автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА ОСНОВЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ПОЛУЧЕННОГО МУТАНТА ASP. FOETIDUS M-45

сЯ-Ъчсяь >;

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО Н СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РСФСР

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

ХАз

Экз. ЛЬ

На правах рукописи

Для служебного пользования

^ ^ УДК: 663.15(043.3)

Павлова Наталья Михайловна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА ОСНОВЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ПОЛУЧЕННОГО МУТАНТА ASP. FOET1DUS М-45

Специальность 05.18.10— Технология витаминных, ферментных и белковых препаратов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва — 1982

Работа выполнена но Всесоюзном научно-исследовательском биотехническом институте.

Научные руководители; доктор биологических паук, профессор С, А, Коновалов, доктор технических паук, профессор К- А, Калунпнц

Официальные оппоненты: доктор технических паук, профессор Б. А. Устинкиков, кандидат технических паук, доцент М, В. Гернет

Ведущее предприятие: Вышне-Волоцкий завод ферментных препаратов.

Защита состоится « . 1982 г. в

часов па заседании специализированного Совета № К 063.51.04 в Московском ордена Трудового Красного Знамени технологическом институте пищевой промышленности по адресу: 125080, Москва А-80, Волоколамское шоссе, 11.

Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по этому адресу на имя ученого секретаря специализированного Совета № К 063.51.04.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МТИПП. Автореферат разослан -к 2-?- » . . 1982 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат технических наук

Е. В. Агапова

ОВДАЯ 1АРАКГ£ШСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из путей интенсификации производства является использование высокоактивных штаммов продуцентов- Применение нового штамма продуцента, обладагщего способностью к сверхсинтезу необходимого фермента шел груши ферментов позволяет увеличить мощность предприятия без дополнительных капитальных вложений. Кроме того, применение нового высокопродуктивного шташа дает возможность улучшить все основные показатели производства: увеличить выход готовой продукции с единивд сырья, снизить расход вода, пара, электроэнергии, рабочей силы и, как следствие, снизить себестоимость готовой продукции.

В решениях ХШ! съезда КШС и в основных направлениях экономического и социального развития народного хозяйства СССР на 1981 -1935 гг. и на период до 1990 г. предусматривается значительное увеличение производства ферментов, создание высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, разработка химико-технологических процессов получения биологически активных веществ с заданными свойствами при использовании недефицитного сырья.

Б связи с этим исследования, связанные с созданием новых высокопродуктивных штаммов,* с разработкой технологии культивирования и выделения ферментов являются актуальными.

Цель работы заключалась в получении высокопродуктивного штамма ¿эр, roetldue - продуцента неполитических ферментов и разработке технологии пектолитических ферментов.на основе полученного мутанта.

5 задачу исследований входило выявить наиболее эффективные мутагенные факторы, вызывающие макс "калыгое накопление положительных мутаций; получение штаммов гилерпроду^енто? пектолитических ферментов, изучение морфслого-биохимическкх и куяьтуральных свойств продуцента, исследование потребности питания и под-

1 имени К.А. Тимирязева | j ЦНБ имени И.И. Железное» i

?г"т~%т&т I

бор оптимальной питательной среды, обеспечивающей активный синтез пектоштических ферментов в условиях глубинного культивирования; разработка условий культивирования и выделения ферментного препарата, изучение его свойств и условий действия.

Научная новизна работа. Проведено изучение индуцированной химическими и физическими мутагенами изменчивости штамма Aspergillus foetidue no признаку образования пектолитических ферментов. Выделен на основе усовершенствованного многоступенчатого метода селекции новый штамм — гиперпродуцент пектолитических ферментов, в настоящее время самый продуктивный в СССР. На ношй штамм получено авторское свидетельство X 5380^.

Установлено, что помимо сверхсинтеза ферментов пектолитическо-го комплекса, полученный штамм синтезирует активный комплекс целлю-лслиткческих ферментов. Изучено влияние различных условий культивирования на способность штамма регулировать биосинтез отдельных ферментов неполитического и целлюлолиткческого комплекса.

Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований впервые разработана комплексная технологическая схема получения певтолитических ферментных препаратов с замкнутым никлом, Разрайотавнай способ ферментативной обработки свекловичного жома и СОЛОДОВЫХ ростков ПОЗВОЛИЛ, ПОМИМО интенсификации процессов биосинтеза ферментов, сократить расходы свекловичного жома и солодовых ростков на приготовление питательной среда. Предложенный способ получения питательной среди с использование« для гидролиза свекловичного жома и солодовых ростков ферментов, содериащихся в ультрафильтрате, позволяет снизить расход воды аа технические нужды. Внедрение технологии пектолитических ферментов на основе нового штамла Asp. foetldua м_45 позволило увеличить шход ферментного препарата с 10 условных кг до GO условных кг о I м3 глубинной культуры.

Экономический эффект от использования штамма составил в 1976-

-Т979 гг. 2.064.409,6 рублей только на Приволжском биохимической заводе. Полученнне данные до составу ферментативного комплекса пр-парато? поз волям рекомендовать его дня гидролиза. подисахаридного сырья в различных отраслях пищевой промышленности и. сельском хозяйстве« Использование препарата Пектофоетидин ГІОх для. получения гор-мопальшлс препаратов из лекарственных растений, увеличивает выход сапогекинов на 15-37$.

Апробация работы. Результата исследований били, представлены и обсуждены на Третьей Всесоюзной конференции по генетическим основам селекции промышленных микроорганизмов (Минск, 1875 г.), на Втором Всесоюзно!.! совещании по ферментам микроорганизмов (Минск, 1378 г.), на 71 съезде ВМО (Рига, 1980 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано- 8 работ, получено два авторских свидетельства. - —-——:— - ——

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 198 страницах машинописного'текста, содержит 19 рисунков и "44 таблиц. • Диссертация состоит из введения, обзора литератур*,- экспери-- ментальной части; выводов, списка цитируемой литератугн (включавшего 246 накыенований отечественной литературы и 113'ииостранных работ) и приложение. " '* - ' '*' '

;;:. НАТЕИШШ И МЕТОДУ ТОСдаОВАНЙЙ. : Объектом исследования служил штамм. полу-

ченный нагли в лаборатории ^ микробных продуцентові ферментов ■ института "ВПИИбиотеуника?. ■ методом ступенчатого. окіора по цризнаку фер*- _ _ментообразования,.ч,^ . .. .. ,.........

Выделение активных вариантов проводили.-высевом, обработанной химическими мутагенами и УФ^лучами суспензии юнндий на чашки» о.. -„ агаром. В результате многочисленных проверок отбирали варианты, стабильно сохраняющие высокий уровень биосинтеза яектолитических-ферментов. Культивирование осуществляли в^конических колбах емкое-

ты> 750 мл на качалке при 180-200 об/мин в течение 66-72 часов при температуре 2&-30°С, В колбу помешали 100 мл питательной среды (.%) i свекловичный жом - 2; вытяжка из солодовых ростков - 10,0; С мнг()г504 - 1,0; kh2so4 - ОД; Meso* - 0,05; рН питательной среды - 3,5. Посевным материалом дня опытно-промышленных испытаний штамма служил активированный мицелий, выращенный в поверхностных условиях ва среде, состоящей {%): отруби - 60; шш свекловичный -- 30; солодовые ростки - 10.* Производственные опыты по культивированию проводшш в ферментерах емкостью I м3 и 10 м3 на Олайнен-ком заводе "Химреактив", 10 м3 на Приволжском биохимическом заводе и 63 м3 на Ладыжинском заводе ферментных препаратов. -

• Количество йиошссы определяли общепринятым весошм методом. Интенсивность кояидие образования определяли после сшва культур! со среда и подсчета в камере Гсряева. Ферментные препарата в лабораторных и производственных условиях получали из фильтрата культу-ральной жидкости путем осаждения органическими растворителями {ацетон, этанол), методом ультрафильтрации и высушивание« кулъгураль-ной жидкости шш фильтрата из куяьтураяьной жадности на распылительной сушилке.

В фильтрате культуральной жидкости и полученных препаратах определяли активность ферментов пектолитического комплекса, целлго-лолитического кощлекса, гемицеллюлазы, кислой протеазы, -глюка-назы. Эвдо-полигалактуронаэную (эндо-ПГ) активность измеряли виоко-зиштрическим методом с использованием вискозиметра Оствальда (ЛЭДпиц и др., 1974). Активность икзо-полигалактуроназы (экзо-ПГ) определяли Йодометрическим титрованием (Корчагина, Румщдева, 1976). При определения пектинэстеразной (ПЭ) активности использовали метод лотенциометрического титрования, основанный на определении освободившихся карбоксильных групп (Лифпдгц, 1969). Общую пектолнтичес-кут активность (ПКС) определяли интерферометрическим методом (Кор-

чагша, рухлядева, 1973, ГОСТ 20264,3-74). Активность эвдо - 1,4 -- jb-глюканаз вискоэиметрическдм методом (Родионова и др., 1976). Определение целлобпазной активности проводили глюкозооксвдазвым методом с использованием ферроцианнда калия (Щербухина и др., 1970). Активность целлюлазы (Cj) методом Mandela, *«Ъег (1969), Восстанавливающие сахара во всех опытах определяли о помощью методов Шомоди ÍSoaogui , 1945, 1952), Нельсона {Не1sen , 1944). Содержание белка определяли методом Лоури и др. ( Lo wry «t al. , 1951). Содержание пектиновых веществ определяли карбозольшм методом (Арасимович и др., 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ I. Измеячитюсть микроскопического гриба Аар. footldUa poj¡ действием мутагенов по признаку образования пекто-литдческис ферментов На первой ступени селекции исходный штамм Asp. foetiaue был рассеян на твердую агаризованную сред? и из рассева выделено несколько вариантов с повышенным синтезом ферментообразовання. Вариант 109, превышающий по активности пектиназы исходный штамм на 25,8$, послужил исходным материалом для последуицей селекционной работы.

с ,

Обработку суспензии конидий, содержащей 2*10° клеток г I ил, проводшш мутагенами в следующих концентрациях; для ватрозоштнл-мочевины (НМЛ) - 0,1%, для нитрозодатилбиурета (НМБ) - 0,C5g, 0,075^. Экспозиция обработки составляла от I до 4 часов. После обработки било отобрано 450 вариантов, у которых проводили проверку на биосинтез пектолитическях ферментов в глубинных условиях. На этом этапе отбора выделен вариант 201, превышающий по общей пекто-литнческой активности исходный штамм на 230Í,

На второй ступени селекции были использованы мутагены: нитро-

зометилмочевины - 0,1%; 0,25 я нитрозовлметилмочевиш"(ВДШ) - ОД; 0,2

1

"йша отмечена коррелятивная зависимость между дозой воздействия мутагена и возникновением "штос" вариантов. ' Смена; мутагенов на второй ступени селекции оказала стиыулирупцее действие на возникновение плюс вариантов. Так, при воздействии ЩШ на конидии варианта Aap. foetldue 201, полученного от обработки исходного шташа;0,1£ раствором НИМ, удалось шдвлять активный вариант а®р. foetldua 124, превлпапций по общей пектолитиче ской активности исходный штаиы в 4,8 раза. г' ;

На третьей ступени селекшш получен мутант Авр. foetldus Ы-45 индуцированный ТЗчлучаыи. Этот вариант отличается от предыдущего повышенное способностью к образовании конидий, более интенсивной скоростьв роста. Активность пектиназы (ИКС) у этого варианта составила 2,10 ед/мм, что на 39,1? превышала активность предыдущего мутанта.

■ На четвертой ступени отбора изучали влияние комбинированного действия нитрозоэтилмочевины (ВЭЫ) и УФ-лучеЯ. На данном этапе отбора бнл отмечен сииергидный эффект совместного воздействия мутагенов различной природа. Выделено значительное количество вариантов с повышенной способностью'к образованию пектолитическпг ферментов в глубинных условшпсг Вариант ¿»p. foetia»» -",'М-45, полуденный на четвертой с^еш сёлекции;: прешшал по ПКС исходный: шташ в 7,3 раза. ' ■

; " Такім образом,* в результате 4-х ступеней селекции- из 3379 вариантов был отобрал'штамм Авр. fo«tidoa 1М5 с повышенным уровнем биосинтеза пектолитических ферментов (таблица I).

Микроскопический гриб isp. roetiaue М-45 значительно отличается. от исходной культуры как со морфологическим, так и по куль-

Тайшща 1

Пектолитическал активность мутантов, шделешшх на четырех ступенях селекции Хер. f«#tldne

0 Исходный. 0,39 - - 100 100

I 201 - 0,90 НШ 230,7 230.7 1200

2 124 1,54 НД№1 167,7 387,1 П79

3* М-52 2,10 ГФ-лу-чаыи 139,1 538,5 520

4 М-45 2,86 ВЭЫ+УФ-лучаш 136,2 733,3 480

туралъшм признакам.

Исследования биохимических свойств полученного шташа показали, что помимо активного синтеза фбравятов, вхпдащнх в пвЕтолзгтн— ческий комплекс, он обладает также пошшешоЗ способностью к био-отнтезу ферментов неллюдолитического комплекса, гемнцемюлааы, £ --глгоканазы а кислотоустойчивой протеазы (таблица 2).

Тайлипа 2

Характеристика комплекса щфохитячбсЕЕХ фврлятов, синтезируемых исходным и мутантшы штампами Asp, foetldue

Культура j ' . . . - Активность фехадонтов, сд/мл _j ИКС j ПЭ j Щ j cx jc^ |g jgogo-

Исходная 0,39 18,6 0,5S 0,39 0,25 2,0 0,5 22,6

культура

Мутант М-45 2,86 128,5 12,9 1,7. 19,6 6,5 1,4

Для интенсификации биосинтеза ферментов необходимо изучить зависимость их образования от состава питательной среды и условий культивирования. Выявление оптимальных условий биосинтеза ферментов позволит получать «ферментные препараты с максимальным выходом. 2. Исследование влияния состава питательной среды на биосинтез Фешентоа мттантом A»P« foetldwa М-45 Изучено влияние на образование пектолитических ферментов таких компонентов питательной среды, как углерод, азот и фосфор. На питательной среде Чапека-Докса, в составе которой в-качестве единственного источника углерода вводились такие сахара, как глюкоза, сахароза, галактоза, лактоза, отмечался интенсивный рост как исходного щтаыма, так и мутанта. Buto показано, что на этих средах мутант продуцирует пектолитическпе ферменты. На среде с лактозой, мальтозой, картофельным крахмалом и декстрином синтез ферментов значительно усиливается. При введении в питательную среду свекловичного пектина активность пектслитических ферментов, продуцируемых Asp. foetidua м-45 резко возрастает, интенсивность же роста при этом снижается.

Мутантный штамм Asp. roetidue . М-45 дает максимальную активность на среде с использованием в качестве основного источника углерода свекловичного кома (тайл.3).

Таблица 3

Влияние концентрации свекловичного кома на биосинтез пектолитнческих ферментов

J№ П/п Концентрация свекловичного аома Исходная культура . .. Мутантный штамм

активность ед/мл активность ед/мл

pH j ПКС 1 энг ПЭ pH j ПКС ¡зндо- i ПЭ • I И* I

I 2 3 | 4 5 6 } 7 | 8 | 9 j 10

I. I 4,0 0,10 12,70 0,06 3,9 0,7 100,5 0,9

- э -

Таблица 3 (продолжение)

і! • 2 і 4 і ^ і в І 7 і 6 ! ч ! 1 9 ! 10

2 4,1 СД5 19,76 0,20 4,3 2,8 119,0 1,04

3. 3 4,0 0,35 40,8 0,50 4,6 4,6 136,2 1,94

4. 4 3,9 0,40 42,8 0,31 4,1 4,2 130,5 1,76

5. 5 4,1 0,21 17,50 0,20 4,1 3,6 122,9 ІД

Нами было установлено, что при использовании в составе питательной среды гидролизатов свекловичного жома достигается интенсификация биосинтеза всего комплекса пекталитических ферментов, Лучшие результаты получены при комбинированном использовании целлвло-литических и пектолитвческих фермзнтов дои ферментативной обработки свекловичного жоиа, Интенсивный рост микроскопического гриба отмечается на перше сутки культивирования. На вторые сутки скорость роста заметно снижается и отмечается биосинтез ферментов, которые достигают своего максимума к 60-66 часу. Внесение в среду свекловичного жома, прошедшего глубокий ферментативный гидролиз комплексными препаратами, приводит к инициации роста микроскопического гриба, вследствие возрастания в среде легкоусвояемых источников углерода и снижения биосинтеза пектолитических ферментов.

Исследовано влияние минеральных и органических форм азота. Показано, что лучшим источником неорганического, азота для биосин-. теза мутантом пектолитических ферментов оказался сернокислый аммоний, Использование органических источников азота, таких как пептон, казеда, кукурузный экстракт, ЕВК и биомасса бактерий значительно стимулировало рост гриба и интенсифвцировадо ими биосинтез ферментов.

- 10 -

3. Разработка национального состава производственной питательной среди для глубинного культивирования Aap, foatldua М-45 Ва осново нзученжя физиологии мутантного штамма разработанная питательная среда с цслье отыскания оптимальних концентраций источников шгганяя быха оптиыиэарована с помощью методов математического планирования эксперимента. В основу планирования при отыскании оптимальных концентраций бил положен план полного факторного эксперимента по методу Бокса-Уиллсона. В серии опытов исследовали зависимость общей пектолитической активности культуры Aap. foetldus 11-45 от концентрации в среде ферментолизатов свекловичного жома и солодощі ростков, а такхе концентрации сульфата аммония и одноза-меценного фосфата кадия. КаздаЙ вариант опыта был поставлен в трех повторностях. При всех вариантах культура хорошо росла, масса сухого мпйлгст составляла 11-12,5 г/л, однако по общей пектолитической активности нп^ддаии сильное колебание: от 1,2 до 4,0 ед/ш. На основании даннях анализа пектолитической активности каждого опыта были рассчитаны коэффициенты регрессии и составлено уравнение регрессии, Путем подбора к оптимизации питательной сред» активность пек- -тсяхгачесЕкх феїмептов (ШЕ) увеличена на 81,5$.

4. Изучение влияния условий культивирования на биосинтез пеитолитяческюс Ферментов мутантом A»parfllllu» fo«tldo» М-45

Освячихехыюй особенностью изучаемого мутанта является то, \ что он по скорости рзема оперехает исходный штамм и что процессы активного роста я биосинтеза ферментов шктслитического комплекса разобщена во времени. Особенность!) иутанта является и то, что он обладает пониженным конидиеобразованием, в связи с чем вопрос подготовки посевного гатериала имеет особое значение, Изучение влияния возраста посевного штериада и условий его подготовки показало, что

посевной материал, выращенный, в поверхностных условиях на среде, состоящей из 60S пшеничных отрубей, 20i свекловичного zcua г 20? солод&вых ростков при температуре 35°С и начальной влажности сроду 60? дает значительное количество спор на 9-10 сутки культивирования (3,5 - I08 - 7 • I08).

Использование такого посевного материала в количестве 0,20,3? позволило получить максимальную активность пектиназ. Предварительная активация посевного материала в течение 12 часов в солевом растворе, содержаще« ионы кобальта и марганца, интенсифицировала процесс биосинтеза н сокращала продолжительность культивирования на 12 часов (таблица 4).

Таблица 4

Влияние времени активации посевного материала на пектолитическую активность 1лр. roetidu» IM5 (возраст - 10 суток; количество - 0,23£)

ДО j Время акти-ц/а {вацни, час. t I

ПКС, ел/ил

48

60

66

72

96

1.

2.

3.

4.

О 12

24 36

1,3 1,5 1,0 0,6

2,0

3.1

2.2 1,4

ЗД 3,9 2,4 1,8

3,4 3,6 2,8 2,0

2,9

3.0

3.1 1.0

Влияние исходного значения рН среда изучено в широком диапазоне от 3,0 до 9,0. Культявдрованна продуцента проводили при температуре 30°с в течение 120 часов. Исходное значение рН питательной среды корректировали 40^-ннм раствором гидроокиси штрих или opto-фосфорной кислотой. Результаты экспериментов представлены на рис.1.

Максимальный синтез пектолитическш: ферментов осуществляется

при культивировании продуцента ва питательной среде с исходный значением pil 3(5. Однако следует отметить, что ферменты синтезируются в диапазона pH от 3,0 до 5,5. При отклонении концентрации ионов водорода в ту ххн иную сторону от оптимального эваченхя происходит стющенже синтеза фехыентов во времени.

Црк изучении мжянвя температуры культивирования на биосинтез ферментов duo показано, что высокие показатели достигались при двф-^юрд ц гуртя и »цт до температуре режимах. Первые сутки культивирования продуцента осуществляли при температуре 35°С, затем температуру культивирования гдпяд до начиная с 48 часа температуру поддергивали ва уровне 28°С (рвс.2>. Тахо! способ культивирования мутанта обусловлен, прежде всего, тем, что одной кз его особенностей является разобщенность процесса роста в синтеза ферментов. Увеличение температур! в перше сутки куль титрования способствовало быстрому накоплению биомассы, что положительно сказывалось ва последующей синтезе ферментов.

Дня культивирования мутанта определена режида аэрации среда. Установлено, что "Д"™8"-™* синтез ферментов происходит при дифференцированных реххках аэрирования. В перше чаш роста питательная среда ве лимитируется по кислороду. Аэрацию мохво поддерживать ва уровне 0,3 объема воздуха ва один объем среда в минуту; в экспоненциальную фазу роста ютенсв^ивдруются все бхохимичеспе процессы в потребность в кислороде возрастает, поэтому степень аэрации мы увеличивал! до 0,6 объею ва объем среды в минуту. С 48 часа увеличение рятпдп воздуха до одного объема на объем среда в минуту ■ч | бжосжнтеэ пектолитических фериентов.

Учитывая это, ш рекомендовали проводить культивирование мутантного штаме ¿ар. foetidu» И-45 црк дифференцированных температур-ввг режимах ж аэрсздак, исходном значении pH питательной среды 3,5. В качество посевного материала рекомендуем активированный посевной

Pue.1 Влияние литопон кнсл0тг.:;тн

CPE MA bUDCtfHTEi ПЕКТШТИЧЕСШ Ol PME К ТО & .

ai 44 « » ce И'Ж; S-I'ive; i-l-J5Tu sa-í.

ThtiT

Рис. 2 6АЦЙКН£ ПМПЕМТУ?« КЇЛІТИІИГО6АНЦЙ ГРИБА J?¿A /0ЄІШІ Ы'4Ь M ДИНАМИКУ НАКОПЛЕНИЯ (ЩІІІ (ІШШТМЧЕЄМЛ

тнаноети.

матерках, ішученнкй поверхностным способом культивирования на среда* состоящей я» 60? otpjiei, 10$ солодошх ростков в ¡30$ свєкео-

ВЖЧНОГО |ИЯ,

5, Дидяминя, тюота - Авр. foetldu« М-45. потребления пдтатагьшгг веществ и биосинтеза ферментов Дія установления продолжительности выраидгеания микроскопического гриба Atp. foetidae Ц-45 с целью отыскания оптимального времени fffflM»1'" нехтоютических ферментов культивирование проводили в глубинных условиях ва оптимизированной питательной среде при оп-ткажышг условиях. Изменение основных показателей компоненетов питательное среды ■ скорость накопления пекгошхтических ферментов в даванию роста жультурц представтены ва рис. 3,4.

Энергичные рост мутанта в аксаонешшально! фазе сопровождается потреблением углерода х азота из питательной среда. К 42 часу культивирования в среде резко снижается содержанке пектиновых веществ. Ifroсинтез пектолитпеских ферментов у мутантного пташа происходят значительно интенсивнее ■ so активности превосходит исходный штамм. Активность ферментов обнаруживается ухе к 12 часу культивирования, х 24 часу она возрастает в ГО раз. Максимальная активность эндоЧГГ н экао-ПГ соответствует ЄО-66 часу. Маюигшяьная активность Ш достигает к 66 часу культивирования. Нараду с активнім синтезом ферментов пвктожитичвекого комплекса мутантный штамм синтезирует цел-лшшза, гемицеллшазу, J^ —глюканаэу и кислотоустойчивую протеазу (табл.5).

к

24 ri M

1—»-H, 2-»-»-е>«1 w—і; а-кииіщ А----№

Рис 3 Н^МИШіК «шгижрмин ПІНИїтН'МІ Went Ь яроиксе рыл)« iip jtetiduf H-4Î

0 « M «

i-S» OC; í * ИКС;}- flí; t-3»iW; в-Ійе««.чсе*)

Рис 4 ДИМЛММК* СНИТЕМ ПЕпслкТкчсекмі ♦Ермїнтоь it їй joettdub Í1-45

.-IS -

Таблица 5

Активность некоторых гидролитических ферментов в тргаяшг»;» роста культура А»р ■ foetldua М-45

pfl { Ферментативная активность кудътуралъной хидкости, конеч-і ед/на

ный 1

Время

культи-

вирова-

час.

-І _ ед/ии_

¡ШСС І зндо-Івкзо- І ИЗ І 5с ) Ст { С_ і _

І ПГ І ПГ i ї 1 І 1 глико-

1 І І І І І j t31"^

6 4,05 - - - - - -

12 3,35 0,05 0,12 0,14 0 0 0 0 0

24 3,60 0,27 1,83 2,6 0,05 o.qi 0,00 0,07 0,4

36 3,0 0,95 5,0 7,9 0,3 0,03 0,01 0,63 0,06

48 2,6 1,43 60,0 13,6 0,5 0,50 10,40 1,03 5,0

60 2,8 3,80 114,3 20,9 1,5 0,65 10,53 2,9 8,5

72 3,7 4,45 128,5 29,5 1,6 1,00 20,64 5,4 14,0

84 4,5 4,05 41,7 29,5 2,2 1,40 10,91 6,6 22,6

96 5,1 1,99 45,1 29,6 1,9 0,70 - 8,35 6,6 30,0

102 4,9 0,91 45,4 31,1 1,5 0,30 9,15 5,4 25,0

6. Выделение и характеристика ферментных препаратов

из КУЛЬТТРаЛЬНОА ЖИДКОСТИ Aap, foetldUB М—45

При разработке технология ферментных препаратов из глубинной культури Asp. foetuue К—45 были исследованы вопросы ввделеиаа, очистки я концентрирования ферментов с применением таких процессов, как вакууышпаривание, сушка распылением, ультрафильтрадая в осаждение ферментов аз их растворов органическими растворителями.

Исследование концентрирования ферментов было проведено ва ва-куумшпарной устаковке типа нентритеры, Результаты исследований показали, что пектолжткческие ферменты из фильтрата вудьтуральной жидкости могут быть сконцентрированы до І/5-І/Ї0 первоначального

объеиа при температурном режиме 100°С, температура хонцеитрирован-ного раствора 30°С, остаточное давление 25,0 мм рт.ст. Потери по общей пегголитической активности при атом режиме составили I0-I5JC, а при введении стабилизатора - сернокислого амюпя - 5,0-8,01,

Исследовано комбинированное концентрирование ж сушка распылением ферментных растворов на сушилке типа ЙСА. Показано, что сушка кудьтуральной жидкости и его фильтратов протекает успешно при сле-дупцих температурних режимах: температура'теплоагента в испарительной камере 00°С, на входе в сушильную камору 140°С, на шходе из сушильной камеры 70°С. Потеря по обпей пектслитической активности при таких режимах составляет.^, а при введении наполнителей в стабилизатора 3% (рис.5).

Следует отметить, что проведение предварительной стандартизации ферментных препаратов перед сушкой распылением позволяет исж-личить операцию дробления и сухой стандартизации, что упрощает технологическую схецу, снижает пртери ферментов я улучшает санитарные условия труда на заводе.

; Шли исследованы и на основе этого разработаны режимы наделения ферментов из растворов эгилошм спиртом, ухьтрафКЕьтрации о по-следущей сушко! предварительно стабилизированных и стандартизованных ультраконцентрата и водного раствора ферментного осадка, полученного при осаждении этанолом.

Сушка распылением ферментных растворов различной степени очистки позволяет резко увеличить производительность труда и снизить потери ферментов.

Неполитические ферменты, содержащиеся в водных растворах из спиртовых осадков являются менее стабильными при сушке распылением, чем таковые, содержащиеся в культуральной жидкости, еще маиее стабильны в атом процессе ферменти, содержащиеся в ультраконцентрате. Однако после внесения в них стабилизатора - сернокислого яіггмгют

1. t° в испарительной каморе 80°C

2. t° в испарительной камере 90%

3. t° в испарительной камере 100%

4. t° в испарительной камере 110%

5. t 0 в испарительной камере 120%

Рис.5. Влияние температурного режима сушки распылением на активность певтолитических ферментов

и наполнителя (хлористого натрия) стабильность их значительно возрастает. При температурных режимах ( t - 140%, * ш - 70%) потери пектолитических ферментов при сушке ультраконцентрата составляли 9£, а при сушке водного раствора спиртового осадка - 3-4it.

Исследование ферментативного комплекса Пектофоетидина ГІОх и Пеитофоетидина ГЗх свидетельствует о том, что эти препараты содер-

хат богатый комплекс гидролитических ферментов, в значительной степени преишашжй в ранее шпускаешг препаратах Пектаваморин ПОх ж ПбКТОфООТИДИН ШОХ (продуцент Аир. roetidua 26).

Оптимальные условия действия пектолитическжх ферментов лежат в пределах 55-60°С и значении pH 3,5-4,5. Пектофобтждин ПОх и Пекто-фоеткдин ГЗх стабильны пра pH 4,5-6,0 и температуре Э0°С. Наибольшую стабильность препараты проявляют в присутствии субстрата; так при явкубаши ферментного раствора с пектином (0,1?) в течение 24 часов при температуре 45°С активность снижалась на 5?, в то время как без субстрата потери активности достигали 55?.

Проведенные исследования позволили разработать технол'огиче скую схему и режим работы оборудования отдельных узлов этой схемы (рис.6).

Разработанная схема е режим производства препаратов из глубинной культурі Авр. foettdue U-45 позволяют получать их с минимальными потерями каталитической активности путем комплексного использования сырья и максимальной утилизации отходов с учетом охраны окрухапцей среда и улучшения санитарного состоагая производственных помещений.

Таким образом, разработанная нами технология пехтолитических ферментов отличается от суиествушах:

1. Применением нового штамма, полученного с использованием современных методов селекции, в настоящее время самого продуктивного по пектолнтическим ферментам в СССР,

2. Применением в составе среды свекловичного жома, обработанного по специально разработанному способу целлюлолитиче скими и сек-толиткческими ферментными препаратами.

3. Применением в процессе культивирования специально разработанной для микроскопического гриба Ав р. foetidu» Ы-45 технологии,

основанной на дифференцированных по температуре я аэрация рехкмах.

4. Применением для обезвоживания Еухьтуральной жидкости lap. foetlflua М-45 сдециядьннх разработанных режимов сушка в аппарате, сошещанцеы процессы видаркд ж. сушки распадением.

В разработанной технологи проверены в уточнены для ферментов кз культуры Asp. fo«tidu« U-45 прогрессивные технологические процессы , разработанные ранее другими исследователями, а именно:

1. Кояцентрвроваяже фильтрата культуральной жидкости на ульт-рафмьтрацвонянх установках до 1/10 первоначального объека.

2. ЗДделегхе ферментов хз концентрата гультуральной жидкости сушкой расшленжем ass оргаЕКчеекямк растворителями по непрерывное схеме.

3. Сушка распылением уяьтракопцентратов кулътуралъной жидкости с предварітвдьной стабилизацией я стандартизацией ферментов.

4. Сушка распылением полученных выделением органическими растворителями ферментных осадков после хх специальной обработки стабилизации и стандартизации.

7, Производственные жспытануд ■ ™°тр?еиже раэюаботанноЗ технологии в дромыдяешоетя

Производственные испытания нового птамка ж разработанной технологи препаратов Дектофретидаа ГЗх и Пектофоетждин ГІОх били проведены ва Олайнском заводе 'Химреактив", Московском опытном завода ферментных препаратов и Приволжском биохимическом заводе.

Пра культквировахжи продуцента в производственных условиях происходит сильное подки слеше питательной среди до їй 2,7-3,0, что создает благоприятные условия для стерильного ведения процесса ферментации.

Нараду о пектодктжческим комплексом в растущей культуре сен-

'isr.î::ïian-;iï£cî«icî ШЕЇЇЛ ПОЛУЧЕНИЯ ферментных пржрятиа !

РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ , 0ЧІЮТКМ ПРИ ПґМП.ІИІ-їОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

/".'______! ÍÍ. . Є _ .1 • > . . - Р Л І Ч

Л^рщіШв peiiüiis M- 45

^flmwiüi;

CScíífiC^U

^M^AÍ^íb /ЛІ І- ni

І lefi ГЛ C<f) '3*. fu i 4 m ҐШх í¡\jf\>' <х>і/чч- »tf.-j'fUJ' í*

ir

jhtmvp

■ЦТ"4'

СҐІ ÍJpr/L

i ! \'itk'a¡cn Oítit c(wicí;t*/Ht*¿o S ікххкше и .¿74,' i cjubW-.'H ' r

J Jl^rfwtíí (ІЇЧ tV^'trtYi'.Y OíUfi't'íí*ШЛ 4. OuiTtttmffit* нищчии'яыюи

5 Ctrr>»tt'fitt.*ititO-} 6- tlWH'iPft*'* (''t>ii>ftt>

ftftrt U 9 ybtWrfH r ■

6 itettvüMi-iAitciwtfU ui'ttt<twuK Ш Wvtt/'iüfi iM'u tm-

ÇffjnpftmCp

H- 'ñi tf^i'.'/ntir- tr<p І1 'j&,40àtf/tt*HCii<

çtRCrîtcaprn u№ Ц Un ----- — HCi№24KU

;Я tuuAMHf* С U

çmv&ujtiib'jieiiitsjau ііцампц^ами л

Ч>. Г ...............f'Uf.4'X<f"'t>/ '

if. faii'fUiifft/ffm/ivWfj а&ніілхч

і M'/'iiwitti/A/ffKi tf'/.\t>initpi.7J?ö~

и brut рта

тезируется кислотоустойчивая протеаза, гемяцеллилаза, эндо-Ji -1,4-гджаяаза и целлобиаза. Готовую культурадьную жидкость подвергали фильтрации, затеи концентрировали на вакуумшпарных установках а из ЕОЛуЧеННОГО концентрата фериеНТН я»Ц»=ч"Т1ги этиловый спиргом.

Двя снижения потерь в этом процессе в фильтрат вводили серно' кислый алшиний, величину pff после этого доводили до 4,5. Б результате потери активности снизились до 5£. Из полученного концентрата пектолжтнческие ферменты выделяли путем добавления 3,5 объемов этанола на один объем концентрата культуральной жидкости. Отделенный на сепараторе ферментной осадок направляли на сушку. Потери активности в процессе сушки были ва уровне 8-10$. На Московском опытной заводе проведены испытания штадаа ж«р. foetidus u-iS при непрерывном культивировании. Непрерывное культивирование осуществляли при скоростях протока-|- и час.-1. Наилучшими оказались рехиш при

скоростях протока' -Ї— час."1. Длительность стабилизации культуры 15

на стадии активного синтеза составила 25 суток.

Проверенная и уточненная технология векталитяческих ферментных препаратов, получаемых на основе глубинного культивирования нового высокопродуктивного штадаа Aap. foetidue Н-45 (Пектофоетвдин ГЗх), была внедрена в 1977 году на Приволжском биохимическом заводе и в 1979 году на Ладыжинском заводе ферментных препаратов. В настоящее время на заводах ..отрасли шцускаются ферментные препараты с использованием нового мутантного штамма. Практическая и теоретическая значимость пектояитических препаратов несомненна.

Применение ферментных препаратов Пектофоетвдин ПОх и Пектофо-етидин ГЗх, полученных при культивировании нового мутантного штамма lap. foetidus U—45, приводит к значительному увеличение выхода конечного продукта производства: виноматериалов, стероидных лекарственна!' сред, соков, розового масла. Исследование Пектофое-твдина ГЗх на предприятиях Союзмехпрома при обработке шубной овчины

показало сокращение продолжительности процесса обработка, увеличение шхода площади полуфабриката в улучшения его качества. Дин повышения коэффициента переваримости кормов и лучшей утилизации питательных веществ корма ферментный препарат Пектофоетидин ГЗх нашел широкое применение в животноводстве.

ВЫВОДЫ

I. Разработаны технологическая схема и технологические режмш производства пектолитичвских ферментных препаратов на основе использования нового высокопродуктивного вташа.Аар. foetidu» ц—45, предусматривающие безотходную технологию •

г. Экспериментально подучен новий шташ Asp. foetidu» м_45 ва основе индуцированной селекции с использованием нитроз осоедине-ний и УФ^лучей, обеспечивающий сверхсинтез внеклеточной пехтиназы и других гидролитических ферментов, превышающий активность исходной культурі более чем в 10 раз.

Установлены наиболее аффективные дозы мутагенных факторов, ш-зывавдие максимальное накопление мутаций. Показано, что наиболее эффективное действие на мутационный процесс оказала смена мутагенов ва каждой из последующих ступенях селекции.

3. Исследовано влияние состава питательной среды аа биосинтез ферментов экспериментально полученным мутантом. При »том установлено, что:

- введение в состав питательной среды пектина резко увеличивает биосинтез продуцируемых изучаешм микроскопическим грибом ферментов;

- наиболее высокая активность гидролитических ферментов отмечена при росте мутанта на среде с гидролизатом свекловичного жома, полученным при действия пектолитичвских я цедлюдолитиче ских ферментов; в качестве источника пектолитичвских и цеддвлголитических

ферментов предложено использовать ультрафильтра! - отход производства.

4. Разработай с применением методов математического планирования эксперимента рациональный состав питательной среды для глубинного культивирования мутанта, вклшащий гидролжэат свекловичного жома, гидролизат солодовых ростков к минеральные соли.

- установлено, что в составе питательной среды гидролизат солодовых ростков макет быть заменен одним из отходов производства ферментных препаратов: гидролизатом мицелия продуцента или гидро— лизатом биомассы бактерий.

5. Разработан способ приготовления вонддиального посевного материала н его активирования, позволяющий сократить продолжит ель— ность процесса ферментации на 12 часов.

6. Исследовано В установлено, ЧТО маі№іттгт.рир бИОСИНТвЗ ферментов осуществляется цри дифференцированных по температуре и аэрировании режимах культивирования.

7. Показано активирующее и стабилизирующее действие ионов Со++, Мп++ и А1+++ на биосинтез пектолитяческих ферментов.

8. Разработаны технологические рехида непрерывного шделения феріентов из культуральной жидкости; концентрирования на ультрафильтрационной установке; сушки концентратов культуральной жидкости (полученных путем: вакуумвапаривания фильтрата культуральной жидкости, ультрафильтрации, осаждения органическими растворителями) на распылительной сушилке с предварительной стандартизацией и стабилизацией ферментов перед сушкой;

9. Дана характеристика препарата Пектофоетидин ПОх и Некто-фоетпдин ГЗх по рН в термостабильности,

10. Разработанная технология пектолитических ферментна* препаратов на основе нового шсокопродуктивного шташа .М-45 (Пектофоетидин ГЗх) внедрена на Приволжском биохимическом за-

; - 25 -

вале и на Ладыжинском заводе ферментных препаратов.

- Экономический аффект от внедрения разработанной технологии только на Приволжском биохимическом заводе за 1976-1979 гг. составил 2.064.409,6 рублей.

II,. Пекгофоетидин ГЗх испытан в качестве катализатора,интенсифицирующего процесс получения сердечных гликозидов из растительного сырья и показал увеличение выхода этих ценных лекарственных веществ па 30%,

12, Разработан способ приготовления корна для сельскохозяйственных животных с использованием Пектофоетвдива ГЗх, позволивший повысить питательную ценность корюв.

Список работ, опубликованных по: материалам диссертации.

1. Павлова Н.М., Зуева Р.В., Коновалов С.А. Изменчивость л*р. footidus продуцента пектолнтическкх ферментов под воздействием

мутагенов. - В кн.; Третья Всесоюзная конференция по генетическим основан селекции прошюленных микроорганизмов (Минск, 20-25 декабря 1975). Теэ.ДОКЛ. - II., 1975.

2. Авт.свид. * 538022 (СССР). Штаил гриба Aep. foetldu» ы-15 - продуцент пектолитвчеоких ферментов (Гендина С.Б., Павлова K.M., Коновалов С. А., Калу нищ К. А.) - И.Е. А 45 5.12.1976.

3. Румянцева Г.Н., Цребешова F.H., Павлова E.U., Волошина Д.А. Разрушение клеточных оболочек корневищ дискореи обработкой их ферментными препаратами. — Прикладная биохимия и мифобиология, 1976, т.12, вып.4, с.591-596*

4. Павлова Н.М., Зуева Р.В., Шахова Т.В. Влияние состава питательной среда на биосинтез пектиназ мутантом. Aap. foetidus; М-45. - В ка.: Второе Всесоюзное совещание по ферментам микроорганизмов (Минск, 27-29 октября 1978). Тез.докл.^- М., 1973, ч.1,

с.103. ; з

5. Удалова Э.В.Павлова H.U*,. СачковаТ.П. Стабильность.пек-тиназы при хранении в составе премиксов. - В кв.: Второе Всесоюзное совещание по ферментам микроорганизмов (Минск, 27-29 октября 1378). Теэ.докл. - М., 1978, ч.2, с.119....v ,, . , _ ._

6. Волошина Д.А., Павлова U.U., Румянцева Г.Е. Шаин С.С., Киселев В.П. Ферыентолиз -гликозидов. пажитника сенного. - Химико-, фардацевтический журнал, 1979, Ä I.^c.75-79.

7. Авт.свид. Ii 737456 (СССР). Способ регулирования процесса. _ культивирования микроорганизмов.,.(Андреев Е.Ф., Ваганова Ы.С., Медиан Д.А., Павлова Н.М.). - i:.C.. й 46.. 17.12.1980.

- 27 -

8, Павлова Н.М. Фиэиолого-морфологические особенности Ач>.

го«гыиаМ-45 - продуцента пектолитнческих ферментов. - В сб.: Микробиологический синтез, биотехнология и биоинхенерия, Т.4 (тей. докл. УХ съезд ВМО, Рига, 25-29 марта 1960). Рига, 1980, с. 61.

9. Величко Б.А., Капуяянц К.А., Ашомко Э.Г., Полянская Т.В., Рубалик В. И., Павлова Н.М., Юшкова В.Г. Непрерывный способ культивирования микроскопических грибов цродуцентоа ферментов. - В сб.: Новое в получении п применении ферментов. Ы., 1960, с.64-73.

10. Павлова Н.М. Комплексный гидролитический препарат для переработки пищевого растительного сырья. - В сб.: Развитие производства биологически полноценных пищевых продуктов на основе комплексного использования сырья и снижения его потерь, - Тез.

докл., - Ы., 1982, с.41-42.

Подписано к печати Г?Л1.ь2г.Заказ 1955.Тираж КЮэкэ. Типография ЩИИТОИпищепрома