автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Разработка технологии получения жирорастворимых биологически активных веществ из биомассы гриба Blakeslea trispora

Введение.

1. Обзор литературы.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Характеристика сырья и основные методы исследований.

2.2. Разработка процесса экстракции биолипидного комплекса из биомассы гриба Bl. trispora.

2.3. Разработка процесса выделения Р-каротина.

2.4. Разработка процесса осаждения фосфолипидов.

2.5. Разработка процесса омыления нейтральных липидов.

2.6. Разработка экстракционного процесса выделения неомыляемой фракции липидов и гидролиза жирных кислот.

2.7. Разработка процесса выделения эргостерина из неомыляемой фракции липидов.

2.8. Разработка процесса адсорбционного выделения концентрата убихинонов.

2.9. Разработка процесса кристаллизации убихинонов.

2.10. Разработка технологического процесса комплексной переработки биомассы гриба Bl. trispora.

3. Влияние условий культивирования на фракционный состав биомассы гриба Bl. trispora.

4. Исследование возможности получения водорастворимого препарата убихинонов при использовании фракции фосфолипидов гриба Bl. trispora.

Биологически активные добавки к пище (БАД) - нутрицевтики, парафармацевтики вошли в нашу жизнь сравнительно недавно, хотя применение активных природных компонентов из растительного, животного сырья наземного и водного происхождения известно с давних времен. В последние годы это направление получило значительное развитие и основано на концепции так называемого позитивного питания. Основа этой концепции определена современными представлениями о роли и значении для жизнедеятельности человека отдельных пищевых веществ, а также новыми данными о механизмах действия и биотрансформации многих природных соединений. Согласно теории позитивного питания предпочтение отдается функциональным или физиологически активным продуктам, которые содержат ингредиенты, повышающие сопротивляемость организма многим заболеваниям, способствующие улучшению физиологических процессов в организме человека, позволяющие долгое время сохранять активный образ жизни. Особую актуальность эта проблема приобретает в настоящее время в связи с загрязнением окружающей среды, увеличением доли таких заболеваний, как сердечно-сосудистые, злокачественные новообразования, лучевое поражение и другие, а также острой необходимостью в профилактике этих заболеваний.

Создание и использование в рационе питания пищевых добавок, содержащих каротиноиды, убихиноны, полиненасыщенные жирные кислоты, некоторые фосфолипиды и витамины группы D, обладающих лечебно-профилактическим действием, позволяет повысить уровень адаптационной защиты организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека и снизить риск развития злокачественных новообразований и ряда других опасных заболеваний.

На основании медико-биологических исследований во многих индустриально развитых странах мира во второй половине XX века были разработаны технологии и организовано большое количество промышленных производств указанных выше биологически активных веществ (БАВ). Наибольшее количество технологий и научных статей по проблемам получения и применения (3-каротина, убихинонов, эргостерина опубликовано в Японии, США, России, ФРГ, Великобритании, Италии и ряде других стран. Биотехнологическими способами в нашей стране уже в течение длительного времени получают [3-каротин из биомассы гриба Blakeslea trispora, и эргостерин из дрожжей рода Sacch. cerevisiae или Sacch. carlbergensis .Российскими специалистами предложен ряд методов химического синтеза убихинонов и их аналогов, а также биотехнологические методы получения высших гомологов убихинона из липидов дрожжей рода Candida и из биомассы бактерий Gluconobacter. Для одновременного получения эргостерина и убихинонов предложены способы использования дрожжей рода Candida и некоторые другие. Значительное количество технологий предложено российскими специалистами по получению фосфолипидов и убихинонов из растительных (подсолнечное и кукурузное масло, некоторые виды морских водорослей) и животных (некоторые виды морских животных и рыб) клеток.

Однако, высокая потребность в указанных БАВ, выявленные недостатки в существующих методах получения БАВ, значительные негативные изменения, происходившие в начале 90-х годов XX столетия в промышленном (в т.ч. биотехнологическом) секторе экономики России, необходимость совершенствования существующих технологических схем определили актуальность проведения исследований по созданию технологии комплексного получения гаммы БАВ из биомассы гриба Bl. trispora. Организация отечественного производства на основе ценных липофильных веществ позволит расширить ассортимент биологически активных пищевых добавок для широких слоев населения России, с целью профилактики 4 онкологических, радиологических и большого числа других заболеваний. Кроме того, данные БАВ (Р-каротин, убихиноны, эргостерин, фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты) находят широкое применение в косметической промышленности, фармакологии и медицине.

Целью настоящей работы является разработка технологии одновременного получения ряда БАВ липидной природы: Р-каротина, фосфолипидов, эргостерина, полиненасыщенных жирных кислот и убихинонов из биомассы гриба Bl. trispora.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи работы:

- разработать рекомендации по оптимизации основных стадий технологического процесса комплексной переработки биомассы гриба В1. trispora с возможностью одновременного получения Р-каротина, убихинонов, эргостерина, фосфолипидов, полиненасыщенных жирных кислот

- разработать технологию одновременного получения жирорастворимых БАВ из биомассы гриба Bl. trispora

- изучить возможность изменения фракционного состава липидов гриба Bl. trispora путем изменения физико-химических параметров процесса ферментации разработать метод получения водорастворимой формы убихинонов с использованием фракций выделенных в результате комплексной переработки Научная новизна работы заключается в разработке:

- определены оптимальные параметры проведения процессов комплексной переработки биомассы гриба Bl. trispora.

- разработана новая технология одновременного получения ряда продуктов пищевого, медицинского и фармакологического назначения.

- показана возможность снижения уровня нейтральных липидов в биомассе гриба Bl. trispora и увеличения концентрации эргостерина и убихинонов путем изменения физико-химических параметров процесса ферментации.

- разработана методика получения водорастворимого препарата убихинона с использованием компонентов получаемых в результате комплексной переработки липидов - фосфолипидов и убихинонов.

Практическая ценность работы.

На основании проведенных исследований разработана технология комплексной переработки биомассы гриба Bl. trispora. Данная технология позволяет получать в едином технологическом процессе несколько ценных целевых продуктов липидной природы: (3-каротин, убихиноны, эргостерин, фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты. При этом достигается более полное использование сырья, что делает данную технологию конкурентоспособной на рынке производства БАВ.

На основании проведенных исследований разработан лабораторный регламент получения БАВ из биомассы гриба Bl. trispora, и технологический регламент на проектирование камеральной установки по переработке биомассы гриба Bl. trispora мощностью 100 кг в месяц по исходному сырью. В настоящее время технологическая схема комплексной переработки биомассы внедряется в промышленных условиях калужского завода химической и фармацевтической продукции-ОАО «Аромасинтез».

Разработанные методы получения водорастворимых форм убихинонов с использованием фосфолипидов, полученных из биомассы гриба Bl. trispora позволяют существенно расширить область применения и способы введения в организм данных биологически активных веществ.

Апробация работы.

Материалы исследований обсуждались на международной конференции молодых ученых «Химия и технология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов» (г. Москва, 2000 год), Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г. Саранск, 2001 год), 6

Международной конференции «От фундаментальных исследований к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Москва-Тверь, 2001 год), а также на лабораторных коллоквиумах лаборатории «Биологически активных веществ» и межлабораторных коллоквиумах ФГУП «ГосНИИсинтезбелок»

Публикации.

По материалам экспериментальной работы опубликовано 5 печатных работ, получены положительные решения на два патента.

Работа выполнена в лаборатории «Биологически активных веществ» ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ».

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. О важной роли биологически активных веществ, как компонента пищи.

Одним из важнейших факторов, определяющих состояние здоровья населения, является рациональное питание, которое необходимо для поддержания нормального функционирования здорового организма, создаёт условия для физического и умственного развития, поддерживает высокую работоспособность, способствует профилактике заболеваний и повышает способность организма противостоять воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Ценность пищи состоит в том, что она является источником энергетических и пластических материалов, а также биологически активных веществ.

В основу рационального питания положен принцип сбалансированности потребляемой пищи, благодаря чему обеспечивается оптимальная потребность организма в пищевых и биологически активных веществах, способных проявлять в организме максимум своего полезного действия. Сбалансированное питание предусматривает наилучшие количественные и качественные взаимосвязи основных пищевых веществ: белков, углеводов, жиров, витаминов и минеральных веществ. Особое значение, по мнению основоположника современных принципов рационального питания академика А. А. Покровского, и ряда других видных ученых, работающих в этом направлении, имеет сбалансированность эссенциальных составных частей пищевых веществ: незаменимых аминокислот, жирных кислот, крахмала и Сахаров, взаимосвязи отдельных витаминов между собой и другими компонентами пищи, а также связь и влияние минеральных элементов на проявление биологических свойств в организме других пищевых веществ и их составных частей (139, 155, 78).

Длительное нарушение питания может привести к разнообразным изменениям, в основе которых лежат изменения метаболизма клеток, связанные либо с повреждением генетического аппарата, либо с недостаточностью незаменимых компонентов пищи или с их избыточностью. Эпидемиологические исследования, проводимые экспертной комиссией ВОЗ в 1993 году (Доклад исследовательской группы: Рацион, питание и предупреждение хронических заболеваний), продемонстрировали самую непосредственную стабильную взаимосвязь между пищевыми рационами и возникновением ряда заболеваний, в том числе патологии сердечнососудистой системы и злокачественных новообразований.

Выявленные изменения в характере питания населения способствуют снижению умственной и физической работоспособности и резистентности организма к неблагоприятным факторам. Наиболее остро проблема нерационального питания распространена среди так называемых уязвимых групп населения: детей, беременных женщин, пожилых людей.

Традиционно считается, что одним из важнейших способов решения проблемы несбалансированности питания является дополнительное употребление достаточного количество биологически активных веществ. У истоков решения этой проблемы стоят отечественные учёные: основоположник витаминологии М.И. Лунин, учёные, открывшие исключительно важную роль минеральных солей А .П. Доброславин и Ф.Ф. Эрисман. Большой вклад в развитие этой проблемы внёс академик А.А. Покровский, обосновав концепцию сбалансированного питания. Необходимость дополнительного приёма биологически активных веществ обосновал в своих работах лауреат Нобелевской премии профессор Л. Полинг, который показал, что употребление больших доз аскорбиновой кислоты повышает неспецифическую резистентность организма и снижает риск возникновения инфекционных заболеваний, однако, некоторые выводы его работы в последствии были подвергнуты сомнению, в частности, получены разноречивые результаты по изучению антиоксидантных и антирадикальных свойств аскорбиновой кислоты.

Управлению процессом поступления в организм биологически активных веществ с целью оздоровления посвящены работы отечественного учёного профессора И.И. Брехмана.

Особый вклад в развитие концепции о необходимости применения микронутриентов внесли академик РАМН В.А. Тутельян и профессор В.А. Княжев, под руководством которых сотрудниками Института питания РАМН ведётся большая работа в развитии нового направления -фармаконутрициологии, занимающего промежуточное место между наукой о питании и фармакологией. В настоящее время сотрудниками Института питания РАМН внедрены и усовершенствованы методики по обогащению пищевых продуктов витаминами, микроэлементами, белком, пищевыми волокнами. Благодаря внедрению новых прогрессивных технологий рационализация питания обеспечивается созданием продуктов заданного химического состава и повышенной пищевой ценности, лечебных и профилактических продуктов.

Накопленный международный опыт свидетельствует о том, что в силу различных объективных причин практически невозможно достигнуть оптимальной обеспеченности всех групп населения энергией и пищевыми веществами за счёт увеличения объёмов производства и расширения ассортимента продовольственных товаров. Одним из наиболее эффективных путей решения проблемы коррекции питания считается создание биологически активных добавок к пище (БАД), представляющих собой специализированные продукты профилактического и лечебного назначения, с одной стороны, и с другой стороны, придание БАД определённой фармацевтической формы приближает их к лекарственным препаратам. Создание биологически активных добавок к пище перевело решение проблемы сбалансированного питания на более высокий технологический уровень и позволило решить проблемы регуляции основных физиологических процессов организма. По сути, создание биологически активных добавок к пище представляет собой программу реализации научных теоретических предпосылок к регулированию жизнедеятельности и здоровья человека через питание, поставленное на промышленную основу.

1.2. БАВ - антиоксиданты, роль в регуляции процессов перекисного окисления липидов.

1.2.1. Свободнорадикальные формы кислорода.

Молекулы кислорода характеризуются наличием на внешних разрыхляющих ти-орбиталях неспаренных электронов с одинаковыми спинами. Это уникальное свойство придает им способность одномоментно принимать не более одного электрона, что препятствует спорадическим реакциям с потенциальными субстратами окисления в соответствии с принципом Паули, имеющими электроны с антипараллельными спинами. Только в ферментативных реакциях с участием цитохромоксидазы, способной обращать спин субстрата, происходит 4-электронное восстановление кислорода до воды. Это основной путь утилизации кислорода в клетке. В то же время 1-5 % кислорода превращается в воду в результате одноэлектронного восстановления с образованием в качестве промежуточных продуктов высокореакционноспособных свободнорадикальных форм кислорода (СРК). (175, 216, 254)

Свободные радикалы - самостоятельно существующие молекулы с неспаренными электронами на внешней орбитали. Подобная не стабильная электронная конфигурация обуславливает высокую реакционную способность и чрезвычайно короткий период существования свободных радикалов.

Схематически процесс одноэлектронного восстановления кислорода можно представить следующим образом: е +е +е +е 02 *02 -►ШЭг *0Н --*Н20

Помимо супероксидного и гидроксильного радикалов кислорода, при одноэлектронном восстановлении кислорода возникает гидропероксид водорода.

В современной биологической литературе часто применяют понятие «активные формы кислорода» (АФК). Этот термин объединяет собственно свободные радикалы кислорода и их разные производные. (46).

Биологические источники образования АФК и факторы, индуцирующие появление АФК, многообразны (46). Например, к основным экзогенным факторам можно отнести следующие:

- ионизирующая радиация

- курение

- пестициды

- воздействие озона

- хиноновые антибиотики, химиотерапевтические агенты

К эндогенным факторам образования АФК относят:

- стимуляция фагоцитирующих клеток опухолевыми промоуторами

- нефагоцитирующие клетки

- редокс цикл «хинон-семихинон»

- индукция синтеза прооксидантных ферментов

- ингибирование антиоксидантных ферментов

- индукция синтеза Ко-А оксидаз жирных кислот

- ишемия и реперфузия

АФК являются продуктами нормального клеточного метаболизма и при физиологически интенсивном образовании в условиях адекватного функционирования систем антиоксидантной защиты не представляют опасности. Однако чрезмерное усиление продукции АФК под влиянием

12 экзогенных и эндогенных факторов и/или вследствие недостаточной системы антиоксидантной защиты может приводить к развитию окислительного стресса (204).

Анализ влияния АФК на молекулы белков показал, что наиболее часто при этом повреждаются участки, содержащие остатки пролина, а также гистидиновые и аргининовые остатки, которые часто связаны с переходными металлами - катализаторами продукции гидроксильного радикала (264).

Среди наиболее серьезных и значимых последствий свободно радикальной атаки белков необходимо отметить их денатурацию и агрегацию (формирование белковых сшивок). Еще одним следствием воздействия АФК на белки является повышение их чувствительности к протеолизу (264).

Однако, несмотря на огромную значимость белков для жизнедеятельности клетки, основные негативные эффекты «окислительного стресса» ассоциируются с перекисным окислением липидов (ПОЛ).

Неконтролируемое, лавинообразное ПОЛ вызывает два фатальных последствия для клетки организма. Во-первых, необратимо нарушается структура липидов, входящих в состав биомембран, что неизбежно изменяет структуру и функции последних (216, 215). Во-вторых, в результате ПОЛ возникают цитотоксические соединения, среди которых наибольшую опасность представляют альдегиды. Альдегиды не только обладают выраженным цитотоксическим действием, но и способны инактивировать ферменты за счет образования белковых сшивок (215).

Установлено, что многие биосинтетические и деструктивные процессы сопряжены с механизмами окислительных превращений липидов. Не вызывает сомнения, что процессы ПОЛ клеточных мембран представляются наиболее важными с биологической точки зрения. Нарушение регуляции ПОЛ рассматривают в настоящее время в качестве патогенетического маркера целого ряда заболеваний. С этой позиции изучению биологической роли биоантиоксидантов как факторов, способных регулировать интенсивность пероксидации липидов, уделяется особенно важное внимание.

13

Цитотоксические свойства АФК обуславливают невозможность существования живых систем без специальных механизмов детоксикации продуктов одноэлектронного восстановления кислорода. В клетке и организме имеется достаточно большое количество белковых и низкомолекулярных соединений, обладающих антиоксидантными свойствами. Эти соединения определенным образом взаимодействуют между собой, что позволяет говорить о существовании системы антиоксидантной защиты (46).

1.3. Защита организма от АФК.

СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗА (СОД). Супероксиддисмутаза является важнейшим элементом антиоксидантной защиты организма. Это фермент из двух субъединиц с общей молекулярной массой 32 кДа, содержащий по одному атому меди и цинка (существует также марганец-содержащая СОД, обнаруженная в печени крысы и человека; в бактериальных клетках обнаружена железо-содержащая СОД). Фермент ускоряет распад О2" на 4 порядка.

Вторым эшелоном защиты организма от АФК являются пероксидаза и катал аза.

KATAJIA3A. Каталаза расщепляет перекись водорода, до которой дисмутирует супероксидный радикал, до молекул воды и молекулярного кислорода. В клетках каталаза в основном сосредоточена в пероксисомах, в которых содержатся и ферменты, продуцирующие перекись водорода, необходимую в ходе ряда процессов жизнедеятельности организма, в частности, в процессах неспецифической иммунной защиты.

ПЕРОКСИДАЗА. Пероксидаза, в особенности глутатион-пероксидаза, широко распространена в клетках животных и растений. Глутатион-пероксидаза состоит из 4 субъединиц в каждой из которых содержится по молекуле селена. В клетках этот фермент располагается в цитозоле и матриксе митохондрий.

Активность глутатион-пероксидазы зависит от содержания глутатиона клетки, что, в свою очередь, определяется активностью глутатионредуктазы и концентрацией НАДФ*Н, который образуется в пентозофосфатном метаболическом цикле. Лимитирующими органами по активности каталазы, являются легкие, мышцы, глаза.

ДРУГИЕ ФОРМЫ ЗАЩИТЫ ОТ АФК

В защите от АФК в организме участвуют и многие другие молекулы и ферментные системы (101). Прежде всего сюда относят группу низкомолекулярных акцептеров кислородных радикалов:

- водорастворимые компоненты (аскорбиновая кислота, мочевая кислота и др.)

- одно- и многоатомные спирты и сахара (этанол, рибоза, глюкоза, миоинозин, маннит)

- сульфгидрильные соединения (глутатион, цистеин)

- жирорастворимые компоненты (витамин Е (а-токоферол), биллирубин, убихиноны, Р-каротин, ликопин и некоторые другие)

Очевидным представляется поиск корректоров мутагенных эффектов среди природных антиоксидантных соединений.

К числу природных антиоксидантов (ингибиторов процессов окисления) относят токоферолы (ТФ) (витамин Е) (26,27,165,186,184,183,195,194,200), каротиноиды (64,65,185,222,226,238,239,259,258,257), витамины А, К (35,74,73,149,222) убихиноны (УХ) (коэнзим Q) (90,91,89,223,227,228,263), убихроменолы (QC) (263), флавоноиды (171,179,190,245236,262).

1.4. Биологические свойства {З-каротина.

По химической природе каротиноиды относятся к сильно ненасыщенным соединениям терпенового ряда, преимущественно с 40 углеродными атомами в молекуле, построенным по единому структурному принципу (25). Присутствие большого количества (11 и более) двойных связей придает каротиноидам высокую биологическую активность, которая проявляется в торможении процессов перекисного окисления липидов и определяет такие их биологические функции, как предотвращение предраковых и возрастных повреждений, радиационных поражений, сердечно-сосудистых заболеваний. Регуляторные эффекты каротиноидов обусловлены их способностью встраиваться в мембранные фосфолипидно-белковые структуры, изменять текучесть мембран в жидкокристаллическом состоянии. Это сопровождается модификацией контактов взаимодействия липидов, белков и может быть существенным фактором проявления антиоксидантной активности каротиноидов.

По мере увеличения длины полиеновой цепочки возрастает степень ее стабилизации и увеличивается антиоксидантная активность (61). На уровень антиоксидантной активности каротиноидов оказывает влияние также пространственная ориентация кольцевых групп. Так каротиноид ликопин, имеющий 11 центральных ненасыщенных двойных связей в виде планарной структуры обладает почти в два раза большей антиоксидантной активностью по сравнению с )3-каротином (61). При модификации кольцевых структур кето- и гидроксигруппами (лютеин, кантаксантин, зеаксантин и астаксантин) происходит как бы увеличение жесткой полиеновой структуры и снижение концентрации каротиноидов, необходимых для торможения перекисного окисления липидов.

Известно около 600 различных каротиноидов, из них только 10% обладают про-А-витаминной активностью. Наиболее распространенным в природе и хорошо изученным является бета-каротин. Он составляет 20-30% от суммы природных каротиноидов. Все исследования по биодоступности и метаболизму каротиноидов проведены в основном с использованием бета Ь-каротина. Симметричная структура молекулы, состоящая из двух остатков А с сопряженной системой пи-связей (см. рис 1.4.1), делает его уникальным с

Рис. 1.4.1 «Молекула Р-каротина».

СН3

P-carotene химической и биологической точек зрения.

В организме взрослого человека в среднем содержится 100-200 мг р-каротина, из них 80% депонируется в жировой ткани, 10% - в печени, около 1% содержится в плазме и 9% - в других органах и тканях (надпочечники, репродуктивные органы, мозг, легкие, сердце, почки, селезенка). Эпидемиологические и экспериментальные исследования убедительно показали, что снижение потребления и усвоения Р-каротина, низкий уровень его в плазме повышают риск возникновения рака, катаракты, сердечнососудистых и некоторых дегенеративных заболеваний (63,187,217,265).

Имеется значительное количество работ, описывающих эффект воздействия каротиноидов на свободнорадикальное окисление липидов, лежащее в основе патогенеза атеросклероза (82,206).

Большой интерес к этой проблеме вызван тем, что сердечнососудистые заболевания остаются основной причиной смертности среди мужчин и женщин. Исследования, проведенные в последние десятилетие, подтвердили, что антиоксидантная терапия может предохранять или препятствовать развитию атеросклероза. Было постулировано, что свободно-радикальное окисление играет существенную роль в патогенезе атеросклеротических заболеваний (253). p-Каротин является провитамином А природного происхождения с антиоксидантными свойствами по отношению к липидам, т.к. основная его часть растворена именно в жировой ткани. При циркуляции липидов он концентрируется также и в атеросклеротических бляшках (243).

Важно отметить, что в настоящее время, имеются данные, полученные в результате исследований, которые указывают на прямую связь между уровнем сывороточного Р-каротина и ишемической болезнью сердца (225).

У людей обнаружены значительные индивидуальные различия в уровне p-каротина в плазме крови, как до, так и после приема каротинсодержащих препаратов (181,169,199,180,255).

Уровень (3-каротина в плазме крови значительно ниже у курящих, алкоголиков, онкологических и кардиологических больных (240,250,252). Низкий уровень Р-каротина в крови связан не только с их дефицитом в пище или низкой биодоступности, но и усиленным расходованием в условиях неконтролируемого свободнорадикального окисления.

Culter (193), проанализировав большой массив экспериментальных и теоретических данных, выдвинул гипотезу, что длительность жизни различных видов может определяться теми же факторами, что и чувствительность к раку. Поскольку имеется много данных о том, что р-каротин и ретинол могут быть важными антиканцерогенными веществами, он исследовал их уровень в плазме как функцию продолжительности жизни и показал, что имеется положительная корреляция между уровнем Р-каротина в плазме крови (но не ретинола) и продолжительностью жизни приматов с коэффициентом корреляции г 0,926 (р<0,01). Не исключено, что при более глубоком исследовании будет обнаружена подобная корреляция между концентрацией p-каротина у индивидуумов и продолжительностью их жизни. Это не означает, что нужно стремиться к неоправданно высокому уровню Р-каротина в плазме. Коррекция должна быть разумной, удовлетворяющей физиологические потребности организма. Избыточное длительное потребление любого питательного, а тем более биологически активного вещества, сопровождается нарушением физиологического равновесного состояния организма. Не удивительно, что интервенционные исследования (3-карогина в комплексе с витамином Е в Финляндии дали негативные результаты (219).

1.5. Биологические свойства убихинонов.

1.5.1. Участие убихинонов в электронном транспорте.

Убихиноны - жирорастворимые органические вещества, принадлежащие к классу природных биохинонов.

Природные биохиноны играют существенную роль в важнейших биологических процессах (фотосинтезе, транспорте электронов, окислительном фосфорилировании), поэтому считают, что они по своей биохимической значимости имеют такое же значение, как АТФ, НАД и цитохромы (196).

Убихиноны были открыты независимо в двух лабораториях: Р. Мортоном с сотрудниками в Великобритании и Ф. Крейном с сотрудниками в США. Американские исследователи назвали выделенное ими вещество коферментом Q-275, поскольку максимум поглощения света этого вещества в ультрафиолетовой области приходится на 275 нм. (202).

Доказав, что убихинон играет огромную роль в обеспечении организма энергией, американский ученый Питер Митчелл в 1978 году получил Нобелевскую премию. Это открытие и сейчас называют одним из наиболее значительных за последние десятилетия. Было установлено, что биологически активный хинон, в отличие от других соединений хинонной природы, может образовываться в организме человека, а при благоприятных условиях - в достаточно больших количествах. И в таких случаях организм сам обеспечивает себя этим незаменимым продуктом.

По своей химической природе убихиноны представляют собой 2,3 -диметокси - 5 метил -1,4 бензохинон, у которого в положении 6 находится пренилъная цепь, состоящая из 1-13 пренильных звеньев (95). (см. рис.

1.5.1.).

Вскоре после открытия убихинонов началось изучение возможности применения этих соединений для лечения патологических состояний

Согласно исследованиям, проведенным в различных странах, установлено, что высшие гомологи убихинона, содержащие от 7 до 10 изопреноидных звеньев имеют широкую область терапевтического применения, что связано с их участием в переносе электронов в дыхательной цепи клетки (75).

Логическая схема, предложенная Фолкерсом и соавт. (202), исходит из того, что дефицит убихинона-10 в организме или в отдельных органах вызывает нарушения биоэнергетики клетки, т.е. дефицит убихинона является «болезнью энергии». Эти авторы подчеркивают, что эффективность при лечении убихинонами будет достигнута лишь у пациентов со значительным его дефицитом.

Известно, что убихиноны играют важную роль в жизнедеятельности клеток, они принимают участие в переносе электронов в дыхательной цепи (81,156). Спектрофотометрически было установлено, что убихинон подвергается окислению и восстановлению в процессе функционирования дыхательной цепи (144,218).

При биологическом окислении центральной реакцией является образование № путем переноса электронов субстратов на молекулярной 02 и присоединение к кислороду водорода из среды. организма (192).

Рис. 1.5.1 «Молекула убихинона».

СН^-О о ся, П

Биологическое окисление, осуществляемое в клетках, имеет значение не только потому, что дает основное количество энергии для жизнедеятельности тканей, но и потому, что освобождаемая в процессе окисления энергия локализуется в форме соединений, при помощи которых совершаются в организме все виды работы.

Весь сложный путь аэробного окисления различных субстратов можно представить как единую схему, где НАДНг и янтарная кислота являются главными субстратами мультиэнзимного комплекса, связанного с внутренней митохондриальной мембраной и катализирующего реакции:

НАДН2 + !/2 02 -► НАД + №0

СУКЦИНАТ + V2O2-► ФУМАРАТ +Н2О ж I, jtfqp

Стандартные потенциалы между НАДН2 и О2 имеют разность 1,14 В. fflJtf+J* Энергия, которая освобождается при этом градиенте потенциала, может использоваться для синтеза АТФ путем окислительного фосфорилирования. (см. рис. 1.5.2) (28,41).

Как видно, на рис. 1.5.2. убихинон в этой схеме принимает непосредственное участие. Поэтому многие исследователи считают, что по своей биохимической значимости убихиноны эквивалентны АТФ, НАД и цитохромам (196). показали, что убихинон-10 улучшает нарушенный метаболизм сердечной мышцы, повышает интенсивность кровотока независимо от частоты пульса, одновременно понижает

Рис. 1.5.2. «Транспорт электронов и окислительное фосфорилирование». сопротивление периферических сосудов. Механизм действия убихинона отличается от такового препаратов дигиталиса или диуретиков, убихинон не оказывает токсического действия, присущего этим группам лекарственных средств. Убихинон-10 оказался перспективным кардиотоническим средством для лечения ишемической болезни сердца (203).

Учитывая многочисленные исследования, предложено использование убихинона при язве желудка, для терапии эмфиземы легких, простатомегалии, облысения, в качестве хорошего радиопротекторного препарата, для лечения бронхиальной астмы, для усиления функции поджелудочной железы и др. заболеваний (69,122,123,124,125,126,128)

Таким образом, многочисленные экспериментальные и клинические исследования показывают перспективность терапии убихиноном заболеваний, связанных с нарушением биоэнергетики клетки и сопровождающихся недостаточностью убихинона в клетке.

1.5.2. Антиоксидантные свойства убихинонов.

Известно, что убихиноны в клетке могут присутствовать в восстановленной (дифенильной, гидрохинонной) форме, которой присущи антиоксидантные свойства (27). От 70% до 100% убихинона -10 в тканях человека находится в восстановленной форме (170).

Антиоксидантные свойства убихинонов обусловлены их способностью восстанавливаться в присутствии доноров электронов, конкурируя с окислительно-восстановительными системами, активирующими свободнорадикальные реакции в клетке (84). В отличие от а-токоферола убихиноны не содержат подвижных атомов водорода, способных взаимодействовать со свободными радикалами (76). Однако, они легко восстанавливаются в присутствии НАДФН. Нейтрализую радикалы, восстановленные производные, ингибируют ПОЛ, окисляясь при этом до исходных бензохинонов, включающихся в новый цикл окислительно-восстановительных превращений. В связи с этим, в отличие от фенольных

22 антиоксидантов, каждая молекула убихинона способна многократно участвовать в процессах перекисного окисления липидов (77).

В свою очередь, хиноновые формы убихинонов также могут взаимодействовать с супероксидными анион-радикалами, образую при этом семихинонные радикалы, способные обрывать цепи окисления при рекомбинации с перекисными радикалами липидов или при взаимодействии с ОН - группой семихинона (27). В этих же реакциях гибнут возможные центры инициирования окисления 02 - радикалы.

1.5.3. Радиопротекторные свойства убихинона.

Активно исследуется роль убихинонов в определении радиационной устойчивости организмов, что связано с важным значением антиокислительной активности мембранных липидов радиочувствительных органов (11). Показано, что у наиболее резистентных видов грызунов (крыс) содержание убихинона-9 в печени было выше (48), а при облучении крыс наблюдается повышение в 2-3 раза интенсивности биосинтеза убихинона в печени (81). Дополнительное введение убихинона-9 за 4-12 часов до у-облучения оказывает явно выраженное радиопротекторное действие (49,57), связанное со снижением радиационно-окислительного повреждения липидов внутриклеточных мембран, улучшении в них восстановительных процессов и влиянии их убихинона на структурную целостность мембран, а также их липидный состав (72).

1.6. Проблема инверсии эффекта некоторых антиоксидантов.

В настоящее время установлено, что антиоксидантную функцию как Р~ каротин, так и убихиноны сочетают с достаточно широким спектром биологического действия, не связанного непосредственно с антиокислительной активностью. Конкретные биохимические проявления действия биоантиоксидантов разнообразны и направлены на различные структурные, метаболические и регуляторные системы организма.

23

В тоже время, существует опасность отрицательных последствий вмешательства в механизм поддержания окислительно-восстановительного баланса в клетке, где свободные радикалы кислорода являются необходимым компонентом нормального метаболизма клеток (12).

В связи с этим, как указывают литературные данные, для многих антиоксидантов характерна инверсия эффекта с генопротекторного на генотоксический или опухолепромоцирующий (146,178).

Так, например, аскорбиновая кислота входит в состав клеточной антирадикальной цепи, с чем и связана ее роль антиоксиданта (10). Вместе с тем, обнаружена инверсия ее антиоксидантного эффекта, когда аскорбиновая кислота активирует развитие свободно радикальных процессов в клетке (45). Именно этим, по мнению А.Д. Дурнева (12), может объясняться двойственность данных, полученных при изучении ее генетических свойств, поэтому существуют данные, как по генотоксическому, так и по генопротекторному действию аскорбиновой кислоты (188).

Аналогичный эффект дозозависимой смены антиоксидантных эффектов на прооксидантный эффект установлен для целого ряда биологически активных соединений в том числе: витамин А, Р-каротин, глутатион, фенольные антиоксиданты (флаваноиды, пирокатехины, стероидные гормоны, галовая, кофеиновая и салициловая кислоты) и многие другие соединения (10,15,24,172,174).

В этой связи представляется важным отметить тот факт, что подобные эксперименты проводились и с другим антиоксидантом - убихиноном-10. Были исследованы антимутагенные свойства убихинона-10, полученного биотехнологическим путем. Показано, что убихинон-10 не обладает собственным мутагенным эффектом, не потенцирует действие ряда мутагенов - ксенобиотиков, в реализации цитогенетических эффектов которых ведущая роль связана с процессами свободно радикального окисления. Антимутагенная активность убихинона-10 проявляется в широком диапазоне концентраций, для данного антиоксиданта отсутствует возможность инверсии защитного действия, что составляет его очевидные преимущества по сравнению с другими антиоксидантами, для которых характерна дозозависимая смена антимутагенного эффекта на мутагенные и мутаген-потенцирующие (13). Кроме того, в последнее время получены интересные данные о взаимодействии некоторых групп антиокидантов, в частности, показано, что каротиноиды увеличивают свою антиоксидантную активность при совместном действии с другими жирорастворимыми антиоксидантами- а-токоферолом и коэнзимом Q10 (60).

1.7. Биологическое значение эргостерина в организме человека.

Витамин Д (кальциферол, антирахитический витамин) относится к жирорастворимым витаминам. В настоящее время известны витамины Д2 (эргокальциферол) и Дз (холекальциферол), а также активные метаболиты витамина Д.

Впервые витамин Д1 (эргостерин) получен только в 1924 г. А. Гесс и М. Вейншток получили его из растительных масел после воздействия ультрафиолетовых лучей длиной волны 280-310 нм. В 1937 г. А. Виндаус выделил из поверхностных слоев кожи свиньи 7-дегидрохолестерин, который при ультрафиолетовом облучении превращается в активный витамин Дз. Другим источником витамина Д в организме является поступающий с пищей витамин Д2. В последние годы стало известно, что около 50% витамина Д синтезируется в коже. Недостаточная инсоляция или нарушение всасывания витамина Д в кишечнике приводят к нарушению фосфорно-кальциевого обмена (рахит у младенцев или остеомаляция у подростков и взрослых).

Рахит.

Несмотря на то, что рахит известен очень давно и упоминается еще в трудах Сорана Эфесского (98-138 г. н.э.) и Галена (131-211 г. н.э.), его клиническое и патологоанатомическое описание дал английский ортопед Ф. Глиссон 1650 году. Рахит встречается во всех странах, но особенно часто, где отмечается недостаток солнечного света. Дети, рожденные осенью и зимой, болеют рахитом чаще и тяжелее. При недостаточной инсоляции, обусловленной климатическими особенностями (частые туманы, облачность, задымленность атмосферного воздуха) или бытовыми условиями, интенсивность синтеза витамина Д снижается. Поэтому заболеваемость рахитом выше в промышленных районах, чем в сельских. В последние годы частота рахита в России среди детей раннего возраста колеблется от 54% до 66%. (94).

По определению Н.Ф.Филатова, рахит является общим заболеванием организма, проявляющимся, главным образом, своеобразным изменением костей.

Согласно современным представлениям, рахит - заболевание, обусловленное временным несоответствием между потребностями растущего организма в фосфоре и кальции и недостаточностью систем, обеспечивающих их доставку в организм ребенка (42).

Рахит относится к обменным заболеваниям с преимущественным нарушением фосфорно-кальциевого обмена. Однако, наряду с этим, отмечаются изменения процессов перекисного окисления липидов, метаболизма белков, микроэлементов, включая железо, медь и др. Ключевым механизмом развития рахита является недостаточное поступление витамина Д с пищей и его образование в коже, а также нарушение его синтеза в печени и почках (42). Рахит развивается обычно у детей, имеющих те или иные факторы предрасположенности, спектр которых у каждого ребенка индивидуален. Сочетание экзогенных и эндогенных факторов определяет сроки манифестации и тяжесть течения рахита.

1.7.1. Регуляция фосфорно-кальциевого обмена.

Витамин Д и его активные метаболиты являются структурными единицами гормональной системы, регулирующей фосфорно-кальциевый обмен. В организме путем сложных превращений в печени и почках, холекальциферол преобразуется в более активные метаболиты , способные регулировать всасывание солей кальция и фосфора в тонком кишечнике, реабсорбцию в почках и отложение их в костях. Известно, что многокомпонентную регуляцию фосфорно-кальциевого гомеостаза в основном, осуществляют: (85)

1. Паратогормон

2. Витамин D

3. Кальцит он ин.

Таким образом, один из основных регуляторов фосфорно-кальциевого гомеостаза является витамин D. Его гомеостатическое действие направлено на восстановление сниженного уровня Са в крови и реализуется медленнее, по сравнению с паратгормоном. Если последний является фактором быстрого реагирования на угрожающую организму гипокальциемию, и восстановление уровня Са происходит ценой деструкции костной ткани с развитием выраженного остеопороза, то витамин Д осуществляет более тонкую регуляцию фосфорно-кальциевого обмена на уровне многих органов.

1.7.2. Нарушения фосфорно-кальциевого обмена.

Нарушения структуры и функции органов, участвующих в регуляции фосфорно-кальциевого обмена, являются причиной различных заболеваний и синдромов гипокальциемии, развивающихся в течение жизни ребенка.

В детском возрасте наиболее выраженными клиническими проявлениями дефицита Са в организме могут быть костные изменения. У детей раннего возраста в подавляющем большинстве случаев встречается рахит, вызванный дефицитом витамина Д. Эта форма рахита (Д-дефицитный,

27 младенческий) рассматривается как самостоятельное заболевание.

У взрослых людей, поражение костной ткани могут вызывать различные лекарственные препараты. Наиболее часто нарушение фосфорно-кальциевого обмена с развитием остеопороза вызывают глюкокортикоиды. На втором месте по частоте стоят остеопатии на фоне применения противосудорожных препаратов (фенобарбитала). Возможно развитие нарушений фосфорно-кальциевого обмена при применении тиреоидных гормонов, гепарина, длительном использовании антацидов, циклоспорина, тетрациклина, гонадотропина, производных фенотиазина (85).

1.8. Фосфолипиды в структуре и функции клеточных мембран.

Представление о биологических мембранах как о полупроницаемых перегородках, не позволяющих содержимому клетки выйти наружу, и как о структурах, обеспечивающих селективный транспорт молекул и ионов в том и другом направлении, является далеко неполным. Обнаружение среди мембранных белков различных энзимов, а также открытие мембранных рецепторов к тем или иным соединениям расширило наши представления о физиологической роли плазматической мембраны клеток в обмене веществ в целом. Во многом дополнились наши представления и о функции мембран клеточных органелл. Для примера можно указать, что внутренняя митохондриальная мембрана, как теперь известно, обеспечивает создание протонного градиента, участвующего во взаимопревращениях одного вида энергии в другой (хемиоосматический принцип энергетического сопряжения).

Важную роль в структуре и функции мембран играют фосфолипиды, которые являются обязательным компонентом плазматической мембраны клетки и мембран клеточных органелл (ядра, митохондрий, эндоплазматической сети, лизосом и др.).

Более полувека назад J. Danielli и Н. Davson предложили модель клеточной плазматической мембраны, согласно которой последняя напоминает собой сэндвич, наружными слоями которого являются белки; между ними располагаются два слоя фосфолипидов.

Существенным шагом вперед явилось создание жидкомазаичной модели мембраны Singer S., Nicolson G. Согласно этой модели, только часть поверхности (20-40%) представлена полярными головками фосфолипидов, остальная часть занята белками. Белки, входящие в состав мембраны, делятся на переферические и интегральные: первые могут быть извлечены без ее разрушения; вторые прочно связаны с мембраной и могут быть изолированы только после ее разрушения, например, с помощью поверхностно-активных веществ.

1.8.1. Биологическое значение фосфолипидов в организме человека.

Многие факторы окружающей среды вызывают нарушения функций печени и, как результат, ее заболевание. 20-30% всего населения Земли страдают заболеваниями печени и нуждаются в срочной медицинской помощи.

Печень - основной орган человеческого организма, в котором протекают более 70 разнообразных метаболических процессов. Анатомическое положение печени рядом с желудочно-кишечным трактом и ее физиологические функции, делают ее особенно уязвимой. Хорошо известно разрушающее действие на печень алкоголя, лекарственных препаратов, промышленных токсинов, неправильного питания и вирусных инфекций, а также сочетание вышеперечисленных факторов. До сих пор переливание крови сопряжено с большой опасностью заражения вирусными инфекциями (особенно гепатитом С).

Мембраны печени состоят на 65% из фосфолипидов; доминирующим является фосфатидилхолин (80 - 90%). Гидрофобные свойства фосфолипидов лежат в основе механизма образования липидного бислоя с гидрофильными группами на внешней и гидрофобными на внутренней поверхности мембран клеток. Некоторые фосфолипиды мембраны функционально действуют как рецепторы для многих биологически активных субстратов, например, нейротрансмиттеров, гормонов, аутоиммунных антител; другие фосфолипиды ответственны за транспорт белков и ферментов.

При воздействии любых повреждающих факторов нарушается структура и функции мембран (148). Повреждения могут быть настолько глубокими, что приводят к образованию физических дефектов в мембранах и выходу наружу содержимого печеночных клеток. Другими словами, любые заболевания печени не зависимо от этиологии вызывают разрушение мембран гепатоцитов с потерей фосфолипидов, как основных структурных компонентов, что приводит к инактивации системы мембранных ферментов, участвующих в биосинтетических и детоксических процессах.

Разрушенная структура мембран клеток печени может быть восстановлена введением фосфолипидов извне (155).

Поэтому вполне логичным представляется использование фосфолипидов, являющихся главными компонентами липидного бислоя, для замещения возникающих дефектов и восстановления нарушенной барьерной функции мембран. Восстановление мембран и структур клеток может быть достигнуто различными путями (36).

1. Фосфолипиды способны "заклеить" разрушенные участки и тем самым восстановить функции элементов кленок.

2. Фосфолипиды увеличивают активность и "текучесть" мембран с помощью полиненасыщенных жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов.

3. Фосфолипиды с высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот активируют фосфолипид-зависимые ферментные системы, расположенные в мембранах. Благодаря этому более, чем в 2 раза увеличивается скорость детоксикации и выведения токсином клетками печени. Патологические процессы, например, фиброз, вызванный алкоголем, значительно снижаются. Введение фосфолипидов снижает разрушение лимфоцитов клетками печени при некоторых формах хронического гепатита (155,36).

Кроме того, важное значение имеют фосфолипиды при профилактике опасного заболевания - атеросклероза, наиболее распространенного заболевания в настоящее время.

Показано, что фосфолипиды оказывают стабилизирующее действие на мембранные белки (23). Это действие фосфолипидов на белки проявляется в замещении дефектов липидного бислоя, восстановлении барьерной функции и соответственно, физико-химических свойств самого бислоя (23).

К настоящему времени сложно в полной мере оценить значение микровязкости биологических мембран в развитии различных патологий. Однако, очевидно, что этим изменениям принадлежит ведущая роль при одном из самых распространенных заболеваний человечества - атеросклерозе (23,148). Это заболевание рассматривают как состояние, характеризующееся накоплением холестерина (ХС) в организме (155,36,23). Рассматривая накопление ХС в мембранах как важнейшее звено в развитии атеросклероза, очевидно, лечение этого заболевания должно быть направлено на выведение этого соединения из организма. В опытах in vitro показана эффективность применения фосфатидилхолиновых липосом для извлечения ХС из мембран эритроцитов.

Вполне логично, что наиболее перспективными следует признать такие препараты фосфолипидов, которые бы обладали в большей степени извлекать из мембран ХС. Важно отметить, что сравнительные исследования липосом различного происхождения показали, что холестерин акцептирующие свойства выражены в большей степени у липосом из полиненасыщенных фосфолипидов.

1.9. Методы получения БАВ

Положительные результаты по исследованию биологической активности и терапевтическому действию каротиноидов, фосфолипидов, эргостерина и убихинонов привели к расширению исследований по разработке методов получения этих биологически активных веществ.

К основным методам можно отнести: методы химического синтеза методы выделения из различных природных объектов (растительных и животных клеток) биотехнологические методы получения БАВ

Так, например, убихиноны и Р-каротин могут быть получены путем химического синтеза. Первое промышленное производство убихинонов было основано на процессе химического синтеза убихинона-10 из соланесола, выделенного из листьев табака (221). Исследования по целенаправленному химическому синтезу убихинонов заметно обогатили теоретический и прикладной арсенал современного органического синтеза, приведя к созданию и усовершенствованию методов регио- и стереоконтролируемого построения структур этого ряда (87).

Однако, сложность химического синтеза длинной пренильной цепочки приводит к высоким капитальным и эксплуотационным затратам, в связи с чем метод химического синтеза убихинонов вскоре оказался менее перспективным по сравнению с биотехнологическими методами.

В настоящее время основное количество коммерческого Р-каротина в мире синтезируется химическим способом. Основными производителями каротина являются швейцарско-американская компания «Hoffman - La Roche» и германский концерн «Basf». Производство Р-каротина химическим способом пока еще более экономически целесообразно, чем биоотехноглогическим. Так, например, себестоимость синтетического каротина составляет около $ 450/кг, тогда как каротин полученный биотехнологическим путем обходится в 1,25 раза дороже. Следует отметить,

32 что у биотехнологического метода получения Р-каротина существуют значительные резервы по возможности снижения себестоимости целевого продукта: снижение стоимости питательных сред, уменьшение длительности процесса ферментации, которое приводит к снижению энергетических затрат на процесс, повышение концентрации целевого продукта в биомассе, а также возможность получения из одного микроорганизма-продуцента сразу нескольких целевых продуктов, что позволит снизить себестоимость каждого из них, а в частности и каротина.

Известны способы получения убихинонов, каротиноидов, фосфолипидов из природных объектов. Эти способы, уступают по эффективности биотехнологическим методам, из-за незначительного содержания ценных компонентов в тканях животных (растений) по сравнению с микроорганизмами. Однако многие из них могут использоваться в настоящее время. Полученные из природных объектов биологически активные вещества находят наибольший спрос в пищевой и фармацевтической промышленности, так как обладают наилучшей усвояемостью и считаются наиболее экологичными.

Убихиноны было предложено изолировать из сердца крупного рогатого скота (231). Специалистами НИИрыбного хозяйства предложен способ получения убихинона-9 из сырья животного происхождения (печень окуня или севуча) (6), в соответствии с которым проводится омыление биомассы раствором гидроксида калия в метаноле в присутствии пирогаллола и трихлорэтилена. После омыления смесь отстаивают и отделяют нижний трихлорэтиленовый слой, и повторно экстрагируют неомыляемую фракцию трихлорэтиленом. Объединенный экстракт промывают водой, упаривают, полученную фракцию разделяют методом адсорбционной хроматографии и целевой продукт кристаллизуют в абсолютном этаноле.

Каротиноиды (Р-каротин и ликопин) было предложено экстрагировать органическими растворителями из различных натуральных источников томатов, грейпфрутов, моркови (242).

33

В качестве иллюстрации можно привести пример сравнения эффективности получения Р-каротина биотехнологическим методом и методом выделения из природных объектов.

В нашей стране Р-каротин получали только на Краснодарском витаминном комбинате из моркови. Производство носило сезонный характер, зависило от климатических условий. Выпуск препарат за 9 лет работы с 1965 по 1974 года составил 827,6 кг каротина в пересчете на кристаллический (21). Однако, только за первый год работы завода «Уралбиофарм» была реализована продукция с содержанием 2274 кг каротина, то есть в 2,8 раза больше, чем за 9 лет его получения из моркови.

Большое количество технологий по получению БАВ из животных тканей посвящено выделению их из гидробионтов морских и пресноводных акваторий, особенно таких беспозвоночных животных, как ракообразные, моллюски, иглокожие (морские огурцы, морские ежи), отличающихся от многих наземных и водных организмов значительным разнообразием метаболитов, среди которых доминирующая часть представлена функциональными соединениями - каротиноидами, фосфолипидами, сапонинами, полиненасыщенными жирными кислотами. (8,9,80,237,220). Однако такие технологии носят, как правило, сезонный характер и являются более дорогостоящими, так как содержание ценных веществ значительно ниже, чем в некоторых микроорганизмах.

Учитывая наибольшую привлекательность биотехнологических способов получения БАВ, этому направлению посвящено наибольшее число публикаций и патентов. Поиск наиболее перспективных видов и штаммов микроорганизмов, условий их культивирования является по данным патентной литературы наиболее важным в разработке технологии получения БАВ.

1.10 Биотехнологии получения жирорастворимых БАВ.

Биотехнологический способ получения жирорастворимых БАВ состоит из следующих стадий:

1. Культивирование микроорганизма

2. Отделение культуральной жидкости от биомассы

3. Выделение БАВ из клеток микроорганизмов

В некоторых случаях в качестве конечного продукта фигурирует биомасса микроорганизмов, содержащая целевые БАВ, тогда вместо этапа выделения, присутствуют стадии иноктивации и сушки биомассы.

Таким образом, на первой стадии технологии получения жирорастворимых БАВ из биомассы микроорганизмов необходимо создать определенные условия культивирования с целью накопления продуцентом целевых компонентов в максимально возможных концентрациях. В настоящее время пути биосинтеза большинства ценных биологически активных соединений в микробной клетке хорошо изучены.

1.10.1. Биосинтез изопреноидов микробной клеткой.

Каротиноиды, стерины, витамины группы D, убихиноны, витамины группы К и Е, а также огромное число других природных соединений объединяют на основании общих начальных стадий биосинтетического пути в одну группу терпенов или терпеноидов (30). Эти соединения построены из углеродного фрагмента: Н2С = С - СН =СН2

Ьнз

Способ построения веществ из различного числа пренильных единиц очень давно и плодотворно использовался в природе.

В докембрийских отложениях обнаружены терпены пристан и фитан, происходящие, по-видимому, дитерпенового спирта фитола. На древность таких терпеновых соединений как каротиноиды, стерины, хиноны, указывает их присутствие в сине-зеленых водорослях и бактериях.

Как отмечалось выше многие терпеновые соединения - биологически активные вещества, несущие важную функциональную нагрузку в организме человека.

В XIX и в начале XX столетия было высказано предположение, что биосинтез многих природных соединений происходит из остатков уксусной кислоты.

Как показали многочисленные исследования, активация ацетата в живой клетке происходит под влиянием соединения, носящего названия кофермента-А (Ко-А), широко распространенного в природе. В результате этой активации образуется соединение, представляющее собой ацетил-Ко-А (СНЗ - С - S - Ко-А), впервые выделенное из дрожжей (234). У

Дальнейший путь биосинтеза терпеноидов подчиняется изопреноидному правилу", сформулированному J1. Ружечкой (247,143).

В соответствии с этим правилом каротиноиды - тетратерпены, стерины - тритерпены, а убихиноны - политерпены синтезируются из изопреновых единиц " в результате прохождения четырех стадий":

1. Образование мевалоната из ацетил-Ко-А

2. Дегидрирование и декарбоксилирование мевалонил-ПФ с образованием "активного изопрена" - изопентилпирофосфата, конденсация изопреновых звеньев с образованием ациклических терпенов различной длинны

3. Циклизация ациклических структур

4. Дальнейшая модификация циклических структур

Пути изопреноидов изучают с использованием ингибиторов, меченых соединений, мутантов микроорганизмов, а также бесклеточных экстрактов (197).

Ацетил-КоА явяляется тем общим промежуточным соединением, которое образуется в результате окислительного распада жирных кислот, углеводов и аминокислот. Ацетил-КоА независимо от своего происхождения может быть исходной строительной единицей для биосинтеза углеродного скелетам многих органических соединений, имеющих важное биологическое значение. Превращение ацетил-КоА стало привлекать внимание исследователей в связи с выяснением роли ацетата как одного из основных и связующих звеньев метаболизма живого организма.

Особенно следует указать на участие ацетил-КоА в биосинтезе мевалоновой кислоты - соединения являющегося важнейшим низкомолекулярным предшественником очень многих физиологически важных соединений изопреноидной структуры - убихинонов (210), каротиноидов (212,173), стеринов (235,256).

На первой ступени (см. рисМЛО.) ацетат в присутствии АТФ активируется, соединяется с КоА и две молекулы ацетил КоА конденсируются с образованием ацетил-КоА, к которому присоединяется еще одна молекула ацетил-КоА, в результате образуется 3-оки - 3 метилглуторил -КоА (ОМГ-КоА). ОМГ-КоА далее в присутствии NADFH восстанавливается до мевалоновой кислоты (МВК). Последняя фосфорилируется при участии мевалонаткиназы по первой спиртовой группе с образованием монофосфомевалоновой кислоты. В результате второго фосфорилирования за счет АТФ образуется пирофосфомевалоновая кислота (МВК-ПФ). При дегидротации и декарбоксилировании МВК-ПФ, которое происходит в присутствии АТФ, образуется изопентилпирофосфат (МППФ). Следовательно, МВК и ИППФ специфические предшественники изопреновых соединений (241).

ИППФ при участии ИППФ-изомеразы изомерезуется в диметилаллил-ПФ (ДМА-ПФ), который служит затравкой в реакции полимерезации. Дальнейшее удлинение цепи происходит путем присоединения к ДМА-ПФ ИППФ, в результате образуется Сю монотерпен - геранил пирофосфат (ГПФ), реакцию катализирует пренилтрансфераза. Этот же фермент осуществляет соединение ГПФ с другой молекулой ИППФ аналогичным образом с образованием С15 производного - фарнезилпирофосфата (ФПФ).

37

Рис. 1.10. «Биосинтез изопреноидов» по (207).

Последующее присоединение ИППФ к ФПФ дает С20 производное -геранилгеранлпирофосфат (ГГПФ). Образование С40 производных (тетратерпенов или каротиноидов) происходит при димеризации ГГПФ, первым в ряду этих соединений стоит - фитоин, бесцветный предшественник окрашенных каротиноидов.

1.10.2. Биосинтез каротиноидов.

Путь синтеза каротиноидов впервые был изучен с использованием гриба Phycomyces blakeleanus - продуцента (3-каротина (208).

Еще более мощным продуцентом каротиноидов является гетероталличный гриб Bl. trispora, биосинтез изопреноидов в клетках которого, постулировал Гудвин (213). Было установлено, что по тому же пути каротиноиды образуются у Chlorella vulgaris, Rliodotorula rubra, Neurospora crassa и некоторых других.

В биосинтезе каротиноидов различают четыре этапа:

1. Образование С40 - углеводорода

2. Последовательное дегидрирование с образованием ненасыщенных ациклических углеводородных каротинов

3. Образование ациклических и ароматических каротиноидов

4. Окисление каротиноидов (иногда сопровождаемое модификацией углеводородного скелета) с образованием ксантофиллов

Первые два этапа относят к ранним ступеням биосинтеза, они общие для различных каротиноидов. Фитоин образуется из циклопропилкарбоксильного катиона при утере протона. Фитоин подвергается далее серии дегидрирований, каждое из которых образует новую двойную связь, таким образом, синтезируется фитофлюин, ^-каротин и нейроспорин. Дальнейший биосинтез каротиноидов может проходить несколькими путями (см. рисунок)

Нейроспорин может, с одной стороны, давать начало а- и (3-зеокаротинам, а с другой - ликопину. Биосинтез циклических каротиноидов также может происходить несколькими путями. Ликопин может, с одной стороны, давать начало у-каротину и (3-каротину, а с другой 6-каротину и а-каротину (см. 1.10.1).

Рис. 1.10.1 «Биосинтез Р-каротина» по (163)

Приведенная схема биосинтеза каротиноидов в основных чертах предложена Гудвином и нашла свое подтверждение в более поздних экспериментальных исследованиях. Тем не менее, она не является универсальной, поскольку пути синтеза каротиноидов могут различаться в зависимости от физико-биохимических особенностей того или иного микроорганизма и условий его культивирования. Существуют многочисленные экспериментальные работы, в которых указывается на то, что в зависимости от условий культивирования возможно получение того

Геранилгерзкилпирофосфат - каротин или иного каротиноида. Так, например, гетероталличный гриб Ph. blakesleanus способен синтезировать в качестве преимущественного каротиноида как фитоин, так и ликопин и (3-каротин (176,230,248,249). Гетероталличный гриб Bl. trispora, также может накапливать в зависимости от условий (3-каротин или ликопин (56,164), что находит широкое применение при промышленном использовании данного продуцента. Аспекты регуляции биосинтеза каротиноидов в настоящее время хорошо изучены (111,160,198).

1.10.3. Биосинтез стеринов.

Кроме указанной выше возможности «наращивания» изопреноидной цепи на стадии образований С15 -► С20 производных возможен и иной путь биосинтеза.

Фарнезилпирофосфат (ФПФ) может подвергаться димеризации в пристствии необходимой ферментной системы путем последующей конденсации двух молекул по типу «хвост к хвосту» (232). Промежуточным продуктом в этой цепи является прескваленпирофосфат (189).

Сквален является важным высокомолекулярным предшественником при биосинтезе стеринов (261). Превращение сквалена в стерины, как показали многочисленные исследования, представляет собой многоступенчатый сложный процесс, проходящий через ряд промежуточных соединений. В большой серии работ можно обнаружить указания на основные закономерности этого синтеза. Особенно из всех этих исследований, представляющих только теоретический интерес, следует указать на работы, выполненные в лаборатории Блоха (Bloch), Линна (Lynen), Попжака (Popjak), а также российских исследователей (83,98,103,119,177,151,233).

Впервые опыты по исследованию биосинтеза эргостерина с помощью изотопов были проведены Зондерхоффом и Томасом (251). Авторы культивировали дрожжи Sacch. cerevisiae с ацетатом и дейтерием, и выделили меченую стериновую фракцию.

40

Превращение еквалена в стерины является анаэробным процессом. Сквален накапливается при недостаточном снабжении клетки микроорганизма кислородом, при окислительной циклизации еквалена вначале образуется ланостерин (см. рисунок). Кислород в этих реакциях необходим для образования гидроксильной группы, удаления внешних метальных групп ланостерина и для перемещения двойной связи на следующей ступени стеринового синтеза. Переход еквалена в ланостерин требует циклизации, которая осуществляется специальной ферментной системой. Эта система действует в присутствии кислорода, нуждается в двух валентных металлах и активируется NADFH2. Путь синтеза и интермедианты между ланостерином и эргостерином окончательно не установлен, хотя в

СИ, i:ir, аи / ' /

-\с <:н. г. си. с <:п,0Р1 фариеш-лирофогфат

L,i -чпокси-оквалрн ланоиерол чргоперол эргоста- 5,7,22,24 (28) эргостл-7,22,2',(:'.Ч) тстраон - ?,f - ол три'ря зппегерол феипстерол

Рис. 1.10.2 «Биосинтез эргостерина в микробной клетке» (32). последние годы в этом направлении ведутся интенсивные исследования. Общую схему превращения еквалена в эргостерин можно представить следующим образом (205). (см. рис. 1.10.2).

1.10.4. Биосинтез убихинонов.

1.10.4.1 Биосинтез изопреноидной цепи убихинонов.

Уже в скором времени после открытия убихинонов было показано, что биосинтез его боковой цепи в организме животных, растений и микроорганизмов идет через мевалоновую кислоту по пути, общему для первоначальных ступеней синтеза всех изопреноидов (246).

Считается, что по аналогии с синтезом других изопреноидных соединений, удлинение боковой цепи происходит по типу «голова к хвосту» присоединением ДМА-ПФ к более низшему С5 предшественнику (211). (см. рисунок).

1.10.4.2. Биосинтез ароматического кольца.

В настоящее время доказано, что шикимовая и п-оксибензойная кислота (п-ОБК) являются предшественниками убихинона во всех без исключения микроорганизмах (167). В свою очередь в некоторых микроорганизмах п-ОБК может образовываться из шикимовой кислоты через хоризмовую. В 1964 году Кох и Гиббсон (191) продемонстрировали включение шикимовой С14 кислоты в убихиноны и витамин К2 у Е. coli, причем n-ОБК и 3,4 -диоксибензальдегид ингибировали это включение. Авторы предположили, что биосинтез хинонового кольца убихинонов и витамина К2 у Е. coli идет по пути, предложенному для синтеза ароматических соединений Гиббсоном (209). ( см. рисунок). Некоторые исследователи (244) обнаружили достаточно эффективное включение ацетата - С14 в хиноновое кольцо убихинонов у Asp. niger, N. crassa, Pen. chrysogenium и Giberella fusikuroi, что наводило на мысль о возможности сочетания в плесенях пути образования кольцевой части убихинонов через шикимовую кислоту и ацетатным путем. Однако, Бентли и Лаветт, показали, что через «ацетатно-мевалонатный» путь эти грибы образуют простые бензохиноны, но не убихиноны (229). соон со® сн2

Фосфоенолпируват сно I снон + I снон сн2о(р)

Erythrose-4-^Р) соон I с=о носн А I нон снон с*:н2о(р)

3-Deoxy-D-aTabino-heptulosonie acid-7-(T) соон

NADP NADPH

AZ.

C.OOH

Шикимовая к-та О

ОН он

Dchydroshikiniic acid соон

Dehydroquinic acid он он

Shikimic acid-5-^Р) сн, —с—соон он

5-Enoylpyiuvyl shikimic acid-5-^р)

К». соон

Рис. 1.10.3. «Биосинтез бензохинонового кольца в молекуле убихинонов» по (207).

1.10.4.3. Алкилирование ароматического кольца.

До сих пор окончательно не закрыт вопрос об этапе алкилирования ароматического кольца полиизопреноидной боковой цепью. Первоначально предполагалось, что алкилирование есть последняя ступень в биосинтезе убихинонов. Однако полипренилфенольные предшественники найдены во многих из исследованных микроорганизмов (167). Наличие таких предшественников свидетельствует об алкилировании полипренил-фосфатамина ранней ступени биосинтеза. И лишь в некоторых из них, где полипренилфенолы не обнаружены (Vibro, Phycomyces blakesleanus и др.), возможно боковая цепь присоединяется после синтеза хинонового кольца.

1.10.5. Методы выделения жирорастворимых БАВ из биомассы микроорганизмов.

Разработанные способы выделения убихинонов, каротиноидов, фосфолипидов, эргостерина, жирных кислот из биомассы микроорганизмов, как правило, включают следующие стадии: экстракции, кристаллизации или осаждения, омыления биомассы или липидов раствором щелочи (130).

Необходимо отметить, что существуют технологии, которые позволяют получать из биомассы микроорганизмов как один, так и несколько целевых продуктов. Последние имеют несомненное преимущество, но применимы только к тем микроорганизмам, которые способны накапливать в своем составе не один, а несколько ценных биологически активных компонентов.

Методы, основанные на непосредственном омылении биомассы, имеют серьезный недостаток, заключающийся в том, что в данном случае возможно получение только одного целевого продукта - убихинона (117). Как показали проведенные рядом авторов исследования (129), целесообразно вводить еще до омыления липидов стадии выделения фосфолипидов и каротиноидов. Такое техническое решение обеспечивает кроме получения дополнительных ценных продуктов, сокращения расхода реагентов на стадии омыления нейтральных липидов и экстракции неомыляемой фракции. Однако выбор

44 схемы выделения биологически активных жирорастворимых компонентов в первую очередь определяется фракционным составом того или иного микроорганизм а.

Известен способ получения кристаллического Р-каротина (112). В соответствии с изобретением, описанным в патенте РФ № 2112808, экстракцию Р-каротина из биомассы гриба Bl. trispora ведут растительным маслом. Экстракцию начинают в реакторе в соотношении биомасса : растворитель равном 1:3- 1:15 (мае.) в течение 15-60 минут и завершают на фильтре тем же растворителем, нагретым до 60-90° С, затем насыщенные экстракты промывают в этиловом спирте в соотношении 10:1 - 3-1 (об.) при 40-55° С, кристаллизацию ведут при 10-20° С в течение 1-3 суток. После этого полученную суспензию нагревают до 40-60° С, кристаллы фильтруют, промывают их этиловым спиртом в соотношении 1:3 - 1:2,5 (мае.) при 5055° С. Выход Р-каротина составляет 25-27%, массовая доля Р-каротина 90%.

Недостатками способа являются получение в качестве конечного продукта только кристаллического Р-каротина, а также длительность процессов экстракции и кристаллизации, значительный расход растворителя на стадии кристаллизации и не высокий выход кристаллов каротина. Известны также способы получения Р-каротина, где на стадии экстракции используют полярные растворители (спирты, кетоны, некоторые неорганические соединения). На следующей стадии выделения отфильтрованую мисцеллу подвергают такому воздействию, при которой диэлектрическая проницаемость раствора повышается. В этих условиях по всему объему мисцеллы происходит образование эмульсии, обусловленное выходом из раствора триглицеридного компонента липидного комплекса. Эмульсия представляет собой диспергированные в объеме мисцеллы мельчайшие капли триглицеридов. Растворимость каротина в триглицеридах выше по сравнению с растворимостью его в мисцелле, вследствие чего он диффундирует из последней в капельки триглицеридов. Данный способ обеспечивает возможность получения препарата с высоким содержанием триглицеридов и каротина и с низким содержанием примесей. Однако способ не предусматривает получения очищенных кристаллов каротина и более того полученный в предлагаемом способе триглицеридный раствор каротина довольно трудно подвергнуть стандартизации по другим компонентам липидного комплекса гриба Bl. trispora (стерины, моно- и диглицериды, жирные кислоты), которые также входят в состав «триглицеридного» раствора каротина. Указанные недостатки устраняются в недавнем патенте полученном специалистами «Уралбиофарм» (114), в котором предложено для обеспечения строгой стандартизации масляного раствора каротина сначала проводить выделение и очистку кристаллов, а уже на следующей стадии проводить растворение кристаллов в растительном масле. Однако и этот способ не предусматривает возможность получения наряду с кристаллами Р-каротина других биологически активных соединений, входящих в состав биомассы гриба Bl. trispora.

Известны способы получения эргостерина из дрожжей, предусматривающий омыление водным раствором щелочи в среде органического растворителя и кристаллизацию эргостерина. (5). В известном способе омылению подвергают биомассу дрожжей, затем биомассу отделяют, а из полученного раствора кристаллизуют эргостерин. Недостатками способа является невысокая чистота эргостерина из-за загрязнения продуктами омыления биомассы. Учитывая выявленный недостаток, специалистами института «ГосНИИсинтезбелок» был запатентован метод получения эргостерина, который предусматривал проведение на первой стадии технологического процесса экстракции липидов дрожжей (Candida tropicalis, Candida guillermondii, Saccharomyces cerevisiae) органическим растворителем, для получения липидного экстракта, затем растворитель удаляли, а омылению подвергали липидный экстракт, экстрагировали неомыленную фракцию и кристаллизовали из нее эргостерин. В качестве органического растворителя применяют полярный растворитель,

46 например спирт, или неполярный растворитель, например гексан или смесь полярного и неполярного растворителя, например, раствор бензина в ацетоне. Обработку липидов водным раствором щелочи проводят при перемешивании и нагревании реакционной смеси до 50-120°С, в основном до температуры кипения смеси. Концентрация щелочи в водном растворе 0,560% (83). Аналогичные приемы рекомендованы и другими авторами. (120,14). В более поздних работах авторы отмечают возможность снижения концентрации щелочи, однако при этом незначительно увеличивается соотношение липидный экстракт : раствор гидроксида калия (109).

Американскими исследователями раньше японских и отечественных исследователей был запатентован биотехнологический способ получения убихинона-10 с использованием бактерий рода Pseudomonas и Proteus. В патенте, который был опубликован в 1962 году достаточно подробно описаны технологические приемы выделения убихинона-10 из биомассы, включающие стадии омыления, экстракции продукта органическими растворителями, адсорбционной хроматографии и кристаллизационной очистки, даны методы идентификации убихинона-10. Несмотря на приоритет в биотехнологическом направлении получения убихинона-10, американскими фирмами не было организовано промышленного производства этого продукта для медицины. В данном направлении японскими фармацевтическими фирмами были проведены достаточно крупномасштабные исследования, которые успешно завершились организацией биотехнологического производства убихинона-10 в Японии и по японским лицензиям в Западной Европе. В настоящее время запатентованы микробиологические процессы получения убихинонов, содержащих от 7 до 11 пренильных единиц. Разработаны методы получения убихинонов из микроорганизмов относящихся к родам Candida, Hansenula, Pseudomonas, Methylomonas, Achromobacter, Alcaligenes (132,134,127). Для получения убихинона-10 предложено культивировать микроорганизмы Rhodopsedomonas capsulatus, некоторые штаммы Acetobacter и Pseudomonas, дрожжи рода Torulopsis, Cryptococcus и Rhodotorula (135,136137,133,131).

47

Важным направлением в технологии получения убихинонов является разработка наиболее эффективных методов экстракции коферментов из биомассы и их очистки. Японскими фирмами "Ниссин", "Кева", "Toe" и "Асахи" запатентованы способы экстракции убихинонов из биомассы втор-бутиловым и третамиловым спиртами, которые обеспечивают более эффективное извлечение целевого продукта из биомассы. (54,55,51). Для очистки экстракта убихинона от примесей фирмой "Мицубиси" запатентован процесс, включающий обработку раствора кофермена Q в гидрофобном растворителе раствором гидроокиси аммония в спирте (52). Одним из наиболее эффективных методов очистки является метод адсорбционной хроматографии. Фирмой «Мицубиси» разработаны способы очистки убихинонов с использованием силикагеля и растворов метил-трет-бутилового эфира и алифатического кетона в неполярных растворителях (52,50). Фирмой «Дзеде» разработан способ очистки коферментов, который включает адсорбцию убихинонов из спиртового или водно-спиртового экстрактов крупноячеестым сополимером стирола и дивинилбензола. С адсорбента убихиноны экстрагируют растворителем более полярным, чем низший спирт (53). Завершающей операцией по очистке убихинонов в большинстве опубликованных патентов является кристаллизация целевого продукта из органического растворителя. Для кристаллизации убихинонов рекомендуются гидрофильные органические растворители: низкомолекулярные спирты, кетоны и ряд нитрильных органических растворителей.

Немецкими специалистами разработан ряд способов получения убихинона-9 и убихинона-10 из липидов кормовых дрожжей Candida, выращиваемых в промышленных условиях на нефтяных дистиллятах, предложено выделять убихинона по технологической схеме, включающей обработку липидов ацетоном, отделение нерастворимого в ацетоне осадка фосфолипидов, омыление в присутствии антиоксиданта, экстракцию неомыленной фракции и выделение из полученной фракции путем адсорбционной хроматографии убихинонов. Отличаем предложенного

48 процесса по сравнению с известными является то, что полученную после осаждения фосфолипидов фракцию нейтральных липидов концентрируют путем частичной отгонки углеводородов. Одновременно с убихинонами получают фосфолипиды, жирные кислоты и эргостерин (107). Для концентрирования фракции убихинона-9, предложено также обрабатывать нейтральные липиды в колонке, заполненой сефадексом Н-20. Обработка сефадексом по данным патента ГДР (110) позволяет увеличить концентрацию убихинона-9 в 10 раз. Предложено также концентрировать убихинон-9 путем обработки липидно-углеродного экстракта дрожжей или нейтральных липидов в двух фазной системе: растворителя, состоящего из углеводорода или углеводородной смеси и низкомолекулярного спирта и воды (116).

Российскими исследователями: Обольникова Е.А., Самохвалов Г.И., Орех Г.Т., Гололобов А.Д., и др. разработаны методы получения убихинонов из микроорганизмов рода Candida и Acetobacter (71,99,118).

С целью одновременного получения с кормовыми дрожжами убихинона-9 было предложено экстрагировать липиды из биомассы, после чего отгонять растворитель и полученные липиды омылять в присутствии антиоксиданта (150,153). Кроме убихинона-9 из липидов кормовых дрожжей было рекомендовано также получать эргостерин, являющийся ценным сырьем для производства витаминов группы D и стероидных гормональных препаратов (№ 568676). Отечественными специалистами впервые был разработан технологический процесс одновременного получения эргостерина и убихинона-9 из липидов кормовых дрожжей, который был запатентован в ряде стран. Технологический процесс схема которого представлена на рис. 1.10.4, включает омыление липидов спиртовым раствором щелочи в присутствии антиоксиданта, экстракцию неомыляемой фракции из реакционной смеси, упаривание экстракта до появления кристаллов эргостерина, отделение эргостерина, отгонку экстрагента от маточного раствора, адсорбционную хроматографию маслянистого продукта, оставшегося после удаления экстрагента и выделение убихинона-9 путем его

49 кристаллизации в абсолютном этиловом спирте. В соответствии с предложенным способом омыление липидов проводят безводным метанольным раствором гидроксида калия, в качестве антиоксиданта применяют пирогаллол, экстракцию неомыляемой фракции проводят диэтиловым эфиром. С целью сокращения объема оборудования и растворителей на стадии хроматографии рекомендовано также проводить частичное отделение углеводородов путем их вымораживания в ацетоне.

По сравнению с зарубежными аналогами, которые были опубликованы ранее или одновременно с отечественным, предложенный процесс имеет существенные преимущества. В запатентованных технических решениях зарубежными исследователями и фирмами, как правило, используются штаммы микроорганизмов, выращиваемых в стерильных условиях на дорогостоящих средах, в которые добавляют биостимуляторы, экстракты, полученные из пищевых продуктов. В предложенном отечественными специалистами процессе используются промышленные штаммы дрожжей Candida, обладающие высокой скоростью роста и выращиваемые на дешевой среде, содержащей н-алканы и минеральное питание без применения биостимуляторов. Процесс выращивания проводится при непрерывном режиме в нестерильных условиях. Липидный экстракт дрожжей, который используется для последующего получения убихинона-9 и эргостерина, является побочным продуктом экстракционной очистки кормовых дрожжей от не утилизированных н-алканов. В технологическом процессе получают не один целевой продукт, а три продукта: кормовые дрожжи, убихинон-9, эргостерин. Эти технические решения обеспечивают существенное снижение стоимости целевых продуктов - убихинона-9 и эргостерина. Одновременно следует отметить, что предложенный процесс имеет ряд недостатков. В технологическом процессе одновременно применяется шесть органических

Рис. 1.10.4 «Технологическая схема процесса одновременного получения эргостерина и убнхинона» (138).

Липиды

Метанол

Пирогаллол Гидроксид калия

Вода

Диэтиловый эфир

Ацетон

Бензол

Петролейный эфир, окись аллюминия, диэтиловый эфир

Т.П.1 омы [ЛЕНИЕ

НЕЙТРАЛЬНЫХ

ЛИПИДОВ

Т.П.2.

РАЗБАВЛЕНИЕ 1 I т.п.з. ЭКСТРАКЦИЯ НЕОМЫЛЯЕМОЙ ФРАКЦИИ

Т.П.4. ВЫДЕЛЕНИЕ ЭРГОСТЕРИНА

1

Т.П.5. ВЫМОРАЖИВАНИЕ УГЛЕВОДОРОДОВ

V

Т.П.6. АЗЕОТРОПНАЯ СУШКА 1

Т.П.7. КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

-►Раствор мыл

-+ЭРГОСТЕРРИН

-►Диэтиловый эфир -► Ацетон

-►УГЛЕВОДОРОДЫ Бензол -►

Т.П.8. КРИСТАЛЛИЗА

Этанол -► ЦИЯ

УБИХИНОНА

Вода

Углеводороды, петролейный эфир, диэтиловый эфир

УБИХИНОН-9

-►

Этанол растворителей, среди них метанол и абсолютный этиловый спирт, одновременное применение которых не допускается по технике безопасности. Применение диэтилового эфира также является неудовлетворительным решением, в связи с его высокой взрыво- и пожароопасностью, большими потерями вследствие высокой летучести и растворимости в водно-спиртовой среде и воде. Использование менее летучих и опасных органических растворителей таких, как бензин или трихлорэтилен на стадии экстракции неомыляемой фракции не дало положительных результатов, в связи с образованием стабильных эмульсий. Вследствие частичной растворимости воды в диэтиловом эфире для ее удаления из неомыляемой фракции перед стадией хроматографии применяется токсичный органический растворитель -бензол. Среди недостатков технологического процесса следует отметить невысокое содержание основного вещества в эргостерине (45-60%), получаемого после выделения из экстракта неомыляемой фракции.

Важно отметить, что в настоящее время данная технологическая схема не может быть применена, так как в России практически свернуто получение кормового белка с использованием дрожжей рода Candida, на средах содержащих н-алканы.

Специалистами «ГосНИИсинтезбелок» под руководством Ю.Е. Казанцева разработаны способы получения эргостерина и убихинона (4), а также способ получения убихинона Q-10 совместно с фосфотидилэтаноламином, описанный в авторском изобретении (3).

Способ получения Q-10 (3) основан на выращивании бактерий р. Acetobacter methylovorans или Acetobacter methylicum. Из биомассы бактерий липиды экстрагируют хлороформом или этанолом. Экстрагент упаривают и затем фильтруют через слой адсорбента. В качестве элюата применяют хлороформ или 2% раствор ацетона в гексане. Полученный раствор упаривают и фракцию убихинона Q-10 растворяют в органическом растворителе (этаноле). Кристаллизацию убихинона Q-10 ведут при 15 - 25° С в течение 424 часов. Для получения продукта с содержанием основного вещества более

52

97% проводят 1-3 ступени перекристаллизации. После элюирования Q-10 с адсорбента элюируют фракцию фосфатидилэтаноламинов смесью гидрофобного и гидрофильного растворителей, содержащей от 20 до 70% гидрофильного органического растворителя. Использование этого приема позволяет удалить с адсорбента фракцию фосфатидилэтаноламинов, включающую фосфатидилэтаноламин и ряд других фосфолипидов с более высокими адсорбционными свойствами, чем Q-10, но более низкими, чем фосфатидилхолины. Затем с адсорбента элюируют фракцию фосфотидилхолинов смесью гидрофобного и гидрофильного растворителей и воды, содержащей от 40 до 95% гидрофильного растворителя и от 2 до 15% воды. Данный подход позволяет получать фосфатидилхолины с высоким содержанием основного вещества (90-98%). Выход Q-10 из 100 г биомассы составляет 0,06-0,08 г, фосфатидилхолинов 0,4-0,6 г

Согласно способу получения эргостерина и Q-9 (4), включающему омыление липидов, выделенных из биомассы дрожжей, раствором щелочи, экстракцию неомыленной фракции, кристаллизацию и выделение эргостерина из раствора неомыленной фракции, обработку неомыленной фракции адсорбентом, элюирование с адсорбента фракции содержащей Q-9, отгонку растворителя и выделение Q-9 из полученной фракции. После элюирования фракции, содержащей Q-9, с адсорбента элюируют гидрофильным растворителем фракцию, содержащую эргостерин при соотношении гидрофильного растворителя : адсорбент 2:1 - 20:1 (по массе). Затем объединяют полученный раствор эргостерина в гидрофильном растворителе с экстрактом неомыленной фракции, а перед кристаллизацией эргостерина неомыляемую фракцию обрабатывают гидрофильным растворителем, содержащим 0,5 - 8,0% воды при соотношении растворитель : неомыляемая фракция 8:1 - 50:12 и отделяют нерастворимый осадок. В соответствии с предлагаемым способом выход эргостерина составляет 2,0-2,2%, убихинона 0,1-0,45%

В НПО «Витамины» проведены исследования по разработке лабораторного процесса получения убихинона-10 из биомассы бактерий рода Gluconobacter (70,96). Процесс включает экстрагирование целевого продукта из биомассы бактерий смесью органических растворителей (этанол-диэтиловый эфир), адсорбционную хроматографию экстракта на силикагеле с использованием системы элюентов: гексан - раствор диэтилового эфира в гексане, и кристаллизацию продукта в этиловом спирте. Существенным преимуществом предлагаемого способа является использование биомассы бактерий, являющихся отходом производства аскорбиновой кислоты. Однако небольшой объем производства биомассы ограничивает возможности производства убихинона-10.

1.11 Некоторые современные тенденции развития биотехнологий биологически активных веществ.

В последние десятилетия достигнуты большие успехи в области изучения микробиологического синтеза биологически активных веществ. Расширены представления о биохимических функциях ряда этих соединений, получены интересные мутанты, с помощью которых удалось расшифровать и уточнить отдельные этапы биосинтеза этих важных соединений. Микробиологические методы получения биологически активных веществ, при которых микробная клетка осуществляет их синтез из элементов питательной среды, имеют важное значение при синтезе особо сложных по строению витаминов порфириновой и стероидной природы, коэнзимных форм витаминов.

Получение ценных биологически активных веществ возможно из различных классов микроорганизмов: бактерии, дрожжи, грибы, актиномицеты, водоросли. В последние десятилетия все больше внимания стали уделять грибам (159).

Эта группа эукареотных микроорганизмов как бы совмещает в себе ряд признаков, свойственных животным и растениям. В качестве примера можно

54 указать, тот факт, что клеточная мембрана грибов по составу - наличию таких липидов как фосфотидилхолин, фосфотидилэтаноламин, фосфотидилинозит, а также ацильных цепей - большее соответствует животной клетке. В тоже время способность грибов продуцировать некоторые стимуляторы и ингибиторы роста сближает их с растениями. Эти способности грибов обеспечили возможность использовать их в качестве продуцентов полиненасыщенных жирных кислот, абсцизовой кислоты и гибберелинов. Высокая сорбционная способность грибов, особенно в отношении тяжелых металлов, также привлекла внимание большого числа биологов к этой группе организмов.

Следует также подчеркнуть технологичность грибов, т.е. способность использовать дешевое сырье и накапливать много биомассы в относительно короткие сроки. Грибы образуют большое число необходимых биологически активных соединений. В японской технологии почти 68% таких соединений получают с использованием этих эукареотных организмов (158).

По некоторым оценками на земле насчитывается около 1,5 млн. видов грибов (166). Таким образом, они являются второй по количеству видов группой организмов после насекомых.

В современной биотехнологии используют около 5% известных грибов. Их вклад в мировую экономику точно не подсчитан, но исчесляеться, тем не менее в миллиардах долларов. Особую значимость практическому использованию грибов придает тот факт, что эти организмы являются продуцентами тех веществ, которые ранее получали из прокариот, растений и животных. Поэтому в развитых странах более 80% необходимых биологически активных веществ планируется в ближайшем будущем получать именно из грибов (159).

Современное коммерческое использование грибов включает в себя следующие производства: антибиотики, аминокислоты, вина, пиво, виски, спирт-ректификат, хлеб, сыры, ферменты, агенты биоконтроля, ароматизаторы, пищевые красители, топлива (этанол, биогаз), гербициды, органические кислоты, пестициды, средства для консервации. (166).

Особую значимость в последнее десятилетие получили новые направления в биологии и биотехнологии, которые обязаны своим возникновением фундаментальным достижениям в области микологии. Так, значительный прогресс в изучении химического состава клеток грибов и их субклеточных фракций на различных стадиях онтогенеза позволили создать прогрессивные биотехнологии, среди которых выделилось целое направление - использование грибов в медицине и фармакологии, приобретающее все большее значение в лекарственной индустрии.

Наиболее значимыми в этом направлении являются исследования по изучению таких важных в медицине и фармакологии соединений как коэнзимы (убихиноны Q-9 и Q-10), целый ряд природных антиоксидантов (а-токоферол, (3-каротин, ликопин), некоторых витаминов стероидной природы (например витамины группы D). Кроме того, к этой бурно развивающейся отрасли медицины можно отнести современные достижения в изучении клеточной стенки грибов. В настоящее время установлено, что полиаминосахариды, входящие в состав клеточных стенок грибов обладают антиканцерогенным, мощным заживляющим эффектом и даже антираковыми свойствами.

1.12 Некоторые экономические аспекты развития биотехнологии.

В начале 80-х годов Советский Союз совершил ощутимый прорыв на новых направлениях биотехнологии. В этот период времени был создан научный потенциал, благодаря которому до настоящего времени Россией не утрачены конкурентоспособные и импортозаменяющие производства современных генноинженерных препаратов, диагностических тест-систем и другой биотехнологической продукции. Объем выпуска субстанций антибиотиков в начале 90-х годов обеспечивал потребности всех республик бывшего СССР и стран членов СЭВ. По сравнению с 1991 годом производство

56 субстанций в нашей стране сократилось в четыре раза, а готовых форм для инъекций - в 2,2 раза. Созданные мощности использовались на четверть своих возможностей. Простой мощностей привел к моральному и физическому старению списанию и утере оборудования. Для того чтобы загрузить их работой были необходимы крупные капиталовложения (142).

Во времена СССР микробиологическая промышленность была ориентирована на крупнотоннажное производство кормового белка, ферментов для пищевой, легкой промышленности, биологических средств защиты растений. Голодный паек, на котором оказались сельское хозяйство и перерабатывающие отрасли, сброс поголовья скота и сокращение посевных площадей привели к тому, что выпуск белково-витаминных концентратов прекращен, хотя потребность в кормовом белке сохраняется.

Экспертные оценки свидетельствуют, что в течение последних двух десятилетий мировой рынок биотехнологической продукции рос на 6-15% в год. Это подтверждает прогноз специалистов о возможности биотехнологических компаний в ближайшие 20 лет ежегодно получать до 30% прибыли (47)

Сегодня мировой рынок биотехнологической продукции оценивается почти в $ 163 млрд. Основными секторами рынка является продукты для пищевой промышленности и сельского хозяйства - $ 45 млрд.; фармацевтическая продукция - $ 26,8 млрд.; ферменты и препараты для производства моющих средств - $21 млрд. Кроме того, к биотехнологии относят производство посадочного материала модифицированных растений -объем продаж до $ 30 млрд. в год, и частично фармацевтические или косметические средства, полученные из натурального растительного или животного сырья. Объем этого рынка - $ 40 млрд. (142)

Российская статистика далеко не учитывает всю номенклатуру биотехнологической продукции, не определен и ее состав. В итоге получается, что доля биотехнологий в ВВП не достигает и 0,1%. Иного мнения придерживается НИИ потребительского рынка и маркетинга

57

Минэкономразвития. Его эксперты считают, что объем производимой в 2001 году биотехнологической продукции превысил 12 млрд. рублей (около $ 400 млн.). Консалтинговое агентство Abercade дает меньшие цифры, около $ 360 млн. При этом ежегодный импорт товаров, в производстве которых используются биотехнологии, оценивается в $650 млн. (47).

Следовательно, реальный объем российского рынка биотехнологических товаров превышает $ 1 млрд. Учитывая мировые тенденции экономического развития биотехнологии, в последние годы рынок биотехнологических технологий в России становится все более привлекательным для инвесторов. Постепенно меняется и отношение государства к биотехнологии.

В 2001 году при разработке бюджета на нынешний год на биотехнологические проекты, в рамках Минпромнауки Росси, предполагалось выделить государственные инвестиции в размере 300 млн. рублей. Причем государственные инвестиции составляют только 10% от выделенных на развитие биотехнологии средств. Биомак - организация, созданная при Минпромнауки РФ и занимающаяся привлечением частных инвестиций для осуществления межведомственной программы «Биотехнология для медицины и АПК», планирует привлечь в 2002 году около $ 300 млн.

Программа получила одобрение экспертного совета по биотехнологии, Комитета Госдумы по промышленности, строительству и наукоемким технологиям, включена как важнейший проект в межведомственную программу активизации инновационной деятельности научно-технической сфере России. Создание для биотехнологических отраслей народного хозяйства особо благоприятных условий развития вновь считается важной государственной задачей. Основными потребителями биотехнологической продукции в России являются: 1. Фармацевтика, 2. Пищевая промышленность, 3. Сельское хозяйство (47). На риунке 1.12.1 представлена структура рынка биотехнологической продукции в России.

Общий объем рынка S 1,01 млрд. Собственное производство $ 360 млн. Импорт - порядка $ 650 млн.

Ш Оборудование В Фармацевтика Ш, Сельское хозяйство □ Пищевая промышленность

Рис. 1.12.1 «Рынок биотехнологической продукции России» (47,142 ).

Фармацевтика.

Самый крупный потребитель биотехнологической продукции в нашей стране - фармацевтика. Общий объем рынка лекарств в Росси составил в 2001 году $ 2,5 млрд., из которых, по оценке Abercade, $ 850 млн. составляет биотехнологические препараты. Но только 25-30% этой суммы приходится на отечественную продукцию. Именно в фармацевтическом направлении биотехнологий уже начался приток инвестиций.

Пищевая промышленность.

Пищевая промышленность по оценке Abercade, закупает биотехнологических препаратов на $ 100 млн. в год. Это в основном закваски для производства кисломолочных продуктов, дрожжи и ферменты для производства спирта и мясопереработки. На этом рынке отечественная продукция занимает всего 15%. Сельское хозяйство.

В сельском хозяйстве страны на закупку препаратов, по оценкам Abercade, ежегодно тратится $ 300 млн. Причем только 8-10% этого рынка составляет отечественная продукция. Импортозамещение - наиболее перспективный путь биотехнологий для сельского хозяйства, этот рынок очень велик и постоянно растет на 10-15% в год.

Выводы по главе:

1. В связи с усилением техногенных процессов, включающих воздействие на человека ионизирующей радиации, электромагнитных полей, микроволнового излучения, канцерогенных веществ загрязненной окружающей среды, а также стрессов, возрастает уровень патологических процессов у людей. В результате проведенных медико-биологических исследований установлено, что одним из наиболее эффективных путей решения проблемы коррекции питания, в сложившихся неблагоприятных условиях, является создание биологически активных добавок к пище.

2. Создание и использование в рационе питания пищевых добавок, содержащих каротиноиды, убихиноны, полиненасыщенные жирные кислоты, некоторые фосфолипиды и витамины группы D, позволяет повысить уровень адаптационной защиты организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека и снизить риск развития злокачественных новообразований и ряда других опасных заболеваний.

3. В настоящее время разработаны методы и созданы технологии позволяющие получать: каротиноиды, убихиноны, полиненасыщенные жирные кислоты, фосфолипиды и эргостерин, методами химического синтеза, экстракцией из животных и растительных тканей или биотехнологическими методами. Последние, по мнению большинства специалистов, являются наиболее перспективными.

60

4. Разработанные способы выделения указанных биологически активных соединений включают, как правило, стадии экстракции липидов из биомассы микроорганизмов, кристаллизации или осаждения, а также стадии омыления биомассы или липидов раствором щелочи в присутствии антиоксиданта, экстракции неомыляемой фракции и гидролиза солей жирных кислот. Однако нарастающая потребность в указанных биологически активных веществах, выявленные недостатки в существующих методах получения, а также значительные негативные изменения, происходившие в промышленном (в т.ч. биотехнологическом) секторе экономики России, указывают на актуальность разработки новых методов получения отечественных жирорастворимых биологически активных веществ. Создание технологии комплексного выделения нескольких БАВ липидной природы позволяет снизить себестоимость каждого из полученных компонентов, делая их наиболее конкурентоспособными.

выводы

1. Определены оптимальные условия проведения стадий технологического процесса, при этом рекомендовано:

- проводить процесс экстракции в три ступени, на первой и второй стадии использовать в качестве экстрагента ацетон, на третьей - этанол. Проводить процесс при t=55°C, при соотношении биомасса : экстрагент 1 :3,5; 1: 2,0; и 1:1,5 на первой, второй и третьей ступенях соответственно. Время ступени при экстракции ацетоном ограничить 30 минутами, а при экстракции этанолом - 65 минутами.

- на стадии кристаллизации Р-каротина в качестве растворителя использовать ацетон, проводить процесс при t=55°C в течение 18 часов, при соотношении липиды : ацетон -1:3; процесс перекристаллизации проводить при t=20°C в этаноле и соотношении кристаллы : этанол 1:4

- на стадии выделения фосфолипидов использовать соотношение липиды ацетон 1:5, процесс проводить в течение 20 минут, при +10°С

-на стадии омыления использовать в качестве среды омыления смесь с соотношением нейтральные липиды : ацетон : вода : гидроксид калия - 1 :4,35 : 1,37 : 0,88, при t=67°C и времени процесса 52 минуты.

- на стадии экстракции неомыляемой фракции в качестве экстрагента использовать гексан, экстракцию проводить в три ступени с соотношением фаз нейтральные липиды : ацетон : вода : гексан 1 : 5,1 : 4,9 : 3,5

- на стадии кристаллизации эргостерина из неомыляемой фракции использовать гексан, процесс кристаллизации проводить при t=20°C и соотношении неомыляемая фракция: гексан равном 1: 5. Проведение перед стадией кристаллизации дополнительной очистки неомыляемой фракции 10%-ым раствором ацетона в гексане позволяет увеличить чистоту кристаллов

- на стадии адсорбционной хроматографии использовать силикагель марки АСКГ, а в качестве элюентов гексан и 5,5% раствор ацетона в гексане

- на стадии кристаллизации убихинонов использовать этанол, процесс проводить при t=20°C и концентрации убихинонов в этаноле 10%

2. Разработана технология комплексной переработки биомассы гриба В1. trispora, позволяющая оптимально извлекать из биомассы ценные БАВ: В-каротин, убихиноны, эргостерин, фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты. Разработанная технология позволяет исключить применение значительного числа опасных органических растворителей (метанол, бензол и др.), исключить применение дорогостоящих антиоксидантов на стадии омыления, при этом на всех стадиях процесса используется только три органических растворителя: этанол, гексан, ацетон.

4. Установлены следующие закономерности культивирования гриба В1. trispora, обеспечивающие максимальное накопление отдельных компонентов биолипидного комплекса:

- наибольшее количество эргостерина и убихинонов синтезируется в условиях интенсивного накопления липидов грибом

- максимальное накопление эргостерина отмечено на 65-ом часу совместной ферментации (+) и (-) штаммов, а максимальное накопление убихинонов на 45-ом часу

- внесение в среду культивирования сквалена оказывает положительное влияние на накопление убихинонов и эргостерина, в этом случае возможно получение биомассы с содержанием убихинонов 3,48 мг/г, и эргостерина около 2%.

5. Разработан способ получения водорастворимой формы убихинонов с использованием фракции фосфолипидов, полученных в процессе комплексной переработки биомассы гриба Bl. trispora. Установлено, что для получения стабильных водных растворов возможно использование смеси с содержанием убихинонов 40%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании анализа научной литературы и патентного поиска было установлено, что в ряде индустриально развитых стран Европы, а также США, Японии и России широко проводятся исследования по созданию технологий получения ценных жирорастворимых биологически активных веществ: Р-каротина, убихинонов, эргостерина, фосфолипидов, полиненасыщенных жирных кислот, и их применению в медицинской практике, фармакологии и пищевой промышленности. Использование в рационе питания указанных ценных компонентов позволяет повысить уровень адаптационной защиты организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека и снизить риск развития злокачественных новообразований и ряда других опасных заболеваний.

В результате изучения технологической документации и анализа фракционного состава липидов перспективных штаммов микроорганизмов определено основное направление настоящей работы - разработка технологии одновременного получения биологически активных веществ липидной природы из биомассы гриба Blakeslea trispora.

Определены основные стадии технологического процесса, позволяющие выделять ценные БАВ из биомассы гриба Bl. trispora, включающие последовательное проведение операций: экстракции липидов из биомассы, кристаллизации Р-каротина, осаждения фосфолипидов, омыления нейтральных липидов, экстракции неомыляемой фракции и гидролиза жирных кислот, кристаллизации эргостерина, выделения фракции суммарных убихинонов, очистки суммарных убихинонов от сопутствующих примесей.

Разработанная технология комплексной переработки биомассы гриба В1. trispora, позволяет оптимально извлекать из биомассы ценные БАВ: р-каротин, убихиноны, эргостерин, фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты. При этом определена возможность исключить применение значительного числа опасных органических растворителей и дорогостоящих антиоксидантов. На всех стадиях предлагаемого процесса используется только три органических растворителя: этанол, гексан, ацетон. Данная технология позволяет получать в едином технологическом процессе несколько ценных целевых продуктов липидной природы. При этом достигается более полное использование сырья, что делает данную технологию конкурентоспособной на рынке производства БАВ.

На основании проведенных исследований разработан лабораторный регламент получения БАВ из биомассы гриба Bl. trispora, и технологический регламент на проектирование камеральной установки по переработке биомассы гриба Bl. trispora мощностью 100 кг в месяц (по исходному сырью). В настоящее время на основании частичной реализации предложенной технологической схемы, выпускаются биологически активные добавки к пище «Липидовит» и «Кютенвит», на которые получены соответствующие удостоверения Министерства Здравоохранения РФ. Внедрение технологической схемы комплексной переработки биомассы в промышленных масштабах идет в условиях калужского завода химической и фармацевтической продукции - ОАО «Аромасинтез».

Проведены исследования и установлены некоторые закономерности культивирования гриба Bl. trispora, обеспечивающие максимальное накопление отдельных компонентов биолипидного комплекса - эргостерина и убихинонов, при одновременном снижении содержания нейтральных липидов в биомассе, что дает возможность в дальнейшем упростить технологическую схему, исключив стадии омыления нейтральных липидов и экстракции неомыляемой фракции.

Разработан способ получения водорастворимой формы убихинонов с использованием фракции фосфолипидов, полученных в процессе комплексной переработки биомассы гриба Bl. trispora, что позволяет получать более совершенную лекарственную форму препарата убихинонов, и кроме того, значительно снижает затраты на его производство.

Таким образом, практическая реализация полученных результатов позволяет получать гамму биологически активных веществ: (3-каротин, убихиноны, эргостерин, фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты, обладающих антиоксидантными, антимутагенными, радиопротекторными и рядом других ценных свойств, защищающих организм человека и наследственность от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды.

1. Наименование источникап/п

2. А.С. № 493499 (СССР) Кл. С 10 М 1/04, 1975.

3. А.С.№1360761(СССР) 3аявл.28.07.86.№4095906-опубл.23.12.87. B.H.N47.

4. А.С. №1706213 (СССР), Кл. А 61 К 15/05, 1988.

5. А.С. №1739633 (СССР), Кл. А 61 К 15/05, 1988.

6. А.С. №465812 (СССР), Кл. А 61 К 15/05, 1967.

7. А.С. №950394 (СССР) Кл. А 61 К35/60 С07 G7/026. 1982.

8. Абдушалимов П.Х., Помазнова О.С., Термицкий Б.И. // Микробиологический синтез 1967 - №6 - с.9-10.

9. Авилов СЛ., Калинин В.И., Дроздова О.А., и др. // Химия природных соединений. 1993. - № 2. - С.49-52.

10. Акулин В.Н., Блинов Ю.Г. Исследования в области технологии использования рыб и нерыбных объектов Дальнего Востока // ТИНРО-70.-Владивосток.-1995,- С.32-51.

11. Алекперов У.К., Антимутагенез. Теоретические прикладные аспекты. -М.:Наука- 1984- 100 с.

12. Ауэрбах Ш. // Проблемы мутагенеза М.: Наука - 1978 - с.21

13. Афанасьев И.Б., Кислородные радикалы в химии, биологиии, медицине -Рига.:РМИ 1988 - с. 9-25.

14. Барляк И.Р., Исаева А.В., // Цитол. И генет. 1994. - №3 - С.3-17.

15. Березовский В.М. Химия витаминов М.:Наука - 1973. - с.175.

16. Бескова Т.В., Малашенко A.M., // Генетика 1991 - №2. - С.285-289.

17. Бехтерева М. Н др. // Микробиология 1969 - Т. 38 вып. 3 стр. 1006

18. Бехтерева М.И., Тарасова Н.В. Феофилова Е.П. и др.,// Микробиология -1967 -Т.36 вып. 1 стр. 46-52

19. Бидлингмейер Б. Препаративная жидкостная хроматография. Пер. с англ. -М.:Мир. 1990 -238 с.

20. Бирюков В.В. Практическое руководство по применению математических методов планирования эксперимента для поиска оптимальных условий в многофакторных процессах. // Рига.:3инате. 1969.

21. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза М.:Наука - 1985 - 296с.

22. Бобнева С.М. В сб. Использование биомассы микроорганизмов для пищевых целей 1985 - Пугцино.

23. Борисенко Е.Г. // Микробиология 1967 - №5 - с. 1-3.

24. Бородин Е.А., Арчаков А.И., Лопухин Ю.М. Теоретическое обоснование использования ненасыщенных фосфолипидов для восстановления структуры и функции поврежденных биологических мембран // Вестник АМН СССР, 1985.-N3.-С.84-90.

25. Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., Наследственностьь человека и мутагены внешней среды. М.: Медицина - 1989. - 270с.

26. Бритиш Г. Биохимия природных пигментов. М.: Мир, 1986. - 422 с.

27. Бурлакова Е.Б. // Успехи химии., 1975 - т.44. - №10 - Р.874-886.

28. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. // Успехи химии 1985 - том 54 - №9 -Р.1540-1558.

29. Вечер А.С., Водородные ионы в биосфере Минск, Наука и техника -1986.

30. Воробьева Г.И., Максимова Г.И., Щекина Е.В. // Микробиологическая промышленность 1970 - №34 - с.60-63.

31. Воробьева Л. И., Микробиологический синтез витаминов М.:МГУ - 1982. -С. 164.

32. Гальцова Р.Д. Стеринообразование у дрожжевых микроорганизмов М. -Наука - 1980 - стр. 65-81

33. Гальцова Р.Д. Стеринообразование у дрожжевых организмов. М.: Наука -1980.

34. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.:Мир -1997 -624с.

35. Гололобов А.Д., Тарасова Н.В. и др. // Микробиологическая промышленность 1972 - №6 - с.9-11.

36. Горгошидзе Л.Ш., Конь И.Я., Кулакова С.Н., Шеваяков А.Н. // Вопросы питания 1986 -V.5 - Р.45-50.

37. Гордиенко А.Д., // Фармакология и токсикология. 1990. - Т. 53. - № 5. -С.78-91.

38. ГОСТ 17689-78 "Количественное определение содержания b-каротина в микробных клетках"

39. Грачев Ю.П. Матемактические методы планирования эксперимента М. Лицевая промышленность 1979 - 200с.

40. Грачева И.М. Гаврилов А.С., Иванкин А.Ф. В сб. Влияние неорганического фосфата на биосинтез каротина грибом Bl. trispora -МТИПГТ М. 1988.

41. Грачева И.М. Гаврилов А.С., Иванкин А.Ф. В сб. Влияние отходов синтеза b-ионона на биосинтез каротина грибом Bl. trispora МТИПП - М.1988.

42. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология 2000 - М.: МГУ.

43. Дамбахер М.А., Шахт Е. Остеопороз и активные метаболиты витамина Д.- EULAR Publishers.-Basle.-Switzerland.-1996.

44. Деев СВ., Буторова И.А., Авчиева П.Б. // Биотехнология 2000 - №5 - стр. 36-46

45. Донченко Г.В. Биохимия убихинонов (Q) Наук. Думка - 1988 - 240 с.

46. Дурнев А.Д., Середенин С.Б. // Фармакологические проблемы поиска и применения антимутагенов Вестник РАМН - 1993 - вып. I. - с. 19-26.

47. Дурнев А.Д., Середенин С.Б., Мутагены (скрининг и фармакологическая профилактика воздействий) М., Медицина 1998 - 328 стр.

48. Ежедневная деловая газета "Ведомости" №50 (613). 26.03.2002.

49. Заславский Ю.А., Акоев И.Г., // Радиобиология 1972 - т.22. - вып.6. -с.444.

50. Заславский Ю.А., Шишкина Л.Н., Кожокару А.Ф., Алексеева Л.В., Акоев И.Г., // Радиобиология 1981 - т.21. - вып.4. - с.609-611.

51. Заявка №56-42913 (Япония) // Мицубиси гасау кагаку К.К. Заявл. 03.03.80. - №52-26367 - опубл. 11.03.82 №1-315 - Изобретения в СССР и за рубежом - 1982 - №9 - вып. 62.

52. Заявка №56-42913 (Япония), // Ниссин сэйфун К.К. Заявл. 30.03.77., №52-34672, опубл. 10.07.81., №1-1073. Изобретения в СССР и за рубежом- 1982, №4 вып. 62.

53. Заявка №57-21308 (Япония), // Мицубиси гасу кагаку К.К. Заявл. 17.03.80. №55-33659, опубл. 06.05.82., №1-533. Изобретения в СССР и за рубежом - 1982, №11 - вып. 62.

54. Заявка №57-6910 (Япония), // Дэюдзе сейси К.К. Заявл. 14.03.77. №5227739, опубл. 02.08.82., №1-173. Изобретения в СССР и за рубежом - 1982, №8 - вып. 62.

55. Заявка №58-53917 (Япония), // Кева хакке коге К.К. Заявл. 28.07.78., №53-91584, опубл. 01.12.83., №1-1348. Изобретения стран мира - 1984, №8- вып. 62.

56. Заявка №59-26272 (Япония), // Toe дзюдзе К.К., Асахи кассей коге К.К. -Заявл. 08.03.77., №52-24427, опубл. 26.06.84., №1-656. Изобретения стран мира 1985, №2 - вып. 62.

57. Иванкин А.Ф., Феофилова Е.П., Киселева А.И., и др. Патент RU №2102416 С09 В61/00 (РФ) 1998.

58. Илюченок Т.Ю., Шадурский К.С., Самохвалов Г.И., Обольникова Е.А., // Фармакология и токсикология 1983 - т.46 - №6 - стр.63-66

59. Казанцев Ю.Е. "Способы фракционирования микробного жира и получение фосфолипидов, жирных кислот и убихинона-9 : Микробиологическое производство: Обзорн. информ. М. : НИИСЭНТИ, 1992. - Вып. 2. -24 с.

60. Казанцев Ю.Е., Скрябина С.В., Орех Г.Т. и др. А.С. №906182 (СССР) Способ получения фосфолипидов и жирных кислот. Заявл. 05.06.80. №2938127/28-13.

61. Капитонов А.Б., Пименов A.M., // Успехи современной биологии. 1996.

62. Т. 116. -Вып.2. -С.134-234

63. Капитонов А.Б., Пименов A.M., // Успехи современной биологии. 1996. -Т. 116. - Вып.2. С.234-244

64. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. // Вопросы мед. Химии 1999 - т.45. - вып. 1 - с.3-12.

65. Каротиноиды в онкологии // Материалы симпозиума ОНЦ РАМН 1992 -М.

66. Касаикина О.Т., Гагарина А.Б., Эмануэль Н.М. // Изв. АН СССР 1975 -.V.10 -Р.2243-2247.

67. Касаикина О.Т., Карташева З.С., Гагарина А.Б // Изв. АН СССР, сер. хим, -1981 V.276 - №3 - Р.556-540.

68. Касаткин А.Г. Основные процессы и аппараты химической технологии -М.:Химия 1971 - 783 с.

69. Кейтс М. Техника липидологии М.:Мир - 1976 с. 332.

70. Коган Л.М. Обольникова Е.А., Уринюк В.М., Сухарева-Неманова Н.Н., Самохвалов Г.И. // Прикл. Биохимия и микробиология 1983 - т. 19. - №4 -с.552-554.

71. Коган Л.М., Обольникова Е.А., Самохвалов Г.И. // Химико-фармакологический журнал,. 1983 17 - №4 с. 234-238

72. Козлова И.В. Исаков Я.И., Миначев Х.М. Способ получения кофермента Q (убихинонов) А.С. №1074081 (СССР) - 1981.

73. Коломийцева И.К., Новоилова Е.Г., Обольникова Е.А. // Угнетение биосинтеза сфингомилеина в печени крыс при облучении и нагрузках убихиноном-9 Докл. АН СССР - 1980 - вып.251- №1 - с. 240-242.

74. Конь И.Я., Горгошидзе Л.Ш. // Бюл. экспер. биол. и мед 1985 V.4 - Р.429.

75. Конь И.Я., Горгошидзе Л.Ш., Васильева О.Н., Кулакова С.Н. // Биохимия -1986 V.51- №1 Р.70-76.

76. Костырко В.А., Колесова Г.М., Кожухова А.И. и др. // В сб.: Митохондрии: Аккумуляция энергии и регуляция ферментативных процессов 1973 - М. , Наука - Р. 116-123.

77. Костюк В.А., Лунец У.Ф. // Биохимия 1983 - т.48 - №9 - с. 1491-1495.

78. Костюк В.А., Потапович Ф.И. // Биохимические механизмы антиоксидантного действия производных о-бензохинона // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине Рига.:РМИ - 1988 - с.43-45

79. Кочеткова А.А., Колеснов А.Ю., Тужилкин В.И. и др. // Пищевая промышленность. 1999. - № 4. - С.7-10.

80. Лабораторный технолгический регламент на выделение убихинона-9 при комплексной переработке микробного жира // ВНИВИ: утв. Зам. Директора ВНИВИ Гунаром В.И. 22.09.76. 1976.

81. Лебская Т.К., Новиков В.Ю., Толкачева В.Ф., Ильина Л.П., Бекетова Н.А. // Сб.Тр. ТИНРОцентра.-1998.-С.49-57.

82. Ленинджер А. Биохимия : Пер. с англ., М., Мир 1974 - 956стр.

83. Лопухин Ю.М., и др. Холестериноз М., Медицина - 1983 - 279стр.

84. Лука В.Т., Вецохола А.О. // Прикп. биохимя и микробиология 1985. - №4. - стр.440-442.

85. Лунец Е.Ф. Титовец Э.П. // Актуальные вопросы нейропаталогии и нейрохирургии Минск. .Наука и техника - 1973 - с.73.

86. Марова Е.И. Роль активных метаболитов витамина Д в патогенезе и лечении метаболических остеопатий. М.: Медицина - 1997 - 132с.

87. Маслов В.В., Султанович Ю.А., Нечаев А.П., Гололобов А.Д. // Химия природных соединений 1982 - №6 - с.812.

88. Моисеенков A.M., Веселовский А.Б. // Химико-фармакологический журнал. 1992. - №6. - С.42-55.

89. Мосичев М.С., Матвеев Д.А., Белов А.П. // Прикладная биохимия и микробиология 1994 - том.З. - вып.З - с.430-435.

90. Наумов В.В., Храпова Н.Г // Биофизика 1985 - V.30 - №1 - Р.5-9.

91. Наумов В.В., Храпова Н.Г. // Биофизика 1983 - V.28 - №5 - Р.730-735.

92. Наумов В.В., Храпова Н.Г. // Кинетика и катализ 1984 - V.25 - №3 -Р.563-570.

93. Нещадим А.Г., Балабанов В.В. Саленко В.И. // Микробиологическая промышленность 1970 - №2А - с.50-55. - 1971 - №4 - с. 6-11.

94. Нещадим А.Г., Овчинникова Г.А., Ржехин В.П. // Микробиологический синтез 1971 - №4 - с. 6-11.

95. Новиков П.В., Кази-Ахметов Е.А., Сафонов А.В. // Росс. Вестник перинатологии и педиатрии 1997 - №6.

96. Номенклатура ферментов // Пер. под ред. А. Е. Браунштейна М. : ВИНИТИ, 1979г.

97. Обольникова Е.А., Татарникова Н.Ю., Померанцева Н.В., Коган JI.M., Самохвалов Г.И. // Микробиология 1987 - т.5. - №3 - с.436-440.

98. Обольникова Е.А., Юлдашева JI.C., Бехтерева М.И., Самохвалов Г.И. // Прикл. биохимия микробиология 1971 - Т.7 - вып. 1 стр. 74-78

99. Орех Г.Т., Воскресенский С.А. // Рационализаторские предложения и изобретения. Главмикробиопром 1983. - вып.1 - с. 4-5.

100. Орех Г.Т., Воскресенский С.А., Казанцев Ю.Е., и др. Способ получения эргостерина из дрожжей. А.С. №1251537 (СССР), 1984.

101. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.В., // Успехи биол. Химии -1990-Т.31 с.180-208.

102. Патент № 1396517 (Франция) кл.12С 1964.

103. Патент №110037 (ГДР), Кл. 4С 12 Р7/64, 1974.

104. Патент №1333739 (Франция) кл. 12С 1962.

105. Патент №1411450 клС67 1975.

106. Патент №1505589 кл. С12 1966.

107. Патент №154448 (ГДР) // Институт технической химии Заявл. 18.08.80. опубл. 24.03.82.

108. Патент №1545243 (Франция) кл С12 1968.

109. Патент №2074711 (Россия), А 61 К 3/07, 1997.

110. Патент №208171 (ГДР) // Институт технической химии Заявл. 18.08.80. опубл. В И.С.М. 1984, вып. 62. №9.

111. Патент №2102416 С09 В61/00 (РФ) 1998.

112. Патент №2112808 (Россия), CI 6А К 31/05, 1995

113. Патент №2112808 (Россия), CI 6А К 31/05, 1995

114. Патент №213471 (Россия), CI 6А К 31/05, 1999.

115. Патент №213471 (Россия), CI 6А К 31/05, 1999.

116. Патент №215091 (ГДР) // Институт технической химии Заявл. 31.10.84. -опубл. В И.С.М. - 1985. - вып. 62. №6.

117. Патент №229152 (ГДР), 1983.

118. Патент №236552 (ГДР) // Институт технической химии Заявл. 26.04.85. -№223368 опубл. В И.С.М. - 1987. - вып. 65. №1.

119. Патент №247922 (ЧССР)Кл. 4С 12 Р7/64, 1987

120. Патент №2874171 (США), 1959.

121. Патент №3891772 (США) кл. А 23 42/60 1975.

122. Патент №4684520 (США), 1987г.

123. Патент №4707360 (США), 1987г.

124. Патент №4713397 (США), 1987г.

125. Патент №4778798 (США), 1988г.

126. Патент №4959212 (США), 1990г.

127. Патент №5119034 (Япония), 1976.

128. Патент №5378461 (США), 1995г.

129. Патент №55-33659 (Япония), 1980.

130. Патент №55-85393 (Япония), 1980.

131. Патент №55-85393 (Япония), 1980.

132. Патент №56-31117 (Япония), 1981.

133. Патент №56-39880 (Япония), 1981.

134. Патент №57-41903 (Япония, 1982.

135. Патент №58-30038 (Япония), 1983.

136. Патент №58-67119 (Япония), 1983.

137. Патент №60-15319 (Япония), 1985.

138. Патент СССР в США №3965130 Кл. CI 6А К 31/05, 1989.

139. Покровский А.А. Метаболические аспекты фармакологии и токсикологии пищи. М.: Медицина, 1979. - 184 с.

140. Проскуряков Н.И., Попова Е. М., Осипов Ф. М. // Биохимия 1938 - №3 -вып. 3 - стр. 397

141. Робышева З.Н. Канд. дис. М. - 1973 - Ин-т микробиологии АН СССР

142. Российская газета№53 (2921) 26.03.2002.

143. Ружечка Л., // Перспективы развития органической химии М.: Наука, 1959

144. Самохвалов Г.И., Обольникова Е.А., // Успехи химии 1976 - том 36 -стр.1012-1041.

145. Санникова В.М., Погуляка В.Д., Санников Ф.Л., Тюпа Г.Г // Биотехнология 1989 - Т. 5 - №1 - стр. 58-60

146. Середенин С.Б., Дурнев А.Д., // Фармакологическая защита человека // М.: ВИНИТИ 1992-с. 162

147. Сидорчук Н.В., Котов В.Б., Ярилова Г.И. // Микробиологическая промышленность 1971 - №3 - с. 18-20.

148. Скулачев В.П. //Биохимия, 1999.-Т.64.-№12.-С.1679-1688.

149. Сыскин Г.А., Зуев Ю.Ф. // В сб.: Исследования по технологии новых объектов промысла 1980 - Владивосток - Р.26 - 33.

150. Тарасова Н.В., Иванова Г.И., Гололобов А.Д. // Микробиологическая пр-ть 1976 - №9.

151. Тарасова Н.В., Обольникова Е.А., Гололбов А.Д. и др. А.С. СССР 568676. Заявл. 27.06.72 № 1803948/16

152. Тарасова Н.В.,Обольникова Е.А., Гололобов А.Д. А.С.№568676 - Заявл. 27.06.72, опубл. В Б.И. - 1977 - №30.

153. Тарасова Н.В.,Обольникова Е.А., Гололобов А.Д., Самохвалов Г.И. А.С.№401180 Заявл. 11.10.71, опубл. В Б.И. - 1977 - №39.

154. Технологический регламент на проектирование опытно-промышленной установки по переработке микробного жира мощностью 2000 тон в год (по исходному сырью). ВНИИсинтезбелок. 09.04.76. М. - 1975.

155. Тутельян В.А. // Вопросы питания. 1996. - № 6. - С.3-11.

156. Уайт Ф., Хендлер Э., Смит и др., Основы биохимии: Пер. с англ. , М. , Мир 1981 - 535стр.

157. Федорович P.M., Шмырева Р.К., Николаева МЛ. // Микробиологическая промышленность 1967 - №6 с. 14-17.

158. Феофилова Е.П. // Микробиология 1994 - том.63. - №6. - с.1121-1122.

159. Феофилова Е.П. // Микробиология 1997 - том.66. - №3. - с.302-309.

160. Феофилова Е.П. // Прикл. бохимия микробиология 1994 - Т.30 - вып. 2 -стр. 181

161. Феофилова Е.П., Арбузов В.А. // Микробиология 1975 - Т. 44 - вып. 3 -стр. 395-399

162. Феофилова Е.П., Бехтерева М.Н., Козлова Ю.И. // Микробиология 1970 -Т. 39 - вып.З - стр. 338-345

163. Феофилова Е.П., Пигменты микроорганизмов. М., Наука - 1974.

164. Феофилова Е.П., Терешина В.М. Меморская А.С., // Микробиология -1995 том 64 - №6 - стр. 734-740

165. Халилов Э.М., Торховская Т.И. // В сб.: Эссенциальные фосфолипиды в лечении атеросклероза 1989 - Л., - Р.36-44.

166. Хоуксворт Д.Л. // Микология и фитопоталогия 1992. Т.26. - вып. 2. -с.152-167.

167. Черменская Т.С. Диссерт. на соиск. уч. ст. к.б.н 1972 - Пущино-на-Оке.

168. Юлдашева Л.С., Феофилова Е.П., Самохвалов Г.И., Бехтерева М.Н. // Микробиология 1972 - Т. 31 - вып. 3 - стр.430-435

169. Якушина Л.М., Малахова Э.Н., Шкарина Т.Н. и др. // Вопр. мед. Химии -1995 V.41(4) Р.36-41.

170. Aberg. F., Appelkvist E.L., Dallner G., Ernester L. // Arch. Biochem. Biopys -1992 - v.295 - p.230-234.

171. Affany A.,Salvayre R.JBlazy L. // Fundament. Clin Pharmacol. 1987 V.l - №1 - P.451-457.

172. Anwar W.A. //Mutant. Res. V.305 - P. 165-173/

173. Arigoni D., // Ciba Found symp. on the biosyntheses of terpens and sterols -London 1959 - P. 231

174. Ashby J., Waters M.D., Preston J., et al. // Mutant. Res. 1996 - V.352 - P153-157.

175. Basage H.S., // Biochemical aspects of free radicals 1990 - V.68 - P. 989-998

176. Bejarano E.R., Cerda Olmedo // FEBS 11313 1992 -v.306. - №2,3 - p.209-212.

177. Bloch K., Proc. Intrn. Conf. Biochem. Lipids Marseill., - 1960.

178. Boone C.W., Keloff G., Malone W.E., // Ibid. 1990 - v.50 - p.2-9.

179. Bors W., Heller W., Michel C., Saran M. // Metods Enzymol. 1990 - V.186 -№1 - P.343-355.

180. Bowen P.E., Garg V., Stacewicz-Sapuntzakis M. et al. // Ann. NY Acad. Sci. -V.691 P.241-243.

181. Brown E.D., Micozzi M.S., Craft N.E. et al. // Am. J. Clin. Nutr.- 1989 -V.49(6) P.1258-1265.

182. Bu'lock J.D., Osaje A.U., // Journal General Microbiology 1973 -V.76 - P. 7783

183. Burton G.W., Ingold K.U. // Acc. Chem. Res. 1986 - V.19 - № 7- P.194-201.

184. Burton G.W., Ingold K.U. // J. Amer. chem. Soc. 1981 - V.103 - P.6472-6477.

185. Burton G.W., Ingold K.U. // Science 1984 V.224 - №91841 - P.569-573.

186. Burton G.W., Pade V.L., Gabe E.J. et al. // J. Am. Chem. Soc., 1980 - V.102 -№26 - P.7791-7792.

187. Canfield L.M.,Krinsky N.I.,01sonI.A.//Ann. NY Acad. Sci.-1994-V.691- P.295.

188. Chaskadbi S., Vaidya V.G., // Mutant. Res. Genet. Toxicol. Test. 1989 - v.222- p.219-222.

189. Corey E.J., Volante R.P., // J. Amer. Soc., 1976 - V.98 -№5 - P.1291

190. Cotelle N., Bernier J.L., Henichart J.P. et al. // Free Radic. Biol, et Med. 1992- V.13 -№1 -P.211-220.

191. Cox Greame В., Gibson F., // Biochem. Biophys. Acta. 1964 - v. 93,- p.204.

192. Crane F.L., Barr R. // Lenaz.G. Ed Chichester 1985.

193. Culter R.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984 - V.81 - P.7627-7631.

194. Diplock A. Fat-soluble vitamins freis biochemistry and applications -Heinemann, London 1985 - P.319.

195. Diplock A.T. // Med. Biol. 1984 - V.62 - № 2 - P.78-80.

196. Dunphy P.I. Brodie A.F. // Method in Enzymology. 1971 - v. 18 - p. 654-659.

197. Duit I.F., Habbal M.Z., // Biochemical Journal 1972. - №.127 - P. 345-359.

198. Elahi M, Chichester C.O., Simpson K. // Phytochem. 1973 - V. 12 - p. 1627

199. Erdman J.W., Bierer T.L., Gugger E.T. // Ann. NYAcad. Sci. 1994 - V.691-P.76-85.

200. Esterbauer H., Puhl H., Waeg G., Krebs A., Dieber-Rotheneder M. In.: Packer L., Fuchs J. eds. Vitamin E : Biochemistry and clinical applications. N.Y.: Marcel Dekker ,Inc., 1992 - P.649-671.

201. Folch J., Ascoli J., Meath J. // J. Biol. chem. -1951 V. 191. - p.833-835.

202. Folkers K. //Lenaz.G. ed Chichester 1985 - p. 379-407

203. Folkers K., Watanabe Т., Kaji M., J. Molec. Med., 1977,v.2

204. Frenkel K., //Pharmac. Ther. 1992 - V.53 - P. 127-166

205. Fryberg M., Ocheschlager A.C., Unran A.M., // Arch.biochem. And biophys.,- 1974-V.160-№1 -P.83

206. Gainer J.L., et al. // Experientia 1992 - V.31 - №5 - P.548-549

207. Garraway M.O., Evans K.C., Fungal nutrition and physiology Jhon Willy and sons., Inc., USA - 1984.

208. Garton G.A., GoodwinT.W., Lijinsky W., // Biochemical Journal 1951. -№.48 - P. 154-163.

209. Gibson M.I., Gibson F. 11 Biochem J. 1964 - v.90. P.248.

210. Gloor U., Wiss O., Arch. Biochem. And biophys., - 1959 - V.83 - P.216

211. Glover J. Biochemistry of Quinones A.P.: N.Y. - 1965.

212. Goodwin T.W., // Ciba Found symp. on the biosyntheses of terpens and sterols -London 1959 - P. 279

213. Goodwin T.W., // Journal Sci. Ind. Res., 1968 - V.27 - P. 103

214. Gregoriadis G. Engineering liposomes for drug discovery: progress and problems // TIBECH. V.13. P.527-537.

215. Hallivel В., Gutteridge J., //FEBS Lett. 1992 V.307 - P.108-112

216. Hallivel В., Gutteridge J., Free radicals in biology and medicine Oxford: Clarendon Press - 1986.

217. Hankin J.H., Marchand L.L., Kolonel L.N., Wilkens L.R. // Ann. NYAcad. Sci.- 1994-V.691 -P.68-75.

218. Hatefi V., Lester R., Crane F., Widmer C., // Biochem et Biophys. Acta 1959 -V.31 - №2 - P.490-501

219. Heinonen O.P., Albanes D. // New Engl. J. Med. 1994 - V.330(15) - P.1029-1035.

220. Jack D., // Lancet. 1998. - V.352. - P.704-710.

221. Kanasawa M., Takanashi T. Coenzyme Q by fermentation in biomedical and clinical aspect of coenzyme Q North-Holland.: Biomedical Press. 1981. -p.311.

222. Kartha Y.N., Krishnamurthy S. // Int. J. Vitam. and Nutr. Res. 1977 - V.47 -P.391- 401.

223. Katazawa S.M., Ozawa Т., Suzuki K. et al. // Experientia 1980 - V.36 - №8 -P.1002-1003.

224. Klein H.P. // J. Bacterid., 1955 - №69 - V. 6 - p. 620

225. Kok S.W. Et al. // Am. J. Clin. Nut. 1987 - V.45 - P.462-468.

226. Krinsky N.I. // Free Rad. Biol, et Med. 1989- V.7 - №6 - P.617-635.

227. Landi L., Cabrini L., Sechi A.M. et al. // Biochem. J. 1984 - V.222 - №2 -P.463-466.

228. Landi L., Carbini L., Tadolini B. et al. // Ital. J. Biochem. 1985 - V.34 - V.5 -P.356-363.

229. Lavate W.V.Dyer J.R., Springer C.M. // J. Biol. Chem., 1965 - v.240. - p.524.

230. Lee T.C., Rodrigiies D.B., Karasawa I., // Appl. Microbiol. 1975 - v.30 -p.988.

231. Liks I.O., // Bioch. Et Biophys. Acta 1963 - v.73 - №3 - P.349-366.

232. Lynen F., // Journal Ceel and pysiol., 1959 - V.54 - №1 - P.33

233. Lynen F., Henning U., // Angew. Chem., 1960 - V.72 - P.820

234. Lynen F., Reichert E., Rueff L., // Annalen de Chemie -1951 V.67 - P.463

235. Lynen F.,// Ciba Found symp. on the biosyntheses of terpens and sterols -London 1959 - P. 95

236. Mora A., Paya M., Rios J.L., Alcanaz M.J. // Biochem.Pharmacol. 1990 -V.40. - №5 - P.793-797.

237. Ohshima Т., // Food technology. 1998. - V.52. - №6. - P.50-54.

238. Ozhogina O.A., Kasaikina O.T. // Free Rad. Biol et Med.- 1995 V.5 - P.575-581.

239. Palozza P.,Krinski N.,I. // Free Rad. Biol et Med. 1991 - V.4 - P.407-414.

240. Polan P.R., Mikal M.S., Basu J., Romney S.L. // Nutr. Cancer. V.15(l) - P. 1320.

241. Popjak G., Goodman W.S., Cornforth J.W. et al., // Biochem and biophys. Res. Communs., 1961 - V.4 - №2 - P. 138

242. Porter J.W., Zscheile F.P. // Arch. Biochem 1946 - v. 10. - №1. - p.537.

243. Prince S.W. et al // Cerculation 1984 - V.78 - P.338-344.

244. Raman T.S., Sharma B.S., Yayaraman J., Ramasarama T. // Arch. Biochem. And Biophys. 1965 - v.l 10 - p.75-84.

245. Ramanathan R.,Das N.P., Tail C.H. // Free Radic. Biol, et Med. 1994 - V.16 -№1 - P.43-48.

246. Rojagopalan K.V., Fridovich I., Handler Ph. 1962 - J. Biol. Chem., v. 237. - p.922.

247. Ruzichka L., // Experientia 1953 - V.9 - №10 - P.357

248. Salgado L.M., Bejarano E.R., // Phytochemistry 1991 - v.30.- №8. - p.2587-2591

249. Salgado L.M., Bejarano E.R., Cerda Olmedo E. // Experimental mycology -1989 v.13. - p.332-336.

250. Smith A.H., Waller K.D. // Am. J. Epidemiol. 1991 - V.133(7) - P. 661-671.

251. Sonderhoff R., Thomas H., // Annalen der chemie 1937 - V.530 - №3 - P.195

252. Stahelin H.B., Gey K.F., Eichholzer M., Ludin E. // Am. J. Clin. Nutr. 1991 -V.53(Suppl. 1) - P.265-269.

253. Steinberg S.W. et al. //N. Engl. Z. Med. 1989 - V.320(14) - P.915-924

254. Stonger S.W., Payne D.K., // Pharmacotherapy 1992 -V.26 - P.l554-1581

255. Tangney Ch.C., Shekelle R.B., Raynor W. et al. // Am. J. Clin. Nutr. 1987 -V.45 - P.764-769.

256. Tavormina P. A./. Gibbs M.N., Huff J. W., J. Amer. Chem - 1956 - V.78 - №17- P.4498

257. Terao J. // In.: All rihgst reserved Flontiers of reactive oxigen species in biology and medicine 1994 - P.329-332.

258. Terao J., Boey P.L., Ojima F., Nagao A., Suzuki E., Takama K. // In.: Oxigen Radicals.-Elsevier 1992 - P.657-660.

259. Terao J., Yamaushi R., Marakami H., Matsushita S. // J. Food Proc. Presery.-1980-V.4-№1 P.79-93.

260. Thommas C.A., Goodwin T. W. // Phytochem., 1967 - V. 6 - p. 355

261. Tohen T.T., Bloch K., // J. Biol. Chem., 1957 - V.226 - №2 - P.921

262. Urnini F., Maiorino M., Morazzoni P., Roveri A., Pifferi G., // Free Radic. Biol, et Med. 1994 - V.16. - №5 - P.547-553.

263. Wagner A.F., Stopkie R.J., Folkers K. // Arch. Biochem. Biophys. 1964 - V.7- № 2 P.184-186.

264. Yu B.P. // Physiolog. Rev. 1994 - V.74 - P.139-162

265. Ziegler R.G.// Ann. NYAcad. Sci. 1994 - V.691 P.l 10-119.1. ЕАПВ/110/2 002

266. ЕВРАЗИЙСКАЯ ПАТЕНТНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ (ЕАПО)

267. The Eurasian Patent Organization1. Ф —-i—

268. ЕВРАЗИЙСКОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО (ЕАПВ) The Eurasian Patent Office

269. Изобретение, заявленное в пункте (пунктах) формулы относится к неохраноспособным объектам, указанным в правиле 3(3) и (4) Инструкции, в связи с чем оно является изъятым заявителем из формулы изобретения.

270. D В связи с тем, что пошлина за подачу евразийской заявки уплачена в размере, превышающем установленный на , эта сумма может быть возвращена, либо зачтена в счет уплаты других пошлин.

271. Пояснения экспертизы смотри па обороте)а № от 27/03/2002 омерзаявки 200200266/26ата отправки 2 9 MAP 20021. Эксперт ^ Х.Д.Мусоев

272. Отдела формальной экспертизы +7(095)921-3353v V у. Лл я

273. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

274. РЕГИСТРАЦИОННОЕ УДОСТОВЕРЕНИЕ,4.Ш.