced beef using immunocapture and real-time PCR / J. Fitzmaurice // Methods Mol Biol., 2006. Vol. 345. - P. 91-96.

64. Fujikawa H. Estimation of viable Salmonella cell numbers in meat and meat product using real-time PCR / H. Fujikawa, Y. Shimojima // Shokuhin Eiseigaku Zasshi., 2008. Vol. 49(4). - P. 261-265.

65. Giammarinaro P. Development of a new oligonucleotide array to identify Staphylococcal strains at species level / P. Giammarinaro, S. Leroy, J.P. Chacornac, J. Delmas, R. Talon //Journal of Clinical Microbiology, 2005. Vol. 43.-№8.-P. 3673-3680.

66. Gilliland S.E. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus / S.E. Gilliland, C.R. Nelson, C. Maxwell // Applied and Environmental Microbiology, 1985. Vol. 49. - № 2. - P. 377-381.

67. Giraffa G. Genotypic and phenotypic heterogeneity of Streptococcus thermophilic strains isolated from dairy products / G. Giraffa, A. Paris, L. Valcavi et al. // J. Appl. Microbiol, 2001. Vol. 91. - P. 937 -943.

68. Giraffa G. Monitoring of the bacterial composition of dairy starter cultures by RAPD-PCR / G. Giraffa, L. Rossetti // FEMS Microbiol. Lett, 2004. Vol. 237. - № 1. - P. 133-138.

69. Hornsey H.C. The colour of cooked cured pork. I. Estimation of the nitric oxide-haem pigments / H.C. Hornsey // J. Sci. Food Agric. 1956. - № 7 -P. 534-540.

70. ISO 22000:2005 Food safety management systems. Requirements for any organization in the food chain / International Organization for Standardization, 2005.-32 p.

71. Jain S. Antioxidant and cholesterol assimilation activities of selected lactobacilli and lactococci cultures / S. Jain, H. Yadav, P.R. Sinha // J Dairy Res., 2009. Vol. 76(4). - P. 385-391.

72. Jang J. A rapid method for identification of typical Leuconostoc species by 16S rDNA PCR-RFLP analysis / J. Jang, B. Kim, J. Lee, H. Han // J. Microbiol. Methods, 2003. Vol. 55. - P. 295-302.

73. Juskiewicz M. Reduction of cholesterol content in milk with dairy thermophilic cultures application / M. Juskiewicz, H. Panfil-Kuncewicz // Milchwissenschaft, 2003. Vol. 58 - P. 370-373.

74. Kawasaki S. Evaluation of a multiplex PCR system for simultaneous detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, and Escherichia coli 0157:H7 in foods and in food subjected to freezing. / S. Kawasaki, P.M.

75. Fratamico, N. Horikoshi, Y. Okada, K. Takeshita, T. Sameshima, S. Kawamoto // Foodborne Pathog Dis., 2009. Vol. 6(1). - P.81-89.

76. Klein G. Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria / G. Klein, A. Pack, C. Bonaparte, G. Reuter // Int. J. Food Microbiol, 1988. Vol. 41. -P. 103-125.

77. Leroy F. Functional meat starter cultures for improved sausage fennentation / F. Leroy, J. Verluyten, L.D. Vuyst II International Journal of Food Microbiology, 2006.-Vol. 106(3).-P. 270-285.

78. Lin M.Y. Reduction of cholesterol by Lactobacillus acidophilus in culture broth / M.Y. Lin, T.W. Chen // Journal of Food and Drug Analysis, 2000. Vol. 8(2).-P. 97-102.

79. Malorny B. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food / B. Malorny, E. Paccassoni, P. Fach, C. Bunge, A. Martin, R. Helmuth // Appl Environ Microbiol, 2004. Vol. 70(12). - P. 7046-7052.

80. Martin B. Rapid quantitative detection of Lactobacillus sakei in meat and fermented sausages by real-time PCR / B. Martin, A. Jofre, M. Garriga, M. Pla, T. Aymerich // Appl Environ Microbiol., 2006. Vol. 72(9). - P. 6040-6048.

81. Pereira D.I.A. Cholesterol asimilation by lactic acid bacteria and bifidobacteria isolated from the human gut / D.I.A. Pereira, G.R. Gibson // Appl Environ Microbiol., 2002. Vol. 68(9). - P. 4689-4693.

82. Pinto M.F. Charqui meats as fermented meat products: role of bacteria for some sensorial properties development / M.F. Pinto, E.H. Ponsano, B.D. Franco, M. Shimokomaki//Meat Sci., 2002. Vol. 61(2).-P. 187-191.

83. Rasic J.L. Assimilation of cholesterol by some culture of lactic acid bacteria and bifidobacteria / Rasic J.L., Vujicic I.F., Skringer M., Vulic M. // 1992. -Biotechnol. Lett., 1992. Vol. 14. - P. 39-44.

84. Roberfroid M.B. Global view on functional foods: European perspectives / M.B. Roberfroid // British J. Nutrition, 2002. Vol.88. - Suppl.2. - P. 133-138.

85. Rodriguez-Lazaro D. Rapid quantitative detection of Listeria monocytogenes in meat products by real-time PCR / D. Rodriguez-Lazaro, A. Jofre, T. Aymerich, M. I-Iugas, M. Pla // Appl Environ Microbiol., 2004. Vol. 70(10). - P. 62996301.

86. Rossetti L. Rapid identification of dairy lactic acid bacteria by M13-generated, RAPD-PCR fingerprint databases / L. Rossetti, G. Giraffa // J. Microbiol. Methods, 2005. Vol. 63. - № 2. - P. 135-144.

87. Schaafsma G. The Functional Drinks Prophecy / G. Schaafsma, R. Korstanje // World Food Ingredients, 2004. March. - P. 44^8.

88. Surak J.G. A Recipe for Safe Food: ISO 22000 and HACCP / G.J. Surak // Quality Progress, 2007. №2. - P. 21-27.

89. Tantillo M.G. Bacteriocin-producing Lactobacillus sakei as starter culture in dry sausages / M.G. Tantillo, P.A. Di, L. Novello // New Microbiol., 2002. Vol. 25(1).-P. 45-49.

90. Techathuvanan C. Real-time reverse transcriptase PCR for the rapid and sensitive detection of Salmonella typhimurium from pork / C. Techathuvanan, F.A. Draughon, D.H. D'Souza, F.A. Draughon, D.H. D'Souza // J Food Prot., 2010. -Vol. 73(3).-P. 507-514.

91. Toldra F. Meat biotechnology / F. Toldra // Springer, 2008. P. 499.

92. Walker D.R. Relationship among bile tolerance, bile salt deconjugation, and assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus / D.R. Walker, S.E. Gilliland //J. Dairy Sei., 1993.-Vol. 76.-P. 956-961.

93. Wang L. Detection of viable Escherichia coli 0157:H7 by ethidium monoazide real-time PCR / L. Wang, Y. Li, A. Mustapha // J Appl Microbiol., 2009.-Vol. 107(5).-P. 1719-1728.

94. Wang L. Rapid and simultaneous quantitation of Escherichia coli 0157:H7, Salmonella, and Shigella in ground beef by multiplex real-time PCR and immunomagnetic separation / L. Wang, Y. Li, A. Mustapha // J Food Prot., 2007. -Vol. 70(6).-P. 1366-1372.

95. Xu X. Study on a dulplex specific detection of Salmonella spp. in foods by a dulplex PCR / X. Xu, Q. Wu, J. Zhang, Y. Zhou // Wei Sheng Yan Jiu, 2008. -Vol. 37(4). P. 483-486.

96. Ziarno M. Cholesterol assimilation by commercial yoghurt starter cultures / M. Ziarno, E. Sekul, A. Lafraya Aguado // Acta Scientiarum Polonorum, Technologia Alimentaria, 2007. Vol. 6(1). - P. 83-94.

97. Zlatkis A. A new method for the direct determination of serum cholesterol / A. Zlatkis, B. Zak, A J. Boyle // J. Lab. Clin. Med., 1953. Vol. 41. - P. 486^92. Интернет-ресурсы

98. Бактериологические исследования:http://www.quality.spb.ru/index.php?PAGECODE=TSL&pageid==71

99. Буланов Ю.Б. Холестерин: http://clubmir.narod.ru/shatalin/holesterin.html

100. Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г. Рюмин Д.В. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR): http://www.pcr.ru/bibliogr/articles/article18.htm

101. Ефимов А. М. Применение молекулярных методов в зооиндустрии: ПЦР-технология: http://www.vettorg.net/magazines/3/2004/96/600/

102. Количественное определение возбудителей методом ПЦР: http://diagnostica.su/real-time.php

103. Компания «ХайМедиаЛабс»: http://www.himedialabs.ru/

104. МУК 4.2.1111-02 Использование метода измерения электрического сопротивления (импеданса) для санитарно-микробиологического исследования питьевой воды 26.02.2002: http://www.skonline.ru/digest/40559.html

105. О системе ХАССП: http://www.pompred.ru/haccp.php

106. Отраслевая Система добровольной сертификации ХАССП-МЯСО: http://www.klubok.net/article 1519.html

107. Официальный интернет-портал Министерства сельского хозяйства РФ: http://www.mcx.ru/documents/document/show/16834.342.htm

108. Сердечно-сосудистые заболевания. Медицинский портал: http://www.med39.ru/article/kardiology/holest.html

109. Система добровольной сертификации ХАССП-МЯСО: http://www.vniimp.ru/index.php/services-and-products/certification/haccp

110. Системы менеджмента безопасности НАССР. Историческая справка: http://www.ex-c.ru/sertifikacija-sistem-menedzhmenta-organizacij/nassr

111. Словарь терминов по молекулярной диагностике: http://www.interlabservice.ru/catalog/faq/?id=3309

112. Стартовые культуры для мясной промышленности: http://iks-media.com.ua/content/blogcategory/13/57/lang,russian/

113. Холестерин: http://www.xumuk.ru/biologhim/078.html

114. Шендеров Б.А. Состояние и перспективы развития концепции «Функциональное питание в России»: общие и избранные разделы проблемы: http://www.gastroportal.ru/php/content.php?id=l 11371

115. Basic Local Alignment Search Tool: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGETYPE-BlastHome

116. CODEX ALIMENTARIUS. International Food Standards: http://www.codexalimentarius.org/

117. НАССР основа государственного контроля безопасности и качества пищевой промышленности: http://www.ya-fermer.ru/news/o-provedenii-seminara-%C2%ABnassr-%E2%80%93-osnova-gosudarstvennogo-kontrolya-bezopasnosti-i-kachestva-pishc

118. Real-time PCR: http://molbiol.rU/protocol/l 20701 .html

119. The National Center for Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/

120. Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов1. ФГУПГосНИИГенетика

121. Россия, Мо«»9,117545,1-ый Дорокный проезд, 1, ФГУПГосНИИГенетика ВКПМ, Ш <095)3151210: фаю: (0S5) 3151210, Эп. почта- vkpm@genetika ги;16 .06.061. СПРАВКА

122. Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов

123. ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенеггика приняла на национальное патентное депонирование 10 ноября 2004г.культуру Lactobacillus curvatus LCR-1

124. Продукт, синтезируемый штаммом: молочная кислота

125. Область применения: антагонист бактерий группы кишечных палочек,сальмонеллы, протея.

126. Депозитор: Московский Государственный Университет прикладной биотехнологии (МГУПБ)

127. КОЛЛЕКЦИОННЫЙ НОМЕР ВКПМ В-88898889

128. Всероссийская Коллекция | Промышленных Микроорганизмов1 ФГУПГосНИИГенетика

129. И Россия, Москва, 117545,1-ый Дорожный проезд, 1, ФГУПГосНИИГенвша ВКПМ, Я (095)3151210,ф31С: (035)3151210,31 почта1 Укрт@депе№а ш,888820 .06.061. СПРАВКА

130. Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов

131. ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетика приняла на национальное патентное депонирование 10 ноября 2004г.культуру РесЗшсоссиз ретозасеиз РОР-28

132. Область применения штамма: обладает антагонистической активностью по отношению к бактериям группы кишечных палочек, сальмонелле, протею. Синтезирует бактериоцины.

133. Депозитор: Московский Государственный Университет прикладной биотехнологии (МГУПБ)1. Л 4

134. КОЛЛЕКЦИОННЫЙ НОМЕР ВКПМ В-8888шшшшут» шш tm шш S- ЦЯР** "HP- " 9RP ЩШ"'

135. Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов1. ФГУПГосНИИГенетика

136. В Россия, Моспа, 117545,1-ый Дорожный проезд, 1, ФГУПГосНИИГенетика ВКПМ; Ж (095) 3151210; фа с: (095) 3151210; Эл. no4ta;vkpm@genetika ш;895316 .06.061. СПРАВКА

137. Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов

138. ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенегшка приняла на национальное патентное депонирование 10 декабря 2004г.культуру Staphylococcus carnosus SPHC-108

139. Область применения ;антагонист бактерий группы кишечных палочек, сальмонеллы, протея. Денитрифицирующий, ароматообразуюший.

140. Депозитор: Московский Государственный Университет прикладной биотехнологии (МГУПБ)

141. КОЛЛЕКЦИОННЫЙ НОМЕР ВКПМ В-8953

142. ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

143. САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

144. ДЬ 77.9Э.37.922.Т.000245.02.08 от 11.02 2008 г.

145. Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет прикладной биотехнологии", г Москва, ул Талалихина, 33, Российская Федерация

146. СООТВЕТСТВУЮТ {УВ.1ГП6ЯПГТГТтППТ) государственным санитарноэпидемиологическим правилам и нормативам (ненужное зачеркнуть, указать полное наименование санитарных правил)

147. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов"

148. Руководитель (заместитель руководителя) Федеральной службы по надзору в сфере лашн гы прав потребителей и благополучия человека

149. Формат А4, Бланк. Срок хранения 5 лет.009579

150. ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

151. САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕЗАКЛЮЧЕНИЕ

152. О 77.99.37.922.Т.000192.02 08 от 05.02.2008 г.

153. Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет прикладной биотехнологии", г.Москва, ул.Талалихина, 33, Российская Федерация

154. СООТВЕТСТВУЮТ государственным санитарноэпидемиологическим правилам и нормативам (ненужное зачеркнуть, указать полное наименование санитарных правил)

155. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов"

156. Руководитель (заместитель руководителя) Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей н благополучия человека

157. Формат А4. Бланк. Срок хранения 5 пот.1. Л; 009523- , и ' * - * ,р х , ^ ъ«^ * ' • . *. х -" ■ ■■ »31. Й*»!«»**" г*1. Р О'С СТ'Й С1КА.Я Д Ж^мим