автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка технологии дрожже-бактериальных функциональных продуктов на базе зернового сырья

На правах рукописи

ЧАН ВАН ТИ

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ДРОЖЖЕ-БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ НА БАЗЕ ЗЕРНОВОГО СЫРЬЯ

Специальность 05.18.07- Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ 1 / ОКТ 2013

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва 2013

005535055

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Борисенко Евгений Георгиевич

Официальные оппоненты: Щербаков Сергей Сергеевич

доктор технических наук, профессор кафедры виноградарства и виноделия Российского государственного аграрного университета -МСХА имени К.А.Тимирязева.

Хныкин Андрей Михайлович

кандидат технических наук, доцент, директор НТЦ «Солодовые напитки»

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт пищевой биотехнологии» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИ ПБТ РАСХН)

Зашита состоится: « 06 » ноября 2013 года в И-00 ч. на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.025.01 по специальности 05.18.07 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИПБиВП) по адресу: 119021, г. Москва, ул. Россолимо, д.7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУВНИИПБиВП Россельхозакадемии.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 119021, г. Москва, ул. Россолимо, д.7. Автореферат разослан « 02 » октября 2013 г.

Ученый секретарь

Совета Д 006.025.01 ' Л.Н.Харламова

Канд. техн. наук.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В условиях быстрого роста населения Земли все больший интерес в мире приобретают технологии новых высокоценных белковых пищевых продуктов и кормов и в первую очередь на базе микробной биоконверсии дикорастущей и сельскохозяйственной растительной биомассы.

Производство биомассы полезных микроорганизмов на съедобных субстратах позволяет параллельно решать еще одну важнейшую задачу человечества -противостояние быстро нарастающему числу желудочно-кишечных заболеваний, вызванных условно-патогенными бактериями, приобретающими плазмиды токсигенности, колонизационной резистентности и антибиотикоустойчивости. Введение в рационы питания микробных продуктов с пробиотическими, пребиотическими и симбиотическими свойствами является важнейшим способом профилактики и даже лечения этих заболеваний.

Хотя количество растительного сырья в мире составляет около 1,6 х 1012 т. в год, вряд ли можно рассчитывать на быстрое развитие крупнотоннажных технологий заготовки, хранения и переработки всех видов сырья, особенно дикорастущего. Скорее всего пилотные производства вначале будут использовать традиционные сельскохозяйственные субстраты, например, зерновые, тем более, если речь идет о создании лечебно — профилактических функциональных продуктов, для которых обычно требуется достаточно стандартное сырье.

Цель н задачи исследования: Целью настоящего исследования являлась разработка технологий новых продуктов, обладающих пробиотическими, пребиотическими и симбиотическими свойствами на базе биоконверсии зернового сырья и зерновых отходов с помощью ассоциации микроорганизмов и оценка их биологической ценности.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

— проанализировать возможность выделения дрожжей и бактерий из молока разных видов млекопитающих;

— выявить наиболее перспективные штаммы дрожжей, высокопродуктивные при прямой биоконверсии зернового сырья.

- провести подбор зерновых субстратов, перспективных для накопления на них дрожжевой биомассы;

- исследовать взаимное влияние дрожжей и лактобактерий при росте на зерновом сырье;

- выбрать наиболее эффективные режимы культивирования микроорганизмов на отобранном зерновом сырье;

- сравнить закономерности роста дрожжей и бактерий на разных комплексных зерновых субстратах в ходе двухстадийного культивирования;

- исследовать показатели качества, органолептические свойства и биологическую ценность функциональных продуктов, полученных путем комплексной микробной биоконверсии зернового сырья.

Научная повита работы:

- установлено, что дрожжи и лактобактерии могут быть выделены из молока разных видов млекопитающих, однако продуктивность дрожжей на зерновых субстратах имеет тенденцию к нарастанию в зависимости от источника выделения: дрожжи из молока дигастричных - моногастричных - человека;

- штамм дрожжей Pichia anómala 9а, выделенный из женского грудного молока, признан наиболее продуктивным при биоконверсии зернового сырья, установлены и определены его амилолитическая и протеолитическая активности;

- определено, что наиболее продуктивными источниками сырья для накопления дрожжевой биомассы является зерно пшеницы и продукты его переработки - пророщенная пшеница и автолизат зерна пшеницы;

- при сравнении глубинного и твердофазного культивирования дрожжей на зерновом сырье, эффективность использования зернового материала для накопления дрожжей при ТФФ признана в 2-3 раза более высокой;

- при микробной биоконверсии зернового сырья ассоциациями дрожжей и лактобактерии, у ряда лактобактерий отмечено заметное ингибирование роста дрожжей;

- выявлена динамика взаимодействия параллельно выращиваемых дрожжей и бактерий на различных стадиях аэробно - анаэробного культивирования на твердых и жидких зерновых субстратах - интенсивное накопление дрожжевой биомассы на аэробном этапе, разрушение дрожжей и интенсивное накопление лактобактерий на анаэробном этапе;

- сформировано понятие о растительно-дрожжевой субстанции для накопления бактериальной массы и установлена рациональность использования этой субстанции при получении концентратов растительно-дрожже-бактериальных функциональных продуктов методом ТФФ;

— сформировано комплексное представление о свойствах новых функциональных растительно-микробных нутриентов: нутрицевтики -парафармацевтики - биопротекторы.

Практическая значимость результатов работы:

Сформулированы основные приемы селекции из молока млекопитающих дрожжей — продуцентов биомассы на твердых растительных субстратах и формирования дрожже-бактериальных ассоциаций для биоконверсии растительного сырья.

Определен ряд первичных и вторичных зерновых субстратов, перспективных для микробной биоконверсии: измельченное зерно, пророщенное зерно, зерновые автолизаты, зерновая патока.

Для разработки состава комплексных питательных сред, используемых в твердофазном культивировании микроорганизмов, предложен ряд перспективных целлюлозосодержащих субстратов (зерновые отруби, солома, стебли кукурузы), до трех раз увеличивающих продуктивность зерновых субстратов по биомассе.

Выявлены основные параметры культивирования дрожже-бактериальных ассоциаций на твердых зерновых субстратах.

Разработаны методы аэробно - анаэробной ферментации зернового сырья для получения концентратов и напитков для человека и кормовых добавок для животных, содержащих симбиотические ассоциации дрожжей и бактерий.

Дана физико-химическая и микробиологическая характеристика новых продуктов, оценена их пищевая и биологическая ценность.

Для производства и использования сухого концентрата как посевного материала рекомендован режим высушивания комплексных культур: температура — 40°С, время — 8-10 ч., влажность конечного продукта - 12%.

Разработаны лабораторные регламенты производства ферментированных напитков и микробных концентратов из пророщенной пшеницы, полученных путем микробной биоконверсии. Оптовая цена таких напитков составляет около 24 руб. за 1 л., а концентратов - около 31 руб. за кг.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на IX Международной научной конференции "Живые системы и биологическая безопасность населения" (Москва, 2011); Международной конференции "Биология-наука XXI века" (Москва, 2012); Конференции, посвященной 125-летию с дня рождения профессора П.М. Силина "Связь времен и поколений, из прошлого в

настоящее" (Москва, 2012); Международной конференции «Probiotics and their Applications International Conference» (Ha Noi - Viet Nam, May 31 - June 1,2013).

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 188 источников (в том числе 60 на иностранных языках). Работа изложена на 179 страницах, содержит 26 рисунков, 65 таблиц и 9 приложений.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы рассмотрена селекция микроорганизмов - продуцентов биомассы из молока млекопитающих. Приведены рецептуры питательных сред для микроорганизмов на основе зерна и зерновых продуктов, а также основные закономерности культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах. Представлены биологически активные вещества микробного происхождения.

2. ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследования проводились на кафедрах "Биотехнология", "Технология общественного питания" МГУПП; в отделе "Технология ферментации" Государственного технологического и научного института Вьетнама, а также в лабораториях Института животноводства Вьетнама и Института наук о жизни Вьетнама.

2.1 Объекты и методы исследований Объектом исследования были различные штаммы дрожжей Pichia anómala 9а Pichia guiellermondii V5-1, Pichia anómala PI и Pichia sp. VR1, взятые из коллекции культур микроорганизмов кафедры «Биотехнология» МГУПП и штаммы дрожжей, выделенные из молока млекопитающих в России, Китае и Вьетнаме. В работе также применяли бактериальную закваску прямого внесения промышленного изготовления в лиофильно-высушенной форме: термофильную моноштаммовую Lactobacillus acidophilus La5 (Chr. Hansen, Дания) и культуры лактобактерий, свежевыделенные из молока млекопитающих.

Образцы молока млекопитающих высевали на твердофазную питательную среду (пшеничные отруби), в которую добавляли 50 мкг/г гентамицина. После инкубации в аэробных условиях при температуре 28-32°С выделяли доминирующие культуры дрожжей и оценивали их продуктивность. Критерием оценки служила концентрация дрожжевых клеток в 1г субстрата, накопленных в процессе

6

твердофазной ферментации (ТФФ). Подсчет клеток осуществляли микроскопически в камере Горяева. Размеры клеток определяли с помощью окуляр-микрометра.

В качестве компонентов для создания питательных сред использовалось сырье: нешелушеное зерно риса ГОСТ 6293-90, рисовая крупа ГОСТ 6292-93, сенная мука ГОСТ 4808-87, пшеничное зерно по ГОСТ 52554 - 2006, отруби пшеничные ГОСТ 7169-66, кукуруза и ее растительные компоненты ГОСТ 13634-90, рисовая солома ГОСТ 30061-93 "Зерно и солома зерновых культур", патока кукурузная крахмальная ГОСТ Р52060 - 2003.

Для поддержания культур лактобактерий и дрожжей, их учета и определения антагонистической активности применяли питательные среды производства ФГУП ГНЦПМ, г. Оболенск.

Глубинную ферментацию (ГФ) вели в качалочных колбах на круговых лабораторных качалках при 180-220 об./мин. при температуре 30±2°С. ТФФ в лабораторных условиях проводили в чашках Петри и в колбах объемом 750 см3 при высоте слоя 1-5 см и влажности субстрата 50-55%. Чашки Петри или колбы помещали в термостат на 48ч при температуре 30±2°С.

Определение содержания молочнокислых микроорганизмов проводили в соответствии с ГОСТ 10444.11-89, дрожжей - в соответствии с ГОСТ 10444.12-88.

Титруемую кислотность определяли в соответствии с ГОСТ 3624-92, ГОСТ 27493-87, активную кислотность - потенциометрическим методом на рН-метре HANNA рН 211. Массовая доля белка - в соответствии с ГОСТ 54662-2011, «сырого протеина» - по методу Несслера. Определение амилолитической активности проводили в соответствии с ГОСТ 54330-2011, протеолитической активности- в соответствии с ГОСТ 53974-2010.

Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли по программе Excel 2007 Microsoft Office, вычисляя среднее значение и стандартное отклонение для каждой величины, а также доверительный интервал при уровне значимости 95%.

2.2 Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1 Селекция дрожжей и бактерий из молока млекопитающих

Отбор дрожжевых культур, наиболее продуктивных по накоплению биомассы на растительном сырье, проводится методом ТФФ, традиционным для стран Юго-Восточной Азии. Обычно в этом методе используют чаще всего мицелиальные

грибы, их смеси или еще более сложные ассоциации грибов, актиномицетов, дрожжей и бактерий. В этом случае процесс ферментации может быть достаточно длительным (иногда до нескольких недель), а конечный продукт по составу бывает весьма вариабельным. При работе с дрожжами эти недостатки можно в значительной степени обойти.

Таблица 2 - Рост дрожжей из натурального молока разных

млекопитающих на пшеничных отрубях

№ п/п Источник выделения Содержание дрожжей, пхЮ' клеток/г

После 24 ч | После 48 ч | После 72 ч

Коровье молоко из России

1 КМ1 0,2 1,4 2,5

2 КМ 2 0,4 0,9 2,1

3 КМЗ 1,25 2,1 2,9

4 КМ 4 2,4 3,1 3,3

5 КМ5 2,5 3,3 3,6

Свиное молоко из Вьетнама

6 СМ1 3,3 4,3 5,0

7 СМ2 2,0 4,0 4,1

8 СМЗ 1,8 4,5 4,7

9 СМ4 2,3 4,1 3,8

10 СМ5 1,7 4,5 4,3

11 С Мб 1,9 5,0 4,7

12 СМ7 2,5 4,2 5,0

13 СМ8 1,7 4,3 5,0

14 СМ9 1,7 4,0 5,1

15 смю 1,7 4,5 4,2

Женское грудное молоко (Вьетнам, провинция)

16 ЖГМ1 2,5 2,8 2,7

17 ЖГМ2 1,0 1,1 1,4

18 жгмз 1,2 1,7 2,7

19 ЖГМ4 1,0 1,1 1,0

20 ЖГМ5 1,1 1,2 1,2

Женское грудное молоко (Вьетнам, Ханой)

21 Р1сЫа £ше]1егтоп(1п У5-1 2,6 4,7 5,1

22 Р^сЫа ер. УЮ 2,4 3,9 4,7

Женское грудное молоко (КНР, провинция)

23 ЖГМ1 0,7 0,7 0,5

24 ЖГМ2 2,1 2,0 1,8

25 ЖГМЗ 0,4 0,5 0,4

26 ЖГМ4 0,8 1,6 1,5

27 ЖГМ5 1,5 1,5 1,7

28 ЖГМ6 2,0 1,5 1,2

Женское грудное молоко (Россия, Москва)

29 Р1сЫа апота1а Р1 2,9 4,6 5,0

30 Р|сЫа апота1а 9а 3,6 5,2 5,4

Из данных табл.2 видно, что дрожжи можно выделить из молока различных видов млекопитающих, однако продуктивность этих дрожжей на пшеничных отрубях имеет тенденцию к нарастанию в зависимости от источника выделения: молоко дигастричных - моногастричных - человека. Практически все они принадлежат к роду Pichia, которому современная микробная биотехнология прогнозирует очень серьезные перспективы из-за высокой биохимической активности этих дрожжей.

Российский штамм Р. anómala 9а уже показывал некоторые преимущества в росте на разных целлюлозосодержащих субстратах. Именно он был выбран нами для работ по биоконверсии зернового сырья, хотя возможность использовать вьетнамские штаммы также вполне реальна.

В предшествующих исследованиях было четко установлено наличие экзоглюканазной и ксиланазной активности у дрожжей Pichia anómala 9а. Мы обнаружили наличие амилолитической и протеолитической активности у этих дрожжей (рис. Г). Следовательно, крахмалсодержащие компоненты в зерновых субстратах являются не просто носителями, но и сами могут быть субстратами биоконверсии, и именно это делает реальной возможность накопления дрожжевой биомассы на зерновом сырье даже без его предварительного гидролиза. И, тем не менее, мы исследовали возможности накопления дрожжевой биомассы при различных вариантах подготовки зернового сырья.

С этой целью зерно осахаривали методом кислотного и ферме?ггативного гидролиза, различные виды зерна проращивали, пророщенное зерно подвергали автолизу и на всех этих вариантах зерновых сред изучали интенсивность роста дрожжей.

-й-Рост дрожжей —# —АС ед/г ПС ед/г

о\ О * С « н 8 7 -6 -5 —. Г 3 - 2,5 - 2 s в сс а и о У S С5 2 о о г S U 1 S р

о О. ч н и о в. ч Ü 4 - 3 -2 1 -0 - МИ ¿¿а sSjS ¡J ■ 1,5 - 1 " 0,5 - 0 h - ч о 4 5 S < S ч 0 01 н о с. с о S со а сз

0 6 12 „ 18 24 30 36 42 Время культивирования, ч 48 54 60

Рисунок 1. Амилолитическая и протеолитнческая активность дрожжей Р. anómala 9а в ТФФ на пророщенном зерне пшеницы.

Б1, Б2, БЗ,...Б8 -лактобактерии, выделение из молока млекопитающих, La5 - производственный штамм Lactobacillus acidophilus Ia5, Н - Lactobacillus acidophilus317/402 (Наринэ)

Рисунок 2 - Влияние лактобактерии на рост дрожжей P. anomala 9а на пророщенном зерне пшеницы.

В молоке млекопитающих дрожжи присутствуют в ассоциации с молочнокислыми бактериями. На рис.2 достаточно четко видно, что не каждая культура лактобактерий может успешно ассоциироваться с дрожжами P. anomala 9а, некоторые из выбранных лактобактерий практически не влияют на рост дрожжей P.anomala 9а (например, штаммы Б1, Б2, Б5 и Н), другие же достаточно заметно этот рост ингибируют (Б6). Это создает определенные трудности при формировании дрожже-бактериальных ассоциаций, делает не возможным эффективное использование генетического потенциала каждого участника ассоциации, если у них проявляются свойства взаимного ингибирования. В этом случае могут быть использованы варианты совместного культивирования микроорганизмов, не параллельного, а последовательного, рассмотренные ниже.

2.2.2 Подбор зерновых субстратов для накопления биомассы дрожжей

Если говорить о крупнотоннажном производстве дрожжевой биомассы методом твердофазной ферментации (ТФФ), то для этих целей одних отрубей не достаточно в силу того, что они сами по себе являются высокоценным кормовым продуктом и хорошей добавкой к пище, прежде всего к хлебобулочным изделиям. Для этих целей нужно иметь множество различных субстратов вторичных и первичных, в том числе и зерновых культур. Поэтому для исследований были выбраны традиционные зерновые культуры: пшеница, рис, кукуруза. В табл.3 представлено накопление дрожжей на таких субстратах.

Таблица 3- Рост дрожжей Р. anómala 9а на различных субстратах методом ТФФ (посевная доза 3x10® кл/г)

№ Питательная среда Содержание дрожжей, п* 10' кл/г продукта

п/ ы После 24 ч После 48ч После 72 ч

1 Рис 2,0 3,3 2,7

2 Кукуруза 2,0 2,3 2,2

3 Пшеница 3,9 5,0 5,1

4 Пророщенный рис 3,2 5,1 4,3

5 Пророщенная кукуруза 2,2 5,0 4,6

6 Пророщенная пшеница 3,6 7,1 6,8

7 Рисовая солома 1,5 1,8 1,85

8 Рисовая мучка 3,6 10,5 9,8

9 Стебли кукурузы 2,5 3,5 3,7

10 Пшеничные отруби 2,5 5,5 5,7

11 Сенная мука 3,0 5,0 5,2

Из табл.3 видно, что действительно различные продукты зернового происхождения могут быть использованы при дрожжевой биоконверсии методом ТФФ, причем одни более, другие менее продуктивны, чем сенная мука, но во всяком случае все они пригодны для этого процесса. В этой таблице также достаточно четко видно влияние проращивания на рост дрожжей на средах из использованных видов зерна, что свидетельствует о большей доступности полисахаридов зерна после процесса проращивания.

Что касается сенной муки и целлюлозосодержащих вторичных продуктов зерновых культур, то эти субстраты не только могут сами с разной эффективностью использоваться для наращивания дрожжевой биомассы, но способны заметно, и в то же время также достаточно различно стимулировать использование дрожжами легкоферментируемых сахаристых субстратов (табл.4).

Как видно из табл. 4, наиболее активными стимуляторами роста в данном случае могут оказаться не обязательно самые продуктивные целлюлозосодержащие материалы. Очевидно, очень большую роль играет пористость целлюлозосодержащих продуктов, что позволяет выбрать способ твердофазного культивирования дрожжей, а не глубинного. По нашему мнению, сравнение этих двух способов достаточно демонстративно можно провести по эффективности дрожжевой биоконверсии, прежде всего, самого зерна или его производных (пророщенного зерна или зерновых автолизатов).

Таблица 4 - Рост дрожжей Р. anómala 9а на комплексных целлюлозно-

№ 7 'п Состав питательной среды (влажность-55%) Содержание дрожжей, пхЮ9 клеток/г комплексной среды Содержание дрожжей, пхЮ10 клеток/г сахаристого компонента

После 24 ч После 48 ч После 72 ч После 24 ч После 48 ч После 72 ч

1 Раствор глюкозы (7%) Рисовая солома 2,4 3,7 3,1 4,7 7,0 6,0

2 Сенная мука 4,0 6,5 6,2 7,6 12,5 11,8

3 Стебли кукурузы 4,7 6,7 6,0 9,0 12,8 11,5

4 Пшеничные отруби 3,9 6,3 6,3 7,4 12,0 12,0

5 Рисовая мучка 1,7 3,1 3,0 3,3 5,9 5,7

6 Раствор кукурузной патоки (7%) Рисовая солома 2,5 3,9 3,6 9,7 7,4 6,8

7 Сенная мука 5,2 7,6 7,3 10,0 14,5 14,0

8 Стебли кукурузы 5,8 7,8 7,2 11,0 14,8 13,8

9 Пшеничные отруби 5,1 7,3 7,4 9,8 14,0 14,2

10 Рисовая мучка 1,6 1,6 1,4 3,0 3,0 2,8

В таблице 5 представлен выход дрожжей с 1 г сухого вещества трех зерновых автолизатов при глубинном культивировании, причем достаточно четко видно, что этот выход нарастает до 10%-ной концентрации сухих веществ этих автолизатов. Если же этими 10%-ными автолизатами увлажнять различные целлюлозосодержащие субстраты, то продуктивность зернового компонента этих комплексных субстратов будет в три раза более высокой, чем в глубинной культуре (табл.6). Очень похожие результаты были получены нами на комплексных средах также и при других видах обработки измельченного зернового сырья: при ферментативном и кислотном гидролизе.

Таблица 5 - Рост дрожжей Р. anómala 9а при глубинном культивировании на жидких средах из автолизатов пророщениого зерна_

№ Кол- Содержание дрожжей, пх101и клеток/г а.с.в. зернового автолизата

7 ' п во Автолизат риса Автолизат кукурузы Автолизат пшеницы

зерна, После После После После После После После После После

% 24 ч 36 ч 48 ч 24 ч 36 ч 48 ч 24 ч 36 ч 48 ч

1 5 3,47 5,33 4,80 3,47 5,60 4,80 4,00 5,60 4,90

2 6 2,89 5,66 4,22 2,89 5,78 5,11 3,78 6,22 4,22

3 7 2,86 5,52 4,76 3,24 5,91 5,33 4,00 6,67 5,71

4 8 2,83 5,67 4,50 3,33 6,00 5,35 3,83 6,50 5,17

5 9 2,52 5,78 5,33 2,96 6,07 5,48 3,56 6,37 5,78

6 10 2,67 5,60 5,20 3,07 6,00 5,87 3,07 6,27 5,60

7 11 2,42 5,10 4,85 2,91 5,58 5,51 2,91 5,70 5,33

8 12 2,33 4,67 4,33 2,67 5,11 5,22 2,78 5,33 5,00

9 13 2,36 4,10 3,80 2,38 4,41 4,10 2,46 4,62 4,62

10 14 2,00 3,62 3,24 2,00 3,52 3,05 2,00 4,10 4,00

Таблица 6 - Рост дрожжей Р. anómala 9а при твердофазной ферментации на

автолизатах с разными целлюлозосодержащимн компонентами

№ Состав питательной среды Рост дрожжей, n*10J Рост дрожжей, пх10ш

'П (влажность-55%) клеток/г комплексной клеток/г зернового

среды компонента

Дегкоферме- Трудноферментиру- После После После После После После

нтируемый емый субстрат 24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч

субстрат

1 Кукурузный автолизат (10%) Рисовая солома 2,4 3,1 2,9 6,1 7,88 7,37

2 Сенная мука 4,9 8,2 8,0 12,46 20,85 20,34

3 Стебли кукурузы 5,3 8,4 8,0 13,48 21,36 20,29

4 Пшеничные отруби 5,3 5,8 6,6 13,31 14,76 16,78

5 Рисовая мучка 0,5 1,6 1,1 1,27 4,07 2,8

6 Рисовая солома 2,5 3,8 4,1 6,36 9,66 10,42

7 Пшеничный Сенная мука 5,4 8,4 8,0 13,73 21,36 19,83

8 автолизат Стебли кукурузы 6,1 8,6 7,8 15,5 21,86 19,91

9 (10%) Пшеничные отруби 3,9 5,8 6,6 9,92 14,75 16,78

10 Рисовая мучка 1,3 1,1 1,1 3,3 2,8 2,8

11 Рисовая солома 2,1 3,2 3,1 5,34 8,14 7,88

12 Рисовый Сенная мука 4,9 7,4 6,9 12,46 18,81 17,54

13 автолизат Стебли кукурузы 5,1 7,6 7,1 12,47 19,32 18,05

14 (10%) Пшеничные отруби 4,2 4,7 5,2 10,68 11,95 13,22

15 Рисовая мучка 1,1 1,3 1,1 2,8 3,31 2,8

2.2.3 Исследование условий культивирования дрожжей на зерновых субстратах

Продуктивность дрожжей Р. anómala 9а в зависимости от величины посевной дозы была исследована при культивировании на измельченной пророщенной пшенице (рис. За, 36). Из этих рисунков видно, что наращивание посевной дозы рационально до ЗхЮ8 кл/г при ТФФ и до 8х107 кл/см3 при ГФ, а далее начинается снижение выхода дрожжей, т.е., очевидно, в таком случае биосинтетический тип метаболизма начинает сменяться на биоокислительный, для которого характерно некоторое снижение максимума количества дрожжей в культурах при более быстром достижении этого максимума.

» После 24ч ■ После 48ч в После 72ч

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Посевная доза х 107 клеток/г

• После24ч «После 36ч в После 48ч

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Посевная доза х 107 клеток/см3

За

36

Рисунок 3 - Влияние посевной дозы дрожжей Р. anómala 9а ТФФ (а) и ГФ (б) способом на иророиденной пшенице.

К температуре различные микроорганизмы относятся по разному. В таблице 7 показано, что оптимальная температура для культивирования дрожжей Р.anómala 9а находится в диапазоне 29-31°С.

Таблица 7 - Влияние температуры на рост дрожжей Р.anómala 9а при ТФФ на пророщенной пшенице

№ Температура Содержание дрожжей, nilü' кл/г

п/п культивирования, °С После 24 ч После 48 ч После 72 ч

1 23-25 3,0 6,2 5,7

2 26-28 3,3 6,7 6,5

3 29-31 3,5 7,0 6,6

4 32-34 3,8 6,8 6,4

5 35-37 3,1 5,8 5,5

6 38-40 2,2 4,3 3,5

Рисунок 4 - Влияние влажности на рост дрожжей P.anomala 9а при ТФФ на пророщенной пшенице.

Один из важных параметров ТФФ - это влажность питательной среды. На рис. 4 показано, что влажность среды из пророщенной пшеницы для культивирования Р. anómala 9а лежит в диапазоне 50 - 55%.

В процессе культивирования микроорганизмов существует точка времени, в которой накопление биомассы достигает максимума. На рис. 5а, 56 показано, что при ТФФ рост дрожжей выходит на максимум уже к 48 ч., а при ГФ к 33 ч., и далее число клеток дрожжей в культурах начинает снижаться, очевидно, из-за автолиза.

Стебли Кукурузы + пшеничный автолизат Стебли Кукурузы + рисовый автолизат

■й 8

-

5 7

С 4 -

'й з -

е. г 1 - 1 0 -

А

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 Время ферментации, ч

10% Пророщенной пшеницы ~ 10% Пшеничного автолизата

-> 4'5

I 4 i 3,5

I 3

в 2,5

0 ¿

1 1,5

о

§■ I

о 0,5 о

О

X -

У —

/ Л X*

/ -

/

у /

/

56

0 3 6 9 12 15 13 21 24 27 30 33 36 39 42 Время ферментации, ч

Рисунок 5 - Продолжительность культивирования дрожжей Р. anómala 9а при ТФФ (а) и ГФ (б) на пророщенной пшенице.

2.2.4 Динамика роста дрожжей и бактерий на зерновом сырье в аэробно-

анаэробной ферментации

На рис. 6а, 66 показано, что на этапе аэробного культивирования на увлажненных твердых субстратах из пророщенного зерна и стеблей кукурузы с автолизатами зерна рост дрожжей достаточно высокий, составляет от 7,0 до 8,0x109 кл/г. Содержание бактериальных клеток в комплексных культурах после аэробной ферментации в 2 - 4 раза меньше, чем дрожжей. Следовательно, при аэробной ферментации накапливается прежде всего дрожжевая биомасса.

0ч 24 48 Время ферментации, ч,

■ 9а + ла5 + пророщенная пшеница

■ 9а + ла5 + пророщенный рис

в 9а+ ла5 + Пророщенная кукуруза

■ 9а + ла5 + Автолизат пшеницы + стебли кукурузы

«я 9а + ла5 + Автолизат риса + стебли кукурузы

■ 9а + ла5 + Автолизат кукурузы + стебли кукурузы

0 24 48 Время ферментации, ч.

9а + ла5 +

Пророщенная пшеница 9а + ла5 +

Пророщенный рис

■9а +ла5 + Пророщенная кукуруза

9а + ла5 + Автолизат пшеницы + стебли кукурузы

9а + ла5 + Автолизат риса + стебли кукурузы

9а + ла5 + Автолизат кукурузы + стебли кукурузы

6а

66

Рисунок 6 - Динамика роста дрожжей Р.апота1а 9а (а) и лактобактерий Ьа5 (б) на различных субстратах в аэробной ферментации

Этап анаэробного культивирования может быть осуществлен разбавлением комплексной культуры, полученной в результате аэробного культивирования, водным раствором сахарозы (7%) в соотношении 1:5.

На рис. 7а, 76 представлена динамика роста дрожжей и лактобактерий в анаэробной ферментации на различных субстратах. Видно, что в течение 72 ч. количество дрожжей быстро падает (до 0,1.109 кл./см3), а содержание лактобактерий резко возрастает (до Ю10 кл./см3). Практически во всех вариантах жидких субстратов за 72 часа анаэробного этапа параллельной дрожже-бактериальной ферментации рН падает от 5,6 - 5,9 до 3,2 - 3,8; титруемая кислотность, напротив, растет от 21-27 Т° до 120- 140 Т°.

■ 9а + ла5 + Пророщенная пшеница

■ 9а + ла5 + Пророщенный рис

®9а +ла5 + Пророщенная кукуруза

■ 9а + ла5 + Автолизат пшеницы + стебли кукурузы

« 9а + ла5 + Автолизат риса + стебли кукурузы

■ 9а + ла5 + Автолизат кукурузы + стебли кукурузы

19а + ла5 + Пророщенная пшеница

— 9а + ла5 +

Пророщенный рис

Время ферментации, ч

9а +ла5 +

Пророщенная

кукуруза

9а + ла5 + Автолизат пшеницы + стебли кукурузы

9а + ла5 + Автолизат риса + стебли кукурузы

9а + ла5 + Автолизат кукурузы + стебли кукурузы

О 24 48 72 Время ферментации, ч.

7а 76

Рисунок 7 - Динамика роста дрожжей P.anomala 9а (а) и лактобактерий La5 (б) на различных субстратах в анаэробной ферментации

Реализация второго варианта дрожже-бактериальной биоконверсии растительного сырья может осуществляться модифицированным методом последовательного твердофазного культивирования. В этом случае 7%-ный раствор сахарозы с внесенной в нее культурой Lactobacillus acidophilus La5 добавляют только до 75%-ной влажности, т.е. культивирование все еще остается твердофазным. Динамика дрожжей и бактерий на анаэробной фазе культивирования (в сосуде с высотой слоя твердофазной культуры 20 см) представлена в табл.8. В этой таблице очень демонстративно просматривается зависимость между влажностью инкубируемой комплексной культуры и содержанием в ней жизнеспособных дрожжей и лактобактерий. По мере нарастания влажности количество дрожжей прогрессивно падает, а количество бактерий наоборот нарастает. Конечно, это скорее всего связано со степенью анаэробиоза, стимулирующего рост лактобактерий. Во всяком случае, эта деталь должна быть учтена при возможном промышленном производстве новых комплексных нутриентов. В табл. 9 представлена динамика химических параметров напитка, полученного с помощью такого полуфабриката. Следует отметить, что они практически идентичны показателям продуктов, полученных по первому варианту.

Таблица 8 - Динамика роста микроорганизмов при росте ассоциации P. anomala 9а + L acidophilus LaS на твердофазной среде из пророщенной

пшеницы в анаэробных условиях

№ п/п Влажность, % Исходная концентрация микроорганизмов, пхЮ9 клеток/г Содержание микроорганизмов, пхЮ9 клеток/г

После 24 ч После 48 ч После 72 ч

9а La5 9а La5 9а La5 9а La5

1 50 7,50 0,100 4,5 0,9 3,3 1,2 1,2 1,3

2 55 6,80 0,090 2,7 1,5 2,0 3,7 0,7 4,0

3 60 6,25 0,080 2,3 2,4 1,0 6,2 0,3 8,0

4 65 5,75 0,076 1,5 3,6 0,4 6,9 0,18 9,0

5 70 5,35 0,071 0,7 3,8 0,25 7,1 0,1 9,5

6 75 5,00 0,066 0,5 4,1 0,1 8,4 0,03 11,0

Оценивая эти два варианта аэробно-анаэробной дрожже-бактериальной биоконверсии зернового сырья, можно отдать предпочтение последовательному культивированию дрожжей и бактерий. В этом случае можно легко избегать ингибирования дрожжей бактериями, на первом этапе культивирования накапливать только дрожжевую биомассу, на втором же этапе на растительно-дрожжевом субстрате накапливать любые бактериальные культуры с пробиотическими свойствами.

Таблица 9 - Динамика рН и титруемой кислотности в суспензии полуфабриката - 7%-ный раствор сахарозы (1:5) при анаэробной ферментации

№ п/п Полуфабрикат: Р.апота1а 9а + Ьа5 на питательной среде 0ч После 24ч После 48ч После 72ч

pH Титруемая кислотность, Т° рн Титруемая кислотность, Т° pH Титруемая кислотность, Т° pH Титруемая кислотность, Т°

1 Пророщенная пшеница 5,6 28 5,1 42 4,1 115 3,2 145

2 Пророщенный рис 5,8 22 5,3 38 4,2 108 3,5 132

3 Пророщенная кукуруза 5,7 25 5,0 45 4,1 118 3,4 137

4 Автолизат пшеницы + стебли кукурузы (1:1) 5,8 22 5,1 41 4,2 107 3,5 130

5 Автолизат риса + стебли кукурузы (1:1) 5,8 23 5,1 40 4,3 102 3,8 125

6 Автолизат кукурузы + стебли кукурузы (1:1) 5,7 25 5,0 45 4,2 110 3,6 128

2.2.5 Биологическая оценка ферментированных продуктов из зернового сырья

Характеристики разработанных в ходе исследований продуктов представлены в табл 10.

Таблица 10 - Характеристика напитков и концентратов, полученных путем микробной биоконверсии пророщенной пшеницы

Наименование показателя Концентрат Напиток

Органолептнческие свойства Мелкозернистая от светло-коричневого до коричневого цвета, запах свойственный пшенице, интенсивно кислый вкус Мутная жидкость от светло-коричневого до коричневого цвета, запах свойственный пшенице, кисло-сладкий вкус

Массовая доля СВ, % не менее 88,0 9,0

Содержание сахара, г в ЮОсм"1 4-5 5-6

Содержание белка,% от а.с.в. не менее 17,0 17,5

Активная кислотность, рН 2,5-3 3,5

Титруемая кислотность, °Т не более 120-140 115

Микроорганизмы, КОЕ/г (см'') не менее Лактобактерии Дрожжи 109 107 109 107

Анализ присущих новым продуктам свойств позволяет отнести их в категорию функциональных растительно-микробных нутриентов по целому ряду причин. Прежде всего, они могут быть отнесены к категории нутрицевтиков, т.к. в ходе комплексной микробной ферментации в ферментируемом зерновом продукте нарастает содержание белка и большинства незаменимых аминокислот. Однако согласно табл. 7, полученный на зерне дрожжевой продукт не просто является первичным продуктом питания для человека, он прежде всего является питательным субстратом - нутрицевтиком для лактобактерий - продуцентов вторичных продуктов питания, т.е. пребиотиком. Кроме того, дрожжевой компонент новых продуктов позволяет лактобактериям лучше выживать в процессе сушки комплексных препаратов (табл. 11) и в агрессивной среде симулированного желудочного сока (табл.12), что придает дрожжевому компоненту свойства неспецифического биопротектора, позволяет рассчитывать на большую активность лучше выживающих бактерий как продуцентов вторичных продуктов питания в

ЖКТ и антагонистов патогенных, токсигенных бактерий.

19

Таблица 11 - Выживаемость дрожжей и лактобактерий при сушке продукта, полученного путем аэробно — анаэробного культивирования дрожже-бактериального комплекса на твердом субстрате (пророщенная пшеница)

№ п/п Температура, °С Время сушки, ч Выживаемость м/о в ассоциации Выживаемость Чистой культуры лактобактерии п х 109 кл/г

КОЕ дрожжей п х 109 кл/г КОЕ бактерии п х 109 кл/г

1 30 11,5 0,15 10 5

2 35 9 0,1 6 3

3 40 8 0,1 5 2

4 45 6 0,01 0,5 0,1

5 50 5 0,008 0,1 0,01

Таблица 12 - Выживаемость культуры лактобактерий в симулированном желудочным соке

№ п/п рн Выживаемость по времени, Мин.

10 30 60 90 120 150 180 210

Чистая культура лактобактерий

1 1,5 + + - - - - - -

2 2,0 + + + + - - - -

Лактобактерии в ассоциации с дрожжами

3 1,5 + + + + + - - -

4 2,0 + + + + + + + -

Антибактериальная активность лактобактерий как пробиотиков широко известна в литературе, в том числе и Lactobacillus acidophilus La5. В настоящей работе установлено прямое ингибирующее влияние дрожжей P. anomala 9а при внесении в лунки на газоне агаровых культур ряда условно патогенных бактерий (таб.13). Хотя в соответствии с МУ 2.3.2.2789-10. 2.3.2 зарегистрированные диаметры зон задержки свидетельствуют о слабом антагонизме, тем не менее этот факт тоже имеет определенную роль в формировании представления о новых продуктах как функциональных.

Таблица 13 - Антагонистическая активность штамма Р. anomala 9а по отношению к условно-патогенным бактериям_

№ п/п Штамм бактерий Диаметр зоны задержки роста, мм (с учетом диаметра лунки в агаре — 7 мм)

1 Escherichia coli 12

2 Enterobacter cloacae B2073 9

3 Enterobacter aerogenes 11

4 Klebsiella oxytoca 10

2.2.6 Пути технологической и технической реализации разработанных процессов

На рис. 8 представлена принципиальная схема получения ферментированного напитка на базе пророщенной пшеницы методом аэробно - анаэробной твердофазно - глубинной ферментации, а на рис. 9 - растительно - микробного концентрата методом аэробно - анаэробной твердофазно - твердофазной ферментации. И в том и в другом варианте субстратом для накопления бактериальной биомассы является растительно -дрожжевая субстанция, но различается форма конечного продукта -жидкий напиток или сухой концентрат.

пшенииы . ВР и Прием и хранение сырья

Вода _

ВР 1.2 Биологическая проверка сырья

ИР" 1.3 Замачивание и прорастание

ВР 1.4 Сушка и измельчение сырья

1.5 Взвешивание и дозирование сырья

□

Пап ^ ВР 2.1 Мойка и стсрмлнзаиия

Пар ^ ВР Проверка оборудования на герметичности

-г

Подготовка сырья

К позиции ТП6.

11одготовка |_

оборудования к работе 1кг пгч-.™«.».« тщ

Атмосферный .

0 4ДуХ

N11,ОН.

Сырье >п ИР 1.

I ¡ар, вода Культура

Подготовка фильтров предварительной грубой , тонкой очистки воздуха

Очистка воздуха

Приготовление растьора аммиачной воды

Приготовление раствора кислоты_

ТП8. ТП9. ТП10,

там

^ГТ

Подготовка воздуха для аэрирования

-с

Подготовка растворов К позиции ТП6. для регулирования рН [ГП8

Стерилизация и охлаждение

нтг

Подготовка питательной сперты

лактобактерий

Приготовление посевного материала в пробирках

Засев питательной среды в

Получение посевного материала в лаборатории

Питательная среда от ВР 5 .

а ОБС^

Растворы от ВР 4

Воздух от ВР 3

Выращивание посевного материала в ристильной | камере

Растворы от ВР 4

Воздух от 1ЧР Я

Засев питательной среды в смесителе

УП 10.1 Приготовление 1% раствор сахара

ТП 10.2 Стерилизация раствора

Аэробное твердофазное ■.-ультини^оваине в камере

котельную Отход на ОБО,,

Анаэробное твердофазное ил инирояаинс

ЬЕ

Готовый У МО У па ковка, маркиронка.

продукт оггрччка

Воздух на ОБ»

Воздух на ОБ^

Воздух на ОБВ

Рисунок 8 - Блок-схема технологического процесса получения ферментированного напитка на базе пророщенной пшеницы

Зерно пшеницы >

Вода

Вода .

Прием и хранение сырья

Биологическая проверка сырья

Замачивание и прорастание

Сушка н измельчение сырья

Взвешивание и дозирование сырья

Подготовка сырья

К позиции ТП6,

ТП7, ТП8

Пар

Пар

Мойка и стерилизация оборудования

Проверка оборудования на герметичность

Подготовка оборудования к работе

К позиции ТП7,

ТП8, ТП9, ТПЮ,' ТП11

Пар -^ ВР 3.1 Подготовка фильтров

предварительной грубой, ВР Подготовка воздуха К позиции ТП6, ^

тонкой очистки воздуха —;> 3 для аэрирования ТП7.ТГ19,

Атмосферный ВР Очистка воздуха

воздух 3.2

Н,50,

Приготовление раствора аммиачной воды

Приготовление раствора кислоты_

Подготовка растворов для регулирования рН

К позиции ТП6.

Культура

Сырье из ВР ИР Стерилизация и охлаждение ВР Подготовка К позиции ТП6..

Пар, вода 5.1 5 питательной среды ТП8

дрожжей Культ^-ра

лактобаетериА

Приготовление посевного материала в пробирках

Засев питательной среды в кюветах

Получение посевного материала в лаборатории

пар

Вода

Питательная среда от ВР 5,

Растворы от ВР4

ж:

Воздух от ВР 3

Вырашивание посевного материала в распшьной камере

Вода

Питательная среда от ВР 5.

Растворы от ВР 4

Воздух от ВРЗ

Засев питательной средя е смесителе

пар

Вода

Кул-ра бактерий из ТП 6

..Вода.,

Сахар .

>1 готовлен ие 7% раствор ара

Стерилизация раствора

Воздух от ВР 3

Аэробное твердофазное культивирование в камере

Упаковочная Этикетки

Отход на ОБО

Воздух на ОВВ

Конденсат в

Вода

Анаэробное твердофазное культивнроваине в смесителе

тара

Готовый продукт

<- УМО

Упаковка, маркировка, _отгрузка

котельную Отход на ОБО

Воздух на ОБВ

Конденсат в

Воздух от ВР 3

Сушка

Воздух на ОБВ

Рисунок 9 - Блок-схема технологического процесса получения микробно-растительного концентрата на базе пророщенной пшеницы

выводы

1. Установлена возможность создания функциональных продуктов на базе дрожже-бактериальной биоконверсии зернового сырья.

2. Для биоконверсии зернового сырья предложено использовать ассоциации дрожжей и лактобактерий, выделяемых из микробиоценозов молока животных и человека.

3. Возможность создания функциональных продуктов из зерна установлена с помощью модельной системы из дрожжей Pichia anomala 9а, обладающих заметной амилолитической и протеолитической активностью и способностью интенсивно накапливать биомассу на твердых растительных субстратах, и производственной бактериальной культуры - Lactobacillus acidophilus La5.

4. Микробная биоконверсия зернового сырья может осуществляться путем совместного культивирования дрожжей и бактерий как параллельным, так и последовательным их выращиванием, однако, второй метод позволяет избегать возможность ингибирования роста дрожжей некоторыми бактериями.

5. При дрожжевой биоконверсии зернового сырья возможно использование как глубинного, так и твердофазного культивирования. Однако при твердофазном культивировании, использующем в качестве сырья не только само зерно, пророщенное зерно и его автолизаты, но и твердые растительные остатки, эффективность использования зернового материала в 2 - 3 раза выше.

6. При параллельном и последовательном выращивании дрожжей и бактерий методом аэробно - анаэробного культивирования на зерновых субстратах, на аэробном этапе происходит интенсивное накопление дрожжевой биомассы, а на анаэробном этане - разрушение дрожжей и интенсивное накопление лактобактерий на формирующемся растительно-дрожжевом комплексе.

7. На основании анализа экспериментальных данных настоящей работы сформировано комплексное представление о новом функциональном растительно-микробном нутриенте (нутрицевтик - парафармацевтик - биопротектор).

8. Представлены физико-химическая, микробиологическая и органолептическая характеристика двух вариантов нового нутриента и лабораторные регламенты их производства.

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Чан Ван Ти. Функциональные свойства дрожжей и бактерий, входящих в состав микробных корректоров пищевого и кормового назначения./ Е.Г. Борисенко, К.В. Горин, М.С. Каночкина, Нгуен Чыонг Занг, Е.А Борисенко, Ф.С. Флуер, А.Ю. Максимушкин. // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2012. - №3. - С. 46-49.

2. Чан Ван Ти. Исследование оптимальных условий культивирования перспективных штаммов дрожжей — источников биологически активных вешеств на основе растительного сырья и отходов его переработки./ Е.Г. Борисенко, К.В. Горин, М.С. Каночкина, Нгуен Чыонг Занг, Е.А Борисенко, Л.А. Гулимова.// Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2012. - №1. - С. 18-20.

3. Чан Ван Ти. Растительно - микробные нутриенты. Сообщение 1: Селекция микроорганизмов - продуцентов биомассы из биоценозов молока. / Л.А. Гулимова, Нгуен Чыонг Занг, К. В. Горин, Борисенко Е.Г..// Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. М.: 2013. - Т.9, - №1 - С. 44 - 50.

4. Чан Ван Ти. Растительно — микробные нутриенты. Сообщение 2: Дрожжевая биоконверсия растительного сырья. / Л.А. Гулимова, Нгуен Чыонг Занг, К. В. Горин, Борисенко Е.Г..// Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. М.: 2013, - Т.9, - №2 - С. 17 - 23.

Статьи и материалы конференций

5. Чан Ван Тн. Повышение питательной и биологической ценности растительных нутриентов с помощью микроорганизмов./ К. В. Горин, М.С. Каночкина, Л.А. Гулимова, Нгуен Чыонг Занг, Е.Г. Борисенко.// Живые системы и биологичесая безопасность населения: материалы IX международной конференции студентов и молодых ученых — М. : МГУПП, 2011- С. 380-382.

6. Чан Ван Ти. Эффективность культивирования дрожжей на комплексных сахаристо-целлюлозных субстратах./ Нгуен Чыонг Занг, Гулимова Л.А., Горин К. В., Борисенко Е.Г.// Материалы Юбилейной X научно-практической конференции с международным участем — Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты - Сборник материалов. - М.: МГУПП, 2012- С-56-58.

7. Чан Ван Ти. Новые горизонты производства функциональных нутриентов. / Борисенко Е.Г., Горин К.В., Борисенко Е.А., Нгуен Чыонг Занг, Каночкина М.С., Гулимова Л.А..// Материалы международной конферениции «Биология - наука XXI века». М.: Российский экономический университет им. Г.В. Плеханова. 2012. — С. 124-127.

8. Tran Van Chi. Plant - Microbial superfood based on the microflora of milk. Borisenko Evgeny Georgievich, Nguyen Truong Giang, Gulimova Lubov Alekseevna. Материалы международной конферениции «Probiotics and their Applications International Conference» (Ha Noi - Viet Nam, May 31 - June 1, 2013 - С 20).

Summary

Bioconversion of grain culture with the help of yeast and bacteria, which are isolated from mammalian milk. It is proposed to carry out in the aerobo - anaerobic solid and deep fermentation. In the aerobic step, cultivation mainly accumulates yeast biomass, and in the anaerobic stage the yeast population is substantially replaced by the bacterial one, both of these phases can be carried out on the solid substrate in the suitable humidity and aerated condition. The obtained products with the high chemical value and the certain antibacterial effect can be categorized as nutriparapharmaceutics.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В АВТОРЕФЕРАТЕ

БАД - биологически активная добавка; ГФ - глубинная ферментация; ТФФ -твердофазная ферментация; СВ - сухие вещества; КОЕ - колонии образующих единиц; КМ - Коровье молоко; СМ - свиное молоко; ЖГМ - женское грудное молоко.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность своему научному руководителю д.т.н., профессору Борисенко Е.Г., заведующей кафедрой "Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза" МГУПП д.б.н., профессору Бутовой С.Н., д.т.н., профессору Ивановой JI.A., к.т.н., профессору Войно Л.И., заведующей отделом технологии пивоварения Российской академии сельскохозяйственных наук ГНУ ВНИИ пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности д.т.н., профессору Гернет М.В., а также всем сотрудникам кафедры «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» МГУПП.

fl

Подписано в печать 26.09.13. Формат 60x90 7i6 Печ. л.1,5. Тираж 150 экз. Изд. № 38. Заказ 125. Издательский комплекс МГУПП 125080, Москва, Волоколамское ш., 11

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ"

04201362885

На правах рукописи

Чан Ван Ти

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ДРОЖЖЕ - БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ НА БАЗЕ ЗЕРНОВОГО СЫРЬЯ

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель -

доктор технических наук, профессор Е.Г. Борисенко

Москва-2013

СОКРАЩЕНИЯ

1. АСВ (а.с.в.) - абсолютно сухое вещество

2. Б АД - биологически активная добавка

3. ГФ - глубинная ферментация

4. ЖГМ - женское грудное молоко

5. ЖКТ - желудочно - кишечный тракт

6. КОЕ - колоние образующие единицы

7. ЛГПС - легкогидролизуемые полисахариды

8. РВИ - редуцирующие вещества после инверсии

9. ТГФ - твердофазно - глубинная ферментация

10. ТФФ - твердофазная ферментация

11. РВ - редуцирующие вещества

12. СВ - сухое вещество

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................10

1.1 Селекция микроорганизмов - продуцентов биомассы из

молока млекопитающих..........................................................................................10

1.1.1 Микрофлора молока млекопитающих и ее роль в формировании биоценозов желудочно-кишечного тракта... 10

1.1.2 Бактериальная составляющая биоценоза молока..............................12

1.1.3. Дрожжевая составляющая биоценоза молока....................................13

1.1.4. Среды накопления микроорганизмов - продуцентов..................13

1.1.5. Методы оценки продуктивности отобранных микроорганизмов............................................................................................................16

1.2 Зерно как основа питательных сред для микроорганизмов... 18

1.2.1 Химический состав зернового продуктов................................................18

1.2.1.1 Характеристика углеводов зерна......................................................................18

1.2.1.2 Зерновые белки..................................................................................................................21

1.2.1.3 Зерновые липиды............................................................................................................25

1.2.1.4 Нуклеиновые кислоты зерна................................................................................26

1.2.1.5 Минеральные элементы..........................................................................................27

1.2.1.6 Зерновые витамины......................................................................................................28

1.2.2 Питательные среды из натурального зернового сырья................31

1.2.3 Питательные среды из химических гидролизатов зернового сырья..........................................................................................................................................35

1.2.4 Питательные среды из ферментативных гидролизатов зернового сырья..............................................................................................................37

1.2.5 Автолизаты зернового сырья................................................................................39

1.3 Основные закономерности культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах... 40

1.3.1 Способы ферментации микроорганизмов................................................40

1.3.2 Преимущества и недостатки глубинной ферментация............42

1.3.3 Преимущества и недостатки твердофазной ферментация... 42

1.3.4 Основные параметры культивирования дрожжей........................44

1.3.5 Основные параметры культивирования бактерий........................48

1.4 Биологически активные вещества микробного происхождения........................................................................................................................................................51

1.4.1 Микробные нутрицевтики......................................................................................51

1.4.2 Микробные парафармацевтики........................................................................57

1.4.3 Микробные пребиотики..........................................................................................59

1.4.4 Пробиотики........................................................................................................................61

1.4.5 Симбиотики........................................................................................................................63

1.4.6 Синбиотики........................................................................................................................64

Заключение 65

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..........................................................66

2.1 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................66

2.1.1 Объекты исследований......................................................................................66

2.1.1.1 Штаммы микроорганизмов, применявшиеся в работе..................66

2.1.1.2 Сырье, применявшееся в работе........................................................................67

2.1.1.3 Реактивы, использованные в работе............................................................68

2.1.2 Методы исследования................................................................................................68

2.1.2.1 Методы приготовления питательных сред..........................................68

2.1.2.2 Методы обработки питательных сред перед засевом..................72

2.1.2.3 Методы засева микроорганизмов..................................................................72

2.1.2.4 Методы культивирования микроорганизмов....................................72

2.1.2.5 Поддержание чистых культур молочнокислых бактерий и приготовление посевного материала............................................................72

2.1.2.6 Поддержание чистых культур дрожжей и приготовление посевного материала................................................................................................73

2.1.2.7 Метод выращивания молочнокислых бактерий на накопительных средах................................................................................................73

2.1.2.8 Метод получения чистых культур молочнокислых бактерий 73

2.1.2.9 Метод получения чистых культур молочных дрожжей............74

2.1.2.10 Определение физиологических признаков штаммов и идентификации дрожжей....................................................................................74

2.1.2.11 Метод глубинного культивирования дрожжей на зерновых средах..........................................................................................................................................74

2.1.2.12 Метод отбора дрожжей из биомассы на твердофазных субстратах..............................................................................................................................75

2.1.2.13 Метод создания микробных ассоциаций на основе дрожжей

и лактобактерий для биоконверсии зерновых субстратов... 75

2.1.2.14 Метод ферментации микробных комплексных растительных субстратов микробными ассоциациями............76

2.1.2.15 Метод приготовление твердых и жидких функциональных продуктов..............................................................................................................................77

2.1.2.16 Метод высушивания полученных активных полуфабрикатов на основе пророщенной пшеницы....................78

2.1.2.17 Определение количества дрожжей и плесневых грибов..........79

2.1.2.18 Метод фракционирования ферментированных жидких продуктов..............................................................................................................................79

2.1.2.19 Прямой количественный учет дрожжевых клеток........................80

2.1.2.20 Определение содержания молочнокислых микроорганизмов, в том числе лактобактерий................................80

2.1.2.21 Определение титруемой кислотности......................................................81

2.1.2.22 Определение активной кислотности..............................................................81

2.1.2.23 Метод определения содержания редуцирующих веществ в питательных средах и продуктах....................................................................81

2.1.2.24 Определение массовой доли сухих веществ......................................82

2.1.2.25 Определение массовой доли белка..............................................................82

2.1.2.26 Метод определения аминокислотного состава белков............82

2.1.2.27 Определение содержания азота по методу Несслера................82

2.1.2.28 Метод определения амилолитической активности дрожжей 85

2.1.2.29 Метод определения протеолитической активности....................85

2.1.2.30 Метод определения содержания пищевых волокон....................85

2.1.2.31 Органолептическая оценка образцов..........................................................85

2.1.2.32 Проведение микробиологического контроля..........................................87

2.1.2.33 Метод определения зольности............................................................................87

2.1.2.34 Метод гидролиза зерна соляной кислотой............................................87

2.1.2.35 Метод гидролиза зерна ферментами..........................................................88

2.1.2.36 Определение антагонистической активности дрожжей..........................88

2.1.2.37 Метод определения жира........................................................................................89

2.1.2.38 Повторность измерений и математическая обработка результатов..........................................................................................................................89

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ........................................................91

2.2.1 Оценка рынка пробиотических продуктов..............................................91

2.2.2 Селекция дрожжей из молока млекопитающих................................92

2.2.3 Приготовление пророщенного зерна для культивирования микроорганизмов............................................................................................................95

2.2.4 Взаимное влияние лактобактерий и дрожжей, выделенных

из молока, при росте на зерновых субстратах..................................99

2.2.5 Подготовка зерновых субстратов для накопления биомассы дрожжей..................................................................................................................................101

2.2.6 Выбор способа культивирования для накопления дрожжевой биомассы..................................................................................................122

2.2.7 Определение условий культивирования дрожжей на комплексных растительных субстратах..................................................127

2.2.7.1 Подбор посевных дрожжей для культивирования........................127

2.2.7.2 Влажность среды для культивирования м/о по ТФФ..................129

2.2.7.3. Время культивирования микроорганизмов............................................129

2.2.7.4 Температура культивирования дрожжей Р.anómala 9а............131

2.2.8. Динамика роста дрожжей и бактерий на зерновом сырье в

аэробно-анаэробной ферментации................................................................131

2.2.9 Биологическая оценка ферментированных продуктов из

зернового сырья..............................................................................................................137

3. ВЫВОДЫ........................................................................................................................146

4. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ............................................................148

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................161

ПРИЛОЖЕНИЯ......................................................................................................180

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

В условиях быстрого роста населения Земли все больший интерес в мире приобретают технологии новых высокоценных белковых пищевых продуктов и кормов и в первую очередь на базе микробной биоконверсии дикорастущей и сельскохозяйственной растительной биомассы.

Производство биомассы полезных микроорганизмов на съедобных субстратах позволяет параллельно решать еще одну важнейшую задачу человечества - противостояние быстро нарастающему числу желудочно-кишечных заболеваний, вызванных условно-патогенными бактериями, приобретающими плазмиды токсигенности, колонизационной резистентности и антибиотикоустойчивости. Введение в рационы питания микробных продуктов с пробиотическими, пребиотическими и симбиотическими свойствами является важнейшим способом профилактики и даже лечения этих заболеваний [118].

1 ^

Хотя количество растительного сырья в мире составляет около 1,6 х 10 ~ т. в год [186], вряд ли можно рассчитывать на быстрое развитие крупнотоннажных технологий заготовки, хранения и переработки всех видов сырья, особенно дикорастущего. Скорее всего пилотные производства вначале будут использовать традиционные сельскохозяйственные субстраты, например, зерновые, тем более, если речь идет о создании лечебно-профилактических функциональных продуктов, для которых обычно требуется достаточно стандартное сырье.

Цель н задачи исследования: Целью настоящего исследования являлась разработка технологий новых продуктов, обладающих пробиотическими, пребиотическими и симбиотическими свойствами на базе биоконверсии зернового сырья и зерновых отходов с помощью ассоциации микроорганизмов и оценка их биологической ценности.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

- проанализировать возможность выделения дрожжей и бактерий из молока разных видов млекопитающих;

- выявить наиболее перспективные штаммы дрожжей, высокопродуктивные при прямой биоконверсии зернового сырья.

- провести подбор зерновых субстратов, перспективных для накопления на них дрожжевой биомассы;

- исследовать взаимное влияние дрожжей и лактобактерий при росте на зерновом сырье;

- выбрать наиболее эффективные режимы культивирования микроорганизмов на отобранном зерновом сырье;

- сравнить закономерности роста дрожжей и бактерий на разных комплексных зерновых субстратах в ходе двухстадийного культивирования;

- исследовать показатели качества, органолептические свойства и биологическую ценность функциональных продуктов, полученных путем комплексной микробной биоконверсии зернового сырья.

Научная новизна работы:

- установлено, что дрожжи и лактобактерии могут быть выделены из молока разных видов млекопитающих, однако продуктивность дрожжей на зерновых субстратах имеет тенденцию к нарастанию в зависимости от источника выделения: дрожжи из молока дигастричных - моногастричных -человека;

- штамм дрожжей Pichia anómala 9а, выделенный из женского грудного молока, признан наиболее продуктивным при биоконверсии зернового сырья, установлены и определены его амилолитическая и протеолитическая активности;

- определено, что наиболее продуктивными источниками сырья для накопления дрожжевой биомассы является зерно пшеницы и продукты его переработки - пророщенная пшеница и автолизат зерна пшеницы;

- при сравнении глубинного и твердофазного культивирования дрожжей на зерновом сырье, эффективность использования зернового материала для накопления дрожжей при ТФФ признана в 2-3 раза более высокой;

- при микробной биоконверсии зернового сырья ассоциациями дрожжей и лактобактерий, у ряда лактобактерий отмечено заметное ингибирование роста дрожжей;

- выявлена динамика взаимодействия параллельно выращиваемых дрожжей и бактерий на различных стадиях аэробно-анаэробного культивирования на твердых и жидких зерновых субстратах - интенсивное накопление дрожжевой биомассы на аэробном этапе, разрушение дрожжей и интенсивное накопление лактобактерий на анаэробном этапе;

- сформировано понятие о растительно-дрожжевой субстанции для накопления бактериальной массы и установлена рациональность использования этой субстанции при получении концентратов растительно -дрожже - бактериальных функциональных продуктов методом ТФФ;

- сформировано комплексное представление о свойствах новых функциональных растительно - микробных нутриентов: нутрицевтики -парафармацевтики - биопротекторы.

Практическая значимость результатов работы:

Сформулированы основные приемы селекции из молока млекопитающих дрожжей - продуцентов биомассы на твердых растительных субстратах и формирования дрожже-бактериальных ассоциаций для биоконверсии растительного сырья.

Определен ряд первичных и вторичных зерновых субстратов, перспективных для микробной биоконверсии: измельченное зерно, пророщенное зерно, зерновые автолизаты, зерновая патока.

Для разработки состава комплексных питательных сред, используемых в твердофазном культивировании микроорганизмов, предложен ряд перспективных целлюлозосодержащих субстратов (зерновые отруби, солома,

стебли кукурузы), до трех раз увеличивающих продуктивность зерновых субстратов по биомассе.

Выявлены основные параметры культивирования дрожже-бактериальных ассоциаций на твердых зерновых субстратах.

Разработаны методы аэробно-анаэробной ферментации зернового сырья для получения концентратов и напитков для человека и кормовых добавок для животных, содержащих симбиотические ассоциации дрожжей и бактерий.

Дана физико-химическая и микробиологическая характеристика новых продуктов, оценена их пищевая и биологическая ценность.

Для производства и использования сухого концентрата как посевного материала рекомендован режим высушивания комплексных культур: температура - 40°С, время - 8-10 ч., влажность конечного продукта - 12%.

Разработаны лабораторные регламенты производства

ферментированных напитков и микробных концентратов из пророщенной пшеницы, полученных путем микробной биоконверсии. Оптовая цена таких напитков составляет около 24 руб. за 1 л., а концентратов - около 31 руб. за кг.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на IX Международной научной конференции "Живые системы и биологическая безопасность населения" (Москва, 2011); Международной конференции "Биология-наука XXI века" (Москва, 2012); Конференции, посвященной 125-летию со дня рождения профессора П.М. Силина "Связь времен и поколений, из прошлого в настоящее" (Москва, 2012); Международной конференции «Probiotics and their Applications International Conference» (Ha Noi - Viet Nam, May 31 - June 1, 2013).

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Селекция микроорганизмов - продуцентов биомассы из молока млекопитающих

1.1.1 Микрофлора молока млекопитающих и ее роль в формировании биоценозов желудочно-кишечного тракта

Грудное молоко способствует гармоничному физическому и нервно-психическому развитию младенца, его устойчивости к инфекциям, снижению риска развития ряда заболеваний [74]. Стационарное женское молоко содержит 3-5% жира, 0,8-0,9% белка, 6,9-7,2 % углеводов включая лактозу и 0,2% минера�