автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Теоретическое обоснование и практические аспекты применения и получения биологически активных регуляторов протеолиза в технологии рыбных продуктов

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ Московская государственная академия прикладной биотехнологии

На правах рукописи УДК 664.951.2.001.1:577.152.34

СЛУЦКАЯ Татьяна Ноевна

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ И ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ РЕГУЛЯТОРОВ ПРОТЕОЛИЗА В ТЕХНОЛОГИИ РЫБНЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность 05.18,04. - технология мясных,

молочных и рыбных продуктов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Тихоокеанском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (ТИНРО)

Научный консультант: доктор технических наук, профессор Т.М. Сафронова

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Н.К.Журавская

доктор технических наук, профессор В.И.Шендеркж

доктор технических наук Ф.М.Ржавс-кая

Ведущая организация: Атлантический научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (АтлантНИРО)

Защита диссертации состоится 1994 г. в _ часов

на заседании специализированного совета Д 063.46.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора технических наук при Московской государственной академии прикладной биотехнологии по адресу:

109818, Москва, ул. Талалихина, 33.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ж

Автореферат разослан ' /У" 1994

г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат технических наук

С.Г.Юрков

I

Общая характеристика, работы

Актуальность проблемы. До недавнего времени автолитическое изменение соленых рыб, т.е. созревание, являлось пассивной частью технологического процесса, что объясняется традиционным характером как самого посола, так и сырья.

Созревание рассматривается нами как процесс ферментативных изменений объектов при посоле, в результате которых меняется пищевая ценность. При этом во многом определяющее значение для процессов, формирующих качество, имеют характер и уровень про-теолитических изменений рыб.

В последние годы в связи с изменившимся составом сырья возникла необходимость обработки новых видов рыб, характеризующихся низким уровнем активности протеодитических ферментов, что не позволяет использовать их для производства созревающей соленой продукции.

Отечественными и зарубежными учеными установлено, что для активации процессов протеолиза и гидролитической деструкции ли-пидов целесообразно использовать ферменты внутренностей рыб, что одновременно позволяет решить вопрос комплексной переработки сырья.

Большой вклад в решение этой проблемы внесли М.И.Турпаев, Н.А.Воскресенский, И.П.Леванидов, А.П.Черногорцев, Л.С.Левиева, Ф.М.Ржавская, А.П.Леонова, A.C.Лысова, Н^К.Журавская, В.И.Шен-дерюк, В. П. Лисовая. " '1

В то же время исследования в этом направлении носили методически разобщенный характер и были посвящены в основном роли протеаз внутренних органов рыб в ферментативном гидролизе белков. Это не дает возможности всесторонне охарактеризовать про-теолиз, особенно участие в этом процессе протеаз мышечной ткани.

Ферментирование рыбного сырья является одной стороной регулирования процессов созревания, другой стороной является замедление процессов протеолиза. Это обусловлено необходимостью обработки быстросозревающих рыб, что требует особого технологического подхода, в частности разделки сырья или замораживания соленой продукции.

Более перспективным в этом отношении является использование специфических ингибиторов протеаз, свойства которых изучены зарубежными и отечественными учеными (Kunitz, Northrop, В.В.Мосолов, Т.А.Валуева, С.А.Кудинов, М.М.Колодзейская), однако применение их в пищевой промышленности до настоящего времени не рассматривалось в научном и в прикладном аспектах.

Поэтому исследование биологически активных регуляторов протеолиза (ферментов и ингибиторов), а также разработка научных основ их использования являются актуальными, представляют интерес для науки и практики, позволяют определить пути регулирования технологических процессов, рационального использования сырья.

Учитывая изложенное, целью работы являлось научно-экспериментальное обоснование направлений применения и получения биологически активных регуляторов процесса посола, а также разработка рациональных технологических режимов производства соленой и копченой продукции и пресервов.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

- изучение протеолитических ферментов мышечной ткани рыб;

- разработка метода прогнозирования интенсивности автоли-тических процессов при посоле с учетом активности протеаз мышечной ткани;

- выявление раздельного и совокупного эффекта воздействия протеаз мышечной ткани и внутренних органов рыб на белки в процессе посола;

- установление связи состава продуктов протеолиза с органо-лептическими признаками созревания соленых рыб;

- исследование специфики протеолиза при наличии в системе хлорида натрия и ферментного препарата;

- обоснование наиболее рациональных технологических режимов производства продукции из рыб с низким уровнем протеолити-ческой активности с использованием ферментов протеолитического действия;

- научное обоснование технологии применения ингибиторов при производстве пресервов и соленой продукции из рыб, характеризующихся высокой протеолитической активностью ферментов мышечной ткани и внутренних органов;

- разработка системы рекомендаций по использованию протео-литических ферментов и их ингибиторов, разработка технической документации по их применению;

- научное обоснование рациональных приемов получения препарата протеолитического действия из внутренностей гидробионтов; разработка технической документации на препарат протеолитичес-ких ферментов и на линию по его производству;

- научное обоснование и разработка технологии производства ингибитора протеолиза из растительного сырья, исследование свойств полученных ингибиторов, обоснование безвредности применения их при производстве рыбной продукции, разработка технической документации.

СТяучкая нгтизня работы. Установлены основные закономерности и последовательность протеолитических процессов при созревании рыб под влиянием ферментных систем мышечной ткани и пищеварительных органов.

Выдвинута гипотеза трехсгадийности процесса протеолиза; показано, что фактором, регулирующим протеолиз на первой стадии, является активность протеаз мышечной ткани.

Самостоятельный теоретический интерес представляет научное доказательство третьего этапа созревания, характерным признаком

которого является образование соединений между продуктами деградации белков и липидов (оснований Шиффа).

Показана возможность совершенствования технологии рыбных продуктов, заключающаяся в изучении состава и свойств сырья, обусловленных присутствием биологически активных протеаз мышечной ткани рыб.

Изучена взаимосвязь между активностью протеаз мышечной ткани промысловых тихоокеанских рыб и протеолитическими процессами при созревании.

Научно обоснованы процессы регулирования созревания рыб при воздействии биологически активных стимуляторов и ингибиторов протеолиза.

Обоснованы и разработаны технологические схемы получения биологически активных регуляторов протеолиза из отходов рыбообрабатывающей промышленности, из растительного сырья и отходов при его переработке.

Общая мя-гпяикя ряГ!пт» хг пГгьяк-ти ипп.тгяттпвяттст. Общий ПОДХОД к решению проблемы состоял в:

- анализе современных достижений научных исследований и практических результатов в области применения биологически активных регуляторов протеолиза и выбора перспективного направления;

- теоретическом и экспериментальном обосновании направления;

- разработке технологических схем и режимов;

- практической проверке теоретических и экспериментальных исследований, а также разработанных технологий в условиях производства; схема проведения исследований представлена на рис. 1.

В работе применяли современные методы химических, биохимических, спектральных, хроматографических, реологических и элек-

ронномикроскопических исследований. Экспериментальные данные бработаны методами математической статистики (дисперсионный, эрреляционный и регрессионный анализ). Достоверность данных □стигалась планированием количества опытов, необходимых и дос-аточных для достижения надежности Р = 0,85-0,95 при доверите-ьном интервале 4 = (± 10 %).

Рис. 1. Схема проведения исследований: АХ - аффинная роматография, ГХ - гель-хроматография, ИХ - ионнообменная хро-атография, ЭМ - электронная микроскопия, ФС - флюоресцентное канирование, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

Объектами исследования служили тихоокеанские рыбы, состав-яющие основу промыслового объема в Дальневосточном регионе с 975 г. по настоящее время:

1. Анчоус япономорский - Engraulis japonicus; анчоус калифорнийский - Engraulis mordax; > , ,, • -

2. Горбуша - Oncorhynchus gorbuscha; .

3. Джакас - Nemadactylus sp.; , ,,

4. Камбала - Microstomias achne;

5. Кета - Oncorhyncjius keta;

6. Мавроликус - Maurolicus pennanti;

7. Минтай - Theragra chalcogramma;

8. Сайра - Cololabis saira;

9. Сардина тихоокеанская (сельдь иваси) - Sardinops sagas melanosticta;

10. Сельдь тихоокеанская - Clupea pallasi pallasi;

11. Серебрянка (тихоокеанская аргентина) - Argentina eIon-

gata;

12. Ставрида - Trachurus trachurus;

13. Терпуг японский - Hexagrammos otakii;

14. Трематома - Tremotus nicolai;

15. Треска тихоокеанская - Gadus macrocephalus.

Пратститшнкаст янячимпсть рябптм. Предложен метод определения уровня протеолиза мышечной ткани рыб при посоле, обосновывающий показатели, согласно которым можно объективно судить с возможности производства из любого рыбного сырья соленой продукции и пресервов высокого качества.

Разработаны принципиально новые технологические схемы производства пищевой продукции с применением препаратов протеоли-тического действия (из гидробионтов), а также ингибиторов протеолиза (из растительного сырья).

Разработаны технологические схемы производства препаратов протеолитического действия из гидробионтов, а также ингибиторов трипсина и химотрипсина из растительного сырья, что обеспечива-

г комплексное использование отходов рыбной и овощеперерабаты-ающей промышленности.

Ряа.тшяаттст ряяультятп'и ипп.тядпнантгя. Разработаны и утверж-зны технические условия и технологические инструкции по произ-здству сельди иваси соленой (ТУ 15-01 457-76, ТУ 15-01 407-84, I 99-79, ТИ 99-84); документация предусматривает условия хра-5ния сырца при производстве соленой продукции.

Разработаны и утверждены изменение № 2 к ОСТ 15 220-79 в . юти использования для•пресервов из сельди иваси специального зсола сырья размером 13-16 см, а также изменение № 4 к ТИ 2263 и изменение № 4 к ТИ 226-84.

За 1982-1983 гг. по указанным документам произведено 15 ¿с. туб пресервов из сельди иваси, с экономическим эффектом на тубу 190,2 руб., с общим экономическим эффектом на 1983 г. соло 2 млн. руб.

Разработаны и утверждены технические условия и технологи-гские инструкции по производству соленой, копченой продукции и ¡есервов с применением ферментного препарата из внутренностей 1б: ТУ 15-01 847-84, ТИ 26 7-84 "Терпуг соленый деликатесный ->луфабрикат"; ТУ 15-01 1601-92, ТИ 441-92 "Ставрида слабосоле-1Я - полуфабрикат"; ТУ 15-01 1666-92, ТИ 290-92 "Пресервы да- . .невосточные"; ТУ 15-993-89, ТИ 343-89 "Минтай холодного коп-¡ния ароматизированный"; ТУ 15-01 966-88, ТИ 321-88 "Препарат ютеолитичеьких ферментов - полуфабрикат".

Технология производства указанных видов продукции внедрена I БСФ им.Надибаидзе и р/к' Владивостокский ПО Приморрыбпром; )ибыль по. ценам 1985-1987 гг. на 1 кг копченой продукции из ■авриды и минтая составляла 12 руб., на 1 тубу пресервов "Да-левосточные" - 111 руб.

Разработаны и утверждены:

- техническое задание на линию производства препарата про-олитических ферментов Н6-ИФЛ-100;

- программа и методика испытаний опытного образца линии производства ферментного препарата.

В 198? г. линия сдана в эксплуатацию на БСФ им. Надибаидзе ПО Приморрыбпром с присвоением высшей категории качества.

Разработанная технология применения ингибиторов протеолизг при производстве соленой продукции и пресервов экономически эффективна и вошла в проект ОСТа "Пресервы из сельди иваси специального посола", проведены производственные проверки и выпусь продукции в условиях перерабатывающих плавучих производств (п/С "Спасск", "Рыбак Владивостока", "Содружество"), а также на береговых предприятиях.

На ингибитор протеолиза разработана и утверждена техническая документация (ТУ 15-01 1602-92, ТН 442-92), в условиях экспериментального производства проведены опытно-промышленные выпуски ингибитора.

Результаты работы использованы в учебном процессе технологического факультета Дальрыбвтуза, в методической литературе лекционных курсов, лабораторных занятий.

Аттрпбация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзном симпозиуме "Современное состояние и перспективы развитш теории и практики производства слабосоленой продукции из океанического рыбного сырья" (Калиниград, 1976); Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979), Всесоюзной научно-технической конференции "Совершенствование производства соленых рыбны: продуктов из новых видов океанического сырья" (Калиниград, 1979), Всесоюзной конференции "Проблемы научных исследований 1 области изучения и освоения ресурсов Тихого океана" (Владивосток, 1980), Всесоюзном совещании "Исследование и рационально« использование биоресурсов дальневосточных и северных морей ] перспективы создания технических средств для освоения неисполь-

зуемых биоресурсов открытого океана" (Владивосток, 1985), Всесоюзном семинаре "Основные направления развития производства пресервов, соленой, копченой и вяленой продукции улучшенного качества" (Калиниград, 1986), Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов" (Владивосток, 1988), Всесоюзном семинаре "Теория и практика регулирования качества соленой и копченой рыбной продукции" (Владивосток, 1989), Двустороннем совещании с представителями фирмы ГЕГЕ KAítCA (Владивосток, 1989), Международной конференции по Японскому и Охотскому морям (Находка, 1989), Всесоюзной научно-технической конференции "Совершенствование технологии производства новых видов пищевых продуктов и добавок" (Киев, 1991), Всесоюзной конференции "Рациональное использование биоресурсов Тихого океана" (Владивосток, 1991), семинаре "Интенсификация и автоматизация технологических процессов обработки пищевых продуктов" (Москва, 1990), а также на ученых советах ТИНРО (19751993 гг.).

Пуггтттсатти. По материалам диссертации опубликовано 76 работ, из них 1 монография, 1 учебное пособие для студентов Даль-рыбвтуза, 2 авторских свидетельства, 3 патента РФ.

Огубим и гтруктура. Работа изложена на 366 стр. машинописного текста, не считая Приложений, состоит из введения и 6 глав, включает 105 рисунков, 81 таблицу. Список литературы включает 301 наименование отечественных и 242 - иностранных авторов.

В Приложениях приведены список утвержденной нормативно-технической документации, составленный по результатам научно-исследовательских работ, документы о производственных выпусках продукции с применением биологически активных регуляторов про-теолиза, ферментов и ингибиторов, приемо-сдаточная документация

линии производства препарата протеолитических ферметов, медико биологическое заключение о возможности применения ингибитора протоколы дегустационных совещаний, документы об экономическо: эффективности.

Каждая глава работы содержит следующие разделы: обзор ли тературы по исследуемому вопросу, объекты и методы исследова ния, собственные экспериментальные данные автора и выводы.

Игг.лядовятшя прптяяя митячнпй ткяни рыб и свяяь их активипгти с

уровиям апгппрптр.плпяа при спаравяншг г.плр.япй прплукгтии

Анализ литературы показал, что в мышечной ткани рыб содер жатся катепсины В, Н, L, С, Д, кальцийзависимая нейтральна протеаза, щелочная сериновая протеаза, различные пептидазы (No mata et al., 1983; Folko et al., 1984; Kashiro et al., 1985 Hara et al., 1987). Установлено, что катепсин Д играет рол пускового механизма при протеолизе in vitro (Goettlish-Riemann 1971). Для выявления роли мышечных лротеаз в протеолизе пред ставляло . интерес исследование не только катепсина Д мышечно ткани рыб, но и других протеаз, имеющих рН-оптимум, близкий рН-оптимуму мышечной ткани соленых рыб, в частности суммы тио ловых - катепсинов Н,' В, L.

Выделение катепсина Д проводили по нескольким схемам; испо льзование гель-хроматографии на G-25 (с предварительной кислот ной и тепловой обработками) позволило получить из мышечной тка ни тихоокеанской сельди фермент со степенью очистки 50, выходе 21,1 %. Методом аффинной хроматографии на гемоглобин-сефарог был получен препарат катепсина Д высокой степени очистки - 25С 400 раз (табл. 1). Увеличение общей и удельной активности щ повторной хроматографии объяснено присутствием в препарате npi

родного ингибитора в комплексе с катепсином, адсорбирующимся на сорбенте при первой хроматографии.

Таблица 1

Результаты выделения и очистки катепсина Д из мышечной ткани _сельди иваси_

Белок, Активнпнть Степень Выход,

Стадия мг/мл Общая, Удельная, очистки, 7»

очистки ед.ак. ед./мг кратность

белка

Экстракция 6,3-8,0 127,0-512,3 0,03-0,04 Тепловая обработка 3,6 32,8-79,2 0,09 2,2-3,0 58,6-91,7 Осаждение

(ЦНОгОД 6,3-17,8 - 0,075-0,082 2,7 22,4-25,2 Кислотная обработка 1,1-1,7 39,4-76,5 0,42-0,32 7,3-14,6 14,9-31,0 Аффинная хроматография 0,03-0,04 4,6-5,5 2,0-7,3 45,3-248,8 1,1-3,6 Повторная аффинная хроматография 0,029_23,0_18,4 413,3 4,5

Из сельди иваси катепсин Д выделен впервые, что представляет самостоятельный научный интерес и указывает на возможность получения катепсина Д в препаративных целях. Параллельно установлена возможность выделения катепсина Д на отечественных сорбентах, лигандами служили грамицидин-Б и бациллихин. Установлено, что содержание катепсина Д у сельди иваси почти в 2 раза выше, чем у сельди тихоокеанской (табл. 2). При нанесении на колонку с бациллихин-силохромом неочищенных экстрактов получены препараты с низкой степенью очистки (до 10), повторная хроматография активной фракции на грамицвдин-З-силохроме увеличила степень очистки.

Таблица 2

Выделение катепсина Д из мышечной ткани рыб

Источник фермента

Лиганд

Удельн. акт., ед.акт./ед. А.

Исходная Полученная

Выход, Степень _ % очистки,

кратность

Сельдь тихоок. {неочищ.

экстракт) Бациллихин 0,009 Сельдь иваси (неочищ.

экстракт) " 0,008

Сельдь тихоок. (диализов.

экстракт) " 0,030

Сельдь иваси (диализов.

экстракт) " 0,019

Сельдь тихоок. (после хроматографии на бацил-

лихине) Грамицидин-S 0,009

Сельдь тихоок. (диализов.

экстракт) " 0,030

0,050 100,0 5,5

0,080 21,0 10,0

0,389 26,5 13,0

0,537 10,0 28,3

0,170 69,2 19,0

0,410 100,0 13,7

При очистке диализованного против 0,5 % КС1 экстракта на бациллихин-силохроме степень очистки значительно выше, но отмечается низкий выход по активности (26,5).

При одностадийной хроматографии мышечных экстрактов обеих рыб активный белок элкжровался с колонки одной фракцией, обозначенной на хроматограммах одним симметричным пиком, при повторной хроматографии - двумя пиками (рис. 2). Результаты диск-электрофореза позволили сделать заключение о наличии в очищенных катептических препаратах двух изоформ катепсина Д (рис. 3).

Сравнительное исследование количества катепсина Д и суммы тиоловых катепсинов в мышечной ткани промысловых рыб методом

ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе показало (табл. 3), что по активности этих протеаз и с учетом отношения, количества тиоловых катепсинов к количеству катепсина Д, рыбы располагаются в определенный ряд, соответствующий их способности • подвергаться протеолитическим изменениям при посоле.

Рис. 2. Рехроматография катепсинов мышечной ткани тихоокеанской сельди на колонке с грамщидин-Б-силохромом (1x8 см). Стрелкой обозначено начало элюирования 1 М КС1 с 25 %-ным изопропанолом, рН 6,5; пики, содержащие активный фермент, заштрихованы

' Рис. 3. Электрофорез в полиакриламидном геле (рН

э

8,3) катептического препарата после хроматографии на бациллихин-силохроме: Ф - фермент; М - минорная форма фермента

Таблица 3

Активность тиоловых катепсинов и катепсина Д в мышечной ткани промысловых рыб, Е/г ткани

Наименование рыбы Тиоловые катеп-сины (КТ) Катепсин Д (КД) КТ/КД

Кета 0,20 0,22 0,9

Сельдь иваси 0,09 0,15 0,6

Горбуша 0,0? 0,21 0,3

Ставрида 0,03 0,10 0,3

Минтай 0,001 0,04 0,02

Проведенная работа дает основание считать, что определение активности тиоловых и карбоксильных протеаз мышечной ткани при рН-оптшумах этих групп ферментов (6,0 и 3,5) позволяет прогнозировать для изученных объектов глубину протеолитического воздействия при их обработке.

Как видно из результатов табл. 4, по совокупности показателей активности мышечных протеаз при рН 3,5 и 6,0, действительно, можно выделить группу хорошо (I), средне (II) и не созревающих (III) при посоле рыб.

Таблица 4

Активность протеаз мышечной ткани рыб, %

Образец Номер Активность протеаз при рН:

группы 3,5 6,0

Сельдь иваси I 17,0 2,4

Анчоус япономорский I 19,7 7,2

Анчоус калифорнийский I 16,0 4,3

Сельдь тихоокеанская, •

питающаяся, осенняя I 16,5 1,9

Сельдь тихоокеанская

слабопитающаяся I 15,0 2,1

Ставрида ЮЗТО II 14,1 2,2

Терпуг II 11,6 6,7

Сельдь тихоокеанская,

нерестовая II 10,8 1,8

Горбуша сахалинская II 8,4 1,3

Камбала III 3,8 1,0

Треска III 4,1 1,0

Минтай III 3,7 0,9

Джакас III 8,0 14,9

19,9 (pH 9,0)

Анализ полученных данных и сопоставление их с результатами оценки степени созревания экспериментальных партий соленых рыб привел к выводу о том, что не во всех случаях протеолиз проте-

<ает в соответствии с активностью протеаз при рН 3,5 и 6,0. Гак, наблюдается несоответствие для ставриды, терпуга и джака-

Поэтому разработан дополнительный показатель, а именно -соличество низкомолекулярных пептидов и аминокислот при гель-сроматографии безбелковых ТХУ-экстрактов, полученных из мышеч-юй ткани рыб после искусственно вызванного протеолиза (рис. 1). Этот показатель выражается в единицах оптической плотности сак разница между термостатированными (18 ч, 37 °С, рН 6,0-6,5) I нетермостатированными образцами в модельных экспериментах. 1ля хорошо созревающих рыб он составляет не менее 0,07 для ди-I трипептидов и 0,15 для аминокислот. Предварительно было уста-ювлено, что групповой состав, определяемый гель-хроматографией Зезбелковых экстрактов мышечной ткани рыб, в модельных опытах и фи созревании в соленом виде идентичен.

С учетом всех показателей промысловые рыбы по способности к фотеолизу при посоле располагаются в следующий ряд: анчоус ка-[ифорнийский > анчоус япономорский > сельдь иваси, размером до .6 см > сельдь иваси, размером 16 см и выше > сельдь тихоокеан-:кая питающаяся > сельдь тихоокеанская нерестовая> горбуша > :таврида > джакас > терпуг > камбала > треска > минтай (A.c. .050633). Более подробное исследование протеаз мышечной ткани

I-,-1-1-1—г-

100 150 2О0 250 300 350 400 «О

Рис. 4. Гель-хроматография небелкового экстракта мышечной ткани ■Утч- Ры(5ы ДО (1) и после (2) термоста-

тирования

рыб показало, что их активность зависит от длины рыб и связанного с этим биологического состояния. Так, установлена значительная разница внутри размерной группы сельди иваси до -16 см и между этой группой и группой 16 см (рис. 5), а также между нерестовой и питающейся сельдью. На основании собственных экспериментальных данных и анализа литературы сделано предположение о том, что лизосомы клеток мышечной ткани, изменяют свою актив-

Рис. 5. Активность протеаз мышечной ткани сельди иваси: 1 -длина рыбы 11-12 см, 2 - 13-14 см, 3 - 16 см и выше

Таким образом, исследование тиоловых и карбоксильных протеаз мышечной ткани и связь их активности со способностью рыб к протеолизу в соленом виде позволили выявить важную роль изученных ферментов в этом процессе.

Уптаяпвленир лгклтштг ататтпв ттрптеплиаа

На основании работ отечественных и зарубежных ученых сделано заключение о том, что белки мышечной ткани рыб, для того, чтобы успешно быть гидролизованными пищеварительными ферментами, должны претерпеть определенные изменения, при которых разрывается небольшое число структурно существенных пептидных свя-

зей и образуется заметное количество высокомолекулярных компонентов (Coffey, Buve, 1968; Harks, Lajtha, 1970; Шендерюк, 1976).

Анализ литературных данных, а также собственные исследова- ; ния протеаз мышечной ткани рыб позволили выдвинуть предположение о том, что протеолиз при воздействии ферментов мышечной ( ткани и пищеварительных органов протекает в несколько стадий. В начальном периоде главную роль играют эндопептидазы мышечной ткани, которые нарушают структуру белков.

Исследование роли и последовательности действия протеаз мы- ; шечной ткани и пищеварительных органов рыб (сельди иваси, сельди тихоокеанской - питающейся и нерестовой) позволило установить следующее. При созревании соленых целых и разделанных рыб гидролиз белка проходит разными путями: при созревании разде- < ланных рыб образуется большее количество крупных пептидов, чем у целых, что свидетельствует о преимущественном влиянии эндо-пептидаз мышечной ткани (рис. 6); роль эндопептидаз мышечной ткани в' деградации белков на крупные полипептидные фрагменты подтверждена и при исследовании вклада отдельных протеаз мышечной ткани в процесс гидролиза белков при созревании лососевых. Количество низкомолекулярных пептидов при хранении целых рыб непрерывно увеличивается, а у разделанных через некоторое время наблюдается равновесие. Расчет математических зависимостей по-

i

казал, что накопление низкомолекулярных пептидов и продолжительность хранения связаны линейным уравнением для целых рыб и ! квадратичным - для разделанных, что свидетельствует о разной направленности протеолиза у целых и разделанных рыб. Путем расчета коэффициентов корреляции (Сафронова, 1991) между органо-лептической оценкой и количеством продуктов протеолиза, установлено, что между количеством мелких пептидов и оценкой кон-

систенции существует прямая зависимость, г = 0,74; т.е. чем выше количество мелких пептидов, тем выше балльная оценка консистенции. Между количеством полипептидов и консистенцией имеется обратная связь, г = -0,77: чем большее количество полипептидов накапливается в процессе созревания, тем ниже балльная оценка консистенции. Между количеством мелких пептидов и интенсивностью вкуса и запаха установлена прямая связь: г = 0,86. Критерии

Стьюдента tXnУn составляли величины от 5,23 до 7,25.

, 2

У) = 15,0828х + 39,9771 У2 = 53,4837-х0'2572

2 7 4 5 6 7

оэду ираиеыие, мво

г > и у б 7 свои иоаиеииа, мео

80

5 I У 6 7

соои иоашеииа.мва

1 > * ? 6 7

соон иваыеииа, «в?

Рис. 6. Изменение содержания отдельных небелковых фракций при созревании соленых рыб (усредненные данные): А - крупные пептиды, В - ди- и трипептиды, С - свободные аминокислоты, Д -триптофан; 1 - неразделанные рыбы, 2 - разделанные

Сделано заключение о том, что изменение консистенции в сторону размягчения связано с работой эндопептидаз, появление вкуса и запаха можно связать с деятельностью различных экзопепти-даз, в том числе внутренних органов рыб. Установлено, что проникновение в мышечную ткань пищеварительных ферментов происхо-

г

дит в период хранения сырья на стадии перехода из состояния окоченения в автолиз. Состав продуктов протеолиза мышечной ткани рыб, разделанных в состоянии окоченения, отличается меньшим количеством всех небелковых фракций по сравнению с тем же у рыб, разделанных до исследования в состоянии автолиза, а у соленых рыб, приготовленных из неразделанного сырья и сырья, находящегося в стадии автолиза перед разделкой, 'имеет очевидное сходство (рис. 7). На основании этого был сделан вывод о необходимости обработки сельди иваси в состоянии окоченения.

Несмотря на то что пищеварительные ферменты внутренних органов рыбы проникают в мышечную ткань уже в процессе посмертных изменений сырья, установлено, что в первый период хранения существенной разницы между образцами пресервов, приготовленных из целых или разделанных рыб, по органолептическим показателям, а также по количеству и составу небелковых продуктов протеолиза не наблюдается (рис. 8). Это позволило заключить, что у разделанных и неразделанных рыб в первый период протеолиз протекает под действием протеаз мышечной ткани и что ферменты внутренних

Е.

15о гоо гвд да ян от ¿я

1/злоата, мл

Рис. 7. Состав небелковых азотсодержащих соединений (гель-хроматография ТХУ-экстрактов на сефадексе С-25) мышечной ткани сельди иваси, разделанной до посола в состоянии автолиза (1), целой (2), в состоянии окоченения (3); хранение в соленом виде в течение 4 мес; а - полипептиды, в - ди- и трипептиды, с - аминокислоты, с1 - триптофан

органов вступают в реакцию после того, как прошло предварительное воздействие на белки мышечных протеаз. Установлена обратная зависимость продолжительности (от 1 до 2 мес) этого периода, который можно назвать периодом предсозревания, от активности мышечных протеаз.

Рис. 8. Состав небелковых азотсодержащих фракций мышечной ткани сельди иваси (гель-хроматография на сефадексе С-25) соленой целой (1), разделанной (2), хранение 1 мес. Остальные обозначения те же, что на рис. 7

Полученные данные позволили предложить следующую схему про-теолиза соленых нераздеданных рыб, условно разделив весь период на несколько этапов.

Первый атап (предсозревание) происходит под действием протеаз мышечной ткани, характеризуется небольшим и практически одинаковым (у разделанных и целых рыб) количеством и составом небелковых фракций и зависит от протеолитической активности мышечных ферментов. По всей вероятности, на этой стадии нарушается расположение полипептидных цепей внутри белковых молекул, чтр, как показано нами, приводит к накоплению крупных полипе-тидных фрагментов, в чем собственно и заключается подготовка белков рыбы к последующему действию протеаз пищеварительных органов.

На основании исследований протеаз мышечной ткани предполагается, что катепсин Д играет роль пускового механизма протео-лиза, способствуя выходу из лизосом тиоловых катепсинов, проявляющих максимальную активность на белковых субстратах при рН мышечной ткани.

Второй ятагт характеризуется активно идущими процессами про-теолиза под суммарным воздействием протеаз мышечной ткани и

внутренностей. В этот период зафиксирован количественный рост всех азотистых соединений, особенно трипгофансодержащих. Образующиеся в начальной стадии крупные полипептидные фрагменты, а также белки, которые по той или иной причине оказались устойчивыми к действию мышечных эндопептидаз, подвергаются разрушению до мелких пептидов и свободных аминокислот.

Третий ятатт характеризует процессы, приводящие к образованию новых качественных признаков рыбы - вкуса и аромата, что обусловлено количественным накоплением продуктов ферментативных, химических и других реакций; немаловажную роль, по-видимому, играют вещества, образующиеся в результате реакции синтеза между продуктами деградации мышечной ткани (Сафронова, 1980). В настоящее время существуют лишь косвенные данные, свидетельствующие о возможности взаимодействия между продуктами расщепления белков и липидов при производстве или хранении пищи (Ржавс-кая, 1976; Ржавская и др., 1977). В нашей работе было проведено специальное исследование, основой которого явилось определение иминов (оснований Шиффа), которые образуются при реакции связывания малонового диальдегида с двумя аминогруппами и обладают флюоресценцией с максимумом при 450 нм при длине волны возбуждения 360-370 нм (Leake, Karrel, 1985). В результате исследований показано, что накопление оснований Шиффа происходит по мере хранения соленых рыб, и прослеживается, что у хорошо созревающих целых рыб, количество оснований Шиффа заметно выше. Так, после 4 мес хранения количество оснований Шиффа было у сельди тихоокеанской 20,3, у сельди иваси - 45,7, у горбуши -7,2, у минтая - 4,6 (мол/мл* 10"11).

Полученные данные являются доказательством взаимодействия между продуктами деградации белков и липидов при хранении соленых рыб и свидетельствуют о наличии третьего этапа созревания.

Таким образом, при исследований особенностей созревания целых и разделанных рыб экспериментально подтверждена выдвинутая

нами гипотеза о существовании первого этапа протеолиза, осущес твляемого ферментами мышечной ткани, показано существование не скольких этапов созревания, а также зависимость органолептичес кой оценки продукции от гидролитической деструкции белков.

Полученный нами экспериментальный материал и имеющаяся литературе информация послужили основой для направленного регу лирования качества соленых рыб.

Разработка твуттп.лпгтт регулирования гпярявяттхтя г. пртшяттяттвм бмплпгичепки актиттмт рягулятпрпв ттрптяплияа

Стимулирование процессов протеолиза

Анализ данных литературы показал, что применение протеол* тических ферментов, увеличивая тендеризацию мышечной ткани нг земных животных и гидробионтов, расширяет сырьевую базу и улу^ шает качество продукции .(Шендерюк, Лисовая, 1978; Wray, 198, Фофанова, Журавская, Михайлова, 1989; Липатов, Алексахинг 1991; Рариву, Большаков, 1991; Johnson et al., 1993). Сдела! заключение о том, что для повышения качественных характерней рыбной продукции ферментный препарат должен не только увелич! вать степень гидролиза белков, но и обеспечивать образован! продуктов распада с определенными вкусоароматическими признак; ми, свойственными созревшей соленой продукции.

Объектами для разработки технологии применения ферментно] препарата служили две группы рыб: плохо созревающие (терпу] ставрида, нерестовая тихоокеанская сельдь) и несозревающие (м: нтай, треска), а также ферментные препараты из внутренност рыб и ракообразных, полученные по разработанной нами технол гии.

При определении необходимой и достаточной дозы ферментно препарата исходили из положения, что в мясе соленых созревают

рыб соотношение небелкового азота к общему находится в пределах 25-30 %. Экспериментально показано, что минимальная доза ферментного препарата с активностью 2-3 ПЕ, которая обеспечивает такое накопление небелкового азота, составляет 3-5 % к массе рыбы (50-60 ПЕ на 1 кг рыбы).

При дальнейших исследованиях были установлены необходимые условия (продолжительность - 2-3 месяца и способ посола - законченный или прерванный) для проведения процессов ферментации, а также влияние хлорида натрия, которое заключается в замедлении процесса образования мелких пептидов и аминокислот.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что деградация белковых веществ мяса соленой рыбы при действии ферментного препарата сопровождается интенсивным накоплением низкомолекулярных азотистых соединений (табл. 5) что, как уже отмечалось, способствует формированию специфических качественных характеристик продукции.

Полученные экспериментальные данные явились основой для технологических схем производства ферментированного соленого полуфабриката для копчения и пресервов из терпуга, ставриды, нерестовой тихоокеанской сельди. Основным этапом технологического процесса является добавление в тузлук при посоле ферментного препарата.

Для рыб тресковых пород, обладающих, как нами показано, чрезвычайно низкой активностью протеаз мышечной ткани, разработан способ активации протеаз мышечной ткани, т.е. активации первого этапа протеолиза, путем снижения рН ткани органическими кислотами. Это, как установлено, способствует росту протео-литической активности в кислой и слабокислой зонах рН и приводит, как показано методом электронной микроскопии, к уплотнению миофибрилл. Последующая обработка ферментным препаратом, необходимое количество которого устанавливалось экспериментально

Таблица 5

Количество отдельных групп продуктов протеолиза, определенных гель-хроматографией, в мышечной ткани соленых рыб, % к Инб

Образец Полипептиды Ди- и три-пепгиды Аминокислоты Триптофан

Ставрида без

фермент, пре-

парата 19,4 15,3 52,6 12,6

Ставрида с фер-

мент. препаратом 8,1 21,3 54,0 16,2

Сельдь тихоокеан-

ская нерестовая

без фермент, пре-

парата 18,0 18,5 51,2 11,3

Сельдь тихоокеан-

ская нерестовая

с фермент, препа-

ратом 4,7 22,0 53,0 13,1

и составило 5-15 % от массы рыбы, приводит к ограниченному про-теолизу структурных белков.

На основании проведенной работы научно обоснованы следующие параметры технологического процесса обработки тресковых рыб (при температуре 0 - минус 2 0С):

- просаливание в кислотно-солевом растворе плотностью 1,0?-1,2 в течение 1,5-2 ч, количество кислоты (лимонной или уксусной) составляет 0,10-0,15 % к массе солевого раствора;

- ферментация в течение 15-48 ч с помощью ферментного препарата в количестве от 5 до 15 /2 к массе рыбы. Получаемый соленый полуфабрикат направляется на приготовление пресервов или продукции холодного копчения.

Другим вариантом приготовления ферментированной соленой продукции из тресковых пород рыб является разработанная нами технология производства продуктов из измельченного мяса минтая или трески, где завершающим этапом обработки является маринование.

• Новизна применения препаратов протеолитического действия защищена авторским свидетельством 1570696 и патентом РФ № 1547094.

Замедление процессов протеолиза

Известны примеры использования растительного сырья, содержащего ингибиторы, а также выделенных ингибиторов для консервации кормовых и пищевых продуктов. Экспериментально показано, что в качестве растительного сырья для сохранения свежей рыбы можно применять картофель, семена рапса, картофельный и кукурузный жом, пшеничную солому, ингибитор протеаз из сои (Martinez, Gildberg, 1988; Steffens, 1988; Bertelsen et al., 1991). Анализ данных литературы показал, что применение пищевых продуктов, содержащих ингибиторы растительного происхождения, перспективно в различных профилактических и медицинских аспектах (Doe 11 et al., 1981; Urna, Nita, 1985; Головченко и др., 1991).

Технологический процесс замедления протеолиза разрабатывался нами с использованием в качестве сырья сельди иваси, питающейся тихоокеанской сельди, япономорского анчоуса, сайры, черноморской кильки и лососевых. После проведенных исследований по влиянию овомукоида, ингибитора Кунитца, трех картофельных ингибиторов с различной молекулярной массой на протеазы мышечной ткани и внутренностей рыб был выбран ингибитор из картофеля смешанного типа, полученный по разработанной нами технологии, как наиболее эффективный. .

Исследование особенностей протеолиза показало, что вследствие связывания ингибитором активных центров пищеварительных протеаз рыб, гидролиз идет преимущественно под влиянием мышечных ферментов. Установление необходимой и достаточной дозы ингибитора позволило заключить, что количество ингибитора 1,5 % к

массе рыбы, (1200 антитрипсиновых единиц на 100 г рыбы) обеспечивает 30-50 %-ное ингибирование при созревании.

Показатели протеолиза у соленых кильки, анчоуса, сельди иваси, сайры, тихоокеанской сельди, приготовленных с применением ингибитора из картофеля, значительно ниже, чем в контрольных, что позволило увеличить сроки хранения продукции в 1,5-2,5 раза. Эффективность действия ингибитора подтверждена и результатами определения остаточной активности протеаз, которая при хранении пресервов (температура хранения для всех образцов -минус 4-6 °С) с ингибитором была значительно ниже (рис. 9).

Рис. 9. Остаточная активность протеаз соленой сельди иваси (неразделанной): А - через 4,5 мес хранения пресервов, Б - через 5,5 мес, В - через 1,5 года хранения пресервов; 1 - без ингибитора, 2-е ингибитором

Исследование с применением электронной микроскопии показало, что мышечная ткань контрольного варианта (сельди иваси соленой неразделанной) через месяц хранения имеет вид гомогенной массы. В образцах, приготовленных с добавлением ингибитора, ультраструктура мышечной ткани при хранении практически не отличается от таковой через 5 сут хранения: миофибриллы сохранили параллельное расположение и не потеряли четких контуров (рис. 10, 11); это свидетельствует о том, что ингибитор существенно влияет на сохранность микроструктуры мышечной ткани, ограничивая протеолиз миофибриллярных белков. Такое же заключение о структуре мышечной ткани и протеолитических процессах было сде-

г гш- г

В

"5 * 5 í ? 5 рЦ

Э А 7 б 7 » рИ

-,-,-,----------

Рис. 10. Участок мышечной ткани сельди иваси через 1 мес хранения после посола с ингибитором протеолиза, увеличение 24 тыс.

Рис. 11. Участок мышечной ткани разделанной сельди иваси через 5 сут хранения после посола, увеличение 24 тыс.

лано при исследовании соленой продукции из разделанного сырца. Полученный материал послужил основанием для рекомендации промышленности применения ингибитора созревания при обработке рыб, обладающих способностью к интенсивным протеолитическим процессам при хранении; новизна применения ингибитора подтверждена патентом РФ № 1598946.

Специально проведенными экспериментами установлено, что добавление ингибитора при посоле рыб, в том числе лососевых, позволяет снизить количество хлорида натрия в готовой продукции на 3-5 %. Экспериментальные результаты свидетельствуют об антиокислительных свойствах ингибитора, что выражается в уменьшении

количества вторичных продуктов окисления в соленой продукции по сравнению с контролем (без ингибитора) (табл. 6).

Таблица 6

Содержание карбонильных соединений в тканях тихоокеанской сельди, посоленной с применением ингибитора, в процентах к тому

же без ингибитора

Срок хранения, Из мороженого Из свежего

мес сырья сырья

3,0 74,1 49,8

3,5 87,7 — 54,9 25,5*

6,5 85,6 88,6

*Для соленой продукции из горбуши.

Совокупность полученного материала предопределила необходимость разработки технологии производства ферментного препарата и ингибитора.

Разра^птк-а труиптпрсти прпттявпдптва фррмрнтнпгп прр.ттарятя ттрптвп.71ит''иургупгп дкйптвия из рнутррннпптрй гипрпАцгттпр

Как показывает анализ данных литературы, большая часть исследований по протеолитическим ферментам внутренностей рыб была предпринята для решения вопросов физиологии питания или сравнительной биохимии (Kalac, 1978; Nöda, 1982; Проскуряков, 1983; Нехамкин, 1986; Ushida, 1986; Пивненко, 1987). Показано, что активность пищеварительных протеаз рыб подвержена сезонной изменчивости (Шендерюк, Шумарова, 1973; Этитейн и др., 1982; Jo-shinaka et al., 1984). Выделение протеаз из внутренностей рыб проводят, применяя различные технологии: гидролиз в кислой или щелочной среде (Некрасова, Голенкова, 1986, 1988; Ревина и др., 1988, 1989), методами солевого фракционирования с удалением балластных белков методом ультрафильтрации (Попова, Бикбов, 1988; Попова и др., 1989) или хроматографии (Эпштейн и др., 1982; Пивненко и др., 1986).

Объектом исследования были внутренности рыб и камчатского краба. Основная задача - разработка технологического цикла и создание производственной линии.

Исследовано влияние на активность препарата параметров гидролиза (время, рН среды), а гакасе хлорида натрия, добавляемого в качестве консерванта. Математическая обработка полученных данных методом дисперсионного анализа позволила установить, что с увеличением времени гидролиза внутренностей существенно снижается удельная активность препарата. Показано, что наибольшую активность имеет препарат, полученный в нейтральной среде. Установлено, что влияние хлорида натрия проявляется в снижении активности ферментного препарата (на 35-Б5 7»). Исследования показали, что наиболее ценным сырьем для получения ферментного препарата являются внутренности горбуши, краба, скумбрии, сельди иваси и сельди тихоокеанской (табл. 7).

Таблица 7

Активность ферментных препаратов, полученных из внутренностей

рыб и краба, ПЕ/г

Источник препарата Протеолитическая активность

рН 8,0 рН 6,0 , рН 3,6

Горбуша, рыба-сырец 29,3 7,0 0,7

Горбуша мороженая, 5 мес хран. 13,7 4,5 0,3

Ставрида, рыба-сырец 9,8 4,3 0,9

Ставрида мороженая, 3 мес хран. 4,7 1.3 0,3

Скумбрия мороженая, 3 мес хран. 4,8 1.9 1,0

Краб камчатский, сырец 4,2 5,2 -

Сельдь т/о, рыба-сырец 4,8 1,6 0,8

Сельдь иваси, рыба-сырец 4,2 2,3 0,8

Сельдь иваси мороженая,

2 мес хран. 3,2 1.8 0,7

Камбала, рыба-сырец 1.2 0,6 1,2

Минтай, рыба-сырец 0,5 0,4 0,4

Треска мороженая, 3 мес хран. 1.5 0,8 0,3

Терпуг мороженый, 3 мес хран. 4,2 0,8 0,4

Оценка препаратов, полученных из внутренностей тресковых, камбал и терпугов, показала их непригодность для производства продукции, что объясняется особенностями питания и пищеварения этих рыб.

Технические параметры линии по производству ферментного препарата обоснованы также с учетом дисперсионного анализа экспериментальных данных:

- диаметр отверстий решетки измельчителя - 8-10 мм;

- температура мороженого сырья, подаваемого на измельчение, - минус 8-10 °С;

- скорость' центрифугирования на горизонтальной центрифуге -2500 g;

- температура подаваемой на центрифугирование массы измельченных внутренностей - 35-40 °С;

- скорость подачи на центрифугирование - 1400-1600 кг/ч;

- температура массы, подаваемой на сепарирование, - 3540 °С;

- скорость подачи на сепаратор - 400-500 кг/ч.

Установлены предельные сроки хранения препарата при температуре минус 6-8 и 12 °С - соответственно 6 и 12 мес.

Научное обоснование технологических параметров позволило предложить оборудование для линии производства ферментного препарата и внедрить схему его производства, технология защищена патентом РФ № 133991?.

Разработка тр.унодогии ттплучяния гтогибитпра тгрптяпттза ттз рягугитЕЛТ.ттгп сырья

Данные литературы свидетельствуют о том, что видовой состав растений, содержащих ингибиторы, чрезвычайно разнообразен: это злаковые (Шульгин, Мосолов, 1985; Lei-Lei-Guey, Reeck, 1986; Филоник, Мосолов, 1989), пасленовые (Rodis, Hoff, 1984;

Ревина и др., 1987), бобовые (Павлова и др., 1982; Vaveloev et al., 1985), гречневые (Покровский, Белозерский, 1980; Iked, Ku-sano, 1983), тыквенные (filusz et al., 1983; Зимачева и др., 1988). Общим свойством белковых ингибиторов является способность подавлять активность протеолитических ферментов в результате образования стойких комплексов (Мосолов, 1966, 1983). Известные способы выделения ингибиторов основаны на процессах экстракции, диализа осаждения, фракционирования, хроматографии (Heigaard, 1981; Boizen, Djurtoff, 1982; Мосолов, 1983; Rodis, Hoff, 1984). Показано, что ингибиторы из сои, картофеля, ржи, кукурузы характеризуются тем, что в активном центре содержится остаток аргинина (Ozawa, Laskowski, 1966; Liu, 1968).

Выбор картофеля как источника ингибитора для использования в рыбной промышленности обусловлен набором ингибиторов, подавляющих активность как трипсина, так и химотрипсина (Hass et al., 1982; Мосолов, 1983), доступностью сырья, а также тем, что при переработке картофеля клеточный сок является отходом производства.

Экспериментальные результаты по выделению ингибиторов про-теолиза из картофельного сока и клубней позволили заключить, что наибольший выход по массе получен при использовании клубней, однако антитрипсиновая активность несколько выше у препаратов, полученных из картофельного сока. В качестве осадителя вместо сернокислого аммония нами предложено использование хлорида натрия; показано, что наиболее рациональной является 60 %-ная степень насыщения (табл. 8).

' Установлено, что ингибиторы, полученные осаждением NaCl, отличаются значительно более высокой активностью по сравнению с таковыми, выделенными осаждением (NlühSOw Гель-хроматография показывает, что в ингибиторах, осажденных ИаС1, содержатся бо-

лее высокомолекулярные компоненты, чем при осаждении (ШЬЭгБС* (рис. 12); это подтверждено с применением ВЭ1Х.

Таблица 8

Характеристика ингибиторов из картофеля

Степень на- Активность, Выход ингибит., г

Образец сыщения ATE ка мг на 100 г карто*

NaCl, % препарата феля

Ингибитор 40 1,58 2,74

из клубней 60 2,07 3,50

80 1,98 4,83

Ингибитор 40 1,92 2,01

из карто- 60 2,39 2,98

фельного сока 80 0,98 4,07

Исследование антитрипсиновой активности (ATE) ингибитора при хранении позволило рекомендовать температуру от 5 до минус 5 °С, срок хранения 3-5 мес. Новизна данного технического решения подтверждена патентом РФ № 1598946.

Рис. 12. Гель-хроматография ингибиторов, выделенных на сефадексе G-75 из картофельного сока: 1 - активность ингибитора, осажденного хлоридом натрия,

2 - сернокислым аммонием;

3 - оптическая плотность при осаждении хлористым натрием,

4 - при осаждении сернокислым аммонием

Исследование свойств полученного ингибитора позволило установить стабильность ингибитора при всех зонах pH кроме изоэлек-трической точки; показано, что ингибитор проявляет большую активность при меньшем содержании хлорида натрия, что открывает перспективы для его применения в производстве слабосоленой продукции. Исследование аминокислотного состава показало, что он

*

содержит высокое количество цистина, что объясняет его устойчивость к изменению рН.

Научно обоснованы продолжительность экстракции сырья для извлечения ингибиторов и остальные технологические параметры. На рис. 13 представлена рекомендуемая схема получения ингибито-« ра протеаз. Как видно» в результате проведенной работы технологический процесс по сравнению с принятым в биохимической практике значительно упрощен. Так* после высаливания хлоридом натрия отсутствует операция "диализ", после центрифугирования -"сублимация" и "очистка на сорбентах".

Картофель, клуони

Сортировка и мойка

Отекание влаги

Измельчение

Экстракция 1 %-ным раствором хлорида натрия в 0,1 н соляной кислоте при температ. 1520 °С в течение 1 ч

Фильтрование

Отстаивание 2-3 ч

натрия

Высаливание

насыщ.

Формирование осадка, 24 ч

Центрифугирование при 20 тыс. £

Осадок-ингибитор Сбор ингибитора

Определение ингиб. активности по трипсину

Нормализация по активности

Упаковывание, хранение

Картофельный сок

Рис, 13. Технологическая схема получения ингибитора протеаз Медико-биологические испытания ингибитора позволили установить у подопытных тавотных улучшение функционального состояния печени, почек, за счет его липотропного действия. Показано, что

использование ингибитора способствует сохранению высокой белковой ценности рыбной продукции (табл. 9).

Таблица 9

Биологическая ценность пресервов из сельди иваси

Пресервы без Пресервы с Показатель ингибитора ингибитором

Прибавка массы, г 47,814,6 49,6±6,9

Привес на 1 г корма, г 2,8±0,2 2,7*0,2

Усвояемость белка, % 89,8±0,7 88,4*1,1

Биологическая ценность, % 70,0±1,4 73,1*1,9

утилизация белка, % 62,4±1,8 63,6*2,6

Коэффициент эффективности белка, % 2,7+0,2 2,8±0,2

.Выводы

1. Теоретически обоснована возможность совершенствования технологии производства рыбной продукции, заключающаяся в изучении свойств сырья, обусловленных присутствием биологически активных веществ.

Из мышечной ткани промысловых рыб методом аффинной хроматографии выделен препарат катепсина Д со степенью очистки 200400 раз. Использование сорбентов на основе бациллихин- и грами-цидин-Б-силохромов для выделения катепсина Д из мышечной ткани рыб позволило получить препарат с достаточно высокой степенью чистоты (до 43 %) и с выходом до 26,5 %, или с выходом около 100 %, но со степенью очистки 5-10. Применение различных способов выделения и очистки катепсина Д мышечной ткани промысловых рыб проведено у нас в стране впервые.

2. Выделение и изучение карбоксильных и тиоловых протеаз мышечной ткани промысловых рыб позволило выявить важную роль этих веществ в процессах протеолиза и установить, что между содержанием катепсинов и степенью протеолиза рыб при созревании в соленом виде имеется прямая зависимость.

Показана значительная вариабельность активности тиоловых и карбоксильных протеаз мышечной ткани в зависимости от биологического состояния рыбы: так, наиболее высокой активностью протеаз мышечной ткани обладает сельдь иваси в нерестовый и преднерестовый периоды, а также рыба длиной' менее 16 см, что свидетельствует о необходимости принятия особых мер при обработке этого вида сырья.

Полученные нами данные позволяют обосновать методический подход к прогнозированию возможного течения протеолиза у тихоокеанских промысловых рыб при посоле.

3. При исследовании закономерностей созревания показано следующее:

- между количеством низкомолекулярных пептидов и органо-лептической оценкой консистенции, вкуса и запаха существует прямая зависимость;

- между количеством крупных пептидов и органолептической оценкой консистенции имеется обратная связь.

Указанные закономерности подтверждены сравнительными исследованиями при хранении целых и разделанных соленых рыб: в мышечной ткани рыб, посоленных в целом виде, количество низкомолекулярных пептидов при созревании и хранении постоянно увеличивается, а у разделанных после некоторого начального роста наступает равновесие во времени.

Установлено, что процесс проникновения в мышечную ткань рыб пищеварительных ферментов происходит уже в период хранения сырья, в частности при переходе от состояния "окоченения" в состояние "автолиз", что позволило обосновать необходимость создания особых условий для увеличения срока нахождения рыбы-сырца в окоченении и нашло отражение в соответствующей технической документации.

4. Проведенные исследования позволили выдвинуть и подтвердить гипотезу трехстадийного механизма протеолиза, условно разделив весь процесс на три этапа:

- первый этап (предсозревание), проходящий под преимущественным воздействием протеаз' мышечной ткани; в этот период вследствие действия протеаз мышечной ткани происходит накопление крупных полипептидных фрагментов; интенсивность этого процесса зависит от активности протеаз мышечной ткани рыб;

- второй этап (созревание) - под суммарным воздействием протеаз мышечной ткани и пищеварительных органов увеличивается степень гидролизуемости белков и в составе небелковых азотсодержащих соединений появляются триптофан и триптофанеодержащие пептиды;

- третий этап, приводящий к образованию основных признаков созревающей рыбы - вкуса и аромата; характерным для этого этапа процессом является взаимодействие продуктов гидролиза белков и вторичных продуктов окисления липидов. Показано, что на этом этапе происходит накопление флюоресцирующих оснований Шиффа.

На основании проведенной работы сделан вывод о возможности регулирования протеолиза при созревании рыб путем использования биологически .активных веществ, проявляющих как эндо-, так и эк-зопептидазную активность или связывающих активные центры проте-олитических ферментов.

5. Теоретически обоснована и установлена возможность стимулирования протеолиза несозревающих и плохо созревающих рыб тихоокеанского бассейна, что позволило установить:

- необходимую и достаточную дозу препарата, составляющую от 50-60 ПЕ на 1 кг рыбы (около 3 % к массе сырца) для плохо созревающих рыб (терпуг, ставрида) и до 250 ПЕ на 1 кг рыбы (515 %) для несозревающих рыб (минтай, треска);

- необходимые условия (продолжительность и способ посола) для проведения процесса ферментации.

Новизна разработанной технологии защищена патентом РФ, утверждена соответствующая техническая документация,, согласно которой произведен'промышленный выпуск соленой, копченой продукции и пресервов.

Обоснована и разработана технология двух видов продукции из измельченной мышечной ткани минтая на основе использования ферментного препарата: из внутренностей рыб; новизна технического решения подтверждена авторским свидетельством.

6. Теоретически обоснована возможность замедления протеоли-за при производстве продукции из быстро созревающих рыб. Показано, что природные ингибиторы протеолитических.ферментов, активные по отношению к трипсину и химотрипсину млекопитающих, способны подавлять активность протеолитических ферментов пищеварительного тракта рыб.

На основании результатов модельных и производственных экспериментов установлено необходимое и достаточное количество ан-титрипсиновых единиц ингибитора (1000-1200 ATE на 100 г рыбы), обеспечивающее замедление протеолиза на 30-50 %; в зависимости от антитрипсиновой активности количество ингибитора может колебаться от 0, 4 до 2 % к массе рыбы.

Установлено,, что ингибитор протеолиза может, быть применен при производстве соленой продукции в качестве антиокислителя. .

Показано', что ингибитор трипсина существенно влияет на сохранность микроструктуры мышечной ткани рыб, ограничивая протео-лиз миофибриллярных белков протеазами;пищеварительных органов.

Разработанная технология применения ингибиторов протеолиза позволяет увеличить срок хранения, соленой продукции в 1,5-2 раза. Технология производства пресервов была проверена в про-

изводственных условиях; новизна технического решения подтверждена патентом РФ.

7. Обоснована и разработана технология производства ферментного препарата из внутренностей дальневосточных гидробион-тов. Установлено, что наиболее ценным сырьем для производства ферментного препарата являются внутренности краба, горбуши, ставриды, скумбрии, сельди иваси, сельди тихоокеанской.

Технологическая схема производства ферментного препарата протеолитического действия без гидролиза позволяет существенно повысить удельную активность препарата и сократить технологический цикл, а также производственные затраты.

Показано, что стабильность ферментного препарата при хранении зависит от температуры: активность препарата в течение 3,5 мес при температуре минус 6 °С и в течение 6 мес при температуре минус 12 °С остается неизменной.

Обоснованы технические параметры линии по производству ферментного препарата: диаметр решетки измельчителя; температура мороженого сырья, подаваемого на измельчение; скорость центрифугирования; температура подаваемой на центрифугирование массы измельченного сырья; скорость подачи на центрифугирование; температура массы, подаваемой на сепарирование; и скорость подачи на сепаратор. •

Опытный образец линии по производству ферментного препарата сдан в эксплуатацию, а разработанная технология внедрена. Новизна технического решения подтверждена патентом РФ;

8. Установлена возможность получения ингибитора трипсина и химотрипсина из картофеля и отходов при его переработке (карто-' фельного сока).

Сравнительное исследование активности и выхода ингибиторов показало целесообразность использования картофельного сока для

производства ингибитора протеолиза. Исследование влияния на выход и свойства ингибиторов протеолиза хлорида натрия в качестве высаливающего агента позволило рекомендовать его для производственного процесса, обоснована рациональная степень насыщения.

На основании' исследований свойств ингибиторов, полученных при-разном времени экстракции, обоснована и установлена продолжительность экстракции ингибитора из клубней картофеля.

В результате проведенных исследований обоснована и разрабо-. тана технология получения ингибитора, которая нашла отражение в утвержденной технической документации.

Разработанная технология получения ингибиторов путем осаждения хлоридом натрия не,имеет, аналогов в мировой практике, а ее; новизна подтверждена патентом РФ.

Установлено, что ингибиторы, полученные осаждением хлоридом натрия, обладают более высокой ингибирующей активностью по отношению к трипсину, чем ингибиторы, осаждаемые сернокислым аммонием.

Показано, что ингибитор не обладает отрицательным действием на организм, и установлено, что его использование способствует сохранению биологической ценности рыбной продукции.

Технология получения ингибитора протеаз опробирована в производственных условиях.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Липатникова С.Н., Слуцкая Т.Н., Чижова Т.В. Изменение небелковых веществ, азотсодержащих соединений при созревании со-лейых рыб // Изв. ГИНРО. - 1976. - Т. 99. - С. 56-62.

2. Чижова Т.В., Липатникова. С.Н., Слуцкая Т.Н. Изменение количественного содержания некоторых фракций в составе небелковых азотистУх веществ и' отдельных классов липидов при созрева-

нии соленых сельдей // Исследования по технологии рыбных продуктов. - Владивосток: ТИНРО, 1976. - Вып. 6. - С. 46-56.

3. Слуцкая Т.Н., Купина Н.М. Биохимические особенности созревания мяса соленых рыб // 4-й Всесоюз. биохим. съезд: Тез. докл. - Л.: Наука, 1979. - С. 258. .

4. Слуцкая Т.Н., Купина Н.М., Калиниченко Т.П. Применение ферментного препарата для стимулирования созревания соленых терпуга и минтая // Рыб. хоз-во. - 1983. - N 5. - С. 62-65.

5. Слуцкая Т.Н., Купина Н.М. Теоретические предпосылки применения ферментных препаратов для стимулирования созревания соленых рыб // Изв. ТИНРО. - 1983. - Т. 108. - С. 77-89.

6. Купина Н.М., Слуцкая Т.Н., Калиниченко Т.П. Влияние хлористого натрия на активность протеолитических ферментов и состав продуктов протеолиза // Изв. ТИНРО. - 1983. - Т. 108.

7. Слуцкая Т.Н., Купина Н.М., Калиниченко Т.П. Ферментный препарат из внутренностей дальневосточных рыб и его, характеристика // Исслед. по технол. мезопелагических рыб и нерыбных объектов. - Владивосток: ТИНРО, 1984. - С. 83-92.

8. Слуцкая Т.Н., Поваляева Н.Т., Хмельницкая И.А. Применение ферментного препарата для улучшения качества пресервов из разделанной ставриды // Исслед. по технол. мезопелагических рыб и нерыбных объектов. - Владивосток: ТИНРО, 1984. - С. 93-99.

9. Леванидов И.П., Купина Н.М., Слуцкая Т.Н. Методика определения способности мяса соленых рыб к созреванию // Рын. хоз-во. - 1984. - N 9. - С. 63-65.

10. Слуцкая Т.Н., Миленина Н.И., Бондарь С.Н. Химический состав и активность протеолитических ферментов мелкой сардины иваси в зимних и весенних уловах // Рын. хоз-во. - 1985. -N 10. - С. 56-58.

11. Иголкина Л.А., Слуцкая Т.Н., Руденская Г.Н. Использование аффинных сорбентов отечественного производства для выделения катептического препарата из мышечной ткани рыб // Исслед. по технол. гидробионтов дальневост. морей. - Владивосток: ТИНРО, 1986. - С. 36-41.

12. Слуцкая Т.Н., Калиниченко Т.П., Купина Н.М. Влияние способов получения протеолитического комплекса из внутренностей рыб на,его активность // Исслед. по технол. гидробионтов дальневост. морей. - Владивосток: ТИНРО, 1986. - С. 30-36.

13. Слуцкая Т.Н., Миленина Н.И., Ломако И.А. Созревание :ресервов из разделанной и неразделанной мелкой сардины иваси '/ Рыб. хоз-во. - 1987. - N 1. - С. 65-67.

14. Слуцкая Т.Н., Иголкина Л.А., Соколова Е.В. Выделение сатепсина Д из мышечной ткани рыб // Прикл. биохим. и микроби->л. - 1987. - Т. 23, вып. 4. - С. 447-452.

15. Купина Н.М., Калиниченко Т.П., Слуцкая Т.Н. Технология Производства слабосоленой ставриды улучшенного качества // Рыб. :оз-во. - 1987. - N 5. - С. 67-71.

16. Леванидов И.П., йонас Г.П., Слуцкая Т.Н. Технология со-[еных, копченых и вяленых рыбных продуктов. - М.: Агропромиз-;ат, 1987. - 160 с.

17. Слуцкая Т.Н. Протеолитические ферменты мышечной ткани и ¡нутренностей рыб // Технология гидробионтов. - Владивосток: 'ИНРО, 1987. - С. 4-21.

18. Слуцкая Т.Н., Яснецкий Г.Н. Полипептидный состав бел-:ов мышечной ткани и тузлука соленых тихоокеанской сардины и ерпуга // Технология гидробионтов. - Владивосток: ТИНРО, 1987.

С. 77-85.

19. Слуцкая Т.Н., Андреев Н.Г., Виняр Т.Н. Активность мы-ечных пептид-гидролаз соленой горбуши // Рыб. хоз-во. - 1988.

N7. - С. 57-60.

20. Иголкина Л.А., Слуцкая Т.Н. Выделение препаратов катеп-ина из мышечной ткани рыб на специфических сорбентах // Изв. узов СССР. Пищ. технол. - 1989. - N 4. - С. 16-18.

21. Слуцкая Т.Н., Виняр Т.Н., Герасимец Л.А. Ингибитор про-еаз в технологии слабосоленой рыбной продукции // Всесоюз. се-инар " Теория и практика регулир. качества солен, и копчен, ыб. продукции": Тез. докл. - Владивосток: ТИНРО, 1989.

22. Слуцкая Т.Н., Миленина Н.И., Герасимова H.A., Синюкова .В. Влияние ингибитора протеаз из картофеля на созревание со-эных лососевых // Всесоюз. семинар "Теория и практика регулир. ачества солен, и копчен, рыб. продукции": Тез. докл. - Влади-осток: ТИНРО, 1989. - С. 59-60.

23. Купина Н.М., Слуцкая Т.Н., Логачева О.В. Разработка те-яологического режима выделения комплекса протеаз из внутрен-эстей рыб // Проблемы технологии переработки нетрадиционного арья из объектов дальневосточного промысла. - Владивосток: ШРО, 1989. - С. 44-52.

24. Слуцкая Т.Н., Артюхов И.Л., Виняр Т.Н., Миленина Н.И. Теория и практика регулирования протеолиза при производстве продукции из рыб Японского и Охотского морей // Международ, конф. по Япон. и Охот, морям: Тез. докл. - Находка, 1989..

25. Дацун В.М., Слуцкая Т.Н. Технология соленых рыбопрдук-тов и икры: Учеб. пособие для студентов по спец. "Технология рыбных продуктов". - Владивосток: Дальрыбвтуз, 1989. - 95 с.

26. Калиниченко Т.П., Синюкова C.B., Слуцкая Т.Н. Действа ферментных препаратов на протеолиз мяса несозревающих рыб Рыб. хоз-во. - 1990. - N 11. - С. 78-80.

27. Петров В.А., Лапардин М.П., Осенняя Н.Б., Слуцкая Т.

и др. Обоснование применения белкового ингибитора для регулирования протеолиза соленых рыб // Изв. вузов СССР. Пищ. технол.

1990. - N 5. - С. 46-48.

28. Слуцкая Т.Н., Миленина Н.И., Виняр Т.Н. Применение белкового препарата из картофеля для замедления созревания соленыу рыб // Изв. вузов СССР. Пищ. технол. - 1990. - N 5. - С. 52-54

29. Слуцкая Т.Н., Миленина Н.И., Ромашкин В.Н., Мосол^-В. В. Подавление активности протеиназ из внутренних органов рыб природными ингибиторами протеолитических ферментов // Прикладн. биохим. и микробиол. - 1991. - Т. 27, вып.4. - С. 529-532.

30. Слуцкая Т.Н., Миленина Н.И., Синюкова C.B. Торможение протеолиза в пресевах из сельди иваси и тихоокеанской сельди // Рыб. хоз-во. - 1991. - N 4. - С. 80-82.

31. Слуцкая Т.Н. Созревание соленых рыб // Рыб. хоз-во. -

1991. - К 7. - С. 75-78.

32. Миленина Н.И., Слуцкая Т.Н. Обоснование технологии получения ингибитора трипсина из растительного сырья и отход--его переработки // Всесоюз. науч.-техн. конф. "Совершенств технол. процесссов произв. новых видов пищ. продуктов и добс-вок. Использ. вторич. сырья пищ. ресурсов.": Тез. докл. - Киев, 1991. - 4.1. - С. 201-202.

33. Логачева О.В., Ломако И.А., Слуцкая Т.Н., Тимчишина Г.Н. Нетрадиционные продукты из минтая // Рыб. хоз-во. - 1991.-N 3. - С. 65-67.

34. Виняр Т.Н., Калиниченко Т.П., Костина Э.Н., Павловский A.M., Слуцкая Т.Н. Регулирование тендеризации мышечной ткани несозревающих рыб при посоле // Изв. ТИНР0. - 1992. - Т. 114.

35. Виняр Т.Н., Калиниченко Т.П., Костина Э.Н., Слуцкая Т.Н. Роль мышечных протеаз, в том числе Саг+-зависимых, в тенде-ризации мышечной ткани рыб // Изв. ТИНРО. - 1992. - Т. 114.

36. Виняр Т.Н., Костина Э.Н., Слуцкая Т.Н. Активность протеаз соленой неразделенной сельди иваси и ультраструктура ее тканей // Изв. ТИНРО. - 1992. - Т. 114. - С. 38-47.

37. Калиниченко Т.П., Логачева О.В., Слуцкая Т.Н., Стародубцева Н.Б. Исследование протеолитической активности и стабильности ферментных препаратов из внутренностей дальневосточных рыб // Изв. ТИНРО. - 1992. - Т. 114. - С. 87-93.

38. A.c. 1050633, МКИ А23 В 4/02. Способ определения созревания рыб при посоле / И.П. Леванидов, Т.Н. Слуцкая, Н.М. Купина, Т.В. Бавдилович (СССР). Заявлено 28.08.88; Опубл. 30.10.83, Бюл. N 40. - 12 е.: 1 ил.

39. A.c. 1570696, МКИ 5А 23 41/325. Способ получения продукта из рыбы, имитирующего мускул двустворчатого моллюска / Т.Н.Слуцкая, Н.М.Купина, О.В.Логачева, Г.Н.Тимчишина (СССР). -1990.

40. Пат. 1547094 РФ, МКИ 5А 23 134/02. Способ приготовления слабосоленой рыбной продукции из несозревающих видов рыб / Н.М.Купина, Т.Н.Слуцкая, Н.В.Стародубцева и др. - 1989.

41. Пат. 1598946 РФ, МКИ А 23 В4/02. Способ приготовления соленой рыбы / Т.Н.Слуцкая, Н.А.Герасимова, Н.И.Миленина и др. - 1990. - Бюл. N38.-5 с.

42. Пат. 1339917 РФ, МКИ А 23 134/02. Способ получения ферментного препарата протеолитического действия из внутренностей свежих или мороженых рыб / Т.Н.Слуцкая, Н.М.Купина, Т.П.Калиниченко. - 1987.

С*/.

Подписано к печати 10.02.94 г. Заказ 654, объем 2,5 уч.-изд. л.

Формат 60x84 1/16. Тираж 120 экз.

Офсетно-множительный участок ОНТИ ТИНРО Владивосток, ул. Западная, 10