автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Совершенствование биотехнологии бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек для производства кисломолочных продуктов

005012525

На правах рукописи

Раскошная Татьяна Александровна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА АЦИДОФИЛЬНЫХ МОЛОЧНОКИСЛЫХ ПАЛОЧЕК ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных

продуктов и холодильных производств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

1 2 идр 2012

Москва 2012

005012525

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор Семенихина Вера Филатовна

доктор биологических наук Ефимочкина Наталья Рамазановна

Ведущая организация:

кандидат технических наук Сорокина Нинель Петровна

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится » 2012 г. в на

заседании Диссертационного совета ДМ 006.b21.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии (ГНУ ВНИМИ им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии) по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, 26.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять в адрес ученого секретаря объединенного Диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИМИ им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «2У »Срб£р&АЯ2<3\2 \

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук, старший научный сотрудник ^ А.Н. Захаров

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Производство кисломолочных продуктов основано на регулировании микробиологических процессов, интенсивность течения которых зависит от свойств используемых микроорганизмов. В России традиционно выпускается широкий ассортимент кисломолочных продуктов, значительную часть которых занимали кисломолочные продукты, производимые с использованием ацидофильных молочнокислых палочек, являющихся представителями нормальной кишечной микрофлоры. Клинические испытания этих продуктов показали их высокое лечебно-профилактическое действие при различных желудочно-кишечных заболеваниях. По сути это были первые кисломолочные продукты, которые по принятой в настоящее время терминологии называются продуктами с «пробиотическими» свойствами. Необходимость производства этой группы кисломолочных продуктов диктуется ухудшением экологической обстановки, качества питьевой воды и увеличением дисбактериоза у людей, связанных с употреблением антибиотиков при лечении различных заболеваний.

Разработке кисломолочных продуктов с пробиотическими свойствами посвящены работы Королевой Н.С., Банниковой Л.А., Семенихиной В.Ф., Ганиной В.И., Рожковой И.В., Лизько H.H., Поспеловой В.В., Гончаровой Г.И., Сундуковой М.Б., Mitchell Н.К., Snell Е.Е., Rogosa М„ Briggs М., De Man J.C., Sharpe M. E., Fry R.M. и других.

Развитие биотехнологических процессов производства кисломолочных продуктов связано с разработкой и использованием бактериальных концентратов, которые позволяют интенсифицировать технологический процесс, снизить возможность появления бактериофага и получать высококачественный продукт, так как исключается последовательная перевивка заквасок на производстве, в результате чего может меняться видовой состав заквасок и их свойства. В развитии биотехнологии бактериального концентрата большое внимание уделяется увеличению количества жизнеспособной микрофлоры в них, что обеспечивается разработкой новых питательных сред и совершенствованием режимов культивирования, позволяющих получить высокое количество клеток микроорганизмов в концентрате и выход биомассы.

Поэтому работа, направленная на разработку и совершенствование биотехнологии бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек со стабильными показателями качества является актуальной.

Цель и задачи исследований

Целью настоящей работы является совершенствование биотехнологии бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек, предназначенного для производства кисломолочных продуктов с пробиотическими свойствами.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

- исследовать производственно-ценные свойства и антагонистическую активность различных штаммов ацидофильных молочнокислых палочек;

- исследовать влияние компонентов питательных сред (в том числе дрожжевого экстракта и автолизата, микроэлементов, агара, №(СН3СОО), источника ненасыщенных жирных кислот ТХУЕЕЫ 80, стимулирующей добавки «Флоравит») на интенсивность размножения ацидофильных молочнокислых палочек;

- разработать состав и уточнить режимы подготовки биологически полноценной, технологичной в применении питательной среды для накопления биомассы пробиотического штамма ацидофильных молочнокислых палочек при периодическом культивировании;

- исследовать влияние технологических параметров периодического культивирования (вида и дозы инокулята, температуры и рН культивирования, вида нейтрализатора) на интенсивность развития ацидофильных молочнокислых палочек;

- исследовать влияние возраста популяции клеток и состава защитной среды на выживаемость ацидофильных молочнокислых палочек в процессе сушки;

- сравнить сублимационную и вакуумную сушку по выживаемости клеток и хранимоспособности бактериального концентрата;

- исследовать изменение концентрации жизнеспособных клеток ацидофильных молочнокислых палочек в процессе хранения бактериального концентрата и установить сроки хранения;

- усовершенствовать биотехнологию бактериального концентрата пробиотической культуры ацидофильных молочнокислых палочек и утвердить изменение к технической документации;

провести опытно-промышленную выработку бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек и кисломолочного

продукта «Ацикор» в производственных условиях.

4

Научная новизна работы

- получены новые данные о пробиотических и биотехнологических свойствах культур ацидофильных молочнокислых палочек;

- доказана интенсификация роста ацидофильных молочнокислых палочек и увеличение выхода биомассы при использовании оптимизированной по составу питательной среды и разработанных режимов культивирования;

- установлена зависимость между выживаемостью ацидофильных молочнокислых палочек в бактериальном концентрате и возрастом популяции клеток;

научно обоснованы технологические процессы производства бактериального концентрата с высоким содержанием клеток ацидофильных молочнокислых палочек;

- получены сравнительные данные по выживаемости клеток и хранимоспособности бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек, высушенного сублимационной и вакуумной сушкой.

Практическая ценность работы

По результатам работы разработано и утверждено Изменение №2 в «Технологическую инструкцию по производству заквасок, бактериальных концентратов, дрожжей и тест-культур».

По данной технологии в Цехе заквасок ГНУ ВНИМИ освоено производство бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек, которое подтверждено «Актом опытно-промышленной выработки бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек».

Разработана технология получения кисломолочного продукта «Ацикор» ТУ 9222-481-00419785-10 (бактериальный концентрат - Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus) для реализации населению.

Апробация результатов работы

Результаты были доложены и обсуждены на Всероссийском смотре-конкурсе лучших пищевых продуктов, продовольственного сырья и инновационных разработок, г. Волгоград 2010 г; на 4-ой конференции молодых ученых и специалистов институтов Отделения «Хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» Россельхозакадемии, Москва 2010 г.; на Международной научно-практической конференции «Инновационные технологии - основа модернизации отраслей производства и переработки сельскохозяйственной продукции» г. Волгоград 2011 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 1 статья в рекомендуемых ВАК изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, результатов эксперимента и их анализа, выводов, списка использованной литературы (314 наименований источников, в том числе 250 работ зарубежных авторов) и приложений. Основная часть работы изложена на 130 стр., из них Л таблиц и 19 рисунков.

Содержание работы

Во введении обоснованы актуальность темы диссертации, сформулирована цель, научная новизна и практическая значимость работы.

В главе «Литературный обзор» рассмотрены причины увеличивающегося количества заболеваний у людей и значимость пробиотиков и продуктов функционального питания в профилактике лечения этих болезней. Проанализированы пути повышения качества бактериальных концентратов в процессе их производства.

В главе «Организация работы, объекты и методы исследований». указано, что работа выполнялась в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности Россельхозакадемии в рамках темы 3.2 (10.02.02.01) «Селекция штаммов молочнокислых и пробиотических культур, продуцирующих биологически активные вещества с использованием молекулярно-генетических методов для разработки новых видов бактериальных концентратов при производстве функциональных кисломолочных продуктов» и в рамках Госконтракта «Разработка технологий универсального быстропереориснтируемого производства заквасок прямого внесения для биотехнологической промышленности» Госконтракт от 26.06.2008 №02.522.12.2009. Экспериментальная часть по вакуумному высушиванию выполнялась в лаборатории быстрозамороженных пищевых продуктов ГНУ ВНИХИ Россельхозакадемии. Определение антагонистической активности ацидофильных молочнокислых палочек проводили в лаборатории эндотоксикозов и гнойно-септических осложнений ФГУ ФНЦ ТИО им. ак. В.И.Шумакова. В лаборатории санитарно-пищевой микробиологии и

микроэкологии ФГБУ НИИ питания РАМН проводились клинические исследования кисломолочного продукта «Ацикор» на крысах.

Объектами исследований служили:

- культуры ацидофильных молочнокислых бактерий из коллекции культур молочнокислых бактерий, бифидобактерий и дрожжей Центральной лаборатории микробиологии ГНУ ВНИМИ;

-компоненты для приготовления питательной среды (сухое обезжиренное молоко, препарат ферментный протосубтилин ГЗх, дрожжевой экстракт и автолизат, сухая питательная среда VIS-START TW50, сыворотка молочная, среда BIOS, TWEEN 80, агар, Na(CH3COO) и другие);

- компоненты для приготовления защитных сред (сухое обезжиренное молоко, уксуснокислый натрий Na(CH3COO), лимоннокислый натрий №зСбН507'2Н20, сахароза, желатин, поваренная соль, глютамат натрия);

- бактериальный концентрат ацидофильных молочнокислых папочек;

- кисломолочный продукт «Ацикор».

При проведении исследований использовали общепринятые

микробиологические, физико-химические и математические (планирование

эксперимента и обработка результатов) методы. Кислотообразующую

активность штаммов ацидофильных палочек и изменение рН на различных

питательных средах определяли на компьютеризированном приборе

параллельных биореакторов фирмы DASGIP. Для периодического

культивирования микроорганизмов в условиях регулируемых параметров

процесса (активной кислотности, температуры и др.) был использован

лабораторный ферментер Prelude (фирмы Biolafitte). Для сублимационного

высушивания клеток микроорганизмов использовали сушилку FreeZone 4.5

Liter Benchtop Freeze Dry Systems и TG-50.4. Экспериментальное оборудование,

на котором проводилось вакуумное высушивание микроорганизмов, включает в

себя вакуумную камеру (с возможностью изменения давления от атмосферного

до 0,06 мм рт. ст.) с расположенными в ней обогреваемыми полками, которые

оборудованы теплообменником с возможностью изменения температуры от

минус 20°С до плюс 50°С, десублиматор (теплообменник-конденсатор),

оснащённый двухступенчатой холодильной машиной с возможностью

охлаждения до минус 100°С, а также приборами автоматического наблюдения и

фиксации изменения температуры в продукте и на поверхности. Определение

количества клеток ацидофильных молочнокислых палочек в питательной среде

и концентрате проводили в соответствии с ГОСТ 10444.11 «Продукты

7

пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов». Антагонистическую активность культур ацидофильных молочнокислых палочек определяли методом развивающихся смешанных популяций в сравнении с ростом тест - штаммов в монокультурах по ТУ 42.14.275-82. Математическая обработка данных проводилась по результатам 3-6 повторностей, построение графиков, диаграмм и таблиц с применением программ «Statistica 6.0», «Microsoft Office 2003-2007» и «Matlab 11.0».

Схема проведения эксперимента представлена на рис. 1.

Результаты исследований и их обсуждение

В главе «Изучение биотехнологических и пробиотических свойств штаммов ацидофильных молочнокислых палочек» приведены результаты исследований производственно-ценных свойств и антагонистической активности культур молочнокислых палочек. Ацидофильные молочнокислые палочки в количестве 27 штаммов были получены из коллекции микроорганизмов Центральной лаборатории микробиологии ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Критериями отбора штаммов ацидофильных молочнокислых палочек для производства бактериальных концентратов, предназначенных для выработки кисломолочных продуктов с пробиотическими свойствами, являются: потенциально высокая урожайность клеток при культивировании на питательной среде, высокая кислотообразующая активность при сквашивании молока, низкая постокислительная активность при хранении кисломолочного продукта и выраженная антагонистическая активность по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам.

По биотехнологическим свойствам были изучены 27 культур ацидофильных молочнокислых палочек и, руководствуясь заданными критериями, был отобран один штамм, который:

- имеет наибольшее содержание клеток в концентрате - 3,5x109 КОЕ/г с выходом биомассы 1,15% при культивировании на питательной среде BIOS;

- имеет максимальную активную кислотность при сквашивании молоко -рНтах=(3,36±0,08)ед.рН;

- обладает высокой кислотообразующей активностью при сквашивании молока, достигая рН~4,8-4,9 от 4 до 6 часов;

- обладает низкой постокислительной активностью в процессе хранения кисломолочного продукта - Д(0,12±0,03) ед. рН за 7 дней хранения при (4±1)°С

и Д(0,30±0,10) ед. рН за 28 дней хранения при (4±1)°С;

8

/ Подготовка ^литературного обзора

I

Определение направления, цели и задач исследований

I

31

Выбор объектов \ исследований /

IОтбор методов\ V исследований )

31

Проведение исследований

> ГИзучениепробиотических и биотехнологических свойствЛ V ацидофильных молочнокислых палочек 1,2 )

Выбор и конструирование4 питательной среды для наращивания биомассы .ацидофильных молочнокислых/ палочек 1,2

Сравнительный анализ питательных сред 1,2

Определение оптимальных ■ концентраций компонентов в питательной среде 1,2

Исследование влияния

факторов роста на интенсивность развития клеток и выход биомассы

ацидофильных молочнокислых палочек 1.2

/точнениеусловии культивирования ацидофильных молочнокислых палочек е сконструированной Питательной среде

Определение вида и дозы инокулята 1,2

Выбор температуры культивирования 1,2

Определение значения активной кислотности 1,2

Уточнение условий подготовки биомассы ^ацидофильных молочнокислых/ палочек к сушке 1,2

Выбор продолжительности культивирования 1,2

Выбор состава защитной среды 1,2

Определение эффективности сушки сублимационной и вакуумной 1,2

Выбор вида нейтрализатора 1,2

Оптимизация параметров выработки бактериального концентрата

I ~

Усовершенствование биотехнологии бактериального концентрата и утверждение изменения № « в «Технологическую инструкцию по производству заквасок, бактериальных концентратов, дрожжей и тест-культур»

I

Выработка опытно-промышленной партии бактериального концентрата 1,2,3

Выработка опытной партии кисломолочного продукта 1,2,3

Рис. 1 Схема проведения исследований Контролируемые показатели: 1-микробиологические; 2-физико-химические; З-оргаиолептическне

Выбранный штамм также обладает выраженной антагонистической активностью по отношению к Е. coli, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Kl. pneumonia и Ps. aeruginosa.

В главе «Исследование влияния компонентов сред на интенсивность размножения ацидофильных молочнокислых палочек и разработка состава питательной среды» приведены результаты влияния компонентов сред на интенсивность размножения ацидофильных молочнокислых палочек. Одним из важнейших этапов производства бактериальных концентратов является получение биомассы с высоким содержанием клеток, которая в свою очередь зависит от состава питательной среды, используемой для культивирования микроорганизмов. Проанализировав литературные данные о применяемых питательных средах для культивирования молочнокислых палочек, были выбраны наиболее часто используемые среды: гидролизованное молоко, обезжиренное молоко, сыворотка молочная, среда VIS-START TW-50 и среда BIOS. Результаты исследований по сравнительной оценке различных питательных сред для выбора среды, с помощью которой можно получить наибольшее количество жизнеспособных клеток в концентрате и количество биомассы, показаны на рис.2.

12

10

О m 1-о ш г s С О

12

10

С 8

Ш О

количество клеток в питательной среде, КОЕ/см количество клеток в концентрате, КОЕ/г количество биомассы, %

среда VIS-START

среда BIOS

сыворотка

гидрол. молоко

Рис. 2 Изменение количества клеток и выхода биомассы при культивировании на различных питательных средах

Анализ полученных данных позволил определить питательные среды, VIS-START TW50 и гидролизованное молоко, обеспечивающие получение высокого стабильного количества клеток и биомассы.

Затем были составлены 19 вариантов питательных сред с использованием VIS-START TW50 и гидролизованного молока с добавлением различных компонентов: сыворотки, среды BIOS и сухого обезжиренного молока для выбора питательной среды, обеспечивающей высокое содержание клеток. Наилучшими результатами обладала среда, состоящая из гидролизованного молока, обезжиренного сухого молока и VIS-START TW50.

Для определения оптимальных концентраций компонентов питательной среды провели математическое планирование эксперимента. Математически обработанные результаты исследований влияния компонентов среды на количество клеток в процессе культивирования представлены в виде мультипликативной поверхности на рис. 3.

Рис. 3 Зависимость количества клеток ацидофильных молочнокислых палочек от

Уравнение регрессии выглядит следующим образом: У=8,54-13,0-Х1-11,0-Х2+11,2ХЗ+12,4-Х1-Х2-9,ЗХГХЗ-6,3-Х2ХЗ+7,5-ХГХ2-ХЗ+7,6Х12+4,00ХЗ2

где, Хг количество гидролизованного молока;

Х2 - количество питательной среды VIS-START TW50; Х3 - количество обезжиренного сухого молока. Верхний доверительный интервал определяется уравнением:

У=9,15-11)5-Х1-9,6-Х2+12,5'ХЗ+14,6-Х1-Х2-7,8-ХГХЗ-5,1-Х2-ХЗ+8,9-Х1-Х2-ХЗ+8,43 Х,2+4,71Х32

Нижний доверительный интервал определяется уравнением: У=7,93-14,5Х1-12,4Х2+9,9-ХЗ+10,2-Х1Х2-10,8Х1ХЗ-7,5-Х2-ХЗ+6,1 XrX2-X3+8,43Xi2+3,29-X32

60

Среда VISSTART, %

концентрации компонентов в питательной среде

Проведенные исследования позволили установить оптимальные соотношения трех компонентов питательных сред для получения наибольшего количества клеток в процессе периодического культивирования. Установлено, что наиболее высокий урожай клеток более 109 КОЕ/см3 был получен при культивировании ацидофильных молочнокислых палочек на питательной среде, содержащей гидролизованного молока - 500 см3/дм3, обезжиренного сухого молока - 25 г/дм3 и VIS-START TW-50 - 25 г/дм3.

Для обогащения разработанной среды стимуляторами роста в отдельные варианты вносили: дрожжевой экстракт 0,2-4 г/дм3 или автолизат 5%, уксуснокислый натрий 1 г/дм3, агар 0,5-1 г/дм3, источник ненасыщенных жирных кислот TWEEN 80 - 1%, MnS04x5H20 - 164 мг/дм3, стимулирующую добавку «Флоравит» - 5%. На рис. 4 представлены результаты исследований по накоплению молочнокислых палочек в питательной среде, концентрате, а также выход биомассы.

■I количество клеток в питательном среде. КОЕ см3 Ц количество клеток в концентрате. КОЕ г ЩИ биомасса клеток. %

без добавок дрож. автолизат TWEEN 80 флоравит

дрож. экстракт Na(CHsCOO) агар MnS05"5H20

Рис.4 Влияние стимуляторов роста на накопление клеток и количество биомассы

Установили, что включение в состав питательной среды дрожжевого экстракта - 4г/дм3 увеличивало количество клеток ацидофильных молочнокислых палочек в питательной среде и концентрате на 14%, а добавление ненасыщенных жирных кислот (Т\¥ЕЕК 80) и уксуснокислого натрия на 3%. Поэтому, в дальнейших исследованиях использовалась питательная среда, описанная выше, в которую дополнительно вносили дрожжевой экстракт в количестве 4 г/дм3.

В главе «Исследование влияния технологических параметров периодического культивирования на интенсивность развития ацидофильных молочнокислых палочек» приведены результаты изучения роста и развития ацидофильных молочнокислых палочек в зависимости от вида и дозы инокулята, вида нейтрализатора, уровня активной кислотности и температуры, поддерживаемой в процессе наращивания.

В результате проведенных экспериментов (рис 5) установили, что максимальное количество клеток в процессе культивирования было получено при использовании инокулята, приготовленного на стерилизованном обезжиренном молоке, а наиболее рациональная его доза составила 5% (рис. 6.)

----стери.г|11'юв:| иное

обезжиренное молоко

у = -0.0262хг + 0.3693Х + "".381 7 К- = 0.982 -среда \1SST ART

у = -0.0092х2+- 0.1812х+ ".3549 К- = 0.8846

- - гидролизов;! иное

молоко

у = -0.00~4х2+- 0.1 Б99х + 6.~554 = 0.8155

Продолжительность культивирования, "I

Рис. 5 Влияние вида инокулята на изменение количества клеток в процессе

культивирования

9,5

9,0 8,5

РО

| 8,0 ш

О 7,5 *

® 7,0 6,5 6,0 5,5

3% у = 5,4288+0,7688*х-0,0474*хл2 4% у = 5,8274+0,8507*х-0,0616*хл2 5% у = 6,7624+0,6638*х-0,0524*хл2 6% у = 6,9589+0,5706*х-0,0451 *хл2 7% у = 6,7701+0,5481*х-0,0419*хл2 8% у = 6,7582+0,7158*х-0,066*хл2

11

12

0456789 10 Продолжительность культивирования, ч

Рис. 6 Влияние дозы инокулята на изменение количества клеток ацидофильных молочнокислых палочек в процессе культивирования

Были определены оптимальные значения активной кислотности среды, при культивировании ацидофильных молочнокислых палочек. Установлено, что наиболее интенсивный рост молочнокислых палочек в процессе культивирования отмечался через 7-9 часов при рН=(5,7±0,1) и рН=(6,0±0,1). (рис. 7)

8,8

8,6

8,4

8,2

"2 8,0 о

ш 7,8

° 78

^ 7,6 7,4 7,2 7,0 6,8 6 6

'О 4 5 6 7 8 9 10

Продолжительность культивирования, ч

Рис. 7 Влияние различных значений активной кислотности на количество клеток ацидофильных молочнокислых палочек в процессе культивирования

С целью уточнения оптимальной температуры роста молочнокислых палочек были проведены эксперименты по их культивированию в разработанной питательной среде при температурах (39±1)°С, (41±1)°С. Выяснено, что оптимальной температурой для культивирования клеток ацидофильных молочнокислых палочек является (41±1)°С, как показано на рис. 8.

--41°С'

- -0.0221х2 ■+■ 0.4068Х + 6.929" К-= 0,9вЗ

- ■ 35°С

= -0.00ббх2 + 0.1932Х+ б,"41 ~ Я-- 0.896"

-37°С"

-0,0196х2 + 0,35"4х+ 6."868 Я-- 0,938

-0.0242Х2 + 0.394<?х+?.8 = 0,8618

0 2 4 6 8 10

Продолжительность культивирования, ч

Рис. 8 Влияние температуры культивирования на изменение количества клеток ацидофильных молочнокислых палочек в культуральной среде

Химические соединения, используемые для нейтрализации молочной кислоты, могут быть дополнительным источником питательных веществ. Поэтому были проведены исследования роста и развития клеток ацидофильных молочнокислых палочек при использовании различных нейтрализаторов представленные на рис. 9.

яг О

о о о.

45 40 35 30 25 20 15 10 5 О

4 5 6 7 8 9 10 Продолжительность культивирования, ч

Рис. 9 Влияние вида нейтрализатора на прирост клеток в питательной среде Установлено, что прирост клеток ацидофильных молочнокислых палочек увеличивается на 50% в течение 7-8 часов культивирования при использовании в качестве нейтрализатора водного раствора МЬЦОН с массовой долей ЫН4ОН 20%, смеси водного раствора с массовой долей 1ЧН4ОН 20% и водного раствора Ыа^СОз с массовой долей Ма2С03 20% в соотношении 1:1.

В главе «Сравнительный анализ сублимационной и вакуумной сушки по выживаемости клеток после высушивания и в процессе хранения» приведены результаты по выживаемости клеток после двух видов сушки и в процессе хранения.

С целью сравнительного анализа разных видов сушек (сублимационной и вакуумной) были проведены исследования по выживаемости клеток в концентрате и его хранимоспособности. В процессе сушки была использована защитная среда №8 (таблица 1).

Продолжительность хранения, месяцев — —вакуумная сушка -сублимационная сушка

Рис. 10 Влияние вида сушки на изменение количества клеток в бактериальном концентрате в процессе хранения

Установили, что выживаемость клеток ацидофильных молочнокислых палочек при сублимационной сушке была 84%, при вакуумной - 60%. В процессе хранения количество клеток в концентратах, высушенных двумя способами, снижалось и через 9 месяцев незначительно отличалось, составляя 21% для двух видов сушки, (см. рис. 10). Недостатком вакуумного способа высушивания является плохая растворимость бактериального концентрата.

В главе «Уточнение влияния отдельных технологических факторов на качество бактериального концентрата» приведены результаты влияния возраста клеток, вида и состава защитной среды на выживаемость бактерий после сублимационного высушивания.

Чтобы правильно выбрать момент отделения биомассы при производстве бактериального концентрата, необходимо учитывать влияние возраста клеток культуры на выживаемость их при дальнейшей обработке. Для постановки эксперимента биомассу ацидофильных молочнокислых палочек отделяли после различной продолжительности наращивания и соединяли с защитной средой. Во всех случаях сушка проводилась при одинаковых режимах. Установили (см. рис. 11), что максимальная выживаемость клеток ацидофильных молочнокислых палочек наблюдается для клеток, отделенных после 7,0 (86%) часов культивирования, т.е. в конце логарифмической фазы роста. В таком состоянии популяция находится 30-40 мин. В течение этого времени происходит кратковременная стабилизация устойчивости к воздействию холода. В дальнейшем, при переходе клеточной популяции в стационарную фазу происходит снижение выживаемости на 20-30% за сравнительно короткий промежуток времени- 1,0-1,5 ч.

г

О после

замораживания

В после сушки

Я после 2-х мес. хранения

В после 4-х мес. хранения

■ после 6-и мес. хранения

Защитная среда

90

,с 80

° 70

I 60 е 50

0

1 40

я

I 30

<1 20 10 о

5 б 7 8 9 10 И

Продолжительность культивирования до отделения биомассы, ч.

сз после замораживания н после сушки а после 2-х мес. хранения

Рис. 11. Влияние продолжительности культивирования до отделения биомассы на выживаемость клеток в бактериальном концентрате после сублимационной сушки и в

процессе хранения

Таким образом, установили продолжительность культивирования до отделения биомассы для ацидофильных молочнокислых палочек - (7,0±0,5) часов.

Важную роль в выживаемости микроорганизмов при замораживании и сушке играет защитная среда. Рассматривали 8 различных сред, состав которых показан в таблице 1, и установили, что наибольшая выживаемость клеток ацидофильных молочнокислых палочек после сушки (95,3% и 96,7%) и в процессе хранения была в случае использования защитных сред №5 и №6 соответсвенно. (см. рис 12).

Рис.12 Влияние вида защитной среды на выживаемость клеток ацидофильных молочнокислых палочек после сублимационной сушки и в процессе хранения

Таблица 1

Состав защитных сред_

Вариант защитной среды Компоненты защитной среды

Молоко обезжиренное Сахароза Уксуснокислый натрий Лимоннокислый натрий Желатин Глютамат натрия Поваренная соль

Массовая доля молока в среде, % Концентрация сухих веществ в среде, % Массовая доля раствора в среде, % Концентрация компонента в растворе, % Массовая доля раствора в среде, % Концентрации компонента в растворе, % Массовая доля раствора в среде, % Концентрация компонента в растворе, % Массовая доля суспензии в среде, % Концентрация компонента в суспензии, % Массовая доля суспензии в среде, % Концентрация компонента в суспензии, % Массовая доля суспензии в среде, % Концентрация компонента в суспензии, %

1 50,0 10,0 - - - - - - 50,0 16,7 - - - -

2 52,5 10,0 10,0 10,0 - - 15,0 35,0 22,0 16,7 - - - -

3 - - 10,0 20,0 - - 20,0 35,0 60,0 16,7 10,0 4,1 - -

4 70,0 10,0 15,0 10,0 - - 15,0 35,0 - - - - - -

5 90,0 10,0 - - - - 10,0 35,0 - - - - - -

6 - - 90,0 10,0 10,0 35,0 - - - - - - - -

7 90,0 10,0 - - 10,0 35,0 - - - - - - - -

8 74,5 10,0 - - - - 15,0 35,0 - - - - 10,0 5,0

Для определения оптимальных концентраций компонентов в выбранных защитных средах с целью повышения выживаемости бактерий, согласно построенному плану эксперимента было проведено сублимационное высушивание бактерий с различными концентрациями компонентов.

Математически обработанные результаты исследований влияния концентрации компонентов в защитных средах №5 и №6 представлены в виде мультипликативных поверхностей на рис. 13 и 14.

на 80 □ 60

□ 40

□ 20 ■ 0

Рис. 13 Влияние концентрации компонентов в защитной среде №5 на выживаемость клеток после сублимационного высушивания

Область максимальной выживаемости ацидофильных молочнокислых

палочек наблюдалась при совместном воздействии обезжиренного молока от 75

до 95% и раствора лимоннокислого натрия от 10 до 20 %.

г = 7,4123+0,3712*х+1,3288*у 22

80 100

Водный раствор сахарозы, %

ГП 20 [Ж] ю

Рис. 14 Влияние концентрации компонентов в защитной среде № 6 на выживаемость клеток после сублимационного высушивания

Область максимальной выживаемости ацидофильных молочнокислых палочек 80-90% наблюдалась при совместном воздействии водного раствора сахарозы от 80 до 90% и раствора уксуснокислого натрия от 10 до 20%.

Таким образом, проведенные исследования позволили определить оптимальные соотношения компонентов в защитных средах.

г = -1,1181+0,4064*х+2,5665*у 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

0 20 40 60 80 100 Обезжиренное молоко, %

В главе «Определение сроков хранения сухих бактериальных концентратов ацидофильных молочнокислых палочек» приведены результаты по изменению количества клеток ацидофильных палочек в концентрате в процессе хранения.

Партии сухих бактериальных концентратов ацидофильных молочнокислых палочек закладывали на хранение при температуре минус (18±2)°С и определяли количество жизнеспособных клеток через определенные промежутки времени.

Согласно нормативной документации количество клеток в бактериальном концентрате молочнокислых палочек должна быть не менее 1хЮ10КОЕ/г. Таким образом, проведенные исследования показали, что возможный срок хранения при температуре минус (18±2)°С составляет (9,0±0,5) месяцев, (рис. 15)

Продолжительность хранения, месяцев -среда №5 ----среда №6

Рис. 15 Изменение количества клеток ацидофильных молочнокислых палочек в сублимированном бактериальном концентрате в процессе хранения

В главе «Совершенствование биотехнологии бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек» приведены материалы, касающиеся совершенствования биотехнологии бактериального концентрата.

На основании полученных результатов были усовершенствованы технологические режимы производства бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек и разработано изменение №2 в «Технологическую инструкцию по производству заквасок, бактериальных концентратов, дрожжей и тест-культур», (таблица 2).

Таблица 2

Изменения, внесенные в технологическую инструкцию по производству заквасок, бактериальных концентратов, дрожжей и тест-культур

«Технологическая инструкция по производству заквасок, бактериальных концентратов, дрожжей и тест-культур»

(ТУ 9229-369-00419785-04)

Изменение №2 в «Технологическую инструкцию по производству заквасок, бактериальных концентратов, дрожжей и тест-культур» (ТУ 9229-369-00419785-04)

1. Среда для наращивания биомассы молочнокислых палочек -сыворотка с добавлением буферных солей и стимуляторов роста или среда У^БТАЯТ с/без добавления гидролизованного молока.

2. Стерилизация среды при давлении 0,08 МПа с выдержкой (60±5) минут.

3. Условия культивирования: К37±1)"С, рН=(5,8±0,1), 5% ино-кулята.

4. Продолжительность культивирования до отделения биомассы -(14±1) ч.

5. Смешивание биомассы с защитной средой: стерилизованное обезжиренное молоко, водный раствор лимоннокислого натрия, водная суспензия желатозы, водный раствор сахарозы, водный раствор никотиновой кислоты; стерилизованное обезжиренное молоко, водный раствор лимоннокислого натрия, водный раствор поваренной соли, водный раствор никотиновой кислоты.

6. Срок хранения бактериального концентрата - при температуре от минус 6°С до минус 18°С не более б месяцев со дня выработки._

1. Наращивание биомассы ацидофильных молочнокислых палочек на питательной среде: гидролизованное молоко - 500 см3/дм3, обезжиренное сухое молоко - 25 г/дм3 и VIS-START TW50 - 25 г/дм3, дрожжевой экстракт - 4 г/дм3.

2. Предварительная стерилизация гидролизованного молока при давлении 0,1 МПа с выдержкой (15±1) мин., последующая стерилизация смеси компонентов при давлении 0,08 МПа с выдержкой (60±5) минут.

3. Условия культивирования t=(41±l)"C, рН=(5,7±0,1), 5% инокулята, нейтрализатор - водный раствор NH4OH с массовой долей NHjOH 20% или смесь водного раствора с массовой долей NH^OH 20% и водного раствора Na2COj с массовой долей Na2C03 20% в соотношении 1:1.

4. Продолжительность культивирования до отделения биомассы -(7,0±0,5) ч.

5. Смешивание биомассы с защитной средой: стерилизованное обезжиренное молоко, водный раствор лимоннокислого натрия; водный раствор сахарозы, водный раствор уксуснокислого натрия.

6. Срок хранения бактериального концентрата при температуре минус (18±2)"С не более 9 месяцев со дня выработки._

В главе «Опытно-промышленная выработка бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек» приведены результаты промышленной выработки бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек.

В соответствии с усовершенствованной и утвержденной технической документацией на экспериментальном заводе ГНУ ВНИМИ, в цехе заквасок

была проведена опытно-промышленная выработка бактериального концентрата. В результате был получен бактериальный концентрат с количеством клеток 6хЮ|0КОЕ/г ацидофильных молочнокислых палочек, массовая доля влаги в бактериальном концентрате - не более 5%, что соответствует требованиям технической документации на бактериальный

концентрат ацидофильных молочнокислых палочек, (таблица 3)

Таблица 3

Характеристика бактериальных концентратов

Наименование показателя Выработанный бактериальный концентрат Норма для бактериального концентрата (ТУ 9229-369-00419785-04)

Внешний вид и консистенция Однородный сухой порошок Однородный сухой порошок

Цвет От кремоватого до светло-коричневого по всей массе порошка От кремоватого до светло-коричневого по всей массе порошка

Микроскопический препарат Палочки крупные и средней длины, одиночные и в коротких цепочках Палочки крупные и средней длины,одиночные и в коротких цепочках

Количество молочнокислых бактерий, КОЕ/г, не менее 6x10'" 10'"

Количество дрожжей и плесневых грибов, КОЕ/г, не более Отсутствуют в 1,0 г 5,0

Масса бактериального концентрата в г, в которой не допускаются БГКП Отсутствуют в 1,0 г Отсутствие в 1,0 г

S. aureus Отсутствуют в 1,0 г Отсутствие в 1,0 г

Патогенные, в том числе сальмонеллы Отсутствуют в 10,0 г Отсутствие в 10,0 г

В главе «Выработка опытно-промышленной партии кисломолочного продукта «Ацикор» приведены результаты выработки и клинических исследований кисломолочного продукта.

Полученный бактериальный концентрат был применен при производстве кисломолочного продукта «Ацикор» ТУ 9222-481-00419785-10 (бактериальный концентрат - Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus).

Для производства кисломолочного продукта «Ацикор» бактериальный концентрат ацидофильных молочнокислых палочек и бактериальный концентрат термофильного стрептококка вносили непосредственно в пастеризованную (92±2)°С в течение 5 минут и охлажденную до температуры заквашивания (37±1)°С нормализованную смесь. Молоко перемешивали в

22

течение 30 минут. Время сквашивания составило 5 часов, кислотность сгустка составляла (95±2)°Т. Все показатели соответствовали нормативной документации. Органолептические, физико-химические и микробиологические показатели образцов представлены в таблице 4.

Таблица 4

Органолептические, физико-химические и микробиологические показатели кисломолочного продукта «Ацикор»

Наименование показателя Выработанный кисломолочный продукт Норма для кисломолочного продукта «Ацикор»

Внешний вид и консистенция Однородная с нарушенным сгустком Однородная с нарушенным сгустком - при резервуарном способе производства; с ненарушенным - при термостатном. На поверхности продукта допускается незначительное отделение сыворотки.

Вкус и запах Чистый, кисломолочный Чистый, кисломолочный

Цвет Молочко-белый Молочно-белый, слегка кремовый

Массовая доля жира, % 3,2±0,1 3,2

Массовая доля белка,% 2,8±0,03 2,8

Массовая доля COMO, % 7,8±0,03 7,8

Кислотность, иТ 95±2 От 90 до 120 включительно

Количество молочнокислых микроорганизмов на конец срока годности, КОЕ/см3 2,5x10" 1х107

Количество плесневых грибов, КОЕ/см3, не более Отсутствуют в 1,0 см3 50

Количество дрожжей, КОЕ/см3, не более Отсутствуют в 1,0 см3 50

Бактерии группы кишечных палочек (БГКП) Отсутствуют в 0,1 см3 Отсутствие в 0,1 см3

Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы Отсутствуют в 25 см3 Отсутствие в 25 см3

S. aureus Отсутствуют в 1,0 см"1 Отсутствие в 1,0 см3

Микроскопический препарат Палочки крупные и средней длины, одиночные и в коротких цепочках, диплококки и цепочки кокков разной длины Палочки крупные и средней длины, одиночные и в коротких цепочках, диплококки и цепочки кокков разной длины

Были проведены клинические исследования кисломолочного продукта «Ацикор» на крысах в ФГБУ НИИ питания РАМН, где оценивали воздействие ацидофильных молочнокислых палочек на общее состояние животных, динамику их массы тела, микробиоценоз толстой кишки, гематологические показатели и иммунный статус. В результате проведенных исследований установили положительное влияние продукта. Это проявлялось в более высоком количестве анаэробных и аэробных бактерий, уровне защитных популяций энтеробактерий, а также снижение численности условно-патогенной микрофлоры. Полученные данные свидетельствовали о выраженном проявлении антагонистической активности пробиотического штамма ацидофильных молочнокислых палочек в составе продукта в отношении потенциально патогенных микроорганизмов.

Выводы

1. Комплекс проведенных исследований позволил экспериментально установить, научно обосновать технологические параметры культивирования, подготовки, обработки клеток ацидофильных молочнокислых палочек для производства пробиотического бактериального концентрата.

2. Изучены и проанализированы производственно-ценные и пробиотические свойства коллекционных культур ацидофильных молочнокислых палочек. Отобран штамм ацидофильных молочнокислых палочек по следующим критериям: высокой урожайности клеток при культивировании на питательной среде, высокой кислотообразующей активности, низкой постокислительной активности и выраженной антагонистической активности по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам.

3. Выявлены закономерности роста ацидофильных молочнокислых палочек на различных питательных средах. На основании полученных данных разработана питательная среда для наращивания бактериальной массы пробиотического штамма ацидофильных молочнокислых палочек.

4. Разработаны технологические параметры накопления биомассы ацидофильных молочнокислых палочек при периодическом культивировании: питательная среда, состоящая из гидролизованного молока - 500 см3/дм3, обезжиренного сухого молока - 25 г/дм3, VIS-START TW50 - 25 г/дм3 и дрожжевого экстракта - 4 г/дм3; доза и вид инокулята - стерилизованное обезжиренное молоко (5,0±0,5)%; температура культивирования - (41±1)°С; активная

кислотность среды - (5,7±0,1) ед. рН, продолжительность культивирования (7,0±0,5) ч., вид нейтрализатора - водный раствор NH4OH с массовой долей NH4OH 20% или смесь водного раствора с массовой долей NH4OH 20% и водного раствора Na2C03 с массовой долей Na2C03 20% в соотношении 1:1.

5. Установлено, что наибольшая выживаемость клеток ацидофильных молочнокислых палочек при замораживании, высушивании и дальнейшем хранении достигается при отделении культуры в конце логарифмической фазы роста.

6. Выбран состав защитных сред для биомассы ацидофильных молочнокислых палочек, обеспечивающих максимальную выживаемость при сублимационной сушке: стерилизованное обезжиренное молоко с водным раствором лимоннокислого натрия и водный раствор сахарозы с уксуснокислым натрием.

7. Сравнительные исследования сублимационной и вакуумной сушки показали, что выживаемость микроорганизмов в процессе сушки составляла -84% и 60% соответственно, в процессе хранения количество клеток в концентратах снижалось и через 9 месяцев отличалось незначительно, составляя 21% для двух видов сушки.

8. Определены сроки хранения сухого бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек при температуре минус (18±2)°С не более 9 месяцев со дня выработки

9. Усовершенствована биотехнология бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек и утверждено Изменение №2 в «Технологическую инструкцию по производству заквасок, бактериальных концентратов, дрожжей и тест-культур». Проведена опытно-промышленная выработка бактериального концентрата и кисломолочного продукта «Ацикор».

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Раскошная Т.А. Определение генетических детерминантов, ответственных за проявление технологических свойств у стартовых культур молочнокислых бактерий: тестирование наличия генов синтеза экзополисахаридов у производственных штаммов Lactobacillus helveticus. Научно-инновационный подход при моделировании технологического процесса производства заквасок прямого внесения / С.Г. Ботина, А.А. Абрамова, Т.А. Раскошная, В.В. Зинченко, Н.В. Коробан, М.М. Бабыкин // Сборник материалов всероссийской научно-практической конференции «Принципы

пищевой комбинаторики - основа моделирования поликомпонентных пищевых продуктов» Углич 2010. - С. 33-34.

2. Раскошная Т.А. Конструирование питательной среды для культивирования ацидофильной молочнокислой палочки / В.Ф. Семенихина, Т.А. Раскошная // Мат 4-ой конференции молодых ученых и специалистов институтов Отделения «Хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» Россельхозакадемии» Научно-инновационные технологии как основа продовольственной безопасности Российской Федерации. Москва 2010. -с. 172-174.

3. Раскошная Т.А. Исследование инновационных технологий производства бактериальных концентратов и пробиотических продуктов на их основе / В.Г. Будрик, Т.А.Раскошная., О.В.Соколова, А.А.Абрамова // Мат. Конф. 4.2 Инновационные пути в разработке ресурсосберегающих технологий производства и переработки сельхозпродукции. Волгоград 2010. - С.162-166

4. Раскошная Т.А. Изучение влияния температуры и рН среды на размножение ацидофильной молочнокислой палочки / В.Ф. Семенихина, Т.А. Раскошная // Научное обеспечение молочной промышленности: Сб. науч. Трудов. М.: ГНУ ВНИМИ, 2010. - С.156-159.

5. Раскошная Т.А. Питательные среды для культивирования ацидофильной молочнокислой палочки / В.Ф. Семенихина, Т.А. Раскошная // Молочная промышленность. - 2010. - №11 - С. 39.

6. Раскошная Т.А. Разработка технологий производства заквасок прямого внесения / В.Д. Харитонов, В.Ф. Семенихина, В.Г. Будрик, И.В. Рожкова, Д.В. Харитонов, Т.А. Раскошная, Н.С. Пряничникова, О.М. Кузьмина // Научное обеспечение молочной промышленности: Сб. науч. трудов. М.: ГНУ ВНИМИ, 2010.-С.211-218.

7. Раскошная Т.А. Разработка режимов культивирования молочнокислых палочек для получения бактериального концентрата /В.Ф. Семенихина, Т.А. Раскошная // Международная научно-практическая конференция «Инновационные технологии - основа модернизации отраслей производства и переработки сельскохозяйственной продукции», ИУНЛВолг ГТУ 4.2., г. Волгоград. 2011.- С. 257-261.

Подписано в печать:

20.02.2012

Заказ № 6696 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

61 ¡2-5/1656

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЛОЧНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ (ГНУ ВНИМИ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ)

На правах рукописи

РАСКОШНАЯ ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА АЦИДОФИЛЬНЫХ МОЛОЧНОКИСЛЫХ ПАЛОЧЕК ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных

продуктов и холодильных производств

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ В.Ф. Семенихина

Москва 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Список используемых сокращений..........................................4

Введение...........................................................................5

Глава 1. Литературный обзор.................................................10

1.1 Продукты функционального питания на основе микроорганизмов и их воздействие на организм человека............................................10

1.2 Характеристика рода Lactobacillus......................................15

1.3 Технология бактериальных концентратов и влияние технологических параметров на качество продукта.............................25

Глава 2. Организация работы, объекты и методы исследований......39

2.1 Организация работы.......................................................39

2.2 Объекты и материалы исследований...................................45

2.3 Методы исследований.....................................................47

Глава 3. Изучение биотехнологических и пробиотических свойств

штаммов ацидофильных молочнокислых палочек...............................51

Глава 4. Оптимизация параметров выработки бактериального концентрата..............................................................................56

4.1 Исследование влияния компонентов сред на интенсивность размножения ацидофильных молочнокислых палочек и разработка состава питательной среды.....................................................................56

4.2 Исследование влияния технологических параметров периодического культивирования на интенсивность развития ацидофильных молочнокислых палочек..........................................64

4.3 Сравнительный анализ сублимационной и вакуумной сушки по выживаемости клеток в бактериальном концентрате после высушивания и в процессе хранения..................................................................71

4.4 Уточнение влияния отдельных технологических факторов на качество бактериального концентрата............................................73

4.5 Определение сроков хранения сухих бактериальных концентратов ацидофильных молочнокислых палочек........................79

4.6 Совершенствование биотехнологии бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек...........................................80

4.7 Опытно-промышленная выработка бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек...........................................87

4.8 Выработка опытно-промышленной партии кисломолочного продукта «Ацикор».....................................................................88

Выводы............................................................................93

Список использованной литературы........................................95

Приложения.....................................................................131

Приложение 1..................................................................131

Приложение 2..................................................................133

Приложение 3...................................................................135

Приложение 4..................................................................137

Приложение 5..................................................................139

Приложение 6..................................................................140

Приложение 7..................................................................141

Приложение 8..................................................................142

Приложение 9...................................................................143

Приложение 10.................................................................144

Приложение 11.................................................................145

Приложение 12.................................................................147

Приложение 13.................................................................148

Приложение 14.................................................................150

Приложение 15.................................................................151

Приложение 16.................................................................152

Приложение 17.................................................................153

Приложение 18.................................................................156

Приложение 19.................................................................158

Список используемых сокращений

БГКП - бактерии группы кишечных палочек;

ГНУ ВНИМИ - Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности;

ГНУ ВНИХИ - Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт холодильной промышленности;

ГОСТ - государственный отраслевой стандарт;

ГИСК им. Тарасевича - Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича;

КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов;

МПА - мясо-пептонный агар;

ФГБУ НИИ питания РАМН - Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт питания» Российской академии медицинских наук;

СанПиН - санитарные нормы и правила;

COMO - сухой обезжиренный молочный остаток;

ТУ - технические условия;

ФГУ ФНЦТИО им. акад. В.И. Шумакова - Федеральное государственное учреждение Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Производство кисломолочных продуктов основано на регулировании микробиологических процессов, интенсивность течения которых зависит от свойств используемых микроорганизмов. В России традиционно выпускается широкий ассортимент кисломолочных продуктов, значительную часть которых занимали продукты, производимые с использованием ацидофильных молочнокислых палочек, являющихся представителями нормальной кишечной микрофлоры. Клинические испытания этих продуктов показали их высокое лечебно-профилактическое действие при различных желудочно-кишечных заболеваниях. [15, 31, 41, 258, 139, 140, 174, 175, 248, 249, 251, 255, 258, 307]. По сути это были первые кисломолочные продукты, которые по принятой в настоящее время терминологии называются продуктами с «пробиотическими» свойствами. Необходимость производства этой группы кисломолочных продуктов диктуется ухудшением экологической обстановки, качества питьевой воды и увеличением дисбактериоза у людей, связанных с употреблением антибиотиков при лечении различных заболеваний.

Разработке кисломолочных продуктов с пробиотическими свойствами посвящены работы Королевой Н.С., Банниковой JI.A., Семенихиной В.Ф., Ганиной В.И., Рожковой И.В., Лизько H.H., Поспеловой В.В., Гончаровой Г.И., Сундуковой М.Б., Mitchell Н.К., Snell Е.Е., Rogosa М., Briggs М., De Man J.C., Sharpe M. E., Fry R.M. и других. [1, 2, 3, 4, 5, 11, 12, 20, 28, 29, 30, 32, 44, 45,46, 122, 219, 280, 281]

Развитие биотехнологических процессов производства кисломолочных продуктов связано с разработкой и использованием бактериальных концентратов, которые позволяют интенсифицировать технологический процесс, снизить возможность появления бактериофага и получать высококачественный продукт, так как исключается

последовательная перевивка заквасок на производстве, в результате чего может меняться видовой состав заквасок и их свойства. В развитии биотехнологии бактериальных концентратов большое внимание уделяется увеличению количества жизнеспособной микрофлоры в них, что обеспечивается разработкой новых питательных сред и совершенствованием режимов культивирования, позволяющих получить высокое количество клеток микроорганизмов в концентрате и выход биомассы. [3, 5, 11, 18, 36, 55, 284] Поэтому работа, направленная на разработку и совершенствование биотехнологии бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек со стабильными показателями качества является актуальной.

Цель и задачи исследований

Целью настоящей работы является совершенствование биотехнологии бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек, предназначенного для производства кисломолочных продуктов с пробиотическими свойствами.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

- исследовать производственно-ценные свойства и антагонистическую активность различных штаммов ацидофильных молочнокислых палочек;

- исследовать влияние компонентов питательных сред (в том числе дрожжевого экстракта и автолизата, микроэлементов, агара, №(СН3СОО), источника ненасыщенных жирных кислот Т\¥ЕЕМ 80, стимулирующей добавки «Флоравит») на интенсивность размножения ацидофильных молочнокислых палочек;

- разработать состав и уточнить режимы подготовки биологически полноценной, технологичной в применении питательной среды для накопления биомассы пробиотического штамма ацидофильных молочнокислых палочек при периодическом культивировании;

- исследовать влияние технологических параметров периодического культивирования (вида и дозы инокулята, температуры и рН культивирования, вида нейтрализатора) на интенсивность развития ацидофильных молочнокислых палочек;

- исследовать влияние возраста популяции клеток и состава защитной среды на выживаемость ацидофильных молочнокислых палочек в процессе сушки;

- сравнить сублимационную и вакуумную сушку по выживаемости клеток и хранимоспособности бактериального концентрата;

- исследовать изменение концентрации жизнеспособных клеток ацидофильных молочнокислых палочек в процессе хранения бактериального концентрата и установить сроки хранения;

- усовершенствовать биотехнологию бактериального концентрата пробиотической культуры ацидофильных молочнокислых палочек и утвердить изменение к технической документации;

- провести опытно-промышленную выработку бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек и кисломолочного продукта «Ацикор» в производственных условиях.

Научная новизна работы

- получены новые данные о пробиотических и биотехнологических свойствах культур ацидофильных молочнокислых палочек;

- доказана интенсификация роста ацидофильных молочнокислых палочек и увеличение выхода биомассы при использовании оптимизированной по составу питательной среды и разработанных режимов культивирования;

- установлена зависимость между выживаемостью ацидофильных молочнокислых палочек в бактериальном концентрате и возрастом популяции клеток;

- научно обоснованы технологические процессы производства бактериального концентрата с высоким содержанием клеток ацидофильных молочнокислых палочек;

- получены сравнительные данные по выживаемости клеток и хранимоспособности бактериальных концентратов ацидофильных молочнокислых палочек, высушенного сублимационной и вакуумной сушкой.

Практическая ценность работы

По результатам работы разработано и утверждено Изменение №2 в «Технологическую инструкцию по производству заквасок, бактериальных концентратов, дрожжей и тест-культур».

По данной технологии в Цехе заквасок ГНУ ВНИМИ освоено производство бактериального концентрата ацидофильных молочнокислых палочек, которое подтверждено «Актом опытно-промышленной выработки концентрата ацидофильных молочнокислых палочек».

Разработана технология кисломолочного продукта «Ацикор» ТУ 9222-481-00419785-10 (бактериальный концентрат - Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus) для реализации населению.

Апробация результатов работы

Результаты были доложены и обсуждены на Всероссийском смотре-конкурсе лучших пищевых продуктов, продовольственного сырья и инновационных разработок, г. Волгоград 2010 г; на 4-ой конференции молодых ученых и специалистов институтов Отделения «Хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» Россельхозакадемии, Москва 2010 г; на Международной научно-практической конференции «Инновационные технологии - основа модернизации отраслей производства и переработки сельскохозяйственной продукции» г. Волгоград 2011 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 1 статья в рекомендуемых ВАК изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, результатов эксперимента и их анализа, выводов, списка использованной литературы (314 наименований источников, в том числе 250 работ зарубежных авторов) и приложений. Основная часть работы изложена на 130 стр., из них Ц таблиц и 19 рисунков.

Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Продукты функционального питания на основе микроорганизмов и их воздействие на организм человека

Анализ состояния здоровья населения, проводимый в последние несколько десятилетий ведущими специалистами в области здравоохранения, убедительно свидетельствует о неуклонном росте числа лиц, страдающих или склонных к различным заболеваниям, прежде всего так называемые оппортунистические инфекции, поражающие новорожденных и больных, находящихся в стационарах, болезни сердца и сосудов, рак, мочекаменная и желчекаменная болезни, бронхиальная астма и другие аллергические заболевания, гепатиты различного происхождения, ожирение, подагра, остеохондроз и другие поражения суставов, остеопороз, диабет и другие.[61, 63, 132, 215, 289]

С начала 80-х годов увеличение числа болезней человека стали связывать с ухудшением состояния окружающей среды антропогенного происхождения, высокой степенью урбанизации, гиподинамией, химизацией сельскохозяйственного и промышленного производства, широким внедрением в быт и здравоохранение новых химических соединений синтетической природы и т.д. Неоднократно высказывалось мнение, что рост числа болезней в наибольшей степени обусловлен увеличением стрессовых воздействий на человеческую популяцию на протяжении жизни нескольких поколений, все возрастающим снижением физической активности, а также внедрением современных технологий выращивания, хранения, подготовки и переработке сырья и продуктов питания, возросшим употреблением лекарственных препаратов, искусственных вкусо-ароматических и других пищевых добавок. [19, 60, 61,63, 117]

Особенно существенно эти изменения затронули пищевой рацион и привычки приема пищи. Одним из моментов, характеризующим существенное изменение диеты современного человека, является

10

уменьшение поступления в его организм молочнокислых бактерий. Действительно, в настоящее время жители развитых стран употребляют в миллионы и более раз меньше подобных микроорганизмов, чем их древние предшественники. К сожалению, из-за внедрения термической обработки продуктов питания, повышенных гигиенических требований к составу и абсолютному содержанию попадающих в организм человека молочнокислых и иных микроорганизмов заметно изменился и уменьшился. Как следствие этого, сроки формирования нормальной микрофлоры резко возросли, изменился качественный и количественной ее состав. Этому же способствовало широкое использование в XX веке антибиотиков и других антимикробных препаратов, как в медицине, так и в быту.[19, 60,61,63]

Общепринятым способом сохранения и восстановления нарушенных микробиоценозов в настоящее время является бактериотерапия. Основным и клинически доказанным средством бактериотерапии служат пробиотики, пребиотики, синбиотики, а так же продукты функционального питания. Термин «пробиотики» в буквальном переводе двух слов «про» и «био» означает «для жизни» в отличие от «антибиотиков» - «против жизни». Пробиотики - живые микроорганизмы, оказывающие благотворный эффект на здоровье человека, реализующийся в желудочно-кишечном тракте. Пробиотические продукты - это ферментированные продукты, приготовленные с использованием пробиотических культур, или продукты, обогащенные ими. Среди бактерий, используемых для изготовления пробиотиков, широкое применение находят представители рода Lactobacillus, Bifidobacterium, Propionibacterium и Streptococcus, которые являются представителями нормальной кишечной микрофлоры человека. [19, 26, 60, 61, 63, 104, 123, 139, 140, 167, 170, 176, 193, 203, 251, 253, 256, 302]

К настоящему времени в литературе опубликовано большое количество экспериментальных данных и клинических наблюдений о

11

выраженной профилактической и терапевтической эффективности пробиотиков и продуктов функционального питания, приготовленных на основе специально отобранных штаммов лактобацилл. Клинические состояния, при которых продукты функционального питания, содержащие пробиотические культуры, оказывали профилактический и/или лечебный эффект:

- микроэкологические нарушения желудочно-кишечного тракта (дисбактериозы); [15, 41, 258]

- предродовая подготовка беременных групп риска на инфекционные осложнения;[15, 41, 48, 164, 258, 271, 309]

острые кишечные инфекции (дизентерия, колиинфекция, сальмонеллез, стафилококковый энтероколит, ротавирусная инфекция, диареи невыясненной этиологии и др.);[15, 41, 175, 255, 258, 307]

- хронические воспалительные заболевания толстой и тонкой кишок (колиты, вызванные Clostridium defficile, болезнь Крона, синдром раздражения толстой кишки, синдром мальабсорбции);[15, 31, 41, 139, 140, 251,258]

- гастриты, гастродуодениты, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки; [31, 174]

- сахарный д