автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ

■ ' ' -¿С - ■ | лвгер£®а>д

Цц

1ЮНИСТЕРСТВ0 ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИИ РСФСР--

МОСКОВСКИЙ ОРДШ ЯТЮВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ТВХНОЛССТРТВСКИЙ ' ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ ПРОМШЯЕЙНОСТИ

М7081

ЛЕБЕДЕВ' Лео

Н« РТТО1ДЯ«

Дхя служебного пользования Экэ.Л

О О О ¿КЗ

ВвНИЖМОХЖЧ

; УДК 577.15/068.8/

РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ШКОЮИЭОМВРАЗЫ

Спвцжальвооть 05.18.10 - Тохнодогяя эвтшявнкх, ферментных ш бвляовыг препарата»

. АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соиокаме ученой степени кандидата технических нвуж

Иоокм - 1982.

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного дааыеня технологическом институте шщевой промьишенноот*.

Научные руководители;

доктор технически! наук, професоор ПОПАЛИЧ-И.А., кандидат техиичеок»! паук, доцент МОСИЧЕВ И.О.

Официальные оппонентыг

доктор технических наук, профеооор ЛРОВЕНКО В.1., кандидат биологически! наук, доцент АУЭРМДН Т.Л.

Ведуиая организация - Московский опытный завод

ферментных препаратов.

Защита состоится 1992 года на

заседании Специализированного Совета № К606Э5Ю4 Московского ордена Трудового Красного Знамени технологического илетитута пищевой промышленности, Волоколамское шоссе, II.

С дисоертадаей можно ознакомитьоя в библиотеке института.

Автореферат разослан " _ Х982 г.

УчеяиЭ секретарь Специализированного Совета доцент

АГАПОВА Б.В.

' _Актуальнооть тема. В решения* ХХУ1 съезда КПСС и иайокого 1982 г. Пленума ЦК НПОС поставлена задача. шире ко пользовать ферментативные процессы в пищевой промышленности. Получение Фруктоз о-глвкоэтх ояропов из. гидролазатов растительного крахмала явдяетоя одним из наиболее перспективных ферментативных процес- ■ оов> промышленное освоение которого обеспечит'пищаву» промвален-я0стьвнсококачест5внншпродуятш,полноценншзшеш1телем сахарозы и инвертного сахара. Ферментативная изомеризация глюкозы, полученной при гидролизе крахмала,в смесь фруктозы и глюкозы осуществляется ферментом глюкозоазомеразой. Б настоящее „время промышленное получаете глюяозоЕзомерззы за рубежом основано на применения продуцентов, синтезирующих внутриклеточный фермент* Использование микроорганизмов, накапливающих внеклеточную глюкозсизоые-разу, позволит снизить затраты на получение препаратов; фермента за счет исключения из технологического* процесса стадии выделения , глюкоэоизомераэы из клеток продуцента, что приведет к оннхенню-, себестоимости фруктозо-глюкоэного сиропа.

Цель работы. Выявление активного продуцента внеклеточной глюкозоизомеразы и разработка опоооба получения внеклеточного фермента. ^ 4

О^довные задачи.!. Поиск активного продуцента внеклеточной . гдлдоэоиаомераэы и его селекция о целью увеличения внеклеточной биоевнтетнчеокойопоообнооти.

2. Оптимизация процесса культивирования продуцента о целы» повышения биосинтеза внеклеточной глюкозоизоыеравы*

3. Получение очищенного препарата внеклеточной глюкозоизомеразы! изучение некоторых свойотв фермента л определение оптимальных условии проведения ферментативной изомеризация глюкозы ч во фруктозу* '

' Научная новизна» Выявлена споообнооть микроорганизмов вид« ЛхърЬопъфАЬ иигыилд накапливать внеклеточную глюкозоазомераву на ранних отадаях роста (до фазы замедления роста)» при культивировании но жидкой питательной среде о ксилозой*

Выявлена четыре штамма, обладающие повышенаой опоообноотью к накоплению внеклеточной глюкозоивсиеравы* 4.о&*т>:жм»1з (ВКЫ А-635), 18 (ВКИ А-696), 105 '

(ВКЫ А-663) ж 97 (ВКМ А-687).

Показана эффективность селекции микроорганизмов вида ЛглрЪэ туило&щьища целью вовваения-биосинтеза внеклеточной глюкозо-иаоыеразы, в результате »[ОТОРОД Л™ГГ»»» цутяятя»р итяму г\ototrtb-

РГАУ-МСХА нмочн К.А. Тимирязева ь^ени Н.И. Железыова Фонд кау^ыйдитер^тхры

13-4 (ВЙМ А-815), высокоакташай продуцент внеклеточной .гяюкоэоизоыеразы. . V '

Выявлено регулирующее действие глицина и хлорида натрия* на соотношение внутриклеточной и внеклеточной глюкозоизомерав-Г

ной аЛТИВНОСТИ ДУЛЬТУрЫ 3. оСсО-0С£и*> 13-4, .

Выявлено увеличение биосинтеза внеклеточной глвкозонзоме-рааыитаммом 3. оСиг^еи*^ 13-4 при смене источника углерода ■(глюкоза яа ксилозу) в процессе культивирования.

□оказана возможность активации внеклеточное глюкозоиэоме-разы из штамма 3. 13-4, путем термообработки.

Предложено использование двухстадийного гидролиэата кси-ланоодержащего сырья в качестве источника углерода для культивирования продуцентов глюкозоизомеразы.

„Практическая ценность. Получен штамм 3. 13-4 *

оптимизированы условия его культивирования, обеспечивающие био-оинтез внеклеточной глюкозоизомеразы, презышавдии в 4...5 раз уровень накопления внеклеточного фермента патентуемыми штаммами иооответствущий уровню накопления внутриклеточной глюкозонзо-меразы для аналогичных вариантов культивирования сатеятируемнх продуцентов, что позволит снизить затраты на получение глюкозоизомеразы за.счет исключения из технологического процесса ота-дви выделения фермента из клеток.

Определены оптиыалыше условия проведения изомеризации глюкозы во фруктозу с помощьо внеклеточное глшюэонзомаразн из шгаюш о&^ссх-ь 13.4 и получена 42-процентная степень изомеризации глюкозы, что указывает на принципиальную возможность-использования препарата внеклеточного фермента для получения Фруктозо-глюкозногосироиа.

Подобраны две питательные среды а разработан.споооб получения питательных сред для культивирования продуцентов глюкозо-жзомеразн, обеспечивающий повышенный биосинтез фегыента.

Разработан способ получения жидкого очищенного препарата внеклеточной глюкозоизомеразы и определены условия его 0"тява-кии.

Модифицирована методика определеввя глюкоэоизвдеразной активности и даны рекомендация по определения яниетачеоких констант фермента. . -

Публикации* По теме диссертации опубликованы два печатные работы и получены 3 положительные решения ва выдачу авторского свидетельства.

.. ' Внедрение. Результаты работы проверены я подтверждены в' опвтно-проышаленных условиях на Московском опытном заводе фер~' • ментяыг препаратов. " " ■ ■ ■

Объем -работы. Диссертация состоит из введения, 17 глав а выводов, содержит^ охравиц печатного текста, 19 рисунков, 19 таблиц, спасок литературы из 135 названий я приложение.

Обзор литерзттры.В обзоре литературы рассмотрена н;проанализирована процесса микробиологического синтеза и применения глю-козонзомеуазы, а также свойства фермента,

ОБЪЕКТЫ И МЕТОД! ИССЛЕДОВАНИЯ

' При поиске активных продуцентов внеклеточной 1.Л)козонэои9-разв исследовались микроорганизмы рода ЭНгр+отумь . из „коллекция актиношцетов отдела . "Систематика и физиология активошщетсв* Института микробиология АН СССР в мутанты, полученные в результате оелекщш штаммов наиболее активных продуцентов внеклеточноЗ гло-коэоизомеразы. , '

В работе также исследовалиоь свойства внеклеточной глокоэо-изомераДы, синтезируемой штаммом о&*клош4 13-4, овязонные о проявлением ее ферментативной активности.

Активность фермента глюкозоизшеразы определяли по методике, разработанной на основе цнотеин-карбазольного метода определения фруктозы (©¿«Яс , /¡съег^'и^+ъ-еС ,1951).

За единицу глвкозоизоыеразной активности (1МЕ) принимали количество феряеата, катализирующего изомеризацию I мкмоля гдю- .! козы'в I мккольфруктозы за I канут? при концентрациях« глюкоза -1,0 М ковов М с - 0,01 фосфатного буфера - 0/0? и, темое-ратуре 70°С, рН среды 7,0 и времени изомеризация 30 минут. В случае изменения условия определения ферментативной активности ее * выражали в модышх образовавшейся фруктоза за X минуту. Балок '■'■■■■. определяли методой Лоурк и спёктрофотоыетрическим методом (Кочетов, 1980). . 1 . ■ , ... ;. ' РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Фермент глюкозоязшераэа^по месту локализации клаоси$ацж~ руется как внутриклеточный (Гервет, Егоров, 19Э2) ■ накоплен!« -внеклеточной глояозолзшэрезы связывается о лизиоом клеток, со- ; держащихвнутриклеточный фермент (Газристо»,1979Ц яла о образованием особой секреторной формы глхжоэоиззмеразн {Щуотрова л др., .1978). В большинстве публикаций7»тот вопрос.вообще не обсуждается» ■ только в двух патентна! (^л^-^Ч а.

197II иГеХч. ,1974) предлагается три штакма рода

э

обладайте способностью накашлвагь внеклеточную глюкозоиво-i ыераэу в количестве 60...75$ от общего содержания ферменте в хультуральной жидкости.

Учитывая эти данные/а также результаты предварительных исследований, проведенных оа кафедре ."Технология микроОиоло- . гичеоких производств" Московского технологияеекого инотитута пищевой промышленности, в данной работе исследовалась споооб- * нооть синтезировать внеклеточную глюкозоиэ ом ераэуу микроорганизмов рода dLttftenytij,

ПОЛУЧЕНИЕ АКТИВНОГО ПРОДУЦЕНТА ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ГЛШОЗСИЗСШРАЗЫ (рло.1).

У^^у^ениэ способности ммнроорганиэмов рода ■átfjtftiom^ сч _син^еэпров8ть вн0клеточвур.,гл»5озоизомерезу ,

При поиске активного продуцента внеклеточной глопозоязо-иеразы било исследовано 62 культура отрептомицетов, ферментационное культивирование которых проводили на питательной среде состава (Í); яоилоэа - 1,0, пептон - 1,0, дрожжевой экстракт -1,0, К^НРО^ЗН^О - 0,3, U^,S04 . 7Н20 - ОД {контрольная среда). В результате проведенных экспериментов било отобрано 4 штамма ( <lo£wvt^ui 13, •ó.jplC^vitMilQ, -d.cUiu* 97, и с*Ш 105), накапливающие внеклеточный фермент в количестве -более 1,0 1ИВ на ил культуральноЯ жлдкоота. Сравнительное изучение этих продуцентов (рис.2) позволило выбрать штамм xS-oU-wl-СШ4 13, который синтезировал наибольшее количество внеклеточной глюкозоизомеразы. 'V

Проведенные исследования показала способность микроорганизмов вода <f.0&-tfDC£¿ttj накапливать внеклеточную глюкозо-иэомеразу к 24...48 часу культивирования в.количестве до 20... 405, а к 72...96 часу до 50...75Í от общего содержания фермента в культуральной жидкости, Выход глюкозоизомераэы аз клеток, когда.культура находится в отадин интенсивного роста к биоока-теза фермента (24...48 час), трудно объяснить лизисом клеток. Основываясь на результате работ, проведенных в Мооковокон технологическом институте пищевой промышленности (Гавристов, 1979)« показавших, что возможным местом локализации глюкозоизомеразы является район клеточной стемчи отрептомицетов,;можно полагать, что условия Ферментационного культивирования продуцента . (высокий коэффициент активности воды а интенсивное перемеаш-ваше) способствуют выходу фермента из клеток. Естественное

1 - исоледоэаво .62 штамма - выявлена •

4 (1ИА > 1,0 1ИЕД(л;к.«.).

' С, - сравнение вшвленнык ттшыов - отобран .

штамм оСбьцсси'ь 1Э(Ш«3,ГГИБ/к1.к.ж.)*

селекция штамма оби-асеи$ 13 -солу-чен21мутантныПштама, , - '

17.-наследован 21 мутант - отобраны

5 (ЕИА > 4,5 ЩВЛл-к.х.). .

У.-сравнение отобранных мутантов - выбрав штамм 5. (ГИЛ ДО 6,5

ГИВДл.я.ж.),

Л.-начатаселекцдя штамма ,5.

21

X п •' Ш • 1У У ■ я

РнсЛ.Получанле активного продуцента внеклеточной глшоэоизомераав.

место обитания отрептомяцето! •• почва (о условиями роста, резко 'отличаюсущися от лабораторного выращивания)) в которой глюкозо-изшераза колет нормально функционировать (например участвовать в метаболизме углеводов клеточной стенки) без выхода во внешнею среду.

' Селекция штамма 13 ' _

С целью увеличения биосинтеза внеклеточной глюкозоизомеразн штамм ^.оСигеиелль 13 был подвергнут селексдиГ в результате которой был получен 21 мутантный штамм. Ферментационное яулыивирова-■ нив получении! мутантов проводили на контрольной питательной среде, в которую вносили 0,5$ сорбита. В результате проведенных экспериментов были отобраны-5 штаммов, синтезирующих к 72 часу выращивания более 4,5 ГИБ внеклеточного фермента на мл культу-ральной жидкости. Сравнительный анализ этих штаммов позволил в -качестве основного продуцента внеклеточной глюкозоизомеразн вя- : брать штамм <}. 13-4, обладающий наиболее высоким био-

синтезом внеклеточного фермента (до 6,5 ШЗАл культуральвой «адкооти). Этот уровень внеклеточной активности превосходит в 2...3 раза баоскнтетическую способность патентуемых продуцентов внеклеточной глюкозоизомеразн. . '

Проведенные эксперименты показала эффективность селекции микроорганизмов вида •ло&иххльиА (селекция штамм« ¿.оСьитющкя . позволила получить мутант, синт&знрувдий в 1,5 раза больше внеклеточной глпкозоизомеразы, чем исходный штамм) и предполагают продолжение работ в этом направлении.

ШТШ13АЩЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА <1оИиГУСггУЬ 13-4

- Хранение в получение посевного

материала ~ -

Исследование процессов хранениями получение спорового и вегетативного посевных материалов культуры о£Смясы*4 13-4 позволило подобрать уолорня проведения этих микробиологических отадий (таблЛ), обеспечивающие вноокей" воспроизводимый бко- . синтез внеклеточной глюкозоиземеразы при ферментационном культивировании, которое проводилось на питательной среде, содержащей индуктор биооинтеза фермента - ксилозу. В этой связи вызывает внтерео увеличение биосинтеза внеклеточной глюкозоизо-

2 Дивамета «авоитеямя глгаювовэомервм s poo* Окоиаовм

жуяъггрг I- s. otUecMb 13, 2- S. eff——o- 18,

' 4- S. ¿¿¿i^Kïu-i 105: а-ввакдвтэтво!, 0-вяутршг«топт»о|, - г-обяв1, д-cyxol бяоыаооы /ГИЛ дана в ГИР/м *змгьтур«**Л*./.

церагв при проведении стадии получения спорового н вегетативного

досевяих материалов на средах, содержащих в качестве источника

углерода глюкозу. Возможно данный эффект овлзан о активацией «е-

таболизма клетки продуцента оря использовании в начестваоубстра-

та ГЛЮ1ГОЗИ, для окончательного объяснения которого требуется до-;

волнительные эксперименты. '- ' , ,

Таблица I

Условия хранения н получения посевного материала культур«

ЧУтйдиЛ. Голойи^ ¿ранение культуры "Получеайй сосав«ого материала

спорового вегетативного

Треда Агарнзованвая овсяно-дроххе- вая ¿гаризованаая СР I о глюкозой £ядкая, оостава «)! * глвиоэа-1,0, пептон-1,0 дрожжевой эястракт-1,0 к2нро4.зн2о-о,з, ы,;о4 7Н20-0,1.

бремя 12... 15 месяцев 10...14 суток 32...48 часов (до оодер ханая влажной бяоиаосн-0,150. ..0,175 г/^л'куль- тур;1шдк)*^ л

Гвмпвра-тура °С б..«8 23 30 £ ( V

Аэрация Естественная Естественная 1220 мг поглощенного кислорода/л.ч. V -"

т/ Для стандартизации процзоса получения вегетатдвкого пооеввого иятериала изучаемых культур было предложено характеризовать;его непременен выращивания (воэраот посевного материала), а содержа-кнеы биомассы в культуральнбй жидкости <9 г влажной биомассы на ил культуральнов жидкости). Воспроизводимый высокий биосиатев внеклеточной глвкозоизомеразы ттешоы 13-4 наблгдался про концентрация влажной биомассы в вегетативном посевном материале 0,150...0,175 г/к», что обычно имело меото к 36...48 часу вмра-оившшя, но иногда задерживалось до 43...60 часов.

в

Влияние некоторых компонентов питательной оре.ш на биосинтез ■* глюкозоиз оме разы штаммом S. о^^щщ. 13-4*

Исследование влияния некоторых источников углерода не биосинтез внеклеточное глюнозоизоыеразы штаммом S. , 13-4 показало, что он наблюдается в присутствии ксилозы» сорбита в . ксилита, а максимальное накопление фермента происходит при со- ' выестасы внеоении в питательную ореду ксилоза а сорбита. Использованиедругих источников углерода не индуцировало синтеза глю-лозоизомеразы, что согласуется о результатами исследований дру-т гих микроорганизмов родаShept*ñyees (7áéo¿oA¿ , 1974, JTíy* в-Ш » Itine »Koiumi в др.>1981).

Иадукцню биосинтеза глюкозоизомеразы ДО- яоилозо-кетолязо-.меразы) ксилозой можно в некоторой степени связать с тем, что в почве - месте обитания стрептомицетов, ксилан (полимер кон. лозы) присутствует в значительных количеотзах, и который может расцепляться до ксилозы и её олигомеров кспланазаыи, синтезируемыми стрептокдцвтамя или другими* микроорганизмами. .

С целью снижения отоиыости питательной среди для культивирования продуцентов гдокозонэомеразы в качестве источника коило-. вы был подобран гидролизат кукурузных кочерыжек; источника азота кислотный гидролизат кормовых дрожжей и мочевина. '

В результате проведенных но следований* был определен качественный состав двух питательных сред: Среда I - оостава: гидро-лизат кукурузных кочерыжек, кислотные гидролизат хорыоках дрожжей, мочевина, калий фосфорно-кполый двухземеценный а магний -сернокислый, которая получила нааваиие "гидролиаатная среда". : Среда 2 - состава: хокдоза, сорбят., пептон, дрожжевой экстракт, мочевина, калий фосфорно-хислый двухзаыещекный я магний еврно-молый ("среда в ксилозой и оорбитсм"). Среда 2 обеспечивает, больший биосинтез глпкозоизонеразы, но имеет более ввоояув стоимость.

. Разработке нового ороооба приготовления питательной ■. : , спела для ктльтиви'рования продуиентов .улгяозоа^<^вра^ц.

С цельо повышения биосинтеза глвкозокэоыерааы был разработан новый способ приготовления питательной среды, основанный нж проведении двухстадийного (щелочного и кислотного) гидролиза коилавсодержааего сырья. (Проведение дополнительного пехочного гидролиза позволяет отщепить от коплена группы, связанные о етм-оложноэфкрной связьв).

, Применение в питательной орэде двумтадийного гидролизата , ксилансодерхащего сырья позволило повысить биосинтез, глюкоэоизо- .. мерезы отрептомицетеми в 1,21...1,36 раза по сравнению о исполь-аованием киолотного гидролизата.-

Оптимизация условий проведения двухотадийного гидролиза -кукурузных кочерыжек позволила подобрать такие условня его проведения (щелочный гидролиз: концентрация -УаОН 90...100°С, время - 60 минут} кислотный:гидролиз; концентрация серной кислоты - 0,?7£, давдение-0,03.ша, время - 36 минут), обеспечивающие повышение биосинтезе внеклеточной глюкозоизомеразы штаммом 13-4 в 1,5 раза по сравнению с первоначальном*

Оптимизация .^ерментапион^уо .цудьтивиоовання штамма З.обсег&сещ 13-4

Выявление Факторов, влиявших на бизоинтез. внеклеточной' ■ глюкозоизомеразы. Исследования, свяэаавье с поиском продуцента, внеклеточной глюкозоизомеразы и подбором питательной оредн для культивирования вташа X о&оФеи** 13-4,.выявило, что на бмо-оиятез внеклеточной глюкозоизомеразы оказывает влияние концентра- . цня источника углерода,концентрация иоточняка органичеокого; : азота и время культивирования. Дальнейшее изучение.этого вопроса показало, что на биосинтез внеклеточного фермента также влияют концентрации сульфата магния в мочевины, рН питательной среды,. " аэрация, доза посевного материала (рио.З). '

Оптимизация процеосдфермдн^адиррного ктльтавировария на рятательной ореде I ("гидооли^атная среда"). Проведенные эксперименты по выявлению факторов, влияющих на биосинтез вивклеточ--ной глюкозоизомеразы, позволили аффективно перейти к оптимиза- • сии стадии ферментационного культивирования на "гидролизатной питательной среде". Оптимизацию проводили о помощью ДОЭ в котором иоследовалооь оовмеотное влияние на биооните8 внекле-' точного фермента штаммом обсмей*! 13-4 оеми факторов % 1} концентраций: двухотадийного гидролизата кукурузных кочерыжек - Хр кислотного гидролиз о тя кормовых дрожжей -12» мбче-вины магния сернокислого - Хс, 2) физико-химичеоких условий культивирования: - питательной среды - Хд и объем питательной среды (аэрация) - Ху и 3) время культивирования -На ооковакяя проведенного многофакторного эксперимента было получено уравнение регрессии (I).

Рто.З Влжяняе веиоторих фахторо» ва бяосжят«» ввешсеточиа* глтасэокомерагы штатом сЛ^аи^ 13-4: - а-ковцентрацжя хоисовеятсгв питательно! среда: 1-«очв«жвл, г-К^РС^ ЗН20, ТН^О; <$-ойъем пггателъвой среда;

г-доаа посевного иатериала; д-рН питательной среди. . Дй1 дана в ГМУил игльтураяьвой «пявост*/

t У (Ш) « 4,29 + 0,26 ÎT + 0,24 Xo - 0,31 ХЛ. + 0,28 XrX> f ♦ 0,29 ♦ 0,27 Xg^ (I). • "

Далее были проведены крутое восхождение и исследование . динамики накопления внеклеточной глюкозоизомеразм в коничеоких колбах на 750м« , s в результате определены условия культивирования штамма us 13-4 (Xj. 3,2s, Xg « 1,0*, 7,25, I4- 0,2%, Цш 0,115%, îg» 84 ч, Xy - 50-iXJ^n, K^P0r3H2(M),®ef круговая качалка - 180 обЛшк), обеспечивающие повышение биосинтеза внеклеточной глюкозоизомеразн в 1,4 раза по сравнению о центром ДФЭ 27-2.

Проведенная оптимизация процесса ферюнтацконного культивирования штамма 13-4 показала целесообразность совместного исследования воех факторов, влияющих на биосинтез ' фермента, включая физико-химические условия ж время культам-. ' рования. Такая постановка многофакторного вксиеримэнта позволяет полно исследовать процесс к аффективно перэйтя к разработке промышленного варианта культивирования.

Оптимизации Фермднтдцядндо^д.ктльтивпрования на питательной opyte 2 ("среда^нси^озоЦ.д сорбитом"). Учитывая, что промышленное культивирование продуцентов глюкозоизамеразн проводится на средах, содержащих ксилозу, глюкозу, дрожжевой экстракт п др.дорогостоящие компоненты, в данной работе была проведена оптимизация ферментационного культивирования штампа •J, (¡¿¿пылил 13-4 на "орсде с ксилозой и сорбитом", на кото- . рой в предварительных экспериментах получена наибольшая внеклеточная глпкоэокгомераэкая ахтквнооть. Вначале исследовалось совместное влияние но биосинтез внеклеточной глюкозоиэоыеравн четырех факторов^ концентрации сорбита - Xj, ксилозы - Xgt органического всючника азота (пептон + дрожжевой вкотракт) Х3 s доза посевного материала - Х4 о помощью ПФЭ 24 я рассчитано уравнение регрессии (2).

у (m) « 6,36 - 0,21 2t 0,18 Ig- 1,19 % + 0,31 Xjfo + : ^»ЗЭ ^4 0,2? I2I4 i!) ~ л

В результате дальнейшей оптимизации удалось повысить б*о-оМтвв внеклеточного фермента в 1,1 раза. Xj» 0,44£, 7.^-1,(Л, ' Хд» 0,8 ♦ 0.BÏ, Хд« 8,Ût, рП среды'- 6,8, остальные параметры имеют величину как при культивировании на среде I.

л Биосинтез внеклаточнойглюкоэоизсмеразы штаммом ¿.оИ^а-шм I 13-4 был повышен до 8,0...9,0 ГИЕДщ культур.жвдк., что пр'евоо-.ходит знеалеточнус баосннте таческую сооообность патентуемых штаммов в 4...5 раз и соответствует биосинтезу внутриклеточной гдпкозонзомераэы при аналогичных вариантах культивирования па-• тентуемых штаммов.

• ПОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННОГО ПРЕПАРАТА ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ГПШОЗО-ИЗСМЕРАЗа ИЗ ШТАММА ¿t-UftcrruftM oli+ЯьсиЦ J3-4

. Изучение:возмохноста получения очищенного.препарата внеклеточной глвкозоиэомвразы из штамма 13-4 позволило предложить схему получения:ходкого очищенного препарата внеклеточной глюкозоизомеразы. На первой втапе натавннй раот-вор, полученный после отделения биомассы центрифугированием, фракционировался сульфатом аммония (отбиралась фракция, ооах-даемая пря донцентрацка ооли 30...50i от макоимального насызе-' яая), получеяяый осадоя раогвор^адв фосфотяса ЗуФере и прогревали при ?0°С в течение 10 икнут. Осадок» полученный после термообработки, отдаляли центрифугированием. Приведенная схема. обеопечввала степень очноткж глокозоизомерази в 25.; ;35 риЗ, 2 эависимоотя от используемой питательной среда,-при выходе ферт иеитатявнойактивнооти78...Э2£.

, ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ ВНЕЩТРЧНОИ ЩШО^О-ИЗОМКГАЗЫ ИЗ ШТАММА <ЗЫрЬ>пхуш ob-trtbCcuA 13-4.

Изучение свойств внеклеточной глюноэоазомеразы аз штамма 13-4 показало, что фермент в наибольшей степени активируется ионами а Со2*{активность в присутствии ионов I0W, а Со2- 60/, а совместное внесение этих активаторов приводило к дополнительной активации глюяозоазомеразв на Эти-данные согласуются о предположением о' независимости активации глвкозоиэомвразы ионамиЫ}.^ и Сffi*ЫотЖмс,, фп&р ,1975). Оптимшьные ков ца и тра ади^э тих активаторов составила для ионов . tlg?V0,0I ¡4, а ионов Со2+ - 0,0001 К (ряо.4).

Изучение влияния рН на свойства глокозоизомераэы выявило, что фермент наиболее активен в интервале рЯ б,8...7,2 (рас.4).

Исследование влияния температуры на ферментативную изомеризацию глюкозы во фруктозу проводили при различной длительности процесса. Было показано, что для времени изомеризации 10,

30 в 300 мянут ыакокмальное образование фруктозы наблюдается-оря температуре 75,70 и. 60°С и в »той непоследовательности уменьшается удельная активность, црегарата глювозоюомеразн , (ряс.4). Это говорит о ток, что при длительном проведении процесса необходимо уделить особое внимание температурному режиму. Исследование возможности стабилизации жидкого препарате глвко-зоизомервэы во время термообработки при 70°С пркеэало, что иона кобальта, оошмо дополнительной активации глюкозонэомераэы значительно стабилизируют фермент, поэтому можно рекомендовать их иопользовагие в процессе получения фруктозо-гдюкозного сиропа из глркозы (несмотря на дополнительные затрата, связанные о удалением ионов Со из получаемого сиропа), где первостепенное значение нмепт отабильнооть и активность глшоэоизоывразн.

Надо отметить тэт факт, что при изучении биосинтеза глп-хоеоизомерззы атаимом 5. сСс+еии^ 13-4 Ферментативная активность определялась* без добавления ионов Со2*(учитнваятокоиче-оное дейотвяе на организм.человека высоких концентраций ионов кобальта, первоначально было решено отказаться от жх использования в процесое вэснедозацяи глюкозы во Фруктозу), поэтому внеклеточная глюяозоиземеразная активность культура -

13-4 - 8,0...Э,0 ГИЕЛя культуральвой жидкости в случае использования конов Со й М<(г+ /глююаоизомеразяая активность патентуемых продуцентов определяется в присутствии ионов И}^* я Со2+ , 1370)/ возрастает на 40£.

В-процессе исследования бела показана возможное» активация жидкого препарата внеклеточной пгокозоиэсмвразы на 10...20$ посредством термообработки.в присутствии глюкозы и гонов Мд^и Со2 . Это может иметь большое значение в случае однократного не продолжи тельного применения жидкого препарата глвкозоизшеразы (одновременно или после действия даилоштичесивх препаратов) в хлебопечении влк коадатероком производстве двд увеличения сда-досги некоторых продуктов, оодержаяк краяд&л а глюкозу а пра-готовляекых пр& повышенной температура*

Исследование влияния концентрации глюкозы на начальную скорость ферментативной рвакцди позволило определить омзшаль-нув .ковцвнтратп» гпзкоэу 1,0»,.2,о И,константу Нихавлиса, хооа» дуемой гдвкоэоизомеразн Кт*0,1ИН (ряо.4).

ГИЛ

рве. 4 Вккянве вехоторнх факторов на аэтжввооть вво«лвтсч«о1. гхгаавожзоиеразн штамма 5. oC¿+ecx*S) 13-41 а-коговвтрацн» гляяояв^ 6-рН среди, в-твмпературн зря времен! реакцп: 1-10 ыж», 2-30 mih, 3-300 uni, г-вопцвитроют «офввторо».

/ТйА дава в юшешпе обрв»овавпе1оя фружтовм м ! un ва мг бела/

ПОЛУЧЕНИЕ ФРУКТШО-ГЛШОЗНОГО СИРСОА • ,

С ПОМОЩЬЮ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ГЛШОЗСИЗСМЕРАЗЫ '*

В работэбыла наследована возможность получения фруктозо- " 1 глвкозного сиропа с помощью жидкого очищенного препарата внеклеточной глпяозоизокеразы из штамма •ó.o&Unx'CLUá 13-4. Про* цесо проводили при температуре 60°С при-концевтращш глюкозы 1,6Мв присутствии ионов Со * и Mg?*. Использование препарата о активность» 45 ГИЕ/мл. позволило к 7 часу проведения'реакции получить 42-процеатнуо степень изомеризации. Проведенный вкспе-римент указал непринципиальную возможность использования внеклеточной глюкозоизомерезв из штамма 13-4 для про" изводства фруитозо-глюкозного оиропа, отвечающего промышленным требованиям. ■ В Ы В О Д Ы

1. Выявлено свойство мякрооргаяаэков вида <$.о&м?ь<лллЬ при культивировании на жидкой питательной среде, содержащей; ксилозу, накапливать внеклеточную глюкозоиэоыеразу и найдеаа -. четыре ектквпых продуцента внеклеточной глюкозоизомеразн. На; штамм , d. olivo^cccci 13 получено положительное решение о выдача авторского свидетельства СССР.

2. Показана эффективность селекции штамма -4.о&лт>шл&1ъ ' • о цель» повышения биосинтеза внеклеточной глскозоиэомераэы и-

\ получен более еятввний штамм •d.oUvvbUUó 13-4» который по биооивтетичесяоа способности в 2...Э раза превосходит патентуемые продуценты внематочного фермента. На »тот штамм подучено -положнтел&поз решение о выдачз авторского свидетельства СССР.

. 3. Подобраны условия хранения и получения спорового'и ' вегетативного посевных материалов культуры ■¿.оПлтягШАб 13-4, обеспечивавшие высокий воспроизводимой биосинтез внеклеточной глояоэоиэоыераэы. :■.-'*!..■ ■

4. Разработан способ получения'питательной среди для куль'. тивированая продуцентов глпкозоиэомерааы, основанный иа даух-;

стадийно« гидролизе (щелочном + кислотном) ксилансодержащего сврья. На этот споообполучено положительное решенже о выдаче . - автэрокого свидетельства СССР* . :' L v "■.■ :

5.-Подобрана питательная среда для культивирования продуцентов глюхозоизоиврзэы состава (?): двухстадиЯныЙ,иифолП8аг ; кукурузных кочерыаек 2,5» квотный гидголязат корковых дрожжей - 1,0, мочевина -0,25> K^HPO^- ЗИ20-0,3 в Uf$Q¿ 7H¿0-0,I; .

обеспечивающая повышенный биосинтез фермента. На ату среду .получено положительное решение о выдаче авторского свидетель- ~ «тве СССР. . . ■ " •

6. Оптимизирован процесс ферментационного культивирования атамма 13-4, в результате которого биосинтез впекла-

.точной глюкозоизоыеразы повышен до 8,0...9,0 ТШ/ил культур.жидя,, что. соответствует накоплении глюяоз онз он ераэ ы при аналогичных вариантах культивирования патентуемых продуцентов внутриклеточного фермента. •

7. Разработан способ получения жидкого препарата внеклеточной глюкозоизомеразы, включающий фракционирование сульфатом аммония и термообработку,и показана возможность активации препарата путем термообработки.

в. Иоследованн некоторые свойства глюкозоиэомеразн и определены оптимальные условия проведения реакции изомеризации глюкозы во Фруктозу. ' -

9. Показала возможность получения фру ктоз о-глшоз ног о сиропа^ оо степенью изомеризации 42-лроцента. с помощью жидкого препарата внеклеточной глюкозоизомеразы. ."

10'. Модифицирован способ определения глюкоз ояз ом зраз ной актив ностн ж даны методические рекомендации для определения кинетических констант глшозоизомеразы и сделаны некоторые предполоиевая, связанные о возможным механизмом действия фермента.

Материалы диссертации опубликованы в работах!

1. Влияние кофакторов на свойства внеклеточной глпкозоизо-меразы из штамма ^<¡1 % в (соавт.И.А.Попадач, Ы.С.Мосячев).- В реф.сб. "Микробиологическая промышленность", 6» 1932.

2. Влияние некоторых физико-химичвоких факторов на свойства внеклеточной глюкозояэомерааы из штамма Лм^/нуем дд . Осоавт. И.А.Поладич).- В реф.сб. "Микробиологическая промышленность", б, 1982.

3. Положительное решение по заявке к 3276786/13 на выдачу авторского свидетельства СССР» 1982, "Штамм -¿Ь-и^Л-отусц о'И*^ 13 - продуцент внеклеточной глюкозоизомеразы" (ооавт.В*Д.Кузнецов, И.А.Попадич, ИЛ1.Грачева, М.С.Моснчев, А.В.Гавриотов). .

.4. Положительное решение по заявке к 3358874/23-13 ва ввдачу авторского свидетельства СССР, 1982,"Питательная среда ждя культивирования продуцентов гдажозожзоивразн и способ ее ' получения"(соавт.М.С.Мооичев, И.А.Иопадич, H.H.Грачева, В.Т.Л&- _ буиюша, В.Д.Кузнецов).

5. Положительна? решение по заявке X 342125? на выдачу авторского свидетельства СССР, 1962, "Штаны àtttpt*n%yu4 +Utra. c*u4 13-4 - - продуцент внеклеточной глюкозоиешеравн" (ооввт. ».Д.Кувивцов, 11.СМ1осичав, Й.А.Попадич, И.И.Грачева),

3a**~ 32-JKH Tap. 100 .

AxsAeMtui MexronHCKHx najK CCCP