автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ STREPTOMYCES ALBOGRISEOLUS 28—3.

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РСФСР

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

ХИН КИС Людмила Львовна

УДК 663.152.321(043.3)

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ

51гер1отусе5 а1Ьо^П5ео1и5 28—3.

Специальность 05.18.10 — Технология витаминных, ферментных и белковых препаратов, чая и табака

АВТО РЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

На правах рукописи Для служебного пользования

Экз. ль 000091 *

Москва — 1986

Работа выполнена' на кафедре «Биотехнология микроб-лого синтеза» Московского ордена Трудового Красного Знамени технологического института пищевой промышленности.

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор И. М. Грачева.

Официальные оппоненты

доктор химических наук, А. Д. Неклюдов;

кандидат технических наук, старший научный сотрудник

К. В. Кобелев

Ведущая организация Всесоюзный заочный институт пищевой промышленности

Защита состоится « А^г » , . , 1986 года

. на заседании Специализированного Совета К 063.51.04 Московского ордена Трудового Красного Знамени технологического института пищевой промышленности по адресу: 126080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11..

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МТИПП.

Автореферат разослан « » 1986 года.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

к. т. н., доц.

А. И. Садова

ОБОД ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема. К началу 80-х годов уровень потребления сахара в навей стране значительно операх ал уровень его производства. Во многих пищевых производствах увеличилось использование сахара как сырья ори выработке хлебо-булочннх, кондитерских изделий, безалкогольных налитков а др. Возрастающая потребность в сахаре обусловила значительное повышение цен на мировой рынке*

Научные исследования в области биотехнологии выявили возможность получения гижово-фруктоэных сиропов (ГФС) из крахмало-содериадвго. сырья путем ферментативного гидролиза крахмала Х-амилазой и глюкоамилааой о последующей частичной изомеризацией D -ГЛЮ1С03Ы В D -фруктозу Г ЛЮЕО 30 из оме раз Ой. ГФС ЯВЛЯЕТСЯ полноценным заменителем сахара и могут применяться в производстве многих пищеввх продуктов, например безалкогольных напитков, плодовых я овоцных консервов, кондитерских изделий, молочных продуктов а др.

За рубежом разработаны к внедрены ферментативные способы получения ГФС из крахмала как заменителя тростникового и свекловичного сахара. Так, в Японии в 1961 г. выработка этого продукта достигла 450 тыо. т (в пересчете на сухое вещество; (Ко-баяся, 1982), к 198* г. в мире ежегодно производилось около 2,5 млн. т ГФС, на что потребовалось 1000 т иммобилизованной глшоаоизомораэы ( itaroom , 1984). В СССР также к 1990 году намечается оргавязацнн иноготоннахного производства ГФС.

Следует отметить, что из осуществляющих трансформацию крахмала ферментов особое значение имеет глюкоаокзомерава -фермент, катализнрущий реакции изомеризации- \

имени К.А. Тимирязева I

• цнБ имени Н.И. Железное.

[тг^тш-1

1 В крупномасштабном производстве целесообразно применять только иммобилизованную глюкозоизомеразу; что связано как о высокой стоимостью фермента, так в с возможностью получения более чистого продукта. Использование новых, более эффективные бшока-тализаторов, содержащих глюкозон зоне разу, должно привести к существенному удеиевлению всего процесса производства ГФС.

В связи с этим получение высокоактивных и стабильных иммобилизованных препаратов глюкозоивоиеразы, пригодных для промышленного получения ГФС, является актуальной задачей для народного хозяйства наяей страны, направленной на выполнение Продовольственной программы СССР.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлась разработка способа получения,высокоактивных и стабильных препаратов иммобилизованной глвкозонзомеразы, пригодных для применения 5 пищевой промышленности для получения ГФС.

Для осуществления поставленной пели в диссертационной работе репались следующие задачи:

- выбор носителя, пригодного для иммобилизации растворимой глюкозонзомеразы, для чего исследовались различные неорганические и органические матрицы;

- выбор метода иммобилизации глюкозоизоморазы (адсорбционный, ионный, ковалентний и координационный);

- получение биокатализаторов на основе клеток э^рготусез «1Ъоег1в«о1ив 28-3, обладающих глюкозоизомеразной активностью, включением в различные гели;

- сравнительное изучение активности и стабильности полученных иммобилизованных препаратов.

Научная новизна, в работе впервые была проведена иммобилизация микробных клеток продуцента глюкоэоизоыеразы включением в гель гидратированной окиси кобальта. Показано, что такой способ

- З -

иммобилизации характеризуется высокий іисодоіі активности и приводит к получению активного к стабильного гетерогенного биоката-лиэатора. ' \

Изучены условия проведения процесса иммобилизации: подобраны оптимальные соотношения компонентов я условия осаждения гидроокиси, в результате чего удалось повисить активность и стабильность иммобилизованного препарата.

Впервые было осуществлено включение растворимой глїеозсизо-мераэы в гель гидратароваяной окиси кобальта и изучены свойства полученныг иммобилизоваяниз: препаратов.

Синтезирован полимерный носитель на основе формальдегида и фенола и показана возможность координационной иммобилизация глскозоизомераза на этом носителе через ионы ряда металлов.

Изучены свойства глвкозоизомеразы, иммобилизованной коорди-напдонным методом на ряде перспективных для проишяенаоста полимерных носителей: силохроме, пористой окиси адвминия, спито» поливиниловом спирте, слитых декстраловшс гелях.

Практическая ценность. В результате проведенню: исследований разработан новый способ иммобилизации микробные клеток, со-дерхащяг глшозоизомеразу, позволяющий получать биокатализатор

с активности) до 500 ГлИЕ/г, что находится на уровне известию: *

зарубежных аналогов. Предложенный способ иммобилизации клеток вощением в гель гидратироваяной окиси кобальта приводит к существенной стабилизация фермента: время полувнаніїгвадіш при 60°С увеличивается с 3-5 ч (для нативных клеток) до 40-43 суток (для иммобилизованные клеток). Не меаее 50% исходной активноени гетерогенного биокатализатора сохраняется в течение 70 суток»

Предложенный метод отличается от.известных тек, что исходные вещества для иммобилизации дешевы и доступны, а процесс ее проведения прост и легко осуществим в промышленном масштабе.

- * -

Все это обуславливает больиую праиическуг значимость г перспективность разработанного способа.

Годовой экономический эффект от применения преддатаеиого в работе препарата шшобялизоваявой глюкоаоиэомераан составит I 245 тис. руб.

Апробация„работы и публикации. Освоввые положения диссертационной работы были представлены на и Всесоюзном сикпоаиуие по инхенерной знвимологяя "Получение и применение б*окатажи8аторов в народном хозяйстве к медицине" (Киев, 1983) и на Ш Всесоюзной симпозиуме "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Кобулети, 1986),

По материалам диссертация опубликовано 3 работа и подана заявка на авторское свидетельство СССР, принятая иа рассмотрение во ВНИИГПЭ. (Заявка Ж 4076304/12, приоритет от 4.04.86).

Структура и обьен работы. Диссертация состоит из введения» обнора литературы, экспериментальной части к обсуждения результатов, заключения, описания цриншшналвной технологической схемы, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена иа 133 страницах, содержит 27 таблиц и 23 рисунка. Синеок литературы включает 226 источников» в ток числе 194 зарубежных публикаций.

Автор выражает глубокую благодарность старшему.научному -сотруднику ИНЭОС АН СССР, к.х.н. Игорю Александровичу Яискову за аостояввую помощь г работе и ценные консультации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы представлены: общая характеристика и свойства гяокозоизомеразн, методы иммобилизации клеток, обладающее глехозоизомеразной активность» (адсорбция, ковалеятное связывание, включение в гель) н носители, пряиевялциеся для иммобилизации растворимой глюяозоиз омерааы.

к

Объекта и методы исследования.

Объектом исследовалия являлась биомасса зїг. лІЬоегіаюіия £8-3, полученная з 0НШІ технологии ферментных препаратов Московского техвологического института шщевой промы&ленвости, а также препарат растворимой глвкозоиэомеразы, полученный вами дробным автолизом из биомассы.

Используемый растворимый ферментный препарат имел активность 250-920 ГлИЕ/г (содержание белка 10-20$) ■ период полуивактива-цви 5-7 ч при 60°С, Клетки, содержащие глюкозоизомеразу, имели активность 350-700 ГлИЕ/г сухой биомассы и период полуияаятива-ции 3-5 ч пра 60°С,

Активность глюхозоизоиеразц выражала в международных единицах ГлИЕ, За единицу активности принимали такое количество фермента, которое гзоиеризует I макромоль глюкозы до фруктозу за

I мин. при рН 7,0, температуре 70°С и оптимальной концентрации

р.

кофактора - ионов , Накопление фруктозы контролировалось с помощьп.цистеинкарбаэольного метода ( оіесЬ* «ї аі , 1951}.

В качестве неорганических повителей дне иммобилизации растворимой глвковоизоиерагы исследовались материалы» выпускаемые отечественной промышленностью: силохрбмы со средним диаметром пор от 30 до 210 ни, пористая ¿"-окись алюминия со средним диаметром пор 32 ни.

Ковалентную иммобилизации на силохроме проводили через глутаровый альдегид. Предварительно носитель модифицировали '

-амииопропилтризтоксисиланом по методу м*ввіов и (1970).

Для координационного связывания глюкоэоизомеразы силохром модифицировали хіо рме тидтриэтоксиселзиом с последующим введением хелатирущего азотсодержащего виганяа обработкой тризти-пентетраминои (ймсков и др., 1979). Лигавдосодержшцае носителя

обрабатывали 2-5-кратный избытком 0,1 И растворов хлоридов соот-ветствувдих металлов в дисхил лироваяной воде при комнатной тепла рагу ре до установления равновесной концентрации растворов солей.

В качестве органических полимерных носителей в работе использовали: - поливиниловый спирт, который сшивала глутаровым альдегидом оо методам кип«ск» «г п1 (1976) и эпихлоргидри-Н011 по методике Яискова и др. (1979);

- фенол фориальдегиднш смолы, синтезированные нами по методу Серенсова и др. (1963).

Включение клеток в кркогеди сшитого полиакрил анида проводили по методике Лозинского к др. (1982).

Вклвчение фермента или клеток в гель гидратироваяной окиси кобальта проводили путем смешивания раствора глвкоаоизоиерааы или биомассы влажностью 90% с водным раствором соли кобальта с последующи осаждением гидроокиси кобальта аммиаком или яаОН, осадок отфильтровывали, промывали и высушивали.

Выгод активности при иммобилизация рассчитывали как отношение активности глшсоэоизомерагы на носителе к активности всего количества растворимого фермента, взятого для иммобилизации.

Стабильность иммобилизованных препаратов определяли при б0-70°С в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,0.

Период полуннактиваиии иммобилизованной глюкоэоязомеразы определяли графическим путем по кривой изменения активности во времени.

Представленный в диссертации цифровой материал получен в результате статистической обработки экспериментальных данных (Грачев, 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ данных литературы, проведенный г диссертации, показал что как иммобилизация фермента, так в иммобилизация клеток, вря-годят е получению бионатализат оров, перспективных в промышленной отношении.

I. Иммобилизация растворимой глснозоизомерагы.

1,1. Иммобилизация глвкозоиаомеразн на силохроне.

Иммобилизацию глвкоэоизомйразы ва сплохроме проводка кова-лентныы методом через глутарсвый адьдегад я координационным методом с исдовмованвем ионов Со (П ), ti(I7) и 2п(1У) в качестве переходных металлов.

Ковалентная иммобилизация фермента ва сдлохроме характеризуется относительно высоким выгодой активности - 27-34% в зависимости ох диаметра пор воснтела в активностью 125-150 ГлИЕ/г

я0сит9ля.

В налей работе большое вккмавие при изучении свойств иммобилизованных препаратов удеяялоеь стабильности гетерогенного биокатализатора. Стабильность характеризовали периодом полуинан-тивацни, т.е. временем непрерывной работа иммобилизованного препарата, за которое его активность снижалась вдвое от первоначальной, Однако стабильность ковалентно иммобилизованной на си-лохроме глвкозоизомеразы невысокая: за 10 ч при 70°С активность снизилась в 2,7 раза.

С цель» повышения стабильности гетерогенных биокатализаторов проводили их обработку боргидрадом натрия, а также солями некоторых металлов. Показано, что новы кобальта оказывают некоторое стабилизирующее воздействие на иммобилизованную глвко-эонзомеразу (табл. I). Однако а в их присутствии бяокатализатор4

достаточно быстро инактівируется - через 35 ч инкубации активность выходи почти на нулевой уровень.

Таблица I.

Влияние ионов металлов на активность к стабильность ковалентно иммобилизованной глювозоиэомеразы.

I Активность препаратов (ГлИЕ/г носителя) ] при различной длительности выдержки Металл |_образцов ігри 70°С. ч_

| 0 { 10 { 20 { 25 { 35

Без металла (контроль) 123 45 29 16 6

Со (П) 137 66 37 22 9

<П) 93 34 20 10 4

А1 <Ш) 37 27 10 5 -

Сг (Ш) 34 26 10 6 -

(Ш) 10 5 - - -

При координацнонвой иммобилизации на силохроие через ионы Со (П) достигнут выгод, активности 16-27% (в зависимости от диаметра пор носителя).

На примере координационной иммобилизации через ионы її(17) и зп(1У) показано, что предварительное высушивание носителя, связанного с ионом-комплексооЗраэователем, приводит к увеличению активности иммобилизованного препарата г 2,5-3 раза (табл. 2).

Стабильность координационно иммобилизованной глюкозоизоые-разы была низкой (период полуивахтивашга 16-18 ч при 70°С).

Из проведении исследований ясно, что силохрои пало пригоден для иммобилизации использованного препарата глюкоэоизоие-разы.

Таблица 2,

Координационная иммобилизация глюкозоизомеразы на силогроие через ионы титана и олова.

Металл ! 1 Активность препарата. ГдИЕ/г носителя

1 I Б стандартных условиях 1 1 На высушенном носителе

И (ИГ) 24 72

Эп ЦУ) 43 103

1.2» Иммобилизация глюкозоизомеразы на пористой окиси алюминия.

На пористой окиси алюминия проводили адсорбцию и координационно» иммобилизацию глюкозоизомеразы.

Были определены оптимальные условия проведения адсорбции. Установлено, что процесс следует проводить в трис-буфере при ра 5,0, с добавлением Ю-3 11 количество фермента для иммоби-

лизации - 200-300 нг/г носителя.

Однако и в оптимальных условиях активность получаемого препарата была невысокая - 30 ГлИЕ/г носителя. Период полуинактивации адсорбцновно иммобилизованной глюкозоизомеразы при 60°С -2 суток.

При координационной иммобилизации фермента на пористой окиси алюминия через ионы Со (П) получен биокатализатор с высоким выходом активности (7556) и с активность!) 137 ГлИЕ/г. Однако координационная иммобилизация глюкозоизомеразы также не приводит к получению препаратов со значительной стабильностью (период полуинактивации 2 оут.). Поэтому метод не представляется перспективным.

1.3, Иммобилизация г лико зоиз оме разы на сшитом

поливиниловой спирте.

Для создания трехмерной структуры гелей в работе использовались два сшивающих бифункциональных реагента - глутаровый альдегид (ГА) и эпихлоргидриа (ЭПХГ).

Поливиниловый спирт, сшитый ГА, использовали для ковалент-

_ *

ной и координационной иммобилизации глюкозоиаомеразы, в последней случае в качестве азотсодержащего лиганда применяли этилен-диамин, а в качестве иона металла - Со {К).

Активность ковалентно иммобилизованного фермента составила 20 ГлИБ/г, а при координационном связывании - 50 ГлИВ/г. Показано, что с увеличением кабухаекости геля с 200% до 500$ активность гетерогенного биокатализатора увеличивается с 18 до 30 ГлИЕ/р.

На поливиниловом спирте, сшитом ЭПКГ, проводили координационную иммобилизацию глюкоэоизомеразы через ноны Со (П),сг (Ш), Зп (ІУ) и їі(ІУ). Лучший результат получен при связывании глюко-зоизомеразы через ионы Со (И ). Однако, как достигаемая активность препарата (20 ГлЙЕ/г), так и выход активности при иммобилизации (2С$) были невнлиаи.

Кроме того, иммобилизованная на поливиниловом спирте глюко-зоизомераза била нестабильна: период подуивагстивацни при 60°С для разных образцов составил 14-20 ч.

1.4. Иммобилизация глюкозонзомеразы на фенолфоркаль-

дегидных смолах.

В работе были синтезированы фенолфориадьдегидные смолы и исследована их пригодность для иммобилизации глюкоэоизомеразы.

Иммобилизацию проводили следующими способами:

I) через ионы ТІ(ІУ) и 5п(1У) - активность составила, соотвеїсгвенно, 19 и 17 ГлИЕ/г, выход активности - 21,1 и 18,9$;

2) полученные фенолфорн альдегидиые смолы■формулировали ди-метилформамидом в присутствии зшорокиси фосфора я проводили ковалей твое связывание ферыеатаактивность 37 ГлИЕ/г, выход активности - 4I«IJ&i

3) формилироваяяый полимер модифицировали этилевдиаюгаом и проводили координационную иммобилизация через ионы Со (IX) -активность 33 ГлИЕ/г, выход активности - 36,7%.

Таким образом, иммобилизация глюкозоиэомераэа на феиолфор-мальдегидныг смолах характеризуется достаточно высоким выходом активности* особенно ори использовании форнилированяото носителя.

Стабильность полученных иммобилизованных препаратов оказалась невысокой. Наиболее стабильной была глюкозонзомераза, иммобилизованная координационным способом через зтилендиаиин и Со (Я). Но и в этом случае период полуияактивацин составил всего I сутки.

1.5. Иммобилизация глюкозоизокерааы на сефадексах.

В работе были исследованы сефадексы-аннониты марок QAE-Seph&dex ¿-50 н ÍQ!AE-3ephadei ¿-50, на которых проводилась ионная иммобилизация глюкозоизоиеразы. Активность полученных препаратов составила 122 ГлИЕ/г < QAE-Sophüdox ) и 104 ГлИЕ/г (ДЕАЕ- Sephadex ), выгод активности, соответственно, 40,7Jf и 34,7¡6. Иммобилизованный фермент имел период полуинактивации 2 сут., причем в течение первых 20 ч активность практически не изменялась (рис. I).

Рио. I, Стабильность глюко-зонзоиер&зы, иошш иммобилизованной на QAE-S*pb»dex (I) и ДЕАВ- Sephadei (2) | - период полуинактивации.

JO 40 50 время, ч

й- «о

Показано, что оптимальным значением рН среды в процессе иммобилизации является рН 7,4, а рН-оптииуы связанной глюхозо-изомеразы - 7,0, что совпадает со значением рН, при котором проводилось определение активности.

1.6. Иммобилизация глюкозоквсмеразц включением в , ;. нерастворимый гель гидраткрованяой окиси кобальта.

Полученные нами и имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о важной рола ионов кобальта в получении стабилизированных препаратов растворимой и иммобилизованной глюкозоизомераэы. В связи с этим нам представлялось весьма перспективный получение биокатализаторов, содержащих глюкозоизомеразу, на основе гидра-тированной окиси кобальта, которая ранее не использовалась для иммобилизации ферментных препаратов.

Нами разработаны условия иммобилизации растворимой глюкозоизомераэы включением в гель гидратиролавной окиси кобальта.

IВ работе получены препараты глюкозоизомераэы путем смешивания раствора фермента с раствором соли кобальта с последующим осаждением гидратированной окиси кобальта (П), которая при окислении на воздухе переходит в нерастворимую гидратировакную окись кобальта (Ш ).

В качестве исходных растворов использовали водные растворы ацетата кобальта, осаждение проводили аммиаком из смесей с различными соотношениями масс сухих компонентов (табл. 3).

Как показали результаты, при шшобилизации глюкозоиэомера-зы таким способом получены препараты с высоким выходом активности ( >95% при соотношении масс ферментного препарата и ацетата кобальта 1:9).

Однако стабильность полученных препаратов была невысокая, по сравнению с растворимой глюкозоиэоиеразой, период подуинакти-

- ІЗ -

вации которой в условиях эксперимента 5-7 чстабильность фермента при иммобилизации- этим способом;повышается в 10-12 раз. ■ '■■' ■ ■■ Таблица 3.

Характеристика иммобилизованных, препаратов, полученных

■ . включением.глвкозоигомерааы.в гидратгрованну»

.'■.'.,'■ '■■'■'. окись кобальта. ■'. ■ ': I.' ''.-.'■ .:: * •

Соотношение ферментного препарата и . Со(СН^СОО)?* } Активность, [ препарата, І г ГлИЕ/ґ 1 Выход { активности, \ % ¡Период лолу, ¡инактивации !при 60°С, сут.

I : 2,8 130 62,4 ■ 3,5

, I : 4,5 134 " 69,7 3,0

I : 9,0; 159 95,4 3,0

I : 18,0 ,51 32,6 2,0

Таким образом,.проведение иммобилизации глюкоэоизомеразы на носителях различной природы показало, что во многих случаях получаются биокатализаторы с высокой активностью и со стабильностью, многократно превышающей стабильность нативного фермента (в 10-12 раз при включении фермента в гель гидратированной окиси кобальта). Однако для практических целей достигнутый во всех вариантах уровень стабилизации растворимой глюкоэоизоиераэы является все же недостаточным.

Для создания биокаталиэаторов с большей стабильностью в работе проводились исследования по разработке способов иммобилизации клеток, обладающих глюкозоизоиеразной активностью.

2. Иммобилизация клеток, обладанию: глюкозоизомеразной активностью.

Для включения в различные гели использовали клетки культуры Зігерїошусез ліьокгівеоіив 28-3, полученные непосредственно после отделения жидкой фазы культуральной среды.

- 14 -

2.1. Иммобилизация клеток в криогели свитого полиакркламида,

Ыетод криоструктурироваяия заключается в осуяествдевии процесса формирования геля в замороженной среде. Криогели обладают макропористой структурой, обеспечивающей их хороаую проницаемость.

Для иммобилизации использовалась биомасса о активностью 46 ГлИЕ/г клеток с влажностью 90%. Иммобилизованный препарат, подученный по методике, предложенной Лозинским и др. (1982),имел активность 77 ГлИЕ/г, период полуинаятивации 2 сут., причем в течение первые 20 ч ввлпчениие в хриоШАГ клетки практически полностью сохраняли первоначальную активность.

Показано, что при увеличении концентрации инициатора полн-мериэадии - персульфата аммония - в 4 раза по сравнению с исходной, получен более упругий гель, с лучшими фильтрующими свойствами; период полуинактивации такого препарата составил 3 суток

Рис. 2. Стабильность клеток, иммобилизованных в криогели спитого поли-анриламида при разных концентрациях

I - 0,4 иг на I г влажной биомассы;

г _ 1,6 мг —" —

г - период полуинактива-Т ции

Научена зависимость активности а стабильности иммобилизованных клеток от их концентрации в геле. Максимальная активность (85 ГлИЕ/г) получена при концентрации биомассы 40%, однако при этой концентрации наблюдается самое быстрое падение активности (период полуинактивации 16-18 ч ). Наиболее стабильным был препарат, полученный при концентрации биомассы 2С$ (период полуинактивации ~ 2 сут.). ч

(рис. 2).

В целой, включение клеток в криогели сшитого полная риламида позволяет увеличить их стабильность - в 15 раз.

2.2, Иммобилизация клеток включением в нерастворимые гель гидратированной окиси кобальта.

В разделе 1.6 показано, что использование метода включения растворимой глюкозойзомеразы в гель гидратированной окиси кобальта приводит к получению активных и стабилизированных по сравнению с натиетым ферментом биокатализаторов (период полушактава-ции 3-3,5 сух*). Поэтому представлялось целесообразным проведение иммобилизации клеток с глюкозоизомеразной активностью включением в гель гидратированной окиси кобальта.

Для выбора оптимальных условий получения биокатализатора нами было изучено влияние аниоиа соли кобальта и условий осаждения гидратированной окиси кобальта на свойства получаемого препарата иммобилизованных клеток.

Клетки продуцента (влалностью ЩІ) суспендировали в водном растворе ацетата или хлорида кобальта и проводили осаждение геля аммиаком или ИаОН при рН 7,0. Соотношение сухих клеток и сода кобальта (по массе) составляло 1:1 (табл. 4). . ,

Таблица 4.

Характеристика клеток, включенных в гель гидратированной окиси кобальта при использовании различных исходных компонентов.

Исходные компоненты ; Активность і пржа' істаого геля і Выход активности, % І Период полу-1 инактивации {при 60°С, сут,

Клетки + Со(СН5СОО)2 + и%ОН гад 92,3 30

Клетки + СоС1г + НН^ОН 210 * 70,6 20

Клетки + Со(СН3СОО)г + иаОН 170 57,1 27

- 16 -

Как видно из таблицы при проведении¡процесса иммобилизация следует использовать ацетат кобальта и аммиак в качестве осаждающего агента. ! I

Данный способ иммобилизации клеток характеризуется высоким выходом активности и приводит нполучению стабильных препаратов. В связи с этик были исследованы условия получения и некоторые свойства иммобилизованных препаратов.

С целы) установления оптимального соотношения компонентов при иммобилизация проводили включение клеток в гель гидратирог-ванной окиси кобальта при соотношении сухих клеток и ацетата кобальта (по массе) от 1:0,05 до 1:10 (табл. 5).

Таблица 5.

Иммобилизация клеток.в геле гидратированной окиси кобальта при различных соотношениях компонентов.

Соотношение сухих клеток и ацетата кобальта 1 I 1 } Активность препарата, ГлИЗ/г сухого геля 1 ! 1 ( I Выход' активности, % } Период полуинактивация { при 60°С, | сут.

' I : 0,05 20 4,0 5

I : 0,1 60 К,? , 12

I : 0,5 180 46,3 -

I : I 240 82,3 30

I : 3 350 99,4 34

I : 5 1 3X0 97,4 30

I ; 10 .210 78,0 31

При соотношении компонентов 1:3 получен препарат с нал-

большей активностью (350 ГлИЕ/г сухого теля) и-с наибольшей

стабильностью (период полуинактивации 34 сут.).

Для проверки влияния рН при формировании гидратированной

окиси кобальта на свойства получаемых препаратов осаждали -гель аммиаком' при рН 7,0; 8,5 и 10,0 (рис.3).

2 ния:

Рис.3. Стабильность клеток, иммобилизованных в гидрати-рованйой окиси кобальта при разных значениях рН осакде-

1 - рй 7,0

2 - рН 8,5

3 - рН 10,0

60

Время,

Как видно из рис.3, изменение рН осаждения сказывается и на активности получаемых иммобилизованных клеток а, особенно, на их стабильности.

Так, при увеличении рН осахдения с 7,0 до 10,0 активность повышается с 350 до 470 ГлИЕ/г, а период подуинактивации иммобилизованных клеток возрастает при этом с 10 до 37 суток. Оптимальным значением рН следует считать 8,5, при котором активность полученного препарата стабилизируется на уровне от исходной по крайней мере в течение 70 суток.

Бшш определены оптимальные значения рН и температуры процесса изомеризации для проявления максимальной активности иммобилизованных клеток. Как видно иэ рис. 4, рН-оптиыум полученного препарата равен 8,0, при {И 7,5 активность"биокатализатора составляет 91-93$ от максимальной. Это важно для промышленного получения гдюкозо-фруктовных сиропов, так как проведение процесса при значении рН, близком к нейтральному, уменьшает долю щелочной изомеризации глюкозы.

Температурный оптимум действия иммобилизованных клеток равен 70°, что совпадает с оптимумом действия дативных клеток, однако его экстремум выражен не так четко.

Рис. Зависимость активности клеток, иммобилизованных

в гидратированной окиси кобальта

а) от рН субстрата; б) от температуры реакция.

1 - нативные клетки

2 - иммобилизованные клетки.

Была исследована рН - стабильность иммобилизованных клеток, для чего образцы инкубировали при 60°С в 0,05 и фосфатном буфере при значениях рК от 5,1 до 8,5, периодически отбирая пробы биокатализатора и определяя их активность.

[Толученнда дайкые представлены на рис. 5.

Наибольпую стабильность препарат имеет при рН 8,0, то есть в области рН-олтимума своего действия. Период полуинактивации иммобилизованных клеток при рН 8,0 - 43 сут., прячем в течение первых 14 суток их активность несколько повышается.

Б работе была проведена иммобилизация микробных клеток, содержащих глюкозоизомеразу, включением в гель желатины по методике йиркев в* «і (1976) и в альгинатный гель (А.о, СССР № І070І63, 1984). Свойства препаратов, полученных по известным методикам, сравнивались со свойствами клеток, иммобилизованных в гидратированной окиси кобальта разработанным нами способом (рис. б).

Препарат, полученный включением клеток в гель гидратированной окиси кобальта, значительно превосходит иммобилизованные клетки, полученные включением в гель желатины и альгинатный гель, по уровню активности в, главное, по стабильности.

Ряо.6. Сравнение стабильности клеток, иммобилизованных в геле желатины

(1), в альгинатном геле

(2) и в геле гидратированной окиси кобальта,при рН 7,0 (3) и рН 8,0 (4).

I - период долуинактива-ции.

» ¿> їо' "м ¿о

Следует отметить, что при использовании биомассы с более высокой исходной активностью можно получить более активный гетерогенный биокатализатор. Так, в работе бал получен иммоби-

§

«ю

МО

£00

«О

лязованный препарат глюкозоизомеразы с активності» 510 ГлИЕ/г при включении клеток с активностью 70 ГлИЕ/г влажной биомассы.

На основании проведенных исследований предложена принципиальная технологическая схема получения иммобилизованной глюкозоизомеразы» представленная на рис. 7.

Биомасса, промытая от остатков кулътурздьвой жидкости, поступает в приемную емкость (I), откуда подается в емкость для термообработки (2), снабженную рубашкой и мешалкой. Термообработка проводится 10-15 мин. при 70°С, гидромодуль 1:5. Для этого в емкость (2) поступает 0,05 Ы фосфатный буфер рВ 7,0, содержащий 10-3Ы Со (П) и НГ2Име(Д), суспензию биомассы перемешивают, нагревают до 70°С в выдерживают 10-15 мин.

После термообработки суспензия подается на сепаратор (3) для отделения биомассы, жидкая фаза отводятся в канализацию. Биомасса поступает в промежуточный сборник (4), а из него - на иммобилизация в реактор-смеситель (5), в который задают 10^-ный раствор ацетата кобальта. Суспензию перемешивают и проводят осаждение гидратированной окиси кобальта концентрированным раствором аммиака, доводя рН смеси до 8,3-8,7 при постоянном перемешивании.

Суспензию из реактора (5) подают на нутчфилвгр (б), где иммобилизованный препарат отмывается от остатков реакционной смеси де ионизирование Й водой.

Промытый препарат подается в промежуточный сборник (7) и далее в сушилку кипящего.слоя (8). Сушка проводится при 50°С в течение 10 мин. ко влажности 7$.

Высушенный препарат поступает в бункер (9), а затем на ситовой классификатор (Ю), где проводят отделение частиц разного размера. Проходя через сйтовой классификатор, частицы с диаметром 0,1-0,2 сы поступают в бункер готовой продукции (IX). Более крупные частицы поступают на варовую мельницу (12) для изиель-

биомасса

буфер

I 2

ггс!

в реактор 5

го

от до»Л р-р Со(СН3С00?2 » Н^ОН

ы

яимобид. препарат

Рис. 7. Приндгаиапиая технологическая схема получения иимобяиэованной глюкозоавонеравы.

ченкя, а мелкие частицы - 5 реактор-смеситель (5) для повторной обработки.

Готовый иммобилизованный препарат имеет активность 500 ГлЙЕ/р.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ иммобилизации клеток зіх-.аіьоєгівеоіив 28-3 с глюкозоязомеразной активностью в гель гидрадированной икиси кобальта. Показано« что метод характеризуется высоким виходом активности - до 99$ в оптимальных условиях и достаточно высокой стабильностью - период лолуинактивации препаратов при 60°С достигал 43 сут., через 70 сут. инкубации сохранялось 30£ меновой активности.

2. Изучено влияние условий получения на свойства иммобилизованных клеток включением в тель гидратированной окиси кобальта. Показево, что наибольшая активность и стабильность достигается при использовании растворов ацетата кобальта» соотновении сухих клеток и соли кобальта (цо массе) 1:5» осаждеиии гидроокиси кобальта ашшаком при рН 8,5.

3. Изучены свойства полученных иммобилизованных препаратов: температурный и рН-оптинуми и рЕ-стабильность. Показано» / что биокаталиаатор наиболее стабилен при рЕТ 3,0, это асе.,значение рН является оптимальным для его активности.

Показаны преимущества предложенного метода по сравнению со способами включения клеток в криоструктурировакный полиакри- . ламидный гель, альгинатннй гель и гель желатины.

5. Получены препараты глюкоэовзомеразы, иммобилизованной на неорганических носителях (силохроме и пористой окиси алюминия) различными методами. Проведено сравнение ковалентних и координационных методов иммобилизации глюкозоиэомеразы на

силохроме и адсорбции и координационной иммобилизации на окиси алюминия. Показано, что координационный метод иммобилизации позволяет получать препараты с более высокой активностью.

6. Изучены свойства глюкозоизомеразы, иммобилизованной на органических носителях: поливиниловом спирте, фенолформальдегид-ной смоле и на свитых декстрановых гелях. Показано, что наиболее стабильными являются препараты, полученные иммобилизацией глюко-зоизомеразы на ДБАВ в <5АЕ- 5«р]ш4ех . Их период полуинактива-

,ции составляет 2-3 суток.

7. На основании проведенных исследований предложена принципиальная технологическая схема получения иммобилизованной глюко-зоизомерааы включением клеток в гель гидратировакной окиси кобальта

8. Предварительные испытания препаратов клетох, иммобилизо-

ванных в гедратированной окиси кобальта, подтвердили их работоспособность и перспективность использования в промышленности.

СПИСОК работ, опубликованных пи томе диссертации.

1. Янеков И.А., Хинкис Л.Л., Перкатова Е.Л.,Даванков В.А., иосичев U.C. Координационная иммобилизация глюкозоизомеразы на силохроме, - Биотехнология, 1985, te б, с.95-98.

2. Хинкис Л.Л., Иосичев U.C.,Грачева U.U., Янеков H.A., Даванков В.А. Иммобилизация глюкозоизомеразы из Act. «ibogri-eeolue 28-3. - В сб.; Тезисы докладов 1У Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология", Киев, 1983, ч.2, с.58.

3. Хинкис Л.Л., Ямсков S.A., Даванков Б.А., Мосичев U.C. Сравнение эффективности способов иммобилизации глюкозоизомеразы на различных носителях. - В сб.: Тезисы докладов Ш Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами", Кобулетп, 1986, с.74-75.

Подписано к печати 35.CB.8e ДСП Формат бОхЭО^/Еб

Ойьем п.л». 1,5- Усл,п.л.1,5 Уч.-дзд.л, 1-14 Печать офсетная

Бумага этикеточная . Тирая ЮОэкэ. ИзД.й461 Зак.029

Типография АгроНИИТЭШ