автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Обоснование способа получения и применения ингибиторов протеолиза в технологии рыбных продуктов

'О <

I

На правах рукописи

«V*

МИЛЕНИНА НАДЕЖДА ИВАНОВНА

ОБОСНОВАНИЕ СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕОЛИЗА В ТЕХНОЛОГИИ РЫБНЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных и рыбных продуктов

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Владивосток - 1997

Работа выполнена в Тихоокеанском научно-исследовательском рыбохозяйственном центре (ТИНРО-центр).

Научный руководитель - доктор технических наук, с.н.с. Слуцкая Т.Н.

Официальные оппоненты - доктор технических наук, профессор Дацун В.М.

кандидат технических наук, доцент Колмогоров Ю.М.

Ведущее предприятие - ОАО «Приморрыбпром»

Защита состоится мая _ 1997 г час на

заседании диссертационного совета К 117.08.03 Дальневосточного государственного технического рыбохозяйственного университета по адресу:

690600, ГСП Владивосток, ул. Луговая, 52-Б

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Дальневосточного государственного технического рыбохозяйсгвенного университета .

Автореферат разослан "_"____апреля_ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

к.т.н. Мамедова Т.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из важных проблем для рыбообрабатывающей промышленности яатяется повышение качества продушин за счет замедления протеолиза, что актуально как при производстве соленой рыбы и пресервов, так и при хранении сырья и производстве фаршей.

Замедление протеолиза при посоле разделанных л неразделенных рыб, характеризующихся высокой активностью протеиназ мышечной ткани и пищеварительных органов, может быть обеспечено различными приемами.

На современном этапе развития технологии из нескольких известных способов осуществления этого процесса - разделки с удалением внутренностей, замораживания готовой продукции, применения специфических ингибиторов протеолиза - последнее в экономическом и организационном алане предпочтительнее (Слуцкая и др.,1990). Поэтому поиск, выделение, характеристика ингибиторов протеиназ имеет определенное научное и практическое значение.

Поскольку в технологии пищевых продуктов могут быть использованы только те ингибиторы, которые не оказывают вредного воздействия на организм человека, большое значение имеет изучение возможности получения таких ингибиторов из растительного сырья, а также - изучение их свойств. Применение ингибиторов для замедления протеолиза скорее всего должно развиваться с учетом следующих факторов: доступности сырья и простоты технологического процесса получения самого ингибитора, а также - его свойств, основным из которых должна быть способность ингибитора связывать активные центры протеиназ рыб.

Использование в пищевой промышленности известных ингибиторов из растительного сырья, обладающих активностью по отношению к различным протеиназам и выделенных в чистом виде (Мосолов, 1983; Валуева и др.. 1983; Алексеева, Федуркина 1987; Зимачева и др., 1988; Ревина и др., 1987; Heigard. 1989; Rodis, Hoff, 1984), не представляется целесообразным в силу сложности процесса выделения и дороговизны конечного продукта. Поэтому применение их рассматривалось лишь в научном аспекте.

Цель и задачи исследовании. Целью настоящей работы является обоснование способа получения и применения ингибиторов протеиназ в технологии рыбных продуктов.

Для достижения постатейной цели необходимо было решить следующие задачи:

- научно обосновать рациональную технологию получения из сои и растительных отходов ингибиторов протеиназ, активных по отношению к основным протеолитическим ферментам рыб: сериновым и цистеиновым;

провести сравнительное исследование физико-химических свойств ингибиторов из растительного сырья;

- научно обосновать способы применения ингибиторов при производстве соленой продукции и пресервов, а также продукции на основе фаршей;

- разработать рекомендации по технологии производства рыбной продукции с применением ингибиторов, в том числе пресервов и фаршей.

Научная новизна. Научно обоснованы технологические параметры получения ингибитора протеиназ из сои и растительных отходов, в том числе - соевой половы;

исследованы физико-химические характеристики ингибиторов протеиназ и установлены различия в составе ингибиторов в зависимости от вида растительного сырья;

показано влияние посмертного состояния рыб, их видового состава и количества ингибитора на эффективность замедления протеолиза;

научно обоснованы способы замедления протеолиза при производстве рыбных продуктов - пресервов и продукции на основе фарша из минтая.

Практическая значимость работы. Разработана технология получения ингибиторов протеиназ из сои и соевой половы для замедления протеолиза при производстве рыбной продукции и хранении сырья;

Установлены рациональные дозировки ингибиторов протеиназ при производстве рыбной продукции;

Разработана и утверждена техшгческая документация на технологию производства пресервов и ингибиторов протеиназ из растительного сырья:

ТУ 9272-067-0047212-96 "Пресервы "Приморские"; ТИ № 36-66-96.

ТУ 15-01 1602-92 "Ингибитор протеаз"; ТИ № 442-92; Изменение № 1 и № 2 к

ним;

Реализация результатов исследований. Выпущены опытно-производственные партии пресервов из сельди иваси, мойвы, питающейся жирной тихоокеанской сельди с добавлением ингибиторов протеиназ.

Продукция получша одобрение на дегустационных совещаниях ВРПО "Дальрыба" и ТИНРО 1988 - 1995 гг.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на:

Всесоюзной научно-технической конференции "Совершенствование технологических процессов производства новых видов пищевььх продуктов и добавок. Использование вторичного сырья пищевых ресурсов" (Киев, 1991 г);

Международной конференции "Технология переработки гидробионтов" (Москва, 1994);

Международной конференции "Проблемы качества потребительских товаров и коммерческой деятельности в условиях рынка", 1995 г, Владивосток;

Юбилейной научной конференции, 8-12 апреля 1996 г, Владивосток, Дальневосточный Государственный институт рыбной промышленности;

Ученых Советах ТИНРО-центра в 1990-96 гг.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 15 работ, в том числе патент № 1598946, заявка на патент, приоритетная справка 018200 от 17.06.96 г.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, 3 глав, выводов, списка использованной литературы и приложений. Работа ихтожена на 154 с. основного текста, содержит 25 таблиц, 38 рисунков и 4 приложения. Список литературы включает 189 наименований отечественных и зарубежных авторов. В приложениях приведены нормативная документация на ингибиторы протеиназ из сои и соевой половы, пресервы из мойвы и сельди иваси с применением ингибитора протеиназ, а также протоколы дегустационных совещаний по определению качества пресервов из сельди иваси, мойвы, тихоокеанской сельди с ингибитором протеиназ из картофеля, сои и соевой половы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность темы, сформулирована цель исследования и намечены пути ее достижения.

Обзор литературы. Проведен анализ данных, содержащихся в работах отечественных и зарубежных исследователей, посвященных содержанию

ингибиторов в растительном сырье, механизму действия, разнообразию свойств ингибиторов протеиназ, методам выделения их из различного растительного сырья, роли ингибиторов, отводимой в производстве пищевых продуктов. Рассматриваются данные по изменению содержания ингибиторов при развитии растений, а также результатам медико-биологических экспериментов, отражающих влияние ингибиторов на функционирование различных систем в организме человека и животных.

Большой раздел посвящен сообщениям по формированию исследований, связанных с регулированием прогеолиза при производстве продукции из быстросозревающих рыб.

Кроме того, рассматриваются материалы по группе ферментов мышечной ткани рыб, проявляющих активность при высоких температурах, которым отводится большая роль в развитии эффекта модори (ослабление или разрушение структуры геля) при производстве рыбных продуктов на основе фаршей.

Объекты и методы исследования. Сырьем для исследований по технологии получения ингибитора протеолиза являлась соя-сырец, соевый материал, получаемый на разных стадиях производства растительного масла, а также соевая полова (промышленная партия) и другие растительные отходы:

- оболочка стручков сои

- оболочка стручков фасоли белой

- оболочка соевого зерна

- оболочка рисового зерна

Объектами для исследований по разработке способов применения ингибиторов протеолиза в технологии рыбных продуктов являлись :

1. Анчоус япономорский - Ег^гаиНэ ^арошсиБ;

2. Минтай - Трега0га сЬа1со8гатта;

3. Мойва - МаПоШБ уШокив;

4. Сардина тихоокеанская (сельдь иваси) - 8агё1поря хас!ах текто.чп^а

5. Сельдь тихоокеанская - С1иреа ра11ах1 ракш.

Определение общей химической характеристики объектов исследования, сырья и продукции проводили согласно ГОСТу 7636-85, содержание белка по Кьельдалю ГОСТ 7636-85 и/или методу Бредфорда (АррепппЬ, Л1Щ51сп, 1987).

Алтитрипсиновую активность ингибитора определяли по методу Каверзневой (Каверзнева, 1971), модифицированному нами. За единицу антитрипсиновой активности (ATE) принимали такую активность ингибитора, которая снижала интенсивность протеолиза под действием трипсина на 0,1 единицу оптической плотности при 670 нм.

Активность ингибитора по отношению к цистеиновым протеиназам определяли с казеином в качестве субстрата по модифицированному методу Кунитца (Sgarbieri, et al, 1964). За единицу ингибиторной активности принимали количество ингибитора, подавляющее активность 1 мг фицина.

Фракционный состав ингибиторов протеиназ определяли с помощью ВЭЖХ на хроматографе высокого давления Shimadzu LC-9A с колонкой Shim-pak Diol 150.

Для идентификации отдельных фракций ингибиторов применяли метод многоволнового детектирования с помощью детектора SPD-M6A( UV-VIS Detector); при этом сравнение проводилось с известными ингибиторам Кунитца и Баумана-Бирка. Молекулярную массу фракций ингибитора определяли с помощью ВЭЖХ и электрофореза в денатурирующих условиях по методу Лэммли (Laemmli, 1970).

Для выделения цистеиновых ингибиторов белка использована ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе .

Рациональную дозировку ингибиторов при заготовке образцов соленой рыбной продукции определяли по модифицированному нами методу самопере варивания мышечной ткани и пищеварительных органов рыб (Леванияов и др., 1973).

Образцы готовили по действующей технологической инструкции к ТУ 15-01 1603-91 с изменениями:

при хранении рыбы-сырца в смеси охлажденной морской воды и льда добавляли ингибитор протеиназ;

ингибитор протеиназ вносили в солевой раствор, используемый при производстве пресервов из рыбы-сырца или мороженой рыбы;

ингибитор протеиназ использовали при хранении рыбы-сырца в охлажденной морской воде со льдом и вносили в солевой раствор, используемый при производстве пресервов;

при производстве мороженой рыбы использонаш сырец, хранившийся в охлажденной морской поде со льдом и добаатением ингибитора протеиназ;

при производстве пресервов с добавлением ингибитора протеолиза в солевой раствор использовали рыбу, хранившуюся до замораживания в охлажденной морской воде со льдом и внесением ингибитора протеиназ.

Интенсивность протеолиза оценивали по накоплению небелковых азотистых веществ, определяемых по Кьельдалю, буферности (ГОСТ 7636-85), содержанию концевых КГЬ-групп (Дарбре, 1989), содержанию отдельных аминокислот (аргинина, фенилаланина, тирозина) на аминокислотном анализаторе Hitachi-335.

Влияние 1гнгибитора на деструкцию тяжелых цепей миозина определяли с помощью электрофореза (Остерман, 1981).

Ингибирование (%) рассчитывали по формуле:

И, » = 100 ( 1 - (N„gl - Nh62) / (NIl53 - N,l64)) где NU6l - содержание небелковых азотистых веществ в пробе с добавлением ингибитора после термостатирования, N„^2 - то же в пробе без термостатирования , \т,,бЗ - содержание небелковых азотистых веществ в пробе без ингибитора после термостатирования, NH64 - то же в пробе без термостатирования (Слуцкая, Миленина и др., 1991)

Консистенцию продукции оценивали по предельному напряжению сдвига (Па) на полуавтоматическом пенетрометре конструкции В-Д.Косого и др. (А.с. 731373, 1980) и разрушающему усилию геля на приборе Food-checker.

Влияние ингибиторов протеиназ на возможное отдаленное общетоксическое, мутагенное и аллергическое действие оценивалось при медико-биологическом исследовании экспериментальной продукции в ВГМУ.

При анализе полученных данных использовали методы математической статистики. Определение параметров эмпирической калибровочной прямой при проведении ВЭЖХ проводили путем линейного парного регрессионного анализа (приближение функций по методу наименьших квадратов).

Аппроксимация данных для значительной части полученных зависимостей осуществлялась с использованием метода полиномной регрессии (Дьяконов, 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка технологии производства ингибитора протепназ из сои При обосновании технологических параметров использован расчет условной активности препарата, определяемой как произведение выхода (в г на 100 г исходного материала) на его активность (ATE / 1 мг препарата). Первым этапом

исследований являлось установление атияния гидромодуля на полноту извлечения ингибитора. Как видно из представленных в табл. 1 данных, самую высокую условную активность имел препарат, полученный при соотношении материал : экстрагент 1:4, которое рассматривалось как необходимое и достаточное.

Исследование влияние природы и концентрации экстрагента позволило установить, что лучший результат получен при использовании 0,1 N HCl + 1 % NaCl, а также 0,25 N H2S04 (табл. 2).

Таблица 1

Характеристика ингибиторов прогеиназ из сои, полученных при различном гидромодуле, экстрагент 0,25 N H2SO4

Гидромо- Выход, Содерж.. Удельная Активность Условная

дуль % NaCl, активность, препарата, активность,

% АТЕ/мг белка АТЕ/мг ATE

1:2 23,6 10,1 12,3 1,60 37808

1:3 40,5 10.1 13,5 1,26 51030

1:4 52,2 12,0 14,2 1,31 68358

1:5 53,8 12.2 И,1 1,25 67250

1:6 55,8 9.6 10,8 1,18 65844

1:10 54,9 9.8 10,6 1,22 66978

Таблица 2

Характеристика ингибиторов протеиназ из сои, полученных при использовании различных экстрагентов, гидромодуль 1:4

Экстрагент Выход, Содерж.. Удельная Активность Условная I

% NaCl, активность, препарата, активность,

% АТЕ/мг белка АТЕ/мг ATE -

0,1 n h!s04 26,0 10,72 9,5 0,83 21580

0,25 n H^S04 52,2 12,02 12,1 1,31 68358

0,1 n HCl 55,0 11,29 3,6 0,33 18150

0,1 n HCl + 44,8 11,0 16,9 1,60 71680

1 % NaCl

При исследовании влияния продолжительности экстракции на выход и активность ингибитора устаноатено (рис.1), что пропорциональная зависимость условной активности препарата от времени сохраняется в течение 2-х час, дальнейшее увеличение времени экстракции дает незначительный эффект.

Таким образом, при получении ингибитора из сои продолжительность экстракции рекомендована не менее 2-х и не более 3-х час.

Рис.1. Изменение условной активности ингибитора протеиназ из сон в зависимости от продолжительности экстракции

Продолжительность экстракции, ч

При определении необходимого количества осадителя установлено (табл. 3), что для получения ингибитора с более высокой активностью степень насыщения должна бьггь не менее 40 % и не выше 60 %, т.к. дальнейшее увеличение степени насыщения осадителя не рационально. Аналогичная зависимости и результаты получены с экстрагентом 0,1 N НС1 с 1 % №С1.

Выбор рациональной степени насыщения проводился также с учетом того, что наиболее чистые препараты (с более высокой удельной активностью) получены при степени насыщения 40 % - 60 %. Подтверждением этому служат данные хроматографического разделения, свидетельствующие о том, что доля фракции с молекулярной массой 23107 - 23307, идентифицированной как соевый ингибитор Кунитца, в этих условиях максимальна и составляет 27,6 и 20,7 % соответственно .

Таблица 3

Характеристика ингибитора протеиназ из сои в зависимости от степени насыщения хлоридом натрия (экстрагент 0,25 N Н^Од), время экстракции 3 час

Степень насыщ. №01,% Выход, % Содерж. №С1, % Удельная активность, АТЕ/мг белка Активность препарата, АТЕ/мг Условная активность, АТЕ

20 39,0 6,8 9,7 0,90 35100

40 45,9 11,9 18,6 1,57 72063

60 53,6 16,3 15,9 1,27 68072

80 60,3 20,4 14,2 1,16 70006

Кроме хлорида натрия, для осаждения ингибиторов протеиназ из экстракта использовали сульфат аммония, со степенью насыщения от 20 до 60 %.

При использовании в качестве осадителя (N(-14)2804 обязательной операцией является последующее удаление его из конечного продукта путем диализа с последующей сублимационной сушкой.

Сравнение активности и выхода при осаждении ингибитора (МН^БО.) разной степени насыщения показало, что рационатыю использование 20 % насыщения.

Полученные ингибиторы практически в равной степени подаачяют активность трипсина и химотрипсина (табл.4).

Таблица 4

Характеристика лиофильных препаратов ингибиторов протеиназ из сои

Степень Выход, Активность Активность по Условная

Экстра-гент насыщения. % % по трипсину, АТЕ/мг преп. химотрипсину, АХЕ/мг преп. активность, ATE

0,25 к 20 7,20 4,80 4,50 34560

H.S04

0,25 к 40 5,38 7,28 6,20 39166

tbSO.,

0,25 к 60 5,30 7,00 5,40 37100

H1SO4

0,1 n

НС1 + 20 5,14 7,23 5,30 37160

1 %

NaCl

Получение ингибиторов протеиназ из продуктов переработки сои и некоторых растительных отходов.

Практический интерес представляет использование для производства ингибиторов растительных отходов, в том числе получаемых при производстве растительного масла : при подготовке сырья (обрушивании сои) - соевая полова, после бензиновой экстракции - белковый концентрат (шрот).

Установлено, что значительная часть активного компонента денатурирует после термической обработки и бензиновой экстракции, что не позволило рекомендовать шрот для получения ингибитора протеиназ.

Соевая полова, условная активность препаратов из которой колеблется от 3000 до 14000 ATE в зависимости от наличия зерновых примесей, рекомендована как сырье для получения ингибиторов.

Условия получения ингибиторов из соевой половы, а также других растительных отходов, подбирались экспериментальным путем на основании работ, проведенных с использованием в качестве сырья - сои.

Для данных материалов установлены рациональный гидромодуль (1:8) и продолжительность экстракции (3 час).

Сравнительная характеристика полученных препаратов свидетельствует о возможности производства из растительных отходов ингибиторов протеиназ, условная активность которых не уступает картофельному (табл. 5).

Таблица 5

Выход и активность ингибиторов протеиназ из растительного сырья

Образец Выход, % Белок, % Активность, АТЕ/мг препарата Удельная активность, АТЕ/мг белка Условная активность, АТЕ

Стручки сои 9,99 1,63 0,50 30,68 4995

Стручки фасоли белой 11,06 1,56 0,23 14,74 2544

Оболочка соевого зерна (полова) 12,64 11,02 0,69 6,26 8722

Оболочка зерна риса 11,03 6,08 0,45 7,40 4964

Картофель 4,00 4,12 1,35 32,77 5400

Полученные экспериментальные материалы свидетельствуют о перспективности

различных отходов зерноперерабатывающей промышленности для производства ингибитора протеолиза.

Физико-химическая характеристика ингибиторов протеиназ из сои и соевой половы.

Результаты хроматографического разделения ингибиторов из сои и соевой половы свидетельствуют о существенном различии их состава, что выражается в разном количественном содержании фракций, идентифицированных как соевый ингибитор Кунитца, Мг 23700 - 24800, и ингибитор цистеиновых протеиназ, Мг 11600 - 11750 (табл.6).

Таблица 6

Результаты ВЭЖХ ингибиторов протеиназ из сои (I) и соевой половы (II).

Время удерживания, мин Мг Да Содержание, %

I II I II \ II

16,367 16,465 24800 23700 15,66 22,16

18,164 18,146 11600 11750 3,05 35,68

- 19,082 - 7827 - 16,94

О : 10 15 2(1 > Л

Время удерживания, чин

Рис.2. Характеристика ингибиторов из сои и половы по фракционному составу:

1 - ингибитор протеиназ из сои;

2 - ингибитор протеиназ из соевой

половы.

Сравнение спектров поглощения многоволнового ЦУ-детектирования фракций с временем удерживания 16.36 в препаратах из сои и соевой половы и соевого ингибитора Кунитца свидетельствуют об идентичности этой фракции и соевого ингибитора Кунитца (рис.3).

.111 ((«№) ИГ=16.45ип 1МС= 218(1«.)-, .816 ои/ш яиц. ш шнтг= .5557 .038 сои/т 511111. и/ ВАитИ= .6962

¿229-240—:

.399 <яи/ге) Н1=16.33»!Т! ЮХ= 218(1«.)-, .816 «и/те) вти. и/ кш1гк= .9903 .838 (АИ/ге) БШИ. и/ ШПОН? .8253

(т)

Рис.3. Результаты сканирования в ЦУ-области спектров поглощения и отношение поглощения: на разных длинах волн: а) фракция ингибитора протеиназ из соевой половы с временем удерживания 16,45 и соевые ингибиторы;

б) фракция ингибитора протеиназ из сои с временем удерживания 16,33 и соевые ингибиторы.

С помощью ионообменной хроматографии, электрофореза установлено, что фракция ингибиторов с Мг 11600 представлена цистеиновыми ингибиторами; это иллюстрируется результатами определения влияния на активность цистеиновых протеиназ (рис. 4).

Ингибитор, мкг

Рис.4. Действие ингибитора из соевой половы на протеолитичес-кую активность цистеиновых протеин аз:

1 - филин (3,53 мкг)

2 - бромелаин (8,25 мкг)

3 - папаин (9,45 мкг)

4 - химопапаин (8,25 мкг)

Полученная совокупность данных позволила заключить, что ингибитор протеиназ из половы характеризуется более выраженной антицистеиновой активностью, в то время как ингибитор из сои - антитрипсиновой. Установленный срок хранения ингибиторов при температуре 5 - О °С составляет 3 мес.

Таким образом, представленный экспериментальный материал позволил обосновать технологию производства ингибиторов протеолиза, активных по отношению к сериновым и цистеиновым протеиназам рыб.

Обоснование рациональной дозировки ингибиторов протеиназ при производстве рыбной продукции Вследствие различий испытуемых объектов по активности протеиназ необходимым являлось определение рациональной дозировки ингибитора для замедления протеолиза путем проведения модельных экспериментов. При этом исходили из того, что рациональной дозировкой является такая, при которой дальнейшее увеличение количества ингибитора не приводит к пропорциональному изменению степени ингибирования. Как видно из результатов, представленных на рис. 5 при производстве пресервов дозировка ингибитора для анчоуса должна составлять не менее 1200, для мо£'|Вы - 600, для питающейся тихоокеанской сельди -1000 АТЕ/100 г рыбы.

Дозировка ингибитора АТЕ/ЮОг ткани

Рис. 5. Обоснование рациональной дозировки ингибиторов протеиназ: из картофеля (А, В) и сои (Б)

А - действие протеиназ мышечной ткани;

Б - суммарное действие протеиназ мышечной ткани и внутренних органов;

В - 1 - действие протеиназ пищеварительных органов;

2 - действие протеиназ мышечной ткани.

Применение ингибиторов для замедления протеолиза

Использование ингибиторов для хранения рыбного сырья. В процессе хранения сырья возможен диффузионный переход ферментов из пищеварительного тракта в мышечную ткань рыбы. Так, результаты исследования показали, что накопление N„g в мышечной ткани япономорского анчоуса разделанного после вылова и замороженного составляет 30, а разделанного после дефростации - 144 (мг/100 г).

Проведенные эксперименты свидетельствуют, что использование ингибитора протеиназ при хранении рыбного сырья перед посолом позволяет замедтить процессы протеолиза в готовой продукции.

В пресервах 2-х мес хранения, приготовленных из анчоуса, хранившегося 1-2 час в охлажденной морской воде при соотношении 1:1 с добавлением ингибитора в количестве 39000 ATE в расчете на 1 кг рыбы, накопление небелковых продуктов

протеолиза составляет 76,3 % от этого показателя в пресервах, приготовленных из того же сырья без ингибитора, и 85 % - в 4 мес. хранения (рис. 6.А).

Степень ингибирования при данном технологическом приеме ослабевает в течение времени, предположительно из-за частичного расщепления ингибитора активными протеазами анчоуса. Отмеченная тенденция подтверждается при анализе данных по накоплению продуктов протеолиза в пресервах из сырца, хранившегося в охлажденной воде с добавлением ингибитора и последующим внесением ингибитора в тузлук в количестве 1200 АТЕ/100 г рыбы, и из сырья только с добавлением ингибитора в туатук. Устаноатено, что ингибирование за счет обработки сырья составляет от 3 до 8%.

.80-

а

в'

о

к 60-

ю я й

40-

•а К о

ю а ¡5

20-

2 4

Срок хранения, мес

Срок хранения, мес

1600-

'400.

1200-

1000-

600-

-1—I—I—.—1—I

О 1200 2400

Дозировка ингибитора, АТЕ/ЮОг

Рис.6. Эффективность ингибирования в пресервах из свежего (А, В), мороженого (Б) япономорского анчоуса в зависимости от способа внесения ингибитора и дозировки:

| -хранение в охлажденной воде с ингибитором; -добавление ингибитора в тузлук;

| -хранение в охлажденной воде с ингибитором + внесение ингибитора в тузлук;

1- пресервы 5 мес хранения;

2- пресервы 3 мес. хранения.

800-

Следует отметить, что степень ингибирования протеолиза в образцах пресервов с добавлением ингибитора в туиук в процессе хранения продукции возрастает вследствие стабилизации процесса на определенном уровне в образцах с ингибитором и постоянного роста содержания продуктов протеолиза в контрольных образцах (без ингибитора).

Исследование интенсивности протеолиза при хранении опытно-производственной партии пресервов из анчоуса с различной дозировкой ингибитора подтвердило необходимую и достаточную дозу ингибитора (рис 6,В).

Эффективность ингибирования при использовании для приготовления продукции (пресервов из япономорского анчоуса) мороженого сырья ниже, чем свежего: отношение N,[6 опытного обр./К,,5 контрольного (без ингибитора) в пресервах из мороженого сырья выше на 10-16 %, чем в пресервах из свежего (рис. 6,Б).

Полученные результаты позволяют предположить, что стабилизация ферментного гидролиза более эффективна на начальном этапе процесса, это подтверждено при исследовании изменения интенсивности протеолиза в пресервах из мойвы в различном посмертном состоянии - посмертного окоченения и разрешения окоченения (табл. 6).

Расчет отношении Мцб опьггн./^иб контр, показывает, что при использовании сырья в состоянии посмертного окоченения эффективность ингибиторов выше на 59%.

Таблица 6

Эффективность ингибирования под действием различных ингибиторов в пресервах из свежей мойвы в состоянии посмертного окоченения (I) и начала разрешения

посмертного окоченения (II) (N„6 о,,мтн./Н,г, ^гт. - %)•

Срок хранения пресервов, мес. Картофельный Соевый

I II I II

4 64,5 75,9 81,3 86,1

5 62,5 72,8 77,8 86,4

6 61,3 66,8 74.9 84,6

Среднее 62,8 71,8 78,0 85,7

Анализ данных по интенсивности протеолиза в пресервах с различным количеством ингибитора показал (на примере пресервов из анчоуса, рис. 6), что

дозировка 1200-1400 АТЕ/100 г является рациональной, что хорошо согласуется < результатами модельных экспериментов.

Применение ингибиторов протеиназ при производстве пресервов из анчоуса мойвы позволяет замедлить протеолиз в той же степени, что и разделка с удалением внутренностей (табл. 7).

Результаты исследований интенсивности протеолиза в образцах пресервов и: мороженой неразделанной питающейся тихоокеанской сельди с ингибиторои протеиназ из соевой половы показали, что в начальный период хранения в течение 2,5 мес. нет заметной разницы в накоплении N„6, в то же время структур; мышечной ткани существенно изменяется, о чем свидетельствуют результать определения предельного напряжения сдвига (рис. 7).

Таблица '

Сравнительная оценка влияния ингибиторов протеолиза и разделки сырья на интенсивность протеолиза в пресервах из япономорского анчоуса и мойвы

Пресервы из Пресервы из

Срок разделанной неразделанной

Образец хран., рыбы , Дозоровка рыбы с

мес. N[¡6 опыта./ ингиб.,. ингибитором,

/ЭДдб конто. > % АТЕ/ЮОг Nh6 опьгш./ -

/Nh6 кпнтр.! %

Пресервы из 1 70,5 2400 67,5

анчоуса сырца 3 55,5 1200 55,1

3 55,5 2400 49,8

Пресервы из моро- 2 62,5 1300 76,5

женого анчоуса

Пресервы из мойвы 4 77,9 1950 86,1

в сост. разрешения 5 69,9 1950 72,8

поем, окоченения 6 53,3 1950 66,8

я 2

ПНС, Па

0 2 4 6 8 Срок хранения, мес

0 2 4 6 8 Срок храпения, мес

Рис.7. Изменение Ын5 и показателя предельного

напряжения сдвига в образцах пресервов из мороженой неразделанной тихоокеанской сельди в процессе хранения:

1 - с ингибитором из соевой половы;

2 - без ингибитора.

Полученные результаты

были проверены на опытно-производственных партиях пресервов из мойвы, япономорского анчоуса, тихоокеанской питающейся сельди, приготовленных с рекомендуемыми добавками ингибиторов. Сделано заключение, что применение ингибиторов позволяет замедлить протеолиз и увеличить срок хранения продукции в 1,5-2 раза по сравнению с принятыми.

Ингибирование протеиназ мышечной ткани. В модельных экспериментах показано, что ингибитор оказывает влияние на мышечные протеиназы, что послужило основанием для испытания данных препаратов при производстве пресервов из разделанной рыбы, отличающейся высокой активностью протеиназ мышечной ткани.

Результаты определения содержания небелковых (N,,6) продуктов протеолиза в опытной продукции свидетельствуют о влиянии ингибиторов на протеолиз (рис.8).

Рис.8. Изменение N„6 в пресервах из разделанной мойвы (в состоянии разрешения посмертного окоченения) с различными ингибиторами протеиназ:

1-без добавления ингибитора;

2-картофельный ингибитор, 1950 ЛТЕ/100 г;

3 - соевый ингибитор, 1950 АТЕ/100 г.

600

Срок хранения, мес

5000

4000-

зооо-

2000-

юоо-

Представленные данные позволили сделать заключение о перспективности использования ингибиторов для снижения при необходимости активности мышечных протеиназ.

Известно, что одним из важнейших этапов получения аналоговой деликатесной продукции на основе фаршей рыб является процесс нагревания до температуры денатурации белков. Установлено, что при медленном подъеме температуры во время приготовлен ия продукта происходит значительное ослабление структуры геля или гель вообще не образуется (Ктовйка сС а1.,1990).

Исследования показали, что данное явление связано с процессом протеолиза миозина под действием термоактивных протеиназ, температурный оптимум которых лежит в диапазоне 50-60 °С. Такое явление названо - модори, а ферменты, индцирующие его - "модори индуцирующие протеиназы" (МИП).

Наличие термоакгивных протеиназ в фарше минтая (сурими) и возможность снижения их активности ингибиторами протеиназ показаны на рис. 9,10.

Исследование состава основных структурообразующих белков сурими, подвергнутых нагреванию при 50 °С, позволило установить, что в образцах без добавления ингибитора наблюдается быстрое разложение основного структурообразующего белка тяжелых цепей - миозина. При этом появляется значительное количество фрагментов с молекулярной массой, большей, чем у актина и с меньшей, чем у миозина. Напротив, в присутствии ингибитора, деградации миозина не наблюдается. дЕщ, Рис.9. Влияние температуры на

0.15-

интенсивность автопротеолиза сурими

1 - 55 °С

2 - 65 °С, * - с добавлением 2,5% КаС!.

0.10-

0.05-

0.00

О

2

3

4

5

Время, ч

Рис. 10. Изменение содержания продуктов

0.15-

автопрогеолиза (а Егхо) фарша сурими при

О 05-

3

внесении ингибиторов протеиназ:

1 - соевый;

2 - картофельный;

3 - без ингибитора (контроль).

0.00

о

3

Время, ч

Исследования водорастворимой фракции азотсодержащих соединений (ВАС) при автопротеолизе сурими (температура 50 °С) показало, что при внесении ингибиторов увеличение ВАС незначительно, причем более эффективным является ингибитор из соевой половы (рис.11), что, возможно обусловлено подавлением активности сериновых и цистеиновых протеиназ. Контроль за изменением количества свободных аминокислот показал, что ингибитор протеиназ (из сои) позволяет инактивировать термоактивные протеиназы, обладающие экзопептидазной активностью (рис.12).

240

азотсодержащих соединений при автопротеолизе

фарша сурими при 50 °С:

1 - без ингибитора;

2 - ингибитор из соевой половы;

3 - картофельный;

4 - ингибитор из сои.

Рис.11. Изменение водорастворимых

80

0

3

4

Время, ч

5 10 15 20 Время,ч

>> £

® 200 И

0 5 10 15 20 25 Время, ч

т-Г"

0 5 10 15 20 25

Время, ч

Рис.12. Влияние ингибитора на накопление свободных аминокислот при автопротеолизе фарша минтая:

А - тирозина; 0 - контроль;

Б - фсшшалашша; 1 - 1% ингибитора;

В - аргинина; : 2- 2% ингибитора.

Добавление ингибиторов позволило сохранить структуру геля: разрушающее усилие геля при использовании ингибиторов из сои и картофеля практически остается на исходном уровне. Эффективность ингибитора из соевой половы несколько ниже, однако достаточно высока, что позволило рекомендовать его для использования в производстве фаршевых изделий, подвергающихся термообработке (рис.13).

Рис.13. Изменение разрушающего усилия геля (в % к исходному) при автопротеолизе фарша минтая при 50 °С.

1-контрольный (без ингибитора);

2-ингибитор из соевой половы;

3-картофельный ингибитор;

4-ингибитор из сои.

о

Ьн

и

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что применение ингибиторов протеиназ перспективно для сохранения структуры изделий из сурими и улучшения качества готовой продукции.

ВЫВОДЫ

1. Научно обоснована технология получения растительных ингибиторов протеолиза, активных по отношению к протеиназам гидробионтов. Определены основные параметры процесса:

- экстрагенты 0,1 N HCl + 1 % NaCl; 0,25 N H2S04;

- продолжительность экстракции 3 часа;

- гидромодуль 1 : 3 (для сои), 1 : 8 (для растительных отходов);

- рациональная степень насыщения NaCl 40 - 60 % и (NH^jSC^ - 20%.

Новизна технического решения подтверждена патентом.

2. С использованием ВЭЖХ, ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, электрофореза установлено, что количество ингибитора типа Кунитца (молекулярная масса 23 кДа) в препарате из сои в 2-3 раза выше, чем в препарате из соевой половы; в препарате из соевой половы в 3 раза выше количество ингибиторов цистеиновых протеиназ молекулярной массой 11 кДа и 7 кДа. Показано, что ингибитор из соевой половы обладает более высокой активностью по отношению к протеазам мышечной ткани (цисгеиновьгм) чем из сои.

3. Научно обоснованы способы замедления протеолиза при хранении сырья, производстве пресервов и продукции на основе фаршей с помощью специфических ингибиторов:

- внесение ингибиторов в охлаждающий раствор при хранении рыбного сырья;

- обработка сырья перед замораживанием;

- внесение ингибиторов в солевой раствор (тузлук), используемый для посола;

- внесение ингибиторов в фарш, направляемый на термообработку.

4. Установлены рациональные дозировки ингибиторов для замедления протеолиза при хранении пресервов из мойвы, анчоуса, тихоокеанской сельди, а также - для подавления трипсиноподобных термостабильных протеаз минтая, составляющие в зависимости от исходного сырья от 600 до 1600 ATE на 100 г материала (что составляет 1-5 % к массе рыбы).

5. Показано, что кратковременное воздействие ингибитора при хранении сырья в течение 1 ч позволяет замедлить протеолиз при хранении пресервов на 5 -10 %.

Установлено влияние на степень ингибирования протеолиза при хранении пресервов посмертного состояния сырья : при использовании рыбы в состоянии посмертного окоченения эффективность ингибитора выше, чем - при разрешении окоченения.

6. Установлено, что применение ингибиторов при производстве пресервов из мойвы, анчоуса, сельди тихоокеанской в рекомендуемых дозировках позволяет замедлить протеолиз белков и увеличить сроки хранения продукции в 1,5-2 раза по сравнению с принятыми. Новизна технического решения подтверждена патентом.

7. Показано, что применение ингибиторов протеиназ из сои, соевой половы и картофеля позволяет сохранить структуру фарша минтая ("сурими") при термообработке за счет торможения распада тяжелых цепей миозина под действием термосгабильных протеиназ.

8. Выполненные комплексные исследования положены в основу технологии получения ингибиторов протеиназ из растительного сырья и применения их при производстве рыбной продукции, а также - разработки технической документации :

ТУ 15-01 1602-92. Ингибитор протеаз, ТИ № 442-92;

ТУ 9272-067-00472012-96. Пресервы "Приморские", ТИ Уз 36-66-96.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Петров В.А., Лапардин М.П., Осенняя Н.Б., Слуцкая Т.Н., Герасимова НА Миленина Н.И., Виняр Т.Н. Обоснование применения белкового ингибитора дл: регулирования протеолиза соленых рыб // Пищевая технология. - 1990. - 5. - С 46-48.

2. Пат. 1598946 РФ, МКИ А 23 В 4/02. Способ приготовления соленой рыбы Т.Н. Слуцкая, H.A.. Герасимова, Н.И. Миленина и др. Заявлено 31.10.1988 опубликовано 15.06.1990.

3. Слуцкая Т.Н., Миленина Н.И., Ромашкин В.И., Мосолов В.В. Подавлени активности протеиназ из внутренних органов рыб природными ингибиторам! протеолитических ферментов // Прикладная биохимия и микробиология. - 1991 Т.27. - С. 529-532.

4. Миленина Н.И., Слуцкая Т.Н. Обоснование технологии получени: ингибитора трипсина из растительного сырья и отходов его переработки / Всесоюзная научно-техническая конференция "Совершенствование технологически: процессов производства новых видов пищевых продуктов и добавок. Использовани вторичного сырья пищевых ресурсов". - Киев. - 1991. - ч. 1. - С. 201-202.

5. Слуцкая Т.Н., Миленииа Н.И., Логачева О.В., Виняр Т.Н. Теоретические и практические аспекты применении биологически активных регуляторов протеолиза в технологии рыбных продуктов // Международная конференция "Технология переработки гидробионтов". - М., - 1994. - С. 147-149.

6. Калиниченко Т.П., Миленина Н.И., Слуцкая Т.Н., Тимчишина Г.Н. Применение регуляторов протеолиза при обработке гидробионтов // Международная конференция "Проблемы качества потребительских товаров и коммерческой деятельности в условиях рынка". - Владивосток. - 1995, ч. 11,- С.28-29.

7. Андреев Н.Г., Логачева О.В., Миленина Н.И., Слуцкая Т.Н. Замедление протеолиза ингибиторами при производстве пресервов из мойвы // Рыбное хозяйство. - 1995. - № 2. - С. 52-53.

8. Миленина Н.И., Слуцкая Т.Н. , Лапардин М.П., Осенняя Н.Б., Соенко А.Г., Тарасенко Г.А. Медико-биологические аспекты использования растительных ингибиторов протеаз при производстве пищевой продукции // Известия ТИНРО. -1995.-Т. 118. - С. 41-47.

9. Миленина Н.И. Ингибиторы протеаз из растительного сырья // Известия ТИНРО. - 1995. - Т. 118. - С. 88-95.

10. Виняр Т.Н., Миленина Н.И., Наседкин A.B., Павловский A.M., Слуцкая Т.Н., Якуш Е.В. Исследование термостабильных протеаз мышечной ткани минтая и фарша сурими и влияния ингибиторов на их активность // Известия ТИНРО, - 1995. - Т. 118. - С. 96-104.

И. Логачева О.В., Миленина Н.И., Слуцкая Т.Н. Основные принципы получения ингибиторов протеолиза из растительного сырья // Известия ТИНРО. -

1995.-Т. 118.-С. 153-160.

12. Виняр Т.Н., Миленина Н.И., Павловский A.M., Слуцкая Т.Н. Действие препаратов Ингибиторов протеаз на термостабильные протеазы минтая // Известия ТИНРО. - 1995. - Т. 118. - С. 161-164.

13. Виняр Т.Н., Миленина Н.И., Павловский А.М. Действие ингибиторов протеолиза из растительного сырья на термостабильные протеиназы минтая // Научн. конференция "Рыбохозяйственные исследования океана". - Владивосток. -

1996. - Т.2. - С. 10.

14. Миленина Н.И., Наседкин A.B., Якуш Е.В. Влияние ингибиторов сериновых протеиназ на изменение физико-химических свойств фарша минтая при нагревании // Научн. конференция "Рыбохозяйственные исследования океана". -Владивосток. - 1996. - Т.2. - С. 65-66.

15. Миленина Н.И., Слуцкая Т.Н., Логачева О.В., Андреев Н.Г., Якуш Е.В., Наседкин A.B., Ковалев H.H. Способ получения ингибитора протеолиза и способ приготовления пищевых продуктов с их использованием //Заявка на пат. РФ. № 96112278/13, приоритет (018200) от 17 июня 1996 г.