автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Применение трансглутаминазы в производстве ферментированных молочных продуктов

На правах рукописи

ДАНИЛОВ НИКОЛАЙ ПЕТРОВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЫ В ПРОИЗВОДСТВЕ ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность 05.18.07. - Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

- 3 ноя 2011

Санкт-Петербург 2011

4858816

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет низкотемпературных и пищевых технологий»

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Шлейкин А.Г.

Официальные оппоненты: доктор технических наук

Арсеньева Т.П. кандидат биологических наук Шарова Н.Ю.

Ведущая организация: Санкт-Петербургский торгово-экономический институт

Защита диссертации состоится шЬ_ 2011 г.

в 14 часов на заседании диссертационного Совета Д 212.234.02. при Санкт-Петербургском государственном университете низкотемпературных и пищевых технологий по адресу:

191002, г. Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, 9, тел./факс 315-30-15

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан « 7-'» У^/^У^_2011г.

Ученый секретарь диссертационного /

совета, доктор технических наук, . ./

профессор (^(¿/¿Л • Колодязная В.С.

(Г ^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Возможности применения ТГ в пищевых технологиях изучали: Максимова Ю.С., Шутова Е.Ю., Мотина Н.В., Якуш Я.В., Наседкин А.В, Горбатовский А.А., Шлейкин А.Г., ВошвсЬ М.Р., ЗсЬогбсЬ С. и др. Использование ТГ в производстве мясных и рыбных изделий даёт возможность получать термоустойчивые системы и снижать количество отходов. Однако субстратная специфичность ТГ к белкам, имеющим пищевое значение, и особенности применения ТГ в переработке молока изучены недостаточно. В литературе отсутствуют сведения о влиянии ТГ на иммунные свойства продуктов. Целенаправленное применение ТГ с целью получения пищевых продуктов с заданными свойствами, является перспективным и требует дальнейшего изучения.

Известно, что проблема потери белков сыворотки при производстве творога и сыра не решена во многих странах мира. Связывание сывороточных белков с помощью ТГ может позволить не только увеличить выход творога, но и повысить его биологическую ценность. Имеющиеся литературные данные о способности ТГ связывать молочные белки служат обоснованием для изучения применения фермента в молочной промышленности (ВбтвсЬ М.Р. е1 а1. (2007), БсЬогесЬ С. е1 а1. (2000), Ьогепгеп Р.СЬг. а1. (1999,2002)).

Ранее сообщалось, что модификация структуры белков влияет на их аллергенные свойства. Нарушение толерантности к белку злаков глютену служит причиной целиакии, приводящей к аутоиммунному поражению тонкого кишечника, поэтому больные целиакией вынуждены воздерживаться от употребления хлеба и других глютенсодержащих продуктов. Однако иммунные свойства глютена, модифицированного ТГ, оставались неизученными. Таким образом, изучение использования ТГ в пищевой биотехнологии с целью получения продуктов с новыми свойствами, представляется весьма актуальным.

Цель работы:

Теоретическое обоснование применения ТГ в модификации пищевых белков; исследование технологии творога и кисломолочных продуктов с использованием препарата ТГ.

Задачи исследования:

Изучить субстратную специфичность ТГ по отношению к бежам сыворотки молока и глютену пшеницы.

Исследовать действие ТГ на структуру творога.

Изучить влияние ТГ на выход творога.

Разработать технологические рекомендации по производству творога с применением ТГ.

Исследовать действие ТГ на остаточное содержание белка в молочной сыворотке.

Изучить совместимость сывороточных белков и глютена при действии ТГ. Выявить особенности совместного связывания КСБ и глютена.

Изучить иммунную активность продукта, полученного ферментативным связыванием КСБ и глютена.

Научная новизна:

- доказана субстратная специфичность трансглутаминазы к белкам растительного (плотен пшеницы) и животного (желатин, белки сыворотки молока) происхождения;

- установлено, что использование ТГ в технологии творога и ацидофильной пасты повышает биологическую ценность и увеличивает выход конечного продукта;

- установлено влияние ТГ на структурно-механические характеристики готовых изделий; определена эффективно действующая концентрация ТГ;

- доказано, что под действием ТГ изменяется иммунная активность глютена пшеницы, что открывает возможность расширения ассортимента продуктов для больных целиакией.

Практическая значимость. Доказана возможность применения ТГ в пищевых технологиях на примере связывания белков молочной сыворотки и глютена, а также получения творога и ацидофильной пасты. Предложены пути промышленного использования фермента трансглутаминазы в переработке молока.

Показана эффективность применения ТГ в производстве продукта на основе комбинирования белков животного и растительного происхождения.

Социально-экономический эффект выполненной работы определяется расширением ассортимента продукции, обладающей повышенной пищевой ценностью и лечебно-профилактическими свойствами, а также экономией традиционного сырья.

Проведена промышленная выработка творога в производственных условиях на ЗАО «Облмолпром». Разработан проект технической документации по производству творога с применением ТГ. Рассчитан экономический эффект предложенного способа переработки молока.

Получен патент № 2009141081 «Способ переработки молочной сыворотки», опубл. 10.05.2011, бюл. № 13.

Положения, выносимые на защиту:

1. Теоретическое обоснование использования трансглутаминазы для связывания молочных и растительных белков.

2. Использование трансглутаминазы для повышения выхода творога и повышения его биологической ценности.

3. Обоснование ферментативного способа утилизации белка сыворотки молока.

4. Использование трансглутаминазы для получения ацидофильного молока и ацидофильной пасты с повышенной биологической ценностью.

5. Применение трансглутаминазы для модификации иммунной активности пищевых белков.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих конференциях: 3rd Baltic Conference on Food Science and Technology "FoodBalt-2008", Jelgawa, 2008; Международная научно-практическая конференция «Инновационные технологии в пищевой и лёгкой промышленности», Алматы, 5-6 июня 2008; Всероссийская конференция «Научно-практические аспекты экологизации продуктов питания», РАСХН, Углич, 2008; VI юбилейная международная научная

конференция «Инновации в науке и образовании - 2008», Калининград, 2008; Международная научно-практическая конференция «Безопасность пищевых продуктов и товаров народного потребления», Алматы, 27-28 ноября 2008; 4th International Conference on "Quality and Safety in Food Production Chain", Wroclaw, Poland, 24 - 25 September 2009; IV Международная научно-техническая конференция «Низко-температурные и пищевые технологии в XXI веке» Санкт-Петербург, 2009 г.; Межрегиональная конференция с международным участием «Современные подходы к метаболической коррекции в профилактике и терапии», Санкт-Петербург, 4 декабря 2009 г. СПбГМА им. И.И. Мечникова; Четырнадцатая Санкт-Петербургская Ассамблея молодых учёных и специалистов, Санкт-Петербург, СПбГПУ, 2009; III Всероссийская конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека», Кемерово, 2010; XI Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии», Казань, 13-16 апреля 2010 г.; IV International Scientific Conference "Meat in technology and human nutrition", Poznan, Poland, 23 - 24.06.2010; 4-ая Конференция молодых учёных и специалистов Отделения «Хранения и переработки с/х продукции» РАСХН «Научно-инновационные технологии как основа продовольственной безопасности Российской Федерации», Москва, 9 декабря 2010 г.; Всероссийская научная конференция с международным участием «Дни биохимии в СПбГМУ», Санкт-Петербург, 13 - 15 марта 2011; 6th Baltic Conference on Food Science and Technology "Innovations for food science and production" FOODBALT-2011, Jelgava, Latvia, May 5-6, 2011; Ulh International Congress on Engineering and Food "Food process engineering in а changing world", Athens, Greece, May 22 - 26,2011.

Публикации. По результатам исследований опубликованы 23 печатные работы, из них одна в издании, рекомендованном ВАК РФ, оформлена заявка на патент.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка использованных источников и приложений. Работа изложена на 93 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков, 5 таблиц и 3 приложения. Список литературы состоит из 159 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность работы, сформулированы цель и задачи исследований, показаны научная новизна и практическая ценность применения трансглутаминазы в пищевых технологиях.

Обзор литературы. Обобщены научно-технические материалы отечественных и зарубежных авторов, характеризующие перспективность применения трансглутаминазы в пищевой промышленности, в том числе в производстве продуктов из растительного сырья. Проведенные информационные исследования показали целесообразность и научно-техническую актуальность работы, позволили сформулировать цель и задачи исследования.

Объекты и методы исследования. Схема проведения эксперимента представлена на рис. 1.

Рис. 1. Схема проведения эксперимента.

В работе использованы: молоко пастеризованное 2,5 % жирности; чистые культуры ацидофильной палочки L. acidophilum и мезофильных лактококков L. lactis; желатин пищевой; коллаген; концентрат сывороточных белков Hiprotal 535, обогащённый р-лактоглобулином (КСБ); ферментные препараты трансглутаминазы «Activa YG» и «Activa GS»; плотен.

При выполнении работы использовали стандартные органолептические, химические и физико-химические методы исследования. Количественное определение белка проводили биуретовым методом методом Лоури, Для определения активности ТГ использовали фотоколориметрический метод. Идентификация белковых фракций осуществлялась электрофорезом в полиакриламидном геле и гель-хроматографией; иммунную активность продуктов связывания оценивали иммуноферментным методом с использованием моноклональных антиглиадиновых антител; измерения консистенции творога проводились на ротационном вискозиметре «Реотест». Статистическая обработка результатов проводилась в программе Microsoft Excel.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ТГ катализирует реакцию ацильного переноса между у-карбоксиамидной группой глутаминового остатка белка или пептида (ацил-донор) и первичными

аминогруппами разнообразных аминосоединений (ацил-акцептор), включая е-аминогруппу лизинового остатка пептида по реакции:

I ^ I

Gin— С—NH2+H2N— Lys-► Glu— С —NH—R + NH3

О ' О

В результате связывания остатков пептидов или белков глутамина и лизина образуются высокомолекулярные соединения, содержащие г-(у-глутамил)- лизиновые внутри- и межмолекулярные изопептидные связи. Образование этих связей оказывает влияние на структуру и функциональные свойства белков.

Изучение субстратной специфичности ТГ

В качестве белков животного происхождения в данной работе были исследованы 8 % раствор желатиноля, КСБ; субстратом растительного происхождения служил очищенный плотен. При связывании желатиноля в условиях опыта 40 % субстрата в течение 1,5 часов было связано ферментом. Таким образом, показано, что ТГ обладает хорошей специфичностью к желатину.

Установлена совместимость сывороточных белков и глютена при связывании ТГ (рис. 2).

Рис. 2. Связывание глютена (1), КСБ (2) и КСБ с глютеном (3). Как видно из рис. 2, скорость связывания исследованных белков составила: глютена - 5,1 мг/час; КСБ - 1,68 мг/час, при совместном связывании КСБ и глютена - 6,6 мг/час. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности совместного связывания КСБ и глютена.

Сравнение величин скоростей связывания свидетельствует об ускорении процесса при одновременном использовании двух субстратов: КСБ и глютена.

Влияние ТГ и неферментных белков на сквашивание молока

Изучалась кинетика сквашивания молока в присутствии добавок: неферментных белков (коллаген, желатин) и фермента ТГ. Определялась доля отделяющейся сыворотки при центрифугировании молочных сгустков, полученных сквашиванием молока ацидофильной палочкой. Полученные данные говорят о том, что, применяя неферментный белок в качестве добавки, можно улучшить скорость сквашивания молока, определяемую увеличением кислотности и относительной вязкостью сгустка. Ускорение может быть связано с тем, что коллаген выступает в роли носителя, на котором закрепляется микрофлора закваски. Иммобилизация Ь. аас1орЫ1ит, вероятно, способствует повышению её сквашивающей эффективности. В свою очередь, установлено, что внесение ТГ не оказывает влияния на скорость сквашивания.

В опытах по определению доли отделяющейся сыворотки при центрифугировании показано, что увеличение концентрации коллагена от 0 до 5 % масс, или желатина от 0 до 4 % масс, позволяет уменьшить долю выделившейся сыворотки. По-видимому, это связано со стабилизацией структуры сгустка, а также с увеличением водосвязывающей активности.

Применение ТГ позволяет уменьшить долю отделяющейся сыворотки: увеличение связывания сывороточного белка имеет экологическое значение, т. к. при выработке молочных продуктов (сыр, творог) образуются большие объёмы сыворотки, богатой белком, которая перерабатывается всего на 38 %, остальная часть сливается в сточные воды, что значительно ухудшает экологическую обстановку [18].

Получение ферментированных молочных продуктов с применением

ТГ.

Проводили сквашивание пастеризованного молока. В качестве сквашивающего агента выбрана ацидофильная палочка, т. к. она обладает более высокой сквашивающей способностью по сравнению с мезофильными стрептококками. Фотографии структуры полученных продуктов приведены на рис. 3.

Рис. 3. Структура продуктов, полученных сквашиванием молока с применением 1 % ТГ (выдержка 5 дней при + 4°С): а) контроль (без фермента); б) ацидофильная паста (с удалением сыворотки); в) ацидофильное молоко (без удаления сыворотки).

Применение ТГ повышает влагоудерживающую способность продукта. Это позволяет получить ацидофильное молоко с пониженным синерезисом, что даёт возможность продлить срок хранения продукта.

Использование ТГ в получении ацидофильной пасты, улучшает её структуру и обогащает продукт белками молочной сыворотки, обладающими высокой биологической и пищевой ценностью.

Проводили связывание сывороточных белков с помощью ТГ. Полученные образцы анализировали методом ПААГ-электрофореза.

Рис. 4. Электрофореграмма белков молочной сыворотки после действия ТГ. Концентрации ТГ в % масс.: 1 -1,0; 2 - 0,8; 3 - 0,6; 4 - 0,4; 5 - контроль.

На рис. 4 показано снижение площади пятен и интенсивности окрашивания основных белков молочной сыворотки - а-лактальбумина (а-ЬА), 14 кДа, и (3-лактоглобулина ((5-1Х}), 18-19 кДа, в образцах, инкубированных с препаратом ТГ по сравнению с контрольным образцом, (не содержащем ТГ), где идентифицируются белки а-ЬА и р-1Х} (зона 5). При увеличении количества ТГ в пробе от 0,4 до 0,8 % масс, (соответственно, зоны 4, 3 и 2) содержание белков снижается, что свидетельствует о зависимости связывания от концентрации ТГ. При концентрации ТГ 1 % масс, (зона 1) данные белки не обнаруживаются, что свидетельствует об их полном связывании.

С целью идентификации белковых фракций КСБ, подвергшихся связыванию под действием ТГ, был проведен анализ опытных образцов методом гель-хроматографии на Сефадексе 0-75. Результаты представлены на рис. 5.

-«-О % ТГ -»-0,1 % ТГ —0,4 % ТГ -*-0,6 % ТГ -*-0,8 % ТГ -#-1 % ТГ

Рис. 5. Результаты гель-хроматографического исследования белков КСБ после инкубирования с препаратом ТГ в концентрациях от 0 до 1 % масс. На оси абсцисс - молекулярной массы белков, на оси ординат - количество белка в пробе.

Как показано на рис. 5, в КСБ обнаружено 3 фракции белков, соответствующие молекулярными массам в логарифмической шкале ММ): 1 - среднем 3,55; 2 - от 4,33 до 4,48; 3 - в среднем 4,95. Под действием ТГ площади белковых пиков снижаются пропорционально возрастанию концентрации фермента. Различий специфичности ТГ по отношению к главным, по количественному содержанию, белкам 1 и 2 фракций не выявлено.

Применение ТГ для производства творога

В отличие от обычной технологии производства творога в молоко одновременно с закваской вносили ТГ и инкубировали до образования сгустка; полученный сгусток центрифугировали для отделения сыворотки (в связи с патентованием способа препарат и условия инкубирования не указываются).

Структура творога, полученного с использованием ТГ, является более прочной. Инкубация молока с ТГ приводит к модификации казеиновых мицелл, которые становится сложно разъединить, чем, вероятно, и объясняется зернистость и прочность структуры полученного продукта.

Органолептическая оценка творога показала, что добавление ТГ позволяет получить творог не хуже контрольного образца по качеству.

Структурно-механические свойства полученных образцов творога были проанализированы на ротационном вискозиметре «Реотест». Зависимость логарифма эффективной вязкости образцов творога от градиента скорости при разных концентрациях ТГ представлена на рис. 6.

Рис. 6. Влияние ТГ на вязкость творога: слева - контроль; справа - 1 % ТГ; прямой ход ротора показан синим цветом, а обратный - красным.

Приведённые на рис. 6 экспериментальные данные позволяют заключить, что применение ТГ способствует улучшению структурно-механических свойств продукта, лучшей восстанавливаемости структуры, что является важным при хранении и транспортировке продукта.

Ферментативная модификация глютена с помощью ТГ

Целиакия - хроническое, прогрессирующее заболевание, при котором поражается слизистая оболочка тонкого кишечника. Этиология целиакии до конца не выяснена, но установлено, что болезнь провоцируется употреблением в пищу глютенсодержащих продуктов из пшеницы, ржи, овса, ячменя и др. злаков. Возможным подходом к профилактике рецидивов целиакии может служить химическая модификация эпитопов глютена, способных образовывать иммунотропные комплексы с тТГ. Поскольку решающую в комплексообразовании глютена с тТГ играют глутаминовые остатки глиадина, являющегося субстратом и для бактериальной ТГ, представлялось интересным исследование возможности модификации глютена путём связывания его с другими белками с помощью бактериальной ТГ. Перспективными в этом отношении являются белки сыворотки молока, по отношению к которым бактериальная ТГ проявляет удовлетворительную специфичность. В данном опыте КСБ и глютен инкубировали в соотношении 1:1 при 37 °С в течение 60 мин. в присутствии 1 % ТГ и отбирали пробы каждые 15 мин. После отделения осадка путём центрифугирования и фильтрования через бумажный фильтр в надосадочной жидкости определяли остаточные количества несвязанного белка методом Лоури. Показано, что ТГ снижает содержание растворимых белков в образцах пропорционально времени инкубирования. Ранее нами было установлено, что при совместном инкубировании КСБ и глютена скорость ферментативного связывания оказалась выше, чем в опытах по связыванию отдельно КСБ и глютена и составила 6,6 мг белка/ч. Значительная часть белков субстратной смеси в результате взаимного связывания потеряла растворимость.

30 мин. 45 мин.

Рис. 7. Электрофореграмма смеси белков КСБ и глютена после совместного инкубирования в присутствии ТГ (1 % масс.)

На рис. 7 показаны пятна, соответствующие КСБ и глютену по отдельности, а также в смеси (0 мин.). Через 15 мин. инкубирования наблюдали снижение интенсивностей пятен, соответствующих КСБ и глютену, что свидетельствует о снижении количеств растворимых белков вследствие связывания их с помощью ТГ в неподвижные конгломераты. После 30 мин. инкубирования интенсивность пятен для КСБ и глютена снизилась в большей степени, причём для глютена сильнее, чем для КСБ. Через 45 мин. глютен связался практически полностью, соответствующее глютену пятно исчезло. Большая часть белков КСБ также связались, о чём свидетельствует почти полное исчезновение соответствующего пятна.

Таким образом, интенсивность и подвижность пятен, соответствующих глютену и сывороточным белкам, снижаются в процессе инкубирования; это свидетельствует о конгруентности снижения свободных растворимых белков и является косвенным подтверждением связывания белков КСБ с глютеном.

Иммунную активность продукта связывания глютена с белками сыворотки определяли иммуноферментным методом (рис. 8). С этой целью использовали моноклональные антитела к глиадину классов ХОУ1, ХвУб, ХОУ16. Наиболее выраженные различия между контрольными и

КСБ

До 70 % белка связывается в течение одного часа с помощью ТГ.

Снижение концентрации растворимого белка в пробах свидетельствует о связывания белковых субстратов под действием ТГ. С целью выяснения, какие из белков исследуемой смеси связывались, было выполнено

остаточных белков смеси (рис. 7).

Глютен

0 мин.

15 мин.

______|

обработанными ТГ образцами глютена получены в опытах с антителами класса Х6У1. Результаты приведены на рис. 8.

_ и.аш О ¿6 0,700 - ;

1 1

X 5 0,500 | 1

С 0,400 К | 0,300 в 0,200 т 5 ОДОО с О о,ооо

0 1 0 Конц< 2 0 гнтрацв 3 0 [Я ТГ, О/ 4 0,5 0,6 о масс

Рис. 8. Влияние концентрации ТГ на количество моноклональных антител ХОУ1 к глютену в образцах, полученных инкубированием КСБ с глютеном. Время инкубирования 60 мин., разведение 1 к 5000.

На рис. 8 показано зависимое от концентрации ТГ снижение количества антител к глютену, что может свидетельствовать об уменьшении токсичности глютена для больных целиакией. Этот результат открывает новый путь к производству пищевых продуктов для питания больных целиакией, заключающийся в ферментативной модификации глютена.

ВЫВОДЫ

1. На основании экспериментальных исследований разработана технология творога с применением ферментного препарата ТГ, позволяющая повысить выход и биологическую ценность продукта за счёт включения сывороточных белков.

2. Установлена совместимость сывороточных белков и глютена при связывании ТГ. Выявлены особенности совместного связывания глютена и КСБ под действием ТГ. Скорости связывания белков сыворотки молока (КСБ), глютена и КСБ + глютен составили: 1,68 ± 0,12; 5,10 ± 0,48 и 6,60 ± 0,53 мг/час , соответственно, что говорит об ускорении процесса при совместном связывании двух субстратов.

3. Изучено влияние белковых добавок на сквашивание молока. Показано, что неферментные белковые вещества: коллаген и желатин -ускоряют сквашивание молока, а препарат ТГ, в исследованных концентрациях, на него не влияет.

4. Исследовано действие ТГ на остаточное содержание белка в молочной сыворотке. При сквашивании молока ацидофильной палочкой установлено снижение содержания растворимого белка в сыворотке на 80 % при применении ТГ в концентрации 1 % масс. При этом доля отделяющейся сыворотки снижается на 22 % по сравнению с контролем при продолжительности центрифугирования 60 мин.

5. Использование ТГ позволяет получить ацидофильные молочные продукты, обогащённые ценными белками молочной сыворотки с пониженным синерезисом.

6. Установлено ферментативное действие ТГ на структуру творога. Показано, что использование ТГ при производстве творога позволяет увеличить выход готового продукта на 15 %.

7. Установлено, что продукт, полученный путём ферментативного связывания глютена с сывороточными белками, обладает меньшим сродством к антителам против глютена, что открывает возможность производства глютенмодифицированных продуктов для больных целиакией.

8. Проведена промышленная выработка творога в производственных условиях на ЗАО «Облмолпром». Разработан проект технической документации по производству творога с применением ТГ. Экономический эффект составил 10213 руб. в расчёте на 1 т творога 9 %-ной жирности.

Работа поддержана грантом Правительства Санкт-Петербурга 2009 г.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Данилов Н.П., Шлейкин А.Г. Субстратная специфичность фермента трансглутаминазы. Сб. «Проблемы техники и технологии пищевых производств» Деп. в ВИНИТИ, № 535 - В, 2008 от 26.06.2008.

2. Shleikin A., Gorbatovsky A., Danilov N. The use of transglutaminase in food processing. 3rd Baltic Conference on Food Science and Technology "FoodBalt-2008", Jelgawa, 2008. - P. 51-53.

3. Горбатовский А.А., Шлейкин А.Г., Ишевский А.А., Данилов Н.П. Производство продуктов смешанного сырьевого состава с использованием трансглутаминазы // Материалы международной научно-практической конференции: Инновационные технологии в пищевой и лёгкой промышленности. - Алматы: Алматинский технологический университет, 5-6 июня 2008. - С. 5-6.

4. Шлейкин А.Г., Данилов Н.П., Петров А.Ю. Действие белковых добавок на отделение сыворотки при сквашивании молока // Материалы всероссийской конференции: Научно-практические аспекты экологизации продуктов питания. - Углич: ВНИИМС, 2008. - С. 323-325.

5. Данилов Н.П., Шлейкин А.Г. Влияние трансглутаминазы на консистенцию молочного сгустка И Материалы всероссийской конференции: Научно-практические аспекты экологизации продуктов питания. - Углич: ВНИИМС, 2008. - С. 82-84.

6. Шлейкин А.Г., Данилов Н.П., Петров А.Ю. Изучение связывания молочных белков. I. Влияние коллагена на сквашивание молока // Материалы VI юбилейной международной научной конференции: Инновации в науке и образовании - 2008. - Калининград: Калининградский государственный технический университет, 2008. - Ч. 1. - С. 329-331.

7. Шлейкин А.Г., Данилов Н.П., Красникова Л.В., Новосёлов А.Г. Применение трансглутаминазы в переработке мясного, рыбного и молочного сырья // Материалы международной научно-практической конференции:

Безопасность пищевых продуктов и товаров народного потребления. - Алматы: Алматинский технологический университет, 27-28 ноября 2008. - С. 5 - 6.

8. Шлейкин А.Г., Данилов Н.П., Шарапова Т.А. Технологические и медико-биологические аспекты действия трансглутаминазы. Известия Санкт-Петербургского государственного университета низкотемпературных и пищевых технологий, 3/4,2009. - С. 47 - 49.

9. Шлейкин А.Г., Данилов Н.П., Красникова JI.B. Влияние трансглутаминазы на связывание сывороточных белков. «Пищевая промышленность», 7,2009. - С. 9.

10. Shleikin A.G., Krasnikova L.V., Danilov N.P. Substrate specificity of transglutaminase. Influence of transglutaminase on milk whey protein cross-linking. "Food technology operations. New Vistas", monography, edited by W. Kopec and M. Korzeniowska, Wroclaw, 2009. - P. 101 -112.

11. Shleikin A.G., Krasnikova L.V., Danilov N.P. Substrate specificity of transglutaminase. Influence of transglutaminase on milk whey protein cross-linking. 4th International Conference on "Quality and Safety in Food Production Chain", Wroclaw, Poland, 24 - 25 September 2009. - P. 211 - 212.

12. Шлейкин А.Г., Данилов Н.П. Роль трансглутаминазы в модификации глютена и в развитии целиакии // Материалы IV международной научно-технической конференции: Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке. - СПб: Санкт-Петербургский государственный университет низкотемпературных и пищевых технологий, 25-27 ноября 2009. - С. 424 - 426.

13. Шлейкин А.Г., Данилов Н.П. Изучение связывания белков сыворотки молока микробной трансглутаминазой // Материалы межрегиональной конференции с международным участием: Современные подходы к метаболической коррекции в профилактике и терапии. - СПб: Санкт-Петербургская медицинская академия им. И.И. Мечникова, 4 декабря 2009. - С. 142 -144.

14. Данилов Н.П. Теоретические основы применения фермента трансглутаминазы в пищевых технологиях. Четырнадцатая Санкт-Петербургская Ассамблея молодых учёных и специалистов. - СПб: СПбГПУ,

2009. - С. 174.

15. Данилов Н.П., Шлейкин А.Г. Влияние трансглутаминазы на консистенцию творога // Материалы III всероссийской конференция студентов, аспирантов и молодых ученых: Пищевые продукты и здоровье человека. -Кемерово: Кемеровский технологический институт пищевой промышленности,

2010.-С. 20-21.

16. Данилов Н.П., Шлейкин А.Г. Применение фермента трансглутаминазы в производстве пищевых продуктов // Материалы XI международной конференции молодых ученых: Пищевые технологии и биотехнологии. - Казань: Казанский государственный технологический университет, 13-16 апреля 2010. - Ч. 1. - С. 248 - 251.

17. Shleikin A., Danilov N., Gorbatovski A., Ishevski A., Domoracki S. Use of binding enzymes in food treatment for technological and functional purposes. IV International Scientific Conference "Meat in technology and human nutrition", Poznan, Poland, 23 - 24.06.2010. - P. 163.

18. Бердышникова О.Н., Терновской Г.В., Данилов Н.П. Перспективы использования трансглутаминазы в хлебопечении // Материалы 4-ой конференции молодых учёных и специалистов Отделения «Хранения и переработки с/х продукции» РАСХН: Научно-инновационные технологии как основа продовольственной безопасности Российской Федерации. - М.: РАСХН, 9 декабря 2010. - С. 32-34.

19. Шлейкин А.Г., Данилов Н.П. Эволюционно-биологические особенности трансглутаминазы. Структура, физиологические функции, применение. «Журнал эволюционной биохимии и физиологии», Т. 47, № 1, 2011.-С. 3-14.

20. Терновской Г.В., Данилов Н.П. Разработка ферментных технологий для производства функциональных продуктов // Материалы всероссийской научной конференции с международным участием: Дни биохимии в СПбГМУ. - СПб: Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова, 13-15 марта 2011. - С. 59 - 60.

21. Shleikin A., Ternovskoy G., Danilov N. Enzyme technologies development in food industry. 6th Baltic Conference on Food Science and Technology "Innovations for food science and production" FOODBALT-2011, Jelgava, Latvia, May 5-6,2011.-P. 18.

22. Shleikin A.G., Danilov N.P., Ternovskoy G.V. Modification of food products properties by use of transglutaminase. 11th International Congress on Engineering and Food "Food process engineering in a changing world", Athens, Greece, May 22 - 26,2011. Congress Proceedings, v. I. - P. 663 - 664.

23. Шлейкин А.Г., Данилов Н.П. Патент № 2009141081 «Способ получения молочной сыворотки с пониженной концентрацией остаточного белка», опубл. 10.05.2011, бюл. № 13.

Подписано к печати Л. Ш. II Формат 60x80 1/16. Бумага писчая.

Печать офсетная. Печ. п.1.0- Тиражей экз. Заказ № 197. СПбГУНиПТ. 191002, Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, 9 ИИК СПбГУНиПТ. 191002, Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, 9

СПИСОК АББРЕВИАТУР И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. Обзор литературы.

1.1. Характеристика каталитических свойств трансглутаминазы.

1.1.1. Субстратная специфичность трансглутаминазы.

1.1.2. Связывание белков животного происхождения.

1.2. Применение ТГ в производстве пищевых продуктов.

1.2.1. Производство молочных продуктов.

1.2.2. Производство комбинированных продуктов (продуктов сложного сырьевого состава).

2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

Методы исследования.

1. Получение творога из СОМ кислотным способом.

2. Промышленное получение творога.

3. Получение ацидофильного молока и ацидофильной пасты.

4. Изучение влияния белковых добавок на процесс сквашивания молока.

5. Изучение совместного связывания белков животного и растительного происхождения.

2.2.6. Определение вязкости молочных сгустков.!.

2.2.7. Изучение вязкостных характеристик творога на ротационном вискозиметре «Реотест».

2.2.8. Определение пенетрации творога на пенетрометре ПМДП.

2.2.9. Определение концентрации растворённого белка биуретовым методом.

2.2.10. Определение белка по Лоури.

2.2.1 1. Проведение электрофореза.

2.2.12. Проведение гель-хроматографии.

2.2.13. Проведение иммуно-ферментного анализа с использованием моноклональных антител мыши к глиадину.

2.2.14.Определение сухого остатка молока и молочных продуктов.

2.2.15. Определение влаги в твороге на приборе Чижовой.

2.2.16. Определение активности гамма-глутамилтранспептидазы.

2.3. Постановка эксперимента.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Изучение субстратной специфичности ТГ. Исследование влияния ТГ на белки животного и растительного происхождения.

3.2. Исследование влияния неферментных добавок на процесс сквашивания молока.

3.3. Влияние трансглутаминазы на процесс сквашивания молока.

3.4. Связывание белков молочной сыворотки. Получение ацидофильного молока и ацидофильной пасты.

3.5. Применение ТГ в производстве творога.

3.6. Ферментативная модификация глютена с помощью ТГ.

ВЫВОДЫ.

Ферменты являются участниками как традиционных, так и новых технологических процессов, применяемых в производстве пищевых продуктов. Одним из древнейших является, в частности, брожение. Но традиционные технологии, например, сквашивание молока или пивоварение, используют эндогенные ферменты, которые содержатся в самом сырье или в заквасках. В 20 веке родилась и была реализована идея использовать для ускорения существующих и инициирования новых реакций экзогенные ферментные препараты. Это привело к развитию индустрии ферментов для выделки кож, осветления пива и т.д. Большинство производимых в настоящее время ферментов, предназначенных для пищевых технологий, являются гидролазами. Это в основном гликозидазы, используемые в переработке растительного сырья, и, частично, протеазы, применяемые в тендеризации мяса. Новое направление в пищевой энзимологии — модификация структуры белков. С этой целью используется трансглутаминаза (ТГ) [КФ 2.3.2.13].

ТГ — широко распространённый в природе фермент. К настоящему времени хорошо изучены Са2+ - зависимые ТГ тканей животных и человека. Коммерческая ТГ производится компанией Ajinomoto из анаэробного микроорганизма Streptomyces mobaraense под маркой Activa.

Применению фермента ТГ в пищевых технологиях посвящена данная работа.

Одной из актуальных проблем молочной индустрии является улавливание и утилизация белков молочной сыворотки. Белки молочной сыворотки (лактальбумин, лактоглобулин, иммуноглобулины и др.) имеют наивысшую скорость расщепления среди цельных белков. Концентрация аминокислот и пептидов в крови резко возрастает уже в течение первого часа после приема пищи на основе белков молочной сыворотки. При этом не меняется кислотообразующая функция желудка, что исключает нарушение его работы и образование газов. Усваиваемость белков молочной сыворотки исключительно высока.

Аминокислотный состав сывороточных белков наиболее близок к аминокислотному составу мышечной ткани человека, а по содержанию незаменимых аминокислот и аминокислот с разветвленной цепью: валина, лейцина и изолейцина, они превосходят все остальные белки животного и растительного происхождения. Кроме того, примерно 14 % белков молочной сыворотки находится в виде продуктов гидролиза (аминокислот, ди-, три- и полипептидов), которые являются инициаторами пищеварения и участвуют в синтезе большинства жизненно важных ферментов и гормонов.

Мероприятия по сбору и промышленной переработке молочной сыворотки в различные пищевые, кормовые и технические продукты экономически выгодны и окупаются за сравнительно короткие сроки (1-3 года). Важное значение имеет при этом охрана окружающей среды. Тонна молочной сыворотки, слитая в сточные воды, загрязняет водоем так же, как 100 о м хозяйственно-бытовых стоков. Затраты на очистку сточных вод, загрязненных сывороткой, которую получают на сыродельном заводе при переработке 50 т молока в смену, равноценны затратам на очистку сточных вод в городе с населением 80 тыс. человек. Основными потребителями кислорода при сбрасывании сыворотки в сточные воды являются молочный сахар, затем белки и остальные компоненты.

Мероприятия по охране окружающей среды от загрязнений молочной сывороткой сводятся к следующему:

1. Максимально полный сбор молочной сыворотки на всех стадиях производства сыра, творога и казеина.

2. Борьба с потерями на всех стадиях переработки молочной сыворотки (переливы из технологических емкостей, выбросы при переполнении и вспенивании сгущаемой в вакуум-выпарных аппаратах сыворотки, уносы с отработанным воздухом при сушке, утечка через неплотности в арматуре и т.

Д.).

3. Очистка сточных вод с извлечением и использованием полезных веществ.

Применению ТГ для утилизации белков молочной сыворотки, которая в настоящее время на 68,5 % сливается в канализацию молочными предприятиями, посвящена часть настоящей работы.

Другая часть работы затрагивает применение ТГ для производства продуктов на основе комбинации животных и растительных белков.

Комбинированные молочные продукты с использованием - сырья и добавок растительного происхождения успешно производятся на многих предприятиях. Учитывая реальную обстановку, тенденции развития сырьевой базы, производственные возможности отечественных производителей, перспективы рынков сбыта, такие продукты дают дополнительные возможности как расширения ассортимента, так и совершенствования их потребительских качеств. Показана возможность производства продуктов для питания больных с нарушенной толерантностью к глютену путём модификации белков клейковины ТГ. Недавние исследования выявили частоту заболевания от 1:300 до 1:100 в нормальной популяции. У больных целиакией проявляется искажённая реакция на пищевой глютен. В работе предложено, модифицируя глютен, устранить его непереносимость.

В работе показана перспективность применения ТГ для получения творога, обогащённого сывороточными белками. В состав творога входят фосфор и кальций, имеющие большое значение для системы свертывания крови, для роста и укрепления костей. Используя ТГ, можно улучшить биологическую ценность творога за счёт включения в его состав сывороточных белков.

В "связи с вышеизложенным, изучение субстратной специфичности ТГ к пищевым белкам и применение данного фермента в пищевой промышленности является актуальной задачей.

Научная новизна работы:

- доказана субстратная специфичность трансглутаминазы к белкам растительного (глютен пшеницы) и животного (желатин, белки сыворотки молока) происхождения;

- установлено, что использование ТГ в технологии творога и ацидофильной пасты повышает биологическую ценность и увеличивает выход конечного продукта;

- установлено влияние ТГ на структурно-механические характеристики готовых изделий; определена эффективно действующая концентрация ТГ;

- доказано, что под действием ТГ изменяется иммунная активность глютена пшеницы, что открывает возможность расширения ассортимента продуктов для больных целиакией.

Практическая ценность диссертационной работы:

Доказана возможность применения ТГ в пищевых технологиях на примере связывания белков молочной сыворотки и глютена, а также получения творога и творожного продукта. Предложены пути промышленного использования фермента трансглутаминазы в переработке молока.

Показана эффективность применения ТГ в производстве продукта на основе комбинирования белков животного и растительного происхождения.

Социально-экономический эффект выполненной работы определяется расширением ассортимента продукции, обладающей повышенной пищевой ценностью и лечебно-профилактическими свойствами, а также экономией традиционного сырья.

Проведена промышленная выработка творога в производственных условиях на ЗАО «Облмолпром». Разработан проект технической документации по производству творога с применением ТГ. Рассчитан экономический эффект.

Получен патент № 2009141081 «Способ переработки молочной сыворотки», опубл. 10.05.2011, бюл. № 13.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка использованных источников и приложений. Работа изложена на 93 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков, 5 таблиц, приложение. Список литературы состоит из 159 наименований.