автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Разработка технологии получения ликопина на основе пары штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+)

На правах рукописи

АВЧИЕВ Марат Исламудинович

Разработка технологии получения ликопина на основе пары штаммов гриба В1акез1еа №шрога ВСБ-129(-> и ВСБ-130(+).

Специальность 05.18.10 - Технология чая, табака и биологически активных

веществ и субтропических культур

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва -2003

Работа выполнена в лаборатории «Биологически активных веществ» ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ»

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник Буторова Ирина Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Борисеико Евгений Георгиевич

доктор химических наук Козлов Эрнест Иванович

Ведущая организация: Московский Государственный Университет инженерной экологии

Защита состоится: У( 2003 г. в час. в аудитории на заседании диссертационного совета Д 212.148.04 Московского Государственного Университета пищевых производств по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д.11, МГУПП.

Просим Вас принять участие в заседании диссертационного совета или прислать отзыв в 2-ух экземплярах, заверенных печатью учреждения по вышеуказанному адресу.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПП.

Автореферат разослан « 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.т.н., доц.

_ Крюкова Е.В.

Общая характеристика работы.

Актуальность темы.

Современный уровень развития техники достиг таких масштабов, что практически любая форма хозяйственной деятельности, в большей или меньшей степени, оказывает негативное влияние на биосферу. Организм человека при этом подвергается все возрастающему действию разнообразных физических, химических и биологических факторов, приводящих к ослаблению сопротивляемости организма, нарушению обмена веществ, возникновению широкого круга заболеваний.

Создание и использование в рационе питания пищевых добавок, содержащих природные биологически активные соединения, такие как витамины и антиоксиданты позволяют значительным образом повысить защитные силы организма и снизить риск развития ряда опасных заболеваний.

В качестве одного из наиболее активных и естественных для организма человека средств такого назначения в последние годы рассматривают ликопин.

Ликопин - относится к природным соединениям группы каротиноидов. Это пигмент, который придает здоровую красную окраску фруктам и овощам, таким как помидоры, арбузы, розовые грейпфруты, облепиха и др. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что ликопин наряду с красящей функцией имеет самостоятельное значение как биологически активная добавка. Ликопин оказывает общеукрепляющее действие на организм и обладает большим набором ценных фармакологических свойств. Подавляя в организме свободнорадикальное окисление, ликопин стабилизирует имунный статус организма, улучшает протекание ряда важнейших биологических процессов в организме, в том числе нормализует уровень глюкозы в крови, липидный обмен, зрение и контролирует пролиферацию (новообразование) клеток.

В условиях растущей потребности в ликопине важным становится вопрос изыскания его новых источников.

До сих пор основным источником получения ликопина являются растения, в частности специально отселекционированные сорта томатов Ьусорешсоп ер. Однако очень низкий выход (0.3-0,4 мг/г сырья), сезонность, действие неблагоприятных погодных факторов и фитопатогенов делают этот способ экономически неэффективным. Один килограмм такого ликопина стоит около 5000 $ США. Высокая цена и дефицит ликопина на рынке являются основными причинами отсутствия необходимого человеческому организму антиоксиданта в ежедневном рационе питания.

Решение указанных проблем возможно путем создания биотехнологического способа получения ликопина. В этом случае производству не грозит сезонность и потеря урожая от действия неблагоприятных факторов. Кроме того, биотехнологический способ позволяет получить ликопин природного качества.

рос. национальная]

библиотека ]

В настоящее время в РФ на предприятии «Уралбиофарм» реализован биотехнологический способ получения ликопина путем культивирования гетероталличного гриба ВУсевЫ й^рога 8А(+) и 8А(-) - продуцента бета-каротина. Для накопления в биомассе ликопина в среду культивирования добавляют соединения класса аминометилпиридинов или табачную крошку (Гаврилов А.С., Киселева А.И. и др., 1996; Феофилова Е. П., Терешина В.М. и др., 1995). Выход ликопина при этом составляет 0,49-0,7 г/л среды, продолжительность ферментации составляет 110-115 часов. Однако, до сих пор получение ликопина микробиологическим способом не получило практического применения в крупномасштабном производстве из-за возможного токсического эффекта гетероциклических соединений, используемых в качестве стимуляторов.

Поиск новых высокоэффективных продуцентов ликопина, разработка на их основе технологий получения ликопина, создание и использование в рационе питания пищевых добавок, содержащих данный каротиноид, является актуальной задачей, поскольку позволяет повысить уровень адаптационной защиты организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека и снизить риск развития ряда опасных заболеваний, в том числе и онкологических.

Цели и задачи исследований:

Целью настоящего исследования являлась разработка технологии получения биотехнологического ликопина на основе новой пары штаммов гетероталличного гриба В1акез1еа йпврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+).

Для достижения цели предполагалось решение следующих задач:

• изучение морфологических, биохимических и физиологических свойств пары штаммов гетероталличного гриба В1акез1еа йврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+);

• разработка технологической схемы получения ликопинсодержащей биомассы;

• оптимизация физико-химических параметров культивирования, обеспечивающих максимальное накопление ликопина парой штаммов гриба ВЫсевка йврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+):

- подбор и оптимизация питательной среды;

- подбор оптимального уровня рН среды;

- подбор условий аэрации;

- определение оптимальной продолжительности культивирования;

- определение количества посевного материала;

- определение количества добавляемого (+) штамма гриба;

• поиск эффективного стимулятора ликопинообразования;

• изучение и разработка условий стабилизации ликопина в процессе ферментации и длительного хранения биомассы;

• получение вододисперсионной формы ликопина.

Научная новизна работы:

- впервые разработана технология получения ликопинсодержащей биомассы на основе новой высокоэффективной пары штаммов гетероталличного гриба В1аке$1еа й^зрога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) без добавления в среду каких-либо предшественников ликопинообразования;

- определены оптимальные физико-химические параметры процесса, обеспечивающие максимальное накопление ликопина в процессе (до 1,15 г/л);

- показано, что в качестве антиоксидантов для стабилизации ликопина при хранении биомассы могут быть использованы собственные липиды гриба, добавленные в среду культивирования в виде масляного раствора перед окончанием процесса ферментации;

- разработана технология получения вододисперсионной формы ликопина, стабильной в течении длительного времени (10 суток) с концентрацией ликопина 1 - 2 мг/100 мл.

Практическая ценность

На основании проведенных исследований разработана технология получения ликопинсодержащей биомассы с использованием новой высокоэффективной пары гриба В1акез1еа Цтврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), что делает данную технологию конкурентно-способной на рынке производства данного каротиноида.

В настоящее время данная технология отрабатывается в промышленных условиях предприятия НПО «Витан» г.Верхнеднепровска (Украина).

Апробация работы

Материалы исследований обсуждались на международной конференции молодых ученых «Химия и технология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов» (г. Москва, 2000 г.), международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г. Саранск, 2001 г.), международной конференции «От фундаментальных исследований к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Моска-Тверь, 2001 г.).

Технология награждена бронзовой медалью Ш Международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 4-7 февраля 2003 г.)

Публикации

По материалам экспериментальной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе получены три патента. Работа выполнена в лаборатории биологически активных веществ ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ».

Объем работы:

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, экспериментальной части, выводов, списка

используемой литературы. Работа изложена на_страницах машинописного

текста, включает _ таблиц, рисунков и фотографий. Библиография

включает_источника.

1. Обзор литературы.

В этом разделе представлены основные сведения о структуре и свойствах каротиноидов, их распространении в природе, биологической активности, способах получения, а также современные представления о синтезе, свойствах ликопина и его физиологических функциях в организме человека.

2. Экспериментальная часть. 2.1. Объекты и методы исследований.

Объектом исследований служила пара штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), полученная из коллекции лаборатории биологически активных веществ института ФГУП ГосНИИсинтезбелок. Для культивирования гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) использовали кукурузно-соевую среду, среду с пздролом и кукурузным экстрактом, а также минеральную среду с глюкозой. Выращивание вели при t=27-28°C при 200 об/мин.

Определение содержания АСВ грибной суспензии, а также влажности биомассы определяли весовым методом при доведении мицелия до постоянного веса при 95-100°С.

Содержание ликопина определяли по методике, включающей выделение ликопина из биомассы экстракцией и последующем определении ликопина спектрофотометрическим методом (Терешина В.М., Меморская A.C. и др., 1994). Для проверки точности результатов, периодически проводили определения по методу ВЖХ, сравнивая результаты с данными, полученными спектрофотометрическим методом.

Содержание липидов в биомассе определяли по методу Фолча (Folch J., AscoliJ. etal., 1951).

Для определения оптимального состава питательной среды использовали следующие методы математического планирования : метод раздельной оптимизации при постоянном фоне и метод с использованием аддитивно-решетчатого описания.

Обработку экспериментальных данных проводили с использованием методов математической статистики (Бирюков В.В., 1969).

2.2. Разработка технологии получения ликопинсодержащей биомассы на основе штаммов гетероталличного гриба В(акез1еа Ьторога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+).

Пара штаммов гриба Вккевка Шврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) получена из коллекции лаборатории биологически активных веществ института ФГУП ГосНИИсинтезбелок.

Данная пара гриба была получена в ходе многоступенчатой селекции с применением химических и физических мутагенов. В качестве конечного продукта каротиногенеза образуется ликопин.

В составе пигментного комплекса данной пары гриба при тонкослойной хроматографии в системе растворителей гексан : ацетон (50:1) обнаружены ликопин и незначительное количество р-каротина (рис. 1). Соотношение ликопин: 0-каротин составляет 96 :4.

В ходе исследований было обнаружено, что при многократном пассировании штаммов ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) на агаризованной среде сусло отмечалась морфологическая изменчивость культур.

Штамм ВСБ-129(-) при пересевах на агаризованной среде образовывал мицелий различной степени окраски: от светло-желтой до оранжево-красной. Штамм ВСБ-130(+) был более однородным. В редких случаях отмечалось изменение окраски от желтого до бежевого цвета.

В связи с этим были проведены селекционные работы по отбору пары штаммов, обладающей наибольшей ликопинсинтезирующей активностью и стабильностью морфологических признаков. Эффективность пары штаммов оценивали

Рис. 1. Тонкослойная хроматография липидов гриба Blakeslea trispora.

1- исходное пятно липидов биомассы;

2 — пятно ли ко пина;

3 - пятно ß-каротина.

визуально по интенсивности окраски при совместном выращивании на агаризованноб среде сусло.

Следует отметить, что при совместном выращивании штаммов на агаризованной среде сусло пара штаммов ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) не образует характерную черную полосу зигоспор. При контакте (+) штамма с (-) штаммом вся поверхность (-) штамма приобретает ярко-красный цвет.

Как показали исследования наиболее активной ликопинсинтезирующей активностью обладала пара, в которой штаммы ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) имели следующую характеристику:

- штамм В1акез1еа йшрога ВСБ-129(-) образует на среде сусло-агар плотный, ярко-оранжевого цвета, субстратный мицелий. Воздушный мицелий практически не развит. В "старой" культуре (более 20 суток) образуется слабо развитый, белого цвета, воздушный мицелий. Спороношение практически отсутствует.

- штамм В1акез1еа Мврога ВСБ-130(+) образует субстратный мицелий бежевого цвета и воздушный мицелий палевого цвета. Спороношение штамма активное.

Изучение динамики роста штаммов гриба на кукурузно-соевой среде показало, что штаммы имеют разную скорость роста {рис. 2), в связи с чем, применение традиционных технологических приемов культивирования для получения биомассы, обогащенной ликопином, не представляется возможным.

Рис. 2. Динамика накопления биомассы штаммами ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) гриба В1акез1еа йтсрога на кукурузно-соевой среде.

В связи с этим для получения биомассы, обогащенной ликопином, была предложена двухстадийная технологическая схема (рис. 3), когда:

- на 1 стадии выращивали (-) штамм гриба В1акез1еа ^рога;

- на 2 стадии в выросшую (-) культуру добавляли (+) штамм гриба и далее вели совместное выращивание штаммов.

По данной технологической схеме было проведено выращивание пары штаммов гриба В1акеБ1еа й-^рога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) на жидкой питательной среде. Исследования проводили на лабораторной среде с

глюкозой, которая ранее была разработана для бета-каротиновой пары штаммов гриба В1акез1еа йгёрога.

Рис. 3. Рост биомассы и накопление ликопина грибом ВккЫеа йэрога (штаммы ВСЕ-129 (-) и ВСБ-130(+)) на минеральной среде с глюкозой.

1 -ликопин, мг/г АСВ;

2-АСВ, г/л.

Как видно из рис. 3 при совместном выращивании штаммов гриба В1акеБ1еа Ыврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) в течение 48 часов на минеральной среде с глюкозой в биомассе накапливалось около 20 мг/г АСВ ликопина. Однако, как показали исследования, при выращивании данной пары гриба В1акез1еа итврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) на минеральной среде с глюкозой накопление ликопина в биомассе было нестабильным и колебалось в интервале от 15 мг/г АСВ до 25 мг/г АСВ.

По литературным данным известно, что на стабильность процесса и накопление биологически активных веществ в биомассе микроорганизмов оказывают влияние такие факторы, как:

- физиологическое состояние посевного материала;

- объем инокулята;

- продолжительность культивирования;

- состав питательной среды и т.д.

В связи с этим были проведены исследования по определению условий стабилизации данного процесса.

Как показали исследования на накопление ликопина парой штаммов гриба ВМевка Ьтврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) большое влияние оказывает морфологическое состояние (-) штамма, которое достигается на 1 стадии процесса. Опыты проводили на минеральной среде с глюкозой. Посевной материал выращивали на кукурузно-соевой среде.

В результате исследований было установлено, что более стабильный процесс накопления ликопина отмечался в том случае, когда (-) штамм на минеральной среде с глюкозой рос в виде глобул диаметром <1 я 3 мм, что достигалось при 2-ух кратном пассировании (-) штамма на минеральной среде с глюкозой (табл. 1).

Табл. 1. Влияние морфологического состояния штамма ВСБ-129(-) на накопление ликопина парой штаммов гетероталличного гриба В1акез1еа йтврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+).

Условия Морфшютческое еосгоише лгамма ВСБ-129(-) при выращивания на минеральной среде с глюкозой. Концентрация совместном выращивании штаммов ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), мг/гАСВ Концентрация биомассы, г/л

Пассаж с кукурузно- соевой среды на минеральную среду с глюкозой. Время выращивания -24 часа. Гомогенная рыхлая масса желтого цвета 15,2-22,3 4,7

1 пассаж с минеральной среды на минеральную среду. Время выращивания - 24 часа. Культура представлена в основном мелкими глобулами с ,5 мм. Цвет - желтый. 18,7-21,3 4,6

2 пассажа с минеральной среды на минеральную среду. Время выращивания - 24 часа. Культура достаточно однородна и представлена в основном в виде глобул <1=3 мм. Цвет - желтый. 20,7-21,4 4,6

3 пассажа с минеральной среды на минеральную среду. Время выращивания - 24 часа. Полиморфная культура: крупные глобулы (1=5 мм, средние глобулы (1=3 мм, мелкие глобулы (1=1,5 мм. Цвет - желтый. 16,2-24,4 4,5

В ходе дальнейших исследований было установлено, что максимальное накопление ликопина парой штаммов гриба В1акез1еа йтБрога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) отмечалось при следующих условиях:

- продолжительность 1-ой стадии технологического процесса составляет 24 часа;

- оптимальное количество вносимого штамма ВСБ-130(+) на 2-ой стадии процесса составляет 1-2%;

- продолжительность совместного выращивания на 2-ой стадии технологического процесса - 24 часа.

В исследованиях по оптимизации состава питательной среды использовали метод раздельной оптимизации каждого фактора при постоянном фоне (Бирюков В.В, Кантере В.М., 1985).

Выращивание штаммов ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) гриба В1аке$1еа Мврога при оптимизации осуществляли по вышеописанной схеме (двухстадийное

выращивание). В каждой серии опытов для большей точности проводили по 3 повторности.

По каждому компоненту питательной среды были определены частные оптимумы, обеспечивающие максимальное накопление ликопина. Сочетание частных оптимумов в соответствии с выбранным методом было принято за общий оптимум процесса. На основании полученных данных по оптимизации питательной была подобрана питательная среда, обеспечивающая максимальное накопление ликопина парой гетероталличного гриба В1акез1еа йкрога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), имеющая следующий состав:

Глюкоза-20 г/л;

(N114)2804 - 9 г/л;

КаН2Р04 - 5,8 г/л;

К2НР04- 2,5 г/л;

М^СМ- 0.34 г/л;

Пептон-20 г/л;

Тиаминхлорид - 0.002%;

Вода водопроводная - до 100%;

При выращивании на данной питательной среде пары штаммов гриба ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) по вышеописанной схеме (двухстадийное культивирование) в биомассе накапливалось до 40 мг/гАСВ ликопина (рис. 4).

Рис. 4. Рост биомассы и накопление ликопина грибом Вккевка 1терога (штаммы ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+)) на оптимизированной среде.

Таким образом, в результате проведенных исследований изучены особенности роста пары штаммов гетероталличного гриба ВЫсеэка йврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) - продуцентов ликопина. Разработана принципиальная технологическая схема получения ликопинсодержащей

биомассы, представляющая собой 2-ух стадийный процесс. Определены возраст посевного материала, его морфологическое состояние, количество посевного материала, продолжительность совместного выращивания штаммов, состав питательной среды, позволяющие получать без дополнительного внесения в среду стимуляторов или предшественников ликопина биомассу с содержанием до 40 мг/гАСВ пигмента.

Полученные результаты исследований послужили основой для разработки технологического процесса получения биомассы, обогащенной ликопином, для промышленных условий.

В настоящее время для культивирования гетероташшчного гриба ЕЛакевка Порога - продуцента бета-каротина в промышленных условиях применяют кукурузно-соевую среду (ЗАО «Уралбиофарм») или питательную среду на основе побочных продуктов гидролиза крахмало-паточного производства - гидрола (зеленой патоки) и кукурузного экстракта (НПО «Витан», Украина).

Были проведены исследования по выращиванию штаммов гриба В1акез1еа пирога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) на производственных средах: кукурузно-соевой среде и среде с гидролом (табл. 2). Среды готовили в соответствии с промышленным регламентом. Выращивание вели по вышеописанной двухстадийной схеме культивирования, при 1=27°С, 200 об/мин. Штамм ВСБ-130(+) добавляли к 24 часовой культуре штамма ВСБ-129(-). Совместное выращивание штаммов вели 48 часов.

Таблица 2. Рост и накопление ликопина штаммами гриба В1акез1еа Мярога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) на производственных питательных средах.

Состав пит. среды АСВ, г/л Содержание лнконння в биомассе, мг/г. Выход ликопина, мг/л.

Кукурузно-соевая сред а с добавлением бета-ионона и растительного масла (4%) 18,8 следы следы

Кукурузно-соевая среда без добавления бета-ионона и растительного масла 26,6 8,3 (бета-каротин -5,37) 53,2

Среда с зеленой патокой, кукурузным экстрактом и растительным маслом 8,52 4,5 (бета-каротин -2,1) 38,34

Среда с зеленой патокой, кукурузным экстрактом без растительным маслом 8,35 24,3 202,91

Исследования показали, что на кукурузно-соевой среде с бета-иононом и растительным маслом в биомассе гриба В1акез1еа йврота ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) ликопин не накапливается (Табл. 2). При исключении из среды бета-ионона и растительного масла в биомассе накапливались ликопин и бета-каротин в количестве 8,30 мг/г и 5,37 мг/г соответственно. На среде с гидролом

и кукурузным экстрактом в присутствии растительного масла также накапливались оба каротиноида: 4,5 мг/г ликопина и 2,1 мг/г бета-каротина, в то время как при отсутствии в питательной среде растительного масла, содержание ликопина в биомассе увеличивалось до 24,3 мг/г АСВ. При этом бета-каротин в биомассе не обнаруживался.

Таким образом, для дальнейших исследований была отобрана производственная среда на основе гидрола (зеленая патока - 30 г/л) и кукурузного экстракта (63 г/л) без добавления растительного масла.

В ранее проведенных исследованиях было установлено, что на накопление ликопина пара штаммов гриба В1акез1еа ^врога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) большое влияние оказывает морфологическое состояние штамма ВСБ-129(-), которое достигается на 1-ой стадии технологического процесса. Кроме этого было установлено, что при внесении в среду культивирования штамма ВСБ-130(+) дальнейшего прироста биомассы не отмечалось. Таким образом, для максимального выхода ликопина важным фактором является продолжительность 1-ой стадии технологического процесса.

В связи с этим при переходе на производственную среду культивирования в первую очередь внимание было уделено оптимизации условий выращивания штамма ВСБ-129(-) на 1 стадии процесса. В ходе исследований было определено количество посевного материала штамма ВСБ-129(-) и продолжительность 1 стадии процесса, обеспечивающие максимальное накопление ликопина на 2 стадии процесса при совместном выращивании штаммов ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+). Засевной материал (-) и (+) штаммов готовили на кукурузно-соевой среде. Выращивание штаммов вели при 200 об/мин и 1=27°С.

Как показали

исследования на

производственной среде с гидролом вышеописанного состава максимальное накопление биомассы гриба составило 10 г/л. При этом, в зависимости от количества засевного материала, максимум накопления биомассы отмечался на 1-ые или 2-ые сутки.

С целью сокращения времени выращивания в дальнейших исследованиях в

лабораторных условиях количество засевного материала составляло 10%.

Рис. 5. Динамика накопления биомассы штаммом гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-); 1 - 10% засевного материала; 2-5% засевного материала.

Были проведены исследования по определению продолжительности 1-ой стадии технологического процесса. При этом штамм гриба ШакевЬа ЪпБрога ВСБ-129(-) находился в разных физиологических состояниях:

1. штамм ВСБ-129(-) находился в фазе замедления роста (18 часов культивирования);

2. штамм ВСБ-129(-) находился в начале стационарной фазы роста (24 часа от начала культивирования);

3. штамм ВСБ-129(-) находился в стационарной фазе роста (26 часов от начала культивирования);

4. штамм ВСБ-129(-) находился в конце стационарной фазы роста (36 часов от начала культивирования).

Количество добавленного (+) штамма составляло 2%. Совместное выращивание вели при 1=27°С, 200 об/мин, в течение 48 часов от начала совместного выращивания.

Исследования показали, что максимальное накопление ликопина отмечалось в том случае, когда переход ко 2-ой стадии технологического процесса (введение в процесс штамма ВСБ-130(+)) осуществляли в тот момент, когда штамм ВСБ-129(-) находился в стационарной фаза роста, что соответствовало 26 часам культивирования от момента засева (табл. 3). При этом содержание ликопина в биомассе составляло 24,8 мг/гАСВ (или 238,8 мг/л).

Таблица 3. Накопление биомассы и ликопина культурой В1акез1еа йпврога в зависимости от условий внесения штамма ВСБ-130(+).

Условия внесения (+) штамма АСВ перед внесением (+) цпамма, г/л АСВ через 48 часов совместного выращивания, г/л Содержание ликопина в биомассе через 48 часов совместного выращивания, мг/гАСВ

(•) штамм находится в фазе замедл. роста, 18 часов культивирования 9,39 9,49 17,68

(-) иггамм находится в начале стационарной фазы, 24 часов культивирования 10,7 8,35 25,9

(-) штамм находится в стационарной фазе, 26 часов культивирования 9,9 8,49 28,4

(-) штамм находится в конце стационарной фазы, 36 часов культивирования 9,8 7,65 19,70

Таким образом, на основании проведенных исследований, была подобрана среда для промышленного производства биотехнологического ликопина и определены параметры технологического процесса.

2.3. Изучение условий стимулирования ликопинообразования пара » штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129( ) и ВСБ-130(+).

По литературным данным известно, что любой фактор, провоцирующий * общую стрессовую ситуацию, оказывает стимулирующее влияние на

накопление у микроорганизмов продуктов вторичного метаболизма и в частности пигментов. Это различные пестициды, ингибирующие рост микроорганизмов, гетероциклические соединения, pH среды, свет, кислород, количество субстрата (Феофилова Е.П., 1994; Герасимова Н.М. с соавт., 1968; Gerald К. et al.,1992 и др.).

При изучении условий стимулирования ликопинообразования парой штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) мы в наших исследованиях руководствовались в первую очередь не только простотой и доступностью стимулирующего фактора, а также отсутствием какого-либо возможного токсического влияния на конечный продукт. В связи с этим, различные гетероциклические соединения, пестициды, действие которых описывается в литературе, нами были исключены из исследований.

Была изучена возможность стимулирования ликопинообразования пары штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) путем изменения параметров процесса.

Известен технологический прием стимулирования каротинообразования путем добавления в начало процесса биомассы с конечной стадии (Умнова Э.Д. с соавт., 1992).

Были проведены исследования, в которых в среду культивирования на старте ферментации добавляли гомогенизированную ликопинсодержащую биомассу, полученную из предыдущей ферментации после 48 часов совместного культивирования. Биомассу добавляли в количестве 2,5 и 5%.

Таблица 4. Влияние добавок ликопинсодержащей биомассы, взятой с конечной стадии процесса, на рост и накопление ликопина пара штаммов гриба В1акев1еа йтврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+).

Количество добавленной биомассы, % ЛСВ, т/л Содержание ликопина в биомассе, мг/гАСВ Содержание ликопина в среде, мг/л Увеличение по сравнению с контролем, %

0 (коотроль) 9,5 27,3 259,4 -

V 10,1 37,6 377,6 45,5

5 10,4 36,4 378,6 45,9

Как показали исследования внесение в среду культивирования гомогенизированной биомассы, полученной в предыдущей ферментации, увеличивает выход ликопина на 45% (табл. 4).

Известно, что накопление каротиноидов зависит от степени аэрации среды [РгаЬЬакаг в. и др., 1993] . Были проведены исследования по изучению влияния аэрации на накопление ликопина культурой гриба В1акез1еа йтврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+).

Поскольку процесс культивирования данной пары гриба В1акез1еа йврога является 2-ух стадийным процессом, в котором ликопин накапливается на 2-ой стадии, после завершения роста, представляет интерес изучение вопроса о необходимости изменения условий аэрации в процессе культивирования при переходе от 1-ой ко 2-ой стадии.

Исследования проводили таким образом, что на 1-ой стадии процесса культивирование вели при оптимальных для качалочных колб условиях аэрации (1220 мг/л/час), а на 2-ой стадии процесса при добавлении в среду штамма ВСБ-130 (+) условия аэрации изменяли в диапазоне 340 мг/л/час - 4280 мг/л/час (табл.5).

Как показали исследования, увеличение аэрации на 2-ой стадии технологического процесса повышало накопление ликопина на 24% (табл. 5).

Таблица 5. Влияние условий аэрации на накопление ликопина пара штаммов гриба В1акез1еа йврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+).

Условия аэрации, мг/л/час[фе10] Тип колб Объем шпат, среды, ыл Содержание ликопина в биомассе, мг/гАСВ Увеличение гго сравнению с контролем,%

340 Обычные качал очные канбы 200 ¡а ■80

670 Обычные качалочные колбы 100 23,3 -И

1220 (кшпр.) Обычные качалочные колбы 50 26,2 -

1920 Качалочиые колбы с 4 отбойниками 150 28,6 9

2930 Качалочные колбы с 4 отбойниками 100 32,4 24

4280 Качалочные колбы с 4 отбойниками 50 19,9 -24

Были проведены исследования по изучению влияния рН среды на рост и накопление ликопина штаммами гриба В1акев1еа йврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+). Поскольку оптимальное значение рН для роста гриба В1акез1еа ПТБрога составляет рН=6,3 были поставлены две серии экспериментов. В первой серии экспериментов рН изменяли на старте ферментации, т.е. штамм ВСБ-129(-) сразу выращивали с момента засева при разных значениях рН. При этом было установлено, что после стерилизации рН среды несколько отличается от того значения, которое устанавливали первоначально.

Во второй серии экспериментов культуру (-) штамма ВСБ-129(-) выращивали при оптимальном значении рН=6,3; рН изменяли на второй стадии процесса при добавлении штамма ВСБ-130(+). При этом в каждой серии экспериментов при переходе ко 2-ой стадии культивирования увеличивали уровень аэрации с 1220 мг/л/час до 2930 мг/л/час.

Таблица 6. Зависимость роста и накопления ликопина штаммами гриба Вккевка П-юрога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) от рН среды.

I. рН среды изменяли на старте ферментации

рН АСВ, г/л Содержание ликопина в биомассе, мг/гАСВ Выход ликопина, мг/л

до стерилизации после стерилизации

5,5 5,5 10,1 12,32 124,4

6,3 6,3 9,6 27,2 261,12

7,0 6,65 8,8 33,7 296.6

7,5 6,86 7,07 51,32 362,8

8,0 6,8 5,39 44,35 239,0

II. рН среды изменяли на 2-ой стадии процесса

рН АСВ, г/л Содержание ликопина в биомассе, иг/гАСВ Выход ликопина, мг/л

5,3 9,5 13,1 124,5

6,3 9,7 20,5 200,8

7,0 9,4 22,4 210,6

7,5 9,7 26,7 259,0

8,0 9,8 23,3 228,3

Как показали исследования при рН = 6,8 , установленных на старте ферментации отмечался наибольший выход ликопина (362,8 мг/л), несмотря на снижение концентрации биомассы по сравнению с оптимальными для роста условиями.

Таким образом, в результате проведенных исследований определены основные параметры культивирования, обеспечивающие накопление ликопина в биомассе до 50 мг/гАСВ. Однако выход ликопина в процессе ферментации в данных условиях невелик, вследствие низкого накопления биомассы. В связи с этим дальнейшие исследования были направлены на оптимизацию состава питательной среды, обеспечивающей повышение накопления биомассы.

Сравнительный анализ содержания основных биогенных элементов в питательной среде на основе гидрола и оптимальной минеральной среды с глюкозой показал, что в производственной среде недостаточное содержание азота (общего и аммонийного) и фосфора (табл. 7), а также отмечается избыток магния и калия.

Таким образом, при оптимизации данной среды изучено влияние 4 факторов: гидрола (зеленой патоки), кукурузного экстракта, азота и фосфора. В качестве источников азота и фосфора использовались минеральные соли (N114)2804 и КН2РО4 соответственно.

Таблица 7. Сравнительный анализ содержания основных биогенных компонетов в питательных средах.

Компоненты Производственная среда с гндродом Оптимальная минеральная среда с глюкозой

Азот общ., г/л 2,200 63

Азот аммонийный, мт/л 0,098 3375

Фосфор, г/л 0,986 1,79

Калий, г/л 2,87 1,12

Магний, г/л 0,41 0,068

В исследованиях по оптимизации питательной среды применяли метод с использованием аддитивно-решетчатого описания, в котором каждый из 4 факторов варьируется на 4 различных уровнях, для получения наиболее удобной схемы планирования эксперимента (в виде ортогонального латинского квадрата). В качестве выходного параметра была взята концентрация ликопина (г/л) по окончанию процесса совместного культивирования.

Данный метод оптимизации целесообразно использовать по нескольким причинам. Во-первых - это простота расчетов и наглядность интерпретации. Во-вторых - имеется возможность изучения влияния выбранных факторов на несколько параметров выхода. Таким образом, получив кривые зависимости различных параметров выхода от входных факторов процесса, можно легко выбрать вариант, оптимальный с нескольких точек зрения или компромиссный. В-третьих, данный метод позволяет получить достоверные результаты даже по 1 опыту (без повторностей), т.к. эффект каждого уровня определяется по 4*4=16 данным.

В процессе оптимизации было проведено 4 серии экспериментов, в результате которых была подобрана оптимальная питательная среда, позволяющая накапливать ликопин до 1,1 г/л среды (Табл. 8).

Таблица 8. Сравнительный анализ питательных сред до и после оптимизации.

Питательная среда Концентрация биомассы (АСВ), г/л Содержание ликопина в биомассе, мг/гАСВ Количество ликопина в среде, г/л

Исходная среда на основе гидрола 10 50 0,5

Оптимизированная среда 21 54 1,145

Состав оптимизированной питательной среды:

гидрол (зеленая патока) - 66,5 г/л; кукурузный экстракт - 81 г/л; (N114)2804 -1,281 г/л; К2НР04 - 4,1 г/л;

На основании проведенных исследований разработана принципиальная технологическая схема получения ликопинсодержащей биомассы (рис. 6).

Гидрол, (Ш^О*

Кукурузный Кукурузная мука,

экстракт, Соевая мука,

КН2РО4, Агар-агар.

В.Р.1. Дозировка и приготовление компонентов

ТХ12 3 Стерилизация питательной среды

вода

от

ТП.1

вода

воздух из им.

ВР6. Приготовление

агаризованной среды.

разлив в пробирки

В Р9. Приготовление

питательной среды

для качалочных колб

-►

отТП.2.

ВР.12 Подготовкой стерилизация воздуха

ВР.13 Отвод тепла от растущей культуры

воздух р ВР.14. Под»«

сжатого »оздуха

ВР.15. Подача

теплоносителя

ТП.1 ПРИЕМ И ХРАНЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ СРЕДЫ

1

ТП.2 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ

1 Г

ТП.З ВЫРАЩИВАНИЕ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА —

1

ТП.4 ФЕРМЕНТАЦИЯ

ТП.5 ФИЛЬТРАЦИЯ —

1

ТП.6 СУШКА —

УМО УПАКОВКА, МАРКИРОВКА, ОТГРУЗКА.

0Б01, ОБ02,

0В01. 0Б02. ОБВ1

0Б01, ОБВ1

ОБО), ОБВ1

Рис. 6. Принципиальная технологическая схема процесса получения ликопинсодержащей биомассы.

2.4. Изучение условий стабилизации ликопииа в процессе культивирования и хранения биомассы гриба В1акез1еа Мзрога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+).

Ликопин, также как и бета-каротин, являясь полиненасыщенным соединением с сопряженными двойными связями, легко и быстро окисляется под воздействием света, повышенной влажности, температуры и т.д. При этом ликопин является более нестабильным соединением по сравнению с бета-каротином.

Проведенные исследования показали, что весь ликопин синтезируемый грибом Вккевка Мзрога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) под воздействием стимуляторов разрушается в течение первых суток, что, вероятно, обусловлено недостатком собственных внутриклеточных антиоксидантных систем (табл. 9).

Таблица 9. Содержание ликопина в биомассе гриба В1акез1еа ^врога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) при хранении.__

Длительность хранения, сутки Содержание ликопина в контрольном образце, мг/гАСВ Содержание ликопина в опытном образце, мг/гАСВ

0 26,4 55

1 26,0 26,9

3 24,8 25,1

7 17,1 16,9

Хранение биомассы осуществляли в закрытой таре при 1=4"С.

В настоящее время в практике производства бета-каротина для повышения его стабильности в процессе культивирования в питательную среду добавляют неприродные антиоксиданты, в частности сантохин или ионол. Однако сантохин и ионол могут оказывать токсическое действие на организм человека и их применение в продуктах медицинского и пищевого назначения в РФ строго ограничено.

Поскольку липиды исследуемого гриба содержат довольно большое количество антиоксидантов и фосфолипидов (табл. 10), препятствующих окислению каротиноидов, нами были проведены исследования по изучению возможности использования собственных липидов гриба В1акез1еа й1врога в качестве антиоксиданта для стабилизации ликопина в процессе культивирования и хранения биомассы.

Однако, результаты исследований показали, что внесение в среду раствора липидов в масле ингибировало синтез ликопина в биомассе, что, вероятно, обусловлено внесением в среду растительного масла, т.к. добавление его в количестве даже 0,5% ингибировало образование ликопина в биомассе гриба до 6,1 мг/гАСВ (табл. 11).

Были проведены исследования, в которых для обеспечения стабилизации ликопина в биомассе при хранении на стадии совместного культивирования за 20 минут до окончания добавляли масляный экстракт, полученный из грибной биомассы.

Таблица 10. Содержание липидов в биомассе и фракционный состав липидов

Компоненты Биомасса В1аке$1еа (гироп, штаммы ВСБ-129(-) н ВСБ-130(+) Биомасса В1акез1еа Мврога, Р-каротиновые штаммы [Деев ОВ, 20001

Общее содержание липидов, % 15 60

Фосфолипиды (и гликолипиды), % 28,8 9,0

Моноглнцериды, % 4,0 4,0

Диглицериды, % 4,0 7,9

Стерины 4,7 4,3

Свободные жирные кислоты, % 23,2 19,5

Триглицериды, % 20,4 52,5

Эфиры стеринов, каротииоиды 9,7 3,8

Углеводороды, % 5,2 12,2

Убихиноны, мг/г 5,2 6,2

Таблица 11. Содержание ликопина в биомассе гриба В1акез1еа Ыврога ВСБ

Условия Кол-во вносимого масляного раствора липидов, % Содержание ликопина в биомассе, мг/гАСВ

Липиды из бега-каротиновой биомассы В1акез1еа 1тЬрога (Витатон) 0,1 0,5 4,6 2,4

Липиды из биомассы штаммов ВСБ-129(-) и ВСБ-130С+) 0,1 0,5 8,3 4,8

Растительное масло 0,5 6,1

Масляную экстракцию проводили в 3 ступени, при 1=55°С в течение 45 минут каждую ступень. Далее экстракты, полученные на каждой ступени объединяли и применяли для исследований. Количество добавляемых экстрактов составляло 10%. По окончанию ферментации биомассу высушивали в термостате при 80°С, растирали в сушке до порошкообразного состояния и помещали на хранение в открытых емкостях при £=37°С. Согласно данному способу хранения 1 месяц хранения биомассы в условиях термостата с соответствует 6 месяцам хранения в закрытой таре при температуре окружающей среды.

Результаты исследований представлены в таблице 12.

Таблица 12. Содержание ликопина в биомассе гриба Вккевка Цтврога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) при длительном хранении.

Условия Содержание ликопина в биомассе после сушки, мг/гАСВ Содержание ликопина в биомассе при Х| ранении, мг/гАСВ

7 дней (1,5 мес) 15 дней (Змее) 30 дней (6 мес)

Контроль 39,3 следы следы следы

масляный экстракт биомассы Витатон 42,5 32,4 20,7 следы

масляный экстракт биомассы штаммов ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) 44,8 22,4 следы следы

Как видно по результатам опыта, масляный экстракт биомассы триба, добавленный в конце ферментации перед сливом может рассматриваться как альтернатива использованию таких антиоксидантов как сантохия или ионол.

2.5. Способы получения вододисперсионной формы ликопина.

Ликопин, как было отмечено, имеет немаловажное значение в пищевой, фармакологической и косметической промышленностях. При этом, наряду с жирорастворимой формой, существует большая потребность в водорастворимой форме ликопина.

Проведенные в лаборатории биологически активных веществ института ФГУП ГосНИИсинтезбелок исследования по получению вододисперсионной формы убихинона, основанные на использовании собственных фосфолипидов гриба Blakeslea trispora легли в основу исследований по получению вододисперсионной формы ликопина [Деев дисс. к.т.н., 2002].

Суть метода получения водорастворимого ликопина заключается в том, что при смешивании жирорастворимого ликопина с фосфолипидами в определенном соотношении полученная смесь приобретает вододисперсионную форму. Согласно данному методу, при смешивании с водой фосфолипиды образуют так называемые мицеллы, в которые включаются кристаллы ликопина. Преимущество данного метода заключается в том, что, во-первых, фосфолипиды можно получать совместно с ликопином в одном технологическом процессе, а, во-вторых, фосфолипиды также как и ликопин обладают ценными биологическими свойствами.

Для выделения из биомассы гриба ликопина и фосфолипидов, также использовали разработанную в лаборатории методику, применявшуюся для выделения бета-каротина [Деев C.B., дисс. к.т.н., 2002]. Поскольку в составе липидов исследуемого гриба помимо ликопина обнаружены и другие ценные компоненты, экстракцию проводили в мягких условиях (t=50-55°C), чтобы в дальнейшем, после выделения ликопина, оставшуюся часть биолипидного комплекса можно было использовать для переработки. При этом получали кристаллы ликопина с чистотой до 95 % и коэффициентом извлечения 0,67.

Суммарные фосфолипиды, при смешивании с водой позволяют получить эмульсию, стабильную в течение 48 часов. При этом концентрация фосфолипидов составляет 0,4 - 1,4 мг/г. Однако, продолжительность сохранения стабильности эмульсии слишком мала, и это послужило основанием для дальнейших исследований по получению стабильной эмульсии.

Известно, что наибольшей способностью образовывать мицеллы в воде обладают те липиды, которые имеют объемную или заряженную полярную головку и сравнительно небольшую углеводородную цепь. Поскольку фракция фосфолипидов гриба содержит различные компоненты, представлялось интересным разделение фосфолипидного комплекса на отдельные группы компонентов. В частности были проведены эксперименты по созданию эмульсий на основе фракции фосфолипидов не содержащей лецитин

(фосфотидилхолин), как компонента обладающего наиболее низкой способностью образовывать мицеллы, содержание которого во фракции фосфолипидов значительно и составляет 34,5%.

Выделение лецитиновой фракции из комплекса фосфолипидов осуществляли, используя физико-химические свойства лецитина - лучшую, по сравнению с другими компонентами, растворимость в этиловом спирите.

Как видно из табл. 13. эмульсии, приготовленные на основе фосфолипидов, не содержащих фракцию лецитина, оказались наиболее стабильными в течение длительного промежутка времени (10 суток) от момента их создания.

Табл. 13. Определение концентрации фосфолипидов, не содержащих лецитина, необходимой для создания стабильной эмульсии._

№ п/п Масса воды, г. Масса фосфолипидов, мг Концепт рация, мг/г ВРЕМЯ,ч.

12 24 48 72 96 120 240 360

1 500 50 0,1 +

2 500 100 0,2 + + + - - - - -

3 500 200 0,4 + + + + - - - -

4 500 300 0,6 + + + + + + + -

5 500 400 0,8 + + + + + + + -

6 500 500 1,0 + + + + + + - -

7 500 600 и + + + + - - -

8 500 700 1.4 + + + - - - - -

9 500 800 1.6 + +

10 500 1000 2,0 + - -

+ - означает отсутствие осадка фосфолипидов - - означает наличие осадка фосфолипидов

Для получения гомогената фосфолипидов и ликопина использовали 4 метода:

1. Прямая гомогенизация фосфолипида и ликопина;

2. Гомогенизация компонентов с использованием летучего органического растворителя;

3. Гомогенат может быть получен непосредственно при реализации технологии выделения ликопина и фосфолипидов из биомассы гриба В1. йчБрога. В этом случае процесс ведут таким образом, что происходит одновременное высаживание необходимых компонентов из раствора органического растворителя;

4. В качестве гомогената фосфолипидов и активного компонента выступает спиртовой раствор, так же, как и в предыдущем случае, получаемый непосредственно при выделении.

Сравнивая полученные во всех экспериментах результаты (см. табл. 14) можно сделать выводы о том, что наиболее стабильные эмульсии можно получить, если использовать способы приготовления гомогената фосфолипидов и каротиноида, основанные на использовании органических растворителей. В нашем случае это 2-ой и 4-ый методы. Концентрации

ликопина в этих случаях составляют 2 мг/100мл и 1 мг/100мл соответственно, при максимальном времени стабильности эмульсии - 240 часов.

Табл. 14. Сравнительные данные, полученные при использовании различных способов приготовления эмульсий.

№ п/п Способ Концентрация аигиоксиданга в р-ре, мг/100мл Стабильность эмульсии (максимальная), ч.

1 Прямая гомогенизация компонентов 0,2 96

2 Гомогенизация с использованием орг. растворителя 2,0 240

3 Одновременное высаживание из экстракта 1.6 30

4 Эмульсия на основе спиртового экстракта б.м.гриба 1,0 240

Таким образом, разработанная на основе новой пары штаммов гриба В1акея1еа йтсрога технология позволяет вести направленный синтез только ликопина, без образования р-каротина. При этом, в отличие от существующих на сегодняшний день технологий, процесс синтеза ликопина осуществляют без добавление в среду химических предшественников синтеза, что делает возможным применение ликопина в пищевой промышленности и медицине. Кроме того, для предотвращения окисления ликопина в качестве стабилизатора используют липиды, получаемые из этой же биомассы гриба, что также исключает использование химических стабилизаторов. Все это в совокупности значительно повышает экономическую эффективность технологического процесса и позволяет получать экологически чистый ликопин в достаточном количестве.

Выводы

1. Изучены культурально-морфологнческне и физиологические особенности новой пара штаммов гриба В1акев1еа 1гарога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) - продуцента ликопина, обеспечивающие стабильность процесса ликопинообразования.

Показано, что наибольшее накопление ликопина наблюдается, когда штаммы на твердых питательных средах имеют следующие отличительные характеристики:

- штамм ВЫсевка Ьтярога ВСБ-129(-) образует плотный, ярко-оранжевого цвета, субстратный мицелий. Воздушный мицелий практически не образуется;

- штамм В1аке51еа ЙБрога ВСБ-130(+) образует субстратный мицелий бежевого цвета и воздушный мицелий палевого цвета. Спороношение штамма активное.

При этом, ликопинсинтезирующая активность наблюдается после 7-9 дней роста.

2. Разработана 2-ух стадийная технологическая схема культивирования пара штаммов гриба В1акез1еа йгёрога ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), которая предусматривает:

- на 1 стадии выращивание штамма ВСБ-129(-); -продолжительность 1 стадии процесса составляет 26 часов, что

соответствует началу стационарной фазы роста;

- на 2 стадии - добавление к выросшему штамму ВСБ-129(-) штамма ВСБ-130(+) и дальнейшее совместное выращивание штаммов гриба;

-продолжительность 2-ой стадии технологического процесса (время совместного выращивания штаммов) составляет 48 часов;

-количество вносимого штамма ВСБ-130(+) на 2 стадии технологического процесса составляет 1-2%.

3. Оптимизирован состав питательной среды и определены основные параметры технологического процесса, обеспечивающие накопление ликопина 1,15 мг/л.

Максимальное накопление ликопина достигается на питательной среде следующего состава:

пидрол (зеленая патока) - 66,5 г/л;

кукурузный экстракт - 81 г/л;

(ИНчЬвОд -1,281 г/л;

К2НРО4- 4,1 г/л;

при рН=6,8 , установленном на старте ферментации и увеличении аэрации при переходе на 2-ую стадию технологического процесса.

4. Показано, что в качестве антиоксидантов для стабилизации ликопина при хранении биомассы могут быть использованы собственные липиды гриба,

добавленные в среду культивирования в виде масляного раствора перед окончанием процесса ферментации.

5. Определены условия получения вододисперсионной формы ликопина, основанной на использовании собственных фосфолипидов гриба, стабильной в течении длительного времени (10 суток) с концентрацией ликопина 1-2 мг/100мл.

Опубликованные работы по теме диссертации:

1. Авчнев М.И., Буторова И. А., Авчиева П.Б. Изучение особенностей роста и накопления ликопина парой гетероталличного гриба В1акез1еа ^врога ВСБ-130(+)и ВСБ-129(-). //Биотехнология. -2003. -т.З. - с. 12-20.

2. Авчиев М.И. Пара штаммов гетероталличного гриба В1акез1еа ^врога ВСБ-129 (-) и ВСБ-130 (+), продуцирующая ликопин, и способ

получения ликопина. // В кн. Тезисы докладов международной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» - Саранск. - 2001. - с.6.

3. Авчиев М.И. Получение ликопина из биомассы гриба В1акеБ1еа ^рога. // В кн. Тезисы докладов международной конференции «От фундаментальных исследований к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» - Москва - Тверь. - 2001. - с. 58.

4. Евразийский патент № 003388.

5. Евразийский патент № 003212.

6. Евразийский патент № 002468.

Принято к исполнению 26/09/2003 Заказ № 367

Исполнено 26/09/2003 Тираж: 100 экз.

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

2oo?-fi

И684 4

Введение

1. Обзор литературы

2. Экспериментальная часть

2.1. Материалы и методы исследований.

2.2. Разработка технологии получения ликопинсодержащей биомассы на основе штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ

129(-) и ВСБ-130(+)

2.3. Изучение условий стимулирования ликопинообразования парой штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+)

2.4. Изучение условий стабилизации ликопина в процессе культивирования и хранения биомассы гриба Blakeslea trispora ВСБ

129(-) и ВСБ-130(+)

2.5. Способы получения вододисперсионной формы ликопина

2.6. Статистическая обработка результатов

Современный уровень развития техники достиг таких масштабов, что практически любая форма хозяйственной деятельности, в большей или меньшей степени, оказывает негативное влияние на биосферу. Организм человека при этом подвергается все возрастающему действию разнообразных физических, химических и биологических факторов (УФ воздействие, озон, повышенный радиационный фон, смог, табачный дым, употребление недоброкачественной воды, различных пестицидов, содержащихся в пище, попадание в организм тяжелых металлов и т.д.), приводящих к ослаблению сопротивляемости организма, нарушению обмена веществ, возникновению широкого круга заболеваний.

В связи с этим огромное значение приобретают природные биологически активные соединения, такие как витамины, антиоксиданты, добавление которых в пищу человека в небольшом количестве приводит к снижению риска развития многих заболеваний и укрепляет иммунную систему человека. В качестве одного из наиболее активных и универсальных средств такого назначения в последние годы рассматривают ликопин.

Ликопин - относится к природным соединениям группы каротиноидов. Это пигмент, который придает здоровую красную окраску фруктам и овощам, таким как помидоры, арбузы, розовые грейпфруты, облепиха и др. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что ликопин наряду с красящей функцией имеет самостоятельное значение как биологически активная добавка. Ликопин оказывает общеукрепляющее действие на организм и обладает большим набором ценных фармакологических свойств. Подавляя в организме свободнорадикальное окисление, ликопин стабилизирует имунный статус организма, улучшает протекание ряда важнейших биологических процессов в организме, в том числе нормализует уровень глюкозы в крови, липидный обмен, зрение и контролирует пролиферацию (новообразование) клеток. Была установлена высокая эффективность использования ликопина при лечении заболеваний предстательной железы, легких, желудка, катаракты, ишемической болезни сердца, атеросклероза [165]. Биологическая активность ликопина связана прежде всего с его антиоксидантными свойствами, т.е. способностью ингибировать свободнорадикальные процессы в клетках.

В условиях растущей потребности в ликопине важным становится вопрос изыскания его новых источников.

До сих пор основным источником получения ликопина являются растения, в частности специально отселекцированные сорта томатов Lycopersicon sp. [165]. Однако очень низкий выход (0.3-0,4 мг/г сырья), сезонность, действие неблагоприятных погодных факторов и фитопатогенов делают этот способ экономически неэффективным. Один килограмм такого ликопина стоит около 5000 $ США. Высокая цена и дефицит ликопина на рынке являются основными причинами отсутствия необходимого человеческому организму антиоксиданта в ежедневном рационе питания.

Решение указанных проблем возможно путем создания биотехнологического способа получения ликопина. В этом случае производству не грозит сезонность и потеря урожая от действия неблагоприятных факторов. Кроме того, биотехнологический способ позволяет получить ликопин природного качества.

В настоящее время в РФ на предприятии «Уралбиофарм» реализован биотехнологический способ получения ликопина путем культивирования гетероталличного гриба Blakeslea trispora - продуцента бета-каротина. Для ингибирования циклаз и получения ликопина в среду культивирования добавляют соединения класса аминометилпиридинов или табачную крошку [22, 83]. Выход ликопина при этом составляет 0,49-0,7 г/л среды, продолжительность ферментации составляет 110-115 часов. Однако, до сих пор получение ликопина микробиологическим способом не получило практического применения в крупномасштабном производстве из-за возможного токсического эффекта гетероциклических соединений, используемых в качестве стимуляторов.

Поиск новых высокоэффективных продуцентов ликопина, разработка на их основе технологий получения ликопина, создание и использование в рационе питания пищевых добавок, содержащих данный каротиноид, является актуальной задачей, поскольку позволяет повысить уровень адаптационной защиты организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека и снизить риск развития ряда опасных заболеваний, в том числе и онкологических.

В связи с этим целью настоящих исследований явилась разработка биотехнологического способа получения ликопина с использованием новой пары гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+).

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи работы:

• изучение морфологических, биохимических и физиологических свойств пары штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+);

• разработка технологической схемы получения ликопинсодержащей биомассы;

• оптимизация физико-химических параметров культивирования, обеспечивающих максимальное накопление ликопина парой штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+):

- подбор и оптимизация питатльной среды

- подбор оптимального уровня рН среды

- подбор условий аэрации

- определение оптимальной продолжительности кульивирования

- определение количества посевного материала

- определение количества добавляемого (+) штамма гриба

• поиск эффективного стимулятора ликопинообразования;

• изучение и разработка условий стабилизации ликопина в процессе ферментации и длительного хранения биомассы;

• получение вододисперсионной формы ликопина.

Научная новизна работы заключается в следующем:

- разработана технологическая схема получения ликопинсодержащей биомассы на основе новой высокоэффективной пары гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) без добавления в среду каких-либо предшественников ликопинообразования;

- определены оптимальные физико-химические параметры процесса, обеспечивающие максимальное накопление ликопина в процессе (1,15 г/л); определены условия стабилизации ликопина в процессе культивирования и хранения биомассы;

- разработана технология получения вододисперсионной формы ликопина, стабильной в течении длительного времени (10 суток) с концентрацией ликопина 1-2 мг/100 мл.

Практическая ценность работы.

На основании проведенных исследований разработана технология получения ликопинсодержащей биомассы с использованием новой высокоэффективной пары штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), что делает данную технологию конкурентно-способной на рынке производства данного каротиноида.

В настоящее время данная технология внедряется в промышленных условиях предприятия НПО «Витан» г.Верхнеднепровска.

Апробация работы.

Материалы исследований обсуждались на международной конференции молодых ученых «Химия и технология пищевых веществ.

Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов» (г. Москва, 2000 г.), международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г. Саранск, 2001 г.), международной конференции «От фундаментальных исследований к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Моска-Тверь, 2001 г.).

Технология награждена бронзовой медалью III Международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 4-7 февраля 2003 г.).

Публикации.

По материалам экспериментальной работы опубликовано 6 печатных работ и получены три патента. Работа выполнена в лаборатории биологически активных веществ ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ».

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Каротиноиды. Общие сведения.

Желтые, растворимые в спирте пигменты осенних листьев Берцелиус в 1837 году предложил назвать ксантофиллами. Фреми и Стоке первые показали, что эти пигменты содержатся также в зеленых листьях, хотя такого рода предположение было высказано значительно раньше в работах, относящихся к 1827г. Впоследствии Цвет в своем классическом учении по хромотографическому разделению ксантофиллов листа показал, что последние являются сложной смесью полихромов. Результатом этого явилось разделение упомянутых пигментов на 2 класса: одни из них, хорошо растворимые в углеводородах, были названы каротинами, тогда как за другими, гораздо менее растворимыми в этих растворителях, но зато хорошо растворимых в этиловом спирте, сохранилось название ксантофиллы. Эти два класса составили одну группу под общим названием каротиноиды [165].

Название каротиноиды было дано этой группе соединений в 1911 году русским ученым Цветом от латинского наименования моркови - Daucus carota, основную часть пигментов которой составляет {3-каротин.

За последние 40 лет достигнуты значительные успехи в химии каротиноидов. Количество каротиноидов, структура которых точно установлена, увеличилось к настоящему времени до 550, причем основные успехи в установлении химического строения каротиноидов следует отнести на период с 1965 по 1975 г. [131]. Именно в это время получены принципиально новые данные о каротиноидах, углеродный скелет которых содержит 45 и 50 атомов углерода вместо традиционно известных 40. Открыты гликозидные каротиноиды, содержащие сахарный остаток.

Было установлено также, что молекула каротиноидов может включать жирные кислоты наряду с сахарными остатками: это, например, миксобактин и миксобактон, являющиеся моноэфирамн различных жирных кислот. Позже подобные каротиноиды, в частности моноэфир капсантина, содержащий ненасыщенную линолевую кислоту, был обнаружен в плодах паприки (Capsicum annum L. var. Sz-20). Эфиры каротиноидов могут содержать и насыщенные жирные кислоты, такие как С12,С14иС16 [90].

По своим физико-химическим свойствам эти водонерастворимые пигменты относят к липидам: либо к производным изопрена [198], либо к группе так называемых нейтральных липидов.

Отличие каротиноидов от других пигментных соединений - наличие хромофора с большим числом единичных и двойных связей между атомами углерода. Обычное число двойных связей от 7 до 17. От числа сопряженных двойных связей зависит наличие окраски и ее интенсивности. Каротиноиды, содержащие до 5 двойных связей (фитоин, фитофлюин) - не окрашены, нейроспорин (7 двойных связей) имеет желтый цвет, p-каротин, ликопин (11 двойных связей), торулин и торулородин (более 11 двойных связей), имеют интенсивный красный цвет или фиолетовый.

Эта многочисленная группа пигментов очень широко распространена в природе: они есть у водорослей, бактерий, грибов, высших растений, животных и человека.

Среди бактерий, синтезирующих каротиноиды, выделяются две группы, отличающиеся физиологией роста, масштабом синтеза и функцией каротиноидов - это фотосинтезирующие и нефотосинтезирующие бактерии [40].

Фотосинтезирующие бактерии образуют широкий круг каротиноидов. У этой группы обнаружено около 60 различных каротиноидов. Однако количество каротиноидов в клетках по сравнению с другими пигментами так мало, что их называют дополнительными или вспомогательными пигментами [43, 159]. Специфическими для фото синтезирующих бактерий Athiorhodaceae и Thiorhodaceae являются метилоксилированные каротиноиды. Присутствие Р-каротина в небольших количествах установлено у Rhodomicrobium vannielii. В следовых количествах гамма-каротин синтезируют коричневые виды рода Chlorobium. Различные виды пурпурных бактерий содержат красные и желтые каротиноиды, главным образом ликопин, спириллоксантин, родопин, ликопинол и родопинол. Зеленые бактерии образуют преимущественно хлоробактин - 55-93% [43, 96]. Главным компонентом у трех видов Ectothiorhodospira является спириллоксантин [186].

Нефотосинтезирующие бактерии как продуценты каротиноидов менее изучены. Они образуют преимущественно С45 и С50 каротиноиды. По сравнению с грибами у них меньше распостранен Р-каротин и другие каротиноиды. Встречаются культуры, синтезирующие значительное количество ксантофиллов [159].

Характерным для бактерий является одновременный синтез большого набора пигментов каротиноидной и некаротиноидной природы. Так штамм Corynebacterium fascians 2у в 1 г сухой биомассы содержит 0,5-0,6 мг каротиноидов 13 наименований. У Micobacterium kansasii идентифицированы Р-каротин, фитоин, фитофлюин, ликопин и альфа-каротин. У штамма Mycobacterium rubrum обнаружены такие каротиноиды, как альфа-каротин, Р-каротин, гамма-каротин, ауроксантин, лютеин, криптоксантин, виолоксантин, зеаксантин, антераксантин, ликопин, рубиксантин, лепротеин, неоксантин [40].

Спектр синтезируемых актиномицетами пигментов весьма разнообразен. Способность синтезировать каротиноиды установлена у видов Streptomyces chestomyceticus var. aurantioides, Str. mediolani, Actinomyces galbus Frommer, Act. subflavus, Act. kanamycetiens, Act. fluorescens и т.д [23]. В настоящее время у актиномицетов идентифизированы: р- и гамма-каротины, ликопин, тетрагидроликопин и проликопин.

Каротиноиды содержатся и во многих мицелиальных грибах. Большинство грибов синтезируют каротиноиды в малых, трудно обнаруживаемых количествах, однако есть виды, обладающие сверхсинтезом и используемые в промышленности. Представители различных таксономических групп грибов отличаются по составу и соотношению синтезируемых ими отдельных каротиноидов. Наиболее распостраненым и почти единственным каротином у различных видов Phycomyces blakesleeanus является p-каротин. До 75% б-каротина синтезируют грибы Penicillium; гамма-каротин - главный пигмент грибов, относящихся к родам Chytridrales и Blastocladiales. Каротиноиды с альфа-иононовым кольцом у грибов отсутствуют [130].

Наиболее изучеными являются виды Neurospora crassa, Phycomyces blakesleeanus и Blakeslea trispora. Уровень синтезируемых каротиноидов у мицелиальных грибов зависит от состава среды, условий, способа и времени культивирования.

В синезеленых водорослях обнаружены три основных каротиноидных пигмента - Р-каротин, эхиненон и миксоксантофилл [40]. У ряда видов Cyanophyta содержатся также в значительных количествах афаницин, зеаксантин и осциллоксантин. Наиболее активными продуцентами каротиноидов среди водорослей являются представители рода Danaliella, особенно D. salina Teod. В условиях, благоприятных для размножения виды Danaliella образуют преимущественно зеленые пигменты, по составу пигментов они близки к зеленым водорослям. Основными пигментами в ростовой фазе являются хлорофиллы а и в, а из каротиноидов - лютеин, антераксантин, виолаксантин и Р-каротин [48].

Желтая и красная окраска рыб обусловлена ксантофилами -астаксантином, лютеинм и тараксантином, большинство из которых присутствуют в этерифицированном состоянии. Особый интерес представляет также специфический для рыб каротиноид тунаксантии, представляющий собой е,Е-каротин-3,3'-диол [110], а также хириквиксактин, являющийся С-6, С-б'-эпимером тунаксантина. Указанные выше ксантофиллы рыб образуются в их организме из р-каротина [132].

В организме птиц накапливаются в основном ксантофиллы, а каротин присутствует только в ретине [100].

Каротиноиды есть и у млекопитающих, в том числе и у человека. Но у последних они не синтезируются в организме, а доставляются с пищей и источником их получения служат высшие растения, водоросли и грибы. При этом большая часть полученных с пищей каротиноидов накапливается в клетках печени, меньшее количество поступает в почки и надпочечники, селезенку, легкие, желудок и кишечник [163, 183, 187]. Основными каротиноидами сыворотки крови людей являются ликопин, бета-каротин и лютеин (0,62, 0,46 и 0,28 мкмоль/л для мужчин и 0,76, 0,58 и 0,27 мкмоль/л у женщин, соответственно) [86],

Отмеченная «вездесущность» каротиноидов обуславливает интерес исследователей к выяснению их биологических функций.

У фотосинтетиков каротиноиды выполняют функции вторичных светособирающих пигментов, оказывают фотопротекторный эффект, регулируют процессы фототропизма и фототаксиса [131]. У нефототрофных организмов основная роль каротиноидов принципиально иная.

Известно также, что фотоконтроль биосинтеза этих пигментов широко распространен и свойствен не только высшим растениям, но и низшим эукариотам, особенно грибам.

Предполагают, что, если у растений в регуляции каротиногенеза участвует фитохром, то у большинства грибов фотоконтроль биосинтеза этих пигментов регулируется либо дорфиринами, либо пигментами флавиновой или каротиноидной природы, способными абсорбировать синий свет [137, 78].

Наиболее подробно процессы фотоиндукции и фоторегуляции изучены для Neitrospora crassa, Verticillium agaricinum и Fusarium aquaeductuum. Особый интерес представляет последний гриб, так как синтез каротиноидов у него является полностью светозависимым [181]. Аналогичным образом у Aspergillus giganteus mut. alba, растущего в темноте, каротиноиды не образуется, но освещение синим светом индуцирует процесс каротиногенеза, причем под фотоконтролем полностью находятся такие ферменты, как фитоинсинтетаза, фитоиндегидрогеназа и ликопинциклаза [111]. У Phycomyces blakesleeanus синий свет также стимулирует образование каротиноидов, хотя синтез этих пигментов протекает и в темновых условиях

89].

И хотя роль каротиноидов в процессах фоторецепции строго экспериментально не доказана [182], считается, что каротиноиды действуют в данном случае, как пигменты антенн фотосинтетиков при фоторецепции, так как передача энергии от каротиноидов к другим пигментам является установленным фактом [109].

Однако свет может оказывать на организмы и достаточно сильное повреждающее действие. Каротиноиды обладают способностью "тушить" первые, образованные под действием света, продукты, обладающие повреждающим действием, т.е. воздействовать на синглетный кислород (^Ог), абсорбировать энергию сенсибилизатора, образуя каротииоид в триплетном состоянии, который рассеивает свою энергию в виде безвредного теплового эффекта. Особый интерес представляют данные о том, что Р-каротин может прямо реагировать с перекисными радикалами, участвуя, таким образом, в процессе окисления липидов. Такая возможность была показана еще в 1932 г., когда установили способность Р-каротина ингибировать процесс окисления линолевой кислоты [167]. Механизм действия этого пигмента заключается в его способности функционировать как антиоксидант, выводящий перекисные радикалы из сферы цепных свободно радикальных реакций [101]. Это свойство каротина зависит от наличии в его молекуле системы конъюгированных двойных связей. Подобное действие могут оказывать и другие каротиноиды и даже ретиноиды.

У грибов каротиноиды выполняют еще одну очень важную функцию -участвуют в репродукции, хотя в этот процесс они вовлекаются не прямо, а связаны с образованием так называемых триспоровых кислот, действующих как гармоны. Установлено, также, что каротиноиды служат предшественниками биологически активного соединения, общего для грибов и растений. Это спорополленин (С90Н130О39), являющийся биополимером поперечносшитых остатков каротиноидов, полученного путем их окислительной полимеризации [191]. Обычно процесс накопления каротиноидов у грибов предшествует образованию спорополленина в клеточной стенке репродуктивных клеток: зигофор или аскоспор [182]. Интересно отметить, что в последние годы спорополленин обнаружили также у миксобактерий и у фикобионтов, входящих в состав лишайников [182].

Согласно современным представлениям, биосинтез каротиноидов слагается из следующих этапов (см. рис. 1.1.1):

1. Образование первичного С5-предшественника.

Стартовым соединением в биосинтезе ликопина является ацетат. Две молекулы ацетил-КоА конденсируются с образованием ацетоацетил-КоА, который в свою очередь конденсируется еще с одной молекулой ацетил-КоА, образуя (3-гидрокси-(3-метилглутарил-КоА. При восстановлении этого соединения образуется мевалоновая кислота (МВК), последняя в присутствии АТФ фосфорилируется с образованием пирофосфата МВК. В присутствии АТФ путем декарбоксилирования и дегидрирования пирофосфат МВК превращается в 5-углеродную изопреновую единицу -изопентилпирофосфат.

2. Биосинтез бесцветных С40-соединений из С5- предшественников. Изопентинилпирофосфат (ИПФ) изомеризуется до стадии диметилалипирофосфата (ДМАПФ). Затем происходит конденсация ИПФ фарнезил пирофосфат, из которого путем последующей конденсации возникает 20-углеродная единица - геранилгеранилпирофосфат. Последний димеризуется, образуя фитоин (7,8,11,12,7',8',1Г,12',-октагидро- ¥ - Ч* -каротин) - первый С40-предшественник каротиноидов.

3. Образование каротиноидов путем дегидрирования фитоина, который превращается в фитофлюин. При дальнейшем дегидрировании фитофлюина образуются уже окрашенные каротиноиды - нейроспорин и ликопин.

4. Этап циклизации.

5. Нейроспорин и ликопин подвергаются последовательной циклизации с образованием полиенов, содержащих а- или р-иононовые кольца.

6. Образование каротиноидов с числом углеродных атомов цепи больше С40 и ксантофиллов [40].

1.2. Биологическая активность каротиноидов.

К настоящему моменту известен широкий круг патологических состояний, которые сопровождаются активацией процесса свободнорадикального ПОЛ (перекисное окисление липидов). Очевидно, что в этих условиях антиоксидантная активность каротиноидов, выявленная in vitro, может трансформироваться в определенный вид биологической активности. Известно, что каротиноиды обладают радиопротекторным действием [47, 65, 150], предотвращают развитие катаракты [87, 204, 196], снижают риск сердечно-сосудистых заболеваний [155, 139], являются иммуномодуляторами [14, 203] и т.д. В последнее время интенсифицировались исследования превентивного действия каротиноидов в процессе канцерогенеза [64, 63,174, 185, 177, 151].

Всемирная Организация Здравоохранения ежегодно констатирует возрастание воспалительных заболеваний печени, вызываемых ксенобиотиками. Спектр подобных веществ весьма широк, однако среди них наиболее выраженный гепатотоксический эффект вызывают хлорорганические соединения. Кроме того, они наиболее употребляемы в промышленности и в быту в качестве органических растворителей и в составе препаратов для чистки различных изделий, а также в производстве хладагентов и экстрагирующих материалов - фреонов. Токсический эффект хлорированных этиленов, как считают, обусловлен их способностью под действием микросомальных оксидаз со смешанной функцией образовывать токсические продукты окисления - эпоксиды, оксираны, которые ацетат (Cz)

• изопентиннлпирофосфат (С5)

СИ, СН, геранилпирофосфат (С5) 1 геранилгеранилпирофосфат (С5) фарнезнлпирофосфат (С$) i си. сн» и, сн, фитоин (С40) I сн, сн, фитофлюин i нейроспорин н,с сн, сн, сн, а-зеакаротин i см, СИ, ликопин

3-зеакаротин i н,с. сн, сн» си» н, Сн, родопсин у-каротин i сн, сн, см, СИ,

СИ, Cht, а-каротин спириллоксантин

Р-каротин детоксицируются в результате внутримолекулярных перегруппировок; токсичность хлороформа связывают с его биоактивацией до фосгена [37].

Однако, среди всего набора хлорорганических соединений наиболее токсичным является четыреххлористый углерод (CCI4). Введение даже очень низких доз этого яда порядка 1 мкл на 100 г веса вызывает появление значительных морфологических изменений в клетках печени (некроза и жировой дистрофии), а биохимически выражается в снижении функциональной способности эндоплазматического ретикулума и белок-синтезирующих систем и в накоплении триглицеридов [20].

Учитывая прооксидантный характер действия CCI4, естественным образом встает вопрос о коррекции токсикоза с помощью антиоксидантов. Известно, что применение альфа-токоферола в виде токоферилацетата в дозах от 20 до 50 мг на 100 г веса животных за сутки или несколько часов до введения яда резко уменьшает его токсическое действие. Гистологически не обнаруживается значительных некротизированных полей в печени [20]. In vitro хорошие результаты по торможению липидной пероксидации микросомальной фракции печени крыс при индукции ПОЛ ССЦ дают синтетические производные фенола; бутилированные гидрокситолуол, анизол, а также катехолы и пирогаллолы [147]. Однако применение их in vivo дает побочные токсические эффекты. Поэтому интенсивные исследования ведутся в направлении поиска превентивных средств при отравлениях CCI4 (как частного случая процессов, сопровождающихся развитием ПОЛ ) на основе природных компонентов.

Антиоксидантные свойства, выявленные у каротиноидов, дают основания предполагать их определенное влияние на ферментную систему печени, метаболизируюшую ксенобиотики. Так, в работе [91] приводятся данные о восстановлении нормального уровня сукцинатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатазы и цитохрома Р-450 у мышей при кормлении их экстрактом моркови перед отравлением CCI4. Авторы другой публикации [107] отмечают резкое падение содержания витамина А в печени крыс при отравлении CCU- Назначение Р-каротина на фоне отравления приводило к менее выраженному росту содержания гидроксилролина на биохимическом уровне, а с точки зрения гистопатологии - к снижению интенсивности процессов фиброгенеза печени крыс [189]. Наряду с этим в отдельной выборке животных повышенный фиброз печени коррелировал с более низким содержанием витамина А [154].

Каротиноиды альфа-каротин, Р-каротин, ликопин и тотеин при инкубации с гепатоцитами крыс in vitro защищали их от ряда дисфункций, вызванных добавлением в среду CCU, а именно: тормозили индуцированное CCU высвобождение в среду глутамат-пируват-трансаминазы и лактатдсгидрогенаэы, снижали уровень ТБК-активных продуктов и повышали выживаемость гелатоцитов [153].

Помимо восстановления активности некоторых ферментов и нормализации типологической картины при отравлении хлорорганикой 4-оксокаротиноиды кантаксантин и астаксантин в обычной ситуации без моделирования отравления какими-либо ксенобиотиками являлись индукторами цитохрома бета-450 подобно полициклическим ароматическим углеводородам, р-нафтофлавону или диоксину при добавлении каротиноидов в диету в дозе 300 мг/кг диеты [133]. Этот факт за неимением более обширного экспериментального материала авторы не теоризируют.

Таким образом, суммируя все вышесказанное, можно предположить, что препараты на основе каротиноидов могут обладать гепатопротекторной активностью по ряду параметров.

Атеросклероз - одна из актуальных проблем современной медицины, поскольку является патогенетической основой таких болезней, как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, сосудистых заболеваний головного мозга и т.д., являющихся основной причиной смертности среди населения. Последние годы ознаменовались значительным прогрессом в исследовании механизмов возникновения атеросклеротического состояния, что нашло отражение в выработке определенных медицинских показаний по профилактике атеросклероза и в выпуске значительных количеств новых превентивных средств на фармацевтический рынок.

К настоящему моменту накоплено значительное количество данных, указывающих корреляцию между степенью развития атеросклеротических изменений и уровнем перекисного окисления липидов (ПОЛ), в первую очередь в липопротеидах (ЛП) крови, а также и в стенках сосудов как животных, так и людей [21, 46]. Активация перекисного окисления при развитии атеросклеротических изменений наблюдалась также в других тканях [21, 47].

Помимо накопления малонового диальдегида (МДА), косвенным доказательством нестационарного характера протекания процессов ПОЛ при развитии атеросклероза может служить изменение антиоксидантного статуса организма. Так, в ряде работ отмечается снижение уровня витаминов С, Е, А и p-каротина у больных, перенесших инфаркт миокарда [194] и страдающих коронарным атеросклерозом [158]. Кроме того, уменьшается активность ферментов, защищающих от активации и развития процесса ПОЛ, а также от повреждающего действия продуктов ПОЛ в крови и стенке сосудов: глутатионлероксидаэы, катализы, глутатионредуктазы [21].

Представляется очевидным, что употребление животными или людьми жирорастворимых антиоксидантов при условии, что они хорошо встраиваются в мембраны форменных элементов крови, клеток сосудистой стенки, а также в ЛП, должно тормозить развитие ПОЛ в этих структурных единицах и, опосредованно, развитие атеросклеротических изменений.

Ведутся интенсивные исследования по обоснованию применения антиоксидантных витаминов (витаминов А, Е, С) и бета-каротина в качестве профилактических а, возможно, и терапевтических гиполипидемических агентов [202, 207,140,158, 124].

Следует отметить, что эффективность действия исследуемых антиоксидантов по защите ЛП от окисления во многом зависит от их способности встраиваться в ЛП и, соответственно, находиться в непосредственной близости к месту индукции радикалов в липидной фазе. В данном случае жирорастворимые антиоксиданты более эффективны, чем водорастворимые. Так. в последние годы довольно много исследований посвящено изучению защиты липопротеидов низкой плотности (ЛНП) от окислительной модификации антиоксидантными витаминами С, Е и (3-каротином [173, 124]. При этом отмечается, что употребление водорастворимого витамина С в дозах, на порядок превышающих дозу Р-каротина, отражается в гораздо меньшем защитном эффекте. Данный факт может быть связан с меньшей биодоступностью вещества: при приеме людьми 900 мг витамина С ежедневно в течение 3 месяцев концентрация его в плазме крови увеличивалась всего на 27%, в то время как прием 18 мг бета-каротина в том же режиме сказывался в повышении плазменного уровня каротиноида в 6 раз [84].

Каротиноиды, как жирорастворимые антиоксиданты, способны существенным образом тормозить процессы ПОЛ в ЛП. Обнаружено, что включение бета-каротина [114] и ликопина [207] в диету приводит к ингибированию реакций окислительной модификации ЛНП человека. В работе Ziemlanski S. [211] приведены результаты скармливания морским свинкам p-каротина в течение 12 недель. При этом в опытной группе отмечено уменьшение интенсивности процессов ПОЛ в крови. Авторы сообщения [114] приводят ряд эффективности защиты ЛНП от окисления: альфа-токоферол > гамма-токоферол > ликопин > p-каротин. Способность каротиноидов тормозить процессы ПОЛ в ЛП крови, по-видимому, лежит в основе гипохолестеринемического эффекта p-каротина, выявленного некоторыми исследователями. Так, Tsai А.С. с соавторами [208] продемонстрировали дозозависимое снижение концентрации общего неэстерифицированного холестерина (ХС), а также ХС-ЛНП и ХС-ЛВП в плазме кроликов при скармливании им P-каротина в течение 44 дней. В популнционных исследованиях, проведенных на людях [145, 207, 194], показано, что существует положительная корреляционная зависимость между уровнем p-каротина в плазме крови и частотой сердечно-сосудистых заболеваний. В работах [121, 193, 211] продемонстрирована способность |3-каротина и кроцетина уменьшать степень атеросклеретического поражения сосудов.

Помимо традиционных исследований по защите ЛНП каротиноидами от окисления Moreno F.S. с соавторами [168] приводят несколько нетривиальный взгляд на роль каротиноидов в торможении развития гиперхолестеринемии: они сообщают, что назначение p-каротина крысам в дозе 7 мг/ 100 г веса в течение 3 недель ингибирует скорость транскрипции гена, кодирующего синтез З-гидрокси-З -метил-глутарил коэнзим А редуктазы - фермента, регулирующего скорость биосинтеза ХС.

Таким образом, можно заключить, что у нас в стране и за рубежом интенсивно ведутся работы по разработке фармакологических средств на основе каротиноидов. В большинстве случае терапевтический эффект таких препаратов связан с их антиоксидантной активностью. Это выявлено в большом числе экспериментальных работ по изучению механизма их влияния на патогенез некоторых заболеваний.

1.Э. Получение каротиноидов.

Ежегодное увеличение объема продукции, производимой пищевой, парфюмерной и фармацевтической промышленностями, где каротиноиды (в основном, Р-каротин) используются традиционно в качестве красящих веществ, пищевых и провитаминных добавок и в составе комплексных витаминных препаратов [63], а также выявление в последние годы широкого спектра биологической активности каротиноидов, требуют расширения потенциальных источников их получения. Производство каротиноидов в мире достигает ежегодного объема несколько сотен тонн. В зависимости от природы каротиноидов в настоящее время их получают путем химического синтеза, микробиологическим способом или выделяют из растительного сырья [80].

Поскольку в растительном сырье каротиноиды локализуются в клеточных мембранах или находятся в составе клеточных органелл, для их извлечения из биологического материала необходимо нарушить целостность клеток. Эта цель достигается за счет использования некоторых растворителей (ацетона, бутанола, метанола). При этом очень важен подбор растворителей (или их смеси), обеспечивающий наиболее полный переход в них пигментов. При экстракции пигментов из разрушенных клеток часто применяют растворители, нарушающие связь пигмента с липидами, например, ацетон, ацетон с петролейным эфиром, этанол с петролейным эфиром [70]. Далее экстрагированные пигменты переводят в неполярный растворитель (бензол, н-гексан, сероуглерод), добавляя 5-10%-й раствор NaCl или (№14)2804 для устранения образующейся эмульсии [147]. Выделенный таким путем пигмент представляет собой обычно комплекс нескольких соединений, из которого требуемый компонент можно получить осаждением в кристаллическом виде, либо выделить его из общей смеси соединений хроматографически, что гораздо более трудоемко. Отделить разные классы каротиноидов друг от друга можно с помощью бифазного разделения, воспользовавшись различием в коэффициентах распределения между полярной и неполярной жидкостями (обычно используют метанол / петролейный эфир) [70, 209]. В работе [47] обосновано использование системы ацетонитрил-гексан для разделения хлорофиллов и каротиноидов. Очевидно, что необходимость извлечения индивидуального компонента из смеси ведет к значительному удорожанию продукта, поэтому в зависимости от целей обычно используют в той или иной мере очищенный экстракт, представляющий собой сумму соединений.

В промышленном масштабе природное сырье используют при получении ксантофиллов крипто- и зеаксантина из кукурузы, астаксантина -из хитиновою покрова морских животных и из лососевых рыб, кислот каротиноидного типа: кроцина, кроцетина и биксина - из шафрана и наиболее распространенного на рынке Р-каротина - из моркови [144]. В последние годы начинает уделяться внимание получению p-каротина из зеленых микроводорослей, в частности из Dunaliella salina [80]. Для обогащения водорослей каротином резко повышают содержание NaCl в среде выращивания. Коммерческое получение осуществляется в больших водоемах вблизи соленых озер в местах с высокой солнечной активностью. Способ применяют в Австралии, Израиле, США.

К преимуществам извлечения каротиноидов из растительного сырья относится их "природное" происхождение, однако получение их экстракционным способом связано с использованием растворителей, которые делают производство в определенной степени токсичным. В связи с этим усилия производителей направлены в настоящий момент на поиск экстрагентов, которые обладали бы одновременно эффективностью и безвредностью.

Помимо этого, к недостаткам способа получения каротиноидов из природных объектов можно отнести невысокое содержание каротиноидов в сырье (0.3-0,4 мг/г сырья), сезонность, действие неблагоприятных погодных факторов и фитопатогенов и достаточно высокую себестоимость продукта.

Хотя экстракционный способ получения каротиноидов из биологического материала является наиболее классическим и, в принципе, с него и начиналась история выделения каротиноидов, в настоящее время лидирующую позицию на рынке сбыта занимают каротиноиды, получаемые синтетическим путем, в основном из-за их низкой стоимости [80]. Из всех известных каротиноидов только пять получают в промышленном масштабе путем химического синтеза: p-каротин, кантаксантин, этил-бета-апо-8-каротиноат, бета-апо-8-каротиналь, цитроксантин [80, 152]. В 1950 - 60 гг. была разработана методика промышленного синтеза ликопина и зеакасантина. Однако она до сих пор не реализована в промышленных масштабах, поскольку не позволяет произвести стабильную форму ликопина. а производство зеаксантина делает дорогостоящим [148, 144]. Этил-бета-апо-8-каротиноат и бета-апо-8-каротиналь синтезируют в качестве провитаминов А. В конце 80-х годов появился спрос и на другие каротиноиды; лютеин, родоксантин и астаксантин, однако пока экономически выгодных технологий по их получению еще не создано [80].

Исходной единицей для синтеза витамина А и каротиноидов служит р-ионон [144, 152], за исключением кантаксантина, который получают окислением р-каротина [144]. Бета-ионон, в свою очередь, первоначально выделяли из масла лимонника. В настоящее время источником получения бета-иоиона служат ацетон, формальдегид, и ацетилен.

Вторым общим для всех производств промежуточным звеном (за исключением фирмы "Hoffman La-Roche" при синтезе бета-каротина) является этилат ретинола, из которого с помощью определенной последовательности реакций синтезируют каротиноиды.

Не вдаваясь в подробности путей синтеза каротиноидов, отметим лишь общие принципы построения полиеновой цепочки с использованием трех типов реакций:

1. Образование а -связи углерод-углерод и дальнейшее образование тг-связи протекает без элиминирования активирующей группы (альдольная конденсации, конденсация Кновенагеля, реакция Реформатского и енол-эфирная конденсация).

2. Образование -л-связи протекает с элиминированием активирующей группы (конденсация по Виттигу, по Хорнеру и при помощи изонитрилов).

3. Введению двойной связи предшествует частичное восстановление а-связи (реакции Гриньяра и Нефа с ацетилидами магния и спиртами).

Хотя получаемые синтетически каротиноиды являются на настоящий момент самыми дешевыми, их производство не является экологически чистым из-за побочных продуктов синтеза [144]. Кроме того, к основным недостаткам синтетического способа получения каротиноидов относится нестере оспецифичность получаемых продуктов, которые обычно представляют собой смесь цис- и трансформ. Конвертирование цис-форм в транс обычно не представляет труда, поскольку транс-изомеры более стабильны. Цис-изомсры при связях 11,12-, 13,14- и 15,15- относительно легко подвергаются изомеризации при нагревании веществ в гексане или гептане или облучении в присутствии каталитического количества иода [209, 152]. Однако, существуют проблемы, связанные со стабильностью цис-9,10-двойной связи. Так, например, при желаемом получении полностью трансретинола-ацетата, процентное соотношение транс-формы к 9-цис-изомеру распределяется как 40 : 60. Изомеризация 9,10 - цис- формы обычным путем невозможна, хотя в отдельных случаях она протекает под действием света в присутствии сенсибилизаторов [152].

Многообещающим для использования в будущем является микробиологический способ получения каротиноидов. В качестве продуцентов каротиноидов в настоящее время используют микроскопические грибы в связи с тем, что они обладают способностью быстро накапливать значительную биомассу в процессе ферментации и могут расти на относительно дешевых средах [80].

Основными каротиноидами грибов, являются бета-, -гамма и альфа-каротины, ликопин, нейроспороксантин, астаксантин [161], кантаксантин, торулин [105], которые, как считают, принимают участие в процессах фоторецепции и, косвенно, в репродукции в качестве предшественников триспоровых кислот, действующих как гармоны. Как правило, содержание каротиноидов в грибах слишком низко для коммерческого использования и не превышает 100-800 мкг/г сухого мицелия [80]. Однако, среди грибов есть сверхсинтетики, способные в определенных условиях культивирования значительно увеличивать образование каротиноидов. Наиболее перспективны как продуценты каротиноидов среди грибов представители порядка Mucorales: Blakeslea trispora. Phycomyces blakesleeanus, Choanephora cucurbitarum. Среди высших грибов в этом отношении представляют интерес Aspergillus giganteus, некоторые виды Penicillium и дрожжи рода Rhodotorula, например R. aurea, R. rubra. Ликопин наряду с (З-каротином найден у Ustilago violacea, кантаксантин - у Cantharellus cinnabarinus; астаксантин - у Phaffia rhodozyma [105, 131].

В настоящее время микробиологическое производство (3-каротина основано на культивировании гриба Blakeslea trispora [16, 17, 18, 57, 58].

Еще в 1904 г. было сделано наблюдение, что контактная зона совместно растущих (+) и (-) мицелиев некоторых мукоровых грибов отличается ярко-желтым цветом, обусловленным интенсивным синтезом р-каротина [92]. Оказалось, что при совместном культивировании (+) и (-) штаммов выход Р-каротина возрастает с 5 до 17 раз по сравнению с количеством каротина, образуемого отдельно растущими штаммами.

Промышленное получение P-каротина в СССР микробиологическим способом было налажено в 60-е годы благодаря работам таких известных ученых, как проф. И. Самохвалов, М.Н. Бехтерева, акад. А.А. Имшенецкий.

Выход P-каротина, образуемого при совместном культивировании (+) и (-) штаммов гриба Blakeslea trispora на сложных природных средах с добавлением масел и специальных стимуляторов составляет в настоящее время 2-3,9 г/л среды [170, 65, 57].

На Екатеринбургском АО «Уралбиофарм» налажено производство p-каротина из биомассы гриба Blakeslea trispora. Штаммы гриба Blakeslea trispora 8А (+) и (-) выращивают на кукурузно-соевой среде с добавлением К2НРО4, витамина В] и подсолнечного масла. По окончанию ферментации выход p-каротина составляет 0,7-0,9 г/л [13].

На Днепропетровском крахмало-паточном комбинате производят Р-каротин, синтезирующийся при совместном культивировании штаммов К1+ и К1- гетеротапличного гриба Blakeslea trispora. Для ферментации используется питательная среда, в состав которой входят зеленая патока, кукурузный экстракт и растительное масло. При этом, после 96 часов ферментации, максимальный выход p-каротина составляет 3,9 г/л среды [57, 58].

1.4. Стимуляторы каротиногенеза у гриба Blakeslea trispora.

Исследования, проведенные и 50-60-х годах, позволили обнаружить и выделить соединения, которые образуются при совместно культивируемых штаммах В. trispora и способные к стимуляции синтеза р-каротина в отдельно культивируемых (-) штаммах этого гриба. Эти соединения были названы триспоровыми кислотами (ТСК) А, В и С [102, 103]. Главным компонентом этих соединений является триспоровая кислота С - З-метил-1 -(2',6-диметил-3 '-оксо-б'-карбоксилциклогексен-1 -ил)-окта-1,3-диен-7-он. Эти кислоты не включаются в молекулу р-каротина [188], а только активируют ферменты, контролирующие биосинтез этого пигмента [205].

Способность к синтезу триспоровых кислот в основном обнаружена у (+) и (-) штаммов гриба Blakeslea trispora (около 100 мг/л), при их совместном культивировании. Остальные мукоровые грибы, например, P.blakesleeanus не способны синтезировать более 1 мг/л триспоровых кислот. Обнаружено, однако, что при совместном культивировании (-) штамма В. trispora и (+) штамма Cunninghamella japonica, не способного к синтезу каротина, в среду выделяется приблизительно 5-7 мг/л триспоровых кислот [73]. Этот факт, а также другие исследования, проведенные ранее [113], показали, что биосинтезу триспоровых кислот способствуют взаимодействия специфических предшественников, образуемых отдельно (+) и (-) штаммами В. trispora. Установлено, что триспорины и 4-гидрокси-метилтриспораты стимулируют образование зигофор и биосинтез триспоровых кислот у (+) и (-) штаммов В. trispora [201].

Хотя триспоровые кислоты и вызывают сильный стимулирующий эффект на выход р-каротина, и несмотря на то, что их использование позволило бы осуществлять процесс ферментации только с одним продуцентом - (-) штаммом, на практике этот способ не получил широкого применения из-за высокой стоимости триспоровых кислот и их нестабильности.

В ходе исследований по стимуляции каротиногенеза обнаружено, что существует еще один стимулятор синтеза P-каротина у В. trispora - бета-ионон, схожее по структуре и биологическому действию с триспоровыми кислотами. Это соединение, в отличие от триспоровых кислот не является природным, но широко применяется в практике. Проведенные исследования [4] позволили считать, что бета-ионон в клетке грибов связывается с каким-то рецепторным белком и этот комплекс стабилизирует мРНК каротиногенных ферментов .

Обнаружено, также, что кроме триспоровых кислот и бета-ионона, синтез каротиногенных ферментов обеспечивает витамин А (ретинол) [82].

В отличие от триспоровых кислот, бета-ионон действует только на фоне добавления растительного масла. Эффект масла связан с присутствием в нем линолевой кислоты. Замена ее на олеиновую снижает стимулирующий эффект бета-ионона. Известно, что С^-жирные кислоты являются активаторами синтеза ряда ферментов [202, 77] и, вероятно, действие бета-ионона сочетается с функциями этих ферментов. Таким же образом можно объяснить и стимулирующий эффект витамина А, проявляющийся только при введении в среду подсолнечного масла.

Обычно для производстваа p-каротина в качестве стимуляторов применяют такие еще более дешевые заменители, как: 1,6,6-триметил-1 -ацетилциклогексен, лимонен, цитрусовую пульпу или цитрусовое масло. Значительным стимулирующим эффектом обладают ретинол, некоторые ароматические соединения (диметилфталаты, вератрол) и ряд гетероциклических соединений (изониазид, ипрониазид). Добавки грибной биомассы, полученной при предыдущих ферментациях [157, 171, 104], также создают стимулирующий эффект.

В качестве стимуляторов каротиногенеза предложены и другие соединения. Отметим, что общепринято активаторы синтеза каротина делить на три группы: триспоровые кислоты, соединения, содержащие бета-иононовое кольцо (ретинол, Р-ионон) и фенилпроизводные, из которых в практике используют диметилфталат и вератрол [92].

Стимуляторами каротинообразонания у В. trispora являются также некоторые амиды, имиды, лактамы, гидразины, замещенные пиридины, в частности сукцинимид и изоникотиноилгидразин, которые более чем в 3 раза увеличивают выход p-каротина при совместном культивировании (+) и (-) штаммов В. trispora. Мощным стимулятором каротиногенеза являются также барбитураты и некоторые гербициды, например nponamm-(N-(3,4-дихлорофенил)-пропанамид [74]. Интересно, что ряд указанных ниже соединений обнаруживает аддитивный эффект на фоне добавления бета-ионона.

Действие вышеперечисленных соединений на каротинообразование обусловлено тем, что эти соединения выступают как стрессоры, а согласно современным представлениям [79, 19], совершенно различные по своей природе факторы могут в определенных концентрациях вызывать нарушение гомеостаза и, как следствие, интенсифицировать синтез вторичных метаболитов, в частности p-каротина. Существует множество данных, подтверждающих факт интенсификации синтеза каротиноидов неблагоприятными факторами. Например, у водорослей Haematoccocus pluvialis каротиноид астаксантин синтезируется в условиях голодания и солевого стресса [94]. Образование каротиноидных пигментов у бактерий рода Thermits также происходит под действием стрессового фактора — интенсивного освещения [197, 25]. Однако, этот способ при производственной ферментации связан со значительными затратами и удорожанием себестоимости получаемого продукта. Исходя из этого, более приемлемым представляется способ, в котором воздействию света подвергается только посевной материал [77].

Очень важной проблемой при производстве каротиноидов является окисление конечного продукта. При исскуственном стимулировании биосинтеза каротиноидов не в полной мере синтезируются соответствующие природные антиоксиданты типа ренолпроизводных соединений. Поэтому существует необходимость введения в среду дополнительных неприродных антиоксидантов, стабилизирующих каротинсодержащий мицелий. Уже давно для этих целей используется сантохин (б-этокси-1,2-дйгидро-2,2',4-три-метилхинолин). Для хранения биомассы стали применять добавки к мицелию сахарозы, карбоксилметилцеллюлозы, крахмала, желатины [126], при этом стабильный уровень каротина может сохраняться в течение 9-12 мес при температуре не выше 41°. Оптимальные условия введения сантохииа - через 40-60 ч от начала ферментации и за 3-10 ч от начала термической обработки; антиоксидант вводят в количестве 0,05% [61].

Несмотря на экологически чистое производство и на перспективу создания в будущем сверхсинтетиков каротиноидов путем генной инженерии, основными недостатками микробиологического способа получения каротиноидов на настоящий момент являются дорогая среда роста, наличие в биотехнологическом процессе двух штаммов и необходимость достаточно высокой стерильности производства.

Таким образом, в заключении, следует отметить, что любой из способов получения каротиноидов (в частности Р-каротина) имеет свои преимущества и недостатки.

В настоящее время ведутся работы, направленные на удешевление и стандартизацию микробиологического способа получения каротиноидов с использованием методов генной инженерии, осуществляемые в двух направлениях [80]:

1) гены, контролирующие путь биосинтеза определенного каротиноида, должны быть клонированы в организм, способный быстро расти на экологически чистых и дешевых средах;

2) путь биосинтеза каротиноида должен быть так изменен в родительском организме, чтобы превратить его в сверхсинтетика этих пигментов.

Так, например, в работе [210] сообщается о введении в ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae генов из бактерии Ervinia uredonova и Ervinia herbicola, кодирующих биосинтез таких каротиноидов, как (3-каротин и ликопин. Помимо этих генов в эти же клетки введены гены, ответственные за синтез фарнезилдифосфата, как начального субстрата а синтезе каротиноидов из индустриального штамма Saccharomyces cerevisiae. Подобный метод позволяет синтезировать 113 мкг ликопина / г сухого веса и 103 мкг (3-каротина. Но пока эти исследования находятся на стадии академических разработок и трудно предсказать, достигнут ли они биотехнологического уровня.

1.5. Структура и физико-химические свойства ликопина.

Ликопин относится к классу природных соединений - каротиноидам. Это каротиноид, который придает здоровую красную окраску фруктам и овощам, таким как помидоры, арбузы, розовые грейпфруты, облепиха и др.

Ликопин является главным каротиноидным компонентом в плодах красных разновидностей помидоров (Lycopersium spp.), но уступает первенство Р-каротину в разновидностях с зелеными плодами (L. peruvanicum, L. Hirsutum); в золотистых разновидностях этот пигмент, вероятно, совсем отсутствует. Ликопин встречается также во многих других плодах, например в плодах шиповника (Rosa canina), в арбузах (Cucumis citrulis), абрикосах (Prunus armeiaca), плодах пальмы (Seafortia elgans) и ягодах брусники. Интересное положение занимают персики: европейские разновидности содержат ликопин наряду с а- и Р-каротином, тогда как американские разновидности совсем не содержат ликопина. [28, 175]

Ликопин (С40Н56) - это ациклический каротин, лишенный активности витамина А. Он известен в кристаллической форме с тех пор, как Миллардэ

31 открыл его в 1876 г. и назвал соланорубином [28]. Главный источник ликопина в нашей еде - помидоры, кетчупы и томатные пасты, которые кроме того богаты витаминами А и С, р-каротином и калием. Другие овощи и фрукты содержат его в небольших количествах.

Таблица 1.5.1. Содержание ликопина в различных продуктах питания.*

Продукт Ликопин мг/100 мг Размер порции Ликопин мг/порцию

Томатный сок 9.5 250 мл ( 1 чашка ) 25.0

Кетчуп 15.9 15 мл(1 столовая ложка) 2.7

Томатная паста 42.2 30 мл(2 столовых ложки) 13.8

Томатный соус 14.1 60 мл(1/4 чашки) 8.9

Арбуз 4.0 368 г(1 кусок 25*2 см) 14.7

Красный грейпфрут 4.0 123 г (1/2 плода) 4.9

Помидор 3.0 123 г (1 плод среднего размера) 3.7 по данным t . J. Heinz Company.

С химической точки зрения ликопин - каротиноид с уникальной структурой (рис. 1.5.1). Его длинная цепочка, состоящая из 13 конъюгированных двойных связей, длиннее, чем у любого другого каротиноида [95].

Рис. 1.5.1. Структурная формула ликопина (С40Н56)

Температура плавления ликопина = 175°С.

Из-за многочисленных двойных связей и наличия ассиметричных атомов углерода ликопин имеет разнообразные конфигурации и стереоизомеры с различными химическими и физическими свойствами. Атом углерода с четырьмя различными заместителями обусловливает возможность оптических R- или S-изомеров. Эти различия между молекулами одной и той же формулы оказывают заметное влияние на физические свойства и на эффективность ликопина как пигмента.

Ликопин, как и все каротиноиды, нерастворим в воде и хорошо растворим во многих органических растворителях (хлороформе, бензоле, гексане, петролейном эфире, четыреххлористом водороде и др.). Растворы ликопина в органических растворителях при спектрофотометрических исследованиях дают характеристические полосы поглощения в основном в видимой области спектра, а стереоизомеры показывают их также и в ультрафиолетовой. На рис. 1.5.2 показан спектр поглощения ликопина в гексане.

Таблица 1.5.2. Максимумы поглощения ликопина в различных растворителях.

Растворитель Сероуглерод Хлороформ Петролейный эфир Гексан

Максимумы поглощения 547, 507 520, 485, 466 506, 474 501,471,447,360

Следует учитывать, что ликопин в чистом виде характеризуется высокой лабильностью - он весьма чувствителен к воздействию кислорода воздуха, нагреванию, воздействию кислот и щелочей. Под воздействием этих неблагоприятных факторов он подвергаются окислению и разрушению

97]. В то же время, входя в состав различных комплексов (например, протеиновых), он проявляет намного большую стабильность.

Рис. 1.5.2. Спектр поглощения ликопина в гексане. D - оптическая плотность раствора; к - длина волны.

1.6. Ликопин и его биологическое значение для человека.

Ликопин присутствует в тканях человеческого организма, в частности в плазме крови, в количествах, больших, чем другие каротиноиды (табл. 1.6.1), что свидетельствует о его важном биологическом значении [129, 95].

Высокое содержание ликопина в человеческом организме связано с его высокой антиоксидантной активностью. Это свойство ликопина позволило в последние годы найти ему широкое применение в медицине.

Ликопин в виде различных лекарственных форм используют как профилактическое радиопротекторное средство, антиканцерогенный препарат, который применяют в комплексной профилактике ряда раковых заболеваний (рак простаты, легких, желудка и т.д.), антисклеротическое средство при лечении атеросклероза, катаракты, ишемической болезни сердца.

Таблица 1.6.1. Содержание каротиноидов в сыворотке крови человека.

Каротиноиды М+/-дельта, мкг/дл Пределы колебаний, мкг/дл % от суммы каротиноидов

Бета-каротин 31,3+/-14,8 7,6-57,9 20,2

Лютеин+зеаксантин 28,4+/-9,7 12,5-45,8 18,4

Ликопин 39,5+/-20,9 10,4-80,9 25,5

Альфа-каротин 2,2+/-1,8 Следы-6,0 1,4

Криптоксантин + Прекриптоксантин 20,0+/-19,1 5,1-70,3 12,9

Неидентифицирован-ные каротиноиды 33,9+/-19,8 11,8-75,7 21,9

Сумма каротиноидов 154,8+/-46,1 26,4-242,5 100

В основе применения ликопинсодержащих препаратов в медицине лежит способность ликопина нейтролизовать так называемые свободные радикалы (молекулы или атомы, имеющие неспаренные электроны, которые появляются в процессе клеточного метаболизма). Недостаток электронов свободные радикалы компенсируют за счет других молекул, делая их химически активными, способными взаимодействовать с другими соединениями. Они могут таким образом повреждать липиды, протеины и молекулы ДНК, вызывая развитие различных заболеваний. Ликопин ловит эти радикалы, отдает собственные электроны и предотвращает окисление других молекул [97] .

Ученые полагают, что избыток свободных радикалов (oxidative stress) способствует развитию атеросклероза [107, 184], рака [93, 120] , катаракты, артроза (изнашивание суставов) и различных сердечных заболеваний.

Курение, загрязнение окружающей среды и радиация увеличивают количество свободных радикалов до уровня, с которым человеческий организм бороться не может. Природная способность защищать нас с возрастом падает, поэтому курильщики и пожилые люди находятся в группе риска.

Все знают, что рак предстательной железы - достаточно распространенное заболевание среди мужчин. Это второй по смертности вид рака у мужчин. Риск заполучить рак простаты увеличивается с возрастом. К примеру, более 70% больных этим видом рака имеют возраст более 65 лет [164]. К причинам появления рака можно также отнести и различные неблагоприятные факторы внешней среды, образ жизни, курение и т.д. Поэтому немаловажным является вопрос профилактики данного заболевания.

Обнаружено, что потребление в пищу продуктов томата приводит к снижению вероятности возникновения рака предстательной железы. Исследования показали, что добавление в рацион больных ликопина приводит к регрессии, уменьшению злокачественной опухоли [125]. В результате шестилетнего исследования 48000 работающих мужчин ученые из Гарвардской медицинской школы выяснили, что потребление томатов, томатных соусов или пиццы чаще чем два раза в неделю по сравнению с отказывающимися употреблять эти продукты уменьшает риск рака предстательной железы на 21 - 34%. По этому показателю помидоры значительно опережают другие 45 овощей и фруктов, такие как арбузы, абрикосы, плоды пальмы, персики и многие другие, влияние которых также изучалось в ходе эксперимента. В 1985 г. ученые Гарвардского Университета выяснили, что пожилые люди, в рационе которых важное место занимают томаты, в два раза реже умирают от рака [164,142,125].

Другое исследование, проводившееся в Ауклэнде (Новая Зеландия) в период с 1996 по 1997 гг, исследовало зависимость между возникновением рака предстательной железы и потреблением ликопина, а также р-каротина. В результате, выяснилось, что в данном случае только ликопин способен в определенной степени снизить риск возникновения рака предстательной железы [172].

При исследованиях на клеточном уровне, обнаружено, что ликопин накапливается в тканях простаты [108], причем в больших концентрациях, чем другие каротиноиды. Исходя из этого, были проведены исследования, показавшие, что уровень ликопина в крови у больных раком предстательной железы меньше, чем у здоровых людей. Это послужило основанием судить о том, что в случае возникновения рака предстательной железы организм использует ликопин для предотвращения развития этой болезни. Существуют и другие исследования подтверждающие данную гипотезу.

Рак груди - наиболее распространенный вид рака у женщин. Употребление в пищу фруктов и овощей в некоторой степени помогает справляться с раком, но употребление томатов и его продуктов в большей степени предотвращает развитие рака груди. Именно ликопин, находящийся в томатах, ингибирует развитие раковой опухоли.

Проведены исследования, в которых сравнивалась ингибирующая способность по отношению к грудным опухолям у ликопина, альфа-каротина и Р-каротина. Было показано, что ликопин оказался более эффективным в данном случае. В случае, когда мышам, генетически расположенным к развитию грудной опухоли, давали употреблять ликопин, опухоли в конечном итоге подавлялись [169]. Другое испытание показало, что когда крысам вводили ликопин, опухоли уменьшались по сравнению с теми крысами, которым ликопин не вводили [190]. Действие Р-каротина в данном случае не принесло никакого эффекта.

Исследования рака груди и легких, проведенные в Израильском Университете Бен Гурион показали, что ликопин более эффективно тормозит развитие раковых клеток (замедляет переход от одной фазы развития к другой), чем а- и Р-каротин. Это свидетельствует о том, что ликопин в некоторых случаях более сильный антиоксидант, чем Р-каротин [162].

Что касается других распространенных женских болезней -затылочного рака и рака яичников, то и здесь ликопин оказывает свое благотворное влияние. При обследованиях женщин больных затылочным раком, обнаружено, что содержание ликопина в их крови меньше, чем у здоровых женщин. Например, при обследовании 147 женщин с диагнозом рака затылка и 191 здоровых женщин, обнаружено, что только содержание ликопина в сыворотке крови было меньше у больных женщин [128]. В другом исследовании 32 женщин с затылочным раком и 113 женщин без диагноза рака, при определении микро-состава крови, выяснилось, что те у тех женщин, которые употребляли в пищу больше ликопина и витамина А, уровень ликопина в крови был выше и, исходя из этого, риск возникновения затылочного рака был ниже в 3 раза.

Исследователи Университета штата Иллинойс утверждают, что женщины с высоким уровнем ликопина в организме имеют в 5 раз меньший риск развития шейки матки, чем женщины с низким уровнем ликопина [178, 179].

Довольно часто среди населения встречаются сердечно-сосудистые заболевания. Научные данные свидетельствуют о том, что окисление липопротеидов низкой плотности (ЛНП), при котором в кровь выделяется холестерин, играет важную роль в развитии атеросклероза и ишемической болезни сердца. Проведенные исследования показывают, что употребление ликопина помогает снизить вероятность появления сердечных болезней [195, 176].

Ликопин является растворимым в липидах антиоксидантом, который транспортируется в крови через липопротеиды. Всасывание ликопина и других каротиноидов позволяет предотвратить окисление липопротеидов низкой плотности (плохого холестерина) [160].

В университете Торонто были проведены исследования, в которых люди принимали одну-две суточные порции ликопина в виде томатного сока, спагетти соуса и концентрированного ликопина. Образцы крови исследовались на содержание ликопина, холестерина и окисленных ЛНП. Уровень ликопина в крови повышался и, хотя содержание холестерина не изменялось, уровень окисленных ЛНП сильно падал. Отсюда сделан вывод, что употребление ликопина препятствует окислительному распаду ЛНП, таким образом, снижая риск возникновения сердечных болезней. Диетологи советуют принимать в день стакан томатного сока, жаренные томаты или 4 столовые ложки кетчупа [85].

В Университете Северной Каролины сравнивали 1379 американцев и европейцев, перенесших инфаркты с таким же числом здоровых людей. Исследователи отметили повышенное содержание ликопина в крови у здоровых людей, что снижало риск в два раза [200].

Клинические исследования ликопина показали также, что ликопин останавливает падение зрения у пожилых людей (macular degeneration), уменьшает риск сердечных приступов.

Регулярное потребление ликопинсодержащих продуктов уменьшает уровень холестерина в крови и соответственно снижает риск развития атеросклероза [121]. (Эти данные были получены в ходе исследования, проводившегося в Университете Торонто). При этом необходимо учитывать, что важным фактором для усвоения ликопина организмом является наличие жировой среды. Ликопин растворяется в жире, а жир усваивается в кишечнике лучше других питательных веществ. Вместе с ним попадает в организм и ликопин. Поэтому помидоры - источники ликопина - надо есть с жиром, например, с растительным маслом или сыром.

Помимо значения ликопина как перспективного медицинского препарата, этот пигмент предполагается все шире использовать как краситель для пищевых изделий и в парфюмерии.

В настоящее время отечественный рынок пищевых продуктов заполнен импортными пищевыми красителями, которые не обладают питательной ценностью и, несмотря на их малую токсичность, потенциально опасны как канцерогены и мутагены. По данным Исследовательского центра по изучению астмы и аллергии в Англии такие химические красители, как тартразин (Е102), желтый закат (Е110), кармуазин (Е122), понсо 4R (Е129) провоцируют аллергические заболевания и вызывают психическое заболевание «синдром гиперактивности» [53].

Сравнительно малодоступны натуральные пищевые красители: импортные — из-за высокой стоимости, отечественные - из-за отсутствия крупных производителей.

Вместе с тем, красители каротиноидного типа, наряду с красящей функцией имеют самостоятельное значение как биологически активные добавки. Замена химических красителей в кондитерских изделиях, растительных маслах, мазях и кремах на природные (в частности ликопин) обеспечивает не только окрашивающий эффект, но и оказывает оздоровительное действие. Особенно велико его значение при изготовлении колбас и ветчинных изделий, где он может заменить нитрит натрия [35].

1.7. Получение ликопина.

В настоящее время ликопин получают экстракцией из растительного сырья и с помощью микробиологического синтеза.

В 1950-1960 гг. была разработана методика химического синтеза ликопина. Однако до сих пор она не реализована в промышленных масштабах, поскольку не позволяет получить стабильную форму ликопина [148].

Известен способ получения ликопина из кожицы томатов путем экстракции хлористым метиленом в присутствии адсорбента [54]. Однако данный метод имеет следующие недостатки: связан с сезонностью, зависит от климатических колебаний, грибной инфекции, в частности урожай томатов может быть полностью уничтожен грибом Phytospora sp. Кроме того, выход ликопина при этом незначительный (0.3 - 0.4 мг/г плодового тела), причем кроме основной all - trans - формы ликопина присутствует также неоликопин А и проликопин, что значительно затрудняет очистку целевого продукта. Указанное делает этот способ экономически нецелесообразным.

Способность синтезировать ликопин обнаружена у различных видов микроорганизмов - бактерий, грибов, актиномицетов.

Характерным для бактерий является одновременный синтез большого набора пигментов каротиноидной и некаротиноидной природы. Значительные количества ликопина накапливают пурпурные бактерии (Thiocystis spp.), микрококки (Micrococcus tetragenus) и микобактерии (Mycobacterium kanaasli, Mycobacterium lacticorn). Известен штамм бактерий Mycobacterium rubrum, который на среде с мелассой и кукурузным экстрактом накапливает до 7,05 мг/г суммарных каротиноидов. При этом в пигментном комплексе бактерий помимо ликопина обнаружены а-, (5- и у-каротин, ауроксантин, лютеин, криптоксантин, виолоксантин, зеаксантин, антераксантин, рубиксантин, лепротеин, неоксантин [44].

Процесс накопления ликопина у актиномицетов занимает продолжительное время, например у Streptomyceticus var. rubescens процесс получения ликопина занимает около 8 суток, что приводит к удорожанию конечного продукта.

Качественный состав пигментов водорослей является таксономическим критерием в систематике этих организмов.

Наиболее активными продуцентами ликопина среди водорослей являются Chara ceratophylla и Nittella syncarpa.

Наиболее изученными грибами, способными образовывать ликопин, являются виды Neurospora crassa, Phycomyces blakesleanus, Blakeslea trispora, Cautharellus cibarius, Cautharellus infundibiliformis и Cautharellus lutesceus.

В настоящее время для получения ликопина микробиологическим способом в качестве продуцентов используют гетероталличные грибы Blakeslea trispora.

Blakeslea trispora - гетероталличный гриб порядка Mucorales. Гетероталлизм данного гриба выражается в образовании разнополого (+) и (-) мицелия, при слиянии которого образуется зигота. Половое размножение возможно только между разными штаммами. Штаммы не отличаются друг от друга по строению, между ними существуют лишь небольшие физиологические различия. Максимальное количество пигментов синтезируется при совместном культивировании плюс- и минус-форм.

В настоящее время в нашей стране на Екатеринбургском заводе «Уралбиофарм» реализуется технология получения ликопина на основе выращивания гриба Blakeslea trispora [22, 83, 75]. Технология получения ликопина основана на ингибировании процесса циклизации ликопина в р-каротин, в результате путь биосинтеза каротиноидов прекращается на ликопине и не происходит дальнейшего превращения ликопина в Р-каротин.

Ингибирование процесса циклизации осуществляют либо изменением рН среды в щелочную сторону либо добавлением ингибиторов циклаз. Изучение отходов от химических и табачного производств показало, что наиболее перспективной является табачная пыль (111) - дешевый выход при производстве табака. Действующим началом этого отхода является природный азин - никотин и его производные [83].

Процесс получения ликопина на заводе «Уралбиофарм» осуществляется следующим образом. Ферментер емкостью Юм3 загружается 4м питательной среды, содержащей кукурузной муки - 17,3 г/л, соевой муки - 40 г/л, КН2РО4 -0,5 г/л, 5% масла и 1% табачной пыли. Ферментацию штаммов гриба Blakeslea trispora 8А (+) и (-) ведут 110 ч. При этом выход ликопина составляет 0,49 - 0,7 г на 1 л среды (определяется спектрофотометрически) [22].

Исследования показали, что добавление в среду табачной пыли не влияет на параметры ферментации (рН среды, накопление биомассы и т.д.), но, при этом, стимулирует ликопинообразование. После окончания ферментации среду в ферментере подкисляют H2SO4 до рН 4.0 и нагревают до 85 °С. Далее отделяют биомассу В. trispora и после промывки водой до рН 7.0 продувают сжатым воздухом и высушивают под вакуумом. Для выделения ликопина из биомассы используют подсолнечное масло.

К недостаткам этого метода можно отнести довольно длительное время ферментации (110 ч.), неэффективный способ экстракции ликопина и необходимость добавлять в среду ингибиторы цикл аз [22, 83].

Наиболее эффективным стимулятором синтеза ликопина у Blakeslea trispora в данном случае является 6-метил-2-аминопиридин [83]. Результаты опытов с циклогексимидом и актиномицином D показывают, что этот стимулятор ликопинообразования действует как репрессор гена, регулирующего синтез специфических ферментов de novo. Действие 6-метил-4-аминопиридина на состав каротиноидов Blakeslea trispora позволяет предположить, что он ингибирует циклазы и некоторые дегидрогеназы и является стимулятором синтеза каротиноидных пигментов и их предшественников. Интересно отметить, что некоторые производные пиридина, в частности цикоцел - (2-хлорэтил)-триметил аммоний хлорид, стимулируют также синтез ликопина у растений, а никотин значительно интенсифицирует образование этого каротиноида и у Mycobacierium marinum [141]. Однако до сих пор получение ликопина микробиологическим способом не получило широкого практического применения в крупномасштабных производствах из-за возможного токсического эффекта гетероциклических соединений, используемых в качестве стимуляторов [80].

Поскольку вышеописанный способ микробиологического получения ликопина с помощью штаммов гриба Blakeslea trispora А-732-3(+) и А-732-3(-) или 8А(+) и 8А(-) на кукурузно-соевой среде с добавлением в качестве ингибиторов циклаз соединений класса аминометилпиридинов или табачной крошки имеет существенные недостатки (недостаточно высокий выход ликопина, токсический эффект гетероциклических соединений), то поиск новых штаммов микроорганизмов-продуцентов ликопина, разработка более эффективного способа получения ликопина, удешевление процесса, а также исключение из среды химических стимуляторов ликопинообразования производных пиридина, является актуальной задачей.

Выводы

1. Изучены культурально-морфологические и физиологические особенности новой пары штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) - продуцента ликопина, обеспечивающие стабильность процесса ликопинообразования.

Показано, что наибольшее накопление ликопина наблюдается, когда штаммы на твердых питательных средах имеют следующие отличительные характеристики:

- штамм Blakeslea trispora ВСБ-129(-) образует плотный, ярко-оранжевого цвета, субстратный мицелий. Воздушный мицелий практически не образуется;

- штамм Blakeslea trispora ВСБ-130(+) образует субстратный мицелий бежевого цвета и воздушный мицелий палевого цвета. Спороношение штамма активное.

При этом, ликопинсинтезирующая активность наблюдается после 7-9 дней роста.

2. Разработана 2-ух стадийная технологическая схема культивирования пары штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), которая предусматривает:

- на 1 стадии выращивание штамма ВСБ-129(-);

- продолжительность 1 стадии процесса составляет 26 часов, что соответствует началу стационарной фазы роста;

- на 2 стадии - добавление к выросшему штамму ВСБ-129(-) штамма ВСБ-130(+) и дальнейшее совместное выращивание штаммов гриба;

- продолжительность 2-ой стадии технологического процесса (время совместного выращивания штаммов) составляет 48 часов;

3. Оптимизирован состав питательной среды и определены основные параметры технологического процесса, обеспечивающие накопление ликопина 1,15 мг/л.

Максимальное накопление ликопина достигается на питательной среде следующего состава: гидрол - 66,5 г/л; кукурузный экстракт - 81 г/л; КН2РО4- 1,28 г/л; (NH4)2S04 - 4,1 г/л; при рН=6,8 , установленном на старте ферментации и увеличении аэрации при переходе на 2-ую стадию технологического процесса.

4. Показано, что в качестве анти оксида ню в для стабилизации ликопина при хранении биомассы могут быть использованы собственные липиды гриба, добавленные в среду культивирования в виде масляного раствора перед окончанием процесса ферментации.

5. Определены условия получения вододисперсионной формы ликопина, основанной на использовании собственных фосфолипидов гриба, стабильной в течении длительного времени (10 суток) с концентрацией ликопина 1-2 мг/100 мл.

Заключение

Анализ многочисленных литературных данных показал, что разработка технологий получения природных биологически активных соединений, в частности антиоксидантов, и создание на их основе пищевых продуктов и Б АД лечебно-профилактического назначения в настоящее время является актуальной задачей.

Исследования последних лет показывают, что одним из наиболее активных и естественных для организма человека соединением такого назначения является ликопин. Наряду с красящей функцией он имеет самостоятельное значение как биологически активная добавка. Подавляя в организме свободнорадикальное окисление, ликопин стабилизирует имунный статус организма, улучшает протекание ряда важнейших биологических процессов в организме, в том числе нормализует уровень глюкозы в крови, липидный обмен, зрение и контролирует новообразование клеток.

В настоящее время из каротиноидов крупномасштабно получают только Р-каротин. Наиболее активным его продуцентом является гетероталличный гриб Blakeslea trispora. В результате проведенных нами исследований были получены новые штаммы этого гриба и разработана технология, позволяющая направленно синтезировать ликопин без образования бета-каротина.

Новая пара штаммов гриба получена в результате многоступенчатой селекции с применением физических и химических мутагенов. Определены культурально-морфологические признаки штаммов ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) на твердых и жидких питательных средах, обеспечивающие стабильность процесса ликопинообразования данной парой. В результате проведенных исследований показано, что стабильность синтеза ликопина в большей степени зависит от культурально-морфологических свойств штаммов на твердых питательных средах. Во всех вариантах экспериментов более стабильный синтез ликопина имел место в случае, когда (-) штамм на сусло-агаре образовывал плотный ярко-оранжевого цвета субстратный мицелий, а (+) штамм образовывал субстратный мицелий бежевого цвета и воздушный мицелий палевого цвета.

На основании проведенных исследований была разработана двухстадийная технологическая схема культивирования пары штаммов, предусматривающая раздельное и совместное выращивание (+) и (-) штаммов. Исследования по изучению влияния морфологического и физиологического состояния культуры на процесс накопления ликопина показали важность продолжительности культивирования на 1-ой стадии технологического процесса.

Определены основные параметры технологического процесса и подобрана оптимальная питательная среда, обеспечивающие накопление ликопина в биомассе гриба до 50-55 мг/гАСВ и выход ликопина на стадии ферментации до 1 г/л. При этом в среду культивирования не вносили стимуляторы ликопинообразования химической природы, которые могут оказывать токсическое действие на организм человека.

Проведены исследования по стабилизации ликопина в процессе культивирования и хранения биомассы. В результате показано, что наибольшее количество ликопина разрушается в течение первых суток хранения, что, вероятно, связано с недостатком собственных внутриклеточных антиоксидантных систем. Проведенный нами поиск антиоксидантов для обеспечения стабильности во время хранения ликопинсодержащей биомассы показал, что лучшие результаты достигаются при использовании собственных липидов гриба Blakeslea trispora.

Разработан способ получения водорастворимой формы ликопина с использованием фосфолипидов, извлекаемых из биомассы гриба Blakeslea trispora в процессе выделения ликопина. Данный способ позволяет получать стабильную вододисперсионную форму ликопина и значительно снижает затраты на получение препарата.

Разработанная технология получения ликопина на основе новой пары штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora награждена бронзовой медалью III Международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 4-7 февраля 2003 г.).

Таким образом, разработанная на основе новой пары штаммов гриба Blakeslea trispora технология позволяет вести направленный синтез только ликопина, без образования бета-каротина. При этом, в отличие от существующих на сегодняшний день технологий, процесс синтеза ликопина осуществляют без добавление в среду химических предшественников синтеза, что делает возможным применение ликопина в пищевой промышленности и медицине. Кроме того, для предотвращения окисления ликопина в качестве стабилизатора используют липиды, получаемые из этой же биомассы гриба, что также исключает использование химических стабилизаторов. Все это в совокупности значительно повышает экономическую эффективность технологического процесса и позволяет получать экологически чистый ликопин в достаточном количестве.

Промышленное производство ликопина по разработанной технологии позволит решить проблему дефицита данного важнейшего антиоксиданта в рационе питания современных людей, что в свою очередь обеспечит повышение уровня адаптационной защиты организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека и снижение риска развития ряда опасных заболеваний, в том числе и онкологических.

В настоящее время разработанная технология получения ликопина на основе пары штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) проходит испытания с целью промышленной реализации в условиях НПО «Витан» г.Верхнеднепровска, Украина.

1. Авчиев М.И., Буторова И. А., Авчиева П.Б. Изучение особенностей роста и накопления ликопина парой гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-130(+) и ВСБ-129(-). // Биотехнология. 2003. - т.З. - с.12-20.

2. Арбузов В.А., Феофилова Е.П., Иванова J1.E., Бехтерева М.Н. // Докл. АН СССР. 1979. Т. 226. № 6. С. 1449-1450.

3. Беляев И.К., Зарайский А.В., Лимберг В.К., Вакулова Л.А. Модификация синтетическим Р-каротином резистентности организма к острым ионизирующим воздействиям.//Вопр. мед. химии. 1992. -T.38.N6. -С.39-41.

4. Биоантиокислители. // Труды московского общества испытателей природы, т. LII М.:Наука, 1975.

5. Бирюков В.В. Практическое руководство по применению математических методов планирования эксперимента для поиска оптимальных условий в многофакторных процессах. //Рига. Изд. Зинатне, 1969.

6. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В., Молотковский Ю.Г. и др. Препаративная биохимия липидов. // М.: Наука, 1981. 256 с.

7. Беркетова Л.В., Семенова И.А., Агапова Е.В // Вопросы питания 1995 -№1 - с. 12-39.

8. Беркетова Л.В. Разработка технологии получения водорастворимой формы (3-каротина и применение ее в пищевой промышленности // Автор, дис. к.т.н. М. - 1997.

9. Бернггейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии. //Л., «Химия», 1975.

10. Булдаков А.С. Пищевые добавки. // Справочник. С.-Петербург, 1996, -240 с.

11. Буюклинская О.В. Коррекция первичного и вторичного иммунодефицита синтетическим Р-каротином. // Вопр. мед. химии. 1992. - Т.38, N6. - С.3132.

12. Вакулова Л.А., Кузнецова В.П., Колот Ф.Б., Бабьева И.П., Самохвалов Г.И. // Микробиология 1964 - т.ЗЗ - №6 - с.1061.

13. Васильченко С.А., Орехов B.C., Кунщикова И.С. Статистический анализ и оптимизация микробного синтеза Р-каротина. // Биотехнология, 1987, том 3, №3, с.391-393.

14. Васильченко С.А., Орехов B.C., Зубарева И.М. // Микробиол. журнал. -1992. 54, №6. - с.28-31

15. Веселовский В.А. Структурно-функциональные изменения мембран растительной клетки при адаптации к повреждениям. // Автореф. дис. докт. биол. наук. М. МГУ, 1990. 44с.

16. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. // Москва, Наука, 1972. 252 С.

17. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах. // Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. Серия биофизика. Т.29. Москва, 1991. - 249 с.

18. Гаврилов А.С., Киселева А.И. и др. // Прикладная биохимия и микробиология, том 32, №5, 1996, с.545-548.

19. Гаркавенко А.И., Савченко Л.Ф. Штамм Actinomyces antibioticus. // А.С. 327250 (СССР). Опубл. в Б. И., 6.03. 1972.

20. Геннис Р. Биомембраны : Молекулярная структура и функции. // М., Мир 1997 - 624с.

21. Герасимова Н. М., Бехтерева М.Н. и др. // Микробиологический синтез, №4, 1968, с. 16-20.

22. Гаврилов А.С., Матушкина С.А., Петров А.Ю. Способ экстракции ликопина из биомассы. // Из материалов 1-ого Международного конгресса

23. Гудвин Т.В. Сравнительная биохимия каротиноидов. // М.: Издательство иностранной литературы, 1980, 317с.

24. Деев С.В., Буторова И.А., Авчиева П.Б. // Биотехнология, 2000, №5 с.36 -47.

25. Деев С.В. Разработка технологии получения жирорастворимых биологически активных веществ из биомассы гриба Blakeslea trispora. // Дис. к.т.н., Москва, 2002,183 е.

26. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. // Учеб. для студентов биол. спец. ун-тов 4-е изд., перераб. и доп. - М: Высшая школа, 1986. - 448с.: ил.

27. Егоров Н.С. Промышленная микробиология. // Учебное пособие для вузов по специальности Микробиология и Биология. М.: Высшая школа, 1989, - 688с.

28. Елисеев А.А., Пушева М.А., Заварзин Г.А. и др. // Докл. АН (Россия). -1993.-331, №1.-с.116-118.

29. Иаков Н.Н., Капитанов А.Б. Биохимические механизмы действия низкомолекулярных хлорорганических алифатических соединений на организм человека и животных (обзор). // Вопр. мед. химии. 1986. -Т. 32, N 3. -С. 2-9.

30. Капитанов А.Б., Пименов A.M., Обухова JI.K., Измайлов Д.М., Радиозащитная эффективность ликопина. // Радиационная Биология. Радиоэкология. 1994. -T.34,N3.-C. 439-445.

31. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. // Вопросы мед. химии 1999 - т.45. - вып. 1 - с.3-12.

32. Квасников Е. И., Суденко В.И. и др. Каротинсинтезирующие дрожжи. // Киев: Изд. Наукова думка, 1980. 171 с.

33. Кейтс М. Техника липидологии. // М. Мир. 1975 - 322с.,

34. Коган JI.M., Обольникова Е.А. // Химико-фармацевтический журнал -1990 №11 - с.76-77.

35. Кретович B.JI. Биохимия растений. // М. Высшая школа, 1980, 348с.

36. Ланкин В.З., Закирова А.Н., Ахматова Б.Х. и др. /У Кардиология. 1980. -т .20, N 7. - с. 96 - 98.

37. Ланкин В.З. // Кардиология. 1980. - т .20. N 8. - с. 42 - 47.

38. Лукин Ю.Л., Симонова Е.А., Оглоблин А.Н., Касымов А.К. // Физиология растений. 1988. - Т.35, Вып.5. - С.1031-1035.

39. Масюк Н.П., Радченко М.И. // Гидробиол. журн., 1971, 7, № 6, с. 31- 41.

40. Меморская А.С., Терешина В.М., Феофилова Е. П. // Микробиология, 1996, том 65, №6, с.777-781.

41. Мосичев М.С., Матвеев Д.А., Белов А.П. /У Прикладная биохимия и микробиология 1994 - том.З. - вып.З - с.430-435.

42. Никипок В.Г. Каротиноиды и их значение в живой природе и для человека. Государственный научный центр лекарственных средств. // Харьков. журнал "Провизор", апрель 1999.

43. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.В. // Успехи биол. Химии -1990-Т.31 с. 180-208.

44. Оценка некоторых пищевых добавок. // Серия технических докладов, 653. ВОЗ. Женева. - 1982.55. Патент РФ № 2085192.56. Патент РФ № 2159765.57. Патент РФ № 2177505.58. Патент РФ № 2177506.59. Патент РФ № 2179401.

45. Санникова В.М., Бондарь И.В., Стужук Г.М. // Биотехнология, № 5, 1985, с. 107-110.

46. Санникова В.М., Купщикова Н.С., Литвиновския Л.В., Даниленко В.Ф. // Биотехнология. 1985. №4. С. 49-50.

47. Санникова В.М., Санников Ф.Л. и др. // Биотехнология, 1989, т.5, №1. -с.58-59.

48. Сергеев А.В., Вакулова Л.А., Шашкина М.Я., Жидкова Т.А. Медико-биологические аспекты каротиноидов. // Вопр. мед. химии. 1992. - Т.38, N6. - С. 8 -11.

49. Сергеева Т.И., Вакулова Л.А., Жидкова Т.А., Сергеев А.В. Ингибирующсе влияние отечественного синтетического (p-каротина и аскорбиновой кислоты на эндогенный канцерогенез мышей. // Вопр. мед. химии. 1992. - Т.38, N6. - С. 12

50. Сухаревич В.И., Медведева Н.Г. и др. // Тез. докл. 1-ого Международного конгресса «Биотехнология : состояние и перспективы развития», Москва, 1418 окт., 2002 г. М.: ЗАО «Пик «Максима», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2002,-с.317.

51. Терешина В.М., Меморская А.С., Феофилова Е.П. // Микробиология, т.63, вып.6, 1994, с. 1111-1116.

52. Терешина В.М., Меморская А.С., Кочкина Г.А., Феофилова Е.П. // Микробиология 2002 - т. 71. - №61 - с. 794-800.

53. Умнова Э.Д., Воробьева Л.И. // Биологические науки. 1992, №3. - с. 122126.

54. Феофилова Е.П. Пигменты микроорганизмов. // Москва, Наука. 1974. -218 С.

55. Феофилова Е.П., Арбузов В.А. // Микробиология. 1975. Т. 44. Вып. 3. С. 395-398.

56. Феофилова Е.П., Фатеева Т.В., Арбузов В.А. //Микробиология. 1976. Т. 45. Вып. 1.С. 169-171.

57. Феофилова Е.П. Закономерности образования пигментов некоторыми микроорганизмами в связи с процессами вторичного метаболизма и

58. Феофилова Е.П., Ушанова А.Е., Иванова Г.В. // Микробиология. 1982. Т. 51. Вып. 2. с. 267-271.

59. Феофилова Е.П., Михайлова М.В., Розанцев Э.Г. Способ получения ликопина. // А.С. № 1080479. Б.И. 1983. № 5.

60. Феофилова Е.П., Волохова М.В., Величко Б.А., Карпов A.M. // Биотехнология. -1988.-Т.4, N6.-C. 719-721.

61. Феофилова Е.П., Михайлова М.В., Грязнова М.В., Горнова И.Б. // Докл. АН СССР. 1989. Т. 307. № 1. С. 234.

62. Феофилова Е.П. Итоги науки и техники. // Сер. Микробиология. 1991.

63. Феофилова Е.П. //Микробиология. 1992. Т. 62. Вып. 5. С. 741-755.

64. Феофилова Е.П. // Прикл. биохимия и микробиол. 1994. - Т.30, N2. -С.181-195.

65. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Ивакин А.Ф., Киселева А.И. // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. т.ЗО, №3. - с.415-419.

66. Феофилова Е.П., Бехтерева М.Н. // Микробиология. 1995. Т. 45. Вып. 3. С. 557-559.

67. Феофилова Е. П., Терешина В.М., Меморская А.С. // Микробиология, 1995, том 64, №6, с.734-740.

68. Abbey M., P. J. Nestel, and P. A. Baghurst. Antioxidant vitamins and low-density -lipoprotein oxidation. // Am. J. Clin. Nutr. 1993. - V.58, N4. - P. 525 -532.

69. Agarwal S., Rao A.V. Tomato lycopene and low-density lipoprotein oxidation: a human dietary intervention study. Lipids 1998; 33:981-984.

70. Barrett, В. M., Sowell, A., Gunter E., Wang M. Potential role of ascorbic acid and beta-carotene in the prevention of preterm rupture of fetal membranes. // Int. J. Vitam. Nutr. Res. 1994. - V.64, N3. - P. 192 - 197.

71. Basage H.S., // Biochemical aspects of free radicals 1990 - V.68 - P. 989-998

72. Bejarano E.R., Avalos J., Lipson E.D., Cerda-Olmedo E. // Planta. 1990. V. 183. N 1/2. P.l-3.

73. Biacs P.A., Daood H.G., Pavisa A., Hajdu F. // J. Agric. Chem. 1989. V.37. N2. P. 350-353.

74. Bishayee A., Sarkar A., Chatterjee M. // J.Etnnopnarmacol. -1995. V.7, N47(2).-P.69 -74.

75. Blakeslee A.F. //Proc. Amer. Acad. Arts Sci. 1904. V. 40. N.l. P. 205-319.

76. Bonssida S„ Vonshak A. //Plant Cell Physiol. 1991. V. 32. № 7. P. 1077-1082.

77. Brady W.E., Mares-Perlman J.A., Bowen P., Stacewicz-Sapuntzakis M. Human serum carotenoid concentrations are related to physiologic and lifestyle factors. // J. Nutr. 1996. v.3. - p. 126-128.

78. Britton G. et al. The carotenoids of rhodomicrobium vanniellii and the effect of diphenylamine on the carotenoid composition. // Phytochemistry, 1975, 14, p. 2427-2433.

79. Britton G. Structure and properties of carotenoids in relation to function. FASEB J. 1995; 9.

80. Bullock J.D., Drake D., Winstanley D.J. // Phytochemistry. 1972. V. 11. № 6. P. 2011-2018. I

81. Bullock J.D., Jones B.E., Winskill I.C.S. // Chem. Communs. 1974. P. 708709.

82. Brush A.H. // See Ref. 1981. V.5. N3. P.539-562.

83. Burton G.W.// J. Nutr. 1989. V. 119. N1. P. 109-111.

84. Cagliotti L., Cainelli G., Camerino B. et al. // Chem. Ind. (Milan). 1964. V. 46. P. 1-5.

85. Cegler A. // Advances Appl. Microbiol. 1965. V. 7. № I. P. 1-34.

86. Cerda-Olmedo E.F. Biotechnology of Vitamines, Pigments and Growth Factors Chap. 3. // Ed. andamme E.J. L.: Elsevier Appl. Sci., 1989. P. 27-42.

87. Chapman K., Prabhudesai M., Erdman J.W. Effects of ethanol and carbon tetrachloride upone vitamin A status of rats. //Alcoh. Clin, and Exper. Res.- 1992. -V.16, N4.-P. 764-768.

88. Clinton S.K., Libby P. Citokines and Growth factors in aterogenesis. // Arch. Pathol. Lab. Med., 1992, 116.

89. Clinton S.K, Emenhiser C, Schwartz SJ, Bostwick DG, Williams AW, Moore BJ, Erdman JW Jr. Cis-trans lycopene isomers, carotenoids, and retinol in the human prostate. // Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 1996; 5:823833.

90. Cogdell R.J. // Pure Appl. Chem. V.57. N5. P.723-728.

91. Crozier G.F., Wilkie D.W. // Compar. Biochem. and Physiol. 1966. V.18. N4. P.801-804.

92. Davenport J.B., Johbson A.R. Biochemistry and methodology of lipids // Eds. Johnston A.B., Davenport J.R. N.Y.: Wiley Interpress, 1971. 318 p.

93. Doi S., Watchabe M., Yoshimura H. // Arch. Microbiol. 1988. V. 149. № 6. P. 507.

94. Esterbauer, H., Striegl, G., Puhl, H., Rotheneder, M. Continuous monitoring of in vitro oxidation of human low density lipoprotein. II Free Radic. Res. Commun, 1989. -V.6, N 3. - P. 67 - 75.

95. Finkelstein Mark, Chien-Chang Huang. Blakeslea trispora mated culture capable of increased beta-carotene production. // U.S. Patent, № 5,422,247, Jun 6, 1995.

96. Folch J., Ascoli J., Meath J.//J. Biol. chem. 1951 - V. 191.-p. 833-835.

97. Foppen F.H. Tabes for the identification of carotenoid pigments // Chromatograph. Rev. -1971 v. 14 - p. 133-298.

98. Ford et al. Diabetes mellitus and serum carotenoids findings from the Third National and Nutrition Examination Survey. И Am J Epidemiol 1999, 149:168176.

99. Frenkel К. II Phannac. Then 1992 - V.53 - P. 127-166.

100. Fund WCR. Food, nutrition and the prevention of cancer: a global perspective. // Washington, DC: Amerrican Institute for Cancer Research, 1987.

101. Furshman В., Elis A., Aviram M. Hypocholesterolemic effects of lycopene and beta-carotene is related to suppression of cholestrol synthesis and augmentation of LDL receptor activity in macrophages. // Biochem Biophis Res Commun 1997, 233.1 irt

102. Gainer J.L., et al. 11 Experientia 1992 - V.31 - №5 - P.548-549.

103. Gilligan D.M., Sack M.N., Guetta V. et al. Effect of antioxidant vitamins on low density lipoprotein oxidation and impaired endothelium-dependent vasodalution in patients with hypercholesterolemia. //. Am. Coll. Cardiol. 1994. -V.24.N7. -P.I611-1617.

104. Giovannucci E, Ascherio A, Rimm EB, et al. // Journal of the National Cancer Institute 1995; 87:1767-1776.

105. Gogek C.J. // J. Agric. Food Chem. V. 16. № 5. P. 730-735.

106. Gooday G.W., Adams D.J. // Advances Microbiol. Physiol. 1993. V.34. P.69-134.

107. Goodruch J., Barker C., Phelps R.J. // Chem. Educ., 1993, V70, №6, p. 158.

108. Goodwin T.W. Carotenoids in fungi and non-photosynthetic bacteria. // Progr. Industr. Microbiol., 1972, 11, p.29-88.

109. Goodwin T.W. //Annual. Rev. Nutr. 1986. V.6. P. 273-297.

110. Gradelet S., Astorg P., Leclerc J., Chevalier L., Vernevaut M.F., Sies M.H. Effects of canthaxanthin, astaxanthin, lycopene and lutein on liver xenobioticmetabolizing enzymes in the rat. //Xenobiotica. 1996. - V.26, N1. - P. 49 - 63.

111. Gregoriadis G. Engineering liposomes for drug discovery: progress and problems // ТШЕСН. V.13. P.527-537.

112. Hallivel В., Gutteridge J., Free radicals in biology and medicine // Oxford: Clarendon Press 1986.

113. Hallivel В., Gutteridge J., I IFEBS Lett. 1992 V.307 - P. 108-112

114. Harding R.W., Shropshire W. // Annual Rev. Plant Physiol. 1980. V.31. P.217-238.

115. Harum-Or-Rashid Md, Kato Fumio, Murata Akira Koudo Michio // Biosc., Biotechnol. and Biochem. 1993. - 57, N6.

116. Hennekens C.H. Antioxidants and cardiovascular disease: the physicians health study. // Sec. Inter. Conf. "Antioxidant Vitamins and Beta-Carotene in Disease Prevention". Berlin, 1994. Programm and Abstracts. P. 20.

117. Hoffman R.M., Garewal H.S. Antioxidants and the prevention of coronary heart disease. // Arch.Intern. Med. 1995. - V.155.N3. - P.241-246.

118. Hsing A. W., Comstock G.W., Abbey H., Polk B.R. Serologic precursors of cancer: retinol, carotenoids and tocopherol and risk of prostate cancer. // J. Natr. Cancer Inst. 1990, 82.

119. Hsu W.I., Poling S.M., Yokoyama H. // Phytochemistry. 1974. V. 13. № 2. P. 415-419.

120. Isler O. Histoiy and industrial application of carotenoids and vitamin A (1) // Pure& Appl. Chem. 1979. - V.51, - P. 447 - 462.

121. Iwama Y., Nishimura S., Katoh K., Yamagami S., Sano K., Ohta H., Tamaki, T. Lower plasma beta-crotene levels correlate with severe coronary artery disease in patients with normal TC. // Atherosclerosis. 1994. - V.109, N1-2. - P. 2627.

122. Jensen S.L., Jensen A. In: " Progress in the chemistry of fats and other lipids" // Pergamon Press, 1965, - V.8, Part.2 , - P. 129.

123. Jha H. C., von Recklinghausen G., Fritz Z. Inhibition of in vitro microsomal lipid peroxidation by isoflavanoids. // Biochem. Pharmacol.- 1985. V.34, N9. -P. 1367- 1369.

124. Kabbe H.-J., Eiter K., Truscheit E. Verfahren zur herstellung von lycopin. // Patentschrift 1168890. Bundersrepublik Deutschland, 12 November 1964.

125. Kanetsky PA, Gammon MD, Mandelblatt J, Zhang ZF, Ramsey E, Dnistrian A, Norkus EP, Wright TCJr. Dietary intake and blood levels of lycopene: association with cervical dysplasia among non-hispanic, black women. // Nutr. Cancer.-31:31-40, 1998.

126. Kapitanov A.B., Pimenov A.M. Comparative analisis of lycopene radioprotective action. // Inter. Symp. on Antioxidants and Disease Prevention. -Stockholm, Sweden, 1993, Abstracts. P.99.

127. Khachik F., Beecher G.R., Smith J.C. Lutein, lycopene and their oxidative metabolites in chemoprevention of cancer. // Cell Biochem. 1995. - V.22. -P.236-246.

128. Kienzle F. The technical synthesis of carotenoids. // Pure & Appl. Chem. -1976. V.47, N2/3.-P. 183- 190.

129. Kim H. Carotenoids protect cultured rat hepatocytcs from injury caused by carbon tetrachloride.// Int. J. Biochem. Cell Biol. 1995. - V.27.N12. - P. 13031309.

130. Knock D.L., Bosnia A., Seifert W.F. Role of vitamine A in liver fibrosis. // J. Gastroenterol. Hepatol. 1995. - V. 1. - P. 547 - 549.

131. Kohlmeier L. Epidemiologic evidence of a role of carotenoids in cardiovascular disease prevention. // Sec. Inter. Conf. "Antioxidant Vitamins and Beta-Carotene in Disease Prevention". Berlin, Germany, 1994. Programm and Abstracts, P. 19.

132. Lampila L.E., Wallen S.E., liullerman L.B. // Mycopathologia. 1985. V. 90. № 1. P. 65-80.

133. Levy J, Bosin E, Feldman B, Giat Y, Miinster, Danilenko M, Sharoni Y. Lycopene is more potent inhibitor of human cancer cell proliferation than either a-carotene or p-carotene. // Nutr Cancer 1995; 24:257-266

134. Levy Y., Nseir W., Boulos M., Omansky Т., Ben-Amotz, A., Cohen A. Relationship between plasma antioxidants and coronary artery disease. // Harefuah. 1994. -V.I 27, N5-6.-P. 154-157.

135. Liaaen-Jensen S., Andrewes A.G. Microbial carotenoids. // Annu. Rev. Microbiol., 1972, 26, p. 225-248.

136. Linseisen J., Hoffmann J., Riedl J., Wolfram G. Effect of a single dose of antioxidant mixture (vitamin E, carotenoids) on the formation of cholesterol oxidation products after ex vivo LDL oxidation in humans. // Eur. J. Med. Res. 1998; 3:5-12.

137. Longo E., Suiro C., Velazquez J.B., Calo P., Cansado J., Villa T.G. // BFE: Biotech. Forum Eur. 1992, - 9, N9, - p.565-567.

138. Mascio P.D., Kaiser S., Sies H. Lycopene is the most effectivebiological carotenoid singlet oxygen quencher. // Arch Biochem. Biophys.1989, V 264.

139. Mathews-Roth M.M., Welankiwar, S„ Sehgal, P.K., Lausen, N.C.G., Russett, M.,Krinsky, N.I. Distribution of I4C.-canthaxanthin and [I4C]-lycopene in rats and monkeys.//J. of Nutr. 1990. - V.I20, N 10. - P. 1205- 1213.

140. Mills PK, Beeson WL, Phillips RL, Fraser GE. Cohort study of diet, lifestyle and prostate cancer in Adventist men. // Cancer 1989; 64:598-604.

141. Mehta В .J., E.Cerda-Olmedo. Mutants of carotene production in Blakeslea trispora. // Appl Microbiol Biotechnol, 1995, № 42, p.836-838.

142. Monaghan B.R., Achmitt C.O. // Biol. Chem. 1932. V. 96. N1. P. 387-395.

143. Moreno F.S., Rossiello M.R., Manjeshwar S., Nath R., Rao P.M., Rajalakshmi S., SarmaD.S.R. Effect of (3-carotene on the expression of 3-hydroxy 3-methylglutaryl coenzyme A reductase in rat liver. // Cancer Lett. 1995. - V.96, N2. - P. 201 -208.

144. Nagasawa H, Mitamura T, Sakamoto S, Yamamoto K. Effects of lycopene on spontaneous mammary tumor development in SHN virgin mice. // Anticancer Res 1995; 15:1173-1178.

145. Nelis M.J., De Leenheer A.P. // App. Biotechnol., 1991, v.70. p.181-191.

146. Nelis M.J. // J. Appl. Bacterid. 1992. V. 70. - p. 116-122.

147. Nonish, Alan E.; Jackson, Rodney Т.; Sharpe, Susan J.; Skeaff, C. Murray, Prostate Cancer and Dietary Carotenoids. // American Journal of Epidemiology. 151(2): 119-123, January 15, 2000

148. Okuzumi J., Nishino H., Murakoshi M., Yamane Т., Kitao Y., Inagake M., Ohya K., Yoshida M., Takahashi T. Palm carotene inhibits tumorpromoting activity of bile acids and intestinal carcinogenesis. // Oncology. 1992. - V.49, N6. -P. 492-497.

149. Ong S.S.H., Tee E.S. Natural sources of carotenoids from plants and oils. // Methods Enzymol. 1992, 213.

150. Parthasarathy S. Mechanisms by which dietary antioxidants may prevent cardiovascular diseases. // J Medicinal Food 1998; 1:45-51.

151. Poppel G., Goldbohm A. Epidemiological evidence for cancer prevention by beta-carotene. // Sec. Inter. Conf. "Antioxidant Vitamins and Beta-Carotene in Disease Prevention". Berlin, Germany. 1994. Programm and Abstracts. P.24.

152. Potishman N., Herrero R., Brinton L.A., et al. A casecontrol stydy of nutrient status and invasive cervical cancer. // Am J Epidemiol 1991, 134.

153. Potishman N., Hoover R.N., Brinton L.A., et al. The relations between cervical cancer and serological markers of nutritional status. // Nutr cancer 1994, 21.

154. Prabhakar G., Raju D.C., Satyanarayana M. // Bioprocess Ind. 1993. - 8, N5-6.-p. 247-249.

155. Rau W. // Pure Appl. Chem. 1976. V.47. N2/3. P. 223-276.

156. Rau W. Plant Pigments / Ed. Goodwin T.W. (Function of carotenoids) // N.Y.: Acad. Press, 1988. P.231-252.

157. Ross R. The patogenesis of atheroscrosis: a perspective for the 90s. // Nature, 1993, 362.

158. Schmidt K., Truper H.G. Carotenoid composition in the genus Ectothiorhodospira Pelsh. // Arch. Microbiol., 1971, 80, N1, p. 38-42.

159. Schmitz H.H., Poor C.L., Wellman R.B., Erdtrmn J.W. Concentrations of selected carotenoids and vitamin A in human liver, kidney and lung tissue. // J.of Nutr. -I991.-V.121.N 10.-P. 1613- 1621.

160. Sebek O., Jager H. // Abstr. 148th Meet. Amer. Chem. Soc. 1964. P. 90.

161. Sharoni Y, Giron E, Rise M, Levy J. Effects of lycopene-enriched tomato oleoresin on 7,12-dimethyl-benz(a)anthracene-induced rat mammary tumors. // Cancer Detect Preven 1997; 21:118-123.

162. Sims Gerald K., O'Loughlin, Edward J. // Appl. and Environ. Microbiol. -1992.-58, N.lO.-c. 3423-3425.

163. Singh R.B., Niaz M.A., Ghosh S., Ahmad S., Begum R„ Ononchi Z., Kummerow F A . Effect of antioxidant vitamins and diets on hyperlipidemia and development of atherosclerosis in rabbits. // Atherosclerosis. 1994. - V. 109, N 1 -2. -P.59.

164. Singh R.B., Niaz M.A., Sharma J.P., Kumar R., Bishnoi I., Begom R. Plasma levels of antioxidant and oxidative stress in patients with acute myocardial infarction. // Acta Cardiol. 1994. - V.49, N 5. - P. 441 - 452.

165. Steinberg D., Parthasarathy S., Care Т.Е., Khoo J.C., Witztum J.L. Beyond cholesterol: Modifications of low-density lipoprotein that increases its atherogenicity. // N Engl J Med 1989: 320:915-924.

166. Sossar O., Shapp B.J. Microbiology of extreme environments and its potential for biotechnology / Eds Du Costa M.S., Duarte I.C., Williams R.A. // FEMS Sympos. N 49. 429 p.

167. Stonger S.W., Payne D.K., // Pharmacotherapy 1992 -V.26 - P. 1554-1581.

168. Street D.A., Constock G.W., Skeld R.M., et al. Serum antioxidants and myocardial infarction. Are low levels of carotenoids and a-tocopherol risk factors for myocardial infarction? // Circulation 1994, 90.

169. Sutter R.P. Eucariotic microbes as model developmental systems. // Eds OT)ay D.H., Norgen P.A. 1977. P. 252-268.

170. Taylor A. Epidemiological, animal and biochemical data relating antioxidants and cataracts. // Sec. Inter. Conf. "Antioxidant Vitamins and Beta-Carotene in Disease Prevention". Berlin, Germany, 1994. Programm and Abstracts, P. 32.

171. Thomas D.M., Harris R.C., Kirk Т.О., Goodwin T.W. // Phytochemistry. 1967. V. 6. №2. P. 361-366.

172. Todd S., Woodward M., Bolton-Smith C. An investigation of the relationship between antioxidant vitamin intake and coronary heart disease in men and women using logistic regression analysis. // J. Clin. Epidemiol. 1995. - V.48, N 2. - P. 307 -316.

173. Tsai A.C., Mazeedi H.A., Mameesh M.S. Dietary beta-carotene reduces serum lipid concentrations in spontaneously hypertensive rats fed a vitamin A-fortified and cholesterol-enriched diet. // J.Nutr.- 1992. V.122.N9.- P. 17681771.

174. Weedon B.C.L. Chemistry of the carotenoids. // In: Chemistry and biochemistry of plant pigments. Ed. by Ooodwin T.W., London-N. Y., Acad. Press. 1965.-P. 75- 125.

175. Yamano S., Ishii Т., Nakasawa M. Metabolic engineering for production of P-carotene and lycopene in Saccharomyces cerevisiae. // Biosci. Biotech. Biochem. -1994. -V. 58, N6.-P. 1112-1114.

176. ФГУП «ГОСШШСИШТЕЗБЕЛОК» 109004, Москва, Б.Коммунмстичссюш уи, 27 тел. (095)912-«9-«0фшк. (095)911-49-23 Е-таШ DcfolU&rulcoWni1. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ

177. Аттестат аккредитации Госсталдарта РФ Xt РОСС RU. 0001.511345 от 18 июля 2001г.тел. (095) 912-62-841.lauMCiiomiiiiic: ликопин кристаллический

178. Количество продукции Ю0г Дат выпуски октябрь 2003 гп/п 2. j. Н а и мс н о ва ш i с п о казател ей Норма показателя по j 1 юрмати В1 юй докумен та-цни Результат анализа 1

179. Внешний вид кристаллический порошок соответствует11вст от темно-красного до фиолетово-красного соответствует

180. Запах слабый, специфический соответствует

181. Максимумы спектра погло1цеиия в бензоле, им 455 ±4 487± 4 454; 487 ) 1

182. Максимумы спектра поглощения в хлороформе, нм 456± 4 485±4 520± 4 1 '455; 481; 521 |вГ~ Массовая доля ликопина, % не менее 90,0 92,0 ;

183. Массовая доля влаги, % не более 1,0 0.5

184. Испытание на чистоту отсутствие хлороргани-ческих растворителей соответствует J

185. Наличие тяжелых металлов, % не более отсутствие соответствует

186. Наличие посторонней микрофлоры, КОЕ / г отсутствие , соответствуети. Острая токсичность, ГОСТ 28178-89 отсутствие соответствует

187. Зав.ан&питическоЙ лабораторией ФГУП «ГосНИИсннтезбелок»1. ЛАЗюкова