автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Технология микробных ферментных препаратов, осуществляющих трансформацию липидов

^ л,

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ л ч--)4 ' ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

Московская Государственная Академия шщевцх производств

На правах рукописи

КРИВОМ Анна Юрьевна

УДК: 663.152.311/043.3/

: ©

ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОБНЫХ ФЕР:ШТНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ОСУЩВСТВЛШЩИХ ТРАНСФОРМАЦИЮ МИДОВ

I I

Специальность: 05.18.10 - Технология витшшншх, ферментных

и белковых препаратов,чая и табака

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Москва, 1995

Работа выполнена в Мроковоком Государственном. Уквверовтетв им. U.B. Доыовооова в Московской Гоаударотваяшо! Академах пищевых производств.

Научны! консультант - профессор,доктор биологических наук

ЕГОРОВ Н.С.

Офицвальвые оппоненты:

Академ PATH,доктор технических наук .профессор ''

ГЕРНЕТ М.В.

Доктор технических наук КИСЛУХИНА О.В. ; |

Доктор химических наук ВАРЛАМОВ В.П.

Ведущая органазадвя: Вавроооявоквй *аучяо~исо«довдтельоий институт прикдалной бвотвхнологвв

Защита состоится декабря 1995 г. в /У часов в«

ваоодавви Специалваврованного Совета Д063*51.03 Московской Государственной Академия лицевых, проваводотв по адресу t 125080,Ыооква , Волоколамское восва , II, .

О двооертацвей мохво ознакомиться в библиотеке. НГАШ. Автореферат разослав воября 1995 г.

УчениЛ секретарь Спецваливврованного Совета,

к.т.в. ,доцеят , I .OAS" Л.А.Иваново

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

Актуальность проблемы. Большой интерес, проявляемый к ферментам, осуществляющим трансформацию липидных продуктов, игравдим важную роль в процессах жизнедеятельности всех организмов, связан как с фундаментальными аспектами, так и с высокой потребностью многих областей промышленности и медицины в ферментах этого спектра действия, а также-в продуктах энзиматических превращений последних.

Быстрое развитие новых биотехнологий с использованием ферментов, траясформирунцих липиды, связано с их широким применением в пищевой, кожевенной, парфюмерной, текстильной, хлебопекарной промнтленностях.в производстве моющих средств, медицина, очистке сточных вод и др.

Открытие простаглаидинов (ПГ) является одним из наиболее значительных событий 20 века, имеющих серьезное общебиологическое и прикладное значение. Получаемые отечественной химической промышленностью медицинские препараты ПГ-подобных веществ не обладают теми свойствами, которые присуди естественным биорегуляторам этого типа. Это определило необходимость разработки технологии ПГ о использованием ферментов микробного происхождения. Однако, несмотря на очевидную перспективность и большие потребности медицинских препаратов с простагландинпо-добннм действием, в настоящее время не существует производства последних посредством методов биотехнологии.

В этой связи большое значение я актуальность приобретают направленный поиск высокоактивных продуцентов, ПГ-синтетаз, изучение закономерностей и регуляции их синтеза, выделения ферментов и изучение их свойств с целью создания технологии,пригодной для промышленной реализации. ,1

Наряду с этой проблемой некоторые отрасли промышленности,в частности, гидролизное производство, кожевенная, меховая, яироперерабаты-ващая промышленность испытывают недостаток ассортимента диполиотческих ферментов, катализирупцих гидролитическое расщепление масел и жиров. Однако, несмотря на крупные успехи в этой области, производство липаз в настоящее время_в нашей стране не налажено.

В рвязи о этим большое значение и актуальность приобретает выбор продуцеотов липаз, разработка условий их культивирования, изучение закономерностей их биосинтеза,оэкреции о цель» создания технологии,пригодной для промышленной реализации.

Для изучения механизма катализа с участием липаз, а также при организации различных биотекнологическкх производств, чрезвычайно важно иметь высокоочженные препараты липаз с определенной специфичностью. Для решения данных проблем актуальными являются исследования по повц-

тению выхода изучаемых ферментов путем воздействия на Механизм естественной секреции, разработке методов и схем очистки ферментов до гомогенного состояния, изучение структуры фермента и его свойств. Успехи в получении высокоочищенных ферментных препаратов в значительной степени связаны с разработкой и внедрением в биотехнологическую практику высокоэффективных, методов аффинной хроматографии на биоспецифических сорбентах. Это позволяет устранить многостадийность и трудоемкость, увеличить выход очищенного фермента. • 1

Важность биохимических и физико-химических исследований липоли-тических ферментов связана также о особым типом катализируемых ими реакций. Липазы, являясь водорастворимыми белками, катализируют гидролиз или »тарификацию нерастворимых в воде субстратов, функционируя на границе раздела лишщ-вода. Вследствие сложности физических условий протекания липолиза наши знания особенностей рефляции этих реакций существенно отстают от тех, которые известны для гомогенного ката лиза. Именно эти особенности липолитических ферментов, а такка расширение аспектов применения последних вызывают большой интерес в плане их иммобилизации на нерастворимых носителях.

Решение всех вышеперечисленных задач путем разработки новых прогрессивных или интенсификации ухе существующих технологий для ферментов, осуществляющих трансформацию липидных продуктов, позволяет внести вклад в новые направления применения данных ферментов, а также улучшить экологическое состояние рада производств. О важности и актуальности проблемы свидетельствует также и то, что данная работа является . частью исследований координируемой Государственным комитетом по высие му образованию международной программы "Прикладная биотехнология" (при каз № 613 от 22.06.94), и то, что часть ее выполнялась в рамках сотрудничества с Университетом Хоенхайм в Штутгарте (Германия).

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в создании промышленной технологии получения препаратов ферментов, обладающих способностью трансформировать липидн, на обнове обобщения теоретв ческих и практических исследований по особенностям механизма регуляции их биосинтеза и секреции этих ферментов, разработке высокоэффективных способов их выделения и очистки, способов иммобилизации изучения физико-химических и каталитических свойств, а также их примененш в различных отраслях промышленности.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

- скрининг и селекция продуцентов ферментов, осуществляющих : трансформацлэ липвдов и их характеристика,

- о:грсдодош:е локализации нсапдувмых ферментов в клетках микро-

- разработка технологий культивирования продуцентов и ее оптимизация,

- изучение особенностей рефляции биосинтеза ферментов,трансформирующих липидн,

- разработка технологии ввделения ферментных препаратов разной степени очистки,

- изучение физико-химических и каталитических свойств высокоочи-¿¡енньк и гомогенных препаратов ферментов,

- получение иммобилизованных препаратов исследуемых ферментов, изучение особенностей их ферментативного катализа и использование для кромышленных целей,:

- разработка н внедрение эффективных режимов и технологий применения ферментов, трансформирующих липидные продукты в пищевой,кожевенной,меховой промьшленностях,для производства СШ, звероводстве и медицине. ,

Научная новизна.

- Впервые з стране найден продуцент фермента, осуществляющего трансформацию грахццоновой кислотн в простагландшш и ПГ-подобные вещества микробного происхождения с высокой биосинтетической активностью, не уступащей известным источникам животного происхождения данного фермента.

- Впервые шмуноцятохимическим методом показана локализация липо-ксигенаэы (ПГ-синтетазы) в зоне цитоплазматической мембраны,установлена прочная связь фермента со структура}«! мембран и клеточной стенки.

- Изучены особенности регуляции биосинтеза ферментов, осуществляющих трансформации арахвдоновой кислоты в простагландины. Впервые установлено, что образование внутриклеточной липоксигеназы (ПГ-синте-тазы) актиномицетом Шч^атпусеь ¿/¡йеъоио/ез Ы8-2 контролируется основными источниками питания, которые составляют единый механизм регуляции биосинтеза этих ферментов- - метаболитную репрессию. Регуляторное воздействие рассматриваемого механизма проявляется на уровне транскрипции.

- На основании полученных результатов и данных литературы составлена модель механизма, контролирующего биосинтез ферментов, на примере протеаз и липокситеназы (ПГ-синтетазн), для микроорганизмов, в частности, душ £ ¿уо4&иц'с(е& М8-2.

- 11а основании экспериментальных данных комплексных исследований разработаны условия культивирования 1сультурн оу%аеъ\ъ\ в промышленных условиях с целые получения ллполитичоеккх соерг.текгов.

- Разработана технология ввделенкл и очиегкп липазы, основанная

на простых и эффективных методах, которые позволяют получить препараты различной степени очистки в промышленных условиях. !

- Впервые выделен и охарактеризован препарат гомогенной липазы. Показана субъвдтшчная структура фермента. Всесторонне изучены физико-химические и каталитические свойства выделенной липазы.

- Впервые проведены' широкие комплексные исследования с привлечением химических и физических методов иммобилизации липаз. Подобраны в качестве сорбентов алшосиликаты в цеолигкой форме с порами 60-80 А для эффективной иммобилизации данного фермента, повышающей их стабильность о отношении температуры, pH, улучшающей химические показатели.

- Впервые разработаны в теоретически обоснованы научные основы применения указанных ферментных препаратов в различных областях народного хозяйства: в медицине для получения лекарственных препаратов.содержащих ПГ-подобные в-ва и ПГ, в звероводстве, при производстве синтетических мопздх средств (СМО), пятновыводных средств, в меховой и кожевенной, пищевой отраслях промышленности.

Практическая значимость. Проведенные исследования явились фунда- . ментом для решения народнохозяйственных задач по эффективному использованию ферментов, осуществляющих трансформации липидных продуктов, в отраслях промышленности.

Разработана технология культивирования S, spiieiotJes М8-2 - продуцента ПГ-сиктетазы (A.c. J6 I4725QI от 1989 г.).

На основе предложенной модели механизма регуляции биосинтеза вне-и внутриклеточных ферментов микроорганизмов разработана концепция формирования и прогнозирования метаболизма продуцента в сторону направ- . ленного синтеза целевых ферментов. ,

По результатам оптимизации биосинтеза протеаз и лшюксигеназы(ПГ-синтетазы) в процессе роста стрептомицета решены задачи комплексного использования культуральной жидкости spht-tciolei М8-2 с цельи виде-, ления первых в опытно-промышленных условиях (A.c. № 579365 от 1977 г., A.c. » 973609 от 1982 г.). •

Получен препарат ПГ-синтетазы в нативноы и иммобилизованной ш мембранах виде.

Показана возможность замены ПГ-синтетазы животного происхождения на фермент данного .спектра действия микробной природы при синтезе ПГ.

Экспериментально доказана перспективность и реальность разработки ' получения ПГ с использованием ми!фобных ферментов, а также применение ПГ группы ПК*, и ПП?2о1 в звероводстве.

В результате лабораторных, стендовых и опытно-промышленных исследований разработана'технология получения липазы культурой Я. 1414. Составлен ц утвержден лабораторный .технологический регламент,ио

которому наработаны ошшше партии фермента в ферментном цохо Голпцин-ского института фитопатологии (положительное решение на авторскую заявку от 2.09.93).

Полученшо данные положены в основу разработанного опытно-промышленного регламента производства Липоризина ГЗХ, внедрение технологии которого осуществлено на Бордском химическом и Приволяском биоетмичес-ком заводах. Разработаны и утвэрздеш технические условия на опытные партии Липоризина ГЗХ ■

На основании изучения свойств промышленных препаратов Липоризин ГЗХ выявлен высокая липолитпческая активность, рН-стабильность и термостабильность препаратов, хорошая совместность и стабильность их в сочетании с основными компонентами CMC. Это позволило выработать рекомендации при разработке эпзимсодершащих рецептур CMC, обладающих высокой эффективностью при удалении загрязнения (на 25-30$).

Разработаны и рекомендованы условия использования Липоризина ГЗХ в составе чистящих препаратов. Получен высокий эффект мойки л обезжиривания загрязненной шерстяной ткани.

Показана эффективность использования мохщих средств с Липоризиноч ГЗХ в своем составе в рыбоперерабатывающей промышленности для мойки коптильных подносов, позволившая сократить энергозатраты и улучшить экологическую обстановку предцриятия.

Разработай условия использования Липоризина ГЗХ в технологии обезжиривания >вчин з козевой основы.

Полученные результаты создали предпосылки для разработки новых направлений по применению липоллтических ферментов в пищевой промышленности, а именно колбасном производстве при обработке кишечного сырья. Предложена конкурентоспособная новая технология обработки кишечного сырья. Гистологическими исследованиями тканей кишечного сырья, обработанного традиционный и ферментативным способами, показана эффективность последнего. На разработанную технологию получен патент,приобретенный Воронеаским мясокомбинатом (патент SIL Jé IS33I45 A3).

Теоретические положения данной работы используются в учебных курсах "Биохимические основы биосинтеза биологически активных веществ" и "Биохимия масличного сырья", читаемых автором. Методические приемы,отработанные в процессе научных исследований, систематизированы,изданы отдельными сборниками и используются в учебном процессе.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и об-суздались на следующих съездах, симпозиумах, конгрессах.,конференциях и коллоквиумах: Республиканская научно-теоретическая конференция молодых ученых микробиологов (Ташкент,1376,1978), 6-я, 7-я конференции молодых ученых Латвийской республики отд.ШОЛ (Pirra, 1977,1980),7-й съезд

Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата,1985), совещание "Ферменты микроорганизмов" (Москва,1985), Международный симпозиум по хроматографии (Будапешт,1986), Всесоюзная конференция "Методы получе-шя и анализа биохимреактивов" (Рига,1982,1987), У1, УП Дунайский симпозиум по хроматографии (София,1987; Лейпциг,1989), Всесоюзная конференция "Микроорганизмы продуценты стимуляторов и ингибиторов роста растений и животных" (Ташкент,1989), совещание "Применение хроматографии в пищевой и микробиологической промышленностях и медицине"(Москва, 1990), Всесоюзная научно-техническая конференция "Совершенствование технологических процессов новых видов пищевой продукции и добавок,ис-пользовшше вторичного сырья пищевых ресурсов" (Киев,1991),научно-практическая конференция ученых в решении социально-экономических проблегл страны (Ташкент,1991), совещание "Прикладная биотехнология на пороге 21 века" (Москва,1995), Международная конференция "Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК" (Москва,1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 59 работ в отечественных и зарубежных куриалах, в штериалах Международных и Всесоюзных съездов, конференций, симпозиумов и конгрессов. Получено 4 авторских свидетельств и патентов и I заявка на выдачу патента имеет положительное решение Госкомизобретений.

Основные положения, выносимые на защиту:

- скрининг и повышение синтетической способности путем естественной изменчивости и регуляции биосинтеза микроорганизмов -продуцентов ферментов, осуществляющих трансформацию липидов, а именно липоксигена-зы (ПГ-синтетазы), липазы;

- технология культивирования продуцентов ферментов данного спектра действия, внедрение предлагаемых технологий в промышленность;

- технология ввделения и очистки (получение ферментных препаратов с различной степенью очистки - ГЗХ, Г10Х-Т25Х) препаратов ферментов. Характеристика их свойств, субстратной и позиционной специфичности. Получение гомогенной липазы R. o\yhaz 1414,изучение.структуры фермента:

- реализация новых биотехнологических процессов и разработка новых технологий с использованием выделенных ферментов (синтез ПГ и их применение в звероводстве, гидролиз липидов в меховой и косвенной промышленности, при изготовлении колбасных изделий, при производстве CMC и пятновыводных средств).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения,обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, а также изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения нормативно-технической документации и актов испытания. Ниже представлена структурная схо!,-д направлений научных исследований.

{ Скрининг и селекция продуцентов ферментов

Изучение биосинтеза и механизма рефляции синтеза ферментов, их локалнзаципя и секреция.

Разработка тегнолопш культивирования и ее оптимизация

режим аэрации ■ доза,ва1р1ст посевного материала питательная среда температур-ный режим длительность культивирования

внутриклеточные ферменты

внеклеточные ферменты

Разработка технологии выделения и получения препаратов с индексом ГЗХ, ПОХ, Г20Х

Концентрированне 1 Осаждение Деградация биомассы Высушивание препарата

т

Разработка технологии высскоонищснных ферментных препаратов

Ноннообмен-нзя хроматогра-ф|< I

Металл о- Гель 1Ьоэлектрофок Электре

хелатно-аффин- фильтра- уенропа форез

ная хроматогра- фия пня ние

>1ЛИНОКСИГЕИАЗА{| .

Разработка технологии иммобилизации

Характеристик-!! свойств ферментных препаратов и гомотшмх ферментов_

Кинетические

Фнзиолого-биохимические

Каталитические

Ферментативная трансформация лнпидов

Гидролиз

Синте- Коже- Мехо Мясо-

тичес- венная вая перера-

кие нро- нро- батыва-

моющие мыш- мыш- ющая

средст- лен- леи- промыш-

ва ность ность ленное^

1 ¡ере-

этернфнкаппя

Пищевая Синтез

л ром ы ш- (ЮС ков и

лелность других

соедине-

нии

■ Перехнсное

окисление

Зверо- Меди-

ПО.ДСТВГ1 цина

Структурная схема нанрпп.>е!1иГ1 научных иселедоиашш.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСЩЕНИЕ

В настоящем исследовании разработаны теоретические,и практические основы применения ферментов, осуществляющих конверсию липидного субстрата. Исследования послужили основой для создания отечественной технологии лшюксигеназы с помощью селехциохшрованного штамма $■ Sp'he-\oides ¡,'8-2, начиная от поиска продуцента, разработки условий культивирования и выделения фермента вплоть до изучения гго свойств и аспектов практического применения.

Полученные результаты тшшз явились фундаментом для решения научных и народнохозяйственных задач по эффективному использованию липолд-тического комплекса ферментов в мясо- и рыбоперерабатывающей промыа-ленности, при производстве биоактивных CMC, в меховом и кожевенном производство.

Разработки завершены внедрением научно обоснованных режимов применения ферментов, осуществляющих конверсию липидного сырья в промышленность. Экономическая эффективность от их внедрения составила свыше 45000 долл. в год.

2.1. Цатериалы и метода

В настоящем разделе приводятся методические подробности проведения экспериментов: скрининг продуцентов и условия культивирования активных штаммов, условия хранения последних, сезонная и естественная изменчивость исследуемых микроорганизмов, выделение и очистка "ферментов, исследование их методами белковой химии, биохимическими и иммуно-. логическими методами. Описаны методические приемы изучения механизма действия ферментов с использованием метода лидкостно-сцинтилляционно-го счета. В работе применены общепринятые и специальное физические, физико-химические, химические, биохимические, микробиологические,ор-ганолептические методы, в том числе хрсматографические, электрофоре-, тические, спектрофотометрические, колориметрические, полярографкчес-' киол ультрацентрифугирование, электронная микроскопия. Подробно описаны разработанные наш синтез и выделение простагландинов. Приведены методы, оценивающие возможности использования ферментов в различных отраслях промышленности, а также эффективность их применения.

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с целью определения однородности собранного материала, его достоверности и точности с позиции принятого уровня значимости. Непосредственный обсчет числовых массивов осуществляли на ЭВМ IBM PC/AT 3L6 с использованием программы"Chtmcbd "Ц"С/гел?stations ",'Хьюстон,США).

2.2. Результаты исследований по лилоксигеиазе и их обсуждение

2.2.1. С1фининг и селекция культур-продуцентов липоксигеназы

Интерес к микроорганизмам, синтезирующим липоксигеназу, велик и вызван большой практической значимостью этого фермента. Сведения о синтезе липоксигеназы микроорганизмами очень ограничены, что вызвало определенную трудность в первичном отборе продуцентов. Объектам! исследования служили 269 шташов различных систематических груш микроорганизмов, полученных из Всероссийской коллекции микроорганизмов(ВК1.1 РФ), коллекции микроорганизмов отдела почвешшх микроорганизмов Института микробиологии АН Р2>, коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета Московского Государственного Университета им.М.В.Ломоносова, коллекции микроорганизмов кафедры Морской микробиологии Одесского Государственного Университета. В результате нескольких этапов скрининга продуцента липоксигеназн из дальнейшей проверки'исключили около 84$ штаммов. Огобрашше активные штаммы микроорганизмов проверялись на способность образовывать липоксигеназу в условиях глубинного культивирования (рисЛ). Следует отметить,что не всегда наблюддлась корреляция между величиной зон гидролиза на плотной среде и актшлюстью липоксигеназы, синтезируемой культурой при росго> на жидкой питательной среде. Возможно, положительный результат при качественном анализе в некоторых случаях объясняется действием неслевд-фических липоксидаз.

Способность образовывать липоксигеназу характеризовали по накоплению липоксигеназной активности штаммами, проверяемыми на втором этапе скрининга, в динамике, т.е. через 24,48 и 72 часа с начала культивирования микроорганизмов на средах различного состава. В результате проверки отобрана культура 5. 5р6ехо1с1е$ как продуцент липоксигеназы.

Изучение естественной изменчивости культуры подтвердило шение (Кузнецов,1975) о значительной вариабельности актиномицетов. Показано, что популяция >5. ¿рНиасс/еь включает три типа колоний. Кроме культу-рально-морфологических отличий, существует значительная разница в уровне синтеза этими вариантами культуры липоксигеназн. Установлено, что наибольшей активностью обладает вариант "палевый" (Кривова и др., 1989) (рис.2). Особое внимание наш было удалено экспериментальному обоснованию способов хранения культуры-продуцента. В результате рекомендовано хранение до года на агаркзованной среде Чапека с глюкозой под слоем масла при 4°С или без масла при этой ::;е теше-ратуре. Установлено, что для более длительного хрансш1я целесообразно проводить лиойимизацию культуры.

ipo

90

I I

{3

70

1

1

5.

1.Candida ditiiqe-

да N13 . z.S.nocacessm,

СШИ №3

z.S.rlmomtKHa--jH.cpwNlZ

Рас.

S.ßr.ciireitm cpt$a. tfs г e. P.aeruoüiosi 12,

epm „

среда tVZ %.&unnirw.echmv-(ata£>KN-S$.cp.2, S.S.s0erofc/e$ среда nh iO.M.eorromBKH--№,среда Hi3 Mkcttiride BKM--2 ss? среди /i:s IZ.P.f>mososm-

SIL среда Nu. j • U.P.vlitmvm 5км. -/506, cpmtf!3 ¿Westum Ш-SSi.Cftgah ,,,,,,, , 15.3. ein im MM-

llASil H Ulli! Ш4 ¡5 'Щ еРЩ № ' ffMtt» eutuvim>vmp( кумту? михрооргпк-лкэл л/яо/ссмши«

1 ypeStnb iuacmmsyi -лилоксиге позы. _g veatgye» x штвт^&ц/умттшъ.__

Ш^^ЫкйЬ,. ж

Pvс. 2. ßtig колонии „палеёаго" варианта S. spftetoides //8-2

Pvc. 3. Локализация- липокс uze налы (имминоцитохимически-и метод) и •avnoKCvreHoscr

Естественная изменчивость актиномицота была использована в солон-■ ции продуцентов липоксигеназн. Последовательный отбор вариантов на питательной среде Ваксмана кукурузной И 2, в наибольшей степеии вшш-лящей изменчивость культуры по морфологии колоний, позволил выдолить вариант А $рЬмо1с/е£ .1.18-2, продуктивность которого на 30$ выше, чем у исходной культуры. Охарактеризованы культурально-морфологические и физиолого-биохимическио признаки штамма (А.с. № 1472501 от 1988 г.). Предложена схема отбора активных пролуцентов липоксигеназн для данного актиномицота. Стабилизирующий отбор основных вариантов из популяции продуцента по разработанной схеме можно рекомендовать для использования в постоянной работе о промышленными штаммами актиномицетов -продуцентами ферментов.

2.2.2. Исследование процесса биосинтеза липоксигеназы

Из литературы известно, что липоксигеназа прокариотных микроорганизмов в основном является внутриклеточным ферментом и извлекается из. мембранной фракции мицелия актиномицвтов ( Надао </л/ 1988; Иехтап с/ аЛ. 1987). Было установлено, что основная часть активности была сосредоточена в мицелии и совсем мало (2-3!?) в фильтрате культуралыюй жидкости. Эти цифры 'были многократно проверены, не только на й. ¿рке-Чо^с/еА М8-2, но и на других, менее активных продуцентах.

Иммуноцитохимические исследования по определению локализации липоксигеназы в мицелии $рЬеЮ1(1е& М8-2 проводились совместно с ВНИИ технологии кровезаменителей и гормональных препаратов. Одним из контролей-специфичности цитохимической реакции служила культура, не обладающая липоксигеназной активностью. На рис.3 представлено распределение окраски, -выявляющей локализацию липоксигеназы. Окрашенный слой в. зоне цитоплазматической мембраны обусловлен, присутствием липо-' ксигеназы. Проведенное имыуноцитохимическое исследование также выявило наличие прочнрй связи фермента со структурами мембран и клеточной ' стенки, т.к. жесткая обработка клетов'высокими концентрациями детергентов не высвободцает липоксигеназу из этих структур.

На синтетической питательной среде, содержащей в качестве основных компонентов глюкозу, натрий лимоннокислый-3-х-замещенный, аммоний сернокислый, установлены общие закономерности роста культуры и биосин-.. теза фермента; Определены параметры про .вое? биосинтеза липоксигеназн: :возраст - 24 ч, доза - 5,0-7,5$ вегетативного посевного материала,начальное значение рН питательной среда - 7,0-7,2, температура-28-29°С, интенсивность аэрации - 432 ч-1 и длительность культивирования-

72 часа.

Наш показано, что регуляция синтеза липоксигеназы связана опосредованно с качественным и количественным составом жирных кислот в мембранах клетсйс актиномицета. Максимальное образование целевого фермента приходится на 72 час роста продуцента, т.е. на "стационарную фа- ■ зу развития микроорганизма. В этих условиях в жирнокислотной фракции значительно возрастает содержание полиненасыщенных кислот, параллельно с этим состав Общей липидной фракции по содержанию насыщенных и ненасыщенных кислот становится более сбалансированным (К «»1,48) (табл.I). Культура £ зрЬего1с1и М8-2 наряду с липоксигеназой образует значительные количества протеолитяческих ферментов с фибринолитическим действием. Учитывая этот факт и то, что липоксигеназа является эндофер-ментом, в отличие от протеаз, которые являются экзоферментами,экономически целесообразно было разработать технологию совместного получения этих препаратов: из биомассы получать липоксигеназу, а из фильтрата культуральной жидкости - протеазы.

Таблица I

Жирнокислотный состав общей липидной фракции $• зрЬе -го1аеьиО-г в процесов роста (% от общей суммы ЖК)

Еирные кислоты

Фазы роста культуры

лаг-фаза экспоненциальная стационарная

10,9 8,6 6,2

16,1 15,0 14,2

6,4 5,1 3,5

24,4 18,7 13,0

0,5 1.4 2,1

12,0 16,0' 19,8

9,5 14,2 18,7

4,4 5,3 6,0

2,2 2,3 2,6

2,4 3,7 4,8

0,5 0,4 0,4

0,5 0,8 1,2

0,2 0,8 1,5

0,1 0,4 0,9

20,3 29,3 38,2

69,8 63,4 56,7

5,9 8,4. 19,5

3,43 2,16 1,48

90,1 92,7 94,9 '

с

0-н-тридекановая 0 - миристиновая д - пентадекановая О -пальмитиновая ^ - ц. -т етрадецен-9-овая 0 - стеариновая ]• - пальмитолегагавая ^ - олеиновая 2-линолевая

2 - эйкозадиековая

3 -эйкозатриеновая

4 - арахидоновая

5 - докозапентаеновая 5 - декозагексаеновая

■/о ненасыщенных жирных кислот % насыщенных жирных кислот % полнненасыщеншгх жирных кислот К -- насщешше/ненасыщенные 0<!,;;:дя' сумда НК

"13 ^14 £5

'14 18 С16 С18 С18 С20 С20 С20 С22 С20

...... ■ ' Таблица 2

Линейные уравнения регрессии биосинтеза фершнтов а статистическая оценка результатов экспериментов

Наименование ферментативных активностей, являвдихся объектом оптимизации 1 1 ^равнения регрессии-"* \ Дисперсия вос-щюизво-дшости среднего , значения выхода Число степеней свободы ' Я Доверительный интервал коэффициентов £€ дисперсия адекватности 52 Адекватность

Фибринолитическая активность, мкг титэозива мл « 1092 - 30Х1 +20X3 -37,2X3 -' -19аХ4+122,4Х5 25511,0 ■31 78,0 52923,0 +

Липоксигеназная активность, нШ2 = 2Г14 - 0,0032Х1 +0,1057X2 --0,ОЗЗ2Х3 - 0,0752Х4 + 0,317X5 0,0398 30 0,1011 0.065Э +

мл клеточного экстракта«мин

Казеш-и-литическая активность, мкг Тирозина мл к.ж.«час «= 2735-43,6X3--136X2 --149, 5Х3 - 755Х4 - 142Х5 235855 * 30 247,5 995444 —

Соотношени активностей ферментов, липоксигеназная казеинолитическая = 0,442 - 0,0093Х1+0,0342Х2 --ЧЗг015Хз +0,0088X5 0,003 29 0,029 _ 0,0053 +

й факторы, адияпцие на процесс: Х^ - (Ш4)2'504; Ъ^ -соевый экстракт, Хд-КБ^РО^ Х4-М$£>04;

Х5 — глюкоза

^ Рис. 4

• Изменение основных пока-

с ¿атией глу-^ Чинней кулбтд-

ры 5. зрбе-% 'го(с(е& '/48-г

в процессе & раета мимро-3 'организма.

* ОИ'ошчыиА: 1-биомасса,

% ¿-акти£нвстб

^ липоксиина-

! Ш>

\ 3 - коаиыстьо

» гиороперели •

: сеи

: 4 -рЙ срыы

а 24 04 М 60 и 40 Оиигпемыошь кУлти!и/>о(анияг час.

Поэтому оптимизация состава питательной среды для в. $рЬе\01с!е$ ¡.18-2 проводилась не только с целью увеличить биосинтез липоксигеназы но л с учетом образования актиномицетом протеаз (табл.2)(А.с.й 57930 от 1977 г.). Оптимизация состава питательной среды позволила значительно повысить биосинтез липоксигеназы на фоне увеличения сложного комплекса протеаз с коэффициентом корреляции 0,86. В результате опти шзации в 1,5 раза повысилась способность актиномицета синтезировать б ало;:, а также были установлены оптимальные соотношения основных ком ионентов питательной среды, обеспечивающие увеличение синтеза липокс геназы в 3 раза, чем на исходной среде. Изучены закономерности измен шш основных показателей развития 5. $рЬам.с1е5 М8-2 на оптимизирова иаИ ерэдо (рис.4).

'¿.2.3. Некоторые биохимические особенности липоксигеназы

Порекиснэе окисление липидов в биологических мембранах влияет и <1«.,щ!ло1'ическую активность клетки; оно такне необходимо для нормальи I си.капля биосинтеткчсских и биоэнергетических процессов. Пакош а.: ■ • луцюнорекисных радикалов в лшшдной фазе мембран вызые

от увеличение их проницаемости для ионов. Показано, что ионы меди,железа, цинка и олова значительно ингибирутот синтоз и активность протеаз и липоксигеназц. Ионн бария, кобальта, магния, марганца и кальция оказывали стимулирунцее действие на накопление ферментов. Такое воздействие ионов металлов связано с частичной дезинтеграцией, игращей существенную роль при самосборке и обновлении мембранных структур клетки. Изменения количества перекисей липидов, накапливаемых актиномице-том в процессе культивирования, тесно связаны с процессами прироста биомассы продуцента. Уменьшение скорости образования мицелия в культуре актиномицега коррелирует с усилеш1ем свободнорадикального окисления липидов и накоплением в общей лшщдной фракции микроорганизма перекис-ных соединений, способных быть физиологически активными. Такими физио-логоактивннми вещества!,та липидной природы могут быть простагландшш, лейкотриены и тромбоксаны, а в основе образования всех этих веществ лекит фермент липокситеназа. Нами идентифицированы продукты трансформации полиненасицешшх жирных кислот продуцента собственной лшоксиге-назой. По результатам ТСХ, КК-спектров, биологических тестов, а также по результатам идентификации продуктов трана^юрмации лшоксигеназой

М8-2 арахидоновой кислоты с использованием радиоактивного метчика % п ВЭНХ мокно утверждать, что в наших опытах мы имеем дело с ПГ-синтетазоЙ - вероятнее всего с комплексом ферментов, отвечающим за образование циклических перекисных продуктов липидной природы -простагландинов и простаглавдиноподобных веществ (рис.5).

2.2.4. Некрторые закономерности биосинтеза липоксигеназы ,: и протеаз культурой ярг!его1с(е$ 1.18-2

У 5. '$р6его1с1е5 М8-2 значительное увеличение уровня синтеза липоксигеназы наблюдается в переходный период от экспоненциальной к стационарной фазе развития, т.е. ближе к 70-72 часам роста стрептомицета. Такого рода наблюдения дают основание высказать предположение, что существенными фактора/ли, определяющими уровень биосинтеза липоксигеназы, являются либо тесная взаимосвязь этого фермента с возрастным состоянием микробной клетки (с конститутивными процесса^ в метке), либо это связано с изменением состава питательной среды, т.е. с наличием определенных соединений в среде и т.д. В результате проведенных исследований установлено, что 72-часовой мицелий актиномицета, для которого характерно интенсивное накоплемне внутриклеточной липоксигеназы, а также 24-часовой мицелий, где уровень данного фермента низок, после перенесения на свежую среду почти не синтезирует указанный фермент в первые 10 часов (рис.6а). С другой стороны, мицелий акткномвдета (условия роста аналогичны вышеприведенному эксперименту) переносили в питатель-

- ib -

тех

I ?

I

Vi

§

ч

a

g

g

Ci tt

qlcucmejjQ pacrbScpu-mtJtú, специфичная, ^л ППfjue

4

*JU

ПГР.

Pacppsge-tet/uß радиак-тиЬности прааунтоб деградации *н-арахи-дон обой кислоты ме-fnosoju ТСХ

Результаты яраматографичесхаго /¿гз иахиза ß тонком слое продуктах реак-

аяахизд б тонком слое продукта s,____

ции geücmbvz иилоксигеназного комлмк са S. sphéroïdes MS-2.

S

ti

>

'3

s *

-о,г ЛК A

'V КОНТРОЛЬ -Ух

<7.....

/ i «3 ч s / i J M 5 / г ¿ V s

■ЯК X

'V КОНТРОЛЬ S \

? : 11 и t i • • i .1 . 1 ■ t

ч s

J « s

О- 5 WZ 15 ZO open я УАЧртиВаниз., мин

Щентификацил продуктов трансформаций ара-. ftí£ona$aü куслотпч ферментами S.spTietotdes методом ВЭШ.

Ел Чmельноенх k ~ éôib'cùemtùa., сек 7

Результаты attposayvú npenaparaS с ломе-гщю биологического rnectna. а)гоногенот Mui{,e-Ji/Jjíhqújjûcch ¿.¡cllcnuc/itt ¿) SAHiam TCK (ПГ- naseíune £ещес;.■?£«}

Рис, 5 Идептифико-циз. продуктов трансформации

а *

V »

о *

i

п.* 5Я 65> ira 0)ч & * ? 3 с s i? «»Сs>î 21 <5 *

—д. —<■ ~

—' *=» у " «=■ - ~ „

VMV3<3 jh//l>i 9u/jOH<¡nwMo ионтонвгпэжвипу

V m 2

„ §35

2 о О О.

S о fl-Г* 4 wo

О <л _ о о» ? 133

J X г<1оО

■i ча о с Soi а

С « JT

2 . о з •Jt^Xto

vO 1Л CL

Ч-- V / w ' о сэ о о о о

jxh/ион tPHSjn эхо un у

кую среду, в которой в течение 1,2,3,4 суток проводилось предварительное выращивание того не продуцента. В этом случае актиномицет продолжал накапливать липоксигеназу с большой скоростью (рис.66). Полученные данные показывают, что способность актиномицета синтезировать липоксигеназу не зависит от возраста шцелия, а определяется изменякхцимся в процессе культивирования составом питательной среда, который является функцией роста микроорганиэла, Внесение в 2-х,3-х,4-х-суточную куль-туральнуш жидкость источников углерода,азота,серы (глюкозы,№¡4)2 SO^; Mj£04), которые истощаются в процессе предварительного выращивания актиномицета, приводит к прекращению синтеза липоксигеназы отмытым мицелием.

Полученные результаты не исключают возможность иццуциругщего воздействия на биосинтез липоксигеназы веществ, которые накапливаются в культуральной жидкости в процессе роста актиномицета, в указывает на решающую роль в регуляции образования липоксигеназы основных источников питания. Установлено, что регуляция биосинтеза липоксигеназы куль, турой S. spftelOidei М8-2 осуществляется наличием в среде легко метабск лизируемых источников углерода, азота и серы. Очевидно, здесь имеет ыесто единый механизм воздействия, который можно отнести к мэтаболит-ной. репрессии. Работами, проводимыми на кафедре микробиологии МГУ им. М.В.Ломоносова с культурой £. spheioides М8-2,показано,что контроль биосинтеза протеолитических ферментов также осуществляется ыэтаболит-ной репрессией (Кривова,1977а; Кривова,19776). Характер регулирования биосинтеза протеаэ и липоксигеназ, возможно, и отличается по своей сути, но прослеяивается очевидная зависимость накопления ферментов, обусловленная не модуляцией ферментов, а функционированием механизма ре-, гулянии. Синтез ферментов у микроорганизмов ыоает контролироваться ка-; на рибосомальном уровне, так и на уровне транскрипции. Чтобы выяснить уровень, на котором метаболитная репрессия воздействует на синтез липоксигеназы (для протеаз доказано, что зто действие осуществляется.на уровне транскрипции (Иваница,1978; Егоров, 1978)), была предпринята по,, пытка подобрать минимальную бактериостатическую концентрацию ангабисн тика актиномицина Д, при которой актиномицет прекращает синтез информационной РНК. Оказалось, что актлнощщин Д при концентрации 150 мкг^ полностью подавляет включение ^С-урацила в молекулу РНК.

Используя'способность антиметаболита 8-азагуанина нарушать тращ| крипцшо, установлено, что,и-РНК липоксигеназы $, spkeldides М8-2 oth/j сительно стабильна. Из рис.7 видно, что пул и-РНК способен поддершь вать синтез липоксигеназы в течение 8 часов. Характер кривых торможу ния биосинтеза липоксигеназы отдельно антиметаболитом и лимитирующщ субстратом и одновременно В-азагуанином с субстратом идентичен. След$

вательно, место приложения изучаемого регуляторного воздействия субстрата на биосинтез липоксигеназы лежит на уровне транскрипции. С использованием ^С-валина и бактериостатической концентрации циклогексамида-10 мкг/мл ("включение" белкового синтеза) показано* что липоксигеназа синтезируется и накапливается в клетках. Если принять за 100$ общее количество липоксигеназы в культуральной жидкости, то на долю внутриклеточного фермента приходится 80-95^ от общего его уровня, что составляет 1,5-1,7 ед/ыг белка.

В результате анализа полученных данных встает вопрос, каким образом информация о наличии в среде источников углерода, азота, серы, а также об их дефиците ^передается из среды на генетический аппарат клетки и что служит физиологическим сигналом "включения" н "выключения" системы синтеза внутриклеточной липоксигеназы.

Для,ферментов по некоторым косвенным данным для изучаемой культуры микроорганизма и согласно данным литературы (Безбородов,1994выдвинуто предположение, что одним из звеньев в цепи передачи информации служат свободные внутриклеточные ампноккслоты.

Как показали результаты анализа, уровень пула свободных аминокислот Л ¿рЫхоЫеь М8-2 достаточно лабилен. Дефицит источника азота в среде приводит к значительному уменьшению аминокислотного пула, а внесение (ШфзНРОд через час инкубации полностью восстанавливает пул аминокислот до исходного значения. Такая закономерность наблюдается для большинства аминокислот. Пул глицина, валина, изолейцина, лейцина, тирозина и фенилаланина восстанавливается только через 4 часа. Интересно ответить, что содержание в пуле пролина независимо от наличия или отсутствия источникаоазота постоянно возрастает. Аналогичный характер изменения уровня пула свободных аминокислот у изучаемого организма наблюдается при лимитации источником углерода. Внесение в среду, лишенную иоточников углерода, глюкозы и соевого экстракта в течение 2 часов восстанавливает уровень большинства аминокислот. В условиях дефицита 'серы уровень большинства аминокислот в пуле остается постоянным или несущественно уменьшается. Значительно уменьшается лишь уровень метионина и цистеина. Внесение источника серы (М^04) приводит к восстановлению пула последних.

Следует отметить, что циклический аденозин монофосфат (цАЮ) не снимает полностью действия метаболитной репрессии. По-видимому, механизм контроля в этом случае отличается от механизма катаболитной репрессии. Другими словами, явления, доказанные для бактериальных культур, а именно, что: I) цАШ, добавленный к бактериальной культуре, растущей на глюкозе, заметно повышает скорость образования чувствительных к катаболитной репрессии ферментов и влияет на синтез других ферментов и

общего белка;

2) скорость синтеза катаболитных ферментов прямо коррелирует в внутриклеточной концентрацией цАШ;

3) дерепрессируидее действие цАШ строго специфично, что не является характерным для культуры 3. Зркею1с1е5' М8-2.

Если допустить предположение, что пул фосфорных соединений (АТФ, 'ц-АМФ) все же участвует в регуляции образования липоксигеназы, то эточ факт должен быть связан с уровнем свободных аминокислот. Следует подчеркнуть, что динамика истощения и накопления пула аминокислот находится в зависимости с динамикой биосинтеза экзопротеаз (Кривова,1976) и липоксигеназ.

Для выяснения роли соединений, содержащих фосфор, нами проведены следующие испытания, позволяющие говорить о связи биосинтеза липоксигеназы и протеазы о уровнем АТФ и ц-АМФ. При переходе в порт-логарифмическую фазу роста продуцента в среду вносилиц-АМФ в количестве 0,0016-0,0018^ от объема среды. В течение первых 2 часов после введения цикло-нуклеотвда у культуры практически не изменяется общий уровень накопления липоксигеназы, причем количество внеклеточной липоксигеназы увеличивается на 15£ за счет соответствующего уменьшения последней внутри клетки. Возможным объяснением этого явления может быть связь его с изменением проницаемости и структуры клеточной стенки под действием Сахаров, которые контролируются уровнем ц-АШ. При увеличении экспозиции культуры с ц-АШ биосинтез протеаз и липоксигеназ интенсифицируется, что также указывает на возможную регуляторную функцию ц-АМФ при биосинтезе этих ферментов. Добавление к растущей культу ре нуклеотидов, таких как АТФ, ГГФ, приводит к аналогичным изменениям в метаболизме актиномицета, что, по-видимому, связано о тем, что уровень ц-АМФ в микробных клетках обусловлен регуляцией синтеза и активностью ферментов аденилатшклазы, катализирующей реакцию АТФ -—-ц-АШ ——1Ф, и аденилатфосфодиэстеразы, участвующей в деградации ц-АМФ по реакции ц-АМФ АМФ. Реакции взаимного превращения адениловых производных постоянно протекают в клетках микроорганизмов, что указывает на большое значение условий роста микроорганизмов и, вероятно, это связано с депрессией синтеза многих ферментов с помощью ц-АШ (Аста-пович,1979).

На основании полученных нами результатов-и данных литературы (Бохински,1987) составлена гипотетическая модель механизма регуляции биосинтеза внеклеточных протеаз и липоксигеназы (рис.8). ,

Рис. В Модем механизма регуляции биосинтеза протеаз и липоксигеназы у микрооргАниз-маб.

?Гю

9 Й

(О

i Е

и

б)

Рис. 10 Влияние просш-?ландино6 на оплада-тварение норок.

а) ■праста.зиандины, полученные традиционным способом ,

ОТ) прастагиандиыь^ порученные с -использоёанг/е^ ПГ- е.ун топазы из Б.¡р*е-гоШа МВ-Х. р | контроль опыт

2.2.5. Модель механизма регуляции биосинтеза 1

протеаз и липоксигеназы $, зрЬеюМев М8-2 , !

Установлено, что Л-фактор в первую очередь активирует фермент,ответственный за синтез ц-АШ>, который, в свою очередь, контролирует активность других ферментов. Контроль через образование ц-АМФ часто осуществляется благодаря аллостерической активации. Повышение концентрации ц-А№ способствует активации биосинтеза такого фермента, как протеин-киназа. Суммарный эффект Р0^3/ц-АШ сводится к повышению скорости накопления в конечном счете такого соединения как пируват. Пируват способен превращаться в ацетил-КоА. Ацетил-КоА связывает несколько метаболических путей, определенное его количество используется в метаболизме лшшдов, доказана его тесная связь с циклом лимонной кислоты. Показана связь катаболических и анаболических процессов цикла лимонной кислоты с метаболизмом аминокислот. Эту связь можно проследить по двум следующим процессам: I) включение в цикл лимонной кислоты части (или полного) углеродного скелета почти всех аминокислот в ходе их1 катабо-лических превращений и 2) вывод из цикла лимонной кислоты углерода .в виде интермедиаторов цикла, которые являются предшественниками при образовании углеродного скелета многих аминокислот в соответствующих анаболических процессах.

Таким образом, аминокислоты могут быть и источником метаболической энергии (АТФ), и источником углерода, необходимого для синтеза углеводов и лшвдов. ..

Вое перечисленные выше моменты: деятельность протеаз продуцента, присутствие в среде легкометаболиэируемых источников углерода, азота, • серы позволяют клетке.поддерживать высокий пул аминокислот.

При этих условиях клетка осуществляет интенсивный синтез нетрано-лируемых РНК и и-РНК для внутриклеточных; белков. В результате содержание "свободных" факторов инициации и и-РНК-полимеразы, которые могут • принимать учаотие в синтезе и-РНК протеаз и липоксигеназы, незначительно. Этим объясняется низкая частота транскрипции и-РНК ферментов и, как следствие, низкий уровень образования ферментов в начале экспоненциальной фазы роста микроорганизма. Как показано нами, истощение в процессе роста актиномицета по одному из субстратов приводит к снижению уровня пула аминокислот в клетке, что, в свою очередь,значительно снижает синтез РНК. В результате освобождаются факторы инициации транскрипции РШ^и Ш-полиыеразн. Увеличивается частота инициации и-РНК ферментов,'а соответственно и синтез протеаз и липоксигеназы.

Другими словами, контролирувдим синтез фактором-служит пуд аминокислот. Состояние пула аминокислот в клетке может видоизменяться,

контролироваться и обеспечиваться как в количественном, так и качественном отношении по меньшей мере по трем направлениям:

1) - Наличие в питательной среде достаточного количества свободных

аминокислот, непосредственно присутствуют^ в ней иЛи возникающих в результате гидролиза белков под действием протеаз, т.е. аминокислот, способных проникать в клетку. Поступление в клетку этих аминокислот может полностью удовлетворить физиологические потребности клетки в аминокислотах и восстановить необходимый уровень аминокислот в их пуле.

2) - Пополнение пула аминокислот клетки за счет процессов анаболизма

при усвоении легко метаболизируемых субстратов и регулирование этого процесса концентрацией конечного продукта синтеза по принципу "обратной связи" (например, цикл лимонной кислоты).

3) - Содержание аминокислот контролируется опосредованно липидным об-

меном клетки, #именно, "включением" метаболизма аминокислот посредством накопления в клетке ц-АМФ, которое, в свою очередь, определено активностью липоксигеназы, которая в процессе перекисного окисления образует из полиненасвдешмх жирных кислот биологически активные вещества типа гормонов - простпгландшш. Простагландины и являются тал Р-факторсм, который "включает связывание" со специфическим рецептором на мембране, осуществляющим контроль активности адонилатциклазы (циклазы).

Концентрация аминокислот в клетке является тем "поплавком", который включает или выключает синтез ферментов, в нашем случае - протоаз и лнпоксигеназ. Блокирующий механизм такого типа позволяет клетке поддерживать уровень ферментов, необходимый для полного обеспечения клетки лимитирупдим субстратом (для I и 2 типа контроля). А в отсутствие таких субстратов, как показано нами для актиномицата £. ярЬею^Жа ¡.18-2, биосинтез липоксигеназы и протеазы контролируется уровнем содержания их в среде и мицелии. °

2.2.6. Применение липоксигеназы

Для того, чтобы найти наиболее рациональный способ применения препарата липоксигеназы, необходимо было извлечь фермент из биомассы продуцента, изучить стабильность фермента, наработать препарат для испытаний и апробировать его на практике.

2.2.6.1. Выделение липоксигеназы из клетки продуцента

Показано, что механические способы дезинтеграции не обеспечивают перевод липокспгонаон в жидкую фазу дезинтеграта. Извлечение формонта химической и энзимглтнчсской дезинтаг^хвдюй биомассы было мало»1\Ьокот»--

ниы. Однако, вызываемая этими методами деструкция меточной стенки повышала уровень определяемой активности в обработанной биомассе в 1,5 раза за счет облегчения диффузии субстрата и продукта реакции.

Предварительная лиофильная сушка биомассы оказалась единственным способом для эффективной экстракции липоксигеназы буферным раствором. Введение дополнительно в этот вариант эксперимента ПАЗ на давало существенных изменений. Хотя уровень ллпоксигеназиой активности в бесклеточном экстракте был менее 30$, однако, он позволил выделить очищенную липоксигеназу для поставленных нами целей,

На основании изучения процесса дезинтеграции биомассы М8-2 подтверздено предположение, ранее показанное иммуноцитохимическим анализов, о локализации форманта в периплазкатичеоком пространстве,либо г, контакте с внутренней стороной клеточной стенки, либо нахождение на внозней стороне мембраны. Эисперклситалкш показана возможность использования липоксигеназы в "^-мобилизованном" состоянии на клеточной стенке а мембранах для решошш практических Бадоч.

2.2.6.2. Технология комплексного использования

культуральной зкидкостй 5. $рке%о1аг$, Ы8-2

Актиномнцет 5'. М8-2 в процессе своего роста образует

богатейший комплекс биологически активных веществ: протеолитичосисве ферменты, липоиоигеназу, ПГ-сштетазу, новоблоцин и др. Поэтому разработка комплексной пршщипкальпой тэтнологической схсми переработки культуральной кпдкооти £ $рЬс xgid.es К'.3-2 представляет практически интерес с позиции получения различных бпадогачооки активаих вещостп и является экономически выгодной. Все полученные вамп результаты были использованы при создании технологической схемы для шхедчвп&я ереиара-тоз протеолити'чеоких формантов с фибранолих^ческим д Ъотсйба и врооха,-гландкнов групп Е2 и р£о1 < новизна которой цодтвер-гдона' авторским свидетельством й 579305 от 1977 г. и & 1472501 от 1988 г., а также материалами наработки соответствующих препаратов не только в лабораторных, но и в опытно-промышешшх условиях. По результатам лабораторгш: и опытно-промышленных испытаний препарат простаглалдиноз, полученный с использованием ПГ-синтетазы из I су ль тури £ зрЬеюЫез М8-2, Всероссийским МЫ технологии кровезаменителей и гормональных препаратов (ВНШПГП) рекомендован к внедрению как обладающий конкурирующей способностью с препаратами ПГ, полученными на основе животного сырья и химическим синтезом.

2,2,6.3. Использование биомассы М8-2

в кормовом радиоле норок

Эксперименты, проведены на норках в опытно-промышленном хозяйство ПИИ пушного звероводства и кролиководства в рамках АО "Биоинком" совместно с сотрудниками 1-Я Московской медицинской Академии им.И.М.Сече-нова Казанской Л.Б. и Максимовой Т.Н. Критерием оценки действия биомассы на организм последних была масса тела и количество гемоглобина в крови (табл.3). Диспепсия но наблвдалась ни у одного животного при скармливании рациона, содержащего биомассу актиномицега. Показана возможность применения биомассы 3. $рЬехо1с1а М8-2 в пушном звероводстве. Сбалансированный состав аминокислот в мицелии (табл.4), а также содержание незаменимых зшрйах кислот в общей липидной фракции биомассы (табл.1) при внедрении наших разработок приводило к экономии мясо-рыбных продуктов в рационе пушных зверей на 4-6$?.

Таблица 3

Использование биомассы 5. врбечосс/еб М8-2 в кормовом рационе норок

Вариант опыта Дата Кивая масса,кг Гемоглобин крови зверей,ед.

Контроль I) 18.04.82 28,0 ± 0,84 14,5 ± 1,14

2) 21.05.82 28,4 ± 0Х90 15,1 ± 2,20 ^

Опыт I) 26.04.82 28,2 ± 0,36 15,1 ± 0,92

2) 23.05.82 29,7 ± 1,02 15,4 ± 1,04

Таблица 4

Аминокислотный состав белка из биомассы М8-2

(содержание в % от воздушно-сухой биомассы)

т пп Аминокислота . Содержание, % ДО ПП Аминокислота Содерка ние, %

I. Аспарагиновая к-та 5,09 9. Изолейцин 1,40

2. Глуташшовая к-та 4,79 10. Лейцин 2,89

3. Пролин 2,60 II. Тирозин 4,60

4. Глицин 2,32 12. Фенилаланин 3,07

5. Алании 4,40- 13. Глстидин 0,93

6. Цистин 0,40 14. Лизин 4,40

7. Валлн 2,40 15. АргШШН 2,71

8. Метионин 0,69 16. Триптофан 0,32

Рас 9 "Технологическая схема получения пли винной культуры в. грпагаШеэ N2-2: и ее комплексное г/спользо&А ние

компоненты среди—

ллр ршцшпа

КонАенсдТ

*лш*гент

¿сидух —-пеиагАси-

тель-Л ¡¡ЛЛАВ-и теп лелгеити

огравотан-нш белм

Ьсмдхая.

К1льтпт/ра о ЬреВирке ия

*6 ¿/гиЪШоа нит&/пел. Среде:

ГШ/ПОГ7* %-Л Ьмсх/ 'лосЪеиогс мг-

канлгнсАх*. Хлшлгеят

тепло- и хлАМАггнти

Сгпйри-хиЗ-а -

цмЯ ереал/

аил посёЗн!

Ч-иатгрчоМ

РН 1,0-1, ^ [

СтерияЬ-нех пи те ые-ниал.

срсра-

ОТйАгШШ* £взл у:<

компоненты срелы~.

ЬОДА, ЯАР-т.

&Ыращ*1ание. Ьссе/мого материала £&%'. Тйч, Р-иЦс.г-

ОЛаА,м.а»ра-■ЦиЛ

Лриютпо^енис литотелбмой лрсылЛодю! ¿е* лоо среды

КуЛтибиаобаА Ние: ± 18°с, 2> 72 V. РиЛ » о.ог-аалмпо-;

е&/оСмиН, перемеиияанна_

Гото (ни посешноа

Питательна я лроиз-8ист&ен-ная сра.а

рМ 7,0-1,5

Стерулизаиии\

лрт&щшш-нацтштатш-ней сревы

Стерильны питателе пая среда

Жльтуралу

(')&иомас(0,

£ горка о/* Жи£и-ТНЧН

(¿)сулерна-тсит — на. утилиза-— цию.

физиологи-'чейкий рас-ТВ ар :0,Я% No.it—-2-

^^ил 6 **Чр •

--«г-Г"~Г.МчмчееопЬ

Цтделниебио иасш%1еитри- (1)суЪсриаА м?щт П (злТуоиас-ей, С6 .£!-

<ругиро(аниел/ (селораиией): Т Юмин > п » еаос Л/ним

\йидсление антибиотика

Лрамызха £Ьо-мъсси Физиол-гичесхим раствором

суперна -тант'на утилизацию

аранидоиа -еая кимата

д/эс&с* ешег-йил ----

а^юент.

Отделение Сиомаса/ цен < •7ри4угим£энь ей.

л ш 60001'Мчн

РщргыЕкие кк теп уптншек ТЦ*30сек\ частота * з.г КГЦ

сиосантеь

прзстаыщцнс) 2 чащ п с г-ооощим

Паи с синенная

суспензия Ь'ионоссы

ОтмытдяХ сионоссо,\

се ~ гзъ'Л

Гсмсгеиат биснассы

Реакцаац-нея слеа

злюат

___ | пмегашр111Н*Г\

филлтраГ на утилизацию и

¿уют но

Кенцгнтыра-йамие ультра-, ф-ильшр а

йасалибамие

I [¡садок

осадок на

тгтиХиза -

\\гн>-

расплавы

ауетеН— фу ют на ае-пнераци/о а-ценИна

ОЛНС^СООСИХ^г

Ъо1еаение »Нее % 5, акмцём-ис , ^

етцнамр. Ц \ ИО'С.Т-Г уве^ ^^ цеит^гуро^реад^ ]

Мафупщ&ция

Препарат ЛиТринотти-чески* ферменте! с инле-_ксон Г&Ох

на яа

2.2.6.4. Использование простагландинов и простагландинподобных веществ, полученных с участием ферментов S.spbnoidHМ8-2,в звероводстве "

Работы по получению простагландинов с использованием ПГ-синтетази из S. spheiatdes 1,18-2 и выделение их проводили совместно с ведущим сотрудником ВНИИТГП Фарунгуляном Г.А. и коллективом лаборатории технологии природных гормонов. Было отмечено, что реакционная смесь в предлагаемом варианта (арахидоновая кислота плюс ПГ-синтетаза актиномицета) содержала меньше примесей, затрудняющих дальнейшее выделение конечного продукта, чем при получении простагландинов стандартным способом (арахадоновая кислота плюс ПГ-синтетаза из везикулярных пузырьков барана). Показано, что полученный продукт соответствует требованиям стандарта (фармакопейной статье). Обосновано введение препарата простагландинов в таблетированном виде при кормлении животных. Критериями оценки действия простагландинов, полученных 1йши на экспериментальной базе ВШИТГП, на организм норок были масса их тела и количество яловых самок.. Контрольная группа состояла из 100 животных. Диспепсии не наблюдалось ни у одного животного при скармливании рациона, содержащего простагландины (рис.10). Полученные результаты позволяют сделать заключение о возможности использования простагландинов не только как стимуляторов репродуктивной системы животных, но и как препарата, позволяющего получить большее поголовье зверей. Показано повышение рентабельности клеточного;разведения пушных зверей на примере норок на 5-7%, I

2.3. Результаты исследования по липолитическим

. _ ферментам и их обсуждение

/

К ферментам, осуществляющим гидролиз липидов, относятся липоли-тические ферменты: липазы и эстеразы. Объектом наших исследований являются липазы, синтезируемые культурой Я. otjjzat 1414.

3..3.I. Локализация липаз Я. огумг 1414 ' '

Методом дифференциального центрифугирования и сравнением липаз-яой активности протопластов и гомогенага клеток нами было показано, но лишь незначительная часть фермента локализована в переплазмати-Í9CKOM пространстве клетки, основная часть эндогенной липазы находит-зя в протоплазме, вероятней всего в лизосшах клетки (табл.5).

Уровень лшхазной активности мицелия составляет 7,0-7,5% от общей асгивности культуральной жидкости. Таким образом, для культуры Я. ои?-2Д£1414 характерно образование преимуществень ' внеклеточной липазы. 1оэтому в дальнейших исследованиях мы ориентировались на экзотшую шпазу.

Локализация липазы Я. oufiae 1414

Таблица 5

Метод обработки

фракции

Липолитическая активность

Общая % от максим.

Дифференциальное центрифугирование

Исходный гомогенат ' 2430

Осадок при 1000 об/мин 0,0

Осадок при 5000 об/мин 129

Осадок при 130000 об/мин 59

Надосадочная жидкость _при_200000^_ __ _.____• _2168

100 0,0

5.3

2.4

89,7

Бесклеточная- Контрольная жидкость 1550 100 суспензия* Надосадочная жидкость • 418 27,0 __ . _Протопласты поояв лизиса 968 62,5

к параметры лизиса биомассы: возраст культуры - 20-24 ч, I Н HaCI в _ 0,02 М фосфатно-цитратном буфере с pH 7,5s 36°(3, лизосубишш ГМХ{ мицелий = 1:1; длительность инкубации - 35-40 мин.__

2.3.2. Влияние условий культивирования на синтез липазы Я. otyzae 1414

Дня культивирования Ä. ory*ael4I4 как в лабораторных, так л в промышленных условиях нами использовалась питательная среда,разрабо-тшшая ранее для этого продуцента о целы) накопления липазы Мухамедва-новой и др. (A.c. Н 608834 от 1978 г.). Нами подобраны оптимальные параметры культивирования исследуемого гриба для промышленного культивирования. По результатам исследований било показано, что культура R- oij/-%ал 1414 особенно чувствительна к изменению температуры культивирования. Так, при повышении температуры культивирования на 1°С уровень биосинтеза липазы при 30°С снижался на 23%, а повышение температуры среды на 5°С (до 34°С) подавляло фермвнтообравование в 3 раза, ■ при этом величина активности липазы в фильтрате культуральной жидкости составила 370-550 ед/мг белка.. Такая резкая реакция гриба на температуру послужила основанием для проведения специального исследования в оптимизации процесса по этому параметру на всей протяженности культивирования микроорганизма, т.е. определения опытным путем наиболее благоприятного для микроорганизма температурного профиля в процессе ферментации. Для определения оптимального температурного профиля культивирования, обеспечивающего максимально возможный в наших условиях синтез и секрецию липазы, использовали метод квазвдинамического моделирования по температуре. Полученные параметры культивирования (табл.6) были положены а основу разработанного и утвервденного опытно-промышленного рэглашлта производства Липоризина ГЗХ, внедрение осуществлено

- 29 - Таблица 6 • Параметры культивирования Л. оъугае 1414

1осевной датериал Начальный рН питат. среды Температуря. режим ■ Интенсивность аэраг Ции ,/ССа ,ч-1 Длительность культивирования, час

£ ,°С период роста, ,от...до,ч

: 340,0 44,0

26 33-44 Активность липазы, ед/мг.белка - 2500*320 Соэффициент вариации, % - 25

'.'■■' ' Ч 1—- "

1а Приволжском биохюшчаском заводе. В результате получено увеличение зыхода целевого фермента на 60-65$ по сравнению о технологией, апробированной нами ранее на Бэрдском химическом заводе,наряду с этим повн-иена стабильность культуры С\) - 24$, сокращена длительность выращивп-гйя Я. сщшь 1414 с 48 до 44 часов, что в условиях многотонналсного 1роизводства дает значительную экономию по электроэнергии и трудовым затратам. |

2.3.3. Получение препаратов липаз

I

Предложена технологическая схега получения ферментных препаратор; эазной.степени очистк!и из культуральной жидкости Я. огухае 1414. Вср-зторонне изучены процессы концентрирования фильтрата культуральной

ощкости,.....вопрооы осаядения липазы органическими растворителям и ме-

содом высаливания сульфатом аммония из концентрата, а также процессы юлучения сухих ферментных препаратов. Исследованы свойства последи«

5 целью разработка биохимической основы технологии применения указанное препаратов в различию: отраслях промышленности. ' ■••'./■ ■ у '

¡.З.ЗД.Концентрщюваяив фильтрата культуральной жидкости X .огугае 1414

Для выделений мицелия из культуральной жидкости использовали фильтрационное оборудование типа ФПАКМ'а, нутч-фильтра, ленточного тальтра. Потери на "этой стадии колебались от I до 3$, которые были ¡вязаны о механическими потерями на смачивание отделяемых осадков и фильтрационного 'материала.; Содержание сух :х веществ (СВ) в фильтрата культуральной жвдкости составило 1,5-2,0$. Концентрирование фильтрагг (существляли методом вакуум-выпйривания или ультрафильтрацией (УХ), [ри вакуум-выпаривании в зависимости от температуры концентрирования I степени сгущения раствора до 6,5-12$ СВ выход по активности ляпази' 1 концентрат составил 92-98$.

При отработке стадия УФ в оштго-промипгаенных условия:; бкгл тгг;

верены импортные и отечественные мембраны различных марок. УФ-мембра-ны установки Пап - (¡(¿жг типа У-10 и ХР-18 обладали 100$ оелектив- . .ностыо по исследуемой липазе, однако, скорость фильтрации была крайне низкая: 1,25-1,86•10~6 м^м^-с, что неизбежно сопровождалось увеличением длительности процесса и приводило к потерям до 60$ активности. Испытания отечественной УФ-установки ДКРИ, оснащенной блоками мембран (УАМ-20,УШЛ-20,УШ-50,11АН-15,ШШ-17), показали, что селективность этих мембран, за исключением УАМ-20, составляет 98-100$, при скорости 4,6--5,0-Ю-6 м3/м2-с. При концентрировании в 4-6 раз выход по активности липазы составлял 84-92$. Более глубокое концентрирование в 9-12 раз приводило к значительному снижению скорости фильтрации и снижению выхода по липазе до 40-50$ (рис.11).

2.3.3.2. Осаждение липазы органическими растворителями и методом высаливания сульфатом аммония

Исследование по осаждению липазы с помощью различных.осадителей из ультраконцентрата, полученного на основе фильтрата культуральной жидкости, проводили с учетом имещихся сведений в литературе (Прунан-ская,1987; Штейн, 1991; Калунянц и др.,1979,и др.). Ультраконцентрат имел активность 62-63 «Ю3 ед Лк/ил и содержание Сухих веществ в концентрате 6,9$. Осаждение проводили при различных концентрациях растворителей, их смесей и сульфата аммония.

Органические растворители по-разному воздействовали на растворимость ферментов, вызывая осаадение липазы с различной полнотой в степенью инактивации (рис .12). Так, этиловый спирт наиболее полно переводил фермент в осадок в активном состоянии в интервале концентраций этанола от 70,4 до 72,5$ в реакционной среде. Выход фермента в осадок в этих вариантах опыта составляет 87,3-89,851. Нами показано, что оптимальное соотношение ультраконцентрата к этиловому спирту - 1:3. Однако, даже небольшое повышение концентрации этанола в реакционной смеси или при возрастании длительности контакта о осадителей создает сложности из-за быстрой инактивации фермента при осуществлении осаждения, особенно в опытно-промышленных условиях.

Применение для осаждения иэопропилового спирта позволяло получить осадок с меньшим содержанием балластных веществ, однако,выход при оптимальных условиях осаждения в препарате липазы в активной форме составил лишь 56$, наряду с этим полученный препарат был нетехнологичен. Показано, что наиболее целесообразно и экономически выгодно использование и качестве осадителя липазы из ультраконцентрата ацетона.Осаждение прозе»,шдось в диапазона концентрации ацетона в реакционной среде <;? и,-\ ¿с 71.4;!. Наилучшие результаты - Ь6,о$ активности в препарате

e s s

-ыиос/ихнэНная t/U ZSi-O похнаНоНи p u/odvuadu $ зйЭоф poHjnuMQ $ iitvunir oawg

*ШО</ШМЭЬ№0* в 9Э 3 •

f ошооштУшоя $ui39tn»f

Vi 'шойоиачи

- хпхлэ 0o*nv

°/a ' '/км понBomn. g try orí эш.9нзз0зи f

3J.DdtUfi3hKDif f HtOLtntr ЧШЗОНдпШМО ЧОНЛОШОШ JQ

3 ae«s<u ■«Л gotSS

«HÜf

ч. S. ex

- были получены при концентрации ацетона 64,3$,при соотношении концентрата и ацетона 1:1,8.Препарат был светлым,рыхлым,прекрасно сушился.

Использование для осавдения смеси изопропилового опирта и этанола ожидаемого результата не дало. По всем показателям результаты были хуже, чем при других вариантах осаждения. .1

Показана' принципиальная возможность получения препарата липазы методом высаливания, но не представляется возможным рекомендовать этот метод для последующего внедрения в производство из-за его нетехнологичности и. сложности регенерации (НН^)2 5 0^.

2.3.3.3. Получение сухих препаратов Липоризин ГЗХ,Г10Х-Г25Х

Учитывая степень очистки препаратов ферментов и области их применения нами рекомендованы два варианта последних стадий технологии' получения сухих препаратов фермента:

- внесение защитных наполнителей и распылительное выдушвание,

- внесение криопротекторов и лиофильное высушивание.

При разработке технологии получения препарата Липоризин ГЗХ из концентрата культуральной жидкости нами подобраны в качестве защитных наполнителей меласса - 1,0$ и хлорид натрия - 5,0%. Использование для распылительного высушивания сушки, разработанной НПО "Биомаш", отличающейся более ниакими температурами теплоносителя (Твх= 85-90°0; Твцх = к 45-50°С) приводило-к увеличению активности в сухом црепарате ГЗХ и снижению потерь последней до 5-65? на -этой стадии технологии (Кривова, 1991). При получении ферментных препаратов с индексом Г10Х.Г25Х в процессе осаждения фермента из концентрата культуральной жидкости нарушалась сольватная оболочка белковой молекулы фермента, что способствовало возникновению ситуации повышенной лабильности энзима к рН,температуре, длительности контакта белка с тепло- или хладонооителем и т.д. Показано, что потери активности в исследуемых образцах* при различных режимах замораживания одинаковы и составляют 20-25$. Исследовано влия-. ние криопротекторов (эгиленгликоль, полиэтиленгликоль-400,(димэтилсуль-. фоксид, сахароза) на сохраняемость липазы в активном оострянии в про- . ; цеосе замораживания (рис.13). . , /

Установлено, что добавление 0,1% сахароэы является позитивным технологическим приемом и способствует не только сохранению активности препарата при лиофилизации, но и при длительном хранении. ,

2.3,4. Разработка условий выделения гомогенной липазы ! 2.3,4.1. Ионообменная хроматография липазы

' освобождения липазы от сопутствущих белков бнл применен ме-

V тод воиоэбменной хроматографии с исг эльзовшшвм "и'оно-Я" колонки с

cos a.i 1.0 sfi Щаzs.o ' концбнтрацив круЬпратекгороаг%

Рис.13 Влияние криопратвктораа на актиб-нос-гпь липазы при saujQ-р оживании

со со

Рис. ЯринцитгуольнаА снема очистки препарата. Лгтоаивьна ГЗх с -использованием Си (j)-PCDК - агаров

ионогенной группой -СН^СНз^ и колонкой "Моно-5" с ионогенной группой, основой которой является группа -С^-ЗОзТ Был получен белковый комплекс, состоящий из 5 белков. В литературе встречаются данные о существовании различных форм липазы, синтезируемых одним и тем же микроорганизмом, отличающихся соотношением различных полипептидных цепей, что,в свою очередь,определяет различие их кинетических характеристик (Диоров,1994). Однако, у исследователей нет единого мнения относительно причин существования множественных форм липаз. Вместе с тем, есть основание полагать, что большинство липаз являются олигомерными белками (Шгауата 1979). Одной из причин, объясняющих существование множественных форм липаз, по-видимому, может быть явление диссоциации-ассоциации. Не исключается также возможность взаимодействия белковой молекулы липаз с различными углеводными остатками, так как показано, что липазы являются гликопротеинами (Брокерхоф,1978). Для уточнения возможности наличия множественности форм липаз у Я. огуъае 1414 необходимо выделение гомогенной липазы. !

2.3.4.2. Выделение гомогенной липазы методом гидрофобной хроматографии и ИЭФ

Одним из эффективно применяемых методов фракционирования белков является биоспецифическая и гидрофобная хроматография. Для очистки экстрацеллшярной липазы гриба Я. о^гое 1414 был использован гидрофобный сорбент - дшштрофенил-гексаметилендиамин сефароза-4В. Выделенная активная фракция подвергалась гель-фильтрации. Удельная активность препарата липазы была повышена почти в 30 раз с выходом по активности около 37$. На хроматограммах был получен, один пик белка, обладающий липолитичеокой активностью. Однако, асимметричность пика требовала дополнительных операций по увеличению его гомогенности. Для выделения гомогенной липазы использовали метод изоэлектрофокусирования. Липаза элюировалась в виде строго симметричного пика. Потери активности на данном этапе очистки составили всего 7,0$. Удельная активность возрос ла в 1,6 раза. После освобождения методом диализа от амфолинов и последующей лиофилизавди нами получена липаза с удельной активностью 142«Ю3 ед/мг белка, что превосходит исходную удельную активность щ парата в 44,0 раза, выход активности составил 9,0$ (табл.6).

2.3.4.3. Разработка принципиально новой схемы получения высокоочищенной липазы к.огугае 1414

• с использованием металло-хелатной аффинной хроматограф

Технология получения гомогенной липазы сложна и требует дорогое» вдого оборудования,однако,в ряде случаев для ферментативного гидролиз: на производстве достаточным является использование высокоочищенных липаз.

Таблица 6

Характеристика этапов получения гомогенной липазы

Очищаемая фракция Удельная липазная активность, ед/мг белка Степень очистки Выход,'

Фильтрат культуральной явдиости 25,0 - 100

Исходные рас:ТВ0Т)Ы

Концентрат культуральной жидкости 139 I 95

Растворенный Липоризин ГЗХ в тритоне ' 148 I 95

Основные- этолы очистки

Надосадочвая зццкость -центрифугирование - ' 125 * 0,84 85

Диализ - диалязированная надосадочиая липкость : 197 1.3 84

Осоядеиие - осаженный ацетоном препарат \ 3300 22 I 65

Ионообменная хроматография 3400 2.3 I . 64

Гндрофобкпл хрсмлтогра^ия 23000 155 7,0 29,0

Гел^:срон:»гогргфня 1 08000 620 28,0 16,0

Изооле;строфо1сусцроБа5зпа 142000 965 44 9,0

Использование цоталло-холат-аффпнной хроматографии.позволило раз работать простую схему выдолегаш высокоочвденной липазы. Этот способ для очистки липаз бил использсвад вперзыо. Сорбцшо фермента осуществляли на С и(П)-ИДС-агароз в, а десорбцию - с добавлением конкурентного вещества - имидазола. Электрофорезом в ПААГ в денатурирущих условиях показано, что в результата (ДАХ на С<у(П)-ВДК-агарозе при рН 7,5 подучен препарат липазы Я.огугле 1414, содержащий две фракции сходной молекулярной гассы (от 20 до 30 кД), а также достигнута высокая степень очистки рабочего /образца. -Такт образом, получен высокоочищенный. препарат липазы /?. pij/zae 1414 с удельно^ активностью 87-Ю3 ед/мг белка, степень очистки которого по сравнению' с Липоризином ГЗХ увеличена в 27 раз,выход процесса - 13$ от исходной активнооти препарата (рис.14).

Технологическая схема получения препаратов Липоризин различной степени очистки представлена на рис.15.

2.3.5. Изучение некоторых свойств липазы И. oiyzae 1414 Получение высокоочищекного и гомогенного' препаратов липазы R- oitj-Zae 1414 позволило нам изучить физико-химические и кинетические свойства фермента.

кампоненгы среды, пар, хладо-агент crnepu/it-нб'й -ъоздцх

атпраЕатпанныи

без дух—-

компоненты cpt-ды, пар, хла'до-агент, стерильный ъоза ух,ле-

нага сите ль-•

о траст, воздух

Приготовление nnm. среды ■ стерилизация, озелахдени^ аыращиёачие поссвнагома-. Териала. t-SS'C> 7-}1y)

Прцгатоёиеиие vpaujbogcT-Венног) среды, стерилизация oxuatkgenve,sqctb среды, т>ы рощиЬание о ферментерах, £ °/граф иль.Хи-зщ Г-Мч.

Исходная культура продуцента липалы Е. orí/леге

Готобчи -но-сеёной материал 2 -3% г

Готовая глубинная культура Я. .oryz ое

о садок (биомасса, твердые чения -»- на -утилизации!

фшьтРАциЯ; селариро&оние

Концентрирование

фильтрат культура льноо жидкости

тпел-1аносите/1Ьш \ Сушка распылением 6о~да

осадок на-

утшизацию

Растворение , фшьтраци.

О с а Ж с?е и г/ е

Концентрат

Липоризин ГЪ*

ферментный рост бор

IMNHmVSOl 0.6 от полного на -i i > сыщения

ацетонг соотношение /:2

шопропилоёии спирт, соотй. i:ft5

ñj смесь: э таном-*- из о пропаном (20%+80е/) соответственно,соотн. -1:2,5°

надосадочная Жидкость на оегенера -■цйю

отходы — -на утилизацию v регенерацию

с е парирование

лпофилизация

виаягньш осадок по Г-Л7 6а-риантаЯ

ЛилоризинПОх по [ -¿У Ьариантан

Лереосашдение, гель-фильтрация, диализ, ультрафильт -рация, фракциониро-ван-ие и т.д.__

Ли о Филизация

Влажный осадок, бодные растворы концентрат ы_

Липоризин Г15Х-Г20х

Рис. 15. Принципиальная технологическая схема выделения v очистки лупазы из '-'..■ti, оияной культуры FL. oryzae ihiU.

2.3.5.1. Влияние pU я температуру на активность н стабильность липазы

1ипава R. aiyzae 1414 достаточно стабильна в нейтральной и щелочной сйглдта Еяачштая рН. Зона IOCÇÎ стабильности псочищсшюго препарата (Г31) находится в интервале от 6,0 до 10,0, а для частично очищенного п Bi!cor.coiirr;mmoro (Г10Х л Г25.Х) сугаотоя до спгмвння pli 6,0-9,0 п 6,0-8,0, соответственно. При рН 12,0 сохранится 65-7CÏ? негодной аа-Тлвпосгп. В кпелой зоно рН псолодусая ялтапа кезео устоЗчзша, пр.ч рН 3,0 теряется ся^зо 70,» шдашцостя (5ораенга. Лшюрязнн ГЗХ наиболее аяхаяез пря рЛ 6,5-8,5. По уэрв увеличения степеня очистка интервал спздагчивйх ееглопзй рН двя действия формата сугадся до рН 7,0-8,0.

Проворза торгкстг.бплгпоо?з препаратов липаза Я. огугае 14x4 и кн-eopsaii» 0-3 3Q до 00°С ггоглзага, что посхадуетай фзруант достаточно ^пр-ос'-М-бг.—л. Тог: после дпуг:гоопой Егспоалтсп прз 50°С прзпарахи Пр'ХПгЩГ'СКЛ ВаШИИЛЯ оохргшял походщп вкишвесть. Чувстшхтолшость ¿¡■"рнп-к??. к дсЗсго^ ~сгяср?.гурм позраотала ко «¡эре узашпозад стсяепп его с<тас*?пп, Я'эторпЕ.тл ГЗХ чороз 2 "ici :гппубгигсз црз 60°G шпхяпизро~ то 4<Х5, и Ятсртаи ИОХ га сто врг^х горня 7Б? пороонаяальаоЗ ярсгптз ГПЛ я ггг:логгг.г.гт устcrn.ci ггзь 152 от ео-::злйо.1 г.:;.-;:ппес.Прл 80°С препарпен ГЗК,ГЮХ,Г25Х поляоогьп нназта-гхрог.ч* -с* n ?0,60,30 гт;пут ccoïsoïc-.'rcnno. ТсгпоштуртД са-

vrfyti npônpaïo "mvi, n спгяоегоояг сг отсдсаз отпест, в

?.3,5.2. яарагяерзеотяа лтаяси Я.оу/гае 1414

Прл псолгчогггяя х^зглтгсл трггэт^лтляясргзоз п oszizozux cl^poa гг^йгло-'тгг ггедот .гтяпзоЗ R.oiyiae Ш4 оряпЕсаяз полуодето расудь-

с етиохтпигн хпрг.:^ор"етггг-!'Т гготф^гкппсссоЗ ляюса з карбоа-еглсо2«1Лгд, При гаоасяогшгп Brsrïocnrss скоргсжз гядролнеа субстрата л гопцеягр?!^ которзя Сэрг.г'шсоглглзь лзпойшгл урашюппся,

Сила rxipnsn удосипя для ргботи л рладипа получпемэго с55зкта гздроет-гя трпгцэтлга (ТАЦ) концяярэдда для ппу^асглого Форле-пта, равная 2,3■10"*' га* бот/'-Я, для пищрсзетгссяоЗ „"тази - 0,037 txr белга/ш, для гарЗогсгиготср^сц - 0,272 »Ю-0 ггг болка/ш. Анализ даршх по азу-чзтпз закономерностей вяияпня ТАЦ па ькорость ого гидролиза прз выбранной рабочей шщоптрацш форг;ептов погасал, -что липаза R■ orjfjai цц по характеру гядролзза ТАЦ блзлэ к дппагаы, чем к осторазам. Апалогзгч-пнэ опыты для лппапшпесках форелентов с 'риб^тиринои (ТЕ) показали, что по характеру кривых зависимости гидролиза последнего от его концентрации для всех трах фераентов свойственна одна в та же картава. Важным является тот факт, что изучаемая липаза R. ozj/гае 1414 имеет

шсокоо сродство к ТБ. При изучении кинетических параметров гидролиза трнкаприллна (ТК) показано, что характер лшюлиза для липазы Я.ох^гае 1414, панкреатической липазы в харбокаалэотеревн был аналогичен.

В ходе исследования по действие липазы Я. агцгае 1414 на истин- -иый субстрат липазы - вмульсиа трнолоина (ТО) установлено, что исследуемый фермент по своему действии аналогичен панкреатической липазе. Карбоксилэстераза из печени свиньи сродства к данному субстрату не проявляла. Необходимо отметить уникальную особенность изучаемой липазы, а именно, явление активацыг последней в прлсутотвяЕ 0,1$ незоко-генного детергента - тритона 1-100 (0,1/1).

По результатам изучения гидролиза субстратов истинных Ботераз(цэ-тялбутирата, отилбутирата, ыетилолеата) дшазой Я.ог^гае 14x4 ксдаю заключить, что у данного фермента отсутствует опецяфачность к субстратам карбоксилэстераз.

Таким образом, изучаемая липаза: во-первых, избирательна к гра-ацилгдицеролам, во-вторых, скорость гидролиза ТБ значительно превыше? скорость гидролиза ТК я ТО. Скорость гидролиза ТАЦ при переходе через ККМ в присутствии липазы резко возрастает, другими словам физическое состояние субстрата влияет на процесс гидролиза последнего, что такнэ подтверждает схоаеоть с панкреатической липазой. По специфичности изучаемой липазы к гиркокпслотной часта триацплгллцеролов субстраты мокио расположить в следущей последовательности: ТАЦ > ТБ> ТК = ТО.

2.3.5.3. Позиционная специфичность дшае Я.огугае 1414

При изучении позиционной специфичности исследушого фермента оценивали глубину и скорость гидролиза триацилглицеролов (ТГ) оливкового и соевого масел. Анализ продуктов реакции осуществляли методама ТСХ и газовой хроматографии. Гидролиз проводили очищенным ферментом о активностью 142*10 ед/мг белка. В табл.7 представлены данные об изменении глицеридаого состава жировой фазы гидролизатов в процессе липо-лиза. За 12 часов проходил глубокий гидролиз исследуемых субстратов, т.к. непрогидролизованнымн остались всего 20-25$ ТГ. Анализ динамика ткопления глицерина в водной фазе, происходящего очень медленно, а также глубина гидролиза ТТ, к атому моменту достигающая 44$, позволяла сделать предположение о наличии у лишзы Я-о\угае 1414 позиционной специфичности (табл.8).

Наряду с этим, величина, характеризутщая степень позиционной ..«••: ;|Ди'шости, рассчитанная по методу Меерова Г.И. с соавторами (Мее-р ,, .У:,), поставила для изучаемой липазы 0,023. Согласно' предложен-• '".1:1:11. чом бол низ эта 'наш чина приближается к нулю, тем выше

/ Таблица 7 Изменение состава жировой фазы гидролизатов ТГ

Время Оливковое масло,? Соевое масло,Я

ферментативного гидролиза^ ч ЕК ИГ ДГ ТГ як МГ ДГ. ТГ

0,5 8,9 0,8 8,7 81,3 3,8 0,9 8,7 84,6

1.0 10,6 '2,4 16,7 72,2 8,2 1,3 12,4 73,6

2,0 19,2 3,2 18,9 58,3 15,0 2,4 18,6 58,3

4,0 25,3 4,5 23,6 46,1 19,7 3,6 22,1 36,7

6,0 32,6 5,6 26,4 34,3 22,3 3,8 23,4 36,0

8,0 36,7 6,7 27,3 27,6 31,4 5,1 25,0 30,2

10,0 40,2 8,6 27,1 22,3 37,6 5,9 24,8 25,6

12,0 44,4 ' 9,1 26,8 20,Г 43,1 6, 3 24,0 22,3

V ' Таблица 8

Накопление глицерина в водной фазе гидролизатов

Время Оливковое иасло Соевое масло ■

ферментативного гидролиза, ч Накопление глицерина,? Глубина гидролиза,* Накопление, глицерина,* Глубина гидролиза,?

0,5 •г» — - -

1.0 , 0',08 4,5 0.1 5,2

2,0 0,14. 8,7 0,17 12,3

4,0 0,25 22,6 0,26 24,6

6,0 0,42 32,1 0,42 33,2

. 8,0 0,51 36,3 0,62 40,2

10,0 /0,79 42,7 0,82 44,6

12,0--- -/0,80 44,1 0,81 44,4

позиционная специфичность вошд>етной лшазн. Основными продуктами,об-разущишся о процеоса диполи за, являются диглицерины (ДГ) и свобод-нна жирные киолоты. Ионоглицарины (1£Г) накапливаются очень медленно и в незначительных количествах. 1роматографичеошй анализ фракций свободных лирных киодот гидролизатов оливкового в ооевого масел свидетельствует о том; что фермент не обладает избирательной способностью в гидролизу эфирных связей в зависимости от насыщенности лирных кислот, ададированных о 'глицериновый остатком. При использовании метода рада-активных индикаторов (Г-^лЗ)-трипаяьштата и (1- С)-триолеата радиак-тивнооть была обиарунена в гидродизате во фракции свободных жирных кислот при величине эколозншш 15 минут я пр должала накапливаться в течение 1,5-3,0 часов п зависимости от субстрата. Накопление ыоногли-церинов в гидролизато через 12 часов гидролиза составило 8-12? при

степени гидролиза 62-б<$. Глицерин накапливался в следовых количества!.

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать заключение о наличии у липазы Я. огугае 1414 определенной 1,3 позиционной специфичности.

2.3.5.4. Перетарификация жиров о применением липазы

Наряду с субстратной и позиционной специфичностью изучаемой липа-си нами била показана возможность ее использования как фермента пере-атерифицируадего действия. С целью преодоления сложностей применения липазы для процесса переэтерификации была проведена таюбилизация последнего на минеральной носителе - алюмосиликате. Способность к переэтерификации ацилглицерсдов иммобилизованной липазой была доказана наличием изменения жирнокислотного состава в ТГ до ж после реакцин (рис.16). Анализ жирнокислотного состава ТГ проводили после их выдел е-аия методом тонкослойной хроматографии о помощи) газокидкостной хроматографии. В процессе ферментативной реакции проиоходаг количественное л качественное изменение жирных кислот в ТГ как в сторону увеличения, так и уменьшения их в реакционной смеси. Следует отметить, что процесс идет и в случае насыщенных жирных кислот о высокой температурой плавления. При атом короткоцепочечные насыщенные жирные кислоты включаются в реакцию предпочтительнее.

Протекание реакции этерификацнж между глицерином ж олеиновой кислотой было продемонстрировано с использованием метода радиационных индикаторов (рис.17). Следует ответить, что синтез МГ идет пропорционально убыванию олеиновой кислоты в реакционной смеси. Синтез ДГ идет медленно с незначительный выходом, ТГ в продуктах реакции не обнаружены

2.3.5.5. Кинетические свойства липазы А. оъугае 1414

Для разработки научно обоснованных режимов использования липазы И.о\угае 1414 исследовали кинетику процесса хадролиза различных субстратов, физические и экзиматические свойства фермента. Определены основные параметры фермента, методом изоэлектрофокусирования найдена язоаочка фермента (р1=4,7), определены коэффициент скорости седиментация (3,0 ед.Сведберга), молекулярная масса (45 кД) (рис.18).

Методом <Ш5-РМ&£ электрофореза показана субъединичная структура липаз и Я- 07^2ае 1414, представленная двумя субъединицами с молекулярной г/ассой 17,4 и 28,2 кД, активность этих фракций составляла 30 ;! о5?'. от суммарной активности соответственно.

5':»:, кинетики гидролиза трибутирлна и оливкового масла пока; - , т • и.'лу:ом Я. огуюс 1414 проявляет сродство к обоим субстра-

/и-

{во

юг

«х

тг

»

Рис. 15. изменение содержания Жирных кислот до и после ф ерментагтьбнои реакции.

(Рмрииахицая слосо£~ нснГть меть да. »

заеиси-аости от' химического строения >Нчрнаг> кислоты)

Обоъначенуя. :

реакции Щ л»<г/< реакции ' парные кислоты ■ 1- ; £ -<?М1СЬ нена-

СЫЩМНИХ Ф-К. 3- ¿5/;/ !

(*~сша > -3"- с(е:а > 6- С^.-д.

Определены* Жирные миеиоти

Илительность , мин.

Рис. 17. Содержание (алеина&ал. кислота.) -6 продуктах синтеза с участием липазы Л. огугае -/4/4

а) Седиментограи/ма гомогенной липазы

5) Определение ■молекулЯрной массы липазы (точка 6)

$ 1-ъякжозоаксидала, \2-ttnotAoSvH, .

* 3-альбумин ничнъш, С Ч-трипсин,

* 5- миогиобЪ«

Г5 . 80 ¿5(

Номера фракции

В) Электрод?орЁгрл-■ мма гомогенной липазы в ПАнГ

Ю 15 го 25 за 35 но Номера Фракций

45 50

г) 11гаэл.екгг\рическае _фокуси-рабание гомогенной липаъы

РисЖ Характеристики гомогенной липазы н, огугае 14-М

ам. Константа Михаалиса для гидролиза трибутщлша была равна ,91 мМоль/л, а максимальная скорость гидролиза 1,51 мМоль/иг»

зп, для панкреатической липазы величина Kw = 2,18 мМоль/л. Определе-а эноргня шшктивацпи лппазы, которая составила 86 кДп/моль.

Подученные данные ойдцетольсгвувт о близости кинетических харак-срлстшс псслодуслого фермента л истишшх лшаз, что позволяот отнести плазу R.oiijzae 1414 к липазам КФ 3.1.1.3.

2.3.6. Игаетбшшзацяя лшази на различных типах носителей

Наин показана перспективность использования ^мобилизованной ли-азн как для гидролитических, так и для процессов синтеза. В нсследо-ашш прниешЕшсь методы ковалентной и физической икюбшшзацпи.

Химическая Еэмбплизация лнпазн осуществлялась на 13 тшах носз-'елеЗ. Наиболее подходящззлп носителями ддя липазы R. о? t/2 а е 1414 являясь эпокснсилохрои, эпокснопликагвль п анпносдлохроу. Установлена горспективность использования пористого алюосшшката в качестве мат-ацп прз иммобилизация липазы, размер пор 60-80 $ п внутренняя поверх-:ость 70 t?/v. Оптвязированы условия шгдэбшшзацпд формопта, тенпера-Тра процесса 30-35°С, pH 7,0-7,2, ддштшшюогь контакта 2 часа, перо-¡вшивание 200-220 об/мин.

Определены гатаотпческпо параметры шгиобшшзованной лппазы: коно-анта Нахаэдпса К« =>» 2,17 мМоль/л, энергия активации и шшктавацди авва 10,5 кДд/моль з 224 нДя/иоль соответственно. Кинетические свойства шшшной и тшрбшшзовшшой ллпазы представлены в табл.9.

• / Таблица 9

Кинетические свойства иативной п иммобилизованной липазц

Свойства

Нативная

Иммобилизованная

липаза' липаза

37 45

25-50 30-65

7,0 7,0

6,0-8,0 • 5,0-9,0

1,91 2,17

36 82

12 10,2

86 224

(птшуи температуры, С

Снапазон териостабалшости,°С( 1-2 д)

ЙЕПЫуи pH /

[иапазон pH стабильности 1-2 ч) :т (мМоль/л)

[орзод пошупнактнвают и пря.Т « 37°,ч Энергия активации, кДж/моль (нергвд инактивации, кДд/моль

Установка, в основу которой заложена иммобилизованная на порпо-гом алюмосиликате липаза А. о?£2ае 1414 и работающая в непрерывной >екше, апробирована на. Московском ыыдоваренном заводе для гидролиза

растительных касол. Кратность использования иммобилизованной липазы достигала 53. При часовой работе колонны кислотное число пропускаемой <щульсни соевого масла увеличивалось в 12 раз. Однако, в силу специфичности действия изучаемой лапазы, показанной ранее, полного гидролиза триацилглицеролов достичь не удалось.

2.4. Приязненна днпазы

Широкий оптииуц рН-действия (6,5-8,5), высокая стабильность препарата Лииоризин ГЗХ, способность гвдролвзовать растительные иасла в твердые лиры, отсутствие избирательности в отношении структуры «шрно-згислотного остатка, устойчивость к повшенныы теиператураа позволяют использовать липазу Я. o?t/2ae 1414 в0 шютах отраслях прошли енностп. В частности, уникальная способность к гидролизу ланояшш дает возыоз-ности применения данного препарата в технологии -обезжиривания меха в кот, а также в технологиях илса ж шеннх продуктов. .Способность препарата Лииоризин ГЗХ гидролизовать различные лшщдные субстраты, его совместимость с различными компонентами s стабилизирущиш соединениями мощих средств позволяют подойти в разработка научно обоснованных рекомендаций использования липазы Я. aitjlQC 1414 в составе сштетичео-ких мощих средотв(СМС) в чистящих средств для выведения игровых пятет

2.4.1. Применение Липоризина ГЗХ в составе рецептур мощих л чистящих средств

Синтетические иопцие средства, как известно, представляют многокомпонентную систему различных химических соединений, включащую поверхностно-активные вещества (ПАВ), конденсированные фосфаты, карбонаты, биокарбонаты, натриевые соли карбоксиыетилцеллгшозы (КЫЦ), силикаты, сульфаты, пербораты натрия, оптические отбеливатели,отдушки в др.

Наряду с щелочестойхостью в термостойкостью препараты липазы должны быть совместимы в сохранять стабильность в сочетании о многокомпонентной системой цощих средств. Было исследовано влияние основных компонентов мощих средств в полных рецептур на липодитическую ак тдвиосгь отечественных препаратов Ляпоризин ГЗХ в Липоаэрузвн ГЗХ. С зтой целью были приготовлены бинарные смеси, в состав которых входил ферментный препарат в сочетании с определенными компонентами CMC. Содержание ферментного препарата в бинарной смеси составляло 1000 ед/г композиция, концентрации кошонентов СМ) - наиболее часто применяемые в рецептурах. Такие бинарные смеси имели влажность 3-0% и хранились -[-л температуре 20-25°С в течение года (табл.10).

И процессе длительного хранения (до 12 мес.) выявлена высокая

Совместимость и стабильность липаз в сочетании о компонентами мощих средств

Компоненты 1сщзх сродета. Содорзанле кошднента, Совместимость с Стабильность липаз за 12 месяцев, %

% компонентом, % Лшорязш ГЗХ Липоаэ|узин

Зул1*$онол 2,0 90,8 8,5 5,2 92,0

7,5 &V- 90,1

16,0 37,5 3,1 88,4

1зкплолашды 5,0 25,3 25,3 92,7

лштетичеекпо нарныо шсяоти (Cjy-C2o') 4,0 91,3 21,3 91,5

Грзполпфосфат глтрзя 40,0 В7,3 * 17,3 86,0

карбонат натрия 12,0 91,7 21,7 90,7

Зикарбонат патря^ 10,0 94,8 24,8 92,8

Зетасилпкат натрия 5,0 80,3 10,3 78,9

1арфиэрпая отдувка 0,1 98,7 28,7 98,4

¡ерборат натрия 15,0 62,0 следа 60,0

Зульфат натрия , до 100 93,4 28,4 96,0

:табндьность Jtoncaopysmta ГЗХ почтя со Bceifs компонентами С!.!С, тогда хах Липорззпн ГЗХ был нестабилен.

Посколыдг препаратам лшт,з необходимо с|фоктпвно действовать при растворения поящее орадств в воде, ввыл изучена танае стабильность из; з сочетания о компонентами мощях средств в раствора!. Препараты Лшго-зззян ГЗХ л Липоаэрузпн ГЗХ вносили в раствора компонентов CMC, кон-хентрация которых соответствовала в средней тем, которые используются } рецептурах мощшс средств, п соответствовала 1000 ед.активностп на [ л раствора (табд.П).

Как елдяо нз представяенншс данных, днпази в растворах неионоген-шх ПАВ стабильны. Для ашюкогетшых ПАВ стабильность фермента мала(64~ >8$). Прзчлна различного воздействия цезеногещшх з анионогенных ПАВ ia стабильность фэруонтов, по-видимоцу, заключается в природе этих сочинений. В растворе анионоганшв ПАВ ионизируются, п заряженные суль-фогрушш, очевидно, взаимодействуют с гидрофобными участками белковой галекулп, связи кезду гидрофобными учаетташ иаогочнеленнн и наряду с юдородншя поддерживают молекулу в стабшштец состоянии. Наличие !ульфогруш, вероятно, ослабляет эти связи,... дабявдается некоторая дестабилизация молекулы, вызывающая частичйу» потерю активности. Неио-югенине ПАВ в растворах на ионизируют в, вцдаао, поэтому их влияние ia стабильность ферментов не сталь существенно.

Наибольшее влияние на стабильность липаз в растворах оказывают

Таблица II

Влияние компонентов CMC на стабильность липаз в растворах (40°С)

Стабильность препаратов липаз, % Лппоризин ГЗХ ) Липоаэрузин ГЗХ

Компоненты CMC

20 ыин | 60 мин } 20 мин 60 мин

Сульфонол Синтаыид-5 Синтетические жирные кислоты (Cjy-C20' Триполифосфат натрия Ыетасиликат натрия Бикарбонат натрия Сульфат натрия На-КМЦ

Перборат натрия

90 58 96 64

100 100 100 100

100 •100 100 100

86 78 84 '82

97 80 98 82

98 90 98 " 91

100 100 100 100

100 100 100 100

81 55 82 54

отбеливающие вещества. Для отбеливания белья в отечественной практике применяют оптические отбеливатели и перборат натрия, Перборат натрия представляет собой белый кристаллический порошок, часто используется виде тетратцдрата HaBOg^ItjO. Причина значительного сшшения ферментной активности в присутствии перборага натрия заключается в той, что при высоких температурах (40- ~0°С) он начинает разлагаться, выделяя кислород, который моает взаимодействовать с активными группами, ослаб дяя связи, определяющие структуру белковой молекулы.

. Таким образом, проведенные исследования по изучению влияния отдельных компонентов CMC на стабильность препаратов липпзн позволила сформулировать основные требования к ен8шсодвржащиы рецептурам.

При выборе рецептур синтетических ковдих средств, включающих липазу, следует использовать неионогенные ПАВ, ограничить применение анионогенных ПАВ, иэтасиликатов натрия и триполифосфатов и исключить перборат.

Испытание мопцей способности растворов свежеприготовленных cuece липазы и неионогенные ПАВ дали положительные результаты. Эффективном удаления жировых загрязнений возрастала на 15-3$ по сравнению о без-энзимнымя композициями моющих средств.

Результаты свидетельствуют о перспективности использования Липо-ризина ГЗХ в составе чистящего средства. При составлении композиции чистящего средства содержание ПАВ ограничивали 2С# от массы смеси. В качестве наполнителя использовали сульфат натрия, т.к. ваш было пока зано, что соли На+ оказывают стабилизирующее действие на липазу гриба огухаг 1414 (табл.12). Изучена зффективность композиций при обезжи г.иьошш иш образцов стандартно за1рязненных шерстяных и хлопчатобу-

Совместимость и стабильность Липоризина ГЗХ в составе чистящих композиций при хранении

Компози- Состав чистящих Концентрация компонентов,% Липолитнческая активность,$

Длительность сутки

ция композиций 0 1 5 10 30

I Липоризин ГЗХ ТПФ-На На2504 1,0 20,0 79,0 97,0 80,0 76,0 72,0

2 Липоризин ГЗХ Синтамид-5 1.0 20,0 79,0 94,0 20,0 9,0 6,0

3 Липоризин ГЗХ На2504 1.0 99,0 94,0 36,0 30,0 30,0

ыажных тканей. На основании проведенного исследования по применению Липоризина ГЗХ в составе чистящих композиций можно утверждать, что:

- наилучшие результаты достигаются при использовании композиции, состоящей из 20$ трлполифосфата натрия, 79$ сульфата натрия и 1$ Липоризина ГЗХ с активностью 50-Ю3 ед/г;

- наибольший чистящий эффект (на 25-60$ выше,чем при химической чистке) получаотся на образцах загрязненной шерсти;

- использование Липоризина ГЗХ в чистящем растворе (1$) экономически выгодно, а главное снимает необходимость работать с органическими растворителями, улучшает условия работы и не снижает качество очищаемых тканей.

Липоризин ГЗХ испытан в составе биологического чистящего пятновы-водного средства (БЧС) в сочетании с амилазой и нейтральной протеазой и средства для предварительной обработки текстильных изделий "Москвичка" в сочетании о щелочной протеазой. Работа проводилась в лаборатории промышленного биокатализа А.0 "Биотехнология" совместно с д.т.н. Гробо-шовой Р.Н. и к.т.н. Рьшковой Т.М.

Лабораторные испытания показали 100$-ную стабильность препарата Липоризин ГЗХ в смеси с указанными средствами при хранении в течение трех месяцев при комнатной температуре. Липаза совместно с амилазой и протеазой в составе БЧС обеспечивала полное удаление с ткани искусственного загрязнения из молочного жира, растительного масла и молока. Однако, существенных улучшений чистящих способностей БЧС с комплехюогд ферментов по отношению к БЧС с Липоризпиом ГЗХ не наблюдалось. Йо-зл-димому, этот факт возможно объяснить том, что Липоризин Г31 является

комплексным препаратом, обладающим наряду со способностью расщеплять жиры протеолитической и амилазной активностями. Оценка действия Липо-ризша ГЗХ в составе пятновыводша средств проводилась в химико-аналитической лаборатории ЦНИИ бытового обслуживания. Результаты испытаний показали высокую эффективность пятновыводных препаратов "Мультиэнзимя| "Субтинол", содержащих Липорязин ГЗХ, в отношении удаления Кировых загрязнений.

2.4.2. Применение липазы в составе мощах средств для пищевого оборудования

Исследование и внедрение проводили совместно с лабораторией ВНИИ-синтезбелок, руководимой к.т.н. Дуловой Л.М.

Проблемой первостепенной важности в рыбоперерабатывающей отрасли является мытье коптильных подносов и оборудования для тепловой обработки рыбы. Плохое снятие щрового загрязнения приводит к ухудшению качества рыбного продукта, к увеличению обсемененности микроорганизмами оборудования во время простоя, к прогоркандю жира, придающего неприятный залах и вкус продукту, к ухудшению условий труда.

Изучение действия Липоризина ГЗХ проводили в составе мощих средств "Триас", "Цолсин", "Дабомит", "Порошок для мойки пищевой посуда" , разработанных ВНШШШ и Щебекннсюш химкомбинатом (табл.13).

.Таблица 13

Совместимость и стабильность Липоризина ГЗХ

в составе различных мощих средств

т цп Наименование CMC Совместимость,^ Стабильность при длительности хранения 6 месяцев,%

I Триас 100 • 80

2 Молсин 100 • 60

3 Лабошт 100 50

4 Порошок для мойки пищевой посуда 72 56

Исследование действия фермента в растворах молцих средств при различных температурах дало возможность определить оптимальную температуру мойки пищевого оборудования - 40°с, Одним и? требований,предъявляемых к моющим средствам для пищевого оборудования, является их ан-тикоррозийность. Для придания антикоррозийных свойств CMC используют различные ингибиторы коррозии, вводя иг в состав моющих средств иди используя в качестве самостоятельных растворов. Наиболее распространенными ингибиторами коррозии являются мотаежликат натрия, Г—2—Ы (гек-саметилеивмин китробензойной кислоты) и ДЬАН-2 (диэтидашш-М-НЕтробен-

зойнокислый). Результаты исследования воздействия ингибиторов коррозии

ia фермент представлены в табл.14, из которой следует, что Липоризин

ГЗХ полностью совмещается (на 100?) и проявляет лучшую стабильность

[60?) о метасиликатои натрия.

i Таблица 14

Действие различных ингибиторов коррозии на Липоризин ГЗХ

ш Наименование -ингибитора • коррозии Концентрация ингибитора коррозии, % . Совместимость, ? Стабильность, ?

I Ыетасиликат натрия 0,1 100,0 60,0

2 Г-2-М 0,5 33,6 0

3 ДЭАН-2 ь 0,5 33,0 0

Мопцнй препарат CMC-I, включающий в качестве основы мопцее средство "Триас", Липоризин ГЗХ 2% к массе CMC и 0,1? иетасиликата натрия, был испытал на рыб заводе QHFK им.С.М.Кирова (Эстония). Для испытания Зшш использоешш разделочные подносы нз аягаиння. Визуально результаты мойки оценивались положительно. Дополнительным положительным эффектом от использования предлагаемого анзимсодерзащего мощего средства являлись сокращение потребления предприятием электроэнергии (подогрев вода), улучшение экологической обстановки предприятия (снижение доз '' ixonqero средства).

2.4.3. Ферментативное обезжиривание меха и кожи

Показана перспективность использования липазы R. otj/гае 1414 при обработке мехового н кожевенного сырья в качестве обезжиривающих агентов. Использование предлагаемых иощих растворов для обезжиривания меховых овчин способствует более интенсивному удалению лкпидов о волосяного покрова, сокращению длительности процесса обезжиривания с 2,5-4,0 часов до 1,0-1,5 часов, улучшению пластических свойств кодовой ткани (табл.15).

На Алма-Атинской меховом комбинате им.50-летяя СССР в условиях сырейно-красильного производства при обработке меховой овчины препаратом Липоризин ГЗХ получен годовой экономический эффект 10000 долларов. Заявленная потребность данного комбината в препарате Липоризин ГЗХ составила 3,5 тонны в год.

2.4.4. Разработка условий применения Липоризита ГЗХ в

обработке кишечного сырья для колбасного производства

Исследование и внедрение проводили совместно с чл.корр. Международной Академии "Холод" профессором Лнтиповой Л.В., заведушей кафедрой "Технологии мяса и мясных продуктов" в Воронежской Государствен-

Влияние состава мовдих растворов на свойства волосяного покрова и кожевой ткани овчины

Показатели качества, Варианты обработки

волосяного покрова и коаеаой ткани I П Ш 1У (контроль)

Реакция Либерыана:

-поело I стадии обезжиривания зеленый зеленый зеленый темно-зел

-после П стадии обезжиривания св.-зел. св.-зел. св.-зел. зеленый

Содержание лилидов в волосяном покрове, %

-после I стадии обезжиривания 3,4 3,5 4,6 8,3

-после С стадии обезжиривания 2,3 2,3 2,3 2,5

Нагрузка при разрыве, Н 42,5 52,6 34,4 43,0

Предел прочности при разрыве,МПа 7,3 . 10,0 8,1 9,1

Удлинение при разрыве, % 96,0 90,8 85,4 79,4-

Удлинение при напряжении 4,9 МПа:

-полное, % 73,0 61,5 6.3,4 61,7

-остаточное, % 54,5 45,7 48,0 46,8

-упругое, % 18,5 15,0 15,4 16,0

Появление трещин лицевого слоя;

-при нагрузке, Н 29,5 40,7 22,7 34,2

-при удалении: % 74,5 73,2 70,3 69,0.

ной технологической Академия. Результаты проверки на патогенвость шта ма Я. опг/М-е 1414 показали, что введение в корм животных гриба в дозе 1-10? и 1*10® не позволило выявить патологических изменений внутренш органов подопытных животных, их гибели на указанных дозах и носительс ва штамма. По результатам токсикологической оценки препарат Липориаш ГЗХ относится к малотоксичным химическим веществам - 4 класса токсичности. Липоризин ГЗХ не обладает аллергенными и эмбриотоксическими свойствами в дозах, рекомендованных для его использования в промилле! ности. Скармливание препарата белым крысам в течение 35 дней в субто! сических дозах (1/10 ЛДзд и 1/50 ЛЛзд) не вызывало у них летальных ис ходов и патологических изменений внутренних органов, что свидвтельси ет об отсутствии эффекта материальной и функциональной кумуляции пре: рата. Безвредность препарата Липоризин ГЗХ открыла новый аспект исп&) зования этого препарата в цищевой промышленности, в частности, в обр< ботке килечного сырья для колбасного производства.

В соответствии с проведенными исследованиями предложена новая т< нология обработки кишечного сырья (рка.19).

Рис.19 Принципиальная схема'паследо&атель-мсти технологических операции обработки кишечного сырья с использоЗаииелг Лиларизина ГЗх

Гистологические исследования тканей кишечного сырья, обработанно-о ыоханическим и ферментативным способами, показали дцентичные результаты, т.е. эффективность действия этих двух способов на серозный ;лоЙ одинакова.

Предлагаемая технология имеет следущие преимущества по сравнению : традиционной (механической):

- полностью заменяет наиболее сложное электромеханическое оборудование по разрыхлению и удалению серозных слоев (шляма), которое требует значительных энергетических затрат на эксплуатацию; в случае предлагаемого решения энергозатраты связаны лишь о использованием воды с температурой 37-40°С;

- практически не влияет на деформацию тканей, и не вызывает разрывов кишок, равномерно и полностью удаляет шши;

- значительно улучшается условия труда (отсутствие шуш,вибрации, лзатательно сокращаются ручные операции).

Патент, полученный на использование препарата Дипоризин ГЗХ в технологии мяса и мясных продуктов на способ обработки кишечного сырья пдя колбасного производства, успешно используется на Воронежском мясокомбинате. Экономический эффект составил 1600000 рублей при обработке I т кишечного сырья в ценах 1993 г.

ВЫВОДЫ

1. Путем скрининга среди эукариотных и прокариотннх микроорганизмов и естественного отбора получен штамм S. spfttioides ДО-2, обла-тдагащй высокой биосинтетической способностью к образованию липоксиге-назы. Доказано, что липоксигеназа S. sphevoic/es да-2 принадлежит к ислиферментной системе (ПГ-синтетазе), осуществляпцей биоспецвфичес-кий синтез простахландинов. Изучены особенности биосинтеза ПГ-сиате-тазы и протеолихических ферментов штаммом в процессе роста,определены факторы, регулирупцие биосинтез этих ферментов.

На основе полученных экспериментальных данных и теоретического обобщения выявленных закономерностей регуляции биосинтеза ферментов сформулирована концепция единого механизма рефляции синтеза последних. Предложена универсальная модель процессов биосинтеза и его регуляции. На основе предложенной модели описана биохимическая основа jr/нига¡жирования ПГ-синтетаз, протеаз на генетическом уровне. Модель позволяет: прогнозировать ход реакций синтеза определенных ферментов и сирзд&ляет пути их интенсификации.

2. Разработаны научные основы, не имеющие аналогов, технология .1;':.7чог;:п л изменения простаглавдинов и ИТ-подобных веществ.Показана

перспективность пх применения в качестве кормовых добавок в зверои ство п как профилактическое средство, стимулирующее репродуктивную систему лпвотных в ветеринарии.

Продпояона технология комплексного использовшшя культурадьной ацдкостз 3.зрЬе1а1с1ев М8-2 с целью производства различных групп ода. логически активных вздеств, образуеглгх данным продуцентом.

3. Разработана п апробирована в промышленных условиях технологи культивирования Я. ач^юе 1414, явившаяся основой для составления и а обходимой технологической документации по этой стадии производства:

- разработали эффоктегня-э метелч лоддеряанля втамма-продуцента. Сконструирован! новые а^гагелькыя среди на осново дешевых и достушгн/. видов отечественного сырья для стадии размножения вегетативного посевного материала и бяосннтзза ферментов,

- экспериментально обоснованы сптзманыше параметра биосинтеза липазы (рН среды, возраст и доза посевного материала, аэрация),обест* .члващко максимум накопления фермента,

- разработаны условия ^ульшшрсвапця Р-. огуюе 1414, позвол,:й;н учесть физиологические особенности микроорганизма. Опытным путем с не пользованном хшагодкнагстссхого управлошш по температуре определен опткцалышй профиль культивирования, обеспочивапций тхсг'.'алънос- накопление лшшгц. 11л Пряводанийл биохимическом оазодо использование разработанного температурного профиля позволило увеличить виход долевого продукта на 60-65$, сократить время культивирования до 41 ч, а сакна повнепть стабильность культуры.

. .4. Разработаны для проылшенного использования способы выделения внссаоочпщенного ферментного препарата липазы пз К.очугае Ш4 с выходом 13$ .-Впервые применен метод метадло-хелат-аффпшой хрогдатогра-йтш для фракционирования ферментного комплекса Я. огугае 1414 При изучении свойств высокоочицешого препарата впервые осуществлено вцделс-ппэ гомогенной лшазн .Я.ачуме. 1414 с р1 4,7.' Степень очистки при получении гомогенного препарата составила 44 раза (по сравнению с исходили препаратом/Лшорлзшх ПОХ), удельная активность 142 «Ю3 ед/ш' бел-па. Однородность фермента подтверждена методом электрофореза, методом определения коэффициента скорости седиментации, гель-фпдьтрацней,изо-олектрсфокуснрсзанисм. Определены молекулярная масса, коэффициент скорости содкмонтащш, нзоэлентрическая точка, термостабильность а рН-стабзльность, юшетлческае свойства лппазн. Установлено, что липаза Я. о гае 1414 - глдкопротезд, обладаю- чй четвертичной структурой. Она состоит иь двух субъедишщ о молекулярной ыассой от 18 до 28 кД, активных в отношении триацилглицеринов с короткоцепочечныш насыщенными

тарными кислотами (триацетш, трибутирин).

Выделенная липаза обладает позиционной специфичностью - 1,3.

Подтверждена концепция об участии липазы в реакциях переотериЗ кации и синтеза моно- и диацилглицерннов.

5. Изучены различные способы иммобилизации липазы на органлчес н минеральных носителях. Доказана перспективность использования иеэ дов физической иммобилизации на минеральных носителях для цромышлег го использования. Проведено сравнительное изучение свойств в кинетх носких характеристик нагивной л иммобилизованной липазы. Подтверзде принципиальная возможность разработки промышленного непрерывного к роли за отров и ыасел на основе гетерогенного катализа с применение! иммобилизованных липаз.

6. Разработаны научные основы технологии применения препарата "Липоризин" различной степени очистки:

~ показана возможность применения Липоризина ГЗХ в моховой и i aoBoiraou производстве, что подтверждено дабораторныш и полуцропзвс ственными испытаниями. В результате сокращается вроия обоззириванш улучшаются прочностные и пластические свойства кодовой ткани выдел ных пкур, свойотва и качеств^ моха;

- разработаны научно-обоснованные разимы применения липазы в < ставе синтетических тпцих средств (CMC) бытового назначения н для технических нужд пищевой промышешости; Предлагаемые рекомендации составлению рецептур CMC апробированы в подупролзводствешшх условз Выявлена высокая мощая способность биоактивных СМ0,прл удалении а грязнения на 35-45$ превосходящая «тот показатель в случае обычно : пользуешх детергентов. Чистящий еффэкт кошозпцай, содерзащпх Лшк ризин.ГЗХ, при чистке шерстяных тканей на 60$ превыхал гффектпвпос; действия органических растворителей, применяемых в пастоадео вреия при химической чистке;

- эффективность действия препаратов липазы Я. OU/zae 1414 прз гидролазе гшров позволила осуществить внедрение их в мясную проша пость в процесс обработки кишечного сырья для колбасного произволе Разработана и внедрена принципиально новая технология удаления сер них слоев кишечного сырья, позволяющая без деформации и разрыва ки равномерно удалять шлям.

7. Внедрение результатов научно обоснованных режимов применен исследованных ферментов в различных отраслях отечественной прошшл vости позволило получить экономический эффект свыше 45000 долл.в г Применение линолвтических ферментов в кожевенном,меховом произволе

, у, «яс о п ерерабатыващей промышленности, при использовании энзи r4Vopvj;.x< п:г.зацих и чистящих средств позволяет внедрить калоотходш

безотходные технологий, что в современных условиях при возрастали. 1грязнении округаэдой среды является исключительно актуальным.

Список работ, опубликовшшых по теме диссертации

1. Загустина H.A., Тихомирова A.C., Рафаловская Т.Н., Янголь II.М,. Кривова A.D., Фзликсова Р.В. Получение и свойства препарата фер мента пз аиегпайа tennt's // Приклад.биохимия и микробшпог-'

1975, 10, вып.5, С.725-729.

2. Калунянц К.А., Ваганова М.С., Щусь Г.В,, Грачей D.H.,Кривола А ,» . Оптимизация состава питательной среди для глубинного кулътиыцо-.' ния // Микробиологическая пром-сть, спец.выпуск, G.'M-sl.

3. Крявова А.Ю., Аль-Нури H.A., Егоров Н.С. Оптимизация пита-rаыж.-л среды для S. spbeioides - продуцента протеолитичвсккх ферменгоь фябришшзткчесшщ действием // Микробиология, 1976,45,4, С. 607- Г, Г/.

4. Егоров Н.С., Кривова A.D., Аль-Цурй М.А. Влияние состава пи-гатале ной среды на термо- п рН-стйб.таъаость препарата протеаз // Прикла. биохимия и ышеробпомгия, 1977, 13 , 5, С.659-662.

5. Егоров Н.С., Крпвоза Л.Ю., Адь-Нуря Ы.А. Влияние состава среды а длительности культивирования на рост spnezoides и биоеиитеj //Микробиология, 1977, 46, 6, C.I007-I0I3.

6. Кривова А.Ю., Егоров Н.С., Аль-Нури М.А. Ддияшю аэрации а ники-го • рых восстановителей на биосинтез протеаз и повобиоцина при глубин нем культивировании S- spfjeiotdes // Приклад.биохимия и микробио логия, 1977, 13, 4, С.493-501.

7. Крнвова А.Ю., Аль-Нура U.A. Блосицтоз ггоотеолитических формантой >.; лппоксигеназы культурой S. spheiatdes ff в сб. "Проблемы микробиологии и ЕЯрусологип", 1977, изд. Зиианте, Рига, С.106-Ш,

8. Кривова A.D. Биосинтез ферментов культурой S. spteutdes Ii ijec: публ.научно-теор.конф.молодых ученых микробиологов. Тез.докл.,

1976, пзд.Фан, Ташкент, С.38-39.

9. Кривова A.D., Аль-Нури U.A. Биосинтез ферментов медицинского на значения к^льт^рой^ S,. sphexoidei ff Микробиологический жури.,

[0. Кривова A.D. Образование актпношщетов рода Siiepiomycts щюк.и;' с фибринолитическим действием и липоксигеназы ff 6-ая копф,молодых ученых. Латв.респ.отд.ВЫОЛ. Тезисы докладов. Рига, 1977,0.10-11.

11. Егоров Н.С., Грачев D.n., Кравова A.D., Аль-Цури U.A., Бажова H.A. Среда для биосинтеза протеолитяческих ферментов // A.c. UCC1 & 579305, бюлл. из.1977, АГ.

12. Кривова A.D., Аль-Нури М.А. Биосинтез ферментов культурой 5. sphe xoiaes Jf П Feen.научно-теор.конф.молодых ученых микробиологов. Тез.докл. Ташкент, изд.Фан, 1978, 44, С.45.

13. Коло И., Кривова A.D., Воробьева Л.И., Бабьева И.П.,Воронкова b.c. Оптимизация среды для образования биотина дрожжами ff Приклад, биохимия, 1575, 1979, С.660-668.

14. Кривова A.D. Влияние различных восстановителей на синтез ферментов культурой S. spbeiaideslJ Конф. молодых ученых. Тез.докладоб. Изд. Зинатне, Рига, X98Q, C.I24.

15. OCiivova J-Iv-, tjozov H.S. (U-fJuxi MJ. tiftcf qf oerotion and чеа'1/cns orj the {iosj/nt/iesis of pjoieases and -novabiacin duting 6u£nit?gci Cu6ii.vaii.an af Qctinomyces sphewides ff Qisiiact Symposium „Biotechnologie" Budapest, *98atp.47.

, .Быкова A.lj. ,Кторов ii.C.,A.tb-ilypu ДА. Регулированный бяэслатез бвс пг;;чоски иicTii-BHiiX вгцасть культурой S.s/rheioides. //.Таэм.р. а практика управляемого irjjbT.iE.^инро-.гои"Hayiwn-i ав, 1981, С. 6Э-70.

Кривова A.D., Егоров Н.С., Аль-Нури U.A. Рмулируемый биосинтез биологически активных веществ культурой S. sofievo-ides // Сборник статей "Теория л практика управляемого культивирования шкроорга-низмов. Наукова думка, Киев, 1981, С.69-78.

Крявова A.C., Егоров Н.С./ Аль-Нури U.A. Некоторые аспекты регуляции биосинтеза новобиоцина и экзоцротеаз в культуре S. sphexotdes //Антибиотики, 1984, 5, С.332-344.

'М, Кривова A.D. Подавление внеклеточной ферментативной активностп некоторыми факторами среды // Микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ. Тез.дою1. Рига, 1984, С.83.

20. Кривова A.D. Зависимость синтеза внеклеточных протеаз и дшоксп-геназы от фазы роста S. sphewides .воааОгшооть ех применения // В сб. "Пути совершенствования тохнол.проц. и оборуд.для произ., хран.,тран. продуктов питания". Тез.докладов. М.,1984, C.I54..

■il, Егоров Н.С., Аль-Цури U.A., Иваница В.А.,, Кравова A.D. Способ определения фибрпнолпигческоя актшшооте // A.c. СССР & I2II292, 1986, балл.6.

22. Кшвова A.D. Рогуляцпя синтеза ферментов в культуре S. spfamJes П 7 съезд ВМО. Б сб. "Достдгения микробиологии - практика? Tos. докладов. Т.2, Наука, КССР, Алма-Ата, 1985, С.9-81.

23. Кривова A.D. Дерепрессивный биосинтез скзопротеаз культуры S.spheioi-c/es // Совец. по фошентаи микроорганизмов. Тез.докладов,Изд. МГУ, 1985, С.89. .

'¿i. Киивова A.D. Влияние аэрации ш синтез тютеолптпчоскпх ферментов и новобиоцина культурой & spfiewides П в книге "Метаболизм шкроорганинмов1', лзд.ШУ, 1986, С.I93-I99.

•:ö, Кривова A.D. Глшоаыилазная активность кульггш £ndomytcpu.s sp. и в кн. "Метаболизм микроорганизмов", изд.МГУ, 1986, C.2I9-225.

23, Кривова A.D. Сведения о некоторых методах статистической обработки экспериментальных данных //В кн. "Мотабсшзза lascpoopraiüiEzioa", изд.1.1гу, 1986, С.233-265.

''Л, t'aKcauoB В.Н., Кривова A.D. Оптимизация состава питательной среди методом матеиатпческого планирования эксперимента // В кн. "Метаболизм микроорганизмов", нзд.ШУ, 1986, €.85-134.

Кривова A.D., Егоров Н.С., Аль-Нури М.А. Использование различит методов хрокатогргфш для очистки белков культура S. spheicldes // материалы Свшозиуш по хрогатографии, Будапешт, Венгрия,I9E5, С. 9—XI.

ЛЭ, Аль-Нури U.A., Кривова A.D. Усовераенствованнне методы определения активности протеаз с фибринолЕтическиы действием н днпоксиго-назы // Материалы 5 Всесоюзн.конф. по методам получения и анализа биохим.реактивов, Dptsana, изд.Зинатне, 1987, С.6-8.

'.¿L Кривова A.D., Аль-Нури М.А., Решетова И.С., Полозкова Е.А. Трано-

С 76С7ЭгЫ<*

it. Нготоп Н.С., Аль-Цури U.A., Прохорова А.Л., Кривова А.О.,Взйно ДИ. ■ ):лозшшсти биосинтеза экзопротеаз культурой S. spfitioldcs М8-2 7 Лет, во ВНИИСЭНТИ, М.. 1989, П 2, С.83.

''■Atjüi/i-ich KiLvova J.jfu. Reactionary c-hiomaiogtaphu

: 7 for -tipxygenoses- cxcretLon iesecr%ch //ßUtza<± "•■•./>7 ¿vmoosivm 07i Chiomatogiaphy. ¿cLpztfl ■ Ctugvst

/•.'S

Sviiartov'ttthfv.A., Kxitnyg Ktuvova 1 V.t Savatzhnina 'I.V. ßeacti'anc/xy

, chxomatagKapfiy app&cattair /01 fatty acids arte/ production 0/ tyia-Stn-ctKi Compauds in Siieptamgces г tseatch. f/QBstiact rih. Symposium Cfixamatogxapty. Budapest i93a.fi. s

, Uses Л.Т., Bpseq Q.B., Привоза A.D., Басевич ß.B. Биоспецифичвс-тай синтез простаглацдинов о участием ишобиливованных ферментов // В cd. "Получение в применение иммобилизованных ферментов в науч.иссл. z медицине", тоз.докд., 1980, С.87.

, Иевх А.Т., Варфоломеев CJw Кнполаев A.B., Игумнова Н.Д., Маме-дов Л.А., Кривова A.B., Захаров В.В., Чурхканов В.В. 0 влиянии простаглащцш Н-сянтетазн на заживление линейных ран // В ^."Инженерная шзяислогая", тез.докл., Вильнюс, 1989, С.83-84.

. Егоров Н.С., Адь-Цури МЛ., Кривова A.D., Прянишникова H.H., Васильева Е.А. üiraiac аятинамяцота.используемый для получения липо-Есигеназы // A.c. СССР & I4725QI, 1989, бил.14.

. Кривова A.C., Полозкова Е.А., Егоров H .С. К вопросу о трансформации ненасыщенных жирных кислот бактериями // Сб.науч.трудов "Биология ми^оо^г^ п их использование в народ.хоз.", Иркутск,ИГУ,

. Кривова A.D., Прянишникова H.H., Бфреишко A.A., Егоров Н.С. Некоторые свойства липоксигеназы актиноцицета // Сб.науч.трудов. "Биология Magoojr^ н их использование в народ.хоз.", Иркутск, ИГУ,

. Кривова A.D., Полозкова ЕЛ., Казанская I.B., Цакскиова Т.Н. Применение лшоксягэнозы при получении просгагдандинов с использованием их в животноводстве // Всесоюз.копф. "Мизфоорг.стимуляторов в ингиб.роста растай, а жив., Теэ.докл. Тапкент, 1989, С.97.

. Кривова A.D., Климова И.В., Савочкина И.Н., Катуков Д.С., Цвотпо-ва H.H., Фросшш И.И. Выбор, условий хранения культуральной жидкости стрептомицета / // Деп. ВНИИСЗНТИ ВНШБиахиммашпроект. М. ,1989, 3 3, С.24. j

. Кривова A.D. , Ириков В.В., Климова И .В., Зайцева C.B. Установление оптимального температурного профиля стадии ферментации // Деп. ВНИИСЗДТИ ШИИ^охшшщроекгГим>1990, » I/C.3.

. Кривова A.D., Климова И.В., Савочкина И.Н., Тихомирова Л.А. Определение жириокислотного состава у различных штаммов // Деп. ВНИИСШТИ ВНИЙБиохтешЕпроект, Ы., 1990, M 2, С.73.

I. Кривова A.D., Бубноз Н.В., Юшкова И.В., Зайцева C.B. Свойства препарата липазы ГЗх в зависимости от стабили зирущих добавок и режимов распылительной суши /У Передовой произ.опыт в мед.пром. реком. для внедр. 1990, 5, С.23-26.

.. Кривова A.D.» Егороа Н.С., Прянишникова H.H. Определение жириокислотного состава мембран у продуцентов ферментов, трансформирующих jngn^M // Конф. "Применение хроматограф, в пищ. и микробиол.мед. пром.", Теэ.докл. В., 1990, С.13.

I. Кривова A.D., Климоза И.В., Кутуков ".С., Кудряшов В.Л., Некрасова Е.А. Выделение шшюкислот из отходов тахмадо-паточного производства //Всесоюз.науч.-техн.конф. "Совершен.технол.проц. новых нвдав пи^.пр^д.^и добавок испод.вт.сырья пищ.ресурсов", 1ез.докл.

». Кривова A.D., Климова И.В., Дмитриева Ю.Б., Кудряшов В Л., Некрасова Е.А. Культивирование ßtevLSacietium spec. с целы) полую-

ння лизина на отходах крахмального производства // Всесоюз.науч. техн.конф. Соверш.технол.проц. новых видов пищ.прод. и добавок в пол.вт. сырья швц.реоурсов, тез.докл. Киев, 1991, С.48.

Кононова И.С., Султанович D.A., Кршова Е.В., Кривова А.Ю. Новые методы получения фармацевтических препаратов на основе липидов мицелиалышх грибов // Науч.-практ.конф. "Ученые в решении соц.-акон.пробл. страны", тез.докл. Ташкент, 1991, С.75.

!:>, Антинова Л.В., Сиделышкова В.Ы., Астонин H.A., Кривова A.D. Еио технологический способ обработки юшеч. сырья для получения колба них оболочек // Новые технологии, 1992, 2, 4, С.456-459.

Кривова A.D., Волошина Т.е., Мещеряков C.B., Тырсин Ю.А. Переэте рификация жиров с применением иммобилизованной липазы на минерал ном носителе // Изв.вузов, Пищевая технология, 1993, й 1-2,

С.84—86.

:,>.;. Антипова Л.В., Кривова А.Ю., Писклова Л.С. Способ обработки кипе кого сырья дая произв. колбасной оболочки // Патент СССР#183314 A3, 1993, бга.й 29.

. I. Кривова А.Ю., Волошина Т.Ю. Оптимизация условий культивирования липаз Шгс/fivs огуюе // Материалы ыеадунар.конф. НТПв АПК, краткие сообщения. М,( 1995, С.148.

:><:. Кривова A.C., Волошина Т.Ю., Мещеряков C.B., Тырсин JQ.A. Некоторые аспекты иммобилизации липолнтических ферментов // Материалы международной конференции НТП в АЖ, краткие сообщения. М.,1995,

К Кривова A.D., Волошина Т Т). Влияние ионов металлов на активное?: натшшой и иммобилизованной липазы // Материалы ыевдунар.конф. I в АПК, краткие сообщения. M., 1995, С.150.

ôt. Кривова А.Ю., Волошина Т.Ю., Тырсин Ю.А., Боттингер Г. Субьепшп нал структура и свойства липазы микробного происхождения // Мал риалы междунар.конф. НТП в АПК, краткие сообщения. М.,1995, C.I!

Волошина Г.С. , Кривова A.D. Новые аспекты применения препарата "Липоризин ГЗХ." U Материалы мевдунар.копф. НШ в АЖ, краткие < общения. M., 1995, С.I5B.

>■</. Тырсин Ю.А., Мещеряков C.B., Кривова A.D., Азнаурьян М.П. Разра ботка малоотходной технологии производства хирнкг кислот на оси во новых ионообменных минеральных катализаторов // Изв.вузов, П щавая технология, Ä 1-2, 1994, С.37-41.

:> ;. Кривова А.Ю., Тырсин D.A. Способ получения дипазн // Полож.реше на авторскую заявку Роспатента от 24.08.93, # 93042492.

s-i. Кривова A.D., Волошина Т.Ю., Ыещериков C.B., Тырсин Ю.А. Иммоби зация липазы физическими методами и ее свойства // Прикладная б хим. и микроб, 1995 (в печати;.

Кривова A.D., Волошина Т.Ю., Боттингер Г., Нахадетян Л.А., Голо на U.C., Тырсин Ю.А. Иммобилизация липазы химическими методами ее свойства //Прикладная биохим. и микроб. 1995 (в печати).

.лКривова А.Ю., Тырсин Ю.А.. Горячева Е.Д. Химия жиров // Метод, указ. лаб.работ. МГАПП, 1993, 47 с.

'IhDceh ii.к., Иванова Л.А., Кривова А.Ю. Специальная биохимия // " :т !Д.уь:аз. лабор.рабст, МГАШ1, 1993, 67 с.

Благодарности

Автор выражает благодарность научному консультанту - д.б.н.,профессору Н.С.Егорову за внимание в работе, д.т.н.» профессору Ю.А.Тир-овну за постоянную поддержку проводимые исследований.

Автор искренне благодарен д.т.н., профессору Л.В.Антиповой.к.б.н. МДЛль-Нури, ведущему научному сотруднику, к.х.п. Г.А.Фарупгуляну, д,х.н.С.В.Мещерякову, д.х.н. Ю.А.Султановичу за помощь н ценные советы в работе. ' I '

Искрения» благодарность автор выражает коллегам, принимавшим участие в выполнена? различных этапов этой работы; д.б.н. Мевх А.Т., д.ц.н. Л.В.Казанской, и.т.н, Т.М.Рышковой, к.т.н. Л.М.Дуповой, к.б.н. Н.И.Прлшашшковой, к.б.п. ЕД.Полозковой, к.т.п. В.Б.Прувшюкой.к.т.и. Т.Ю.Водозиной, И.В.Квдмовой, начальнику технического отдела Бердского химического завода, к.б.н. Р.П.Когзрскдх, хяавному инженеру Приволжского бзохпзчеисого савода, к.т.н. В.Ц.Сергееву, начальнику отдела ферментации института, фитопатологии г.Голицдпо,кл.н. Г.Д.Хатунпеву.

\

! \

■ I,