автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ВЫДЕЛЕНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗ АКТИНОМИЦЕТОВ

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РСФСР

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО. КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

На правах рукописи

Для служебного пользования

Экз. №_

МИХАЙЛОВ Алексей Маркович УДК 577.150.72

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ВЫДЕЛЕНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗ АКТИНОМИЦЕТОВ

Специальность 05.18.10 — Технология витаминных, ферментных н белковых препаратов, чая и табака

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

МОСКВА — 1985

)р / V)

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском биотехническом институте, на кафедре «Технология микробиологических производств» Московского ордена Трудового Красного Знамени технологического института пищевой промышленности.

Научный руководитель — доктор биологических наук,

профессор И. М. ГРАЧЕВА,

Официальные оппоненты — ДОКТОр технических наук»

профессор мГп. ПОЛОЗ

кандидат технических" 'на~ук, с. н. с. И. Ф. МИШУНИН.

Ведущая организация — Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехноло-

Защита диссертации состоится « . 1985 г,

в . . . . час, на заседании специализированного Совета Д 063.51.03 при Московском ордена Трудового Красного Знамени технологическом институте пищевой промышленности.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МТИПП,

Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 125080, г, Москва, А-80, Волоколамское шоссе, 11, Совет №Д 063.51.03,

Автореферат разослан - íXmJ . . . 1985 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат технических наук,

Доцент а^сьл

ОБЩАЯ 2АРАКШШГЯШ ЕА£<ЛЫ

Актуальность работы. В решениях ХЕУ1 съезда партии, майского (1982 Г.) Пленума ЦК КПСС большое внимание уделяется одной из главных задач П г Ш пятилеток - Продовольственной программе СССР, направленной на бесперебойное снабжение'населения продуктами питания. В программе, в частности, говорится: ..получит развитие производство сахаристых веществ из крахиалосодержащего сырья, ••.расширится производство полноценных заменителей сахара".

Как заменитель сахарозы представляет большой практический интерес глюкозо-фруктозный сироп и крнстАллическая фруктоза. Перспективный путем их производства является получение глюкозы ферментативаым,гидролизом крахмала, а также из непищевого цеялю-лозосодержадего сырья, такого как несортового хлопка, отходов древесины, гуза-пая и'др. и дальнейшей изомеризацией ее во фруктозу с использованием глюкозоизошразы. Решение задачи производства в нашей стране глюкозо^Цзуктозного сиропа в кристаллической фруктозы является актуальной проблемой и имеет- большое народнохозяйственное значение.

Если технология гидролитического расщепления крахмала и целлшозосодеряадего сырья изучена "сравнительно хорошо,., то в производстве глюкозоизомераз заметно значительное отставание, что особенно касается получения стабильных иммобилизованных препаратов глюкозоизомераз. Поэтому глубокое изучение свойств глюко зоизомераз на примере высокоочищекннх препаратов является актуальным и важным исследованием в теоретическом и практическом плане.

Цель, и .задачи, исследования. '

Для, исследования были взяты два актиномицетяых шташа продуцентов ГЛЮКОЗОИЗОЫераЗЫ - 5 и. оггу;

ЦНВ МСХА

фонд научной литературы Г19

научной литера!

сеиз 13-4, полученные из коллекции микроорганизмов Института микро биологии АН СССР и активно изучаемые на предмет свэрхсинте-за глюкозойзомеразн на кафедре "Технология микробиологических производств" ЫШШ. Первый штаим является продуцентом исключительно внутриклеточной глюкозоизомеразн, второй штамм - str.ol.i-уасеиз 1Э-4 - обладает способностью к накоплению внутриклеточной и * внеклеточной глюкозоизоиераз. Знание фиэико-химических и каталитических свойств глпкозоизоиераз из этих источников позволило бы выявить оптимальные условия для проведения иммобилизации, повысить активность и стабильность их препаратов при использовании в промышленных условиях. Исходя из изложенного, цель» работы п явилось исследование характерных свойств глюкозо-изомераз зьг.«1Ьодг1зво1из гв-э г зе.г,о11у«сеиз аз-4. Так как многие свойства и структуру белка ферментов, а также их кинети-чесдие характеристики можно исследовать, располагая ферментными препаратами только в высокоочщенном состоянии, то для достижения поставленной шли необходимо било решить следующие задачи;

- разработать схеш очистки препаратов глюкозоизоыераз з«.ахьо<дг15во1ия 23-3 и 13-4' до гомогенного состояния«

- исследовать каталитические свойства ферментов - субстрат* ну» специфичность, оптимальные условия действия, стабильность, выявить активаторы и ингибиторы;

- исследовать физико-химические свойства ферментов - наличие субъединичной структуры, аминокислотный состав, определить молекулярную массу, нзоэлектрическу» точку, содержание связанных металлов.

Научная новизна работы.

Впервые подучены-в гомогенном состоянии глюкозоизомеразн

Str.albogrlseolus2e-3 H Str.olivaceus 13-4.

Ba основании изучения физико-химических свойств эндо- и экзоглвкозоизомераз str.oiivaceus хз-4 показана иг идентичность.

Показано, что глюкозоизоиеразы обоих продуцентов являются истинными D-ксшгоза кетол-изомеразами (КФ 5.3.1.5) и близки между собой по свойствам.

Заявлена тетрамерность четвертичной структуры обеих глюко-зоизомераз, что необходимо учитывать при проведении работ по получению иммобилизованных препаратов этих ферментов.

Практическая ценность работа.

Разработаны технологические схемы получения глюкозоизоме-раэ Etr.albogrlsoolus 20-3 И Str.ollvaceus 13-4 В гомогенной состоянии, которые получили положительную оценку ори испытании: в заводских* условиях.

Показано, что добавление ионов Со2+ на стадии выделения глпкозокзоыераэ из биомассы увеличивает стабильность фермента и повышает выход его в активном состоянии на I6-I9Î.

Найдены активаторы в ингибиторы гликозоизомераз.

реализация результате? исследований.

Полученные в диссертапиокной работе результаты были использованы при создании лабораторного технологического регламента на производство внсокоочищенного препарата глюкозоизомеразы

Str.albogriaeolus 28-3.

На основания разработанного способа и технологической схе-ыы в мае-иене 1984 г, на Московском опытном заводе ферментных препаратов бьша проявлена наработка опытной партии внеокоочишен-ного препарата глхзюзоизомеразы str.«ibo9rieeoius 28-э в количестве 1,6 г о активностью 23700 ГлИЕ/г.

работы. Основные результаты исследований доложены на заоедачхях секции Ученого совета "ВНИИОиотехника"' в I9S3-

1984 г., на конференции молодит ученых ЫШШ в 1983 г., на встрече ыолодыг специалистов предприятий а организаций Главин-кробиопрома в 1984 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи,

Структура и объем работы. Диссертация состоят аэ введения, обзора литературы, экспериментальной чаоти, заключения) выводов, списка использованной литературы иприлояений.

Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 таблицами и 23 рисунками.

СОДЕДАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре представлен анализ даяпнх литературы но -глюкозо-' изомеразе. Затронуты вопросы о распространении среди микроорганизмов способности к образованию гдасоэояэомераз, механизме иэо-маризадии:глюкозы во фруктозу, выделении а очистке мшкозоизоые-раз, их аминокислотной составе а наличии четвертичной структуры, субстратной спешфпнооти глгжоэоизокераз, активаторах и ингибитора! , влиянии рН и температуры на активность л стабильность глвкозоизомераз.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и иет^Д^ яг^ацрвй^ид

Объектами исследования являлись глпкоэоизомеразы 5Ъг.а1Ьо-дг1зео1из 28-3 И Str.oli.vac« из 13-4 (ВКЫ А-588 и ЕКЫ А-685), полученные из коллекции Института микробиологии АН СССР. Биомасса культур была получена в результате-глубинного культивирования в колбах на качалке. При получении глшозоиэоыераэы из зсг.оИт»-

ceua 13-4 фергент выделяла как вз биомассы, так. и из фильтрата культурлльной ашцоостя.

Активность глюкозоизомораз определяет, используя тдобарбз-туровый к шстенн-карбаэолькый методы определения кето-сахаров (Percheron,I962; Dl3Che, Qorenfreund, 1952), Sa единицу ar.TEBHO-сти при ни то дд количество ферьинта, каталюирутеее из оноразаппп I iaii о-глшюзн в течение I мин, при стандартных условиях.

Содержание Делад определяла по методу ^Доури (Lowry et »i, 1951) К СП0ктрофотометрически (Harburg, Christian, 1941).

Двск-электройорез проведали по методу Дэниса (Davis, 1964) на приборе 'Для аналитического электрофореза "Reanai.".

Электрофорез е /исвользоЕлнием додетшгетльЗата наград проводили по методу Шапиро (shapir© et ai, 1967).

Микроэлементы определяли методом атошо-абсорбпионвой спек-троиатряя на атомво-айсорйдзонном спектрометре -Perxin-Eimer", модель 603. .

Авалапгеескае ультрадевтра$угированде проводили на улътра-пентрифуге "spinco" модель £ («ввскяагг), расчет коэффициентов седвыэнтасди проводили по методу скорости седкменташи (Боуэн, 1973). ' .

Изоэлектрическое Фокусирование проводили па аналитической колонке ыоделя 8ioo сисв») объемом ПО мл (Hagiund, 1971),

Дпя^ пчянркяслат^оуо доставд проводаля на аминокислотном анализаторе кхл-з {"Hitachi") по методу Спакмаиа (spackman et *1, 1958).

компоненту проводили фенол-серно-кислотньы методом (Dubois *t «it. 1956).

Как правило, анализы проводил ве менее чемв трех совтор-ностях, пр2 о том в каждой вз парсллалыак ошков заховсивраостк

воспроизводились. Анализ достоверности результатов осуществляло с применением критерия максимального отклонения (Грачев, 1979). Сцснкл дисперсия объединяли, проанализировав сначала их однородность с помозью критерия <Szzepa. Для расчета доверительных интервалов средних результатов опытов использовали критерий Сты>-дента. При статистичоскои анализе полученных результатов доверительная вероятность была принята равной 0,95.

Р2ЭУ2ЫА1Н ИССЛЕДОВАНИЙ X^ Введение и очистка глюко зодзометл з

Hps проведении работ со выделена» а очистке гликоэоизоыв-раз stc.aibo^riseoius 28-з использовали биомассу в фазе мался-иального накопления фермента в клетке (20-22 часа роста). Время выравнивания культуры str.oiivaceue 13-4 составляло 60-72 часа, что соответствовало максимальному накоплении экэо-глгжозовзоме-раза. Активность эндо-глюкозоиэомераэы к этому времени составляла 30-35$ от общей.

Выделение внутриклеточных глюкозоиаомераз иэ биомасоыкулъ-тур обоих продуцентов проводили по единой методике, подвергая биомассу ферментативному гидролизу при 40°С в течение 3-х часов в присутствии лиэоедма (0,5 мг/шс). Для стабялиэаши глюкозоизо-уераз в бу^ор добавляли ионы с©2+ в концентрации 10"^ М, в результате чого выход активности фермента повивался на I6-IS& *

Остатки клеточных стенок отделяла z отбрасывали.

СермонтатЛЕЗшЗ гидролизах биомассы,подвергался теркооЗра-ботке, которую проводили в течение 30 ш. при 70°С, что вызывало коагулята» части балластного белка, который удаляли центрифугированием.

Следупдим этапом ОЧИСТИЛ ГЛВКОЗОЖЭСМераЗЫ Scr.olivaceus 13-4 явилась обработка раствора препарата сольи mhci2, добавляемой до концентрации 0.05 U. После вццердваняя в течение 30 мин. wmnBrrtrft осадок нуклеиновых кислот II нуклеопротеядов отделяла аентр2$угированием. На атом отаге очистка ннакпшгщга гягкозо-ЕЭСКврЗЗЫ scr.olivaceus 13-4 практически не было, в то же вреня уцалыля активность феркента увеличилась сочти в 3 раза.

Сракшонзроваяае ацетоном явгдось сл едущим этапом очистки глакозоизомераз, Еа первой стадия фракционирования ацетон добавляли к раствору ферментного препарата до концентрации 30% upa очистке глшюзокэомеразы str.aibogriseolus 2в-э и 20% глшсозо-изомэразн str.oüvaceus t3-i. Ha второй стадии концентрацию ацетона увеличивали соответственно до 60 в 40Í, оря этой в осадок перегодила практически вся глюхозоизокераза. Осадок отделяла центрифугированием и суспевстревали в минимальном количестве 0,1 И »«-фосфатного буфера рЗ 7,4. Нерастворнвгиеся денатурированные белет удаляли.

На следугцем этапе очистки глякозоизомераз использовала ионообменную хроматографа», Раствор ферментного препарата наносили на колонку (2,5 х 18 см) с ДЭ£Э-сефадексоы А-50; уравновешенную ОД II tu-фосфатнын буфером рН 7,4. После нанесения белка колонку промывали в течение еоче тем хе буфером в элгировалд градиентом концентрации nocí от 0 до 0,4 Ы. В обоих случаях глв-козоизомераза злсзровалась одним пиком. Пробили элешги глккозо-изсмераз представлены на pzc. I. Фракции с глхкозоазокеразяоЗ активность» объединяли, концентрировали на роторном испарителе при 30°С д- диалэгеовалд для удаления солебв течение нота.

Еа последнем этапе очистки глжоэовзсмераз использовали гель-хрсматографазз на колонке (1,5 х S0 см) с се^адекеом с-зоо.

И A '432HU

■ 0,4 0,4

■ 0,3 0,3

■0,2 0,2

0,1 0,1

У к 432hm

-•0,4 •0,4

• 0,3 -0,3

■ 0,2 •0,2

✓ ■0,1 -0,1

42 48

Äft ФРАКЦИЯ

Рно. I* ИовооЛгенвая хроматографы глшозоЕзокеразы Str.&lbo-griseolus 26-3 la) » внутриклеточной Ctít х внеклеточной <в> rjn>-козоизомераз Str.oliváceas 1J-4- на ДЗАЭ-сефадексе А-50, ашхшя 0,1 UВа-(^ос$аташ буфером pH 7,4, градиент концентрации нав! о 0 до 0,4 Ц. I - белок í^ge^íí 2 ~ активность <А43гам>; .3 -концентрация Keel, Ц.

k23Qtm

Pic. 2; Гель-хрока го графи гдакозоизомерази str.albogrieeoloe 2в-3 (а)* внутриклеточной «fr ж ввеывтатаой (в) глжозоиэомораэ str.oiiv&oráe 15-» на сефадексе о-гоо, вшш 0,004 И Яа-фосфа*-вш ффером ifl 7,4. I - белок lAgßCtoi1' 2 " ä*™®800*1 &43гвн}*

уравновешенную 0,004 и »«-фосфатным буфером рН 7,4. Зишврованке проводила тем хе буфером. Профили а лести гликозоиэомераз ери голь-хроматографии приведены на рис. 2. На последнем этапе очистка удалось повысить удельную активность глтхозоззокораэ а1Ьодг1Есо1из зз-з и г^г.о117«сеиз 13-4 соответственно на 7 и 11?, что говорит об относительно высокой чистоте препаратов уже после ионообменной хрса*атогрйфли. Фраюст, облагался® охтгэяос-тья, обьодпняла и диофлльно засудгад.

Счистку внеклеточной гяиюаоагзмвраэи 13-*

проьогклд следгацнк образом. Сдльтра? культуральноЗ «ндкости концентрирован:а 5 раз со обьему роторном испарителе при 30°С, охлатаали и добавляли адеток до концентрации На второй стадии фракционирования коипентрапз» ацетона угэдзчаьали до 50%. Осадок, содержалаЗ глвкозокзомсразу, отделяя пвнтрлфуги-рованкем, суссекдхроЕ£лх в ианкиал^аом количестве ОД и мв-фос-фатного буфера и после отделения норастьораьшижя белков наносили на колонку с ДЭАЭ-сефадоксом А-Ю» Ионообмеквул грсматогра-фая а голь-хроматографи» зкзо-глгжозолзомэрааы 13-4 проводили, как описано выше.

Степень очистки глюкезоязомераз проверяли методами диск-электрофореза в ПААГ а аналитического ультрадантоифугировавия. На рис. 3 представлена результаты элактрофоретичесхого исследо-раиия фермзнтов, которые о&шрудаздлгеь в виде одзой белковой эолы каканЯ. }1а рис. 4 представлеи: результаты аналитического ультрапентргфугироьания в^сокоочпзеитк гдгкоэоазеуараз. Сшмка сделаны через 40 мин. после достаженал годной скорости эраденнв (5С0С0 об/мин). О гошгенноств ферментов свидетельствует наличие на седиментогрмакх одного сю^этречного едка,

В результате провздешшг работ со очистке ферментов бата

Q

4 f i

. . I

J

' i.

Rio. 3.

L1/.../4

?ИО. 4. ' .

Рис. 3. Результата исследования высокоочишеннкг глгасозоязсмераэ методой двск-электро$ореза в ПЛАТ, а) - внутриклеточная гдтозоизо-кораза Gtr.ollTRcexis б)- внеклеточная глшозоизомераэа Str.

ollvaceue в)- глпкозоизомераза Str.alboerieoolii«28-3.

Рис. 4. Результаты исследования васокоочищеиныг гдгоозоязомераэ методом аналитического ультралев трассирования. а)- глюкозоиэоме-раза str.albogrlßeoloo 2ß-jj б)- внутриклеточная гликозоизомвраза Str.ollvaeeua в)- внеклеточная глтозоизомероза str.oXl-

■raceus 1J-4. Скорость вращения ротора 56000 об/мин,, температура 20°, концентрация бежа 5 мг/ыл, снимке сделаны через 40 мня. пос-хе достижения полной скорости вращения.

Таблица I

Характеристика этапов процесса очистки глюкоэоизомвраэы 5£г> а1Ьодг1«о1из 23-3

Этап очистки

X

Ферментолизат йиомасоц

8140 8720

5600 8460

1060 €280

230 4910

Гель-хроматография 135 3080

Термообработка

Фракционирование ацетоном

Ионообменная хроматография

1,0? 1,51

5,84

21,4 22.8

100 69

13

2,8 1.7

100 97

72

56 35

I

1.4

8.5

20,0 21,2

Таблица 2

Характеристика этапов процесса очистки внутриклеточной

глвкозоизоиеразы 13-4 ---г

-1---(-,-

Общее тпйшая ¡Удельная

актив-

Этап очистки {чество;™*^ вость, :белка. > ГлИЕ/мг

Т

Т

В(-0- 1 Выгод I

1актвв-1Степевь Ое5камноста,т очистки

1 % 1

Серыентолпэат биомасса 12400 10700 0,87 100. 100 I

Термообработка 10300 10400 1,01. 83 97 1.2

Обработка ионаид ма2+ 3230 9780 3,04 23 91 3,5

Сракшгонированве ацетоном. 537 6180 11,5 4,8 58- 13,4

Ионообменная хроматография 133 4270 32.2 1.Х 40 37,5

Гель-хроыатогрзфая 103 3680 35,7 0,8 34 41.5

Таблица 3

Характеристика этапов процесса очистки внеклеточной гдюкозоизошраэн ¡^г.оИтгасеи» 13-4

Этап очистка

8150 7330 0,69 100 100 I

1090 4800 3,74 13,4 65 4,2

93 2660 28,6 1Д 36 .32,0

70 2160 30,7 0,85 29 34,4

(^ЙК-РЯЙ?»^ Iактив-!Степень

зй» !Ц: г2№ «тЧ^Р™

_\ иг | 1ЖЬ | бедка | 1 " {_

Концентрированный

фильтрат культу- *

ральной жидкости

Фракционирование ацетоном

Ионообменная хроматография

Гель-хроматография

получены гомогенные по ряду критериев глпкозоизоыераза str.ai.bo-дг1вво1ив гэ-з, имеадаяудельнув активность 23.Г-йШ/мг белка, внутри- в внеклеточная гдюкозоизомеразы з^оНуами* 13-4 с удельной активностью 36 и 31 ГдИЕ/мг белка соответственно. Ва-ход активности составил 29-3556 от первоначальной, что является относительно высокое величиной длй" достаточно сложной схемы

ОЧИСТКИ,-

2: Исследование йизико-химяческих свойств

Сизшсо-хтшческие свойства являются* важной характеристикой индивидуальных ферментов, изучение которых способно оказать большую помощь в работе со их практическому применению, В данной работе для изучения свойств ферментов были использованы препараты глокозоизомераз в гомогенном состоянии.

Цолекулярну» массу глпкозокзомераз определяли, используя

метод гедь-хроматогра$ин. Результаты представлена на рас. 5. Для гджоэонзоыеразн зьг.&1Ьогг1зее1ив гв-з значение ыолекулкр-ной шссы состаанло 178 600, для внутри- а внеклеточной глеко-ЭОХЭС&Ораз .оНуасеиз 13-4 - 165 ССО.

Коэф^киент седкиенташк, значение которого заваедг как от кассы, тах и от форш молекул, дяя глккоэокэокоразы str.elbogr.i-аео1из 38-2 гиеет жвдвчпну 7,5 е. Для внутри- и ВН6КЛ0Т0ЧН0Й • глш>зэиэоь:араз зъг.оНуасеив 13-4 значение коэффициента сэдв-адзн татки оказалось одзнакоЕии и составило 7,0 е.

Используя мзтод пэ о электрического фокусирования, оилз определены зяаченля яэоэлектрачссхях течек ферментов, соотвегству»-еае для глЕкоэоизсаеразы аъг.а11:одги»о1и* зв-з ;начейи> рН 4,8, для внутри» и Енеклеточяой глюдозоиэеыераз зьг.оНуасвчэ 13-4 -4,95.

Величина.углеводного компонента 7 глюкоаонзошразн зьг.«а-• Ьэзг1з*от* гв-з составила I от ее молекулярной шеса, у глхн козовзоиэраз зъг.о11у*с*иа 13-4 - 0,'8£ у внутриклеточного фермента и 1,2* у внеклеточного* Роль углеводного компонента а молекуле глякозэизоыеразы неизвестна, ко внекаэнвшюоь предположений, что он участвует в ^тшеаши фермента на клеточной стенке.

Сравнение фнзпко-хтшческях свойств внутри- и внеклеточной глЕкозоиэскерзз эьг.оНувсеиЕ 13-4 показало, что они обладает одинаковый! величинам! молекулярной аассы, коэффасвента сади-

монтакяи, значениям! рй, соотватствухщЕх язоэлектряческсму со»

стоя!га» и относительной электро<*оретической подвижностью, на основании чего моашо с уверенностью говорить об их тождественности. Следовательно, в процессе лизиса клеток фермент не сре-терпаиает кшетной моззЗЕакасяи, за исключением невольного различая в Еоличанах углеводного ксьгопэнта.

Выделение глхжозоа&омеразы из клеток продуцентов продстав-ляатодну гз главных простои в получении ее юоюбилазовашшх препаратов, з то обстоятельство, что собственные лзгическпе ферменты клеток не вызывает значительной иодд^дкапеа глюкозо-язоыераза зиг.оПу&сеи» 11-4, дьлает перспективным шпек условий , ускорлпцих процесс автолиза биомасс и.

Результаты доследования, характеризуйте ашзюкислотные составы поучаемых гдекоэо изомера э, представлены в таблано 4. Суммарное количество остатков хпссых амипоослот - аспарапшо-ьой а гдутаигновоЗ значительно вое количества основных - лизина а аргшша. Это хорошо согласуется со значсшшгирН, соот-ветствушии вэоэлектрическш точка« обеих гдпкозояэодораз. смеаенакм в кзоаув зону. Преобладайте остатков азеднх ашшокао-лот над основными вообще характерно для глюкозонэомераз разлач-ных продуцентов.

Относительно больше значения молекулярной хаосы глюкоэо-шецэраз 5«.в1Ьо-гг1яво1ио 29-э и зьг.о11*»с<аиа 13-4 позволяет предположить, что зти белка являются олзгомерныш. Для иселадо- * ванаявалнчия у ферментов четвертичной структура нзя&ж ьдпя-нге на них реагентов» разрупащнх связи, ее обусдовдаяаива». Метод, основашшЗ иа сравнения молекулярной массы ватгвного феркзпта в его молекулярной массн после обработки доавсаасуль-фато« натрия (ДС~ка) является хотя и косвенны») но впэлпе надежным при исследовании наличия четвертичной структура На ргс. 6 продставяени результаты определения велтчшы молекулярной массы глскозоазоыераз гьг.л1Ьочг1яес>1иа г&>) я асг.оЦуасе-иа 13-4 с пспользсЕлнвец электрофореза в ШАГ в присутствии ДС-ыа. Рагсчгтааные со калибровочному графзку гзлпчаны молекулярной массы ферментов оказались равны соответственно 46 ООО я

те4

■ ■ ■ ' б

. Мол. масса

Рис. S. Определенна ыолекуля1ВоВ кассы глжозоиэсмераз методой •гвль-жроматографяя на 0иогвле Р-300. 1 - лизошш; 2 - овалыЗумш? 3 - с ив. альбумин; 4 - гексоклназа; 5 - глтасозоокстоаза; 6,7 -внутри- я внеклеточная глгаозоизоыеразы str.oliTaceua 13-4 t 8 -глшозовзоиераза Str.&lbogrieeolua 26-35 9 - ¿-фруктофураноэидаза

0£, 0,4. 0,6 -03 1,0 «ЯГ^

Рис. 6. Определение молекулярной массы глгаоэовзомераэ методом электрофореза в ПЛАТ о 0,1Х ДС-Па. I - димер сыв. альбумина; 2 -¿¡•мер овадъ<5ушша; 3 - сыв.*. альбумин; 4 - глшозонзомераэа Str. albogrlseolua 2ß-3i 5 -овальбуиин; б - глкжозоизоыераза Str. olimceua 7— трипсин; 8 - дизайны.

Таблица 4

Аминокислотный состав глккозоизомераз зьг.«1Ьо?г1»«оХиг ге-з

Аквнокислотяый состав, число остатков на молекул;

днищ имиша ! ! 5«г.»1Ьодг1ь«о1и: 28-3 1

Лизин - 82 87

Гистиднн 45 27

Аргинин - 126 . 88

Ассарагиновая кислота 196 133

Треонин 89 54

Серив 46 49

Глутамановая кислота 128 177

ПрОЛЕШ 34 37

Глицин 139 140

Алании 204 239

Шгстоин - -

Валян 85 65

Метиошщ 26 61

Изолейдив 50 39

Лейцин 169 145

Тирозин 36 27

файкд^ Н 55 56

Триптофан * ' 40 . 19

Общее количество 1556 1435

* Спектрофотсметрическое определенжз

41 ООО. Сопоставление этих величин с молекулярными пассами ш-ггвннх. фершктов указывает на надичие у обеих глвкозоиасие раз четвертичной структуры, состоящей кз четырех субгединид. Так как действие дС-на, как детергента, направлено на разрыв гздро-фобнкг связей, можно сделать гывод, что важней^ роль в под-

- 18. дерзивании субъединичной структуры играет именно гидрофобные взаимодействия. С этим выводом хорошо согласуются результата исследовании аминокислотного состава глвкозовзомэраз, выявивсше преобладание остатков гидрофобных аминокислот (алаяина с ле£ди~ па) над гидрофильными, Добавление при обработке глтхозоизомераз раствором ДС-ма 2-меркалтоэтавода, являющегося сальным восстановителем, не приводило к изменению величины молездглярной массы субъединиц, что указывает на отсутствие десульфшшх шстнков ■ между субьедкшгцацг д также согласуется с результатами аминокислотного анализа, псхазавзего отсутствие цистеива.

С помогаю метода атомно-абсорбционной спектрометрии установлено, что обе глЕкозоизомзразы-имеют-связанные металлы. Один ШЛЬ белка ГЛВКОЗОИЗОМераЗЫ Str.Albosriseolua 26-3 содержит 3,8 грамм-атома кобальта и 0,2 гршш~атома магния, глгкозоизомараза . str.olivaceus 13-4 - 1,5 -я'-0,3 соответственно. Все другие металлы, наличие которых проверяют, - марганец, железо, хром, пи-i кель, тсшк в их белках: отсутствовали. \

3. Иссле^ми»^ каталитических свойств '

-• Исследованию каталитических свойств фермента приваддегит главная роль в его всестороннем изучении. Определение условий, при которых фериент стабильно и в течение длительного времени ^ катализирует превращение субстрата с ваксикальной скорость» -. вопрос больгой практической важности м условиях проплетенной изомеризации глюкозы приобретает первостепенное значение.

К числу главных факторов, определяющих скорость ферментативных реакций, относятся: концентрация фермента, концентрация субстрата, рВ, тешература реакционной смеси, присутствие активаторов и ингибиторов. Влияние этих факторов на скорость изоме-

рвзадаи глюкозы к изучалось в настоящей работе.

Исследование Т"гяф"*я копдентрашш фермента па скорость ферментативной реакции показало, что махду этими величинами наблюдается строго пропорциональная зависимость вплоть до концентрации фермента 3 мг/мл. Исследование влияния кснкзнтрации субстрата на скорость изомеризации глккозы показало, что ее оптимальная хонкентршжя для обеих глюкозоизеиераз находится в пределах 1,25-1,5 М z сра дальевйгоц увеличении ео скорость образования фрухтоэы уменьшатся.

На рис, 7 2 8 представлены загзезыостг агпшгести ферментов от величины рН а температуры реадшонной смесв. Как вхддэ, оптимум действия для обеих глскозоаммероз находится прд рН 8,0, оптимальной температурой действия гхскозоиэомзразы seolus 20-i является 80°С» a Str.olivAceus 13-4 - 70°С.

Во многих работах было показало сктивирущее влияние ионов некоторых металлов на активность гзехозожзоиераз. Для виявхояхя активаторов ГЛПКОЗОИЗОМЁраЭ ser.albo^rtseolus 20-3 И ccr.oliváceas было исследовано влияадо солой таких металлов на ах фзрментатаЕнуо активность, как nqso4, coci2, tuci3, r«so4, F62(so4)3, crcij, ttiso4, CaCij, Nací, Baci, zn3o4, euSo4. Установлено, что актнвирупщы действием обладают только вони нд2\ Со24", ко2*. Максимальное активируя;« влияние оказывает да обе глгкозопзездразн com: кд2+; ионы Со2* телеке активируют их в знцчдтельной стесенз. Одновременное присутствие ионов обоях металлов оказывает синергадкоо даестшэ. Для этих ионов били pao-счстакн каяу^иеся константы Мяхазлдса, значения которых дред-стаадгны в таблице 5. Низкие концентрасеж ионсв мл2* тагае обладит а е значительным актисиругсди действием.

В исследованиях до изучении идгибярования глехазоизомераз

рНПУКТОЗЫ

пин

Рис. 7. Зависимость активности глпкозолзоиераз str.altjogrieeoioa 26-3'ti) я Str.ollvaccïis (2) от величины jH реакционной сывеж

рМ фруггты мин

ЯН

*>

Xh

ю-

о

4h

50:

—г— 60

10

То ITi/c

Рис. 8. Зависимость активяости глккоэоизсшервз Str.albogriesolne Э8-5 (IV ж str.olivaceua 13-^ <2) от температура реакционной смеси

Таблица 5

Значащи кагущихсяКуДля ионов ид2* и со3* гливозоиэомераз 3«.«1Ьодг1аео1из 28-3 Я 3£г.о11уаевиз 13-4 И Их оптимальные концентрации

Г . .. и, - , .

I к « ■ Оптимальная

Продуцент ; ьажуоаяся Лц, м - концентрация, И

глю&озонзомвразы-1-

| ..... Мд ; Со

2ьг.а1Ьодг1зв- 7,8-Ю^Л 2,2-Ю-4 ,±

о1уц 28-3 ± 0,24-Ю-4 1 0,09-10"*

3«.о11»асви9 8,4'1СГ5с±

13-4 ± 0Г34.ИГ4 ± 0.30-КГ5

2* ! СО2*

5-КГ3 Ю-3

5-Ю-3 5.10"4

отмечалось, что некоторые полиолы в значительной степени ингиби-руют фермент. При исследовании влияния о-ксклвтана активность изучаемые ферментов установлено, что он является сидьвим ингибитором обеих глвкозоизомераз, Для определения типа и константы ингибпрования был использован метод Диксона. При конкурентной типе ингибирования значения Кг составили (ЗДЮ.Ю-ИГ3 К для глшязоизомеразы ЗЬГ.*1ЬодПзво1иЗ 28-3 И (1,ЕЙЭ,С8)-10 11 для глювозоизомеразы асг.о!Х?асвиз 13-4. Относительно вязкие значения константы ингибирования го ворят о высоком сродстве глпкозо-изомераз обоих продуцентов к о-гхилату, в связи с чем он мохе; быть использован в качестве лиганяа при проведении аффинной хро-мато1$афш!.

Исследование стабильности глюкозоиземераз в зависимости от ра среды проводили в интервала от 4,0 до 12,0, Установлено, что оба фермента в интервале рН в,О - 8,0 обладают значительной стабильность», резко умепьезпдэйся при смешении как в кделую, так я в келочау» зону. При исследования торностабальноста фериоптов

изучали влияние на нее ионов соа+ и ндг*. Исследование проводили при 70°С для глюкозоизоиеразн £ъг.&1Ъодг1в*о1и& гв-з в 60°С для глвкозоизоморазы г^г.оНуассив 13-4, то есть на 10° ниже температурных оапшумов ферментов для 1-го часа. Результаты показала, что присутствие в реакционной смеси ионов Со2* оказывает ярко выраженное стабслизаругсее воздействие на оба фермента. Для глпкозовзомораз 5йГ.л1Ьодг1эео1из 28-3 И З^т.о1^всвиэ 13-4 через 10 часов инкубаош активность составила соответственно &&% а 94% от исходной против 14$ и 415 при инкубировании ферментов в отсутствии ионоз со2*. Иовы мд2* на теркостабильвость обеих глпкозоизомераз ве оказывали никакого вгияяия.

Известно, что о-ксилоза кетод-изокераза обладает относительной групповой специфичностью и, кроие о-глгкоэы в своего естественного субстрата - о-ксшгазы тапке способна изокеразовать некоторые другие альдо-сахара - п-рибозу из пентоз, в-г&лактозу и о-ахяозу из гексоз^ Эти альдо-сахара д были использованы при исследовании субстратной специфичности изучаемых глюкозоазоме-раз. Результаты показали, что оба фермента способны катализировать изомеризации в соответствушше хето-сахара только о-ксвло-зы, о-глпкозы в о-рибозы. Рассчитанные величины каздстхся констант Ылхаэдиса названных субстратов представлены в тайшсе 6.

Таблидэ 6

Кахусиеся константы Кихоэлиса для субстратов глскозоизомераз

5ег.а1Ьодг1зео1иа 26-3 К £Ьг.о11у«саиз 13-4

Продуцент | Кц ках. для субстратов

глвко зо кос »¡зразы | о-глпкоза | о-ксилоза | э-рибоза

str.aib09rj.se- . 13-4 * О^ОЭ'Ю"1 ■ 4,6-Ю"Ч,± ±0,18-10-2 ± ¿0,17-10-2 1 0,07-10"1 2,1-Ю"1* 0,06-Ю-1

Оба фермента проявляет наибольшее сродство к D-ксилоэе, и это доказывает, что глхжозоезомерлзы str.elbogriaeolus ао-э и stс.оiiv*ceus 13-4 являются тдлечншш d-ксвлоза кетол-изомераза-ми (Е» 5.3Л.5).

Б Ы Б О Д Ы

1. Разработаны технологические схемы получения глвкозоизо-ыеразы str.aibogriseoiua 29-3, внутри- а внеклеточной глвкоэо-изомераз str.oiivaceus 13-4 в гомогенном,по дашгем длск-элеэтро-фореза в ПААГ и акалитичеокого удьтрадентрифугерованая, состоя-яви,. которые получили полоаагтедънув осонху при испытании в заводских условиях,

2. Определена важнейшие фазяко-химичесхие свойства фермеа-тов - молекулярная масса (178 500 х 165 ООО соответственно для глвковоаэомераз str.«ibogri*«©iu» ге-э я str.oiivac«us 13-4), изоэлекгрическая точка (4,60 к 4,95), коэффипаент седиментации (7,5 И 7,0 s).

3. Доказана тетрамервость четвертичной структура глвкозо-азоиераэ обоих продуцентов, в поддерживании которое длсульфдд-ныв связи не принимают участия.

4. Результаты аюшокислотного анализа ферментов доказали преобладание в них гидрофобных л дикарСоновнх остатков аминокислот в отсутствие пистеина. Величина углеводного компонента -составляет около IX от молекулярной массы глпкозоазомераз.

5. Температурный оптимум глюкоэоаэомераз s«.«íboqriaeoiu« 28—э a str.olivaceue 13—4 составляет 80°С и 70°С соответственно, оптимум находится при рЕ 8,0 для обоих ферментов. В нейтральной области значений рЭ гликозоазомерази обладает высокой

стабильностью.

' 6. Исследование субстратной специфичности глюкозоизоыерзв показало, что,. являясь типичными о-ксилоза. кетол-изс«ераз^и (К5 5.3.1.5), оба фермента обладает способностью катализировать изомеризацию е^е и в-глвкозы и р-рибозы, вследствие чего могут быть использованы как биохимические реагенты для получения о-фруктозы, в-ясилудозы и ю-рибулозы.

7. Актишгрутацее влияние на гликозоизошразв обоих продуцент тов оказывают коны сог* и мд2*, наличие которых в составе ферментов обнаружено методом атомно-абсорбщонной спектрометрии в количестве 3,7 и'1,5 грамм-атомов кобальта, 0,2 и 0,3 грамм-атомов магния на моль белка глшеозоизомераз зьг.а1Ьо9г1зео1и« 28-3 и 13-4.. Другие металлы (марганец, никель, хром, шшк, железо) в их белке отсутствовали. Ионы со1* оказывает ярко выраженное стабилизирующее воздействие на ферменты.'

8. Сравнение фазико-химическихсвойств.показало тождественность внутри- и внеклеточной глхжозсизоиераз аъг.о11уас«ив 13-4, что говорит об отсутствии- значительной модификации глекозоизо-меразн в проиессе ее выделения пра лизасе биомассы микроорганизмов. ;.* ■ . 1 - '"

Список работ; опубликованных по ^^мо ^десеотасив

I, Михайлов А.Ы. , Грачева НШ. , Ыосячев Ы.С. Васокоочиден-ная глскозоизоиераза отамм 28-3.-

Рукопись дев., в ОНТИТЗИмихробгопром II.06.1984» * 20Э' Мб Д84, Юс;. / " . ■ ' ■ •

г. ¡Михайлов А.И;, Грачева И.М., Посипев II; С. Аминокислот-

аый состав и четвертичная структура глшсозоизоыеразн stceptoray-c«s aiboeriaooius, штамм 28-3.- Рукопись ses. в ОШИТШмикробио-ороы 11.06.1984, « 208 иб Д84, 9 с.

3. Михайлов А.М., Резчиков А.А., Мосячев U.C. Изучение и применение о*ксшюз& кегол-иэоиараз актнвомицетов.- В кн. : Ферменты в биохимических анализах. Тезисы сообщений Всесс&зной конференции "Применение ферментов в биохимических анализах", Палан-

га. 1984, ч. I, с. 33.

Подписано в пёчать^^^уЗакаа^у/ Тираж Ф-kj «KspT<viirror[¡í фия», ул Зор«, 15