автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Разработка технологии мультиэнзимной композиции для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья

Государственный комитет Российской Федерации по высшему образованию

Московская Государственная Академия пишевых производств

РГБ ОД

2) ДВГ 1985 На правах рукописи

Экз. №

УДК: 663.15:663.53 (043.3)

Буй Тхи Тху Ха

Разработка технологии мультиэнзимной композиции ддя биоконверсии целлюлозосодержащего сырья

Специальность 05.18.10 -Технология витаминных, ферментных и белковых препаратов, чая и табака

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук.

Москва, 1995

Работа выполнена в Московской государственной академии пишевых производств.

Научный руководитель: доктор технических наук,

профессор М.В. Гернет

Официальные оппоненты: доктор технических наук,

профессор Е.Г. Борисенко, кандидат технических наук, с.н.с. Н.В. Сурикова

Ведущая организация: Кафедра химической энзимологии Московского Государственного университета им. Ломоносова

Защита состоится " ¿CUjtépZ, 1995 г. в Jo часов на заседании специализированного Совета № К 063.51.04 в Московской ордена Трудового Красного Знамени государственной академии пищевых производств по адресу: 125080, Москва А-80, Волоколамское ш„ 11.

Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по этому адресу на имя ученого секретаря специализированного Совета № .К 063.51.04.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГАПП.

Автореферат разослан "Ad-" UfOUA, 1995 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, к.т.н. доц.

Тихомирова

О.И.

SU n N & RT

Itie use of high-active enzymatic preparations is one of the ways of production intensification. The application of a new active nulti-enzymic complex« vhich contains a necessary enzyme or a group of enzymes allots to increase the capacity of an enterprise without additional capital investments. Besides« the '■ application of a nev high-active complex creates the pomipfitty of inproving all basis indices of the production: to enlarge the yield of finished produce with the raw materials unit« to lover the expenditure of water« steam« electric power« labour force« and as a consequence« to cut production' costs of the finished produce. Nowadays a significant increase of cnzyns manufacture« a creation of high-active crrplex is being envisaged« as well as the elaboration of chemical technological processes of obtaining biological active sub- .. stances with the givsn properties using non-deficit raw materials. In connection with this the investigations bound up with the creation of new highly productive strain associations« with the elaboration of cultivation technology

and the secretion of enzymes are particularly urgent. The working out of

T

cellulolytic enzyne preparations technology on the base of deep microorganisms cultivation is actual as it allows to create new complex systems for more effective and purpcseful hydrolysis of natural non-starchy polysaccharides for the solution of many tasks in the food industry« medicine and agriculture. The intensification of technological processes of application more balanced (on cocplex) enzyme systems is actual all over the world« including Russia and Vietnam.

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Одним из путей интенсификации производства является использование высокоактивных ферментных препаратов. Применение нового активного мультиэнзимного комплекса, содержащего необходимый фермент или группы ферментов позволяет увеличить мощность предприятия без дополнительных капитальных вложений. Кроме того, применение нового высокоактивного комплекса дает возможность улучшить все основные показатели производства: увеличить выход готовой продукции с единицы сырья, снизить расход воды, пара, электроэнергии, рабочей силы и, как следствие, снизить себестоимость готовой продукции.

В настоящее время предусматривается значительное увеличение производства ферментов, создание высокоактивного комплекса, разработка химико-технологических процессов получения биологически активных, веществ с- заданными • свойствами при использовании недефицитного сырья.

В связи с этим исследования, связанные с созданием новых высокопродуктивных ассоциаций штаммов, с разработкой технологии культивирования и выделением ферментов является актуальными.

Разработка технологии целлюлолигических ферментных препаратов на основе глубинного культивирования микроорганизмов актуальна, так как позволяет создать новые комплексные системы для эффективного и целенаправленного гидролиза природных некрахмальных полисахаридов для решения многих задач пищевой промышленности, медицины и сельского хозяйства. Интенсификация технологических процессов применения более сбалансированных по комплексу ферментных систем актуальна во всем мире, в том числе и в России и во Вьетнаме.

Целью работы являлась разработка технологии на основе глубинного культивирования ассоциации микроорганизмов препаратов целлюлаз и гемицешполаз, эффективно гидролизующих нативную целлюлозу до глюкозы.

Исходя из цели работы поставлены следующие задачи:

- Осуществить поиск микроорганизмов - продуцентов цеюполазно-гемицешполазного комплекса; „

- Оптимизировать условия культивирования монокультур продуцентов; г

- Провести совместное культивирование продуцентов для получения сбалансированных по составу мультиэнзимных композиций;

- Оптимизировать условия культивирования, позволяющие повысить активность и осуществлять направленный биосинтез ферментов цешполазно-гемицеллюлазного комплекса;

- Получить мультиэнзимный комплекс разной степени очистки с повышенным содержанием ксилапаз и изучить эффективность гидролиза целлюлоз под действием этого комплекса.

Научная новизна работы. Разработаны питательные среды и оптимизированы условия глубинного культивирования микроскопического гриба Aspergillus foetidus D-73 с целью направленного биосинтеза гемицешполаз.

Провести скрининг микроорганизмов среди промышленных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз. Выявлены ассоциации культур, способные совместно развиваться на твердых агаризованных средах и разработаны условия для благоприятного роста сообщества-. Оптимизирован состав питательной среды и параметры совместного культивирования * ассоциации грибов, позволяющей . получить сбалансированный мультиэнзимный комплекс, эффективно гидролизующий целлюлозу до глюкозы.

Практическая ценность работы. На основании полученных данных разработан лабораторный технологический регламент производства МЭК "ЦКГ" (Целлюлазноксиланазноглюканазного) разной степени очистки.

Полученный на . основе ассоциации микроорганизмов мультиэнзимный комплекс позволяет увеличить эффективность гидролиза различных видов целлюлозы от 15 до 50%.

Технология апробирована на стендовой установке МГАПП, а ферментный препарат был использован для интенсификации процессов в пивоварении.

Разработаны схемы получения препаратов разной степени очистки с применением методов ультрафильтрации и аффинной хроматографии.

Ожидаемый экономический эффект от применения МЭК "ЦКГ" при производстве пива в расчете на 1 млн. дал составит 85,5 млн. рублей.

Работа л выполнены на кафедре "Процессы ферментации и. промышленного биокатализа " Московской Ордена Трудового Красного Знамени государственной Академии пищевых производств.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на республиканской научно-технической конференции "Проблемы энергетики теплотехнологии в отраслях АПК, перерабатывающих, растительное сырье"(Москва, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 215 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 18 таблиц.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной часта, выводов, списка цитируемой литературы (включающего 125 наименований советской литературы и 152 иностранных работ) и предложение.

1. Обзор литературы.

Рассмотрены целлюлазы и гемицеллюлазы, их субстраты и микроорганизмы - их продуценты. Приведены данные по вопросам смешанных культур , изучения механизмов , принципов создания и управления микробными ассоциациями.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы и методы исследования:

Объектами исследования являлись различные штаммы гррбов -продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз , полученные в лаборатории МГАПП. Культуры поддерживали, пересевали на пробирках со скошенным сусло-агаром раз в 2-3 месяца.

Культивирование осуществляли в конических колбах емкостью 250 мл и на пилотной установке "Анкум" емкостью 50 литров , в течение 6-7 суток при температуре 28-30 С .

В колбу помещали: 50 мл питательной среды . Контрольная среда для Т. 1оп!рЬгас1пашт7-2б (Гернет М.В. ,1986) - среда "Кг" : • свекловичный жом" 4,6-,' лшеййчньге отруби - 0,35; хлопковый шрот -0,35 ; КН2Р04 - 0,3; N№N03 - 0,7, контрольная среда для Т.ип^е 44 (Острихова Н.А., 1983) - среда "Ю" : свекловичный жом - 3 гузупая -0,3; БВК - 0,03; лактоза - 0,4; (ЫН4)г504 - 0,3; КН2РО4- 0,6; МпБ04 -0,06; 1ла -9,06.

Среда для совместного культивирования Т.утёе 44 и Т. ЬпрЬгасЫаШт 7-26 : среда "0я ( подобранная нами) : свекловичный жом 4,6; пшеничные отруби -0,35; хлопковый шрот - 0,35; КН2РО4 -0,6; Ш4Шз - 0,7; лактоза - 0,4; МпБ04 * 5НгО - 0,096; ЫС1 - 0,06 . '

Среда для глубинного культивирования Анрег^Иш foetidus 0-73, (подобранная нами) - среда "А" : свекловичный жом - 1,5; пшеничные отруби ->2,0; овсяная шелуха - 1,0; БВК - 0,1; лактоза - 0,4;

, КН2РО4 - 0,6; ЫНдИОз - 0,7; иС1-0,06.

- ■ 6 Среда для совместного культивирования T.viride 44 и A. foetidus D-73 (подобранная нами) - среда "Ос" : свекловичный жом - 2,0; пшеничные отруби - 2,0; овсяная шелуха - 1,0; БВК - 0,18; лактоза 0,4; NH4NO3 -0,7; КН4РО4 - 0,$; хлопковый шрот - 0,35; LiCl - 0,6; МпБОч * 5 НгО -0.096.

Ферментативную активность определяли методами принятыми в работе других исследователей : активность целлюлаз при гидролизе фильтровальной бумаги (АФБ) - по методу Мандельс-Вебера (Mandéis М.,Weber Т., 1969) . активность по КМЦ осахаривакмцей - методом Мандеяьс- Вебера (Mandéis М.,Weber Т., 1969), ксиланазную активность - по рекомендации Рухлядева (Рухлядева, Полыгалина, 1981).

В ходе исследования определяли белок методом Лоури (Lowry et al., 1951), восстанавливающие сахара - методом Шомодьи- Нельсона (Somodyi,1952,Nelson, 1944).

В работе применяли методы статистической обработки экспериментальных данных , факторного плана эксперимент^ Грачев, ■ ' • 1979). -

Ош>гш проводились в трех и более повторностях. Для каждого опыта рассчитывали среднеарифметические из полученных j результатов и оценки дисперсии единичного и среднего результата.

Í В рамках каждого опьгга осуществлен анализ достоверности

! результатов с применением критерия максимального отклонения.

i Оценки дисперсии старались объединить , проанализировав сначала

!

их однородность, как правило, с помощью критерия Фишера.

Найденные средневзвешанные оценки дисперсии использовали для I . расчета доверительных ошибок средних результатов опьггов с

I помощью критерия Стьюдента при доверительной вероятности 0,95.

i 2.2 Отбор микроорганизмов продуцентов целлюлаз й

гемицеллюлаз.

Среда микроскопических грибов для полученш препаратов целлюлаз и гемицеллюлаз был выбран гриб Aspergillus foetidus D-73 -наиболее продуктивный по синтезу гемицеллюлаз, а среди грибов Trichoderma выбраны Trichoderma viride 44 и Т. longibrachiatum 7-26 -активные продуценты целлюлолитических ферментов (таблица 1).

Таблица 1

Биосинтез целлюлаз и гемицеллюлаз различных микроорганизмов

№ Наименование культур Уровень ферментативной активности

КМЦ АФБ КС

1 Trichoderma viride 44 +++ +++ +

2 Trichoderma longibrachiatum 7-26 ++ ++ ■ +

3 Aspergillus niger + + -

4 Aspergillus foetidus D-52 - - +

5 Aspergillus foetidus D-73 + + +++

6 Aspergillus foetidus BB - - +

7 Aspergillus foetidus 45 + + +

8 Aspergillus foetidus НГУ-9 - - +

Сравнительные обозначения:

(+++) очень активный биосинтез , (++) активный биосинтез , (+) активность на среднем уровне, (-) активности не обнаружено. Совместимость культур проведена на сусло- агаровой среде в чашке Петри.

При совместимости двух популяций на среду в каждой чашке наносили по одному вертикальному штриху одной популяции я вверху по 2 параллельным горизонтальным штрихом.

При совместном выживании в местах соединения популяций по. штриху образовалась зона преимущественного развития предыдущей популяции. у - -

Очередность и момент засева популяции играют важную роль в их совместном выживании . При одновременном засеве ТпсЬоёетта

longibrachiatum 7-26 и Trichodemia viride 44 если Trichoderma longibrachiatum был засеян первым , то развитие Т.viride подавляется ростом T.longibrachiatum , а в противном случае, когда Т.viride был засеян первым, его рост достигается на 50% меньше монокультуры. Когда Trichoderma longibrachiatum засевали через одни сутки после внесения T.viride , то T.viride уже успел гармонично развиться и у Trichoderma longibrachiatum не существует конкуренции за субстрат. Совместимость культур T.viride и A. foetidus проявляется наилучшим образом при подсеве последней через двое суток от начала культивирования.

Результаты испытаний совместимости двух и трех культур Trichoderma viride 44 (T.v.) .Trichoderma longibrachiatum 7-26 (Т.1.) и Aspergillus foetidus D-73 (A.f), показали следующие варианты, в которых популяция при совместимости со временем благоприятно сосуществует.

1.T.v + A.f(l)

2.T.V + T.10)

3. T.v + A.f (2)

4.Т.1+ (A.f+T.v)(l)

5. T.1 + (A.f + T.v) (2)

6.T.V + (A.f + T.v) (2)

Цифры ( I), (2) обозначают, что эта популяция внесена через одни или двое суток после засева первой культуры.

Таким образом, выявлены возможные варианты совместимости микроорганизмов на твердой агаризованной среде с предпочтительными диапазонами и момент их внесения в ассоциации.

Проведено совместное культивирование ассоциации T.v + ТЛ и T.v + ТЛ (1) на средах, подобранных для них в отдельности ( "КГ. и "Кг" ) и подобранной нами для их совместного роста ( среда "0").

ЁКМЦ<%), (ЗОед/шг) . Ц АФБСД), (& esta) КС<%). (150 ед/ид)

Диаграмма 1. Изменение ферментативной активности при совместном выращивании культур T.v н Т.1 на различных питательных средах.

I-T.v. на контрольной среде "Kj"; 2 -Т.1. на среде "К2";

3 - T.v. + Тi(l) на среде "0я.

Во всех случаях совместного культивирования T.v и T.I не происходит существенного изменения активности целлюлаз и гемицеллюлаз, хотя их совместимости на твердой агаризованной среде оказываются хорошими. Только в случае культивирования вариантом T.v и Т.1 (1) на среде "0я происходит повышение ксиланазной активности па 10% по сравнению с монокультурой T.v и на 30% с монокультурой Т.1. Однако это повышение сопровождалось относительно снижением активности целлюлаз на 10-25%. А по сравнению с монокультурой T.v на среде" Ki " , Т.1 на среде "Кг " _, повышение биосинтеза ксиланаз у ассоциации T.v + TJ (1) на среде "0" достигается от 20 до 70 % ( диаграмма 1) при этом снижение суммарной целлюлазной активности наблюдается на уровне 10-16%.

Таким образом гриб T.viride 44 в совместном выращивании с 7-26 не дает существенного повышения гемицешполазной активности, активносг цешполаз значительно снижается, хотя по их совместимости на твердой среде можно было рассчитывать на большую эффективность результатов.

Поэтому считаем нецелесообразным совместное культивирование T.viride 44 и T.longibrachiatum 7-26 с целью получения комплекса ферментов с повышенной гемицеллюлазной активностью при достаточно хорошей целлюлазной активности.

2.3 Разработка условий глубинного культивирования гриба Aspergillus foetidus D-73 для получения целлюлазно-гемицеллюлазного комплекса.

При разработке состава питательных сред принимали во внимание способность микроорганизмов изменить комплехс синтезируемых ферментов в зависимости от состава питательных сред.

В соответствии с рекомендациями других' исследователей (Гогинова и др., 1981 , Месхи ,1983) , в поверхностных условиях крахмал и папин значительно оказывают влияние н биосинтез ксиланаз . Мы исследовали влияние этих компонентов на активность ксиланаз, целлюлаз грибом Aspergillus foetidus D-73 в глубинных условиях. Использовали дня конструирования питательных сред компоненты, такие как пшеничные отруби, содержащие крахмал, свекловичный жом, содержащий пектин, овсяную шелуху, содержащую . ксилан, рисовые отруби, солому, шелуху, пшеничные шелуху, солому, опилки, хлопковый шрот, ферментолизат БВК.

В качестве неорганических источников азота использовали аммонийные соли соляной, азотной, серной и фосфорной .кислот , г также азотнокислые, соли щелочных металлов.- А в качестве

И

легкодоступного источника углерода служили глюкоза, ксилоза, лактоза.

Установлено, что внесение в среду овсяной шелухи приводит к существенному изменению ксиланазной активности: биосинтез ксиланаз грибом повышается в 5-8 раз при внесении в среду овсяной шелухи в количестве 1%.

Доплнительное введение в среду с определенной концентрацией улучшает биосинтез целлюлаз и гемицел^лаз: Глюкоза в количестве 0,3 % позволяет повысить КМЦазу, активность по АФБ и по ксиланазе на 10,12,16% соответственно.

При замене КН2РО4 на NH4H2PO4 происходит ухудшение биосинтез ферментов, активности снижаются на 18-30 %. В присутствии КН2РО4 и NH4H2PO4 наблюдается дополнительное снижение активностей ферментов: АФБ - на 50%, КМЦ- 37%, ксиланазы - 44%.

Дополнительное введение таких компонентов как рисовые отруби, солома, шелуха, пшеничная солома, . опилки в различных концентрациях не оказывает активирующего действия. А ряд исследований замен ими таких компонентов, как свекловичного жома, пшеничных отрубей, овсяной шелухи не приводит к повышению уровня^биосинтеза изучаемых ферментов у гриба.

На основании проведенных исследований, нами были определены набор элементов питательной среды и их композиции для обеспечения активного биосинтеза целлюлаз и гемицеллюлаз грибом Aspergillus foetidus D-73. В состав этой среды входят свекловичный жом, • пшеничные отруби, овсяная шелуха, хлопковый шрот, лактоза," КН4РО4, БВК, NH4NO3, LiCl.

рн

Рис. 1а. Влияние активной кислотности среды на биосинтез гемицеллюлаз и цсллюлаз гриба А. ГоейЛю Б-73.

<с

Рис. 16. Влияние температуры культивирования гриба А. й>ей(1и$ 1>-73 на биосинтез гемицеллюлаз и целлюлаз.

Врамцтк^гпО

Рис. 1в. Динамика биосинтеза гемицеллюлаз-и целлюлаз у гриба А. Гоеййиэ В-73.

Оптимизация состава питательной среды осуществлена с помощью факторного плана эксперимента ДФЭ2П-', в результате чего подобрана среда состав которой состоит из следующего компонента (среда "А"): свекловичный жом - 1,5; пшеничные отруби - 2,0; овсяная шелуха - 1,0; хлопковый шрот - 0,35; лактоза - 0,4; БВК - 0,1; NH4NO3 - 0,7; КНгРОц -0,6; LiCl - 0,06 . На этой среде Aspergillus foetidus D-73 дает активность по АФБ -1 ед/мл, по КМЦ - 6 ед/мл, по ксиланазе - 320 ед/мл.

Как показали результаты испытаний, что наиболее активный биосинтез целлюлаз и ксиланаз грибом Aspergillus foetidus D-73 протекает на средах, исходное значение pH которых находится в пределах 4,9 - 5,2 (рис 1а).

Установлено , что оптимальной для роста гриба и накопления ферментов является температура 28-31 °С ( рис. 16) , а для получения максимального накопления целлюлаз и ксиланаз грибом необходима продслясительносгькультивирования 4-5суток (рис. 1в).

2.4 Р^работка условий совместного культивирования Trichoderma wide 44 a Aspergillus foetidus D-73 для получения целлнхлазно-гсиицеллюлазного комплекса. ' ' " '

- Проведен ряд культивирований монокультурой Trichoderma viride 44 на среде "Ki", среде "О" и среде "А" . Результат показал, что среда "А" обеспечивает активный биосинтез ксиланаз и целлюлаз не только гриба Aspergillus foetidus D-73, но и для Trichoderma viride 44. На этой среде наблюдается повышение всех активностей у Trichoderma viride 44.

На фойе компонентов среды "А" проводами конструирование питательной среды для Trichoderma viride 44 и для сообщества с Aspergillus foetidus D-73. Исследовали влияния концентрации таких .компонентов как съекловичный жом, пшеничные отруби, глюкоза, БВК, лактоза па "биосинтез целлюлаз и ксиланаз так и монокультурой Trichoderma viride 44, как и сообществом. И установлено, что

свекловичный жом в количестве 2%, отрубей - 2%, лактозы - 0,4% , БВК - 0,18 % обеспечивают максимальное накопление ферментов монокультурой и смешанной культурой, а глюкоза не оказывает активирующего действия для биосинтеза ферментов монокультурой и в концентрации (0,1%) она позволяет повысить биосинтез цешполаз смешанной культурой на 10-15%. n

Свекловичный жом после обработки на "стадии очистки цеягаолазы афинной хроматографией уже частично гидролизуется ферментом, Его можно использовать снова в качотве компонента питательной среды для ассоциации Т.: v. + A.f.(2), и для Т. v. монокультуры.

Результаты исследования показали, что жом в количестве 1,5- 2,0 % обеспечивает активный биосинтез цешполаз. В количестве 1,5% наблюдается повышение активности по АФБ на 25% , КМЦ на 13% , ксиланазы - на 7,5% , в количестве 2% обработанной жом позволяет повышение активности по АФБ на 20%, КМЦ - 7% и ксиланазы на 5% при культивировании Trichodenna viride 44 монокультурой.

В результате конструирования питательной среды подобрана среда ("Ос"), обеспечивающая максимальное накопление ферментов монокультурой Trichodenna viride 44 и смешанной Trichodenna viride 44 и Aspergillus foetidus D-73. Эта среда содержит следующие компоненты : свекловичный жом - 2,0 ; пшеничные отруби - 2,0 ; овсяная шелуха -1,0; БВК - 0,18 ; хлопковый шрот - 0,35; NHUNCb - 0,7 ; КН2РО4 - 0,6 ; UC1 - 0,06 ; MnSO« - 5НгО - 0,096 ; лактоза - 0,4. На этой среде гриб Trichodenna viride 44 обеспечивает КМЦ - 40 ея/мл, АФБ -10 ед/мл, кашаназа - 280 ед/мл, что по КМЦ на 33% , по АФБ -33%, по ксиланазе -на 3 раза больше чем на контрольной среде "Ki

Среда" Ос " дает способность смешанной .культуре синтезировать КМЦазу-30 ед/мл, АФБ-7 ед/мл, ксиланазу-480 ед/мл.

Таким образом, совместное культивирование Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73 на подобранной среде позволяет повысить ксиланазную активность ферментной ; системы в 5,5 раз при этом сохраняется целлюлазная активность на 93-100% по сравнению с биосинтезом этих ферментов монокультурой Trichoderma viride 44 на контрольной среде.

Очередность и предпочтительный диапозон. засева микроорганизмов существенно влияют на их развитие и физилогическую активность в ассоциации.

Изучена роль этих факторов на биосинтез ферментов при совместном культивировании Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73 ( диаграмма 2 и табл.2). Во всех вариантах совместного культивирования целлюлазная активность по АФБ достигается ниже моно Trichoderma viride 44, больше моно Aspergillus foetidus D-73, способность синтезировать КМЦазу' у Trichoderma viride 44 не ингибируется грибом Aspergillus foetidus D-73 если его подсев осуществляет через 2 суток и 3 суток. Самый интенсивный биосинтез ксиланаз достигается, когда к двухсуточной культуре Trichoderma viride 44 подсевают Aspergillus foetidus D-73. При этом биосинтез цешполаз сохраняется на 93-100% активности по сравнению с моно Trichoderma viride 44. ... ,

Намечена четкая тенденция : чем дольше микроорганизмы находятся в контакте друг с другом, тем больше негативное влияние они проявляют на суммарное накопление целлюлопкгаческих ферментов. Разновременное внесение посевного материала . продуцентов позволило в широких пределах варьировать соотношение -компонентов в мультиэнзимном комплексе.

- - 1 - - 16

• Таблица 2. Активность целлюлаз и геммицелюлаз при совместном культивировании в зависимости от очередности и времени внесения посевного материала.

Наименование культуры Срок подсева Ферментативная активность

КМЦ АФБ КС

ед/ мл % ед/ мл % ед/ мл %

Trichoderma viride 44 Подсев:А. foetidus D-73 .• ■ 30 100 7,5 100 57. 100

Одновременно 15,4 53 4,5 60 306 350

Через 1 сут. 24,S 82,6 5,4 72 325 370

- Через 2 сут. 30,0 100 7,0 93 480 550

Черз 3 сут. 30,0 100 7,3 97. 275 320

A. foetidus D-73 1 Подсев: Trichoderma viride 44 г 6,0 1,0 320

Через 1 сут. 15 50 3,9 52 300 340

Через 2 сут. 12.5 41 3,2 42 320 360

Через 3 сут. 12 40 3,2 40 320 360

Этот вариант совместного культивирования имеет преимущество по сравнению с раздельным выращиванием грибов, т.к. за одну ферментацию позволяет получить более активную культуральную жидкость, чем давали бы две раздельные ферментации. Если объединить' равные объемы культуральной жидкости Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73, то ксиланазная активность в смеси состапляегг 0,5*(320+87)=203,5 ед/мл, КМЦазная активность: 0,5*^0+6)=18 ед/мл, а;гп1Вкость по АФБ: 0,5*(1+7)=4,25 ед/мл. В то вреж при совместном культивировании продуцентов в одном, ферментере мы получали культуральную жидкость с кснланазпон, КМЦззнэй, активность по АФБ: 480,30 ,7 ед/мл соответственно.

ОРПЯ1 j ШРЯД2 I OPWJ

КМЦ(%), (30 ед/ил) Ц АФБ<%), (7,5 сд/мл)

КС(%), (480 сз/мл)

Диаграмма 2. Изменение ферментативной активности при совместном культировании Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73.

1- Т. viride 44 на контрольной среде "К|"; 2- A. foetidus D-73 на среде "А"; 3- Т. viride 44 + A. foetidus D-73 (2) на среде "Ос"

" Кроме того, мы предположили, что' мультюнзимный комплекс, полученный при данном способе засева будет более эффективно гидролизовать натнвную целлюлозу, чем ферментная система Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73, как показано далее в разд.2.5, такой подход был вполне оправдан.

На фоне оптимальной питательной среды исследовали влияние условий культивирования на продуктивность биосинтеза ферментов смешанной культурой. Максимальное накопление ферментов наблюдается когда значение рН исходной среды после стерилизации . находится в пределах 5,0-5,5 (ри&2а). В случае, когда температура -процесса культивирования снижает ниже 28" С или превышает более 32° С наблюдается и снижение активности ферментов. Температура 30е С - оптимальная для роста ассоциации культур (рис.26).

Рис.2а. Влияние величин pH питательной среды на биосинтез ферментов ассоциацией Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73

Рис.26. Влияние температуры культивирования на биосинтез -ферментов ассоциацией Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73

кмц

0123-4 56789

Врамя, сутки

Рис.2в. Биосинтез ферментов ассоциацией Trichoderma viride 44 и. ' Aspergillus foetidus D-73 в зависимости от длительности культивирования

А при испытании процесса совместного культивирования по времени то активный биосинтез целлюлаз и гемицешголаз у ассоциации начинается с 6-ых до 7-ых суток культивирования, что этот фактор совладает с огггимумами длительности культивирования каждой монокультуры (рис.2в). ^

25 Получение препарата МЭК "ЦКГ" и изучение эффективности его действия:

Исследовали динамику гидролиза дативной целлюлозы ферментом системы Trichoderma viride 44 в ассоциации с Aspergillus foetidus D-73. Использовали микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) (рис.3), карбоксиметил - целлюлозу (КМЦ) (рис.4) и сервацел (рис.5) с концентрациями 10 г/л и 20 г/л . Гидролиз проводится при 40е С, рН 4,5, в течении 36 часов. Использована дозировка ферментов 3 ед. по фильтровальной бумаге на 1г субстрата.

Результаты исследований показали, что МЭК "ЦКГ" , полученный на основе совместного культивирования Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73- во всех вариантах гидролиза целлюлоз дает самый высокий выход продукта при этом сокращается время гидролиза; гидролиз МКЦ, КМЦ, 10 г/л - время выхода на стационарный уровень - 12 часов, гидролиз МКЦ, КМЦ 20 г/л - 18 часов , а гидролиз сервзцела - 24 часа. Т.о. благодаря набору ферментов в МЭКе "ЦКГ* позволяет уменьшить время гидролиза нативной целлюлозы и повысить выход продуктов на 15-50% по сравнению с препаратами из монокультур.

Рис. 4а. Динамика гидрапиза КМЦ (10 Пп, рН 4.5, ДОС)

10 20 Врамятярмт, '

Рис. 5а. Дииамика гидролиза сервацела „ (101/л, рН 4.5, ДОС)

10 20 Время (хомяка, «ис

Рис. 46. Динамика пиролиза КМЦ (20 |Й1, рН 4ч5,40С)

Рис. 56. Динамика гидролиза сервацепа (20 гСп, рН Д.5, ДОС)

1 - препарат из А. Гоеййщ В-73 :3 ед. АФБ; 18 ед. КМЦ; 960 ед. КС

2 - препарат из Т. \iride 44 : 3 ед. АФБ; 12 ед. КМЦ; 35 ед. КС

3 - МЭК : 3 ед. АФБ; 12,8 ед. КМЦ; 206 ед. КС

2.6 Разработка способа очистки "ЩсГ" методом аффинной хроматографии.

Для очистки и концентрирования ферментных растворов сущетвуюг многие методы, такие как вакуум- выпаривание, ультрафильтрация, осаждение органическими растворителями, аффинная хроматография. И значительный эффект очистки удается при исследовании последнего метода. В литературе имеются примеры применения данного метода для фракционирования цеялюлазных комплексов по компонентному составу. Основываясь на различной степени сродства компонентов цетполазной системе к субстрату нами была проведена очистка методом аффинной хроматографии.

О 0,5 1. 1,8 - 2

I - свекловичный жом; 2 - осиновые опилки; 3 - бумажные отходы

Рис.6. Влияние размера целлюлозосоДержащих субстратов на коэффициент равновесного распределения адсорбции эндсппоканазы

(Кр).

Для подбора носителя процесса ийтользовали свекловичный жом,-осиновые опилки, бумажные отходы (рис. 6). Видно из рис.6, что все кривые близки друг к другу, при этом коффициент пригодности -критерия оценки сырья этих субстратов практически одинаковы, и средний равен 7,33. Поскольку свекловичный жом

частичнообработанный ферментным раствором активно интенсифицирует процесс биосинтеза цешполаз, как компонент питательной среды нами был выбран в качестве носителя процесса аффинной хроматографии свекловичный жом.

Нами проведена аффинная хроматография целлюлаз с помощью буферных растворов - 0,1 М ацетатного на стадии адсорбции ферментов на субстратах и 0,1М фосфатного буфера на стадии дессорбции ферментов со субстратов (Мартьянов В.А., 1982) и также осуществлен этот процесс с помощью электрохимической активированной воды (ЭХА-воды) различной величиной рН.

На основе литературных данных процесс адсорбции проводится при температуре 4-10" С, величине рН 4,5-5,0, времени контакта с адсорбентом 10-40 мин. а процесс десорбции осуществлен при 30-40° С , рН 6-7,0,15-20 мин.

Для подготовки носителя к адсорбции, свекловичный жом предварительно замачивается с буфером или ЭХА-водой рН 4,7 в .. течении 1 часа. . '„ . ..... . •

Процесс очистки ферментов с участием ЭХА-воды дает значительный эффект по сравнению с традиционым методом. Степень адсорбции целлюлаз на свекловичном жоме ацетатным буфером составляет 96,1% по КМЦ, 94,5 по АФБ , 92% по КС и 91% по бешсу, в то время зги величины становятся 95,5, 95,94 . 92,6 соответственно, на 1-3 % больше при использовании ЭХА-воды рН 4,7.

При десорбции ферментов элюированием ЭХА-воды рН 7,0 выход активности и белка составляет 87,5 % ,88%, 84,5% и 79,5% соответственно, что на 4-8% выше, чем при десорбции фосфатным буфером.

Особенно получили 3 фракции ферментов с различной степенью очистки как по удельной активности так и по сухим веществам. Эффект очистки составлял от 40 до 100 раз.

Соотношение ферментов в каждой фракции представлены в таб.3.

Таблица 3.

Очистка ферментов.

№ фракции Соотношение ферментов

КМЦ АФБ КС

Фракция 1 1.1 1 1.2

Фракция 2 0.87 1 0.87

Фракция 3 0.93 1 0.7

Таким образом , полученный результат аффинной хроматографии целлюлаз на свекловичном жоме с помощью ЭХА-воды подтверждает практическую значимость: метод простой, дешевый, экономически выгоден, экологически чище, перспективен по выходу активностей и белка,-решает проблему очистки с целы» получения высокоОчищенных' ферментных препаратов.

2.7 Получение мультиэнзимного комплекса целлюлаз "ЦКГ" и его характеристика.

Культуральную жидкость, полученную после культивирования смешанной культурой Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73 отделяли or биомассы центрифугированием при 6000 об/мин в течении 15 минут. Концентрирование культуральной жидкости осуществляли методом вакуум-выпаривания при температуре греющего пара 60-80° • С , температуре вторичного пара 25-30° С и давлении 0,8 atm и методом 'ультрафильтрации с мембраной УАМ-300 до 1/10 первоначальных объемов и до объемов, удобных для последующего процесса.

Концентрат после вакуум-выпарки осаждали этиловым спиртом.Максимальный выход ферментов и наилучшее формирование осадка были получили при осаждении спиртов 79%, время контакта 15 мин при 0-4° С. Оптимальная концентрация сухих веществ в растворе ферментов 8-13 %. При этом выделяется 92% активности по АФБ, 90% по КМЦ, 92% по ксиланазе. После формирования осадка его отделяли центрифугированием при 5000 об/мин, 25 мин. Сушку влажного осадка проводили в оптимальном режиме: спой осадка высотой до 4 мм, предварительно замораживали до (-40 ° С), после замораживания сушку осадка проводили при следующих условиях : температура излучателя - 20 С, температура конденсатора - (-40°С) ., среднее давление в вакуумной камере - 20 Па. При этом выход активности высушенного препарата достигается 98-99% от исходной.

Характеристика высушенного спиртоосажденного целлюлазного р комплекса "ДОГ"

( - Выход препарата с 1 м3 культуральной жидкости -10,4 кг

- Содержание белка -130 мг/г ' •

- Активность по АФБ - 360 ед/г

I - Активность по КМЦ- 1562 ед/г

- Гемицеялюлазная активность (ксиланазная) - 23000 ед/г

ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ ЫУЛЬТИЭНЗШНОГО ЦЕЛЛСЛАЗНОКСИЛАНАЗИОГЛШАНАЗНОГО КОМПЛЕКСА "ЦКГ" ПОХ

Выводы

1. Проведен скрининг микроорганизмов - активных продуцентов ксиланаз и целлюлаз . Исследованы совместимости различных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз на твердой агаризованной среде. Проведены совместимости нескольасих культур: Trich'oderma viride 44 , Trichoderma longibrachiatum 7-26, Aspergillus foetidus D-73 на твердой агаризованной среде. Исследована возможность их сосуществования. Установлена роль очередности и момента внесения культур на совместимости двух и трех культур. Выделены возможные варианты смешанной культуры в которых микроорганизмы благоприятно сосуществуют.

2. Разработаны условия глубинного культивирования микроскопического гриба Aspergillus foetidus D-73 для направленного биосинтеза ферментов цешполазно-гемицешполазного комплекса.

- Исследовано влияние состава питательной среды на биосинтез целлюлаз, гемицеллюлаз у Aspergillus foetidus D-73. Отмечено, что биосинтез ксиланаз и целлюлаз повышается при использовании в питательной среде свекловичного жома, пшеничных отрубей и овсяной шелухи.

- Показано, что биосинтез ферментов повышается значительно при внесении в питательную среду КН2РО4 . Установлено влияние глюкозы , ксилозы, лактозы на биосинтез ксиланаз у гриба. Установлено, что при добавке глюкозы в среде не более' 0,3 % активность ксиланаз и целлюлаз повышется.

- Оптимизирован состав питательной среды для глубинного культивирования гриба Aspergillus foetidus D-73 с целью биосинтеза ксиланаз и целлюлаз. Определены оптимальные условия

культивирования Aspergillus foetidus D-73 с целью биосинтеза ксиланаз и целлюлаз.

3. Проведено совместное культивирование Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73 > с целью биосинтеза целлюлаз и гемицеллюлаз.

Оптимизирована питательная среда для совместного культивирования Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73 с целью биосинтеза целлюлаз и гемицеллюлаз, позволяющая увеличить активность ксиланаз в 1,5-5,5 раза.

Разработаны оптимальные параметры совместного культивирования. Установлено, что время и очередности внесения посевного материала оказывают существенное влияние на соотношение компонентов целлюлазно-гемицешголазного комплекса.

4. Изучена динамика гидролиза МКЦ, КМЦ и .сервацела под действием полиферментных систем. Показано, что использование мультиэнзимного комплекса,. полученного совместным культивированием продуцентов, позволяет значительно интенсифицировать конверсию целлюлозы в различных процессах и увеличить концентрацию продукта гидролиза на 15-50%.

5. Разработан способ очиспси ферментного комплекса аффинной хроматографией целлюлаз на свекловичном жоме с помощью ЭХА-воды. Выделены активные фракции ферментов для получения высокоактивного, высокоочищенного мультиэнзимного комплекса.

6. Разработана технологическая схема получения МЭК "ЦКГ" разной степени очистки.

7. Ожидаемый экономический эффект'от применения МЭК "ЦКГ" для получения экстрактов хмеля в пивоваренной промышленности в расчете на 1 млн. дал . пива составил' 85,5 млн.руб. Экономический

эффект основан на снижении количества хмеля при применении

ферментированного экстракта.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Буй Тхи Тху Ха, Гернет М.В. Микроскопическое исследование совместимости различных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз.-М.,1993,-9с.-Деп. в ЦНИИТЭИпищепрома.21 дек. 1993 N2546 (28).

2. Буй Тхи Тху Ха, Гернет М.В. Разработка условий глубинного культивирования гриб Aspergillus foetid us D-73 для биосинтеза ферментов целлюлазно-гемицеюоолазного комплекса.-М.,1993,-6с.-Деп. в ЦНИИТЭИпищепрома.21 дек. 1993,N 2544(26).

3. Буй Тхи Тху Ха, Гернет М.В. Разработка технологии мультиэнзимной композиции для биоконверсии растительного сырья на основе совместного культивирования микроскопических грибов.-М.,1993,-9с.-Деп. в ЦНИИТЭИпищепрома.21 дек. 1993,N 2545 (27).

4. Буй Тхи Тху Ха, Гернет М.В. Разработка мультиэнзимных композиций для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья. В кн.: Тездокл. Республиканская научно-техническая конференция Проблемы энергетики теплотехнологии в отраслях АПК, перерабатывающих растительное сырье.М.!994.с. 10-11.

5. Буй Тхи Тху Ха, Гернет М.В. Сравнительная оценка деградации целлюлозы под действием комплексов целлюлолитических ферментов. Биотехнология и управление,Bbm.Nl ,1995, с.39-41.

6. Буй Тхи Тху Ха, Гернет М.В. Аффинная хроматография целлюлаз на целлюлозе. Научно-технический инф. сборник.Отеч.науч. произв. опыт, рекомендуемый для внедрения на предприятиях отраслей, достижение зарубежной науки и техники. Винодельческая пивобезалкогольная, спиртовая дикероводочная и дрожжевая промышленность. Вып. 2, 1995, АгроНИИТЭИПП.