автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка технологии активных полимикробных посевных материалов для производства дрожже-бактериальных функциональных продуктов

На правах рукописи

005017082

КАНОЧКИНА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА

^ЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ АКТИВНЫХ ПОЛИМИКРОБНЫХ ПОСЕВНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДРОЖЖЕ-БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность: 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических

активных веществ

1 О [.¡'-П

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2012

005017082

Работа выполнена на кафедре "Биотехнология" ФГБОУ ВПО «Московск*. государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Борнсенко Евгений Георгиевич

Туликова Татьяна Владимировна

доктор технических наук,.

ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств», профессор кафедры «Управление качеством и безопасностью пищевых продуктов и производств»

Тихомирова Ольга Ильинична

кандидат технических наук, доцент, ЗАО «СЖС Восток Лимитед»,

менеджер по развитию направления обучения по России

Ведущая организация: ФГУ Российский государственный аграрный университет ■ МСХА имени К.А.Тимирязева

Защита состоится: мая 2012 г. в в ауд. 302 на заседании Совет

по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.04 при ФГБОУ ВПС «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080 Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «МГУПП».

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, ФГБ05 ВПО «МГУПП».

Автореферат разослан апреля 2012 г.

Ученый секретарь Совета, к.т.н., доцент Тимофеев Д.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современное состояние промышленности и окружающей :реды требует создания эффективных технологий продуктов функционального шначения, направленных на укрепление защитных функций организма человека и кивотных. Роль активных ингредиентов в них могут шрать клетки дрожжей и [актобакгерий. Дрожжевые клетки обладают лакто- и бифидогенными, а также ;орбционными свойствами и при попадании в кишечник стимулируют рост обственной микрофлоры организма, выводя оттуда патогенные бактерии и их оксичные метаболиты. Кроме того, в процессе ферментации пищевых субстратов, (рожжи обогащают их различными физиологически активными веществами.

Таким образом, производство дрожжевых пребиотических препаратов и [родуктов, удовлетворяющих ежедневные потребности организма в необходимых юмпонентах и обладающих свойством регулировать и нормализовать микробиоценозы желудочно-кишечного тракта, является перспективным и актуальным направлением.

Продукты питания, содержащие дрожжи и их метаболиты, на современном |0ссийск0м рынке представлены в основном кисломолочными напитками смешанного ■актериально-дрожжевого брожения типа кефира, тана, катыка. Содержание дрожжевых клеток в таких продуктах не превышает уровня 104-105 кл/г. Технология юдобных напитков предусматривает прямое внесение бактериальных и дрожжевых ультур без использования микробных консорциумов или полимикробных посевных ттериалов. Другие известные напитки дрожжевого брожения (квас, пиво) [редставляют собой, как правило, фильтрованные продукты. В то же время значимые линические эффекты, связанные с лечебно-профилактическим действием дрожжевых леток, показаны только для биологически активных добавок с концентрацией -109 кл/г.

Не менее актуальной проблемой является защита окружающей среды от отходов гропромышленных предприятий (далее АПК) (спиртзаводов, молзаводов, [укомольных предприятий и т.п.). В пищевых отраслях России образуется до 45 млн. т торичных ресурсов и отходов в год, из которых значительная часть используется «эффективно, тем самым нанося огромный вред окружающей среде.

В связи с вышеизложенным, разработка технологии активных полимикробных осевных материалов, в том числе заквасок, на базе отходов агропромышленных редприятий для производства ферментированных напитков и других продуктов бщественного питания, доступных для потребления широким слоям населения, ктуальна и экономически привлекательна.

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационной работы стала разработка технологии активных посевных [атериалов для производства функциональных продуктов на основе жизнеспособных

клеток дрожжей и лактобакгерий. В соответствии с поставленной целью были

определены следующие задачи:

- выявить наиболее перспективные штаммы дрожжей для получения активных полимикробных посевных материалов и провести подбор растительных субстратов для

накопления ими биомассы;

- выбрать способ культивирования дрожжей, подобрать жидкие и твердые питательные среды для роста и накопления биомассы выделенными дрожжами на

основе отходов АПК;

- получить микробные консорциумы на основе выбранных дрожжевых культур и промышленного штамма L. acidophilus La 5 и изучить процесс взаимного влияния культур;

- получить активные полимикробные посевные материалы в сухом, замороженном виде и исследовать выживаемость клеток дрожжей и лактобакгерий в процессе их получения, определить физико-химические и биохимические характеристики, установить сроки и условия их хранения;

- получить жидкие полуфабрикаты на основе активных полимикробных посевных материалов и определить их характеристики и сроки хранения;

- установить возможность использования полученных натуральных, высушенных, замороженных активных посевных материалов и жидких полуфабрикатов для глубинной ферментации жидких субстратов с целью получения питьевых ферментированных продуктов питания;

- разработать рецептуры новых ферментированных продуктов на основе полученных активных полимикробных посевных материалов. Дать физико-химическую и микробиологическую характеристику новых продуктов, оценить их пищевую и биологическую ценность.

Научная новизна.

Впервые установлена возможность производства активных посевных материалов из дрожжей вида Pichia anomala на растительном сырье. Показано, что в качестве сырья для производства дрожжевых посевных материалов могут быть использованы различные виды твердого растительного сырья, как первичного, так и вторичного. Универсальным субстратом для этих целей являются зерновые отруби. Для доведения влажности этих субстратов до оптимального уровня могут быть использованы как вода, так и различные жидкие вторичные продукты.

Наиболее рациональным признано получать активные посевные материалы методом твердофазного культивирования отселекционированных дрожжевых культур.

На различных твердых растительных субстратах констатирована способность дрожжей и лактобакгерий к симбиозу без выраженного взаимного ингибирования.

Установлена возможность получения хранимых активных полимикробных юсевных материалов путем высушивания и замораживания комплексных микробных ультур.

Получены хранимые посевные материалы в виде жидких полуфабрикатов, становлена зависимость их физико-химических и микробиологических показателей от [лительности хранения.

Результаты анализа выявленных зависимостей послужили обоснованием [редложенных в работе технологий производства новых ферментированных продуктов, богащенных биомассой дрожжей и лакгобакгерий, и подтверждением их ¡ункциональных свойств.

Практическая значимость результатов работы.

Из коллекции дрожжевых культур МГУ!ill, отобраны штаммы дрожжей, наиболее ктивно накапливающие биомассу при росте на первичных и вторичных сырьевых есурсах АПК. Выявлено несколько перспективных штаммов дрожжей относящихся к оду Pichia, из них максимальную продуктивность по биомассе показал штамм Pichia nomala PI. В результате проведенных исследований установлено, что данный штамм бладает некоторой антагонистической активностью по отношению к условно-атогенным микроорганизмам.

Показано, что в условиях твердофазного культивирования наблюдается большее акопление биомассы выбранными штаммами дрожжей, чем при глубинной >ерментации.

Впервые получены активные полимикробные посевные материалы на основе рожжей Pichia anomala PI и лактобактерий Lactobacillus acidophilus La 5 в натуральном, ысушенном, замороженном состояниях, а также в виде жидких полуфабрикатов, [оказана возможность сушки при 40С°. Разработаны технологический регламент и ехнические условия на сухие активные полимикробные посевные материалы. Подана аявка на патент РФ «Способ получения активного полимикробного сухого посевного ;атериала для производства продуктов функционального питания» per. №2012110630 от 1.03.2012г. Разработана технология получения активных посевных материалов, [роведен расчет экономической эффективности разработанной технологии, который оказал, что оптовая цена полученного посевного материала составляет 60 руб за 1 кг.

Определены физико-химические и биохимические характеристики полученных ктивных полимикробных посевных материалов. Установлены сроки и условия их ранения: 40 сут - для жидких полуфабрикатов и 100 сут - для других видов посевных атериалов.

Получены новые ферментированные напитки на базе активных полимикробных осевных материалов. Дана физико-химическая и микробиологическая характеристика

новых продуктов, оценена их пищевая ценность, доказано их соответствие требованиям безопасности, предъявляемым к продуктам питания. Наработаны опытные партии новых ферментированных напитков на стендовой установке ГНУ ВНИИПБТ РАСХН. Результаты проведенной работы подтверждены актами. Проведена органолептическая оценка образцов на кафедре «Технология общественного питания» МГУПП. Полученные результаты также подтверждены актами.

Апробация работы.

Основные положения работы докладывались на российских и международных конференциях и симпозиумах: Первой научно-практической конференции с международным участием "Безопасность и экология предприятий пищевой промышленности. Инновационные решения использования отходов пищевых производств" (Москва 2009); VII международная научно - практическая конференция "Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты" (Москва 2009); Первой международной научно-практической конференции "Идентификация фальсифицированных пищевых продуктов. Контроль содержания и безопасность наночастиц в продукции сельского хозяйства и пищевых продуктах" (Москва 2009); EurasiaBio 2nd International Congress-Partnering & Exhibition on Biotchnology and Bioenergy, Moscow 2010; III межведомственной научно-практической конференции "Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров", (Москва 2010); IX Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва 2011).

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК, 1 заявка на патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 228 источников (в том числе 68- на иностранных языках) и 8 приложений. Работа изложена на 174 страницах, содержит 30 рисунков, 25 таблиц.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы рассмотрены современные способы переработки растительного и животного сырья. Дана характеристика основных сырьевых ресурсов, использование которых возможно для биоконверсии в целевые продукты, оценена их перспективность. Приведены примеры использования микробной конверсии в производстве продуктов питания. Освещена роль функционального питания в качестве средства оздоровления населения. Определены основные виды заквасок и посевных материалов, используемых в биотехнологии ферментированных продуктов.

Рассмотрены функциональные свойства дрожжей и молочнокислых бактерий. Приведены примеры их симбиотического использования в пищевой промышленности.

Анализ данных литературы выявил проблемы, существующие в данной области, и позволил сформулировать цели и задачи настоящего исследования.

3. ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследования проводились на кафедре «Биотехнология» МГУПП, в испытательном лабораторном центре «Биотест» МГУПП, а также в лаборатории «Молекулярные основы патогенности» ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф, Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

3.1 Материалы и методы исследований

Объектом исследования были различные штаммы дрожжей рода Pichia, взятые из коллекции культур микроорганизмов кафедры «Биотехнология» МГУПП. В работе также применяли бактериальную закваску прямого внесения промышленного изготовления в лиофильно-высушенной форме: термофильную моноштаммовую Lactobacillus acidophilus (Chr. Hansen, Дания). В качестве контроля использовали штамм Candida famata Т8, уже более 10 лет, использующийся для производства функциональных продуктов «Фервитал» и «Фервистим».

В качестве компонентов для создания питательных сред использовалось сырье: сенная мука ГОСТ 4808-87, отруби пшеничные ГОСТ 7169-66 , сухая сыворотка ТУ 10.02.927-91, морковь ГОСТ Р 51782-2001, кукуруза и ее растительные компоненты ГОСТ 13634-90, послеспиртовая барда сухая ТУ 9182-082-00334586-2007.

Для поддержания культур лактобактерий и дрожжей, их учета и определения антагонистической активности применяли питательные среды производства ФГУП ГНЦПМ, г. Оболенск.

Глубинную ферментацию вели в качалочных колбах на круговых лабораторных качалках при 180-220 об./мин. Продолжительность ферментации - 24 - 48 ч, температура 30±2°С. ТФФ в лабораторных условиях проводили в чашках Петри и в качалочных колбах при высоте слоя 1-3 см и влажности субстрата 50-55%. Чашки Петри или колбы помещали в термостат на 48 ч при температуре воздуха 30±2°С и влажности 90-95%.

Титруемую кислотность определяли в соответствии с ГОСТ 3624-92, ГОСТ 27493-87, активную кислотность - потенциометрическим методом на рН-метре HANNApH211

Содержание общего белка проводили в соответствии с ГОСТ 23327-98, ГОСТ 10846-91, «сырого протеина» - по методу Несслера,

Антагонистическую активность дрожжей изучали методом лунок в соответствии с МУ 2.3.2.2789-10. 2.3.2., определение подавления токсинообразования

St.aureus FRI722 дрожже-бактериальными ассоциациями проводили в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи».

Определение содержания молочнокислых микроорганизмов проводили в соответствии с ГОСТ 10444.11-89, дрожжей - в соответствии с ГОСТ 10444.12-88

Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли по программе Excel 2007 Microsoft Office, вычисляя среднее значение и стандартное отклонение для каждой величины, а также доверительный интервал при уровне значимости 95%.

3.2 Результаты исследований и их обсуждение.

3.2.1 Тестирование коллекционных дрожжевых культур МГУПП на различных

субстратах

С целью выявления наиболее перспективных штаммов дрожжей для получения активных полимикробных, посевных материалов было проведено тестирование коллекционных дрожжевых культур МГУПП, выделенных из женского грудного молока.

Таблица 1

Продуктивность дрожжей при твердофазной ферментации (ТФФ) на различных _ субстратах__

№ п/п Штамм дрожжей Р. anómala Накопление биомассы дрожжевыми культурами в течение 48 ч, при температуре 30 С° на различных растительных субстратах, увлажненных водой до уровня влажности 55% 10 кл/гна

отрубях сенной муке натуральной кукурузе высушенной кукурузе

1 Н1 2,44 2,76 2,68 1,36

2 Al 1,28 2,20 2,08 0,96

3 25 0,96 0,60 0,44 0,28

4 А2 0,44 0,08 0,52 0,12

5 II 2,68 2,68 332 1,96

6 12 0,44 0,32 0,44 0,28

7 13 0,96 0,52 0,60 0,32

8 L1 1,36 0,12 0,84 0,64

9 9В 3,80 3,28 3,48 2,56

10 TI 0,40 1,04 0,32 0,28

11 19 3,08 3,48 2,56 2,68

12 11 0,44 0,28 0,32 0,12

13 14 1,04 1,96 1,68 1,00

14 PI 536 4,40 4,60 3,80

1S 8 2,84 2,32 2,68 1,96

16 17 0,60 1,00 1,04 0,72

17 9A 4,84 4,04 4,08 3,96

контроль С. famata T8 2,56 1,68 2,84 1,36

В данном исследовании (табл. 1) в качестве субстратов использовали отруби,

сенную муку, растительные компоненты сельскохозяйственных культур (в основном стебли и початки кукурузы, как в натуральном виде, так и в высушенном).

В процессе тестирования были выделены несколько штаммов-П.9В.9а,19.Р1, превосходящие контрольный штамм С. Гата1а(Нагп50п)Т8 по продуктивности.

Для более детального изучения влияния состава комплексной питательной среды из растительного субстрата и увлажняющего (до уровня влажности -55%) материала на прирост дрожжевой биомассы было предложено в качестве жидкого компонента среды использовать послеспиртовую барду (П.Б.) и молочную сыворотку (М.С.) (табл. 2). Выявлена определенная зависимость продуктивности дрожжей от добавляемого жидкого компонента питательной среды, причем для каждого растительного субстрата этот компонент свой.

Таблица 2

Продуктивность дрожжей при ТФФ на растительных субстратах с добавлением

различных увлажняющих компонентов

Штамм м/о Накопление биомассы дрожжевым» культурами. 10'' кл/г на

отруоях с сенной муке с натуральной кукурузе с высушенной кукурузе с

Г1.Б. М.С. вода П.Б. М.С. вода П.Б. М.С. вода 11 Б. М.С. вода

P.anomala Р1 3,64 5,68 4,36 5,68 5,32 4,92 4,64 5,68 5,96 3,76 3,92 3,88

P.anomala 9а 4,8 5,46 4,2 4,48 3,84 3,6 4,56 4,96 5,08 2,6 3,64 3.24

9в 3,88 4,2 3,80 3,48 3,60 3,28 3,32 3,24 3,48 2,4 2,68 2,56

19 2,08 2,56 3,08 3,84 3,32 3,48 2,88 3,4 2,56 1,32 1,24 2,68

P.guilliermondi И 2,74 1,24 2,08 2,60 2,80 2,68 2.56 2,6 3,32 2,0 2,08 1,96

Для дальнейших исследовании были выбраны более продуктивные штаммы Picliia anómala 9а. Р1. 9в и 19. В качестве перспективного субстрата для получения активных посевных материалов пищевого назначения были выбраны отруби, увлажненные либо водой, либо 6% молочной сывороткой. Этот выбор обоснован универсальностью отрубей в качестве компонента пищевых продуктов, а также адаптированностыо населения к их применению.

3.2.2 Выбор способа культппировапия наиболее перспектпвпых штаммов дрожжей

При поверхностном культивирований дрожжей контрольного штамма С. famata(Harrison)T8 и Р. anómala 9а. Р. anómala Р1 при дозе посевного материала на уровне 107 кл/г основной прирост дрожжевой биомассы приходился на первые двое суток культивирования и составил более двух порядков, достигая 5.68*109кл/г (рис.1).

При глубинном культивировании (ГФ) на средах из воды с добавлением различного процента отрубей в условиях аэрации была отмечена зависимость в накоплении биомассы данных штаммов от степени гетерогенности среды для культивирования (рис.2). При добавлении пшеничных отрубей биомасса незначительно, но все-таки нарастала: максимум достигался при 8% содержания отрубей в жидкой среде и составил 0,62*10чкл/см3. При добавлении большего количества отрубей (10%) видимого увеличения численности С. famata Т8, Р. anómala 9а. P.anomala Р1 не наблюдалось.

1 0,023

0 (поемная доза)

время ферментации, ч

2 4 6 8 10 Содержание отрубей, %

Рис. 1 Накопление биомассы дрожжевыми Рис. 2 Накопление биомассы дрожжевыми культурами при ТФФ в течение 72 ч культурами при ГФ в течение 48 ч

Проведенные исследования позволили выбрать твердофазный способ

культивирования, при котором продуктивность дрожжей на порядок больше, чем при глубинной ферментации. При этом осуществление ТФФ более реально и целесообразно, так как при данном способе ферментации отсутствуют сложные и дорогостоящие операции, связанные с выделением и концентрированием продукта.

3.2.3 Определение антагонистической активности наиболее перспективных

дрожжей.

В литературе имеются сведения об антагонистической активности дрожжей вида Pichia anómala (Greame М. Walker, 2011; Jijakli MH ,2010; Laitila A et al,2007) по отношению к различным видам условно-патогенных микроорганизмов. С целью определения функциональных свойств отобранного штамма дрожжей Pichia anómala PI проводились исследования по определению антагонистической активности вышеуказанного штамма по отношению к условно-патогенным культурам микроорганизмов: E.coli, Е. cloacae В 2073, К. oxytoca sypi. E.aerogenes. Зоны задержки роста при использовании всех использованных условно-патогенных культур, с учетом диаметра самой лунки - 7 мм. не превышали 11-12 мм. такой штамм дрожжей в соответствии с МУ 2.3.2.2789-10. 2.3.2 относят к слабым антагонистам.

3.2.4 Развитие микробных консорциумов в аэробных условиях

С целью получения активных полимикробных посевных материалов с более выраженными функциональными свойствами была поставлена задача создать микробный консорциум на основе отобранных дрожжевых культур и лактобактерий и изучить взаимное влияние его составляющих. В данной работе был использован

характерный представитель пробиотиков - промышленный штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus La 5.

Для изучения влияния лактобактерий на отобранные дрожжевые культуры была поставлена твердофазная ферментация в течение 48 ч. при температуре 30±2С°, на выбранных в п.3.2.1 субстратах (рис. 3). Ингибирующее и стимулирующее влияние бактериальной составляющей на накопление биомассы дрожжей установлено не было.

Варианты состава субстратов i

нультиоируемых на них микроорганизмов

Рис.3. Продуктивность выбранных дрожжевых культур при ТФФ в зависимости от состава субстрата и присутствия L. acidophilus La5.

Варианты состава субстратов и культивируемых на них микроорганизмов:

2- натуральная кукуруза + вода+ Pichia anómala Pl

I- натуральная кукуруза + М.С. + Pichia anómala Pi 3- отруби + М.С. + Pichia anómala Pl

5- натуральная кукуруза + М.С. + Pichia anómala 9а 7- отруби + М.С. + Pichia anómala 9а 9- натуральная кукуруза + М.С. + дрожжи 9в

II- отруби + М.С. +дрожжи 9в

13- натуральная кукуруза + М.С. + дрожжи 19 15- отруби + М.С. ■ дрожжи 19

4- отруби +вода + Pichia anomalaPla

6- натуральная кукуруза + вода Pichia anómala 9а

8- отруби t-вода + Pichia anómala 9а

10- натуральная кукуруза + вода дрожжи 9в

12- отруби +вода + дрожжи 9в

14- натуральная кукуруза + вода+ дрожжи 19

16- отруби+вода+дрожжи 19

На накопление биомассы клеток L. acidophilus La 5 на отрубях, увлажненных 6%

молочной сывороткой,

выбранные дрожжевые

культуры влияли очень незначительно (рис.4).

Максимальный результат был достигнут при внесении в субстрат штамма Pichia anomala Pl и составил 5,2*10s КОЕ/г.

Рис.4 Влияние дрожжей на жизнеспособность и накопление биомассы L. acidophilus La 5

Оптимальное соотношение дрожжевых культур и вносимых лактобактерий составило 1:1. Установлено, что внесение лактобактерий в дрожжевые культуры практически не снижает уровень рН полученных активных посевных материалов по всем вариантам, указанным в рис. 3.

3.2.5 Развитие микробных консорциумов в анаэробных условиях.

Лактобациллы являются облигатными обитателями кишечника поэтому благоприятными условиями являются температура 37С°. отсутствие аэрации и содержание в среде достаточного количества питательных веществ. Для глубинного культивирования выбрали жидкую среду, состоящую из молочной сыворотки и 8% отрубей, при этом были созданы анаэробные условия путем использования матрацев с резиновыми пробками или завязывания полиэтиленовой пленкой качалочных колб.

Присутствие дрожжевых культур стимулировало развитие культуры L. acidophilus

¿я5(рис.5), прирост биомассы при совместном развитии увеличился в 1.5 раза. Таким образом. в условиях, частично имитирующих

условия пищеварительного тракта, т.е. in vitro, показано, что клетки дрожжей Р. anomala PI и P. anomala 9а являются потенциальным регулятором микрофлоры пищеварительного тракта.

Рис.5 Динамика изменения жизнеспособных клеток дрожжей и лактобактерий в анаэробных условиях

Дрожжи при совместном развитии с L. acidophilus La5 в анаэробных условиях

практически не изменяли свою численность и к концу ферментации содержание жизнеспособных клеток дрожжей P.anomala PI составило 5.2*107КОЕ/см\ P. anomala 9а - 5,4*107КОЕ/см3.

3.2.6. Выживаемость микробных консорциумов при получении сухих посевных материалов.

Полученные активные полимикробные посевные материалы на основе пшеничных отрубей, увлажненных водой или молочной сывороткой, содержат жизнеспособные клетки дрожжей и лактобактерий на уровне 10 'КОЕ/г. Рекомендуется хранение при температуре 4С° не более 30 суток. Для увеличения сроков хранения и возможности транспортировки посевных материалов, их сушат. При этом важно подобрать такой режим сушки, чтобы наименее травмировать живые клетки микроорганизмов в составе посевных материалов. Было предложено несколько температурных режимов сушки - при 35 С°. 40 С° и 50 С°.

Экспериментальные данные (рнс.6) позволили выбрать режимы сушки при температуре 35 С°и 40 С° когда действие на жизнеспособные клетки дрожжевых культур не так травматично, погибло всего 10-20 % дрожжевых клеток.

молочная оода сыворотка

молочная вода молочная вода сыворотка !сыворотка

молочная сыворотка

Досушки

после сушки при температуре 35С в течение 8 ч

послесушки при температуре ДОС Й,0014 0 течение 5 ч

■ после сушки при температуре 50С в течение 3 ч

Р. anómala 9а+ LaS ; Р. anómala Р1+ LaS ; дрожжи 9b+La5 дрожжи №19+La5 состав субстрата и культивируемых на нем микроорганизмов

Рис. 6 Влияние температурного режима сушки на число жизнеспособных клеток дрожжей

Однако. высушивание при температуре 40С° происходило быстрее, соответственно целесообразно применять данный режим сушки. Высушивание при 50С° приводило к почти полному отмиранию дрожжевых клеток - живыми оставалось менее 0,1%.

послесушки при температуре 35С в 25 течение 8 ч

■ послесушки при температуре 40С в течение 5 ч

■ послесушки при температуре БОС в течение 3 ч

о S

Pichia anómala 9а i Pichia anómala P1 Pichia anómala 9b №19

Состав субстрата и культивируемых на нем микроорганизмов

Рис. 7 Влияние температурного режима сушки на число жизнеспособных клеток лактобактерий

При изучении влияния различных температурных режимов сушки на лактобактерии установлена та же зависимость, что и для дрожжевых культур. Действие высоких температур па жизнеспособные клетки лактобактерий более травматично, чем на жизнеспособные клетки дрожжей, погибло 22- 59 % клеток лактобактерий (рис.7). Однако, оставшееся количество жизнеспособных клеток лактобактерий. которое составило 0.13-0,29*109 КОЕ/г. вполне достаточно для дальнейших ферментаций

3.2.7. Выживаемость микробных консорциумов при получении замороженных посевных материалов.

Для увеличения сроков хранения и возможности транспортировки посевных материалов их замораживали при температуре -18°С в течение 12 ч. Установлено, что уровни выживаемости дрожжевых культур при воздействии низких температур (-18°С) на 10% меньше, чем при воздействии высоких (40°С )(рис. 8).

■до заморозки

вода М.С. М.С. М.С

P.anomala Р. anómala дрожжи дрожжи

9a*laS Pl+laS 9btla5 №№LaS

Штаммы микроорганизмов

«ода М.С. М.С. М.С.

Р. anómala Р. anómala ДРОЖЖИ дрожжи

9а* La5 PI« LaS 9b+la5 №19»US

штаммы микроорганизмов

Рис.8 Влияние заморозки при -18 С° на Рис.9 Влияние заморозки при -18 С0 на число жизнеспособных клеток дрожжей число жизнеспособных клеток лактобактерий Количество жизнеспособных клеток дрожжевых культур после воздействия температуры -18 С° в течение 12 ч в процентном соотношении к изначальному числу составляет 46.2-81.8 % в зависимости от штамма дрожжей.

При изучении влияния низких температур на лакгобактерии установлено, что уровень выживаемости L. acidophilus La5 при воздействии низких температур (-18°С) на 15% больше, чем при воздействии высоких (40°С Крис. 9). Количество жизнеспособных клеток лактобактерий после воздействия температуры -18 С° в течение 12 ч в процентном соотношении к изначальному числу составило 80-92.3 %.

3.2.8. Определение сроков и условий хранения полученных активных замороженных и сухих посевных материалов.

При хранении сухих активных полимикробных посевных материалов при температуре 10С° установлена зависимость количества жизнеспособных клеток лактобактерий и дрожжей от длительности хранения (рис. 10). При хранении в течение 100 сут сухих посевных материалов выживаемость активных культур составила 80-85%, что соответствует 2,5*Ю9КОЕ/г дрожжей и 0.34*109 КОЕ/г лактобактерий для штамма

P.anomala PI и L.acidophilus La5, 1,8*10чКОЕ/г и 0.2*ЮчКОЕ/г - для P.anomala 9а и L.acidophilus La5.

■ p. anomala 9a * LaS

t P. anomala Pl+La5

о процессе хранения сухих посевных материалов в течение. сут.

в процессе хранения сухих посевных материалов в течение, сут.

лактобактерий

время хранеиия.сут.

дрожжевых культур

Рис. 10 Влияние длительности хранения сухих активных полимикробных посевных материалов на активность культур микроорганизмов

При хранении замороженных посевных материалов в морозильнике (-18С°)

динамика изменения жизнеспособных клеток лактобактерий и дрожжей такая же. как и

при хранении сухих посевных материалов (рис. 11). Установлено, что хранение сухих и

замороженных активных полимикробных посевных материалов без снижения

жизнеспособности культур микроорганизмов возможно в течение 100 сут. Полученные

посевные материалы могут быть использованы для глубиной или твердофазной

ферментации различных субстратов с целью получения новых ферментированных

продуктов.

Рис. 11 Влияние длительности хранения замороженных активных полимикробных посевных материалов на активность культур микроорганизмов

3.2.9. Определение физико-химических характеристик полученных посевных

материалов

Установлено, что активная кислотность полученных посевных материалов варьировалась в диапазоне 6,92-7,30 ед. рН. титруемая в диапазоне 24-30 °Т (рис.12), что не влияло на органолептические свойства получаемых продуктов.

Ш Pichia anómala 9а +La5 натуральна« т Pichia anómala 9а -*La5 сухая

Ш Pichia anómala 9а + La 5

замороженная

■ Pichia anómala PI+La5 натуралвная

■ Pichia anómala PI *La5 сухая

m Pichia anómala P1+LaS

замороженная

Рис. 12 Активная и титруемая кислотность полученных посевных материалов

Содержание «сырого протеина» в посевных материалах составило 10,8-20.0 %. что характеризует полученные посевные материалы как потенциальные обогатители пищевых продуктов.

3.2.11. Динамика изменения количества жизнеспособных клеток микробного консорциума при производстве жидкого полуфабриката

Помимо натуральных, сухих и замороженных посевных материалов возможно получение жидких полуфабрикатов, которые также имеют длительные сроки хранения и могут стать основой для новых ферментированных продуктов. В отличие от сухих и замороженных посевных материалов, в жидких полуфабрикатах, которые получаются путем разбавления жидким компонентом натуральных посевных материалов (гидромодуль 4:1) создаются благоприятные условия для развития L.acidophilus La 5. Лактобактерии подкисляют среду, тем самым играя роль натурального консерванта делают невозможным развитие посторонней микрофлоры.

Экспериментально установлено, что в жидких полуфабрикатах с течением времени количество клеток лактобактерий резко увеличивалось (рис. 14). в то время как дрожжи прекращали свой рост и постепенно их количество сокращалось более чем на порядок (рис. 13). из этого можно сделать вывод, что дрожжи являлись источниками питательных веществ для роста и развития молочнокислых бактерий.

Рис. 13 Влияние длительности хранения Рис. 14 Влияние длительности хранения жидких жидких полуфабрикатов па количество полуфабрикатов на количество жизнеспособных жизнеспособных клеток дрожжей клеток Ь.ас1с1орЫ1и8 Ьа 5

3.2.12. Определение физико-химических показателей жидких полуфабрикатов

В процессе хранения жидких полуфабрикатов наблюдалось значительное закиеление среды до уровня 4.0-4.5 ед. рН(рис. 15). При этом важно отметить, что интенсивное понижение активной кислотности наблюдалось в первые 5 сут. Основное увеличение титруемой кислотности происходило также в первые 5 сут и составило 80-112°Т (рис. 16). При дальнейшем хранении отмечено незначительное изменение титруемой и активной кислотности - не более 5%.

V

к

J2

а

h <

о

в процессе «ранения жидкою полуфабриката в течение, сут.

-Ис1шэ1«ш1а9э * La5 6% молочная сыворотка

—Pichia anómala 9а» 1а5 7% сахарный раствор

-Pichia anomalaPl +1а5 6% молочная сыворотка

-Pichia anomalaPl ♦1а5 7% сахарный раствор

140 120 100

I О

-Pichia anómala 9а t la56tí молочная сыворотка

-Pichiimimh9i> laS 7% сахарный раствор

-Pichia anómala Р1 tla5 6% молочная сыворотка

в процессе хранения жидкою полуфабриката в течение, сут.

-Pichia anómala Р1 tla5 7% сахарный раствор

Рис. 15 Влияние длительности хранения Рис. 16 Влияние длительности хранения жидких полуфабрикатов на активную жидких полуфабрикатов на титруемую

кислотность среды кислотность среды

-Pichia anoi»3laPl +La5 6% молочная

сыворотка

-^Рк1шапота1а9а» 43 1а5 6% молочная сыворотка

39 -•-РкМаапотэИа» 1а5 7% сахарный раствор

в процессе хранения жидкого полуфабриката 9 течение, сут.

-Pichia anomalaPl tlaS 7% сахарный раствор

В полученных жидких полуфабрикатах содержался «сырой протеин» на уровне 1,83-2.02 г на 100 мл. что позволило использовать их в качестве обогатителей пищевых продуктов. Содержание сухих веществ (СВ) в жидком полуфабрикате составило 16,8018,75 %.

3.2,13. Характеристики продуктов, полученных при ферментации молочной основы активными полимикробными посевными материалами

Приготовление нового молочного ферментированного продукта осуществляли методом глубинной ферментации молока питьевого с массовой долей жира 0.5% сухими, замороженными, натуральными активными полимикробными посевными материалами (гидромодуль 10:1) и жидкими полуфабрикатами (гидромодуль 3:1).

Установлено, что в процессе получения нового ферментированного напитка количество жизнеспособных клеток дрожжевых культур уменьшается (рис. 17) пропорционально увеличению количества активных клеток лактобактерий (рис.18). При этом длительность ферментации можно изменять в зависимости от необходимых показателей выживаемости культур микроорганизмов.

0,35

0,3

К Посевная доза (в напитке до ферментации)

•после 18 ч ферментации

ЯпослеЗбч ферментации

■после 48ч ферментации

1 2 3 4 5 6 7 варианты вносимых посевных материалов

S Посевная доза (внапиткедо ферментации) •после 18ч ферментации

ШослеЗбч ферментации

* после 48 ч ферментации

" варианты вносимых посёвных^атерйалов ®

Рис. 17 Влияние длительности ферментации Рис. 18 Влияние длительности ферментации на жизнеспособность дрожжевых культур на жизнеспособность лактобактерий

Варианты вносимых посевных материалов:

1- натуральный посевной материал на основе P.anomala 9а +La5

2- сухой посевной материал на основе P.anomala 9а +La5

3- замороженный посевной материал на основе P.anomala 9а ' La5

4- жидкий полуфабрикат на основе 6% М.С. и P.anomala 9а +La5

5- натуральный посевной материал на основе P.anomala Pl +La5

6- сухой посевной материал на основе P.anomala Pl +La5

7- замороженный посевной материал на основе P.anomala Pl +La5

8- жидкий полуфабрикат на основе 6% М.С. и P.anomala Р I -La5

При этом наилучшие результаты вне зависимости от вида вносимого посевного материала показали микробные консорциумы на основе лактобактерий и Р.апота1а Р1.

В процессе ферментации активная кислотность уменьшалась до уровня 4.52 ед. рН (рис. 20). титруемая - возрастала и составила через 48 ч ферментации 120°Т, при дальнейшей ферментации изменение титруемой и активной кислотности незначительно - не более 3 % (рис. 19).

Рис. 19 Влияние длительности ферментации Рис. 20 Влияние длительности ферментации на титруемую кислотность полученных на активную кислотность полученных новых ферментированных напитков новых ферментированных напитков

Физико-химические, микробиологические и органолептические показатели

полученных продуктов представлены в табл. 3.

Таблица 3

Органолептические. химические и микробиологические показатели разработанных новых ферментированных напитков на молочной основе_

Наименование показателя Значение показателя для молочных напитков (питьевых йогуртов)

!. Массовая доля белка. % не менее 3,0

2. Содержание СВ. % не менее, в том числе отруби . не более 17 10

3. Активная кислотность среды. рН не менее 4,5

4. Титруемая кислотность среды, в С" Тернера не более 110

5. Содержание дрожжей, КОЕ/г не менее 110

6. Содержание молочнокислых бактерий. КОЕ/г не менее 1Т09

7. БГКП (колиформы), КОЕ в 0,01 г Не допускается

8. Патогенные м/о. вт.ч. сальмонеллы, КОЕ в 25 г Не допускается

9. Споры грибов, КОЕ в 1 г Не допускается

10. Внешний вид. цвет и консистенция Однородная, в меру вязкая, молочно-белая с наличием включений зерновых отрубей

11. Запах и вкус Свойственный молочнокислым продуктам

12. Масса нетто, упакованной единицы, л, не менее 0,1

3.2.14. Сравнение полученных новых молочных ферментированных продуктов питания с уже представленными па рынке РФ

Для определения конкурентоспособности полученных новых молочных ферментированных продуктов были исследованы образцы молочных напитков с добавками зерновых культур, закупленные в торговой сети г. Москвы с целью определения их состава и свойств (табл. 4).

Таблица 4

Сравнительная характеристика питьевых йогуртов, представленных на рынке

№ Измеряемый параметр

п/ Наименование продукта Активная Титруе- Содер Содер В том Мас- Содер

п кислот- мая жание жание числе совая жание

ность кислот- дрож- МКБ, лактоба доля белка

среды,ел. рП ность среды. °Т жей. КОЕ/г КОЕ/г ктерии. КОЕ/г СВ. % в г на 100 г

1 Биойогурт «Юнимилк» со 4,32 104 0,2*10' 1,1*10" 1,5*10 18,3 3,1

паками

о Биойогурт «Лакомо» злаки 4,46 86 3*10' 4.0*10" - 16,3 2.8

3 Иоглрт питьевой «Эрмигурт prebiotic» 5 злаков 4,48 95 2,5*10'' 3,6*10'' 17,9 3,1

4 Йогурт «активна» со злаками 4,56 88 2*104 1,2*10" - 17,6 2,8

5 Йогурт «Большая кружка» хлаки и земляника 4,51 89 1*104 4,2*10" 1,6*10' 19,1 2,8

6 Питьевой йогурт, полученный с использованием сухого посевного материала на отрубях P.anomala 9а L.acidophilus La5 4,52 92 1,3*10' 4,2*10" 4,2*10" 18,3 3,3

7 Питьевой йогу рт, полученный с использованием сухого посевного материала на отрубях Р. anómala Р1+ L.acidophilus La5 4,6 96 3*10 5,0*10" 5.0*10'' 17,9 4.3

Установлено, что полученные новые ферментированные молочные продукты превосходят существующие аналоги молочных напитков с добавками зерновых культур по всем определяемым показателям

3.2.15 Показатели безопасности полученного нового ферментированного

напитка

При производстве пищевых продуктов на основе молока предъявляются жесткие требования, изложенные в нормативной документации (СанПиН 2.3.2.1078-01. 88-ФЗ от 12 июня 2008 г.). Анализ содержания токсичных элементов, радионуклеидов и пестицидов в новом ферментированном молочном продукте на основе микробного консорциума, содержащего Р. anómala Р1 и L.acidophilus La5, был выполнен в испытательном центре пищевой продукции ЗЛО «Ростест-Москва». Результаты (табл. 5) подтверждены протоколом химико-аналитических исследований.

Таблица 5

Наименование Фактическое значение Единица измерения Норматив

Токсичные элементы: ртуть мышьяк кадмий свинец менее 0,002 менее 0,002 менее 0,005 менее 0,06 мг/кг не более 0,005 не более 0,05 не более 0,03 не более 0,1

Пестициды: ГХЦ ддг менее 0,008 менее 0,005 мг/кг не более 0,05 не более 0,05

Радионуклиды^-13 7 Бг-90 менее 5 менее 10 Бк/л не более 100 не более 25

Полученные результаты свидетельствуют о соответствии нового разработанного ферментированного напитка на молочной основе требованиям Федерального закона Российской Федерации от 12 июня 2008 г. N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию" и возможности его реализации в качестве пищевого продукта.

3.2.16 Взаимодействие полученных комплексных культур и патогенных микроорганизмов

Исследования, проведенные в лаборатории «Молекулярные основы патогенности» (группы «Стафилококковых инфекций») ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, показали, что инактивированные комплексные дрожже-бактериалыше культуры ингибирующего действия на выбранный нами модельный штамм патогенного стафилококка и его токсинообразование не оказывали, они даже несколько стимулировали рост модельной культуры и ее токсинообразование (табл. б).

Таблица 6

Показатели роста и функциональных свойств токсинообразующих St.aureus FRI722 при

совместном выращивании с полученными комплексными культурами

№ п/ п Штамм lg КОЕ/ см3(г) Фосфоли-пазная активность, % рн Концентрация токсина

б/ Р 1:10 1:50 1:100 1:200

1 Контроль S. aureus FRI 722 10,8 100 7,8 + + + - -

2 Контроль 2 S. aureus FRI 722 10,2 25 5,0 + + - -

3 Контроль S. boulardii живые 9,5 100 8,4 + + + + -

Контроль S. boulardii инакт.* 10 100 8,2 + + + + +

4 Р. anomala 9а + La 5 на отрубях 10 90 8,6 - - - - -

5 Р. anomala 9а +La5 на отрубях инакт*. 12т3 100 8,2 + + + + -

*инакт - инактивированный (прогретый при 100°С 15 минут)

Эти данные позволили сделать заключение, что дрожжи являются в основном нутриентами - стимуляторами роста бактерий. Таким образом, позитивное действие дрожжей при токсикоинфекциях в макроорганизме достигается их непрямым влиянием на токсигенный микроб через стимулирование активности собственной полезной микрофлоры кишечника. Роль же прямых биокорректоров принадлежит, скорее всего, бактериальной составляющей микробного консорциума, а значит, разработанные в

21

настоящей работе пищевые продукты должны содержать живые комплексные культуры и прежде всего культуры лакгобакгерий.

3.2.17. Характеристики продуктов полученных при ферментации 7% сахарного раствора активными полимикробными посевными материалами

Приготовление нового ферментированного напитка осуществляли методом глубинной ферментации 7% сахарного раствора сухими, замороженными, натуральными активными полимикробными посевными материалами (гидромодуль 10:1) и жидкими полуфабрикатами (гидромодуль 3:1) в течение 72 ч. Для получения лучших органолептических свойств проводили фракционирование напитков на твердую (может использоваться в качестве обогатителя пищевых продуктов) и жидкую (питьевой напиток) фазы.

Физико-химические, микробиологические и органолептические показатели полученных продуктов представлены в табл. 7.

Таблица 7

Органолептические, химические и микробиологические показатели разработанных новых ферментированных напитков и обогатителей пищевых продуктов

'Зттпттауттга ппичат»*»

Наименование показателя Значение показателя

для пищевого обогатителя (твердая фаза') для питьевого напитка (жидкая фаза)

1. Массовая доля белка, % не менее 5 0,5

2. Содержание СВ, % не менее, 35 8

3. Содержание дрожжей, КОЕ/г не менее МО" не менее 1-10'

4. Содержание молочнокислых бактерий, КОЕ/г не менее МО" не менее 1-10"

5. БГКП (колиформы), КОЕ в 0,01 г Не допускается Не допускается

6. Патогенные м/о, в т.ч. сальмонеллы, КОЕ в 25 г Не допускается Не допускается

7. Споры грибов, КОЕ в 1 г Не допускается Не допускается

8. Внешний вид, цвет и консистенция Однородная влажная крупка от светло — коричневого до коричневого цвета Однородная, прозрачно-бежевая жидкость

9. Запах и вкус Свойственный зерновым продуктам Свойственный сахаристым напиткам

10. Масса нетто, упакованной единицы, л, не менее кг, не менее 0,9 0,1

3.2.18 Наработка опытных партий новых ферментированных напитков.

На основании лабораторных исследований был разработан технологический регламент и технические условия на сухой активный полимикробный посевной материал. Разработана технологическая схема получения сухих посевных материалов (рис 21). Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии, который показал, что оптовая цена полученного посевного материала составляет 60 руб за 1 кг.

Наработаны опытные партии новых ферментированных напитков на основе полученных сухих посевных материалов на стендовой установке ГНУ ВНИИПБТ

22

РАСХН. Проведена органолептическая оценка образцов полученных гольевых напитков на кафедре «Технология общественного питания» МГУПП.

отвуби ВР-1.1 Прием и хранение сырья

ВР-1.2 Биологическая проверка сырья ВР-1 Подготовка

ВР-1.3 Взвешивание и дозирование сырья _ сырья

воздух ВР-2.1 Предварительная очистка воздуха БР-2

ВР-2.2 Стерилизация в головных и индивидуальных фильтрах

вода ^

Приготовление кальцинированной соды

~^\ВР-3.2\ Приготовление перекиси водорода |—

_вова_ пар

воздух пер

ВР-4.1\Мойка и стерилизация оборудований

ВР-4.2

Проверка оборудования на герметичность

чисты* культуры

777-5.7

ТЛ-5.2

777-5.3

777-5.4

Выращивание ПМ на косяках и в колбах

Приготовление и стерилизация ПС Оля кювет

Охлаждение и засев ПС культурами в юоветах

Приготовление ПС

ОПЮХЦ ---

Приготовление ПС

^ 777-7.21 Стерилизация, охлаждение ПС

Поддержание культур дрожжей и лантобактериВ

] 777-6.21 Стерилизация, охлаждение ПС

этиквтки т ! УМП* 0 Л Подготовка тары и этикеток

УМО- 9.2 Расфасовка сухого полуфабриката

ВР-4

Подготовка оборудования к загрузке

ТП-5

Засев и выращивание ГШ а лаборатории

*оздухшвР-2

ТП-в

Выращивание ПМ е растильной камере

воздух опт ——

£Н

Г/7-7

вортиД воздух

Подготовка моющих и

ВР-3 дезинфицирующих на все стадии

растворов

воде

Промышленное твердофазное культивирование _микроорганизмов_

нзцстюлыовенмыД ПН на ОБО

воздух Нв ОБВг

промывные аоДы ^

еоэдух на ОБВ>

ТП-8 Сушка

М0-9| Упаковка, маркировка, отгрузка

Готовый продукция на склад

Рис.21 Блок-схема процесса получения сухих активных посевных материалов

выводы

1. Установлена возможность производства активных посевных материалов из дрожжей рода Pichia, выделенных из женского грудного молока, на первичных и вторичных сырьевых ресурсах АПК. Выявлено несколько перспективных штаммов дрожжей, из которых самые высокие результаты показал штамм Píchia anómala PI. Установлено наличие антагонистической активности у данного штамма по отношению к E.coli, Е. cloacae В 2073, К. oxytoca sypi, E.aerogenes.

2. Показано, что в условиях твердофазного культивирования наблюдается максимальное накопление биомассы выбранными штаммами дрожжевых культур, которое составляет 3,36- 5,68 *109 кл/г.

3. Получены микробные консорциумы на основе выбранных дрожжей и промышленного штамма L.acidophilus La5. На различных твердых растительных субстратах констатирована способность дрожжей и лактобактерий к симбиозу без выраженного взаимного ингибирования. In vitro показано, что дрожжи стимулируют рост лактобактерий.

4. Впервые получены хранимые активные полимикробные посевные материалы путем высушивания и замораживания комплексных культур. Установлена возможность сушки при 40°С. Рекомендовано хранение в течение 100 сут при температуре 10°С.

5. Разработана технология получения активных полимикробных посевных материалов. Оптовая цена сухого посевного материала составляет 60 руб за 1кг.

6. Установлена зависимость физико-химических и микробиологических показателей качества посевных материалов в виде жидких полуфабрикатов от длительности их хранения. Рекомендовано хранение в течение 40сут.

7. Получены новые ферментированные напитки на базе активных полимикробных посевных материалов в различном виде. Проведены испытания технологий новых ферментированных напитков на стендовой установке ГНУ ВНИИПБТ РАСХН, оценены их органолептические свойства и показатели безопасности. Новые молочные ферментированные напитки превосходят существующие аналоги молочных напитков с добавками зерновых культур по всем определяемым показателям.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Каночкина М.С. Жидкие агропромышленные поллюанш как сырье для

производства микробной биомассы / Борисенко Е.Г., Горин К.В.// Безопасность и

экология предприятий пищевой промышленности. Инновационные решения

использования отходов пищевых производств: тезисы докл. Первой научно-

практической конференции с международным участием (Москва, 23 сентября 2009 г.). -М., 2009. - С. 57-62.

2. Каночкина М.С. Целлюлозосодержащие материалы как сырье для производства дрожжевой биомассы / Борисенко Е.Г., Горин KB,// Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты: тезисы докл. VII международной научно - практической конференции и выставки (Москва, 7-8 октября 2009 г.). - М., 2009 - С. 157-161.

3. Kanochkina M.S. The yeast-bacterial edible products based on the primary and secondary agroindustrial raw materials / Borisenko E.G., Gorin K.V., Nguen Chyong Zang // EurasiaBio: 2nd International Congress-Partnering & Exhibition on Biotchnology and Bioenergy (Moscow, 13-15 April 2010). - Moscow, 2010. - P. 236-237.

4. Каночкина М.С. Нутриенты - биокорректоры на базе нетрадиционного сырья /Борисенко Е.Г., ГоринК.В., Нгуен Ч.З.// Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров: Сборник докладов III межведомственной научно-практической конференции (Москва, 2010г.). - М., 2010. - С. 81-85.

5. Каночкина М.С. Выживаемость дрожжей в твердофазных культурах// Пищевая промышленность.- 2011 . - №6. - С.54-55.

6. Каночкина М.С. Повышение питательной и биологической ценности растительных нутриентов с помощью микроорганизмов/ Борисенко Е.Г., ГоринК.В., Нгуен Ч.З., Чан В.Т., Гулимова JI.A., Максимушкин АЛО.// Живые системы и биологическая безопасность населения: тезисы докл. IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых (Москва,2011г.). - М., 2011 - С.380-382.

7. Каночкина М.С. Функциональные свойства дрожжей и бактерий, входящих в состав микробных корректоров пищевого и кормового назначения/ Борисенко Е.Г., ГоринК.В., Нгуен Ч.З., Чан В.Т., Максимушкин А.Ю., Борисенко Е.А., Флуер Ф.С.// Хранение и переработка сельхозсырья.-2012. - №3.- С. 46-49.

8. Каночкина М.С. Исследование оптимальных условий культивирования перспективных штаммов дрожжей— источников биологически активных веществ на основе растительного сырья и отходов его переработки/ Борисенко Е.Г., Горин К.В., Нгуен Ч.З., Чан В.Т., Борисенко Е.А., Гулимова JI.A.// Производство спирта и ликероводочных изделий.- 2012.- №1,- С. 18-20.

9. Заявка на патент №2012110630 «Способ получения активного полимикробного сухого посевного материала для производства продуктов функционального питания»/Борисенко Е.Г., Каночкина М.С.//-заявлено 21.03.2012.

Для заметок

Подписано в печать 17.04.12. Формат 60x90 Vi6. Печ. л. 1,3. Тираж 150 экз. Изд. № 46. Заказ № 52.

Издательский комплекс МГУ 1111 125080, Москва, Волоколамское шоссе, 11

61 12-5/2458

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ЕОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ"

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ АКТИВНЫХ ПОЛИМИКРОБНЫХ ПОСЕВНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДРОЖЖЕ-БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность 05Л8.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ

На правах рукописи

Каночкина Мария Сергеевна

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Научный руководитель -

доктор технических наук, профессор Е.Г. Борисенко

Москва-2012

СОКРАЩЕНИЯ

1. АСВ (а.с.в.) - абсолютно сухое вещество

2. БВК - белково - витаминный концентрат

3. БАД - биологически активная добавка

4. БТА - биотерапевтические агенты

5. ГФ - глубинная ферментация

6. ЖКТ - желудочно - кишечный тракт

7. КРС - крупный рогатый скот

8. ПЦР - полимеразно-цепная реакция

9. СВ - сухие вещества

10.ТФФ - твердофазная ферментация

11 .ТГФ - твердофазно - глубинная ферментация

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................7

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................13

1.1. Микробная биоконверсия - современный способ переработки растительного и животного сырья....................................13

1.1.1. Методы ферментации микроорганизмов......................................................14

1.1.2. Сырьевые ресурсы, применяемые для биоконверсии и перспективность их использования..................................................................18

1.1.2.1. Характеристика послеспиртовой барды как сырья для микробной ферментации..........................................................................................18

1.1.2.2. Молочная сыворотка как вторичное пищевое сырье........................24

1.1.2.3. Пшеничные отруби как высокоценный отход мукомольного производства..........................................................................................................................28

1.1.2.4. Перспективность использования сенной муки как сырья для биоконверсии........................................................................................................................31

1.1.2.5. Растительные компоненты натуральной кукурузы как

ценный материал для микробной конверсии............................................32

1.1.3. Рациональная утилизация агропромышленных отходов................33

1.2. Использование микробной конверсии в производстве продуктов питания............................................................................................................34

1.3. Функциональное питание как метод оздоровления

населения..................................................................................................................................40

1.3.1. Сырье для производства продуктов функционального

питания........................................................................................................................................43

1.3.2. Посевные материалы и закваски в биотехнологии ферментированных продуктов..............................................................................44

1.3.2.1. Комбинированные закваски....................................................................................47

1.3.2.2. Закваски, используемые в странах Азии......................................................47

1.3.3. Функциональное действие дрожжевых препаратов..........................48

1.3.4. Поддержание нормальной микрофлоры макроорганизма с использованием биотерапевтических агентов......................................54

1.4. Молочнокислое брожение и семейство Lactobacillaceae................55

1.4.1. Гомо- и гетероферментативные молочнокислые бактерии..........55

1.4.2. Характерные особенности рода Lactobacillus..........................................56

1.4.3. Практическое использование молочнокислых бактерий..............58

1.5. Симбиотическое взаимное влияние дрожжей и молочнокислых бактерий............................................................................................63

1.6. Заключение..............................................................................................................................66

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ............................................................69

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ................................69

2.1.1 Материалы исследований........................................................................................69

2.1.1.1 Штаммы микроорганизмов, применявшиеся в работе..................69

2.1.1.2 Сырье, применявшееся в работе........................................................................70

2.1.1.3 Реактивы, использованные в работе..............................................................72

2.1.2 Методы исследования................................................................................................73

2.1.2.1 Методы приготовления питательных сред................................................73

2.1.2.2 Методы обработки питательных сред перед засевом........................75

2.1.2.3 Метод получения посевного материала........................................................76

2.1.2.4 Методы засева микроорганизмов........................................................................76

2.1.2.5 Методы культивирования микроорганизмов............................................76

2.1.2.6 Внесение лиофильно-высушенных заквасок в сырьевые

основы..........................................................................................................................................76

2.1.2.7 Пастеризация сырьевых основ разрабатываемых продуктов в лабораторных условиях..............................................................................................76

2.1.2.8 Метод отбора дрожжей-суперпродуцентов биомассы на твердофазных субстратах..........................................................................................77

2.1.2.9 Метод создания микробных консорциумов на основе дрожжей и лактобактерий для биоконверсии зерновых

отрубей..............................................................................................................................77

2.1.2.10 Метод высушивания и замораживания полученных активных полимикробных посевных материалов............................................................78

2.1.2.11 Метод получения жидких полуфабрикатов................................................79

2.1.2.12 Метод приготовления твердых и жидких функциональных продуктов..................................................................................................................................79

2.1.2.13 Метод фракционирования ферментированных напитков на основе

7% сахарного раствора........................................................................................................................81

2.1.2.14 Определение титруемой кислотности............................................................81

2.1.2.15 Определение активной кислотности................................................................82

2.1.2.16 Определение массовой доли сухих веществ............................................82

2.1.2.17 Определение массовой доли белка....................................................................82

2.1.2.18 Определение антагонистической активности дрожжей и полученных продуктов................................................................................................82

2.1.2.19 Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов......................................84

2.1.2.20 Определение количества дрожжей и плесневых грибов..............84

2.1.2.21 Прямой количественный учет дрожжевых клеток..............................84

2.1.2.22 Определение содержания молочнокислых микроорганизмов,

в том числе лактобацилл..............................................................................................85

2.1.2.23 Определение содержания азота по методу Несслера........................86

2.1.2.24 Органолептическая оценка образцов................................................................88

2.1.2.25 Проведение микробиологического контроля..........................................88

2.1.2.26 Повторность измерений и математическая обработка результатов..............................................................................................................................89

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.......................90

2.2.1 Выбор дрожжевых штаммов, способов их культивирования, а также субстратов для получения активных посевных

материалов............................................................................................................................90

2.2.1.1. Тестирование коллекционных дрожжевых культур МГУПП

на различных субстратах................................................ 90

2.2.1.2. Выбор способа культивирования отобранных дрожжевых культур..................................................................... 96

2.2.1.3. Определение посевной дозы вносимых дрожжевых культур... 101

2.2.2. Определение антагонистической активности наиболее перспективного штамма дрожжей.................................... 102

2.2.3. Взаимное влияние лактобактерий и выбранных дрожжевых культур..................................................................... 103

2.2.3.1. Развитие микробных консорциумов в аэробных условиях...... 103

2.2.3.2. Развитие микробных консорциумов в анаэробных условиях... 107

2.2.3.3. Определение активной кислотности полученных посевных материалов................................................................. 109

2.2.4. Получение активных полимикробных посевных материалов

при различных условиях роизводетва.............................. 110

2.2.4.1. Выживаемость микробных консорциумов при различных температурных режимах сушки....................................... 110

2.2.4.2. Выживаемость микробных консорциумов в условиях замораживания............................................................ 114

2.2.4.3. Определение сроков и условий хранения полученных активных замороженных и сухих посевных материалов........ 116

2.2.5. Определение физико-химических характеристик полученных посевных материалов.................................................... 121

2.2.5.1. Определение титруемой и активной кислотности................................121

2.2.5.1. Определение «сырого протеина»..........................................................................122

2.2.6. Получение жидких полуфабрикатов на основе активных полимикробных посевных материалов....................................................................123

2.2.6.1. Динамика изменения количества жизнеспособных клеток лактобактерий и дрожжей в процессе получения жидких полуфабрикатов........................................................... 123

2.2.6.2. Определение физико-химических показателей жидких полуфабрикатов.......................................................... 126

2.2.6.3. Определение ««сырого протеина» и содержания сухих

веществ в жидких полуфабрикатах................................... 128

2.2.7. Использование полученных посевных материалов для глубинной ферментации с целью получения питьевых ферментированных продуктов питания............................. 129

2.2.7.1. Характеристики продуктов, полученных при ферментации молочной основы активными полимикробными посевными материалами.............................................................. 129

2.2.7.1.1. Динамика изменения количества жизнеспособных клеток лактобактерий и дрожжей в процессе получения молочных ферментированных продуктов питания............................ 129

2.2.7.1.2. Физико-химические характеристики полученных новых

молочных ферментированных продуктов питания.............. 132

2.2.7.1.3. Определение ««сырого протеина» и содержания сухих веществ в полученных новых молочных ферментированных продуктов питания..................................................... 134

2.2.7.1.4. Сравнение полученных новых молочных ферментированных продуктов питания с аналогами, представленными на рынке г. Москвы....................................................... 134

2.2.7.2. Характеристики продуктов, полученных при ферментации 7% сахарного раствора активными полимикробными посевными материалами.............................................. 137

2.2.7.2.1. Динамика изменения количества жизнеспособных клеток лактобактерий и дрожжей в процессе получения ферментированных напитков........................................ 137

2.2.7.2.2. Физико-химические характеристики полученных новых ферментированных напитков........................................ 139

2.2.7.2.3. Микробиологические и биохимчсекие характеристики полученных новых продуктов............................................. 141

2.2.8. Взаимодействие полученных комплексных культур и патогенных микроорганизмов....................................... 142

2.2.9. Наработка опытных партий новых ферментированных напитков.................................................................. 144

2.2.10. Показатели безопасности полученного нового

ферментированного напитка на молочной основе................ 146

3. ВЫВОДЫ............................................................... 150

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................... 152

ПРИЛОЖЕНИЯ....................................................... 174

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Современное состояние промышленности и экологии требует создания эффективных технологий получения продуктов функционального назначения, направленных на укрепление защитных функций организма человека и животных. Обогащение пищевых и кормовых продуктов белком и незаменимыми аминокислотами, а также придание им пробиотических, пребиотических и симбиотических свойств - одна из важных проблем настоящего, так как человечество развивается таким образом, что уже очень скоро оно вряд ли сможет обеспечить себя пищей традиционными методами.

Значение микроорганизмов в решении этих проблем трудно переоценить. Имеется достаточно фактических данных о положительном влиянии некоторых видов дрожжей на нормофлору кишечника. С одной стороны, дрожжи обогащают ферментируемый субстрат биологически активными веществами, с другой стороны, клеточные стенки дрожжей, обладают лакто- и бифидогенными, а также сорбционными свойствами и при попадании в кишечник стимулируют рост собственной микрофлоры организма, выводя оттуда патогенные бактерии и их токсичные метаболиты.

Таким образом, производство дрожжевых пребиотических

препаратов и продуктов, удовлетворяющих ежедневные потребности организма в необходимых компонентах и обладающих свойством регулировать и нормализовать микробиоценозы желудочно-кишечного является перспективным и актуальным направлением.

Продукты питания, содержащие дрожжи и их метаболиты, на

современном российском рынке представлены в основном кисломолочными

напитками смешанного бактериально-дрожжевого брожения типа кефира,

тана, катыка. Содержание дрожжевых клеток в таких продуктах не

превышает уровня 104-10Э кл/г. Технология подобных напитков

предусматривает прямое внесение бактериальных и дрожжевых культур без

использования микробных консорциумов или полимикробных посевных

7

материалов. Другие известные напитки дрожжевого брожения (квас, пиво) представляют собой, как правило, фильтрованные продукты. В то же время значимые клинические эффекты, связанные с лечебно-профилактическим действием дрожжевых клеток, показаны только для биологически активных добавок с концентрацией - 1(Г кл/г.

Наиболее перспективными для использования в составе полимикробных посевных материалов являются дрожжи рода Pichia, в особенности вид Pichia anómala. Научные исследования, проводящиеся в настоящее время за рубежом, показали, что дрожжи данного вида обладают высокой продуктивностью, антагонистической активностью по отношению к различным видам условно-патогенных микроорганизмов, способностью продуцировать различные ферменты и физиологические активные вещества[ 193,163,176,180,182,203,206,208]. Отмечена возможность использования дрожжей Р.anómala в качестве пробиотиков [193,217,221,214].

Не менее актуальной проблемой является защита окружающей среды от отходов агропромышленных предприятий (далее АПК) (спиртзаводов, молзаводов, мукомольных предприятий и т.п.). В пищевых отраслях России образуется до 45 млн. т вторичных ресурсов и отходов в год, из которых значительная часть используется неэффективно, тем самым нанося огромный вред окружающей среде.

В связи с вышеизложенным, разработка технологии активных полимикробных посевных материалов, в том числе заквасок, на базе отходов агропромышленных предприятий для производства ферментированных напитков и других продуктов общественного питания, доступных для потребления широким слоям населения, актуальна и экономически привлекательна.

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационной работы стала разработка технологии активных посевных материалов для производства функциональных

продуктов на основе жизнеспособных клеток дрожжей и лактобактерий. В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

- выявить наиболее перспективные штаммы дрожжей для получения активных полимикробных посевных материалов и провести подбор растительных субстратов для накопления ими биомассы;

- выбрать способ культивирования дрожжей, подобрать жидкие и твердые питательные среды для роста и накопления биомассы выделенными дрожжами на основе отходов АПК;

- получить микробные консорциумы на основе выбранных дрожжевых культур и промышленного штамма L. acidophilus La 5 и изучить процесс взаимного влияния культур;

- получить активные полимикробные посевные материалы в сухом, замороженном виде и исследовать выживаемость клеток дрожжей и лактобактерий в процессе их получения, определить физико-химические и биохимические характеристики, установить сроки и условия их хранения;

- получить жидкие полуфабрикаты на основе активных полимикробных посевных материалов и определить их характеристики и сроки хранения;

- установить возможность использования полученных натуральных, высушенных, замороженных активных посевных материалов и жидких полуфабрикатов для глубинной ферментации жидких субстратов с целью получения питьевых ферментированных продуктов питания;

- разработать рецептуры новых ферментированных продуктов на основе полученных активных полимикробных посевных материалов. Дать физико-химическую и микробиологическую характеристику новых продуктов, оценить их пищевую и биологическую ценность.

Научная новизна.

Впервые установлена возможность производства активных посевных материалов из дрожжей вида Pichia anomala на растительном сырье. Показано, что в качестве сырья для производства дрожжевых посевных материалов могут быть использованы различные виды твердого

9

растительного сырья, как первичного, так и вторичного. Универсальным субстратом для этих целей являются зерновые отруби. Для доведения влажности этих субстратов до оптимального уровня могут быть использованы как вода, так и различные жидкие вторичные продукты.

Наи