автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Обоснование рекомендаций по переработке глубоководных рыб в зависимости от свойств структурных белков и активности трансглутаминазы

/

J- j Г На правах рукописи

к

I*

¿J

КАРАУЛ ОВД ЕКАТЕРИНА ПАВЛОВНА

ОБОСНОВАНИЕ РЕКОМЕНДАЦИЙ ПО ПЕРЕРАБОТКЕ ГЛУБОКОВОДНЫХ РЫБ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СВОЙСТВ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ И АКТИВНОСТИ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЫ

Специальность 05 18 07 - биотехнология пищевых продуктов (биотехнология гидробионтов) 03 00 04 - биохимия (технические пауки)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических паук

Владивосток - 2007

003071187

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» (ФГУП «ТИНРО-Центр»)

Научный руководитель

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Якуш Евгений Валентинович

Официальные оппоненты доктор технических наук,

профессор Жаринов Александр Иванович доктор биологических наук, профессор Эпштейн Леонид Мендельевич

Ведущая организация АтлантНИРО, г Калининград

Защита - ,ссертации состоится «25» мая 2007 г в 10 ч на заседании диссертационного совета Д 307 012 01 при ФГУП «ТИНРО-Центр» по адресу 690950, г Владивосток, ГСП, пер Шевченко, 4 Факс (4232) 300751

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ТИНРО-Центр» Автореферат разослан «23» апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

О С Темных

ОБЩАЯ ХАРАК1ЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы В связи с сокращением объема вылова традиционных морских гидробионтов акт} альной становится проблема использования нетрадиционного сырья для производства пищевои продукции

Среди видов, широко распространенных на дальневосточном бассейне и недостаточно используемых, следует отметить глубоководных рыб, основные промысловые скопления которых образованы макрурусами (Albatrossia pectoralis, Cory-phaenoides cinerens, Coryphaenoides rupestus, Coryphaenoides acrolepis), ликодами (Lycodes raridens, Lycodes soldatoxi), лемонемой (Laemonema longipes) Ориентировочные запасы макруруса малоглазого позволяют вылавливать до 70 тыс т рыбы в год (Тупоногов, 1986), лемонемы -до 40 тыс т ежегодно (Савин, 1998)

В научной литературе имеются сообщения о биологии некоторых глубоководных рыб (Drazen, 2001), биохимических характеристиках мышечного а-актина (Coryphaenoides armatus, Cotyphaenoides yaqumae) (Monta, 2003), кинетике тепловой коагуляции мышечных белков (Lvcogramma zesta) (Taguchr, 1981), технохимической характеристике (Мельникова 1976) Известны данные, свидетельствующие о высокой обводненности ткани этих рыб, что наряду с низким содержанием белка и плохой во-досвязывающен способностью ограничивает производство пищевой продукции из них (Швидкая 1980, Одинцов, 2002) Анализ рез>льтатов опубликованных работ не позволяет обосновать и разработать рекомендации по использованию лемонемы и макрурусов для производства пищевой продукции, поскольку отсутствуют систематические данные но составу и свойствам структурообразующих белков и активности тканевых ферментов

Одним из перспективных путей использования глубоководных рыб является производство белковых продуктов с заданными реологическими свойствами, для чего необходимы специальные исследования структурообразующих свойств белков Определение основных физико-химических факторов, влияющих на структурирование мышечных белков, может явиться основой для разработки и создания новых пищевых продуктов из глубоководных рыб с применением специальных приемов биотехнологии

В последнее время в производстве эластичных структурированных пищевых продуктов используются трансглутаминазы (ТГ) (Niwa, 1992) В результате действия

мышечных ТГ образуются полимеры миозина тяжелых цепей (МТЦ), что связывают с формированием у систем мышечных белков прочных и эластичных свойств (Novvsad et al , 1993) Испочьзование ТГ может стать перспективным и при получении структурированных пищевых продуктов из глубоководных рыб

ТГ обнаружена в мышцах гидробионтов, ее активность существенно зависит от вида рыб (Araki, Seki, 1993, Novvsad et al, 1995) Что же касается глубоководных рыб, то сведений об активности ТГ в их мышцах на момент проведения исследований нами не обнаружено

Таким образом, исследование физико-химических и биохимических свойств структурообразующих белков глубоководных рыб представляется актуальным При этом важным для разработки научных рекомендаций по созданию пищевых продуктов на основе измечьченной мышечной ткани глубоководных рыб явтяется исследование влияния трансглутаминаз на структуру получаемых белковых систем

Цель исследования: научно обосновать технологические рекомендации но переработке глубоководных рыб в зависимости от свойств структурных белков и актив-нос ги трансглутаминазы

Задачи исследования

- изучить состав и физико-химические свойства миофибриллярных белков глубоководных рыб и установить их потенциальную способность к структурообразова-нию,

- определить влияние вечичины активности тканевой (эндогенной) трансглутаминазы на состав основных структурных белков, в том числе тяжелых цепей миозина,

- установить зависимость реологических характеристик измельченной мышечной ткани глубоководных рыб от величины активности внесенной (экзогенной) трансглутаминазы,

- обосновать рациональные величины активности трансглутаминазы и оптимальное количество белка для получения структурированных белковых систем на основе мышечной ткани глубоководных рыб,

- разработать рекомендации для получения пищевои продукции (формованных изделий) на основе измельченной мышечной ткани глубоководных рыб

Научная новизна Впервые из мышечной ткани исследуемых глубоководных рыб выделены основные структурные миофибриллярные белки миозин, актин, акто-

миозин, тропонин и тропомиозин, определены ич молекулярные массы Исследованы основные свойства бетков миофибрилл соотношение миозин/актин, АТФ-активность, вязкость, параметры суперпреципитации и кинетика агрегации актомиозинов На основании рассмотренных свойств мышечных бе п ко в установлено, что белые мышцы глубоководных рыб обладают смешанными фазными и тоническими, свойствами

Установлено, что чем ниже содержание белка в мышцах исследуемых глубоководных рыб, тем выше доля минорных миофибриллярныч белков и ниже соотношение основных структурных белков мышц - миозин/актин Выявлено, что мышцы глубоководных рыб обладают высокой активностью трансглутаминаз, которая значительно выше этого показателя для мышц пелагических рыб Установлено, что уменьшение содержания белка в мышцах глубоководных рыб сопровождается увеличением активности трансглутаминазы Указанная зависимость имеет экспоненциальный характер

Обнаружено, что с увеличением активности трансглутаминаз мышц исследуемых глубоководных рыб возрастает относительная доля почимера тяжелых цепей миозина - белка с молекулярной массой (ММ) 480 кДа Установлено, что в миофиб-риллах мышц глубоководных рыб, в отличие от пелагических, возможна деполимеризация миозина под действием собственной тканевой трансглутаминазы Сделано заключение, что при этом структурно-механические показатели белковых систем имеют тенденцию к снижению Обоснована оптимальная величина ТГ-активности для получения структурированных белковых систем на основе мышечной ткани глубоководных рыб

Практическая значимость работы Разработаны способы выделения миозина, актина, актомиозина, компонентов тропонинового и тропомиозинового комплексов из мышц малоглазого макруруса лемонемы и пепельного макруруса, позволяющие получать белки с минимальным количеством примесей и с сохранением функциональности

Установлено, что для получения структурированных белковых систем заданной прочности и эластичности необходимо, чтобы содержание полимеризованного миозина с ММ 480 кДа составляло не менее 65 % от общего количества миозинов тяжелых цепей Разработаны биотехнологические приемы, позволяющие увеличивать в получаемой белковой системе долю миозина с ММ 480 кДа Определено необходи-

мое и достаточное количество белка для достижения оптимального количества миозина с ММ 480 кДа, позволяющее получать прочные и эластичные структуры на основе измельченной мышечной ткани малоглазого макруруса, лемонемы и пепельного макруруса

Разработаны рекомендации для поучения структурированных белковых продуктов па основе измельченной мышечной ткани глубоководных рыб макруруса малоглазого, макруруса пепельного и лемонемы Обоснованы рациональные количества вносимого белка (казеин или изолят соевого белка), необходимые для получения прочных и эластичных белковых систем заданной структуры Разработан проект технической документации на производство пищевых продуктов на основе измельченной мышечной ткани малоглазого макруруса, лемонемы и пепельного макруруса

Положения, выносимые на защиту

] Установленное для глубоководных рыб соотношение миозин/актин в акто-миозине влияет на структурообразующие свойства белковых систем на основе измельченной мышечной ткани исследуемых объектов

2 Для глубоководных рыб состав тяжелых цепей миозина и и\ способность к полимеризации и деполимеризации зависят от активности тканевой трансглутамина-зы

3 Внесение дополнительного белка — субстрата трансглутаминазы — позволяет рационально использовать высокую активность трансглутаминаз мышц глубоководных рыб при получении прочных белковых структур на основе мышечной ткани этих объектов

Апробация работы. Основные положения работы были дотожены и обсуждены на V региональной конференции по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии в ДВГУ (Владивосток, 2002), Всероссийской конференции молодых ученых «Комплексные исследования и переработка морских и пресноводных гид-робионтов» в ТИНРО-Центре (Владивосток 2003), II международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» в МГУ (Москва, 2004), Всероссийской конференции молодых ученых "Актуальные проблемы изучения и использования водных биоресурсов" (Владивосток, 2004), научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология проблемы и перспективы» (Калининград, 2006), ученых советах ФГУП «ТИНРО-Центр» в 2002-2003 гг

Публикации По теме диссертации опубликовано 9 работ

Структура и объем работы. Диссертация изтожена на 130 стр, состоит из введения, трех глав, выводов, списка цитированной литературы, включающего 208 источников, содержит 11 таблиц, 22 рисунка и 2 приложения

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение Обоснована актуальность работы, сформулированы цель и задачи исследоваштя, показаны научная новизна и практическая ценность изучения основных биохимических характеристик белков скелетных мышц рыб с повышенным содержанием воды

Глава 1 Обзор литературы Обобщены научные данные отечественных и зарубежных авторов, характеризующие особенности биологии глубоководных рыб, а также особенности состава и свойств белков скелетных мышц глубоководных рыб Рассмотрены основные функции, свойства и методы выделения мышечных структурных белков Обобщены данные, касающиеся исследований ферментов — трансглута-миназ — и и\ использования в пищевой промышленности

Глава 2. Материалы п методы. В качестве объектов исследования использовали белые быстрые мышцы глубоководных рыб - макруруса малоглазого (Albatrossia pectoralis), макруруса пепельного (Coryphaertoides cinerens) и лемонемы (Laemonema longipes) Материалы для настоящей работы собраны в 2001-2002 гг в экспедициях на судах БАТМ «Николай Чепин» и НИС «ТИНРО» Траления лемонемы проводились у о Сахалин между 54 и 55° с ш и 145 и 148° в д в слое 400-800 м Траления пепельного и малоглазого макрурусов проводились у о Хонсю между 45 и 47° с ш и 152° в д в слое 1300-1600 м

Также в качестве сравнения использовали белые быстрые мышцы пелагических и донных рыб минтай тихоокеанский (Theragra chalcogramma), малоротая корюшка (Hypomesus japomcus), южный одноперый терпуг (Plenrogrammus monopterygnis), бе-локорый палтус (Hippogtossm luppoglossus), \амбала желтоперая (Limanda aspera)

Содержатгае общего азота определяли на анализаторе "Kieltec Auto 1030 Analyser" (Tecator) Экстракцию миофибрилтярных белков проводили по методу Като (Kato, 1977) Кочичество воды определяли на инфракрасном влагомере Kett F-1A (Kett Electric Laboratory, Япония) Реологические показатели (Николаев, 1964) определяли на приборах Rheolograph Sol-535 (Toyo Seki, Япония) Предельное напряжение

сдвига (Па) определяли на полуавтоматическом пенетрометре конструкции В Д Косого Расчет показателей проводился по формуле Ребиндера для конических пенетрометров (Измайлова, Ребиндер, 1974)

Качественный и количественный состав белков глубоководных рыб исследовали методом диск-ДСН-электрофореза на оборудовании фирмы Pharmacia Biotech AB (Швеция) в полиакриламидном геле (ПААГ) В качестве концентрирующего геля использовали 3,5 %-ный ПААГ Концентрирование вели при силе тока 15 мА и напряжении 210-220 В Для разделения использовали ПААГ 7,5, 10,0 и 15,0 % Кроме этого, использовали градиентные 7,5-15,0 %-ные ПААГ Разделение вели при силе тока 5 мА и напряжении 100-110 В в течение 6-8 ч Молекулярную массу (ММ) определяли сравнивая относительные подвижности компонентов образца и стандартных белков (ICN Biochemicals Inc ) Белки окрашивали кумасси голубым по стандартной методике Количественные соотношения белков определяли по денситограммам окрашен ных пластинок электрофореграмм на денситометре UV-260 (LKB, Sweden)

Актомиозин выделяли используя метод Эбаши (Ebashi, 1962) в некоторой модификации Миозины выделяли по методу Брагманна и Дженни (Bruggmann, Jenny, 1975) с некоторыми изменениями Актин и актшшн получали методом К1-экстракции (Ishikawa, 1983) Для получения тропомиозина использовали схему Бейли (Bailey, 1948) в небольшой модификации Разделение тропомиозина и тропонина выполняли основываясь на более высокой термостабилыюсти тропомиозина по сравнению с тропонином (Cheng, Parrish, 1979)

Общую активность трансглутаминаз (ТГ) определяли по методу Секи (Takeda, Seki, 1996) При проведении реакции полимеризации белков использовали ТГ из печени морской свинки (тканевая ТГ, Sigma) и микробиальную ТГ (TG-Activa™, Ajmomoto, Япония) Тканевую ТГ растворяли в буфере, содержащем 0,5 М NaCl, 5 мМ СаС12 и 50 мМ трис-HCl, pH = 7,5, микробиальную - в буфере, содержащем 0,5 М NaCl, 50 мМ трис-HCI, pH = 7,5 Реакцию проводили в течение 1 ч при температуре 25 °С Для окончания реакции смесь нагревали до 93-95 "С на водяной бане Образовавшиеся осадки белковых агрегатов отделяли центрифугированием и использовали для анализа

Полученные данные обрабатывали с помощью пакета программы «Microsoft Excel» с определением стандартного отклонения (а) и доверительного интервата (р)

Глава 3 Результаты н обсуждение

Особенности химического состава скелетных мышц исследуемых видов глубоководных рыб. Сравнение основных химических характеристик мышц глубоководных и пелагических рыб показало, что объекты исследования (глубоководные рыбы) отличаются высоким содержанием воды и низким - белка и липидов Содержание воды максимально для малоглазого макруруса и превышает 90 % и минимально для пепельного макруруса (не более 85 %) Доля белков максимальна для пепельного макруруса и соответствует уровню, характерному для пелагических рыб (1618 %) Исследования показали безопасность глубоководных рыб по содержанию токсичных этементов

Состав бетков мышц глубоководных рыб. Фракционный состав белков мышц глубоководных рыб несколько отличается от состава белков пелагических и донных рыб Как видно на рис 1, мышцы малоглазого макруруса характеризуются более высокой долей миофибриллярных белков, несмотря на пониженное общее содержание белка Для пепельного макруруса и лемонемы этот показатель несколько ниже, чем для мышц пелагических и донных рыб

Стоит отметить что в отличие от пелагических и донных рыб доля миофибриллярных белков у глубоководных имеет тенденцию возрастать с увеличением количества воды мышц Практически одинаковые количества миофибриллярных белков традиционных видов объясняются близким химическим составом и сходными условиями обитания Фракционный состав белков мышц малоглазого макруруса существенно отличается, что связало с наиболее высокой обводненностью его мышц и является следствием усло-

Рис 1 Доля миофибриллярных белков и содержание воды в мышцах некоторых видов рыб 1 - терпуг одноперый, 2 -бельдюга восточная, 3 - палтус бепокорый 4 - камбала желтоперая, 5 - корюшка малорогая, 6 - минтай тихоокеанский

вий обитания Вероятно, эти оттичия найдут отражение в содержании и свойствах основных структурных миофибриллярных белков исследуемых глубоководных рыб

Состав и фишко-хнмические свойства основных миофибриллярных белков мышц глубоководных рыб в связи с их способностью к образованию структуры Для выделения основных миофибриллярных белков мышц пубоководных рыб — миозина, актина, актомиозина, белков тропонинового и тропомиозинового комплексов (рис 2) — был проведен подбор условий экстракции, что обеспечило извлечение отдельных компонентов миофибрилл, с сохранением биологической активности и с минимальным числом примесей Во всех экспериментах контроль чистоты полученных препаратов проводили с использованием диск-электрофореза в ПААГ (рис 2 — приведен общий состав миофибрилт мышц глубоководных рыб)

Рис 2 Деноггограммы электрофореграмм миофибритлярных бепков мышц глубоководных рыб а — макрурус пепельный, б — лемонема, в — макру-рус мглоглазый Градиентный ПААГ, 10-15 %, А -актин, ПЦ-1, ЛЦ-2 - легкие цепи миозина, М-миозин, Тм — тропомиозин, Тн-Т - тропонин-Т, Тн-С - тропо-нин-С Тн-1 - тропошш-1

Отнесение отдельных компонентов к определенному бечку проводили исходя из физико-химических свойств белков, известных из литературы параметров УФФ-спектров, АТФ-активности и чувствительности миозинов, взаи-модеиствия актина с мышечным мио¡ином, вязкости и суперпреципитации актомиозинов, молекулярных масс белков Выделение основных компонентов миофибриллярных белков позволите рассчитать количественный состав миофибрилл исследуемых видов глубоководных рыб и оценить общую долю минорных компонентов миофибрилл (рис 2, зона 1) Количественный состав основных миофибриллярных белков глубоководных рыб в сравнении с белками пелагических рыб представлен в табл 1

Таблица 1

Состав миофибрилл мышц рыб

Обьект Молекулярная масса и доля (%) белка в миофибриллах мышц

Миозин Актин Тропонин Тропомиозин

Мол масса су бъединиц, кДа Доля белка, % Мол масса, кДа Доля белка, % Мол масса субъединиц кДа Доля белка, % Мол масса субъединиц, кДа Доля белка, %

МТЦ Лц-1 1 Лц-2 Тн-Т Тн-1 Тн-С Тм-а Тм-()

Макрурус мало-пазый 210,0 28,5 16,8 60,6 47,0 21,3 37,3 20,5 20,1 6,2 33,0 34,0 4,8

Лемонема 210,0 20 0 17 5 59,8 47 0 21,7 39 0 20,4 17,7 62 34,2 36,6 46

Макрурус пепельный 210,0 26,2 16,5 56,8 47,0 21,9 38,0 21,0 18,5 5,4 34,3 36,0 4,7

Минтай тихоокеанский* 200,0 20,0 18,0 65,2 50,0 21,5 38,2 24,5 20,5 5,5 35,5 36,5 3,5

Сардина тихоокеанская* 220,0 22,0 18,0 60-70 50,0 25-35 40 0 25,0 20,0 3-5 36,0 37,1 2,5-3

Палтус белоко-рый* 210,0 25,0 20,0 60-70 52 0 25-30 40,0 25 0 20,0 3-5 35 0 40 0 2-3

Примечания МТЦ - тяжелые цепи миозина, ЛЦ-1, ЛЦ-2 - легкие лепи миозина, А - актин, Тм-а, Тм-Р - тропомиозин (а, р-субъединицы), Тн-Т - тропонин-Т Тп-С - тропонин-С, Тн-1 - тропонин-1 * Литературные данные (Shimomura, 1980, Kato, 1993, Ishizaki, 1995)

Из данных табл 1 видно, что миозины всех трех исследу емых объектов имеют сходный субъединичный состав и характеризуются близкими значениями молекулярных масс При этом выделенные нами из скелетных мышц исследуемых видов глубоководных рыб миозины имеют состав, характерный для других видов рыб Однако наблюдаются некоторые различия в составе компонентов тропонинового и тропомио-зинового комплексов Установлено, что соотношение субъединиц тропомиозина а Р различно и увеличивается в ряду пубоководных рыб от малоглазого макруруса к пепельному и составляет соответственно 1,10 1,0, 1,20 1,0 и 1,35 1,0 Подобная зависимость наблюдается и при сравнении с некоторыми пелагическими видами рыб Так, для минтая при содержании воды в мышцах 81-85 % соотношение а р-субъединиц тропомиозинового комплекса составило 1,66 1,0 Для дальневосточной сардины это соотношение еще выше и составляет 2,40 1,0 при содержании воды в мышце 74-76 % (Shimomura, 1980) Замеченные различия можно связать с разной скоростью сокращения мышечных волокон у глубоководных и пелагических рыб Это не противоречит некоторым литературным данным, свидетельствующим, что скорость сокращения мышцы связана с количеством Р-субъединицы тропомиозина в мышце (Humphreys, Cummins, 1984)

Было установлено, что молекулярные массы выделенных тропонинов (Тн) глубоководных рыб практически одинаковы - око то 77 кДа Это соответствует данным приводимым в литературе для других видов рыб (Sperling et al, 1979) Отличительной особенностью миофибрилл обоих макрурусов и лемонемы является ярко выраженное преобладание самого тяжелого компонента (Тн-Т), который выполняет структурную роль и прикрепляет другие компоненты тропонина к актиновому филаменту (Гусев, 1987) Возможно, преобладание Тн-Т в мышцах глубоководных рыб обусловлено условиями их обитания и связанно с общим пониженным содержанием белка в мышцах

Наряду с различиями в составе основных структурных белков обнаружены различия в содержании минорных компонентов миофибрилл глубоководных рыб Известно, что минорные белки миофибрилл обладают регуляторными и структурными функциями, необходимыми для поддержания биосистем в условиях повышенных давлений Для некоторых белков М- и Z-полосы, а также белков А-диска принципиальная возможность стабилимровать структуру миозиновых нитеи была показана ранее (Фревдина, 1980, Подлубная, 1987) Наши исследования позволили установить

связь между содержанием минорных белков миофибрилл и общим содержанием белка для глубоководных и пелагических рыб (рис 3)

Как видно на рис 3, мышцы ыубоководных рыб характеризуются более высокой долей минорных миофиб-риллярных белков У малогла-зого макруруса при содержании белка 7,8 % наблюдалось максимальное содержание минорных белков (11,6 %) Для пепельного макруруса (содержание белка в мышцах 17,4 %) доля этих компонентов составляет 49% Содержание минорных белков ниже 5,5 % характерно и дтя пелагических рыб Сопоставпение полученных данных для глубоководных и пелагических рыб позволило установить что между содержанием белка и долей минорных компонентов миофибршл имеется линейная связь Поскольку миофибриллярные белки, как известно, участвуют в образован™ структуры мышечного волокна и в функционировании мышц, это может играть важную роль именно для малоглаюго макруруса, отличающегося высоким содержанием воды, низким содержанием белка и подвергающегося действию высоких давлений Таким образом, уменьшение содержания белка в мышцах связано с увеличением концентрации минорных компонентов структурных и функциональных белков

Cooi ношение миозин/актин (М/А) в актомиозине используется для характеристики способности белков к гелеобразовацию Считается, что оптимальным для образования эластичной и прочной структуры является соотношение М/А от 3 до 4 (Kim, 2001)

Как видно на рис 4, дчя исследуемых видов глубоководных рыб соотношение М/А значительно ниже, чем для пелагических и донных, и варьирует от 2,60 (мало-глазый макрурус) до 2,85 (пепельный макр>рус) У пелагических рыб при содержании белка выше 16 % соотношение М/А превышает 3 На основании данных рис 4 и ли-

Белок %

Рис 3 Содержание минорных компонентов (ММ субъединиц 50-200 кДа) миофибрилтярныч белков мышц некоторых видов рыб

гературных данных о способности актомиозинов к гелеобразованию можно предположить, что наилучшими гелеобразукяцими свойствами из трех исследуемых видов будут обладать мышечные ткани пепельного макруруса, а наихудшими - малоглазсп о макруруса Зависимость между общим содержанием белка и соотношением миозин/актин является чиненной и общей для всех рассмотренных видов рыб

Таким образом, по-

локорый

даоперый казано, что состав основных миофибриллярных белков глубоководных рыб сходен с составом миофибрилч пелагических рыб При этом физико-химические свойства актомиозинов мышц глубо-

Рис 4 Соотношение миозин/актин актомиозиновых комплексов ководных рыб имеют ряд мышц некоторых видов рыб в зависимости от содержания белка

отличий от свойств актомиозинов пелагических рыб В табч 2 представлены основные, исследуемые нами, свойства актомиозинов величина АТФ-активности, время восстановле1гия вязкости pací воров при реакции с АТФ, величины скорости суперпреципитации

Таблица 2

Некоторые свойства актомиозинов рыб

Показатель Объект исследования

Макрурус малоглазый Лемонема Макрурус пепельный Минтай тихоокеанский* Камбала желтоперая* Терпуг одно-перый* I Палту с бело-корый* Корюшка малоротая*

М£2+-зависимая АТФаза Л.М, мкМ Р мг 'мин 1 0,091 0,181 0,167 0,195 0,153 - - 0,205

Время восст-ния вязкости растворов АМ, мин 220 180 200 10 10 5 15 10

СКОРОСТЬ СПП, 1 1Д, мин 1,4 1,8 1,13 U7 0,85 - - 1,5

Примечание АМ - актомнознн, СПП - суперпреципитация, «-» — данные отсутствуют

* Литературные данные (Maruyama, 1962, Finlayson, 1969, Spooner, 1971, Iguchi, 1981)

Как известно, свойства актомиозинов позволяют судить о мышечной активности (Lai et al, 1998) Низкая АТФ-активность, высокая скорость СПП, длительное восстановление вязкости свидетельствуют о том что у гтубоководных рыб реализуются два типа мышечной активности — высокая, за счет действия фазных мышечных волокон, и низкая, за счет действия тонических волокон Другими словами, для гтубоководных рыб характерен малоподвижный образ жизни, и при этом они способны к мощному, но короткому бросковому движению

Проведенные исследования показали, что миофибриллы глубоководных рыб характериз^ ются рядом специфических свойств, отличающих их от пелагических Однако факторов, отвечающих за формирование структуры мышечного волокна, выявлено недостаточно

Поскольку известно, что существенную роль в стр\ктурообразовании миофиб-риллярных белков играет тканевая ТГ, быта исстедована ее активность в мышцах глубоководных рыб

Влияние активности тканевой транспутамина1ы на структурообразова-нне бетков, в том числе тяжелых цепей миозинов мышц исследуемых глубоководных рыб Установлено, что активность тканевой трансглутаминазы мышц исече-дуемых глубоководных рыб различна и в среднем изменяется от 2,5 отн ед для пе-печьного макруруса до 13,5 отн ед —дтя матоглазого макруруса Эти значения выше, а для малогтазого макруруса значительно выше, чем для других объектов (рис 5) В целом, для нечагических рыб относительные величины ТГ-активности сопоставимы и не превышают 1

К ---L __ А

- ма Мькр>р\с 1 ' спешили

--- я- 99 . \<

■л "

'чирусы .А

I _

7 9 11 Ь '5 17 19 21 2 5 2 " 29 11 33 И 3 7 3 9

"а (.ОО-НОШ^НШ. МИОЗШ^НКТИН ПН г 'I

Рис 5 Зависимость активности трансглутаминазы от содержания белка в мышце (А) и соотношения миозин'актин (Б) 1 - сардина дальневосточная 2 - ставрида японская, 3 - кета, 4 - макрель меткоиятнистая, 5 - терпуг одноперыи, 6 - палтус белокорыи, 7 - камбала желтоперая, 8 - минтаи тихоокеанский, 9 - корюшка малоротая

Установлено, что с увеличением доли белка в мышце и соотношения М/А в ;ж-томиозине активность ТТ снижается экспоненциально (рис. 5, А, Б). Полуденные зависимости позволили сделать предположение о возможной роли ТГ в формировании стабильной структуры скелетных мышц глубоководных рыб и и первую очередь о влиянии ТГ на состав M ГЦ.

Установлено, что миозины тяжелых цепей (М ГЦ) всех трех исследуемых рыб содержат два белка, с ММ 4SI) к Да (димер. МТЦ-2) и 180 к Да (мономер. МТЦ-1) (рис. 6). Кроме того, в зоне M ГЦ были обнаружены минорные белковые компоненты с ММ 270-380 кДа (рис.6).

Рис 6. Электрофоре грим м а зоны миозинов тяжелы? испей Исследуемых видов глубоководных рыб. 5 %-ныи ПААГ, I — макру-рус малоглазый, 2 - лемонема, 3 - иакрурус пепельный

Количество минорных компонентов М ГЦ различно для всех исследуемых видов. 11ри этом большей доле минорных белков соответствует более низкое соотношение основных белков М ГЦ-2/МТЦ-1. Обнаруженное несоответствие между ММ мономера н димерз миозина наблюдаете* для всех исследуемых глубоководных рыб и не характерно для пелагических. Также для пелагических соотношение ди-мер/мономер всегда меньше 1 за счет меньшей доли димера но сравнению с мономером. В случае глубоководных рыб наблюдалась, напротив, более высокая доля димера по сравнению с мономером.

Такой состав М ГЦ может образоваться а результате реакций ферментативной полимеризации мышечных белков под действием фермента — трансглутаминазы, — катализирующей реакции межмолекулярвого поперечного сшивании белков.

Тканевая трансглу там ин аза участвует в процессах структуре образования мышечных белков в живом организме и играет существенную роль в сгру¡парообразовании миофибриллирных белков при производстве пищевых продуктов. В результате действия мышечных трацкглутаминаз образуются, как правило, полимеры миозина

состава МТЦ-2, МТЦ-3, МТЦ-4 Их наличие, по литературным данным, связывают с формированием у систем мышечных белков прочных и эластичных свойств (Niwa, 1992, Takeda, 1996)

Нами было исследовано изменение состава МТЦ мышц глубоководных рыб при внесении трансглутаминазы из печени морской свинки Предварительно было установлено, что характер изменения состава МТЦ под действием собственной и внесенной ТГ для миозинов мышц рыб совпадает

Установлено, что при увеличении активности ТГ от 0,3 до 0,5 ед/100 мг миозина происходит накопление доли белка с ММ 480 кДа (рис 7), а доля минорных компонентов МТЦ снижается (рис 7) Дальнейшее увеличение активности фермента более 0,7 ед/100 мг миозина приводит к уменьшению доли белка с ММ 480 кДа и увеличению количества минорных компонентов и белка с ММ 180 кДа (мономер МТЦ)

Активность трансглутаминазы ед /100 мг миозина

Рис 7 Состав тяжелых цепей миозина мышц глубоководных рыб в зависимости от активности тканевой трансглутаминазы

Характерным отличием белков глубоководных рыб от пелагических является протекание двух противоположных процессов (полимеризации и деполимеризации) под действием собственной тканевой ТГ Увеличение активности фермента выше 0,5 ед/100 мг миозина приводит к деполимеризации белков под действием ТГ, которая действует в этом слу чае как изопептидаза, т е расщепляет глутамин-лизиновые связи

Такая принципиальная возможность гидролиза е-(у-гл>тамил)-лизиновой связи под действием ТГ была показана ранее (Fesus et al, 2002)

На рис 7 видно, что наибольшее относительное количество МТЦ-2 (ММ 480 кДа) от 50 до 90 % обеспечивается активностью ТГ в пределах 0,3-0,7 ед /100 мг миозина Из этого можно сделать заключение, что такой уровень активности ТГ оптимален для создания прочной белковой структуры на основе измельченных мышечных тканей глубоководных рыб Полученные результаты показывают возможность регулирования состава МТЦ в зависимости от величины активности тканевой зрансглу-таминазы в мышцах глубоководных рыб, что в свою очередь позволит влиять па реологические свойства (прочность и эластичность) получаемых белковых систем из мышечной ткани глубоководных рыб

Влияние активности трансглутаминазы на реологические характеристики измельченной мышечной ткапп исследуемых глубоководных рыб. При разработке рекомендаций для получения белковых структур на основе регулирования состава МТЦ исходили из того, что максимальное количество полимеризованной фракции МТЦ с ММ 480 кДа обеспечивается активностью ТГ, равной 0,3-0,7 ед/100 мг миозина

Согласно литературным данным, процесс «становления» геля из сырья рыбного происхождения включает в себя процесс поперечного сшивания мономеров МТЦ При этом уменьшается доля МТЦ-1 и увеличивается доля полимерной фракции Найдена корреляция между количеством доли полимерной фракции МТЦ и реологическими свойствами геля Показано, что прочность и эластичность геля прямо пропорциональны количеству полимеризованного миозина тяжелых цепей (Lee, 1990, Tsu-kamasa, 1990)

Было проведено сопоставление данных состава МТЦ и активности ТГ с реологическими характеристиками белковых систем на основе измельченной мышечной ткани глубоководных рыб Для этого в измельченную мышечную ткань исследуемых глубоководных рыб с минимальной активностью ТГ, равной 0.15 ед/100 мг миозина для лемонемы и малоглазого макруруса и 0,06 ед/100 мг миозина для пепельного макруруса, вносили дополнительный фермент до максимальной величины 2,45 ед/100 мг миозина Для характеристики изменения реологических параметров при внесении фермента использовали изменения динамических характеристик модуля

сохранения О' и комплексного модуля О* (кПа) Было установлено, что изменение О* и С при увеличении активности 1Г в измельченной мышечной ткани исследуемых видов гтубоководных рыб происходит синхронно Изменение комплексного модуля измельченной мышечной ткани в зависимости от активности ТГ приведено на рис 8

Активность трансглугамнназы ел1'100мг млочина

Рис 8 В таяние активности трансгл\таминазы на общее сопротивление системы внешним деформациям

На рис 8 видно, что при 1Г-активности 0,3 ед /100 мг миозшга для малоглазого макруруса и 0 5-0 7 ед/100 мг миошна для лемонемы и пепельного макруруса измельченная мышечная ткань глубоководных рыб характеризуются максимальными величинами эчастичности При таких значениях активности комплексный модуль возрастает на 7, 27 и 56 % соответственно для малоглазого макруруса, лемонемы и пепельного макруруса по сравнению с минимальной активностью ТГ в мышцах ис-стедуемыч рыб При увеличении активности ТГ выше этих значений упругость и эластичность измельченной мышечной ткани снижаются, что характеризуется уменьшением О* (кПа) на 80 36 и 5 % соответственно для мачоглазого макруруса лемонемы и пепельного макру руса

Таким образом, рекомендуемая величина активности ТГ для получения структурированных систем на основе мышечной ткани глубоководных рыб составчяет 0 3 ед /100 мг миозина для малогчазого макруруса и 0,5-0,7 ед /100 мг миозина для лемонемы и пепечьного макруруса

Отличительной особенностью белковых систем на основе мышц глубоководных рыб является то, что увеличение активности выше 0,3 ед /100 мг миозина для ма-логлазого макруруса и выше 0,7 ед/100 мг миозина для лемонемы и пепельного мак-руруса приводит к снижению прочностных характеристик получаемых белковых систем Это обусловлено тем, что, как показано на рис 8, при таком увеличении активности ТГ происходит деполимеризация МТЦ и снижение доли димера МТЦ с одновременным увеличением доли мономера МТЦ

Полученные зависимости реологических показателей от активности ТГ подтверждают тот факт, что максимальная доля полидгеризованной фракции МТЦ обеспечивает максимальные реологические характеристики получаемых белковых структурированных систем При этом следует отметить, что для мышц исследуемых видов глубоководных рыб собственная величина активности ТГ обычно выше рекомендуемых оптимальных величин Так, для пепельного макруруса собственная ТГ-активность изменяется от 0,1 до 0,6 ед /100 мг миозина, а для лемонемы — от 0,15 до 0,6 ед /100 мг миозина Как видно на рис 8, собственная максимальная активность ТГ для лемонемы и пепельного макруруса, равная 0,6 ед/100 мг миозина, обеспечивает более высокие значения прочности и этастичность гелей, получаемых на основе измельченной мышечной ткани этих видов рыб Собственная активность ТГ в мышцах малоглазого макруруса в основном изменяется от 1,0 до 2,0 ед/100 мг миозина Как видно на рис 8, при таких величинах активности наблюдается значительное снижение прочности и эластичности Как было показано ранее, это обусловлено процессами деполимеризации миозинов тяжелых цепей под действием высокой активности ТГ Также снижение эластичности при увеличении активности ТГ может быть связано с пониженным содержанием бепка в скелетных мышцах малоглазого макруруса Известно, что прочность геля зависит не только от активности ТГ, но и от концентрации основного белка, подвергающегося модификации под действием фермента ТГ (N10, 1985)

На основании полученных данных сделано заключение, что для получения гелей с высокими эластичностью и прочностью из мышц малоглазого макруруса необходимо увеличить относительную долю белка в получаемой системе, способного по-лимеризоваться под действием ТГ При этом вносимые белки должны быть хорошими субстратами для трансглутаминазы Из литературы известно, что казеин, изолят

соевого белка пшеничная и кукурузная клейковины способны подвергаться модификации под действием трансглутаминазы (1кига, 1980)

Нами было рассчитано, что при собственной активности ТГ мышц малоглазого макруруса, составляющей 1,0-2,0 ед /100 мг миозина, необходимо увеличить концентрацию белка в 3-6 раз Для этого необходимо вносить соответственно от 9 до 20 % сухого белка Такое количество внесенного субстрата должно обеспечить оптимальную активность ТГ, составляющую 0,3 ед/100 мг миозина, и способствовать получению высоких реологических параметров структурированных белковых систем за счет их полимеризации под действием ТГ

Чтобы исследовать связь реологических характеристик измельченной мышечной ткани глубоководных рыб при внесении дополнительного белка, был проведен следующий эксперимент В измельченную мышечную ткань исследуемых видов глубоководных рыб вносили от 3 до 25 % изолята соевого белка Исходная активность мышечной ткани малоглазого макруруса, лемонемы и пепельного макруруса составила соответственно 1,5, 0,6 и 0,5 ед /100 мг миозина Изменения реологических характеристик оценивали по изменению предельного напряжения сдвига (ПНС) (рис 9)

Полученные результаты подтверждают данные о том, что внесение дополнительного белка в измельченную мышечную ткань глубоководных рыб приводит к улучшению структурных свойств получаемых белковых систем Характер их изменения свидетельствует о том, что этот белок вступает в соответствующую реакцию полимеризации Как видно на рис 9, добавление 15-20 % соевого изолята приводит к увеличению ПНС белковой системы на основе мышц малоглазого макруруса более чем в 7 раз В случае лемонемы и пепельного макруруса увеличение ПНС происходит в 1,7 и 1,5 раза при внесении 5-8 % белка Причем интересно отметить, что внесение 8 % соевого изолята в измельченную мышечную

Рис 9 Влияние количества внесенного белка на предельное напряжение сдвига измельченной мышечной ткани глубоководных рыб, %

ткань лемонемы приводит к близким значениям ПНС при внесении 15-20 % соевого изолята в измельченные мышцы малоглазого макруруса В мышечной ткани пепельного макруруса максимальное значение ПНС превышает максимум для малоглазого макруруса на 25 % и для лемонемы на 18 %

Подобные результаты были получены и с использованием казеина, рациональное количество которого, как установлено, составляет 5-10 % к массе измельченной мышечной ткани малоглазого макруруса Показатели ПНС при этом составили 3500— 4200 Па В случае лемонемы и пепельного макруруса внесение 2-3 % казеина приводило к увеличению ПНС до 3800-5200 Па, что соответствует максимальным значениям ПНС, полученным при внесении 5-8 % соевого изолята

На основании полученных результатов разработан проект технической документации для производства пищевых формованных изделий на основе измельченной мышечной ткани лемонемы, малоглазого и пепельного макрурусов

Технология получения пищевой продукции основывалась на смешивании измельченной мышечной ткани с компонентами, предусмотренными в рецептуре для формованных изделий После смешивания ингредиентов, набивки в оболочки, прогревания при температурно-временных параметрах, рекомендованных ТИ, продукция оценивалась на дегустационных совещаниях, где были установлены удовлетворительные качественные показатели образцов Наиболее высокие оценки получили изделия, имеющие показатели ПНС в интервале 5000-7500 Па Увеличение ПНС в готовых изделиях по сравнению с исходными объясняется денату рационными изменениями структурных белков в процессе тепювого воздействия, что не противоречит известным данным Выводы

1 Установлены отличия основных структурных белков мышц глубоководных рыб (миозина, актина, актомиозина, тропонина и тропомиозина) от белков мышц пелагических рыб, которые заключаются в том, что доля миофибриллярных белков (в том числе минорных) увеличивается с уменьшением массовой доли белка в мышцах

2 Выявлено, что миофибриллярные белки глубоководных рыб отличаются по соотношению основных структурных белков миозина и актина от миофибриллярных белков пелагических и донных рыб В ряду исследуемых глубоководных рыб соотношение М/А минимально для малоглазого макруруса (2,6) и максимально для пе-

пелыюго макруруса (2,85) Полученные данные свидетельствуют о низкой потенциальной способности белков глубоководных рыб к гелеобразованию

3 Установлено, что малоподвижный образ жизни глубоководных рыб характеризуется низкой АТФ-активностью, высокой скоростью СПП, длительным восстановлением вязкости основных сократительных белков мышц - актомиозинов

4 Сравнение активности трансглутаминаз в мышцах исследуемых глубоководных и пелагических рыб показало, что мышцы исследуемых видов глубоководных рыб обладают более высокой активностью трансглутаминаз составляющей величины от 2.5 до 13,5 отн ед

5 Наибольшее количество миозина МТЦ-2 с ММ 480 кДа, который является основным фактором, обеспечивающим прочную и эластичную структуру получаемых белковых систем на основе измельченной мышечной ткани глубоководных рыб, образуется при величинах активности ТГ от 0,3 до 0,7 ед /100 мг миозина

6 Научно обоснованы величины активности трансглутаминазы, позволяющие получать формованные изделия на основе фаршей г лубоководных рыб с оптимальными структурными характеристиками Они составляют 0,3 ед/100 мг миозина для малоглазого макруруса и 0,5-0,7 ед/100 мг миозина — для лемонемы и пепельного макруруса

7 Научно обосновано количество вносимого белка в измельченную мышечную ткань, необходимое для создания белковой структуры с высокими реологическими показателями, составляющее 15-20 % для малоглазого макруруса и 5-8 % для лемонемы и пепельного макруруса При этом установлено что структура обеспечивается увеличением относительного количества МТЦ-2 с ММ 480 кДа и соответствует оптимальным величинам активности ТГ

8 На основании проделанной работы были разработаны рекомендации для производства пищевых продуктов - формованных изделий с ПНС от 5000 до 7500 Па, что нашло отражение в проекте технической документации

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Караулова Е П , Леваньков С В , Якуш Е В , Акулин В Н Качественный и количественный состав миофибрил тарных белков некоторых видов глубоководных рыб // Изв ТИН-РО 2003 Т 134 С 309-320

Караулова Е TI, Леваньков С В , Якуш Е В , Аку лин В Н Акгомиозины скелетных мышц глубоководных рыб// И ÍB ТИНРО 2003 Т 134 С 321-333

Караулова Е.П , Леваньков С В , Якуш Е В Сравнительная технохимическая характеристика некоторых видов глубоководных рыб // Хранение и переработка сельхозсырья 2003 № 12 С 50-53

Караулова Е П., Леваньков С В Якуш Е В Некоторые особенности биохимии мышц глубоководных рыб // Изв ТИНРО 2007 Т 148 С 312-321

Караулова Е П , Леваньков С В , Якуш Е В Влияние трансглутаминазы на состав тяжелых цепей миозинов скелетных мышц некоторых видов глубоководных рыб // Изв ТИНРО 2007 Т 148 С 322-329

Материалы конференций

Караулова ЕП Роль тканевой трансглутаминазы в регулировании состава тяжелых цепей миозина // Материалы VI региональной конференции по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнотогин студентов, аспирантов и мотодых ученых Дальнего Востока России Владивосток ДВГУ 2003 С 50-52

Караулова Е П. Некоторые особенности биохимии мышечных тканей глубоководных рыб в связи с условиями обитания // Матерн&ты Всероссийской конференции молодых ученых "Актуальные проблемы изучения и использования водных биоресурсов" Владивосток ТИНРО-Центр, 2004 С 170-174

Караулова Е П Трансглутаминазы мышечных тканей глубоководных рыб // Материалы Всероссийской конференции молодых ученых "Актуальные пробтемы изучения и ис-потьзовання водных биоресурсов" Владивосток ТИНРО-Центр, 2004 С 188-192

Караулова Е II, Якуш Е В Некоторые особенности технологии переработки глубоководных рыб и их использование в пищевой продукции // Материалы научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнотогия пробтемы и перспективы» Калининград, 2006 С 62-63

Подписано в печать 16 04 2007 Формат 60x90'/i6 Уст печ л 10 ____Тираж 100 экз Зак № 3

Отпечаюно в типографии ТИНРО-Центра 690000, Владивосток, пер Шевченко, 4

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Глубоководные рыбы. Особенности биологии, обитания и питания.

1.2. Особенности состава и свойств скелетных мышц глубоководных и пелагических рыб в связи с условиями обитания.

1.3. Структура и функции основных мышечных белков, методы выделения.

1.3.1. Характеристика миозина и его субъединщ, методы выделения.

1.3.2. Актин, свойства и методы выделения.

1.3.3. Основные регуляторные белки сократительных мышц.

1.4. Трансглутаминазы, их каталитические свойства и строение.

1.4.1. Свойства трансглутаминаз.

1.4.2. Распространение трансглутаминаз.

1.4.3. Тканевая трансглутаминаза. Структура фермента и распределение в тканях.

1.4.4. Микробиалъная трансглутаминаза.

1.5. Структурообразование в белковых системах. Влияние трансглутаминазы на состав тяжелых цепей миозинов и реологические характеристики продуктов на основе измельченной мышечной ткани рыб.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Район исследования.

2.3. Исследование технохимических характеристик.

2.4. Исследование реологических характеристик.

2.5. Методы анализа белков.

2.6. Выделение и свойства белков.

Глава 3. Результаты и их обсуяадение.

3.1. Особенности химического состава скелетных мышц исследуемых видов глубоководных рыб.

3.2. Состав белков мышц глубоководных рыб.

3.3. Состав и физико-химические свойства основных миофибриллярных белков мышц глубоководных рыб в связи с их способностью к образованию структуры.

3.3.1. Общий состав миофибриллярных белков скелетных мышц пепельного и малоглазого макрурусов илемонемы.

3.3.2. Выделение основных компонентов скелетных мышц исследуемых видов глубоководных рыб.

3.3.3. Актомиозины скелетных мышц глубоководных рыб.

3.4. Влияние активности тканевой трансглутаминазы на структурообразо-вание белков, в том числе тяжелых цепей миозинов мышц исследуемых глубоководных рыб.

3.4.1. Состав тяжелых цепей миозина скелетных мышц исследуемых видов глубоководных рыб.

3.4.2. Активность трансглутаминаз, сравнение среди исследуемых видов и с другими организмами.

3.4.3. Зависимость состава тяжелых цепей миозинов скелетных мышц исследуемых глубоководных рыб от активности трансглутамназы.

3.5. Влияние активности трансглутаминазы на реологические характеристики измельченной мышечной ткани исследуемых глубоководных рыб.

Выводы.

Актуальность темы. В связи с сокращением объема вылова традиционных морских гидробионтов актуальной становится проблема использования нетрадиционного сырья для производства пищевой продукции.

Среди видов, широко распространенных на дальневосточном бассейне и недостаточно используемых, следует отметить глубоководных рыб, основные промысловые скопления которых образованы макрурусами (Albatrossia pectoralis, Cory-phaenoides cinereus, Coryphaenoides rupestris, Coryphaenoides acrolepis), ликодами (Lycodes raridens, Lycodes soldatovi), лемонемой (Laemonema longipes). Ориентировочные запасы макруруса малоглазого позволяют вылавливать до 70 тыс. т рыбы в год (Тупоногов, 1986), лемонемы - до 40 тыс. т ежегодно (Савин, 1998).

В научной литературе имеются сообщения о биологии некоторых глубоководных рыб (Drazen, 2001), биохимических характеристиках мышечного а-актина (Coryphaenoides armatus, Coryphaenoides yaquinac) (Morita, 2003), кинетике тепловой коагуляции мышечных белков (Lycogramma zesta) (Taguchi, 1981), технохимической характеристике (Мельникова, 1976). Известны данные, свидетельствующие о высокой обводненности ткани этих рыб, что наряду с низким содержанием белка и плохой во-досвязывающей способностью ограничивает производство пищевой продукции из них (Швидкая, 1980; Одинцов, 2002). Анализ результатов опубликованных работ не позволяет обосновать и разработать рекомендации по использованию лемонемы и макрурусов для производства пищевой продукции, поскольку отсутствуют систематические данные по составу и свойствам структурообразующих белков и активности тканевых ферментов.

Одним из перспективных путей использования глубоководных рыб является производство белковых продуктов с заданными реологическими свойствами, для чего необходимы специальные исследования структурообразующих свойств белков. Определение основных физико-химических факторов, влияющих на структурирование мышечных белков, может явиться основой для разработки и создания новых пищевых продуктов из глубоководных рыб с применением специальных приемов биотехнологии.

В последнее время в производстве эластичных структурированных пищевых продуктов используются трансглутаминазы (ТГ) (Niwa, 1992). В результате действия мышечных ТГ образуются полимеры миозина тяжелых цепей (МТЦ), что связывают с формированием у систем мышечных белков прочных и эластичных свойств (Nowsad et al., 1993). Использование ТГ может стать перспективным и при получении структурированных пищевых продуктов из глубоководных рыб.

ТГ обнаружена в мышцах гидробионтов, её активность существенно зависит от вида рыб (Araki, Seki, 1993; Nowsad et al., 1995). Что же касается глубоководных рыб, то сведений об активности ТГ в их мышцах на момент проведения исследований нами не обнаружено.

Таким образом, исследование физико-химических и биохимических свойств структурообразующих белков глубоководных рыб представляется актуальным. При этом важным для разработки научных рекомендаций по созданию пищевых продуктов на основе измельченной мышечной ткани глубоководных рыб является исследование влияния трансглутаминаз на структуру получаемых белковых систем.

Цель исследования: научно обосновать технологические рекомендации по переработке глубоководных рыб в зависимости от свойств структурных белков и активности трансглутаминазы.

Задачи исследования:

- изучить состав и физико-химические свойства миофибриллярных белков глубоководных рыб и установить их потенциальную способность к структурообразова-нию;

- определить влияние величины активности тканевой (эндогенной) трансглутаминазы на состав основных структурных белков, в том числе тяжелых цепей миозина;

- установить зависимость реологических характеристик измельченной мышечной ткани глубоководных рыб от величины активности внесенной (экзогенной) трансглутаминазы;

- обосновать рациональные величины активности трансглутаминазы и оптимальное количество белка для получения структурированных белковых систем на основе мышечной ткани глубоководных рыб;

- разработать рекомендации для получения пищевой продукции (формованных изделий) на основе измельченной мышечной ткани глубоководных рыб.

Научная новизна. Впервые из мышечной ткани исследуемых глубоководных рыб выделены основные структурные миофибриллярные белки: миозин, актин, акто-миозин, тропонин и тропомиозин, определены их молекулярные массы. Исследованы основные свойства белков миофибрилл: соотношение миозин/актин, АТФ-активность, вязкость, параметры суперпреципитации и кинетика агрегации актомио-зинов. На основании рассмотренных свойств мышечных белков установлено, что белые мышцы глубоководных рыб обладают смешанными, фазными и тоническими, свойствами.

Установлено, что чем ниже содержание белка в мышцах исследуемых глубоководных рыб, тем выше доля минорных миофибриллярных белков и ниже соотношение основных структурных белков мышц - миозин/актин. Выявлено, что мышцы глубоководных рыб обладают высокой активностью трансглутаминаз, которая значительно выше этого показателя для мышц пелагических рыб. Установлено, что уменьшение содержания белка в мышцах глубоководных рыб сопровождается увеличением активности трансглутаминазы. Указанная зависимость имеет экспоненциальный характер.

Обнаружено, что с увеличением активности трансглутаминаз мышц исследуемых глубоководных рыб возрастает относительная доля полимера тяжелых цепей миозина - белка с молекулярной массой (ММ) 480 кДа. Установлено, что в миофиб-риллах мышц глубоководных рыб, в отличие от пелагических, возможна деполимеризация миозина под действием собственной тканевой трансглутаминазы. Сделано заключение, что при этом структурно-механические показатели белковых систем имеют тенденцию к снижению. Обоснована оптимальная величина ТГ-активности для получения структурированных белковых систем на основе мышечной ткани глубоководных рыб.

Практическая значимость работы. Разработаны способы выделения миозина, актина, актомиозина, компонентов тропонинового и тропомиозинового комплексов из мышц малоглазого макруруса, лемонемы и пепельного макруруса, позволяющие получать белки с минимальным количеством примесей и с сохранением функциональности.

Установлено, что для получения структурированных белковых систем заданной прочности и эластичности необходимо, чтобы содержание полимеризованного миозина с ММ 480 кДа составляло не менее 65 % от общего количества миозинов тяжелых цепей. Разработаны биотехнологические приемы, позволяющие увеличивать в получаемой белковой системе долю миозина с ММ 480 кДа. Определено необходимое и достаточное количество белка для достижения оптимального количества миозина с ММ 480 кДа, позволяющее получать прочные и эластичные структуры на основе измельченной мышечной ткани малоглазого макруруса, лемонемы и пепельного макруруса.

Разработаны рекомендации для получения структурированных белковых продуктов на основе измельченной мышечной ткани глубоководных рыб: макруруса малоглазого, макруруса пепельного и лемонемы. Обоснованы рациональные количества вносимого белка (казеин или изолят соевого белка), необходимые для получения прочных и эластичных белковых систем заданной структуры. Разработан проект технической документации на производство пищевых продуктов на основе измельченной мышечной ткани малоглазого макруруса, лемонемы и пепельного макруруса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Установленное для глубоководных рыб соотношение миозин/актин в акто-миозине влияет на структурообразующие свойства белковых систем на основе измельченной мышечной ткани исследуемых объектов.

2. Для глубоководных рыб состав тяжелых цепей миозина и их способность к полимеризации и деполимеризации зависят от активности тканевой трансглутамина-зы.

3. Внесение дополнительного белка - субстрата трансглутаминазы - позволяет рационально использовать высокую активность трансглутаминаз мышц глубоководных рыб при получении прочных белковых структур на основе мышечной ткани этих объектов.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на V региональной конференции по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии в ДВГУ (Владивосток, 2002); Всероссийской конференции молодых ученых «Комплексные исследования и переработка морских и пресноводных гидробионтов» в ТИНРО-Центре (Владивосток, 2003); II международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» в МГУ (Москва, 2004); Всероссийской конференции молодых ученых "Актуальные проблемы изучения и использования водных биоресурсов" (Владивосток, 2004); научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы» (Калининград, 2006); ученых советах ФГУП «ТИНРО-Центр» в 2002-2003 гг. Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 стр., состоит из введения, трех глав, выводов, списка цитированной литературы, включающего 208 источников; содержит 11 таблиц, 22 рисунка и 2 приложения.

ВЫВОДЫ

1. Установлены отличия основных структурных белков мышц глубоководных рыб (миозина, актина, актомиозина, тропонина и тропомиозина) от белков мышц пелагических рыб, которые заключаются в том, что доля миофибриллярных белков (в том числе минорных) увеличивается с уменьшением массовой доли белка в мышцах.

2. Выявлено, что миофибриллярные белки глубоководных рыб отличаются по соотношению основных структурных белков миозина и актина от миофибриллярных белков пелагических и донных рыб. В ряду исследуемых глубоководных рыб соотношение М/А минимально для малоглазого макруруса (2,6) и максимально для пепельного макруруса (2,85). Полученные данные свидетельствуют о низкой потенциальной способности белков глубоководных рыб к гелеобразованию.

3. Установлено, что малоподвижный образ жизни глубоководных рыб характеризуется низкой АТФ-активностью, высокой скоростью СПП, длительным восстановлением вязкости основных сократительных белков мышц - актомиозинов.

4. Сравнение активности трансглутаминаз в мышцах исследуемых глубоководных и пелагических рыб показало, что мышцы исследуемых видов глубоководных рыб обладают более высокой активностью трансглутаминаз, составляющей величины от 2,5 до 13,5 отн. ед.

5. Наибольшее количество миозина МТЦ-2 с ММ 480 кДа, который является основным фактором, обеспечивающим прочную и эластичную структуру получаемых белковых систем на основе измельченной мышечной ткани глубоководных рыб, образуется при величинах активности ТГ от 0,3 до 0,7 ед./100 мг миозина.

6. Научно обоснованы величины активности трансглутаминазы, позволяющие получать формованные изделия на основе фаршей глубоководных рыб с оптимальными структурными характеристиками. Они составляют 0,3 ед./100 мг миозина для малоглазого макруруса и 0,5-0,7 ед./100 мг миозина — для лемонемы и пепельного макруруса.

7. Научно обосновано количество вносимого белка в измельченную мышечную ткань, необходимое для создания белковой структуры с высокими реологическими показателями, составляющее 15-20 % для малоглазого макруруса и 5-8 % для лемонемы и пепельного макруруса. При этом установлено, что структура обеспечивается увеличением относительного количества МТЦ-2 с ММ 480 кДа и соответствует оптимальным величинам активности ТГ.

8. На основании проделанной работы были разработаны рекомендации для производства пищевых продуктов - формованных изделий с ПНС от 5000 до 7500 Па, что нашло отражение в проекте технической документации.

86

1. Акимушкин И.И. Основной объект питания бутылконоса (Hyperoodon rostratum Miller) // ДАН СССР. 1954. т. 95, №2. С. 419-422.

2. Аршавский И.А., Даринский Н.В. Биофизические и физиологические характеристики скелетных мышц млекопитающих в онтогенезе. В кн.: Биофизика и биохимия мышечного сокращения. М.: Наука. 1976. С. 240-247.

3. Богданов В.Д., Сафронова Т.М. Структурообразователи и рыбные композиции. М.: ВНИРО. 1993.368 с.

4. Борисочкина Л.И., Дубровская Т.А. Технология продуктов из океанических рыб. М.: Агропромиздат. 1988.208 с.

5. Бурков В.А., Арсенъев B.C. Опыт выделения водных масс в зоне соприкосновения Куросио и Курильского течения // Тр. ИО АН СССР. 1958. Т.27. С. 5-11.

6. Быков В.П., Ионас ГЛ., Головкова Т.Н., Диденко А.П., Акулин В.Н., Перова Л.И. Справочник по химическому составу и технологическим свойствам морских и океанических рыб // М.: ВНИРО. 1998.223 с.

7. Винокурова Т.Т. Сравнительная характеристика океанологических условий в системе вод Куросио в 1967-1970гг. // Изв. ТИНРО. 1973. Т. 89. С. 18-31.

8. Гусев Н.Б. молекулярные механизмы мышечного сокращения // СОЖ. 2000. №8. С. 24-32.

9. Измайлова В.Н., Ребиндер П.А. Структурообразование в белковых системах. М.: Наука. 1974. 268 с.

10. Караулова Е.П., Леваньков С.В., Якуш Е.В., Акулин В.Н. Качественный и количественный состав миофибриллярных белков некоторых видов глубоководных рыб // Изв. ТИНРО. 20036. Т. 134. С. 309-320.

11. Караулова ЕЛ., Леваньков С.В., Якуш Е.В., Акулин В.Н. Актомиозины скелетных мышц глубоководных рыб // Изв. ТИНРО. 2003в. Т. 134. С. 321-333.

12. Караулова Е.П., Леваньков С.В., Якуш Е.В. Сравнительная техно-химическая характеристика некоторых видов глубоководных рыб // Хранение и переработка сельхозсырья. 2003г. №12. С. 50-53.

13. Караулова Е.П. Трансглутаминазы мышечных тканей глубоководных рыб // Материалы Всероссийской конференции молодых ученых "Актуальные проблемы изучения и использования водных биоресурсов". Владивосток: ТИНРО-Центр, 20046. С. 188- 192.

14. Караулова Е.П., Леваньков С.В., Якуш Е.В. Некоторые особенности биохимии мышц глубоководных рыб // Изв. ТИНРО. 2007а. Т. 148. С. 312-321.

15. Караулова Е.П., Леваньков С.В., Якуш Е.В. Влияние трансглутаминазы на состав тяжелых цепей миозинов скелетных мышц некоторых видов глубоководных рыб // Изв. ТИНРО. 20076. Т. 148. С. 322-329.

16. Кремнева Е.В., Николавева О.П., Гусев Н.Б., Левицкий Д.И. Влияние тро-понина на тепловую денатурацию связанного с актином тропомиозина // Биохимия. 2003. Т. 68, вып.7. С. 976-984.

17. Кодолов Л.С., Паутов Г.П. Лемонема // Биологические ресурсы Тихого океана. 1986. С. 181-186.

18. Лазаревский А.А. Технохимический контроль в рыбообрабатывающей промышленности. М.: Пищепромиздат. 1976. 515 с.

19. Левицкий Д.И., Хайтлина С.Ю., Гусев Н.Б. Белки актомиозиновой системы подвижности. В кн.: Белки и пептиды. М.: Наука. 1995. Т. 1 С. 249-293.

20. Маргулис Б.А. Тартаковский А.Д., Пинаев Г.П. Влияние очистки и лио-филизации миозина кролика на фракционный состав его "легких" субъединиц // Научная конференция Института цитологии АН СССР, посвященная 15-летию Института. Л. 1972. С. 59-60.

21. Мельникова О.М. О влагоудерживающей способности мышечных тканей // Рыбное хозяйство. 1977. №2. С.72-73.

22. Морошкин КВ. Водные массы Охотского моря. М. 1966. 67 с.

23. Николаев В.А. Изменение структурно-механических свойств пищевых продуктов. М.: Экономика. 1964.170 с.

24. Новиков Н.П. Биология малоглазого долгохвоста Chalinura pectoralis в северной части Тихого океана // Советские рыбхоз, исслед. в северной части Тихого океана: Тр. ВНИРО. Т. 70. Изв. ТИНРО. Т. 72. 1970. С. 300-326.

25. Новиков Н.П. Промысловые рыбы материкового склона северной части Тихого океана. М.: Пищепром. 1974. 308 с.

26. Пинаев Т.Н. Проблема чистоты и нативности препаратов сократительных белков, в кн. Биофизические и биохимические методы исследования мышечных белков. Л.: Наука. 1978. С. 14-23.

27. Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. Миозин и биологическая подвижность. М.: Наука. 1982.345 с.

28. Поглазов Б.Ф. Структура и функции сократительных белков. М.: Наука. 1965.223 с.

29. Подлубная З.А. Минорные белки толстых нитей. В кн. Структура и функции белков сократительных систем. 1987. С. 32-36.

30. Пронина О., Копеланд О. и др. С-концевые сайты кальдесмона управляют циклом гидролиза АТФ, сдвигая промежуточные состояния актомиозина к слабым формам взаимодействия миозина с актином // Цитология. 2006. Т.48 (1). С. 9-18.

31. Проссер Л., Браун Ф. Сравнительная физиология животных. М.: Мир. 1967. 766 с.

32. Савин А.Б. Биология лемонемы (Laemonema longipes, Moridae) Северозападной части тихого океана // Изв. ТИНРО. 1998. Т. 124 (1). С. 108-138.

33. Тупоногов В.Н. Распределение, возраст и динамика запасов малоглазого долгохвоста (Coryphaenoides pectoralis) у Курильских островов (1974-1985 гг.) // Динамика численности промысл, животных дальневосточных морей. Владивосток: ТИНРО. 1986. С. 100-109.

34. Тартаковский А.Д., Пашкова JI.B., Пинаев Г.П., Жирмунский А.В., Воробьев В. И. Теплоустойчивость и аминокислотный состав очищенных на ДЭАЭ-сефадексе миозинов озерной и травяной лягушек // Цитология. 1973. 15 (7). С. 855861.

35. Туроверов К.К., Хайтлина С.Ю., Пинаев Г.П. Флуоресцентные свойства и определение содержания нативного актина в его препаратах. // Биохимия. 1975. Т. 40. Вып. 2. С. 316-322.

36. Туроверов К.К., Щелчков Б.В. Исследование тепловой денатурации белков с помощью двухволнового метода регистрации изменений спектра их ультрафиолетовой флуоресценции //Биофизика. 1970. Т. 15. №.6. С. 965-972.

37. Тупоногов В.Н., Куренной А.А. Малоглазый макрурус // Биологические ресурсы Тихого океана. М.: Наука. 1986. С. 233-241.

38. Филатов В.Л., Катруха А.Г., Буларгина Т.В., Гусев Н.Б. Тропонин: строение, свойства и механизм функционирования // Биохимия. 1999. Т. 64. Вып. 9. С. 1155-1174.

39. Фрейдина Н.А., Орлова А.А., Подлубная З.А. Электронно-микроскопическое исследование структуры С-белка и его взаимодействия с миозином, фрагментами миозина и актином. В кн.: Структурные основы и регуляция биологической подвижности. М. 1980. С. 160-163.

40. Хочачка П., СомероДж. Биохимическая адаптация. М.: Мир. 1988.

41. Чучукало В.И., Кодолов Л.С., Тупоногов В.Н. Характеристика питания некоторых массовых и глубоководных рыб в северо-западной части Тихого океана // Владивосток: ТИНРО. 1990. Деп. во ВНИЭРХ. № 1113-рх90.

42. Шелудъко Н.С., Пинаев ГЛ. Регуляторные белки миофибрилл, взаимодействующие с Ф-актином. В кн. Биофизика и биохимия мышечного сокращения. М.: Наука. 1976. С. 164-170.

43. Шелудъко Н.С. Исходные экстракты в методах выделения сократительных белков. В кн.: Биофизические и биохимические методы исследования мышечных белков. JL: Наука. 1978. С. 23-40.

44. Эфтинк М.Р. Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков // Биохимия. 1998. Т.63. №.3. С. 327-337.

45. Adelstein R., Pollard Т., Kuehl W. Isolation and characterization of myosin and two myosin fragments from human blood platelets // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1971. Vol. 68. P. 2703-2707.

46. Adelstein R., Conti M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin atpase Activity //Nature. 1975. Vol. 256. P. 597-601.

47. Aeschlimann D., Paulsson M. Transglutaminases: protein cross-linking enzymes in tissues and body fluids // Thromb. Haemost. 1994. Vol. 71. P. 402-415.

48. Aeschlimann D., Koeller M., Allen-Hoffmann В., Mosher D. Isolation of a cDNA encoding a novel member of the transglutaminase gene family from human keratino-cytes // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 3452-3460.

49. Ando H., Adachi M., Umeda K., Matsura A. Purification and characteristics of novel transglutaminase derived from microorganisms // Agric. Biol. Chem. 1989. Vol. 53. №10. P. 2613-2617.

50. Araki H., Seki. Comparison of reactivity of transglutaminase to various fish actomyosins//Nippon Suisan Gakkaishi. 1993. Vol. 59 (4). P. 711-716.

51. Avdeev G. Plerocercoids of some Cestoda as bioindicators of the population structure of Podonema longipes // Parasitology and pathology of marine organisms of the World Ocean (NOAA Tech. rep. NMFS). 1986. Vol. 25. P. 79-82.

52. Bailey K. Tropomyosin: a new asymmetric protein of muscle // Nature. 1946. Vol. 157. P. 368-369.

53. Bailey K. Tropomyosin: a new asymmetric protein component of muscle fibril // J. Biochem. 1948. Vol. 43. №2. P. 271-279.

54. В ail in G., Barany M. Studies on Actin-Actin and Actin-Myosin Interaction // 1967. Biochim. Biophys. Acta. Vol. 140. P. 208-213.

55. Banse K. The vertical distribution of zooplankton in the sea // Progress in Oceanography. 1964. Vol. 2. P. 53-125.

56. Barany M., Nagy В., Finkelman F., Chrambach A. Studies on the Removal of the Bound Nucleotide of Actin // J. Biol. Chem. 1961. Vol. 236. P. 2917-2924.

57. Bergamini C. GTP modulates calcium binding and cation-induced conformational changes in erythrocyte transglutaminase //FEBS Lett. 1988. Vol. 239. P. 255-258.

58. Blanchoin L., Amann K., Higgs H., Marchand J., Kaiser D. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/SCAR proteins//Nature. 2000. Vol. 404. P. 1007-1011.

59. Bligh E., Dyer W. A rapid method for total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. Vol. 37. №8. P. 911-917.

60. Bottenus R., Ichinose A., Davie E. Nucleotide sequence of the gene for the b subunit of human factor XIII // Biochem. 1990. Vol. 29. P. 11195-11209.

61. Brett J., Groves T. Physiological energetics. In: Fish Physiology, ed. Hoar W., Randall D., Brett J. New York.: Academic Press. 1979. Vol. 7. P. 279-352.

62. Bruggmann S., Jenny E. The immunological specificity of myosins from cross-strained muscles as revealed by quantitative microcomplement fixation and enzyme inhibition by antisera // Biochem. Biophys. 1975. Vol. 412. P. 39-43.

63. Chanyongvorakul Y, Matsumura Y., Sakamoto H., et al. Gelation of beans 11S globulins by Ca -independent transglutaminase // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. Vol. 58(5). P. 864-869.

64. Chanyongvorakul Y., Matsumura Y, Nohaka M. et al. Physical properties of soy bean and broad bean 1 IS globulin Gels formed by transglutaminase reaction // J. Food Sci. 1995. Vol. 60(3). P. 483-493.

65. Chen J., Mehta K. Tissue transglutaminase: an enzyme with a split personality //Cell Biology. 1999. Vol. 31. P. 817-836.

66. Cheng C., Parrish F. Heat-induced changes in myofibrillar proteins of bovine longissimus muscle //J. Food Sci. 1979. Vol. 44. P. 23-26.

67. Childress J., Nygaard M. The chemical composition of midwater fishes as a function of depth of occurrence off Southern California // Deep-Sea Res. 1973. Vol. 20. 1093-1100.

68. Childress J. Are there physiological and biochemical adaptations of metabolism in deep-sea animals? // Trends Ecol. Evol. 1995. Vol. 10. P. 30-36.

69. Condeelis J. The isolation of microquantities of myosin from Amoeba proteus and Chaos carolinensis // Anal. Biochem. 1977. Vol. 78. P.374-394.

70. ConnelJ., Howgate P. Studies on the properties of skeletal muscle // Biochem. J. 1959. Vol. 71. №1. P. 83-86.

71. Соре М., Whisstock J., Rayment I., Kendrick-Jones J. Conservation within the myosin motor domain: implications for structure and function // Structure. 1996. Vol. 4. P. 969-987.

72. Cummins P., Perry S. Chemical and immunochemical characteristics of tropomyosins from striated and smooth muscle // Biochem. J. 1974. Vol. 141(1). P. 43-49.

73. Dayton P., Hessler R. Role of biological disturbance in maintaining diversity in the deep sea // Deep-Sea Research 1972. Vol. 19. P. 199-208

74. Dickinson E. Hydrocolloids at interfaces and the influence on the properties of dispersed systems //Food Hydrocolloids. 2003. Vol. 17. P. 25-39.

75. Duran M., Junqua J., Schmitter C. et al. Purification, characterisation, and gene cloning of transglutaminase from Streptoverticillium cinnamoneum CBS 683.68 // Biochem. 1998. Vol. 80. P. 313-319.

76. Ebashi S., Lippman F. Adenosine triphosphata linked concentration of calcium ions in particulate fraction of rabbit musculs // J. Cel. Biol. 1962. Vol. 14. P. 389-400.

77. Ebashi S., Endo M. Calcium ion and muscle contraction // Progr. Biophys. Mol. Biol. 1968. Vol. 18. P.123-129.

78. Ebashi S., Endo M., Ohtsuki I. Control of muscle contraction // Quart. Rev. Biophys. 1969. Vol. 2. P. 351-384.

79. Ebashi S., Kodama A. Troponin. Preparation and physiological function // J. Biochem. 1968. Vol. 64. P. 465-477.

80. Fes us L., Piacentini M. Transglutaminase 2: an enigmatic enzyme with diverse function // Trends in Biochem. Sci. 2002. Vol. 27. P. 534-539.

81. Finlayson В., Lymn R., Taylor E. Studies on the Kinetics of formation and dissociation of the actomyosin complex // Biochem. 1969. Vol. 8. P. 811-817.

82. FofonoffN. P. Physical properties of sea-water in: The sea, ed. M. Hill. N. Y.: 1962. Vol. 1.

83. Folk J., Chung S. Molecular and catalytic properties of transglutaminases // Adv. Enzymol. 1973. Vol. 38. P.109-191.

84. Folk J. Transglutaminases // Annu. Rev. Biochem. 1980. Vol. 49. P. 517-531.

85. Fisher D., Wang G., Tobacman L. NH2-terminal truncation of skeletal muscle troponin T does not alter the Ca2+ sensitivity of thin filament assembly // J.Biol.Chem. 1995. Vol. 270. P. 25455-25460.

86. Janssens B.J., Childress J.J., Baguet F., Rees J-F. Reduced enzymatic anti-oxidative defense in deep-sea fish // The J. of Exp. Biology. 2000. Vol. 203. P. 3717-3725.

87. Hama H., Maruyama K., Noda H. Natural F-Actin. I. Direct Isolation of F-Actin from Myofibrils and Its Physico-Chemical Properties // Biochim. Biophys. Acta. 1965. Vol. 102. P. 249-253.

88. Hashimoto R., Watanabe M., Koyachi S. Biological studies on the gadiform fishes in the deep sea area of the north-eastern Japan // Bull. Tohoku red. Fish. Res. Lab. 1982. №44. P. 1-24.

89. Haedrich L., Henderson R. Pelagic food of Coryphaenoides armatus, a deep benthic rattail //Deep-Sea Research. 1974. Vol. 21. P. 739-744.

90. Hanson J., Lowy J. The Structure of F-Actin and of Actin Filaments Isolated from Muscle // J. Mol. Biol. 1963. Vol. 6. P. 46-52.

91. Hesketh J., Virmaux N., Mandel P. Purification and characterization of myosin from bovine retina // Biochim. et Biophys. Acta. 1978. Vol. 542. P.39-46.

92. Hochachka P. Somero N. Biochemical adaptation: Mechanism and process in physiological evolution. Oxford University Press: New York. 2002.466 p.

93. Humphreys J., Cummins P. Regulatory proteins of the myocardium atriar and ventricular tropomyosin and troponin-I in the developing and adult bovine and human heart // J. Mol. Cell Cardiol. 1984. Vol. 16. P.643-657.

94. Huang Y., Seguro K., Motoki M., Tawada K. Cross-linking of cohtractile proteins from skeletal muscle by treatment with microbial transglutaminase // J. Biochem. 1992. Vol. 112. P. 229-234.

95. Ichinose A., Bottenus R.E., Davie E.W. Structure of transglutaminase // J.Biol.Chem. 1990. Vol.265. № 23. P.13411-13414.

96. Ichinose A., Davie E. Characterization of the gene for the «а» subunit of human factor XIII (plasma transglutaminase), a blood coagulation factor // Proc. Natl Acad. Sci. USA 85. 1988. P. 5828-5833.

97. Iismaa S., Chung L., Wu M.J., Teller D.C., Yee V.C., Graham R.M. The core domain of the tissue transglutaminase Gh hydrolyzes GTP and ATP // Biochemistry. 1997. Vol. 36. P. 11655-11664.

98. Ikura К., Goto M., Yoshikawa M., et. al. Use of transglutaminase. Reversible blocking of aminogroups in substrate proteins for high yield of specific products // Agric. Biol. Chem. 1984. Vol. 48(9). P. 2347-2354.

99. Ikura К., Okumura K., Yoshikawa M., et. al. Incorporation of lysyldipeptides into food protein by transglutaminase //Agric. Biol. Chem. 1985. Vol. 49(6). P. 1877-1878.

100. Ikura K., Nasu Т., Yokota H., Tsuchiya Y., Sasaki R., Chiba H. Amino acid sequence of guinea pig liver transglutaminase from its cDNA sequence // Biochemistry. 1998. Vol. 27. P. 2898-2905.

101. Ishikawa H. Fine structure of skeletal muscle. In: Cell and muscle Motility. N.Y.: Plenum Press. 1983. P. 1-40.

102. Ishizaki S., Tanaka M., Takai R., Taguchi T. Stability of fish myosins ahd their fragmehyts to high hydrostatic pressure // Fish. Sci. 1995. Vol. 61. P. 989-992.

103. Iwamoto Т., Stein D. L. A systematic review of rattail fishes (Macrouridae: Gadiformes) from Oregon and adjaceht waters // Occasional Papers of the California Academy of Sciences. 1974. Vol. 111. P. 1-79.

104. Gazith J., Himmelfarb S., Harrington W.F. Studies on the subunit structure of myosin //J. Biol. Chem. 1970. Vol. 245. P. 15-18.

105. Gentile V., Thomazy V., Piacentini M., Fesus L., Davies P.J.A. Expression of tissue transglutaminase in Balb-C 3T3 fibroblasts: effects on cellular morphology and adhesion//! Cell Biol. 1992. Vol. 119. P. 463-474.

106. Gentile V., Davies P.J.A., Baldini A. The human tissue transglutaminase gene maps on chromosome 20ql2 by in situ uorescence hybridization // Genomics. 1994. Vol. 20. P. 295-297.

107. Gibbs A. Deep-sea Fishes. New York.: Academic Press. 1997. P. 239-278.

108. Greaney G.S., Somero G.N. Effects of anions on the activation thermodynamics and fluorescence emission spectrum of alkaline phosphatase: evidence for enzyme hydration changes during catalysis //Biochemistry. 1979. Vol. 18. P. 5322-5332.

109. Greaser M.L., Gergely J. Reconstitution of troponin activity from three protein components // J. Biol. Chem. 1971. Vol. 246. P. 4226-4233.

110. Greenberg C.S., Birckbichler P.J., Rice R.H. Transglutaminases: multifunctional cross-linking enzymes that stabilize tissues // FASEB J. 1991. Vol. 5. P. 3071-3077.

111. Griffn M, Wilson J. Detection of e(g-glutamyl) lysine // Molec. Cell. Bio-chem. 1984. Vol. 58. P. 37-49.

112. Kang H., Cho YD. Purification and properties of transglutaminase from Soybean leaves 11 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 223. P. 288-292.

113. Kanaji Т., Ozaki H., Такао Т., Kawajiri H., Ide H., Motoki M., Shimonishi Y. Primary structure of microbial transglutaminase from Streptoverticillium sp. strain s-8112 II J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 11565-11572.

114. Kato Т., Tonomura Y. Identification of myosin in Nitell flexilis // J. Biochem. 1977. Vol. 82. P. 777-782.

115. Kato S., Konno K. Isolation of carp myosin rod and its structural stability II Nippon Suisan Gakkaishi. 1993. Vol. 59(3). P. 539-544.

116. Kawasaki H., Kretsinger R.H. Calcium-binding proteins // Protein profile. 1994. Vol. 1. P. 343-390.

117. Kim J., Morita J., Ishioroshi M., Samejima K. Effect of divalent cations on heat-induced gelation of chicken gizzard myosin // Anim. Sc. J. 2001. Vol. 72(10). P. 564569.

118. Kimura I., Sugimoto M., Toyoda K, et. al. A study on the cross-linking reaction of myosin in kamaboko "suwari" gels //Nippon Suisan Gakkaishi. 1991. Vol. 57(7). P. 1389-1396.

119. Lai T-S., Bielawsda A., Peoples K.A., Hannun Y.A., Greenberg C.S. Sphingo-sylphosphocholine reduces the calcium ion requirement for activating tissue transglutaminase//J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 16295-16300.

120. Leavis P.C., Gergely J. Thin filament proteins and thin filament linked regulation of vertebrate muscle contraction // CRC Crit. Rev. Biochem. 1984. Vol. 16. P. 235-305.

121. Lee N. H., seki N., Kato N., et. al. Changes in myosin heavy chain and gel forming ability of salt-ground meat from Hoki // Nippon Suisan Gakkaishi. 1990. Vol. 56(12). P. 2093-2101.

122. LorandL., ConradS. Transglutaminases. // Molec. Cell.Biol. 1984. Vol. 58. P.9.35.

123. Low P.S., Somero G.N. Pressure effects on enzyme structure and function in vitro and under simulated in vivo conditions // Сотр. Biochem. Physiol. 1975. 52B. P. 6774.

124. MakA.S., Smillie L.B., Stewatr G.R. The comparison of amino acid sequences of rabbit skeletal muscle a- and P-tropomiosins. J.Biol.Chem. 1980. Vol. 255. P. 36473655.

125. Macpherson E. Ecological overlap between macrourids in the western Mediterranean Sea // Marine Biology. 1979. Vol. 53. P. 149-159.

126. Maruyama K., Gergely J. Interaction of Actomyosin with Adenosine Triphosphate at Low Ionic Strength. I. Dissociation of Actomyosin During the Clear Phase // J. Biol. Chem. 1962. Vol. 237. P. 1095-1099.

127. Maruyama K. Effect of actinins on the adenosinetriphosphatase activity of actomyosin at low ionic strength // Biochem. Z. 1966. Vol. 345. P. 108-114.

128. Mauchline J., Gordon J.D.M. Diets and bathymetric distributions of the macrourid fish of the Rockall Trough, northeastern Atlantic Ocean // Marine Biology. 1984. Vol. 81. P. 107-121.

129. Mauchline J., Gordon J.D.M. Foraging strategies of deep-sea fish // Marine Ecology Progress Series. 1986. Vol. 27. P. 227-238.

130. Merrett N.R. Demersal ichthyofaunal distribution in the abyssal eastern North Atlantic, with special reference to Coryphaenoides armatus (Macrouridae // J. of the Marine Biological Association of the UK. Vol. 72. P. 5-24.

131. Mooseker M.S., Cheney R.E. Unconventional Myosins // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1996. Vol. 11. P. 633-675.

132. Mori Y., Horie N., Tsuchiya 71, Matsumoto J. Characterization of adenosi-netriphosphatase of squid actomyosin // Bull. Japan Soc. of Sci. Fisheries. 1980. Vol. 46. №12. P. 1533-1537.

133. Morita T. Amino acid sequences of alpha-skeletal muscle actin isoforms in two species of rattail fish, Coryphaenoides acrolepis and Coryphaenoides cinereus // Fish. Sci. 2000. Vol. 66. P. 1150-1157.

134. Morita T. Structure-based analysis of high pressure adaptation of a-actin // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. № 30. P. 28060-28066.

135. Motoki M., Nio N. Cross-linking of different proteins by transglutminase // J. Food Sci. 1983. Vol. 48(2). P. 561-566.

136. Nakanishi K., Nara K., Hagiwara H., Aoyama Y., Ueno H., Hirose S. Cloning and sequence analysis of cDNA clones for bovine aortic-endothelial-cell transglutaminase // Eur. J. Biochem. 1991. Vol. 202. P. 15-21.

137. Nishimoto S., Hashimoto A., Seki., et. al. Influencing factors on changes in myosin heavy chain and jelly strength of salted meat paste from Alaska Pollack during setting // Nippon Suisan Gakkaishi. 1987. Vol. 53(11). P. 2011-2020.

138. Nonaka M., Tanaka Н., Okiyama A., et. al. Polymerization of several proteins by Ca -indepent transglutaminase derived from microorganisms //Argic. Biol. Chem. 1989. vol. 53(10)-P. 2619-2623.

139. Nowsad A., Kanoh S., Niwa E. Effect of amine salts on the elasticity of suwary gel from alasks Pollack //Nippon Suisan Gakkaishi. 1993. Vol. 59(6). P. 1017-1021.

140. Numakura t., Seki N., Kimura I., et. al. Cross-linking reaction of myosin in the fish paste during setting (suwari) // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1985. Vol. 51(9). P. 15591565.

141. Numakura t., Seki N., Kimura I., et. al. changes in the SDS-gel filtration pattern of muscle proteins in salted fish meat paste during setting (suwari) // Nippon Suisan Gakkaishi. 1987. Vol. 53(11). P. 2045-2049.

142. Oakenfuul D.G. Food gels // Food Research Quart. 1984. Vol. 44.(3). P. 4950.

143. Olah G.A., Trewhella J.A. Model structure of the muscle protein complex Ca , troponin C, troponin I derived from small-angle scattering data 11 Biochem. 1994. P. 12800-12806.

144. Ohsura K., Inoue A. Identification of myosin in a flowering plant Egeria densa II J. Biochim. 1979. Vol. 85. P. 375-378.

145. Parry D.A.D. Structure of rabbit skeletal myosin. Analysis of amino acid sequences of two fragments from the rod region // J. Mol. Biol. 1981. Vol. 153. P. 459-464.

146. Perry S.V., Davies V., Hayter D. "Natural" tropomyosin and the factor sensitizing actomyosin adenosine-triphosphatase to ethylenedioxybis-(ethyleneamino)-tetraacetic acid // Biochem. J. 1966. Vol. 99. P. 1-2.

147. Perry S.V. Vertebrate tropomyosin: distribution, properties and function // J. Muscle Res. Cell Motil. 2001. Vol. 22. P. 5-49.

148. Piacentini M., Ceru M.P., DiniL., Rao M.D., Piredda L., Thomazy V., Davies P.J.A., Fesus L. In vivo and in vitro induction of tissue transglutaminase in rat hepatocytes by retinoic acid // Biochim. Biophys. Acta. 1992. Vol. 1135. P. 171-179.

149. Pollack G.A. Muscles and Molecules. Seattle: Ebher and Sons Publ. 1990. 3001. P

150. Pollard T.D., Кот S.K. Acanthamoeba myosin-I. Isolation from Acan-thamoeba castellanii of an enzyme similar to muscle myosin // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248. P. 4682-4690.

151. Potter J.D. The content of troponin, tropomyosin, actin and myosin in rabbit skeletal muscle myofibrils //Arch. Biochem. Biophys. 1974. Vol. 162. P. 436-441.

152. Potter J.D., Sheng Z, Pan B.S., Zhao J. A direct regulatory role for troponin T and a dual role for troponin С in the Ca2+ regulation of muscle contraction // J.Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 2557-2562.

153. Rass T.S. Deep-sea fishes of the Nothem Pacific and Far Eastern Seas // XVth International Congress Zool. sekt. III. paper 34. 1959. P. 1-2.

154. Sedberry G.R., Musick J.A. Feeding strategies of some demersal fishes of the continental slope and rise off the mid-Atlantic coast of the USA // Marine Biology. 1978. Vol. 44. P. 357-375.

155. Seki N., Uno #., Lee., Kimura I., Toyoda K., Fujita Т., Arai К. Transglutaminase activity in Alaska polloack muscle and its reaction with myosin В // Nippon Suisan Gakkaishi. 1990. Vol.56. P.125-132.

156. Siebel B.A., Thuesen E. V., Childress J.J. Gorodezky L.A. Decline in pelagic cephalopod metabolism with habitat depth reflects differences in locomotory efficiency // Biol. Bull. 1997. Vol. 192. P. 262-278.

157. Siebenaller J.F., Murray T.F. The Effects of Hydrostatic-Pressure on Pertussis Toxin-Catalyzed Ribosylation of Guanine-Nucleotide-Binding Proteins from 2 Congeneric Marine Fish // Сотр. Biochem. and Physiol. 1994. Vol 108 (4). P. 423-430.

158. Shimizu Y., Karata S., Nishioka F. Extractability of proteins for fish skeletal muscle at low ionic strength//Bull. Jap. Soc. Sci.Fish. 1976. Vol. 42. №9. P. 1025-1031.

159. Shimomura M., Seki N. A comparative study on the regulatory proteins from fish ordinary and dark muscles // Bull, of the Jap. Soc. Of Sci. Fish. 1980. Vol. 46(9). P. 1159-1163.

160. Smethurst P. A., Grifin M. Measurement of tissue transglutaminase activity in a permeabilized cell system: its regulation by Ca2+ and nucleotides // Biochem. J. 1996. Vol. 313. P. 803-808.

161. Sperling J.E., Feldmann K., Meyer H., Jahnke U., Heilmeyer L.M.G. Isolation, characterization and phosphorylation pattern of the troponin complexes TI2C and I2C // Eur. J. Biochem. 1979. Vol. 101. P. 581-592.

162. Somero G.N. Adaptztion to hign hydrostatic pressure // Annu. Rev. Physiol. 1992. Vol. 54. P. 557-577.

163. Somero G.N., Bowlus R.D. Solute compatibility with enzyme structure and function. In: The Mollusca, ed. P.W. Hochachka. New York: Academic Press. 1983. P. 77100.

164. Spooner В., Yamada K., Wessells N. Microfilaments and Cell Locomotion // J. Cell Biol. 1971. Vol. 49. P. 595-601.

165. Spiess F.N., Macdonald K.C., Atwater Т., et. al. East Pacific rise: hot springs and geophysical experiments // Science. 1980. Vol. 207. P. 1421-1433.

166. Staprans I., Watanabe S. Optical properties of troponin, tropomyosin and relaxing protein of rabbit skeletal muscle // J. Biol. Chem. 1970. Vol. 245. P. 5962-5966.

167. Stein D.L., Pearcy W.G. Aspects of reproduction, early life history, and biology of Macrourid fishes off Oregon USA // Deep-Sea Research I. 1982. Vol. 29. (11 A). P. 1313-1329.

168. Swezey R.R., Somero G.N. Pressure effects on actin self-assembly: interspecific differences in the equilibrium and the kinetics of the G to F transformation // Biochem. 1985. Vol. 24(4). P. 852-860.

169. Takeda H., Seki N. Enzyme-catalyzed cross-linking and degradation of myosin heavy chain in Walley Pollack surimi paste during setting // Fish. Sci. 1996. Vol. 62. P. 462467.

170. Takahashi N. Takahashi Y., Putnam F. W. Primary structure of blood coagulation factor XHIa (fibrinoligase, transglutaminase) from human placenta // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. Vol. 83. P. 8019-8023.

171. Taguchi Т., Kikuchi К., Tanaka М., Suzuki К. Heat coagulation of fish actin // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1979. Vol. 45. №5. P. 639-642.

172. Taguchi Т., Ishizaka H., Tanaka M., Nagashima Y., Amano K. Protein-protein interaction offish myosin fragments // J. Food Sci. 1987. Vol. 52. №.4. P. 1103-1104.

173. Tellez-Luis S., Ramirez J., Vazquez M. Application in restructured fish products of transglutaminase obtained by Strepto verticillum ladakanaum in media made from hydrolysates of sorghum straw // J. of Food Sci. 2004. Vol. 69. P.

174. Thomazy V, Fesus L. Differential expression of tissue transglutaminase in human cells. An immunohisto-chemical study // Cell. Tissue Res. 1989. Vol. 255. P. 215224.

175. Tobacman L.S. Thin filament-mediated regulation of cardiac contraction // Annu. Rev. Physiol. 1996. Vol. 58. P. 447-481.

176. Tsukamasa Y., Shimizy Y. Setting property of Sardine and Pacific Mackerel meat // Nippon Suisan Gakkaishi. 1990. Vol. 56(7). P. 1105-1112.

177. Vaskovsky V.E., Latyshev N. Modified Jungnickel reagent for detecting phospholipid and phosphorus compounds on TLC chromatograms // J. Chromatogr. 1975. Vol. 115. P. 246-249.

178. Vaskovsky V.E. Phospholipids // Marine biogenic lipids, fats and oils. Boca Raton. Florida: CRC Press Inc. 1989. P. 199-242.

179. Vibert P., Craig R., Lehman W. Steric-model for activation of muscle thin filaments // J. Mol. Biol. 1997. Vol. 266. P. 8-14.

180. Violante V, Luongo A, Pepe I, Annunziata S, Gentile V. Transglutaminase-dependent formation of protein aggregates as possible biochemical mechanism for polyglu-tamine diseases // Brain Research Bull. 2001. Vol. 56. P. 169-172.

181. Yancey P.H., Fyfe-Johnson A.L., Kelly R.H., et. al. Triethylamine oxide counteracts effects of hydrostatic pressure on proteins of deep-sea teleosts // J. Exp. Zool. 2001. Vol. 289, P. 172-176.

182. Yasueda H., Nakanishi K., Kumazawa Y., Nagase K., Motoki M., Matsui H. Tissue-type transglutaminase from red sea bream (Pagrus major). Sequence analysis of the cDNA and functional expression in Escherichia coli IIFEBS Lett. 1995. Vol. 232. P. 411419.

183. Yates L.D., Greaser M.L. Troponin subunit sticheometry and content in rabbit skeletal muscle and myofibrils // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. P. 5770-5774.

184. Yee V.C., Pedersen L.C., Trong I.L., Bishop P.D., Stenkamp R.E., Teller D.C. Three-dimensional structure of a transglutaminase: human blood coagulation factor XIII // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 7296-7300.

185. Yildirim M., Hettiarachchy N.S. Biopolymers produced by cross-linking soybean 11S globulin with whey proteins using transglutaminase // J. of Food Sci. 1997. Vol. 62 (2). P. 270-275.

186. Wakabayashi Т., Huxley H. E., Amos L. A., KlugA. Three-dimensional image reconstruction of actin-tropomyosin complex and actin-tropomyosin-troponin-T-troponin-I complex // J. Mol. Biol. 1975. Vol. 93. P.477.

187. Watabe S., Hirayama Y., Imai J., Kikuchi K., Yamashita M. Sequences of cDNA clones encoding a-actin of carp and goldfish skeletal muscles // Fish. Sci. 1995. Vol. 61. P. 998-1003.

188. Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristallisation des Garungsferments Enolase // Biochem. Z. 1941. Vol. 310. P. 384-421.

189. Weeds A.G., Lowey S. Subsructure of the myosin molecule II. The light chains of myosin //J. Mol. Biol. 1971. Vol. 61. P. 701.

190. Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis // J. Biol. Chem. 1969. Vol. 224. P. 4406-4412.

191. Weber H., Portzehl H. Muscle contraction and fibrous muscle proteins // Adv. Prot. Chem. 1952. Vol. 7. P. 161-236.

192. Weraarchakul-Boonmark K., Jeong J.M., Murthy S.N.P., Engel J.D. Cloning and expression of chicken eiythrocyte transglutaminase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. Vol. 89. P. 9804-9808.

193. Willemijn L. Specificity of tissue transglutaminase explains cereal toxicity in coeliac disease // J. Exp. Med. 2002. Vol. 195. P. 643-649.

194. Wong A.J., Kiehart D.P., Pollard T.D. Myosin from human erythrocytes // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P.46-49.

195. Zhang J., Lesort M., Guttmann R.P., Johnson G. V. W. Modulation of the in situ activity of tissue transglutaminase by calcium and GTP. J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 2288-2295.

196. Zhu Y., Rinzema A., Tramper J. Medium design based on stoichiometric analysis of microbial transglutaminase production by streptoverticillium mobaraense // Biotech. Bioengin. 1996. Vol. 50. № 3. P. 291-298.