автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.14, диссертация на тему:Защитные механизмы картофеля, обработанного культуральной жидкостью бактерий-антагонистов родов Pseudomonas и Mycobacterium в лечебный период и при холодильном хранении

САНКТ - ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ХОЛОДА И

ПИЩЕВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

ЗАЩИТНЫЕ МЕХАНИЗМЫ КАРТОФЕЛЯ, ОБРАБОТАННОГО КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТЬЮ БАКТЕРИЙ-АНТАГОНИСТОВ РОДОВ PSEUDOMONAS И MYCOBACTERIUM, В ЛЕЧЕБНЫЙ ПЕРИОД И ПРИ ХОЛОДИЛЬНОМ ХРАНЕНИИ

Специальность 05. 18. 14. - холодильная технология

пищевых продуктов

На правах рукописи УДК 664. 8. 037. 1

ГУДИМ А Людмила Ратмировна

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель доктор техн. наук.профессор КОЛОДЯЗНАЯ Валентина Степановна

Санкт - Петербург 1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................4

1 ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТИТЕЛЬНОГО ОРГАНИЗМА К ФИТОПА-

ТОГЕНАМ ПРИ ВЕГЕТАЦИИ И ХРАНЕНИИ.........9

1.1 Микроорганизмы - продуценты биологически активных соединений, обладающих антагонистической активностью......................9

1.2 Антибиотические вещества, синтезируемые

бактериями рода Pseudomonas и Mycobacterium.........18

1.3 Исследование взаимоотношения патогенных

организмов и растения-хозяина..................25

1.4 Биологическая защита растительной продукции

от фитопатогенов при хранении................31

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТА................45

2.1 Объекты исследования................... 45

2.2 Методы исследования...................50

2.3 Постановка эксперимента..................54

3 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НА ЗАЩИТНЫЕ МЕХАНИЗМЫ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ

СОСТОЯНИЕ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ХРАНЕНИИ.........58

3.1 Суберинизация......................58

3.1.1 Синтез суберина в механически поврежденных

клубнях в лечебный период ....................59

3.1.2 Динамика суберина при хранении картофеля........65

3.2 Фенольные соединения..................70

3.2.1 Фенольные соединения в раневой перидерме

клубней в лечебный период ..................70

3.2.2 Фенольные соединения клубней при хранении.......81

3.3 Активность ферментов ...................86

3.3.1 Активность оксидаз раневой перидермы

клубней в лечебный период . ..................86

3.3.2, Активность оксидаз при хранении.............95

3.4 Защитная система фенольные соединения + фенолоксидаза . . .105

3.5 Пектиновые вещества...................112

3.5.1 Пектиновые вещества в раневой перидерме

клубней в лечебный период..................112

3.5.2 Пектиновые вещества в коре клубней при хранении.....116

3.6 Влияние условий обработки на физиологическое

состояние клубней.......................120

3.6.1 Интенсивность дыхания.................120

3.6.2 Прорастание......................123

3.6.3 Убыль массы.......................129

3.6.4 Товароведные и фитопатологические показатели качества . .132

3.6.5 Экономическая эффективность..............135

ВЫВОДЫ...........................137

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................139

ПРИЛОЖЕНИЯ.......................159

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Одной из причин высоких потерь картофеля при хранении даже с применением искусственного холода являются механические повреждения клубней, неизбежные в процессе механизированной уборки и транспортировки урожая. При этом создаются благоприятные условия не только для развития фитопатогенов, но и снижается естественный иммунитет растительной ткани. Проведение лечебного периода картофеля с глубокими механическими повреждениями при повышенных температурах, как правило, не способствует высококачественному сохранению урожая в течение длительного времени.

Основной путь защиты плодов и овощей от инфекционных заболеваний состоит в селекции наиболее устойчивых сортов и использование разнообразных средств для максимального сохранения присущего им иммунитета.

До настоящего времени наиболее широко используется химический метод защиты растений. Однако, глобальное применение пестицидов привело к загрязнению окружающей среды и ряду нежелательных последствий.

Анализ научно-технической информации показал, что биологический метод защиты растений является наиболее перспективным и экологически безопасным средством защиты сельскохозяйственных культур от различных возбудителей болезней. Этот метод не уступает химическому способу и обладает многими преимуществами.

В настоящее время установлена эффективность применения некоторых штаммов бактерий родов Pseudomonas и Mycobacterium при длительном холодильном хранении картофеля. Однако, отсутствуют сведения по влиянию бактерий-антагонистов и продуктов их жизнедеятельности на защитные механизмы картофеля в лечебный период и в процессе длительного холодильного хранения в зависимости от физиологического состояния клубней.

Теоретические и экспериментальные исследования защитных механиз-

мов растительной ткани являются актуальными и имеют важное научное и практическое значение, так как позволяют выбрать высокоэффективные штаммы различных родов и видов микроорганизмов в зависимости от сорта, физиологического состояния и технологических параметров хранения картофеля.

Цель работы - исследовать защитные механизмы клубней картофеля, обработанного культуральной жидкостью (КЖ) бактерий-антагонистов родов Pseudomonas и Mycobacterium, в лечебный период и при длительном холодильном хранении.

В основу рабочей гипотезы положено предположение, что бактерии-антагонисты и продукты их жизнедеятельности не только подавляют рост и развитие патогенной микрофлоры, но и способны активизировать защитные реакции клубней картофеля. Для проверки рабочей гипотезы и достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- изучить влияние рода, вида и штаммов бактерий-антагонистов на накопление суберина в раневой перидерме механически поврежденных клубней в лечебный период и в естественной перидерме неповрежденных клубней в процессе длительного холодильного хранения;

- исследовать влияние биологических средств на защитную систему "фенольные соединения+фенолоксидаза" (ФС+ФО) в раневой перидерме механически поврежденных клубней в лечебный период, в коре клубней, помещенных в условия инфекционного очага и при длительном холодильном хранении;

- выявить влияние обработки механически поврежденных клубней КЖ бактерий-антагонистов на процесс раневой репарации и свойства раневой перидермы;

- исследовать содержание пектиновых веществ в раневой перидерме механически поврежденных клубней в лечебный период и в коре неповрежденных клубней в процессе длительного холодильного хранения под действием

биологических средств защиты;

- изучить влияние обработки картофеля КЖ бактерий-антагонистов на продолжительность физиологического покоя клубней и поражаемость картофеля инфекционными заболеваниями;

- разработать рекомендации по применению бактерий-антагонистов, повышающих устойчивость к инфекционным заболеваниям в лечебный период и при длительном холодильном хранении клубней.

Научная новизна

Установлено, что бактерии-антагонисты влияют на количественный и качественный состав фенольных соединений и активность фермеитов-оксидаз в раневой перидерме клубней картофеля. В зависимости от штамма они активизируют защитную систему ФС+ФО в раневой и в естественной перидерме клубней, помещенных в условия инфекционного очага.

Выявлена зависимость синтеза суберина в раневой и естественной перидерме клубней от температуры лечебного периода и продолжительности хранения картофеля, обработанного КЖ бактерий-антагонистов для различных штаммов.

Установлено, что обработка механически поврежденных клубней КЖ бактерий-антагонистов способствует увеличению клеточных слоев раневой перидермы и накоплению в ней протопектина.

Практическая ценность

Установлена способность исследуемых штаммов бактерий-антагонистов активизировать защитные механизмы механически поврежденных клубней при различных температурах.

Показана целесообразность проведения лечебного периода для клубней с глубокими механическими повреждениями с применением бактерий-антагонистов.

Рекомендовано исключить лечебный период клубней, имеющих неглубокие механические повреждения и обработанных КЖ бактерий-

антагонистов.

Разработаны дополнения к "Технологической инструкции по производству и длительному хранению картофеля на основе применения биологических средств защиты" ТИ 9739-005-02068491-95.

Экономический эффект от применения биологических средств защиты при хранении картофеля составил 142-288 руб./т, в зависимости от штамма бактерий и сорта картофеля.

Апробация работы

Основные результаты исследований доложены на научно-технических конференциях профессорско-преподавательского состава (СПГАХПТ, 1996, 1997 и 1998 гг.); международной научно-технической конференции "Холод и пищевые производства" (СПГАХПТ, 1996 г.); 2-й Всероссийской научно-теоретической конференции "Прогрессивные экологически безопасные технологии хранения и комплексной переработки сельскохозяйственной продукции для создания продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности" (Углич, 1996 г.); международном симпозиуме "Экология человека: пищевые технологии и продукты на пороге XXI века"(Пятигорск, 1997 г.); международной научно-технической конференции "Техника и технология пищевых производств" (Могилев, 1998 г.); международной научно-технической конференции "Ресурсосберегающие технологии пищевых производств" (СПГАХПТ, 1998 г.); международной научно-практической конференции "Безопасность питания - основа жизни человека XXI века" (СПГАХПТ, 1998 г.); международной научно-технической конференции "Advances in the Refrigeration system, Food technologies and Cold сЬат"(София, 1998 г.); международной научно-технической конференции "Холодильная техника России. Состояние и перспективы XXI века" (СПГАХПТ, 1998 г.).

Публикации Основной материал диссертационной работы опубликован в 12 работах.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы и приложений.

Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц и 27 рисунков. Список литературы состоит из 219 наименований работ, 90 из которых - зарубежных авторов.

1 ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТИТЕЛЬНОГО ОРГАНИЗМА К ФИТОПАТОГЕНАМ ПРИ ВЕГЕТАЦИИ

И ХРАНЕНИИ

1.1 Микроорганизмы - продуценты биологически активных соединений, обладающих антагонистической активностью

В последние годы все более актуальным становится изыскание новых активных штаммов микроорганизмов с целью разработки на их основе высокоэффективных и экологически безопасных средств защиты сельскохозяйственных культур от различных возбудителей болезней. Одним из основных направлений таких поисков следует считать селекцию микроорганизмов, способных к регулированию структур биоценоза, направленного на подавление фитопатогенов. Необходимыми условиями успешного использования штаммов и биопрепаратов на их основе является их генетическая стабильность, низкая устойчивость к биоценологическим факторам и способность размножаться,не теряя активности (136).

До недавнего времени поиск активных микробов-антагонистов проводили в основном среди грибов. Наиболее обширные исследования связаны с использованием в защите растений представителей рода Trichoderma (104,105,149), Gliocladium (124, 173) и Trichothecum (127, 165). Лишь недавно в число агентов микробиологического контроля численности возбудителей болезней растений были включены бактерии и актиномицеты (21, 24, 49, 112, 117, 163, 167, 186, 190, 195). Как показали многочисленные исследования, наиболее перспективны для защиты растений не только бактерии родов Bacillus и Pseudomonas ( 167, 186, 189), но не менее перспективны для борьбы с грибными заболеваниями актиномицеты. Биологическая эффективность предпосевной обработки семян и внесение в почву штаммов Streptomyces spp. составила 50-90% при защите от корневых гнилей зерновых, овощных

культур и картофеля ( 154, 189, 202). Обладая высокой антагонистической активностью, штаммы бактерий и актиномицетов в то же время более технологичны: хорошо растут на недефицитных и дешевых промышленных питательных средах, не теряют жизнеспособности при различных режимах сушки и длительном хранении в широком диапазоне температур.

Антагонизм является сложным многокомпонентным биологическим явлением, обусловленным рядом взаимодействующих факторов, способных существенно изменять среду обитания микроорганизмов. Совокупность этих факторов может в значительной степени влиять на количественный и качественный состав микрофлоры почвы, что в свою очередь положительно, воздействует на физиологическое состояние растения.

Явление антагонизма микроорганизмов проявляется различно. В некоторых случаях оно выражается в изменении реакции среды в сторону, неблагоприятную для роста и развития других видов микроорганизмов. Так, например, в процессе дезаминирования мочевины уробактериями создается щелочная среда, препятствующая росту ряда почвенных микроорганизмов, но хорошо переносимая уробактериями. В других случаях угнетающее действие связано с изменениями самой среды, делающими ее неблагоприятной для развития конкурента. Так, неспорообразующие бактерии, обильно развиваясь в почве при ее значительном увлажнении, угнетают жизнедеятельность споровых бактерий и актиномицетов (5). Подавление развития патогенов в некоторых случаях происходит в результате конкуренции за углерод, как источник энергии. Однако, многие работы показали, что существенным элементом конкуренции организмов является железо. Оно необходимо для многих биологических процессов в клетках микробов и его отсутствие тормозит развитие любого фитопатогенного гриба ( 19, 89, 90, 132, 181, 198, 215,). Также подавление роста микроорганизмов может быть связано с продуцированием антагонистами продуктов обмена в виде спирта, перекиси водорода, летучих кислот, эфиров, ферментов, антибиотиков, сидерофоров и

других биологически активных соединений. Именно данные продукты обмена, как предполагают 2,5,13,15, 91, 132, 142 , помогают микробам сохранить преимущество в борьбе за существование. Обладая способностью проникать, распространяться и накапливаться в различных частях растения, активные вещества антагонистов усиливают иммунобиологические свойства растений. Кроме того, антибиотические вещества принимают активное участие в процессах жизнедеятельности бактериальной клетки-продуцента. Описано участие антибиотиков в процессах спорообразования продуцентов Bacillus Licheneformis : усиление образования антибиотика совпадает по времени с началом обильной споруляции. Установлено, что большая часть антибиотика, содержащегося в вегетативных клетках продуцента, переходит в споры; возможно, антибиотик используется бактериями, как источник энергии и конструктивный материал (2).

Большинство исследований касается объяснения возможного механиз-

ч

ма антагонистического действия выделенных штаммов. Исходя из того, что все штаммы- антагонисты активно образуют при росте на искусственных питательных средах зоны подавления роста и развития культур патогенов, естественно было бы предположить, что клетки штаммов выделяют в среду какие-то вещества, осуществляющие химический контроль развития конкурирующих с ними патогенов.

В частности, известно, что штаммы грибов рода Trichoderma spp. образуют 29 соединений, обладающих фунгицидной активностью. К их числу относятся пептиды, метаболиты аминокислот, терпеноиды и т.д.(149). Некоторые из них обладают ростстимулирующей активностью. Ростстимулирующей активностью обладают также некоторые штаммы микробов-антагонистов родов Pseudomonas и Pénicillium (63), Achromobacter (11), Microccocus flavos (128), синтезирующие вещества типа ауксинов, гиббереллинов, цитокининов. Представители рода Bacillus активно синтезируют циклические олигопепти-ды, ингибирующие синтез клеточной стенки ( бацитрацин ), олигопептиды,

нарушающие функции мембран ( грамицидины, полимиксин ), а также ами-ноглюкозиды, нарушающие функции рибосом (190). Кроме того, к числу факторов, определяющих антагонистическую активность Bacillus spp., может относиться комплекс разнообразных экзоферментов ( протеаз, амилаз и т.д.). Pseudomonas putida продуцируют флюоресцирующий пигмент пиловердин, проявляющий высокую антигрибную, антибактериальную и биостимули-рующую активность (49). В значительной степени антагонистическая активность псевдомонад связана с синтезом специфических низкомолекулярных соединений, участвующих в усвоении и транспорте сидерофоров, например, аэробактин и псевдобактин (155). В значительной степени активность псевдомонад обусловлена синтезом антибиотиков ряда феназинов, оомицина А, пилутеорина, пирролнитрина (155, 163).

Высокой фунгицидной активностью обладают метаболиты актиноми-цетов. Например, Streptomyces griseochromogenes образует антибиотик тау-томицетин, подавляющий развитие возбудителей фузариозов (137). Дрожжи Williopsis subsufficiensu, Williopsis beijerincki синтезируют киллерные токсины, обладающие широким спектром действия по отношению к дрожжам, в том числе и патогенным грибам рода Candida (118). Подавление роста патогенных грибов ( Alternaría altura, Alternaría tenuis, Fusarium oxysporium, Colletorichum glocosporioides) штаммом Nocardiopsis spp. A6 связано с выделением внеклеточного токсина (70).

Исследуя природу