автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии бактериального концентрата для производства пробиотической сметаны

005531250

На правах рукописи

ХАЗАГАЕВА СОФЬЯ НИКОЛАЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОБИОТИЧЕСКОЙ СМЕТАНЫ

Специальность: 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

- ИЮЛ ¿013

Улан-Удэ - 2013

005531250

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (ВСГУТУ)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Хамагаева Ирина Сергеевна

Официальные оппоненты:

Жамсаранова Сэсэгма Дашиевна,

доктор биологических наук, профессор кафедры «Биоорганическая и пищевая химия» ВСГУТУ

Занданова Туяна Нимбуевна,

кандидат технических наук, доцент кафедры специальных дисциплин Бурятского филиала НОУ ВПО «Сибирский университет потребительской кооперации»

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р. Филиппова» (г. Улан-Удэ)

Защита диссертации состоится «28» июня 2013 г в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.039.05 при ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» по адресу: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40в, ауд. 8-124.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСГУТУ.

Автореферат разослан « Л мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного С0В6Т&

Столярова Анна Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Производство пробиотических молочных продуктов, сохраняющих стабильные показатели качества при хранении, одна из важнейших задач пищевой промышленности. Интенсивное расширение ассортимента продуктов привело к использованию в технологии пищевых добавок. Для улучшения реологических характеристик и увеличения срока годности применяют стабилизаторы, консерванты и антиоксиданты различного происхождения. Однако до последнего времени не решены все аспекты биобезопасности, возникающие при использовании в производстве продуктов питания пищевых добавок.

В последние годы за рубежом акцентируется внимание на новые стартовые культуры, синтезирующие экзополисахариды, которые являются не только натуральной альтернативой пищевым добавкам, улучшающим реологические показатели пищевых продуктов, но и выступают в роли факторов, способствующих адгезии полезных микроорганизмов на стенках кишечника. Особый интерес к ЭПС-активным культурам пробиотических микроорганизмов обусловлен тем, что на международном уровне молочнокислым и бифидобактери-ям присвоен статус безопасности GRAS (Generally recognized as safe), что подтверждает возможность применения ЭПС-продуцирующих штаммов этих микроорганизмов в производстве безопасных продуктов питания.

Цель работы. Разработка бактериального концентрата для производства пробиотической сметаны.

Для достижения указанной цели были определены следующие задачи:

- исследовать биотехнологический потенциал и подобрать штаммы бифидо, лакто - и пропионовокислых бактерий по производственно-ценным свойствам для составления консорциума микроорганизмов;

- выбрать оптимальное соотношение культур и условия культивирования консорциума;

- исследовать влияние селенита натрия на биосинтез экзополисахари-дов пробиотическими микроорганизмами;

- обосновать технологические параметры получения бактериального концентрата;

- изучить практические аспекты применения замороженного бактериального концентрата.

Научная новизна. С учетом биотехнологического потенциала выбрано оптимальное соотношение культур Bifidobacterium Bifidum 83. Lactococcus lac-tis subsp. Cremoris 244 Propionibacterium Shewianii AC-2503 для создания консорциума пробиотических микроорганизмов, обладающего высокой биохимической активностью и экзополисахаридным потенциалом.

Установлены основные закономерности биосинтеза экзополисахаридов пробиотическими микроорганизмами в зависимости от условий культивирования.

Отмечено, что добавление селенита натрия в питательную среду стимулирует синтез экзополисахаридов и образование микроколоний, что способст-

вует адаптации микроорганизмов к высоким концентрациям селена. Максимальное количество экзополисахаридов отмечено в стационарной фазе роста. Показано, что применение бактериального концентрата улучшает структурно-механические свойства, снижает интенсивность гидролитических и окислительных процессов и повышает хранимоспособность готового продукта

Практическая значимость. Основные результаты исследований нашли практическую реализацию в разработке технологии замороженных концентратов для производства биопродуктов. Разработаны проекты технической документации и проведена опытно-промышленная проверка технологии замороженного бактериального концентрата в условиях малого инновационного предприятия «Бифивит».

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на научных конференциях ВСГУТУ (Улан-Удэ, 2008-2013), II научно-практической конференции «Современные технологии производства продуктов питания. Состояние, проблемы и перспективы развития» (Омск, 2008), II Всероссийской конференции студентов и аспирантов «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово, 2009), XI Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2010), VII Международной научной конференции студентов и аспирантов «Техника и технология пищевых производств» (Могилев, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2010).

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 10 работ, в том числе одна статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора, методической части, результатов эксперимента и их анализа, списка литературы и приложений. Основная часть работы изложена на 128 страницах машинописного текста, включает17 таблиц, 28 рисунков, 2 приложения. Список литературы включает 148 наименований.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Экспериментальная часть исследований проводилась в лабораториях кафедры «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» и малом инновационном предприятии «Бифивит» ВСГУТУ.

Объектами исследований служили чистые культуры пробиотических бактерий: штамм Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii AC-2503, полученный из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (Москва), штаммы бифидобактерий Bifidobacterium longum DK 100. Bifidobacterium bifidum 8;. Bifidobacterium Ion-gum B379M, активизированные уникальным биотехнологическим методом, разработанным в ВСГУТУ и штаммы молочнокислых бактерий Lactococcus ¡actis subsp. cremoris 18П, Lactococcus lactis subsp. cremoris 244. Lactococcus lac-tis subsp. cremoris T-18-20. полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика».

Для культивирования пробиотических микроорганизмов применяли питательную среду на основе осветленной сыворотки с внесением ростовых компонентов, разработанную в ВСГУТУ.

Активную кислотность определяли по ГОСТ Р 53358-2009, титруемую кислотность - ГОСТ Р 54669-2011; перекисное число - ГОСТ Р 51487-99; контаминацию - ГОСТ Р 53430-2009; морфологию клеток бактерий - путем приготовления препаратов, окрашенных метиленовым синим или по Граму с последующим микроскопированием в иммерсионной системе; количественное определение экзополисахаридов -колориметрическим фенол-кислотным методом; рост биомассы фотоколориметрическим методом на спектрофотометре PD-101 APEL при >.=550 нм; адгезивные свойства - по развернутому методу Брилис; количественный учет бифидобактерий и пропионовокислых бактерий - по МУК 4.2.999-00; идентификацию культур при совместном культивировании методом угнетения пропионовокислых бактерий антибиотиком (тетрациклином); количественный учет клеток Lactococcus lactis - на плотной агаризован-ной среде MRS; эффективную вязкость сметаны — на ротационном вискозиметре Brookfield RVDV-II+Pro. В таблицах обсуждаются статистически достоверные различия при р<0,05.

Общая схема проведения эксперимента представлена на рисунке 1.

I

Обработка результатов

Показатели

1. Органолептические показатели.

2. Активная кислотность.

3. Титруемая кислотность.

4. Оптическая плотность.

5. Средний показатель адгезивности.

6. Количество клеток бифидобактерий.

7. Количество клеток лакгобактерий.

8. Количество клеток пропионовокислых бактерий.

9. Концентрация экзополисахаридов (ЭПС)

10. Содержание летучих жирных кислот (ЛЖК).

11. Кислотное число.

12. Перекисное число.

13. Эффективная вязкость.

14. Микроскопический препарат.

15. Показатели безопасности.

16. Контаминация.

Рисунок 1- Схема проведения эксперимента

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование биотехнологического потенциала пробиотических бактерий

На начальном этапе исследований был изучен биотехнологический потенциал пробиотических микроорганизмов. При выборе штаммов учитывали стабильность технологических и функциональных свойств, таких как органо-лептические свойства, способность к накоплению биомассы, способность к образованию вязких сгустков посредством синтеза экзополисахаридов, а также соответствие критериям, предъявляемым к пробиотическим микроорганизмам. По результатам исследований отобраны штаммы Bifidobacterium bifidum 83, Lactococcus lactis subspecies cremoris 244 и Propionibacterium Shermanii AC-2503. Биотехнологический потенциал штаммов пробиотических бактерий, выбранных в консорциум комбинированной закваски, представлен в таблице 1.

Таблица 1 - Биотехнологический потенциал пробиотических микроорганизмов

Показатели Ь.сгетопБ 244 В. bifidum 8, Р^Иегтапп АС-2503

Внешний вид и кон- Однородная Однородная Однородная густая

систенция плотная вязкая в меру жидкая в меру вязкая

Чистый кисломолоч- Чистый нежный, Чистый кислосломо-

Вкус и аромат ный, нежный сли- кисломолочный лочный слегка пряный

вочный привкус

Активность 10-12 12-14 12-14

ферментации, ч

Кислотность,

титруемая, "Т 74±2 67±2 72±2

активная, рН 4,92±0,03 4,98±0,02 4,95±0,01

Титр жизнеспособ- 5*10"

ных клеток, кое/см! 6*10" 4*10'

Рост клеток при

20% желчи + + +

40% желчи ± + ±

4% №С1 ± + +

рН=4,5 + + +

Устойчивость к

фенолу

Продуцирование

экзополисахаридов, 23,8±0.64 7,8±0,12 30,2± 1,04

мкг/см1

Индекс адгезивности 4,28±0.15 4,22±0,21 5,4±0,09

микроорганизма

Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что подобранные культуры синтезируют экзополисахариды и характеризуются высокими адгезивными свойствами. Следует отметить их устойчивость к высоким кон-

центрациям желчи, хлорида натрия, фенола и способность развиваться в среде с низким значением рН.

Установлено, что заквасочные культуры активно ферментируют молоко с образованием сгустков с хорошими органолептическими свойствами. Совокупность полученных результатов показывает, что изученные штаммы обладают высоким потенциалом жизнеспособности в желудочно-кишечном тракте, сохраняя при этом ферментативную активность.

В результате исследований установлено, что подобранные культуры пробиотических микроорганизмов удовлетворяют всем критериям пригодности и являются перспективными для использования в составе комбинированной закваски для производства кисломолочных биопродуктов.

Выбор оптимального соотношения пробиотических микроорганизмов и условий культивирования консорциума

Современные биотехнологические приемы в комплексе с традиционными методами пищевой технологии позволяют разрабатывать уникальные бактериальные концентраты с заданными физиолого-биохимическими свойствами. Одним из перспективных направлений является разработка новых комбинированных препаратов с пробиотическими бактериями разных таксономических групп.

При создании консорциума бифидо-, лакто- и пропионовокислых бактерий необходимо подобрать оптимальные параметры культивирования, при которых будет наблюдаться взаимное стимулирование, сбалансированный рост и стабильное равновесие культур, а также сохранение производственно-ценных свойств каждого представителя микробной ассоциации. Сложность составления консорциума заквасочных культур в данном случае заключается в том, что культуры, составляющие конструкцию закваски, нуждаются в различных температурных оптимумах и обладают неодинаковым темпом размножения. В дальнейших исследованиях оптимальную температуру для совместного культивирования микроорганизмов определяли по удельной скорости роста. Результаты представлены на рисунке 2.

•Р^ЬегшапИ АС 2503

- В.В1'Яаиш 8 3

- ЬСгетопэ 24 4

температура, С

Рисунок 2 - Зависимость удельной скорости роста культур от температуры

Как видно из рисунка 2. при промежуточной температуре 35°С значения удельных скоростей роста изучаемых микроорганизмов приближаются, следо-

вательно, при такой температуре будет наблюдаться равномерное развитие подобранных штаммов в консорциуме.

Оптимальное соотношение микроорганизмов в консорциуме выбирали с учетом сбалансированного роста культур и органолептических показателей сгустков. Полученные результаты отражены в таблице 2.

Таблица 2 - Выбор соотношения культур в комбинированной закваске

Показатели Соотношение В.В1Й(Зит 8з:Ь.Сгетопз 244:Р.311егтапи АС-2503

20:30:50 20:40:40 40:30:30

Консистенция и внешний вид Однородная, вязкая Однородная, вязкая Однородная, в меру вязкая, плотная

Вкус и аромат Чистый, кисломолочный, пряный Чистый, кисломолочный Нежный, чистый, кисломолочный

Активность ферментации, ч 10-12 10-12 10-12

Кислотность,"Т 74-76 74-76 70-72

Титр жизнеспособных клеток, кое/см3 В. ЫПекин 8з 1^.сгетоп5 244 Р. 5Ьегтапп, 3*108 3*109 6*109 8*108 6*109 5*109 5*109 3*10' 4*10"

Содержание ЛЖК, мг/100г 3,2 3,6 3,8

Данные таблицы 2 свидетельствуют, что сбалансированный рост всех микроорганизмов наблюдается при соотношении В.ЕНПёит 83:Ь.Сгетопз 244:Р.8Ьегтапп АС-2503, равном 40:30:30. При этом сгусток характеризуется однородной в меру вязкой консистенцией и высокими органолептическими показателями. О хорошей сочетаемости и прочных симбиотических отношениях свидетельствует высокая плотность популяций культур, которая гарантирует стабильность микробного консорциума.

Подобранные условия культивирования консорциума пробиотических микроорганизмов обеспечивают высокую биохимическую активность и хорошие органолептические показатели комбинированной закваски.

Влияние селенита натрия на биосинтез экзополисахаридов пробиотическими микроорганизмами

Закваски являются основополагающим фактором качества в производстве сметаны. Именно закваски придают продукту большинство характерных особенностей - вязкость, структуру сгустка, консистенцию, аромат, а также определяют стабильность качественных показателей при хранении.

Структура и консистенция кисломолочных продуктов в значительной степени зависят от способности заквасочных культур продуцировать внеклеточные полисахариды.

Согласно литературным данным, синтез и качественный состав экзоме-таболитов бактерий зависят от условий культивирования. Известно, что при культивировании бифидобактерий и пропионовокислых бактерий на питательной среде с добавлением селенита натрия повышается вязкость культуральной жидкости и увеличивается концентрация экзополисахаридов. Что касается лак-тококков, то такая информация в литературе отсутствует.

Поэтому на следующем этапе было изучено влияние различных доз селенита натрия на биосинтез ЭПС пробиотическими микроорганизмами. Результаты исследований представлены на рисунке 3.

45 т---------1

У|=-0,00256*х2+0,26*х+7,8 Я2=99,93 %

У,=-0,002277*хл2+0,25*х+23,657 Я'Г=99,57 %

У,=-0,003098*хл2+0,31*х+30,385 Я2=99,48 %

концентрация селенита натрия, мкг/мл -*-1-6.ЬМит8 3 -»-2-1_.Сгетоп5 24 4 -А-З^^егтап»

Рисунок 3 - Влияние селенита натрия на биосинтез экзополисахаридов

Как видно из данных, представленных на рисунке 3, добавление селенита натрия в питательную среду стимулирует синтез экзополисахаридов. Наибольший прирост экзополисахаридов наблюдается в интервале концентраций селенита натрия от 10 до 30 мкг/см3 Дальнейшее увеличение концентрации селенита до 50 мкг/см3 не приводит к значительному повышению экзополисахаридов. Интересным является тот факт, что повышение концентрации селенита натрия в питательной среде не приводит к задержке роста микроорганизмов, и количество жизнеспособных клеток в конце культивирования составляет (10|о-10") кое/см3. Это свидетельствует о высокой устойчивости микроорганизмов к селениту натрия. Устойчивость к селену бактерий может быть обусловлена наличием ассоциированных с клетками полисахаридов, препятствующих проникновению селена в клетки, которые затем высвобождаются в среду. Из литературных источников известно о защитных биологических функциях ЭПС микроорганизмов, которые играют главную защитную роль, поскольку действуют гораздо быстрее по сравнению с индуцибельными системами защиты.

В результате проведенных исследований выбрана оптимальная доза селенита натрия 30 мкг/см"'. обеспечивающая высокое количество экзополисахаридов и активный рост микроорганизмов.

В дальнейших исследованиях изучали рост биомассы и синтез ЭПС при совместном культивировании В.В'|Пс!ит взХ.СгетопБ 244, и Р.БЬегтапм АС-2503 взятых в соотношении 40:30:30 на питательной среде с добавлением селе-

нита натрия в количестве 30 мкг/см^. Результаты исследований представлены на рисунках 4 и 5.

0 4 8 12 16 20 24

продолжительность культивирования.ч

—•—Оптическая плотность, О.Е.Д. А........ЭПС, мкг/мл

Рисунок 4 - Накопление биомассы и экзополисахаридов

12 16 20 24

продолжителньость культивирования, ч

□ В.ылаит 8 3 ■ иСгетош 24 4

□ РЗЬегтагш

Рисунок 5 - Динамика роста культур комбинированной закваски

Как видно из данных, представленных на рисунке 4, синтез экзополисахаридов культурами комбинированной закваски начинается на ранних стадиях роста и продолжается в течение всего периода культивирования, максимальное количество экзополисахаридов отмечено в стационарной фазе роста и составляет 39,6 мкг/см3.

При совместном культивировании культур В. В1Пёит 83, Ь.Сгетопз 244 и Р. 81тегтапГ1 АС-2503 на питательной среде с селенитом натрия отмечен сбалансированный рост микроорганизмов и количество жизнеспособных клеток через 20 часов культивирования составляет (I О10-101') кое/см^ (рис. 5).

Следует отметить, что экзополисахариды играют важную роль в формировании симбиотических систем. Так. данные, имеющиеся в литературе свидетельствуют о том, что узнавание и первичные контакты симбионтов происходят благодаря взаимодействию полисахаридов клеточной поверхности бактерий, которые обеспечивают высокую адаптационную, физиологическую устойчивость клеток микроорганизмов.

При исследовании морфологии микроорганизмов при различных концентрациях селенита натрия было отмечено, что с увеличением селенита натрия наблюдается скопление клеток (когезия). Такая же динамика характерна и при культивировании консорциума микроорганизмов (рис. 6).

ня

а) среда без селенита натрия

б) среда с селенитом натрия

Рисунок 6 - Микрокартина консорциума пробиотических бактерий

К)

Данные, представленные на рисунке 6, свидетельствуют, что при совместном культивировании микроорганизмов на среде с селенитом натрия образуются микроколонии, что обеспечивает высокую выживаемость при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды. Вероятно, в условиях межклеточных контактов посредством агрегации клетки поддерживают свою жизнедеятельность.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что введение в состав питательной среды селенита натрия позволяет повысить синтез экзополисахаридов и усилить симбиотические взаимоотношения между пробиотическими бактериями, что повышает производственно-ценные свойства консорциума.

Обоснование технологических режимов производства замороженного бактериального концентрата

На основании проведенных экспериментов подобраны оптимальные технологические параметры получения замороженного бактериального концентрата. Технологическая схема представлена на рисунке 7.

| Приготовление питательной среды_

_I_

| Стерилизация питательной среды 1=(121±1 )°С, т=20 мин.

_I_

| Охлаждение Н35±1)°С

1

Приготовление 1% раствора селенита _ Внесение раствора селенита натрия

натрия *

Перемешивание 2-5 мин

1

Приготовление - Внесение инокулята, 5%

инокулята *

Наращивание биомассы, 1=(35± I )"С, т=(20-22) ч с промежуточной нейтрализацией

1

Отделение суспензии клеток от культуральной жидкости (т) = 3000 об/мин, т = 20 мин)

Подготовка защитной среды

- Смешивание биомассы с защитной средой (1:1)

1

Розлив, укупорка, маркировка

__|_

| Замораживание 1=минус 20-22 "С_

_I _

| Хранение, 1=минус 20"С

Рисунок 7 - Технологическая схема производства замороженного бактериального концентрата

Особенностью предлагаемой технологии является внесение свежеприготовленного стерильного 1% раствора селенита натрия в охлажденную питательную среду, в связи с неустойчивостью селенита натрия при длительной стерилизации. В качестве инокулята применяют консорциум В. ВШ<Зит 83, Ь. Сгетог^ 244 и Р. БИегтагш АС-2503 в соотношении 40:30:30.

Для производства замороженных концентрированных заквасок прямого внесения биомассу декантируют для полного отделения культуральной жидкости и смешивают с защитной средой. После смешивания с защитной средой смесь разливают, замораживают и хранят до реализации. Серия проведенных исследований показывает, что после процесса замораживания количество жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов уменьшается незначительно и сохраняется высокая биохимическая активность бактериального концентрата. Это можно объяснить не только действием защитной среды, но и высоким содержанием экзополисахаридов, которые выполняют роль естественных криопротекторов, повышая жизнеспособность клеток. Срок годности замороженного бактериального концентрата составляет 8 месяцев.

Характеристика бактериального концентрата представлена в таблице 3.

Таблица 3 - Качественная характеристика бактериального концентрата

Наименование показателя Значение показателя

Консистенция и внешний вид замороженная суспензия

Цвет от белого до розовато-желтого

Активность бактериального концентрата, ч 12-14

Предельные значения pH 5,5-6,5

Объем замороженного концентрата, мл 5

Температура при выпуске с предприятия, °С, не более минус 20±2

Количество бактерий, кое/см-1, не менее, на конец срока годности: Bifidobacterium Bifidum 83 Propionibacterium Freudenreichii subsp. Shermanii AC-2503 Lactococcus lactis subsp. Cremoris 244 10'° 10'° 10'°

Объем продукта (см3), в котором не допускаются: БГКП (колиформы) S. aureus Патогенные микроорганизмы (в т.ч. сальмонеллы) Дрожжи, кое/см'\ не более Плесени, кое/см3, не более 10 100 100 5 5

Анализ данных таблицы 3 показывает, что бактериальный концентрат обладает высокой биохимической активностью и соответствует требованиям.

предъявляемым к закваскам прямого внесения, и может быть рекомендован для производства сметаны.

Практические аспекты применения бактериального концентрата

Для определения дозы внесения замороженного бактериального концентрата при выработке сметаны была проведена серия опытов по исследованию биохимической активности концентрата. В результате установлено, что один флакон, содержащий 5 мл (5 единиц активности) закваски прямого внесения, способен ферментировать 200 кг сливок за (12-14) ч при температуре 35 С.

Замороженный бактериальный концентрат был применен для ферментации сливок. Качественная характеристика пробиотической сметаны 15%-ной жирности приведена в таблице 4.

Таблица 4 - Качественная характеристика пробиотической сметаны

Наименование показателя Значение показателя

Внешний вид и консистенция Однородная, плотная, густая. Поверхность гладкая, глянцевая

Вкус и запах Чистый, нежный, кисломолочный, с ярко выраженным привкусом пастеризованных сливок

Цвет Белый, с кремовым оттенком, равномерный по всей массе

Массовая доля жира, % 15

Кислотность, °Т 68

Количество жизнеспособных клеток, кое/см В. Bifidum 83 L. Cremoris 244 P. Shermann АС-2503 6*109 6*109 4*109

Объем продукта (cmj), в котором не допускаются: БГКП (колиформы) S. aureus Патогенные микроорганизмы (в т.ч. сальмонеллы) Дрожжи, кое/см^, не более Плесени, кое/см3, не более 0,1 I 25 • 50 50

Как видно из представленных данных, сметана характеризуется хорошими органолептическими показателями и содержит высокое количество жизнеспособных клеток пробиогических бактерий.

Сметана относится к структурированным дисперсным системам. Характерной особенностью сметаны является то. что ее вязкостные свойства претерпевают значительные изменения не только при изменении температуры продукта, но и при изменении градиента скорости сдвига, который имеет место при различных видах механического воздействия на продукт.

Исследования эффективной вязкости разрушенной структуры опытного образца сметаны были проведены на ротационном вискозиметре при температуре 20°С. В качестве контрольного образца использовали сметану, ферментированную бактериальным концентратом без добавления селенита натрия. Результаты представлены на рисунке 8.

-Контроль -Опыт

5 6 7 8 9 10 11 12 Скорость вращения, об/сек

Рисунок 8 - Исследование эффективной вязкости сметаны

Как видно из данных рисунка 8, вязкость опытного образца сметаны на 15% выше, чем в контрольном образце. При увеличении скорости вращения шпинделя и механического воздействия наблюдается снижение эффективной вязкости. В опытном образце сметаны потери вязкости составляют 60,27, в контрольном - 73,87%.

Таким образом, структура опытного образца сметаны более устойчива к механическому воздействию, поэтому консистенция продукта будет в меньшей степени подвержена воздействию технологических факторов.

Исследование гидролитических и окислительных процессов в сметане при хранении

Стойкость пищевого продукта при хранении является показателем высокого качества. Сохранение органолептических показателей, биологической и пищевой ценности в течение определенного периода времени обеспечивает функциональную эффективность пробиотического продукта и его конкурентоспособность. При хранении продуктов, содержащих значительное количество жира, происходит изменение липидов с образованием веществ, снижающих пищевую ценность и диетические качества. Это необходимо учитывать при определении сроков годности сметаны.

Поэтому в следующей серии опытов были исследованы изменения качественных характеристик сметаны при хранении. Образцы сметаны 15%-ной жирности хранили при температуре (4±2)°С. Как известно, превращение молочного жира в основном происходит в результате ферментативного гидролиза и окисления под действием кислорода воздуха. Для определения интенсивности этих процессов в исследуемых образцах были определены значения кислотного и перекисного числа. Результаты представлены на рисунках 9 и 10.

О 5 7 10 14

0 5 7 10 14

Продолжительность хранения, сут В контрольный образец □ опытный образец

Продолжительность ранения, сут в контрольный образец о опытный образец

Рисунок 9 - Изменение кислотного числа при хранении сметаны

Рисунок 10 - Изменение перекисного числа при хранении сметаны

Как видно из данных рисунка 9, в контрольном образце отмечена более высокая скорость образования свободных жирных кислот и перекисей. Значения кислотного числа на начальном этапе в образцах различаются незначительно, так как вначале происходит накопление свободных жирных кислот, формирующих вкус и аромат сметаны. Усиление гидролиза с дальнейшим повышением концентрации свободных жирных кислот приводит к окислению освободившихся ненасыщенных жирных кислот кислородом воздуха с образованием кетонов и альдегидов, ухудшающих органолептические показатели продукта.

Значения перекисного числа в опытном образце ниже, чем в контрольном. Это можно объяснить тем, что в опытном образце сметаны, сохраняется высокое количество жизнеспособных клеток микроорганизмов закваски, обладающих собственным механизмом антиокислительной защиты посредством синтеза ферментов и антиоксидантными свойствами остаточного количества селена. Комплексное воздействие этих факторов приводит к снижению скорости окислительных процессов в опытном образце сметаны (рис. 10).

Совокупность полученных данных свидетельствует, что сметана, выработанная с использованием бактериального концентрата, обладает хорошими органолептическими, реологическими показателями, высоким пробиотическим потенциалом и характеризуется повышенной стойкостью при хранении.

1. В результате проведенных исследований разработана технология замороженного бактериального концентрата для пробиотической сметаны.

2. С учётом биотехнологического потенциала для создания консорциума выбраны штаммы Bifidobacterium Bifidum 83. Lactococcus lactis subspecies Cremoris 24д и Propionibacterium Shermanii AC-2503. обладающие производст-

Выводы

венно-ценными свойствами, соответствующими требованиям технологического процесса производства сметаны.

3. Установлено, что с увеличением концентрации селенита натрия повышается содержание экзополисахаридов, которые являются факторами адаптации пробиотических микроорганизмов. Выбрана оптимальная доза внесения селенита натрия - 30 мкг/см3 питательной среды, при которой отмечены высокая концентрация экзополисахаридов и содержание жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов (Ю'°-10"кое/см3).

4. На основании проведенных исследований обоснованы оптимальные технологические параметры и разработана технологическая схема производства замороженного бактериального концентрата.

5. Установлено, что симбиотический бактериальный концентрат активно ферментирует сливки, сохраняет высокую степень жизнеспособности клеток при замораживании, не теряет биохимическую активность при длительном хранении.

6. Использование бактериального концентрата в производстве сметаны позволяет повысить органолептические и реологические показатели сметаны, снижает интенсивность гидролитических и окислительных процессов, что улучшает хранимоспособность продукта.

7. Опытно-промышленная проверка бактериального концентрата на базе ООО МИП «Бифивит» показала, что он обладает высокой биохимической активностью и соответствует требованиям технической документации. Сметана, выработанная с использованием бактериального концентрата, обладает хорошими органолептическими и реологическими свойствами и длительным сроком хранения.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Хазагаева С.Н. Изучение биотехнологического потенциала новых штаммов бифидобактерий / С.Н. Хазагаева, И.С. Хамагаева // Сб. науч. тр. ВСГТУ. Сер.: Биотехнология. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2008. - С. 29-31.

2. Хамагаева И.С. Исследование адгезивных свойств бифидобактерий / И.С. Хамагаева, С.Н. Хазагаева // Сб. науч. тр. междунар. науч-практ. конф. «Современные технологии производства технологии продуктов питания. Состояние. проблемы и перспективы развития». - Омск: Изд-во ОмГТУ. 2008. - С. 28.

3. Хамагаева И.С. Стрессы и регуляция стрессовых ответов бифидобактерий / И.С. Хамагаева, Н. Чойжилсуренгийн, С.Н. Хазагаева // Сб. науч. тр. ВСГТУ. Сер.: Биотехнология. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2009. - С. 60-64.

4. Хамагаева И.С. Исследование биохимических свойств комбинированной закваски на основе пробиотических бактерий / И.С. Хамагаева, С.Н. Хазагаева // Материалы VII Междунар. конф. студентов и аспирантов «Техника и технология пищевых производств». - Могилёв: Изд-во МГУП. 2010. - С. 68.

5. Хазагаева С.Н. Подбор условий культивирования комбинированной закваски /С.Н. Хазагаева. И.С. Хамагаева // Материалы XI Междунар. конф.

молодых ученых «Пищевая технология и биотехнология». - Казань: Изд-во КГТУ, 2010. - С. 104.

6. Хазагаева С.Н. Разработка технологии бактериального концентрата для пробиотической сметаны / С.Н. Хазагаева, И.С. Хамагаева // Сб. науч. тр. ВСГТУ. Сер.: Биотехнология. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2010. - С. 225-230.

7. Хазагаева С.Н. Бактериальный концентрат для производства пробиотической сметаны / Материалы III Всерос. науч.-практ. конф. «Технология и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности». - Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-т, 2010. - С. 239-242.

8. Хазагаева С.Н. Исследование биохимической активности симбиоти-ческого концентрата / С.Н. Хазагаева, H.A. Фролова // Сб. науч. тр. ВСГТУ. Сер.: Биотехнология. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2011. - С. 36-38 .

9. Хазагаева С.Н. Влияние мультиштаммовой закваски на формирование качества пробиотического продукта / И.С. Хамагаева, С.Н. Хазагаева // Сб. науч. тр. Сер.: Биотехнология. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2011. - С. 32-35.

10. Хазагаева С.Н. Качественная характеристика мультиштаммовой пробиотической закваски / С.Н. Хазагаева, И.С. Хамагаева // Вестник ВСГУТУ. -Улан-Удэ, 2011. - №2 (33). - С. 62-65.

Подписано в печать 24.05.2013 г. Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1.16. Тираж 100 экз. Заказ №169

Издательство ВСГУТУ, 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская. 40в

ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет

технологий и управления»

На правах рукописи

ХАЗАГАЕВА СОФЬЯ НИКОЛАЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОБИОТИЧЕСКОЙ СМЕТАНЫ

Специальность 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор И.С. Хамагаева

Улан-Удэ-2013

Содержание

Введение..........................................................................................................................................................................5

Глава 1. Состояние вопроса и задачи исследований................................................................7

1.1 Физиолого-биохимические свойства пробиотических бактерий........................7

1.2 Характеристика экзополисахаридов бактерий......................................................................24

1.3 Метаболизм селена микроорганизмами....................................................................................32

1.4 Принципы создания комбинированных заквасок............................................................36

1.5 Заключение по обзору литературы и задачи исследования....................................39

Глава 2. Организация проведения эксперимента. Материалы и методы

исследования................................................................................................................................................................42

2.1 Объекты и методики постановки эксперимента..................................................................42

2.2.1 Методы исследований. Физико-химические методы исследования............44

2.2 .2 Микробиологические методы исследования....................................................................44

2.2.3 Реологические методы исследования......................................................................................46

2.3 Статистическая обработка результатов......................................................................................46

Глава 3. Скрининг штаммов пробиотических бактерий для создания микробного консорциума..........................................................................................................................................49

3.1 Изучение экзополисахаридного потенциала пробиотических бактерий... 49

3.2 Исследование биотехнологического потенциала лакто-, бифидо- и про-пионовокислых бактерий........................................................................................................................51

3.3 Выбор оптимального соотношения пробиотических микроорганизмов и

условий культивирования консорциума..............................................................................................56

Глава 4. Исследование влияния селенита натрия на свойства пробиотических микроорганизмов..........................................................................................................62

4.1 Влияние селенита натрия на биосинтез экзополисахаридов пробиотиче-скими микроорганизмами..................................................................................................62

4.2 Влияние селенита натрия на рост биомассы, когезию и адгезию консорциума пробиотических бактерий..............................................................................................73

Глава 5 Разработка технологии замороженного бактериального концентрата для пробиотической сметаны......................................................................................80

5.1 Изучение устойчивости заквасочных культур к замораживанию........... 80

5.2 Разработка технологической схемы получения замороженных концентрированных заквасок прямого внесения............................................. 82

5.3 Исследование качественных характеристик и сроков хранения замороженных заквасок прямого внесения.................................................... 84

Глава 6. Практические аспекты применения замороженного бактериального концентрата.............................................................................. 88

6.1 Выбор и обоснование дозы внесения замороженного бактериального концентрата пробиотических бактерий для ферментации сливок............... 88

6.2 Разработка технологии производства пробиотической сметаны............ 89

6.3 Исследование качественных характеристик пробиотической сметаны.... 91

6.4 Исследование гидролитических и окислительных процессов в сметане

при хранении................................................................................ 94

Глава 7. Расчет себестоимости бакконцентрата для производства пробиотической сметаны.......................................................................... 99

Выводы....................................................................................... 108

Библиография............................................................................... 110

Приложения................................................................................. 126

Список сокращений

ЭПС - экзополисахариды

ЛЖК - летучие жирные кислоты

ИАМ - индекс адгезивности микроорганизма

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

GSH - глутатион (X (2-амино-5-{[2-[(карбоксиметил)амино]-1-меркаптометил)-2-оксоэтил]амино} -5-оксопентаноевая кислота, англ. glutathione, GSH); трипептид у-глутамилцистеинилглицин; GRAS- Generally recognized as safe

Введение

Сегодня, как никогда, остро стоит задача обеспечения населения биологически- полноценными, экологически - чистыми пищевыми продуктами, отвечающими современным требованиям науки о питании для различных возрастных групп.

Современные требования к пищевым продуктам, предъявляемые медиками-диетологами, обусловленные развитием общества и состоянием здоровья населения, стимулируют производителей выпускать как традиционные, так и новые кисломолочные продукты, например, с более длительным сроком хранения, обладающие функциональной активностью, а также произведённые из натуральных компонентов, не содержащих генно- модифицированных и искусственно синтезированных добавок. Выработка качественных и безопасных молочных продуктов, стабильно сохраняющих показатели при хранении, одна из важнейших задач в производстве продуктов питания.

Сметана - один из наиболее популярных кисломолочных продуктов в нашей стране, благодаря повышенной пищевой и энергетической ценности, высоким вкусовым достоинствам.

Технологический процесс производства сметаны более сложный по сравнению с другими кисломолочными продуктами, поэтому возникает больше проблем с управлением качеством. В связи с этим затруднительно обеспечить стабильность производства сметаны с высокими качественными характеристиками. Качество сметаны зависит от множества технологических факторов, к которым относятся свойства исходного сырья и бактериальных заквасок, условия проведения технологического процесса выработки продукта и его хранения.

Первостепенное значение в формировании качества сметаны имеют бактериальные закваски, обуслвливающие интенсивность и направленность микробиологических и биохимических процессов, протекающих во время сквашивания сливок, созревания и хранения. Именно закваски придают про-

дукту большинство характерных особенностей - вязкость, структуру сгустка, консистенцию, аромат, а также определяют стабильность качественных показателей при хранении.

Структура и консистенция кисломолочных продуктов в значительной степени зависят от способности заквасочных культур продуцировать внеклеточные полисахариды. Согласно литературным данным, синтез и качественный состав экзометаболитов бактерий зависят от условий культивирования.

Одним из перспективных направлений является разработка новых комбинированных препаратов с пробиотическими бактериями разных таксономических групп. Вовлечение в производство заквасок, состоящих из разных видов микроорганизмов, направлено на:

• стабилизацию технологического процесса с заданными показателями качества и безопасности;

• усиление пробиотических свойств за счет биологически активных веществ, синтезируемых специально подобранными штаммами пробиотических бактерий;

• улучшение органолептических показателей продуктов;

• повышение биологической ценности продуктов;

• увеличение сроков хранения готового продукта;

• расширение ассортимента продуктов.

Таким образом, создание и применение бактериальных препаратов, соответствующих научно-обоснованным критериям пригодности, позволит нивелировать влияние труднорегулируемых и зачастую независящих от производителя факторов и стабильно получать продукт с высокими качественными характеристиками.

Глава 1 Состояние вопроса и задачи исследования

1.1 Физиолого-биохимические свойства пробиотических бактерий

Микроорганизмы рода Bifidobacterium и так называемые бифидосател-литы Propionibacteria, Faecalibacteria, Roseburia spp., являются наиболее значимыми представителями облигатных бактерий в кишечнике детей и взрослых [72,30,127].

Пробиотики - живые микроорганизмы или ферментированные ими продукты, которые оказывают благотворный эффект на здоровье человека и животных, в большей степени реализующийся в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). Большинство специалистов относят к пробиотическим бактериям эу-биотики - представителей нормальной микрофлоры кишечника и других полостей организма, бифидо - и молочнокислые бактерии рода Lactobacillus, называя их классическими пробиотиками. Это связано с тем, что наибольшее количество благотворно влияющих на здоровье бактерий выделено именно из кишечника человека и именно эти бактерии, колонизируя ЖКТ и постоянно присутствуя в нём, берут на себя основную защитную функцию, в то время как другие являются транзитными. Вместе с тем имеется достаточно фактических данных, свидетельствующих о наличии пробиотических свойств у молочнокислых палочек и кокков, не встречающихся в кишечнике человека, а также других микроорганизмов - грамположительных (Propionibacterium, Bacillus) и грамотрицательных (Ecschererichia coli, Citrobacter) бактерий, дрожжей ( Saccharomyces, Candida pintolepsii) и грибов, в том числе и высших( Aspergillus, Rhizopus, Cordiceps)[90,128].

Бифидобактерии блокируют рецепторы на слизистой оболочке кишечника, предотвращая фиксацию на них потенциально опасных микроорганизмов^].

Бифидобактерии представляют четкую древнюю эволюционную ветвь, восходящую от актиномицетного предка. Актиномицеты содержат три группы. Группа 1 включает одноклеточные молочнокислые бактерии и микро-

кокки, группа 2 - коринеформные бактерии и проактимицеты, группа 3 - эу-актиномицеты. Бифидобактерии относятся ко второй группе [20,88,87].

В настоящее время идентифицировано 44 вида бифидобактерий (от лат. bifidus - раздвоенный, расщепленный надвое), объединенных в род Bifidobacterium, который относится к семейству Actinomycetaceae[35,106].

Наиболее изучаемыми видами бифидобактерий являются: В. bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve, В. infantis, В. lactentis, В. liberorium и т.д.

Бифидобактерии — это грамположительные, анаэробные, бесспоровые, неподвижные палочки, (0,5-1,3) х (1,5-8) мкм. Бифидобактерии представляют собой чрезвычайно вариабельные по форме палочки - прямые, изогнутые, разветвленные, раздвоенные Y- или V-формы, булавовидные и лопатовид-ные[20,88].

Полиморфизм является характерным свойством бифидобактерий: в мазках молодой культуры встречались неразветвленные особи, а более старой -ветвящиеся или с булавовидными утолщениями на концах, иногда неравномерно окрашенные, гранулированные палочки.

Среди штаммов, выделенных из кишечника взрослых людей, преобладают палочковидные и булавовидные формы: ветвящиеся палочки чаще встречаются у детей грудного возраста. На ранних стадиях развития преобладают палочковидные формы, а при дальнейшем культивировании образуются разветвленные нити с многочисленными перегородками и в основном стволе и в ответвлениях [16].

Форма клеток микроба зависит от различных факторов: условий культивирования, возраста культуры, изменения состава питательных сред, изменения рН среды и др. Несмотря на то что, ряд авторов, описывая морфологию бифидобактерий, были единодушны, отмечая их полиморфизм, то в отношении причин, его вызывающих, мнения были противоречивы [83,55,108].

Так, если Tissier отмечал появление ветвящихся форм у более старых особей, то Schuler наблюдал ветвление у молодых, свежевыделенных куль-

тур, субкультуры же имели тенденцию к образованию палочковидных форм [88].

В то же время некоторые авторы считают, что в естественной среде обитания доминируют палочковидные формы бифидобактерий. По сообщению Яевтк на жидкой питательной среде чаще обнаруживались «коккоид-ные» и «диплококкоидные» клетки, причем среды с добавлением молока способствовали образованию коккоидных форм. Однако, по данным Семени-хиной В.Ф., Борисовой Г.В., на молочных средах и средах с добавлением молока бифидобактерии преимущественно вырастали в виде гранулированных без ветвлений палочек.

Все виды бифидобактерий при первичном выделении являются строгими анаэробами. В присутствии углекислого газа они могут быть толерантными к кислороду. При лабораторном культивировании эти микроорганизмы приобретают способность развиваться в присутствии некоторого количества кислорода, а в высокопитательных средах - расти в полностью аэробных условиях. Чувствительность к кислороду у многих штаммов варьирует, что обусловлено различиями в механизме брожения. Некоторые виды могут рас-т^в атмосфере воздуха, обогащенного 10 % СОг- Оптимальной является температура (37-40) °С. Оптимальное значение рН (6-7), при рН ниже 4,5 и выше 8,5 рост микроорганизмов прекращается.

Бифидобактерии являются хемоорганотрофами, активно сбраживают сахарозу, галактозу, фруктозу, мелибиозу, раффинозу, лактозу и др., с образованием, в основном, уксусной и молочной кислот в молярном соотношении 3:2. Образуют также примеси муравьиной и янтарной кислот, а также этанола. Масляную, пропионовую кислоты и СОг не образуют. Для роста на питательных средах нуждаются в добавлении витаминов.

Бифидобактерии не продуцируют каталазы, не образуют индол и сероводород, не восстанавливают нитраты, не разжижают желатин. Они не продуцируют фенол, не образуют аммиак из аргинина. При развитии в лакмусовом молоке бифидобактерии вызывают частичное или полное его восстанов-

ление. Эти микроорганизмы способны развиваться в бульоне из гидролизо-ванного молока с 2 %-ным раствором поваренной соли, 20 % желчи, концентрацией фенола 1:250. Цитраты в качестве источника энергии бифидобакте-рии не используют[88,99].

Бифидобактерии сбраживают сахар с образованием молочной кислоты в качестве основного конечного продукта. Однако суммарное уравнение носит особый характер и не соответствует ни гомоферментативному, ни типичному гетероферментативному молочнокислому брожению (формула 1).

2 глюкоза-------------------3 ацетат + 2 Ь - лактат (1)

Этот вид брожения имеет единственный в своем роде биохимический механизм превращения глюкозы.

Как и при расщеплении по пути Эмбдена - Мейерггоффа, глюкоза сначала фосфорилируется в положении 6, а затем превращается во фруктозо-6-фосфат. Расщепление связи С2-С4 во фруктозо-6-фосфат сопровождается присоединением неорганического фосфата. Последующей реакцией между эритрозо-4-фосфатом и фруктозо-6-фосфатом начинается сложный ряд взаимных превращений сахарофосфатов, в результате чего, в конечном счете, образуются 2 моля ацетилфосфата и 2 моля глицеральдегида-3-фосфата. Из ацетилфосфата получается ацетат, а триазафосфат через пируват превращается лактат. В энергетическом отношении это брожение несколько более эффективно, поскольку оно дает 5 молей АТФ на каждые 2 моля сброженной глюкозы. Имеются данные, указывающие, что бифидобактерии продуцируют Ц+) молочную кислоту, которая является для млекопитающих физиологически активной формой, целенаправленно используется организмом, тогда как Е)-молочная кислота не усваивается. В организме человека молочная кислота образуется в больших количествах и играет важную роль в метаболизме. Однако, следует отметить, что только Ь (+) - молочная кислота служит в качестве источника энергии для сердца, скелетных мускул, печени, почек, мозга и /

сжигается до СО2 и воды, а также используется в цикле глюкозы для образования гликогена и животного крахмала [99].

Некоторые штаммы бифидобактерий растут при наличии азотфикси-рующих олигасахаридов - Ы-ацетил-глюкозамина, Ы-ацетил-галактозамина Ы-ацетил-манозамина и др., которые отсутствуют в коровьем молоке (содержатся в женском молоке). Присутствие таких соединений в молоке делает его наиболее благоприятной средой для бифидобактерий, и, вероятно, именно этим объясняется их преобладание в кишечной микрофлоре грудных детей. Своеобразной бифидостимулирующей активностью обладают экстракты моркови. Благодаря исследованиям японских ученых бифидофактор был идентифицирован и компоненты его выделены в чистом виде. В последующем оказалось, что стимулирующей рост активностью в отношении к различным штаммам бифидобактерий обладают различные производные панто-теновой кислоты, в том числе витамин. Констатировано, что бифидобактерии подобно молочнокислым бактериям, обнаруживают абсолютную зависимость от производных пантотеновой кислоты. Ряд исследователей для стимуляции роста бифидобактерий в молоке используют сорбит, олигосахариды и полисахариды, образующиеся при термической обработке крахмала из риса или кукурузы. Имеются сведения о выделении бифидус-факторов или их синтеза на основе аминокарбонильных реакций [82,99].

Особый интерес в последние годы проявляется к олигосахаридам женского молока. Как известно, главным углеводом молока является лактоза. Устан�