автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка технологии микробных нутриентов - биокорректоров на базе целлюлозосодержащего сырья

005003294

ГОРИН КИРИЛЛ ВИКТОРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МИКРОБНЫХ НУТРИЕНТОВ -БИОКОРРЕКТОРОВ НА БАЗЕ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ

Специальность: 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и оиологических

активных веществ

- 1 ДЕК 2011

АВТОРЕФЕРАТ ^

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2011

005003294

Работа выполнена на кафедре "Биотехнология" ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель: докгор технических наук, профессор

Борисеико Евгений Георгиевич

Официальные оппоненты: докгор технических наук, профессор

Ермолаева Галина Алексеевна кандидат технических наук Лыско Ксения Андреевна

Ведущая организация: ФГУ Российский государственный аграрный университет -МСХА имени К.А. Тимирязева.

Защита состоится: « 2011 г. вЮ.ОО ч. в ауд. заседании

Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.04 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГУПП.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, ФГБОУ ВПО МГУПП, ученому секретарю Совета Д 212.148.04

Автореферат отправлен по адресу referat_vak@mon.gov.ru для размещения в сети Интернет Министерством образования и науки РФ и размещен на сайте www.nigupp.ru.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Совета, к.т.н. Тимофеев Д.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Во всем мире, и в России в том числе, весьма острой является проблема дефицита животного белка, сбалансированного по незаменимым аминокислотам. Значительный интерес в этом плане представляет использование белка одноклеточных. В Советском Союзе микробная биомасса в виде дрожжей, выращенных на гидролизатах целлюлозосодержащего сырья и на парафинах нефти (1,5 млн. тонн в год), была очень эффективным обогатителем кормов для сельскохозяйственных животных, однако практически все производства кормовых дрожжей в настоящее время свою деятельность прекратили из-за распада промышленного животноводства, дороговизны сырья, электроэнергии и материального оснащения. Однако сама идея интенсивного использования микробного белка остается весьма актуальной. Причем такой белок становится все более интересным не только как компонент кормов для животных, но и пищи для людей.

Существующие мощности подавляющего большинства биотехнологических предприятий, возведенных в основном еще в советское время, либо разрушены, либо морально и физически устарели и требуют модернизации с использованием инновационных технологий.

Очень актуальным становится вопрос по каким направлениям вести эти инновации. В "Стратегии национальной безопасности Российской Федерации до 2020 года", утвержденной Указом президента Российской Федерации №537 от 12 мая 2009 г., к числу главных направлений обеспечения национальной безопасности в среднесрочной перспективе отнесена продовольственная безопасность. Микробная биомасса является важнейшим нутриентом человека у народов очень многих стран, однако в нашей стране это направление особенного развития не имело.

Второй немаловажной проблемой является нарушение структуры питания населения. Нехватка в рационе полноценных белков, витаминов, пищевых волокон, макро- и микронутриентов, полезных микробов в пище вызывает рост социально опасных заболеваний, в том числе желудочно-кишечных. Часто причиной этих заболеваний является нарушение микробиоценозов желудочно-кишечного траста. Возбудителями заболеваний человека и животных нередко становятся условно-патогенные бактерии, приобретающие плазмиды токсигенности, колонизационной резистентности и антибиотикоустойчивости. _ ,

Не менее актуальной проблемой является защита окружающей среды от отходов агропромышленных предприятий (спиртзаводов, молзаводов, животноводческих комплексов и т.п.). В пищевых отраслях образуется до 45 млн т вторичных ресурсов и отходов в год, из которых значительная часть используется неэффективно, направляясь в отвалы или выливается в водоемы, тем самым нанося огромный вред окружающей среде.

Все вышеприведенные проблемы могут эффективно решаться путем микробной биоконверсии сложных субстратов, составленных из первичных и вторичных, твердых и жидких агропромышленных продуктов растительного и животного происхождения.

Инструментом биоконверсии исходных субстратов являются прежде всего микроорганизмы, отличающиеся высокой способностью накапливать богатую незаменимыми аминокислотами биомассу на твердых и жидких субстратах, а полученные в результате микробной ферментации продукты имеют очень серьезные перспективы для использования в качестве основы или компонента пищи и кормов.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы стала разработка универсального способа биоконверсии различных видов первичного и вторичного агропромышленного и прежде всего растительного сырья, отходов его переработки, в том числе и ксенобиотиков в биологически активные полуфабрикаты, обогащенные микробным белком.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. Отселекционировать новые штаммы дрожжей и бактерий из молока млекопитающих, способные расти на твердых негидролизованных растительных субстратах.

2. Сконструировать жидкие и твердые питательные среды для выделенных дрожжей и выявить из них наиболее перспективные, подобрать оптимальный состав и условия культивирования.

3. Сконструировать дрожже-бактериальные ассоциации для совместного культивирования на твердых и жидких субстратах.

4. Разработать рецептуры полуфабрикатов пищевых продуктов и кормов.

5. Оценить химическую и биологическую ценность полученных полуфабрикатов и приготовленных из них продуктов.

Научная новизна.

- Впервые разработана методика выделения дрожжей и молочнокислых бактерий из женского грудного молока.

- Показана возможность эффективной биоконверсии практически любого целлюлозосодержащего растительного сырья с помощью сконструированных дрожже-бактериальных ассоциаций; установлена перспективность использования для этих целей прежде всего дрожжей рода Pichia и молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus.

- Установлено, что взаимоотношения дрожжей - суперпродуцентов биомассы и молочнокислых бактерий при совместном аэробном культивировании на твердых средах не носят конкурентного характера. В условиях же анаэробной ферментации наблюдается стимулирующее влияние дрожжей на рост молочнокислых бактерий, а развитие дрожжей при этом подавляется.

- Сформулированы представления о механизме действия выделенных дрожжей и молочнокислых бактерий а также твердых и жидких полуфабрикатов на патогенную микрофлору. Молочнокислые бактерии в чистых культурах и в составе пищевых продуктов в большей или меньшей степени подавляют рост патогенных стафилококков и продукцию стафилококкового энтеротоксина. Дрожжи, выделенные из грудного молока, такой выраженной способностью не обладают и они его могут даже стимулировать подобно сахаромицетам.

- Таким образом, in vitro показано, что дрожжи прежде всего являются нутриентами для бактерий, а молочнокислые бактерии являются потенциальным регулятором микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Результаты исследований выявленных зависимостей послужили обоснованием предложенной в работе технологии производства новых видов нутриентов - биокорректоров на основе аэробно -анаэробной биоконверсии целлюлозосодержащего сырья дрожже - бактериальными ассоциациями.

Практическая значимость результатов работы. Отобраны штаммы дрожжей, обладающие высокой продуктивностью и скоростью роста на различных видах целлюлозосодержащего сырья. Сформированы дрожже-бактериальные ассоциации для эффективной биоконверсии растительных субтратов. Сконструированы твердофазные питательные среды для дрожже-бактериалышх ассоциаций. Определены общие закономерности роста дрожже - бактериальных ассоциаций на простых и комплексных твердых питательных средах, определены оптимальные параметры субстратов и условия

роста. Разработана двухэтапная технология получения продуктов пищевого и кормового назначения, по которой на аэробном этапе осуществляется в основном накопление дрожжевой биомассы на увлажненном субстрате, после добавления же жидкого компонента ферментация осуществляется в анаэробном режиме с накоплением бактериальной массы, продуктов ее метаболизма и формированием специфического комплекса органолептических свойств новых продуктов. Предложена рецептура и технология производства новых продуктов - напитков на основе отрубей и сенной муки, обогащенных дрожжами и молочнокислыми бактериями. Дана физико-химическая и микробиологическая характеристика продукта. Разработана технологическая инструкция получения дрожже-бактериального полуфабриката, получаемого путем аэробной твердофазной ферментации пшеничных отрубей.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на российских и международных конференциях и симпозиумах: Международная, научно-практическая конференция "Биотехнология. Вода и пищевые продукты" (Москва, 2008); VI Научно-практическая конференция с международным участием "Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации. Эффективное использование ресурсов отрасли" (Москва, 2008); VI международной научно-практической конференции " Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты."; X юбилейном международном форуме "Высокие технологии 21 века" (Москва 2009); Первой научно-практической конференции с международным участием "Безопасность и экология предприятий пищевой промышленности. Инновационные решения использования отходов пищевых производств" (Москва 2009); VII международная научно - практическая конференция и выставка "Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты (Москва 2009); Первой международной научно-практической конференции "Идентификация фальсифицированных пищевых продуктов. Контроль содержания и безопасность наночастиц в продукции сельского хозяйства и пищевых продуктах" (Москва 2009); EurasiaBio 2nd International Congress-Partnering & Exhibition on Biotchnology and Bioenergy, Moscow 2010; III межведомственной научно-практической конференции "Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров", (Москва 2010).

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 204 источника (в том числе 82 - на иностранных языках) и 7 приложений. Работа изложена на 160 страницах, содержит 39 рисунков, 22 таблицы.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы рассмотрены общие представления о пищевой цепи животных и человека, охарактеризован каждый составляющий её уровень. Приведена краткая история индустриального производства микробного белка. Рассмотрен микробный биоценоз желудочно - кишечного тракта, его роль в колонизации кишечника макроорганизма, приведены современные средства его коррекции. Также приведены данные по стафилококку и стафилококковым энтеротоксинам и их роли в желудочно - кишечной патологии. Дана характеристика молока млекопитающих, химический и микробиологический состав, а также его роль в становлении и поддержании микробиоценоза человека.

2 ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Исследования проводились на кафедрах "Биотехнология" МГУПП, "Биология почв" МГУ, а также в лабораториях «Молекулярные основы патогенности» (группы «Стафилококковых инфекций») и лаборатории "Генная инженерия патогенных микроорганизмов" ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

2.1 Материалы и методы исследований Объектом исследования были различные штаммы дрожжей и бактерий, выделенные из молока млекопитающих, микробиоценозов молочнокислых продуктов, производственных заквасок и пробиотических продуктов.

Образцы молока млекопитающих высевали на твердофазную питательную среду (пшеничные отруби), в которую добавляли 50 мкг/г гентамицина. После инкубации в аэробных условиях при температуре 28-32°С выделяли доминирующие культуры и оценивали их продуктивность. Критерием оценки служила концентрация дрожжевых клеток в 1 г субстрата, накопленная в процессе ТФФ. Подсчет клеток осуществляли микроскопически в камере Горяева. Размеры клеток определяли с помощью окуляр-микрометра. Идентификацшо дрожжей проводили по общепринятой методике (Бабьева И.П., 1979) согласно определителям дрожжей. Идентификацию дрожжей до вида проводили методом ПЦР-анализа (Фомичева Г.М. и др., 2006).

В качестве основы питательных сред использовалось целлюлозосодержащее сырье: сенная мука, травяная мука, соломенная мука, шрот подсолнечный, шрот соевый, а также зерно, продукты и отходы его переработки, корнеплоды, овощи.

ГФ вели в качал очных колбах на круговых лабораторных качалках при 180-220 об./мин. Продолжительность ферментации - 24 - 48 ч, температура 30±2°С.

ТФФ в лабораторных условиях проводили в чашках Петри и в качалочных колбах при высоте слоя 1-3 см и влажности субстрата 50-55%. Чашки Петри или колбы помещали в термостат на 24 - 72 часа при температуре воздуха 30±2°С и влажности 9095%.

Содержание сырого протеина определяли по методу Несслера, величину рН измеряли потенциометрическим методом.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по программе Excel 97 Microsoft Office, вычисляя среднее значение и стандартное отклонение для каждой величины, а также доверительный интервал при уровне значимости 95%.

2.2 Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1 Селекция дрожжей - суперпродуцентов биомассы на целлюлозосодержащем сырье.

В литературе очень много сведений о лактобактериях и бифидобактериях молока и в частности женского грудного молока, об их роли в формировании микробиоценозов ребенка, потребляющего это молоко.

И в то же время очень мало сведений о дрожжевой компоненте этих продуктов. В настоящей работе мы сделали попытку осветить этот малоизученный вопрос. В общей сложности было выделено более 100 дрожжевых культур. Так как доминирующей в молоке все-таки является бактериальная составляющая, а дрожжи, если даже они в нем встречаются, все-таки вряд ли могут конкурировать с бактериями, в женском грудном молоке дрожжи искали на разных стадиях его формирования (молозиво и стационарное молоко), а само культивирование вели как без подавления бактериальной флоры, так и при подавлении ее антибиотиком гентамицином. В таблице 1 представлены результаты этой серии экспериментов.

Таблица 1

Рост дрожжей из натурального молока на пшеничных отрубях.

№ Источник дрожжей Количество исследуемых образцов Количество выросших дрожжевых культур

п/ п На отрубях с антибиотиком На чистых отрубях

Положительных результатов % Положительных результатов %

1 Натуральное коровье молоко 31 30 96,7 29 93,5

2 Женское молозиво 43 3 6,97 2 4,65

3 Женское грудное молоко стационарное 32 25 78,1 15 46,87

Из этой таблицы достаточно четко видно, что в изученном в качестве контроля коровьем молоке выделяемость дрожжей почти 100% - пая как на средах без антибиотика, так и в его присутствии. Что же касается женского грудного молока, то здесь ситуация значительно более сложная. На основании наших экспериментов мы можем говорить о положительном влиянии вводимого в питательные среды гентамицина на стимулирование роста дрожжей и частоту их выделения. И совсем уж демонстративной является разница в частоте выделения дрожжей из молозива и стационарного молока. На основании этих результатов мы считаем нерациональным пытаться выделять дрожжи из молозива и в качестве материала для поиска дрожжей рекомендуем использовать стационарное молоко.

Дрожжи, выделения из молока млекопитающих и пищевых продуктов, сравнивались по продуктивности при ГФ и ТФФ (таблица 2).

Таблица 2

Продуктивность дрожжей при глубинной и твердофазной ферментации

№ п/п Источник выделения Продуктивность 109 кл./ г (см3)

Г'Ф на молоке ТФФ на пшеничном проделе ТФФ на пшеничных отрубях

24 ч 24 ч 24 ч 48 ч 72 ч

1 Коровье молоко 0,15 0,65 0,2 0,8 1,3

2 Коровье молоко 0,27 0,51 0,1 0,6 1,1

3 Коровье молоко 0,05 0,32 0,18 0,5 1,4

4 Коровье молоко 0,22 0,53 0.16 0,9 1,2

5 Коровье молоко 0,07 0,06 0,2 1,4 2,5

6 Коровье молоко 0,1 0,67 0,3 0,7 1,6

7 Коровье молоко 0,03 0,26 0,24 0,5 0,9

8 Коровье молоко 0,2 0,15 0,4 0,9 2.1

9 Коровье молоко 0,21 _ _

10 Коровье молоко 0.13 0,37 0,22 0,7 1,2

11 Коровье молоко 0,2 0.14 0,3 0,6 1,1

12 Коровье молоко 0,1 0,41 0,2 0,5 0,9

13 Коровье молоко 0,1 0,18 0,4 0,6 0,8

14 Коровье молоко - . _

15 Коровье молоко 0,05 0,13 0,26 0,9 1,7

16 Коровье молоко 0,1 2 1,25 2,1 2,9

17 Коровье молоко 0,15 0,51 0,28 0,8 1,6

18 Коровье молоко 0,1 0,41 2,4 3,1 3,3

19 Коровье молоко 0,11 0,55 2,5 3,3 3,6

20 Коровье молоко - .

21 Коровье молоко 0,03 0,3 0,6 0,8 1,9

22 Коровье молоко 0,05 0,24 0.4 0,7 1,2

23 Коровье молоко 0.1 0,3 0,22 1,1 1,8

24 Коровье молоко 0,2 1,2 0,15 0,4 0,7

25 Коровье молоко 0,3 0,2 0.5 0,7 1,1

26 Коровье молоко 0,6 1,9 1,2 2,3 3,6

27 Коровье молоко 0,31 0,85 1,2 1,8 2,9

28 Коровье молоко 0,17 0,8 0,9 1,7 2,3

29 Коровье молоко 0,06 0,46 0,4 0,8 2,2

30 Коровье молоко 0,03 0,9 1 2,3 3,1

31 Коровье молоко 0,2 0,5 0,34 0,9 2,1

32 Козье молоко 0,12 0,9 0,28 0,7 1,5

33 Айран 0,4 0,7 1 1,7 1,8

34 Кефир 0.05 0,8 0.8 1,1 1,2

35 Candida famata Т8 0,9 2 2,1 3,7 4,2

В ряде случаев при росте дрожжей, выделенных из коровьего молока, на твердой питательной среде продуктивность была в 10 раз выше, чем на жидкой среде. В связи с этим выбор был сделан в пользу твердофазного культивирования для накопления дрожжевой биомассы. Следует отметить, что только 11 % штаммов дрожжей, выделенных из коровьего молока приближались, но не превосходили по продуктивности контрольный штамм Candida famata Т8.

Культуры дрожжей, выделенные из женского грудного молока, также сравнивались по продуктивности с эталонным штаммом дрожжей - Candida famata Т8, который уже используется в производстве БЛД "Фсрвитал" (Солдатова, 2004 г, таблица 3). Близкими к нему свойствами обладают 12 % тестируемых культур, превосходящими 35%. Как правило, это дрожжи, размеры клеток которых не превышают (1,5-4,0) х (3,08,0) мкм.

Таблица 3

Продуктивность дрожжей, выделенных из грудного молока, на пшеничных

отрубях.

Кг п/п Штамм Размеры клеток на Сабуро-агаре, мкм Продуктивность дрожжей, 109кл./г

24 48 72

1 Р1 (1,0-3,0)*(3,0-6,0) 2,1 4,9 5,1

2 Al (1,0-3,5)х(3,5-8,0) 2.2 4,7 4,9

3 11 (1,0-3,5W3.5-8,0) 1.9 4,3 4,5

4 А2 (2,0-4,0)х(3,0-12,0) 1,1 1,5 1.5

5 TI (2,0-4,0)х(3,5-12,0) 1,4 2,5 2,7

6 L1 (2,0-4,0W3,5-12,0) 0,6 1,2 1,3

7 N1 (1,0-3,5)х(3,5-8,0) 1,5 3,9 4,6

8 8 (1.0-3,5W3,5-8,0) 1,2 2,8 3,1

9 9а (1,0-3,0)43,0-6,0) 2,5 5,1 5,3

10 9b (1.0-3,0 W3.0-6.0) 2,3 5,0 5,1

11 И (1,0-3,5)*(3.5-8.0) 0,7 0,8 1,3

12 12 (1,0-3,5)х(3.5-8,0) 1,3 1,5 1,5

13 13 (1.0-3,0)х(3,0-8,0) 1,8 2,6 2,9

14 14 (1.0-3,5)*(3,5-8,0) 1,6 2,3 2,6

15 17 (2,0-4,0)х(3,0-12,0) 0,6 0,9 1,2

16 19 (1.0-3.0)х(3.0-6,0) 1.0 2.7 3,0

17 25 П.0-3,0)*(3,0-6,0) 1,1 2,0 2,5

18 Candida famata T8 (1,5-4,0)*(3,0-5,0) 2,2 3,6 4,4

Самые продуктивные выделенные штаммы идентифицированы по ПЦР до вида: Pichia anómala (Pl, 9а), Pichia guilliermondii (Al, II). Изучены их биохимические свойства, а также определена способность к иленкообразованию всех выделенных дрожжей в чистом виде и совместно с лактобактериями.

2.2.2 Конструирование питательных субстратов для твердофазной ферментации.

Если говорить о крупнотоннажном производстве микробной биомассы методом ТФФ, то для этих целей одних отрубей не достаточно в силу того, что они сами по себе являются высокоценным кормовым продуктом и хорошей добавкой к пище, прежде всего к хлебобулочным изделиям. Для этих целей нужно иметь множество различных субстратов вторичных и первичных, а в агропромышленном комплексе России они есть. Одним из таких субстратов является сенная мука из дикорастущих и сеяных трав, количество которой может достигать сотен миллионов тонн, если учесть те огромные нераспахиваемые площади в стране, на которых травы вообще никогда не косились, и практически половину пахотных земель, которые заросли травами и нередко мелколесьем за последние 20 лет.

В качестве первичного агропромышленного сырья для конструирования питательных субстратов использовали сенную и травяную муку. На первичном сырье практически самыми продуктивными оказались те же штаммы, что и на отрубях, достигая максимума 4,7*109 кл/г. Самым интересным из первичного сырья оказалась сенная мука (рисунок 1), продуктивность выделенных дрожжей иа ней была даже несколько выше, чем на травяной муке. Это можно объяснить несколько большей пористостью сенной муки, изготовленной из созревших, более богатых целлюлозой растений.

Более нежные частицы травяной муки,

возможно, не

обеспечивают оптимальную степень пористости. Сенная мука естественной сушки имеет

неоспоримые экономические

----—1 преимущества.

Рисунок 1 - Продуктивность дрожжей на сенной муке.

Заготовка, хранение и подготовка сырья требует специальных технических средств, материальных и трудовых затрат. В то же время в агропромышленном комплексе имеется достаточно большое количество вторичных субстратов, которые остаются, нередко в очень больших количествах после получения целевого первичного продукта. В качестве вторичного сырья использовали соломенную муку, подсолнечный шрот, соевый шрот, свеклосахарный жом. Практически около 50 млн. тонн соломы не находит рационального применения и в основном просто сжигается. На соломе мы также попытались накапливать микробную биомассу. Хотя и на этом субстрате самыми продуктивными были штаммы дрожжей, продуктивные на сенной и травяной муке, но все же на этом виде целлюлозосодержащего сырья продуктивность дрожжей едва превышала 1 • 109 клеток/г, т.е. практически была ниже в 4 раза, а значит по каким - то

Р1 А1 11 А2 Т1 И N1 8 9а 9Ь 11 12 13 14 17 19 25 Т8 Штамм дрожжей

составляющим этот субстрат явно был дефицитным и для интенсивного роста дрожжей он должен обогащаться какими - то добавками, более богатыми ростовыми веществами.

В этом плане другие вторичные продукты, такие как подсолнечниковый и соевый шроты, свеклосахарный жом были несравненно более продуктивными для накопления дрожжевой биомассы (5 - 7 • 109 кл/г субстрата). Естественно, что такие вторичные продукты как сосвый и подсолнечниковый шроты сами по себе являются ценными кормовыми добавками и источниками достаточно ценного растительного белка для животных и для микробной биоконверсии они могут быть использованы весьма ограниченно. А вот свеклосахарный жом в нашей стране на современном этапе, когда производство сахарной свеклы и активность сахарных заводов заметно оживились, составляет серьезную проблему, т.к. он не утилизируется традиционными методами как корм для крупного рогатого скота и часто является серьезным загрязнителем окружающей среды в регионах производства и переработки сахарной свеклы.

Конструирование

от 2 до 3

от 1 до 2

Размер фракции, мм

Менее 1 Все фракции Все фракции Т8

питательных сред из новых субстратов естественно требует нахождения оптимальной степени дисперсности, влажности среды и влияния углеводных и азотсодержащих добавок.

Рисунок 2 - Продуктивность дрожжей Pichia anómala 9а на разных фракциях сенной муки.

На рисунке 2 представлен наиболее подходящий размер частиц сенной муки для

биоконверисии ее дрожжами. Продуктивность дрожжей не сильно зависит от

дисперсности целлюлозосодержащих материалов, но все - таки максимум достигается

при размере частиц 1 - 3 мм, т.е. в производственных условиях у технолога будет

достаточно большая степень свободы в этом параметре.

Классическое твердофазное культивирование микроорганизмов сформулировало представление о каких - то стандартных условиях влажности твердофазных культур. Обычно она

Рисунок 3 - Удельная продуктивность дрожжей Р1сЫа атотаЬ колеблется в

9а при различной влажности сенной муки. интервале 50-60%

Вообще для роста дрожжей на целлюлозосодержащих субстратах показатель оптимальной влажности довольно сильно размыт, что опять же и по этому параметру дает технологу довольно широкую степень свободы, а если говорить об оптимуме влажности, то при такой ферментации, по нашему мнению, нужно ввести новый показатель эффективности роста культур на твердофазной среде - удельную продуктивность дрожжей при различной влажности. По этому показателю как на отрубях, так и на сенной муке (рисунок 3) оптимум будет приходиться на 70 - 80% -ную влажность, что в литературе обычно не фигурировало. Это также является значительным удобством для технолога, т.к. в условиях интенсивного роста твердофазных культур значительное повышение влажности это явление достаточно типичное.

Для более четкого представления о стимулирующей роли углеводных добавок на рост дрожжей использовали наиболее бедный для микробной биоконверсии субстрат -пшеничную солому. В качестве нативных Сахаров использовати сахарозу и глюкозу, а также овощи, богатые углеводами, морковь и капусту белокочанную с содержанием глюкозы 2,5 % и 2,6 % соответсвенно.

Солому и овощи в соотношении 1:3 засевали дрожже-бактериальной ассоциацией до влажности 50-55%. В качестве контролен служили чистая солома, морковь и капуста.

Образцы соломы с сахарозой и глюкозой увлажняли до влажности 50-55% и конечной концентрацией сахара засеянной культуры 2% (рисунок 4).

Добавление сахарозы стимулировало продуктивность дрожжей в 1,7 раза, глюкозы - в 2 раза, моркови -в 4,7 раза, капусты - в 5 раз по сравнению с продуктивностью на нативной

Рисунок 4 - Продуктивность дрожжей Pichia anómala 9а на соломе. питательных средах с углеводными добавками.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что стимуляция

роста дрожжей более эффективна при добавлении комплексных углеводистых

субстратов. Возможно, это связано не только с содержанием углеводов в овощах, но и

других минеральных элементов.

Соломенная мука по химическому составу значительно беднее сенной муки и прежде всего по сырому протеину. В работе была сделана попытка повысить содержание белка в этих субстратах с помощью минерального азота (сульфат аммония)

и нативной зерновой послеспиртовой барды.

Введение минерального азота в сенную питательную среду не оказывает заметного стимулирующего влияния на рост дрожжей.

Таблица 4

Влияние барды на рост дрожжей на соломе.

№ п/п Штамм Питательная среда Увлажня ющий компонент Влаж ность ,% 24 часа 48 часов 72 часа

1 Candida famata Т8 солома барда 50-55 6,0 6,3 4,7

2 Р. guilliermondii солома барда 50-55 7,2 6,4 4,3

3 Р. anómala Р1 солома барда 50-55 6,0 5,3 3,9

7 С. famata Т8 солома+зерно (1:1) барда 50-55 4,2 7,0 4,5

8 Р. guilliermondii солома+зерно (1:1) барда 50-55 5,0 8,0 5,5

9 Р. anómala Р1 солома+зерно (1:1) барда 50-55 5,6 8,3 4,8

В то же время из таблицы 4 достаточно наглядно видно, что барда является очень хорошим стимулятором роста дрожжей на соломенной муке, причем этот рост идет быстро, в основном в течение первых суток. Последующее культивирование обычно приводит к лизису уже наросших дрожжей. Если же к этому комплексному субстрату добавлять измельченное зерно, то максимум клеток достигается за более продолжительное время и этот максимум ни так уж значительно отличается от комплексной среды без зерна. Скорее всего, наиболее рациональной средой для утилизации барды по данной технологии будет соломенная мука, увлажненная зерновой бардой до 60-70% - ой влажности.

2.2.3. Определение условий культивирования дрожжей на целлюлозосодержащих субстратах.

Определена наиболее подходящая температура для культивирования выделенных дрожжей - 30°С, высота слоя твердофазной культуры - не более 3 см.

В большинстве случаев дрожжи накапливают биомассу в течение 24-48 часов, а затем через 72 часа наблюдается либо незначительное нарастание, либо культура остается на том же уровне. Нередки также факты, когда после 48 часов ферментации можно визуально наблюдать снижение числа клеток в твердофазных культурах, в других же случаях к 72-му часу рост продолжается. Задачей технолога в каждом отдельном случае, применительно к продукту и субстрату проконтролировать ход процесса. Но все-таки как правило основную массу клеток (свыше 70%) дрожжи наращивали в течение первых двух суток.

Перемешивание растущей твердофазной культуры особо не влияет на рост дрожжей. Этот факт мы считаем очень важным при конструировании растильного оборудования для твердофазного культивирования микроорганизмов. Практически приемлемыми могут быть установки и с перемешиванием и без перемешивания растущей культуры.

2.3. Взаимодействие дрожжей и лактобактерий в процессе производства микробных нутриентов.

w о а

^SL Чяпрзт

0.5 Й----—-esS:.....1----

L IZTC.

Время ферментации, ч

Рисунок 5 - Динамика дрожжей Pichia anomala 9а и лактобактерий Lactobacillus acidophilus в процессе аэробного культивирования на сенной муке.

SP Р - - I

- : ■

;В Дрожжи '-Баперии]

Время ферментации, ч

Лактобактерии при совместном твердофазном культивировании с дрожжами в аэробных условиях не оказывают на них ингибирующего и стимулирующего влияния. В этих условиях идет

преимущественное накопление дрожжевой биомассы (рисунок 5).

В процессе анаэробной ферментации создаются благоприятные условия для развития лактобактерий и роль дрожжей отходит на второй план - их рост прекращается и даже отмечается

постепенный их лизис (рисунок 6).

Рисунок 6 - Динамика дрожжей Pichia anomala 9а и лактобактерий Lactobacillus acidophilus в ходе анаэробной ферментации.

В процессе анаэробного культивирования активная кислотность уменьшается, а титруемая возрастает. Скорее всего это связано с интенсивным ростом лактобактерий и образованием ими молочной кислоты. Если говорить о получении напитка по титруемой

кислотности сравнимой с квасом (20-40 °Т), то достаточно 24 -ех часовой ферметнации, кефира (85 -130 °Т) - 96 - ти часовой ферметнации. Содержание сухих веществ (СВ) в напитке составляло 12%.

Содержание белка в продуктах микробной ферментации повышается на 20-25% и что особенно важно на 20-30% нарастает содержание особо ценных незаменимых аминокислот.

2.4. Некоторые аспекты взаимодействия дрожже-бактериальных препаратов и патогенных микроорганизмов.

В процессе исследования влияния чистых культур бактерий на патогенные стафилококки показано, что молочнокислые бактерии обладают ингибирующей способностью по отношению к СЭА и СЭВ, причем более активно они ингибировали синтез СЭА, чем СЭВ.

Что касается дрожжей, то из таблицы 5 видно, что взятые в качестве контроля дрожжи Засскаготусех ЪоиЫгйп известные в литературе их позитивным действием при заболеваниях, вызванных токсигенными бактериями, никакого ингибирующего действия на выбранный нами модельный штамм и его токсинообразование не оказывают. Аналогично ведут себя и полученные нами инакгивированные комплексные культуры, что позволяет сделать заключение, что дрожжи являются в основном путриентами и если мы говорим о позитивном действии дрожжей при токсикоинфекциях, то скорее всего речь идет о непрямом их влиянии на токсигенный микроб через стимулирование активности собственной полезной микрофлоры кишечника. Роль же прямых биокорректоров принадлежит скорее всего бактериальной составляющей ассоциации, а сама ассоциация в пищевых и кормовых продуктах должна содержать живые комплексные культуры.

Таблица 5

Показатели роста и функциональных свойств токсинообразующих Staphylococcus aureus FRI 722 при совместном выращивании с жидкими дрожже-бактериальными __ полуфабрикатами. _

№ п/п Штамм lg КОЕ/ см3(г) Фосфоли-пазная активность, % рН Концентрация токсина

б/р 1:10 1:50 1:100 1:200

1 Контроль 1 S. aureus FRI 722 10,8 100 7,81 + + + - -

2 Контроль 2 S. aureus FRI 722 + отруби +свекла+ сахарный р-р. 10,2 25 5,0 + + - - -

3 S. boulardii живые 9,5 100 8,45 + + + +

S. boulardii инакт.* 10 100 8,2 + + + + +

Комплексные культуры

3 Р. anómala 9а на 2 сутки+Z. acidophilus 9,7 50 8,33 + - - - -

4 Р. anómala 9а инакт. на 2 сутки +L. acidophilus 11,8 100 7,4 + + + + +

5 Р. anómala 9а на 5 сутки + L. acidophilus 10 90 8,6 - - - - -

6 Р. anómala 9а инакт. на 5 сутки +L. acidophilus 12,3 100 8,2 + + + + -

7 Р. anómala 9а на 7 сутки + L. acidophilus 9,3 60 8,71 - - - - -

8 Р. anómala 9а инакт на 7 сутки +L. acidophilus 9,7 60 8,05 + + + + - ¡ i

*инакт- инактивированный (прогретый при 100°С 15 минут)

2.5. Пути технологической и технической реализации разработанных процессов.

На рисунке 7 представлена принципиальная схема получения микробных нутриентов.

Основной стадией получения продуктов по разработанной технологии является непосредственно ферментация твердых субстратов дрожже - бактериальными ассоциациями. В условиях существующих спиртзаводов и хлебозаводов данную стадию возможно осуществлять непосредственно в кюветах или поддонах, используемых на спиртзаводах для получения грибных гидролитических ферментов методом твердофазного культивирования, на хлебозаводах - на протвинях для выпечки хлеба.

Если технология будет доведена до промышленного производства, эта стадия станет самим узким местом в техническом решении. Здесь нами разработаны 2 варианта оборудования:

1. Для чисто твердофазной ферментации в кондиционируемом помещении может быть использована система горизонтальных транспортерных лент с ограничиваемой высотой слоя растущей культуры и с пересыпанием с ленты на лету. Прототипы подобного устройства в литературе известны.

2. Для твердофазно - глубинной ферментации нами предлагается специальная кассета, адаптируемая к вертикальным ферментационным аппаратам любой емкости и предназначенная для последовательно осуществляемых ТФФ и ГФ (твердофазно-глубинная ферментация ТГФ) в одной и той же емкости. Такого аппарата в металле не существует и он еще не запатентован._

Высокопродуктивные дрожже-бактериальные ассоциации

Сырье для биоколверсии: Измельченные трава, сено, солома, зеленая масса кукурузы, сахарного тростника, проса, зерно, продукты и отходы его переработки, клубни, корнеплоды, плоды, овощи, жомы, шроты, послеспиртовая барда, молочная сыворотка, и т.п.

А

Аэробная твердофазная ферментация (ТФФ)

-гишии

Полуфабрикат после ТФФ

Инактивиро-вание, сушка

т

т

Разбавление жидким сахаристым субстратом и анаэробная глубинная ферментация

Инактиви-рованние, сушка

Твердые корма (пребиотики)

Фракционирование живых культур

X

т

Сушка в

щадящем

режиме

т

Твердые пищевые продукты и полуфабрикаты (пребиотики, симбиотики) _

Твердые влажные нутриенты, корма для с/х животных (пробиотики, симбиотики)

Жидкие нутриенты, напитки (пробиотики. симбиотики)

Рисунок 7 - Блок - схема ключевых технологических этапов разрабатываемой технологии.

выводы

1. Установлена возможность эффективного накопления микробной биомассы пищевого и кормового назначения на твердых целлюлозосодержащих субстратах.

2. В качестве источника микроорганизмов - продуцентов биомассы предложено использовать молоко млекопитающих.

3. Наиболее перспективным источником дрожжей и бактерий - продуцентов биомассы на твердых растительных субстратах признано женское грудное молоко.

4. Для накопления дрожже-бактериальной биомассы рекомендовано использовать различные виды первичного и вторичного целлюлозосодержащего сырья: зерновые отруби, сенная, травяная мука, жомы, шроты и т.п.

5. Подобраны оптимальные условия культивирования дрожже-бактериальных сообществ на различных твердофазных субстратах: влажность - 40-70%, температура -30-35°С, продолжительность культивирования 24-48 часов, размер частиц субстрата - 13 мм, высота слоя растущей культуры - до 3 см.

6. В разработанной технологии ферментацию предложено осуществлять в 2 этапа: 1 - й этап - аэробный, на котором осуществляется в основном накопление дрожжевой биомассы на увлажненной твердой среде, 2 - й этап - после добавления жидкого компонента ферментация осуществляется в анаэробном режиме с накоплением бактериальной массы и продуктов ее метаболизма, которые в основном формируют органолептические свойства получаемых продуктов.

7. Разработана технологическая схема, по которой пищевые и кормовые продукты и полуфабрикаты могут получаться как в твердофазном так и в твердофазно - глубинном варианте.

8. Установлены принципы взаимодействия получаемых твердых и жидких микробных продуктов с патогенными токсигенными микроорганизмами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Горин К.В. Твердофазное культивирование микроорганизмов в комплексном решении народно-хозяйственных проблем. / Борисенко Е.Г., Шамсутдинова В.Р. // В сб.: Международная научно-практическая конференция "Биотехнология. Вода и пищевые продукты". Москва, 11-13 марта 2008 г. - С.57.

2. Горин К.В. Микробная биомасса в пище и кормах: свершения и надежды. / Борисенко Е.Г., Шамсутдинова В.Р. // В сб.: VI Научно-практическая конференция с

международным участием "Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации. Эффективное использование ресурсов отрасли". М.: МГУПП, 18-19 ноября 2008 г. - С. 64-71.

3. Горин К.В. Функциональные пищевые продукты на основе первичного и вторичного зернового сырья. / Борисенко Е.Г. // Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты. Сборник материалов VI международной научно-практической конференции. - М.: МГУПП, 2008 г. - 4.2. - С. 117-121.

4. Горин К.В. Инновационные технологии производства продовольствия и кормов. / Борисенко Е.Г. // X юбилейный международный форум "Высокие технологии 21 века". Москва, 21-24 апреля 2009 г. - С. 193-196.

5. Горин К.В. Жидкие агропромышленные поллюанты как сырье для производства микробной биомассы. / Каночкина М.С.,, Борисенко Е.Г. // Первая научно-практическая конференция с международным участием "Безопасность и экология предприятий пищевой промышленности. Инновационные решения использования отходов пищевых производств". - М.: МГУПП, 23 сентября 2009 г. - С. 57-62.

6. Горин К.В. Целлюлозосодержащие материалы как сырье для производства дрожжевой биомассы. / Каночкина М.С., Борисенко Е.Г. // VII международная научно -практическая конференция и выставка "Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты". - М. .-МГУПП, 7-8 октября 2009 г. - С. 157-161.

7. Горин К.В. Альтернативное производство продовольствия в условиях кризиса. / Борисенко Е.Г. // Пищевая промышленность, 2009 г. - №6. - С.28-29.

8. Gorin K.V. The yeast-bacterial edible products based on the primary and secondary agroindustrial raw materials. / Borisenko E.G., Kanochkina M.S, Nguen Chyong Zang // EurasiaBio 2nd International Congress-Partnering & Exhibition on Biotchnology and Bioenergy, Moscow, 2010. - P. 236-237.

9. Горин К.В. Нутриенты - биокорректоры на базе нетрадиционного сырья. / Нгуен Ч.З., Каночкика М.С., Борисенко Е.Г. // Сборник докладов III межведомственной научно-практической конференции "Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров"/ Отв. ред. Ю.И. Сидоренко. - М.: Издательский комплекс МГУПП, 2010.-С. 81-85.

10. Горин К.В. Влияние молочнокислых микроорганизмов и дрожжей на продукцию стафилококковых энтеротокссинов типа А и В. / Флуер Ф.С., Борисенко Е.Г., Батищева С. Ю. // Вопросы питания, 2011. - Том 80. - №5. - С. 55 - 59.

Список сокращений, использованных в автореферате

БАД - биологически активная добавка; ГФ - глубинная ферментация; ТТФ -твердофазная ферментация; ТГФ - твердофазно - глубинная ферментация; ПЦР -полимеразная цепная реакция; СЭА - стафилококковый энтеротоксин типа А; СЭВ-стафилококковый энтеротоксин типа В; СВ - сухие вещества.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность своему научному руководителю д.т.н., профессору Борисенко Е.Г., заведующей кафедрой "Биотехнология" МГУПП д.т.н., профессору Ивановой Л.А., к.м.н., с.н.с. НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Флуеру Ф.С., с.н.с. НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Алексеевой Н.В., заведующему кафедрой "Биологии почв" МГУ д.б.н., профессору Чернову И.Ю., а также всем сотрудникам кафедры «Биотехнология» МГУПП.

Summary

The problem of protein deficit in human's and animal's nutrition based on microbial bioconversion various cellulosic substrate, which enriched essential amino acid, vitamins, we suggest to decide. The strains of yeasts and bacteria were selected from human breast milk. These yeasts have ability of intensive accumulation of biomass on various primary and secondary raw materials during solid-state fermentation. We developed yeasts - bacteria associations for bioconversion raw materials, which contain cellulose: crushed grass, hay, straw, green weight of corn and millet, grain, products of its processing, tubers, root crops and etc. These yeasts - bacteria associations depend upon aerobic - anaerobic fermentaton arc used for production semi - products for food and feed, which become a nutrients - biocorrectors of gastro - intestinal tract. Its food and feed enriched viable microflora action against pathogenic bacteria and it's toxins.

Подписано в печать 15.11.11. Формат 60><90 V^. Печ. л. 1,1. Тираж 150 экз. Изд. №111. Заказ 160. Издательский комплекс МГУПП 125080, Москва, Волоколамское ш., 11

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Пищевая цепь человека и животных и ее особенности.

1.1.1 Растительная биомасса как основа пищевой цепи живых организмов.

1.1.2 Микробно-растительная биомасса как основа рациона растительноядных животных.

1.1.3 Животные продукты: их биологическая ценность и роль.

1.2 Индустриальное производство микробных нутриентов и его особенности.

1.2.1 История развития производства микробного белка.

1.2.2 Получение микробных нутриентов с помощью ТФФ.

1.2.3 Прямая биоконверсия растительного сырья микроорганизмами.

1.3 Микробный биоценоз желудочно - кишечного тракта как экстракорпоральный орган макроорганизма.

1.3.1 Общие представления о микрофлоре ЖКТ.

1.3.2 Биопленка как средство аггрегации микроорганизмов.

1.3.3 Дисбактериозы и их роль в современной патологии человека и животных.

1.3.4 Коррекция микробиоценозов ЖКТ.

1.4 Стафилококк и стафилококковые энтеротоксины и их роль в желудочно-кишечной патологии.

1.4.1 Общая характеристика стафилококков.

1.4.2 Продукция энтеротоксинов стафилококками.

1.4.3 Пищевые отравления стафилококковой этиологии и методы борьбы с ними.

1.5 Молоко млекопитающих и его биологическая роль

1.5.1 Образование молока.

1.5.2 Химический состав молока.

1.5.3 Микробиологический состав молока и его роль в становлении и поддержании микробиоценоза новорожденного.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1.1 Материалы исследований.

2.1.1.1 Штаммы микроорганизмов, применявшиеся в работе.

2.1.1.2 Сырье, применявшееся в работе.

2.1.1.3 Реактивы, использованные в работе.

2.1.2 Методы исследования.

2.1.2.1 Метод приготовление питательных сред для работы с натуральной молочной микрофлорой.

2.1.2.2 Метод выращивания дрожжей на накопительных г и ' № питательных средах.

2.1.2.3 Метод выращивания молочнокислых бактерий на накопительных средах.

1- 2.1.2.4 Метод получения чистых культур молочных дрожжей.

2.1.2.5 Метод получения чистых культур молочнокислых бактерий

2.1.2.6 Метод определения антибактериальной активности выделенных молочнокислых бактерий. р 2.1.2.7 Метод глубинного культивирования дрожжей на молоке и молочной сыворотке.

Г 2.1.2.8 Метод глубинного культивирования дрожжей на молочно < растительных и сывороточно-растительных средах.

1 ^ 2.1.2.9 Метод отбора дрожжей-суперпродуцентов биомассы на твердофазных субстратах. г 2.1.2.10 Метод конструирования дрожже-бактериальных ассоциаций для биоконверсии зерновых отрубей. р 2.1.2.11 Метод ферментации первичных растительных субстратов с р помощью отселекционированных микробных ассоциаций < 2.1.2.12 Метод ферментации вторичного сырья пищевых предприятий с помощью отселекционированных ассоциаций

2.1.2.13 Метод приготовление твердых полуфабрикатов

I функциональных пищевых продуктов и кормов с помощью отселекционированных микробных ассоциаций.

2.1.2.14 Метод приготовление твердых и жидких функциональных продуктов.

I? 2.1.2.15 Определение физиологических признаков штаммов и р идентификации дрожжей.

2.1.2.16 Методы приготовления питательных сред.

2.1.2.17 Определение количества дрожжей.

2.1.2.18 Определение содержания молочнокислых микроорганизмов, в том числе лактобацилл.

2.1.2.19 Поддержание чистых культур дрожжей и приготовление посевного материала.

2.1.2.20 Поддержание чистых культур молочнокислых бактерий и приготовление посевного материала.

2.1.2.21 Методы культивирования микроорганизмов.

5 2.1.2.22 Определение содержания белка.

2.1.2.23 Определение влажности.

2.1.2.24 Метод количественной оценки интенсивности сформированной биопленки.

2.1.2.25 Методы обработки питательных сред перед засевом.

2.1.2.26 Методы засева микроорганизмов.

2.1.2.27 Метод определения аминокислотного состава белков.

2.1.2.28 Метод определения биологической ценности полученных культур дрожжей и бактерий и продуктов на их основе.

§>;; 2.1.2.29 ОпределениерНрастворов.

2.1.2.30 Определение титруемой кислотности.

2.1.2.31 Метод фракционирования ферментированных субстратов.

2.1.2.32 Проведение микробиологического контроля. щ 2.1.2.33 Повторность измерений и математическая обработка результатов.

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2.1 Селекция молочных дрожжей - суперпродуцентов биомассы

Щ, на целлюлозосодержащем сырье.

Ш 2.2.1.1 Выделяемость дрожжей из молочных продуктов.

Щ 2.2.1.2 Взаимодействие дрожжей и бактерий, выделенных из щ молока.

Щ 2.2.1.3 Продуктивность молочных дрожжей на целлюлозосодержащих субстратах. щ 2.2.1.4 Идентификация дрожжей - суперпродуцентов биомассы и некоторые биологические свойства.

2.2.2 Конструирование питательных субстратов для твердофазной ферментации.

2.2.2.1 Агропромышленные целлюлозосодержащие субстраты как

Щ основа твердофазных сред.

2.2.2.1.1 Использование первичного агропромышленного сырья в

Щ качестве питательной среды.

2.2.2.1.2 Использование вторичного агропромышленного сырья в качестве питательной среды.

2.2.2.2 Дисперсность целлюлозосодержащих субстратов как фактор стимулирования роста микроорганизмов.

2.2.2.3 Влажность целлюлозосодержащих субстратов как фактор

Ш* стимулирования роста микроорганизмов.

2.2.2.4 Влияние углеводных добавок к целлюлозосодержащим субстратам.

2.2.2.5 Азотсодержащие добавки как стимуляторы роста

7 микроорганизмов.

2.2.3 Определение условий культивирования дрожжей на целлюлозосодержащих субстратах.

Ц» 2.2.3.1 Температурные режимы твердофазного культивирования

2.2.3.2 Высота слоя твердофазных культур. р 2.2.3.3 Влияние перемешивания растущей твердофазной культуры.

З,- 2.2.3.4 Продолжительность культивирования. г 2.2.4 Взаимодействие дрожжей и бактерий в микробных нутриентах.

2.2.4.1 Взаимодействие дрожжей и лактобактерий в процессе

Ь аэробного культивирования.

2.2.4.2 Взаимодействие дрожжей и лактобактерий в процессе

Ж, анаэробного культивирования.

2.2.4.3 Динамика показателей ферментированных дрожже-бактериальных продуктов.

2.2.4.4 Некоторые аспекты взаимодействия дрожже-бактериальных препаратов и патогенных микроорганизмов.

2.2.4.4.1 Взаимодействие чистых культур дрожжей и молочнокислых бактерий и патогенных микроорганизмов.

2.2.4.4.2 Взаимодействие полученных дрожже-бактериальных полуфабрикатов и патогенных микроорганизмов.

2.2.5 Пути технологической и технической реализации разработанных процессов.

3. ВЫВОДЫ.

4. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ.

Актуальность темы. Во всем мире, и в России в том числе, весьма острой является проблема дефицита животного белка, сбалансированного по незаменимым аминокислотам. Значительный интерес в этом плане представляет использование белка одноклеточных. В Советском Союзе микробная биомасса в виде дрожжей, выращенных на гидролизатах целлюлозосодержащего сырья и на парафинах нефти (1,5 млн т в год), была очень эффективным обогатителем кормов для сельскохозяйственных животных, однако практически все производства кормовых дрожжей в настоящее время свою деятельность прекратили из-за распада промышленного животноводства, дороговизны сырья, электроэнергии и материального оснащения. Однако сама идея интенсивного использования микробного белка остается весьма актуальной. Причем такой белок становится все более интересным не только как компонент кормов для животных, но и пищи для людей.

Существующие мощности подавляющего большинства биотехнологических предприятий, возведенных в основном еще в советское время, либо разрушены, либо морально и физически устарели и требуют модернизации с использованием инновационных технологий.

Очень актуальным становится вопрос по каким направлениям вести эти инновации. В "Стратегии национальной безопасности Российской Федерации до 2020 года", утвержденной Указом президента Российской Федерации №537 от 12 мая 2009 г., к числу главных направлений обеспечения национальной безопасности в среднесрочной перспективе отнесена продовольственная безопасность. Микробная биомасса является важнейшим нутриентом человека у народов очень многих стран, однако в нашей стране это направление особенного развития не имело.

Второй немаловажной проблемой является нарушение структуры питания населения. Нехватка в рационе полноценных белков, витаминов, пищевых волокон, макро- и микронутриентов, полезных микробов в пище вызывает рост социально опасных заболеваний, в том числе желудочно-кишечных. Часто причиной этих заболеваний является нарушение микробиоценозов желудочно-кишечного тракта. Возбудителями заболеваний человека и животных нередко становятся условно-патогенные бактерии, приобретающие плазмиды токсигенности, колонизационной резистентности и антибиотикоустойчивости.

Не менее актуальной проблемой является защита окружающей среды от отходов агропромышленных предприятий (спиртзаводов, молзаводов, животноводческих комплексов и т.п.). В пищевых отраслях образуется до 45 млн т вторичных ресурсов и отходов в год, из которых значительная часть используется неэффективно, направляясь в отвалы или выливается в водоемы, тем самым нанося огромный вред окружающей среде.

Все вышеприведенные проблемы могут эффективно решаться путем микробной биоконверсии сложных субстратов, составленных из первичных и вторичных, твердых и жидких агропромышленных продуктов растительного и животного происхождения.

Инструментом биоконверсии исходных субстратов являются прежде всего микроорганизмы, отличающиеся высокой способностью накапливать богатую незаменимыми аминокислотами биомассу на твердых жидких субстратах, а полученные в результате микробной ферментации продукты имеют очень серьезные перспективы для использования в качестве основы или компонента пищи и кормов.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы стала разработка универсального способа биоконверсии различных видов первичного и вторичного агропромышленного и прежде всего растительного сырья, отходов его переработки, в том числе и ксенобиотиков в биологически активные полуфабрикаты, обогащенные микробным белком.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. Отселекционировать новые штаммы дрожжей и бактерий из молока млекопитающих, способные расти на твердых негидролизованных растительных субстратах.

2. Сконструировать жидкие и твердые питательные среды для выделенных дрожжей и выявить из них наиболее перспективные, подобрать оптимальный состав и условия культивирования.

3. Сконструировать дрожже-бактериальные ассоциации для совместного культивирования на твердых и жидких субстратах.

4. Разработать рецептуры полуфабрикатов пищевых продуктов и кормов.

5. Оценить химическую и биологическую ценность полученных полуфабрикатов и приготовленных из них продуктов.

Научная новизна работы.

Впервые разработана методика выделения дрожжей и молочнокислых бактерий из женского 1рудного молока. Показана возможность эффективной биоконверсии практически любого целлюлозосодержащего растительного сырья с помощью сконструированных дрожже-бактериальных ассоциаций; установлена перспективность использования для этих целей прежде всего дрожжей рода Pichia и молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus. Установлено, что взаимоотношения дрожжей - суперпродуцентов биомассы и молочнокислых бактерий при совместном аэробном культивировании на твердых средах не носят конкурентного характера. В условиях же анаэробной ферментации наблюдается стимулирующее влияние дрожжей на рост молочнокислых бактерий, а развитие дрожжей при этом подавляется.

Сформулированы представления о механизме действия выделенных дрожжей и молочнокислых бактерий а также твердых и жидких полуфабрикатов на патогенную микрофлору.

Молочнокислые бактерии в чистых культурах и в составе пищевых продуктов в большей или меньшей степени подавляют рост патогенных стафилококков и продукцию стафилококкового энтеротоксина.

Дрожжи, выделенные из грудного молока, такой выраженной способностью не обладают и они его могут даже стимулировать подобно сахаромицетам.

Таким образом, in vitro показано, что дрожжи прежде всего являются нутриентами для бактерий, а молочнокислые бактерии являются потенциальным регулятором микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Результаты исследований выявленных зависимостей послужили обоснованием предложенной в работе технологии производства новых видов нутриентов - биокорректоров на основе аэробно - анаэробной биоконверсии целлюлозосодержащего сырья дрожже - бактериальными ассоциациями.

Практическая значимость и реализация результатов работы.

Разработаны методики выделения и селекции дрожжей суперпродуцентов биомассы и молочнокислых бактерий из женского грудного молока. Отобраны штаммы дрожжей, обладающие высокой продуктивностью и скоростью роста на различных видах целлюлозосодержащего сырья. Сформированы дрожже-бактериальные ассоциации для эффективной биоконверсии растительных субтратов.

Сконструированы твердофазные питательные среды для дрожжебактериальных ассоциаций. Определены общие закономерности роста дрожже - бактериальных ассоциаций на простых и комплексных твердых питательных средах, определены оптимальные параметры субстратов и условия роста. Разработана двухэтапная технология получения продуктов пищевого и кормового назначения, по которой на аэробном этапе осуществляется в основном накопление дрожжевой биомассы на увлажненном субстрате, после добавления же жидкого компонента ферментация осуществляется в анаэробном режиме с накоплением бактериальной массы, продуктов ее метаболизма и формированием

10 специфического комплекса органолептических свойств новых продуктов. Предложена рецептура и технология производства новых продуктов -напитков на основе отрубей и сенной муки, обогащенных дрожжами и молочнокислыми бактериями. Дана физико-химическая и микробиологическая характеристика продукта. Разработана технологическая инструкция получения дрожже-бактериального полуфабриката, получаемого путем аэробной твердофазной ферментации пшеничных отрубей. Апробация работы. Основные положения работы докладывались на российских и международных конференциях и симпозиумах: Международная научно-практическая конференция "Биотехнология. Вода и пищевые продукты" (Москва, 2008), VI Научно-практическая конференция с международным участием "Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации. Эффективное использование ресурсов отрасли". (Москва, 2008); VI международной научно-практической конференции " Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты.", X юбилейном международном форуме "Высокие технологии 21 века". (Москва 2009), Первой научно-практической конференции с международным участием "Безопасность и экология предприятий пищевой промышленности. Инновационные решения использования отходов пищевых производств" (Москва 2009), VII международная научно - практическая конференция и выставка "Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты. (Москва 2009), Первой международной научно-практической конференции "Идентификация фальсифицированных пищевых продуктов. Контроль содержания и безопасность наночастиц в продукции сельского хозяйства и пищевых продуктах" (Москва 2009), EurasiaBio 2nd International Congress-Partnering & Exhibition on Biotchnology and Bioenergy, Moscow 2010, III межведомственной научно-практической конференции "Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров", (Москва 2010).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Пищевая цепь живых организмов и ее особенности.

Жизнь на Земле возможна лишь как планетарное явление, как форма существования биосферы с обязательными для нее кругооборотом веществ и потоков энергии - биотическим круговоротом. Равновесие между синтезом и деструкцией веществ - необходимое условие поддержания жизни в планетарном масштабе и существования каждого вида. Биотический круговорот при этом выступает в большей степени как трофический процесс, а сами организмы составляют трофические цепи, где каждый вид использует определенные источники питания и вместе с тем сам служит пищевым объектом [94]. Способность преобразовывать энергию солнца в энергию химических связей, которая используется в трофических цепях, позволяет организмам осуществлять планетарные биогеохимические процессы и круговорот веществ, формирование почвенного покрова литосферы, химического состава атмосферы и гидросферы.

Пищевая цепь живых организмов на нашей планете представлена на рисунке 1.

Неорганические биогены

1.И. Исследование канцерогенности микотоксинов в эксперименте на обезьяне. - Москва, 1985. - С. 32.

2. Азимов Г.И. Как образуется молоко. М.: Колос, 1965. - 71с.

3. Акатов А.К., Флуер Ф.С., Михеева Г.В. и др. .// ВФС 42-236, ВС 89, 1989.

4. Акимкин В.Г., Заболотнова В.И., Антонова Г.К. и др. Микроэкологические нарушения толстого кишечника у больных гастроэнтерологического профиля.// Журн. микробиол. 1997. - №2. - С. 8586.

5. Андреев A.A., Брызгалов Л.И. Произовдство кормовых дрожжей,- М.: Лесная промышленность, 1986. 249 с.

6. Ашмарин И.П. Воробьев A.A. статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Мед. лит., 1962. - 115 с.

7. Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей. М.: Пищевая промышленность, 1979. - 120 с.

8. Бекер М.Е. Введение в биотехнологию, пищевая промышленность. -Москва, 1978.-231 стр.

9. Бекер М.Е. Интенсификация прямой микробной биоконверсии растительных материалов // Биоконверсия растительного сырья: Тез.докл.-Рига: Зинатне,, 1982.- с.3-4.

10. Бойко З.М., Романчук А.Г. Использование отходов свинооткормочного комплекса. Копрологические аспекты промышленного животноводства, тезисы докл. сов. чехосл. симп. Ужгород, 1985. - стр. 102-104.

11. Бондаренко В.М. Дисбиоз. Современные возможности профилактики и лечения. М., 1995. - 164 с.

12. Бондаренко В.М., Боев Б.В., Воробьев A.A. Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1998. - №1. - С. 66-70.

13. Борановский А.Ю., Кондрашина Э.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. СПб., 2000. - 209 с.

14. Борисенко Е.Г. Разработка комплексной технологии белковых препаратов на основе нетрадиционного сырья и дрожжей: дисс. док. тех. наук. М., 1990.-471с.

15. Борисова C.B., Решетник O.A., Мингалеева З.Ш. Использование дрожжей в промышленности.- М.:Гиорд, 2008. 216 с.

16. Бхутатма дас, Курма дас, Друтакарма дас, Мукунда Е.С. Высший вкус. М.: The Bhaktivedanta Book Trust, 2010.-176 с.

17. Васильева Л.И., Брагина Л.Е. Бактериологическая характеристика грудного молока здоровых женщин в первые 7 суток после родов // Рук. -Деп. В ВИНИТИ, 1989. 14 с. (№6660-в89).

18. Виестур У.Э. и др. Система ферментации. Рига. Занатне, 1986. - 174 стр.

19. Войно Л.И. Методические укзания к выполнению лабораторных работ : по разделу «Дрожжи» курса «Микробиология». М.: МГУ1111, 1999. - 19 с.

20. Волков В.А. и др. У истоков советской микробиологической1промышленности. Биотехнология. 1985. - №1.I

21. Воробьева Г.И., Выслоух В.А., Тихонов И.Д., Катруш Р.В. Обогащение крахмал- и целлюлозосодержащего сырья белком микроорганизмов // Биоконверсия растительного сырья: Тез.докл.- Рига: Зинатне, 1982.- С. 186.

22. Воронцова И.М., Мазурина A.B. Справочник по детской диететике-Л.: Медицина, 1977. 343 с.

23. Выродов В.А., Кислицын А.Н., Глухарева М.И. и др. Технология лесохимических производств. М.: Лесная промышленность, 1987.

24. Генетические основы классификации и идентификации дрожжей (1986-1988)/ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов. М., 1989.- 164 с.

25. Головлева Л.А., Грекова Г.А, Черменский Д.Н., Гаврилов A.B.Биоконверсия соломы и опилок, предобработанных различными144I

26. Гололобов А.Д., Катруш Р.В., Курочкина В.Г., Макаров Ю.А. Биоконверсия растительных отходов и создание на этой основе полнорационных кормов // Биоконверсия растительного сырья: Тез. Докл.-Рига: Зинатне, 1982.- с. 146

27. Горбатова К. К. Биохимия молока и молочных продуктов. М.: Легкая и пищ. пром-ть, 1984. - С. 113-119.

28. Градова Н.Б., Касим-Заде И., Зобнина В.П. Исследование биоконверсии гребней винограда // Биоконверсия растительного сырья: Тез.докл.- Рига: Зинатне, 1982.- с.193-194.

29. Грачева Н.М. Дисбактериозы и суперинфекции, причины их возникновения, диагностика, лечение.//Лечащий врач. 1998. - №1. - С. 1821.

30. Грачева Ю.П. Математические методы планирования экспериментов. -Москва: Пищевая промышленность. 1971.-198 стр.

31. Девис П.А., Гетефорс Л.А. Бактериальные инфекции плода и новорожденного: Пер. с англ. М.: Медицина, 1987. - 494с.

32. Донченко Л.В. Технология пектина и пектинопродуктов. М.: Дели принт, 2000.

33. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. М.: Издательство «ГрантЪ», 2002. - 296 с.

34. Дроздова Т.М. Физиология питания. Новосибирск, 2007.- 352 с.

35. Ерофеев П.Ю. Разработка технологии дрожжевых лечебно-профилактических продуктов на базе растительного сырья: дис. канд. тех .наук. М., 1980.-124с.

36. Зябрева Н.В. Прямая биоконверсия целлюлозосодержащих материалов термофильными анаэробами: дис. канд. техн. Наук. М., 2001. - С. 11.

37. Калунянц К.А., Яровенко B.JL, Домарецкий В.А., Колчева P.A. Технология солода, пива и безалкогольных напитков. М.: Колос, 1992. -446 с.

38. Катруш Р.В., Мирзоянова Э.Г. Индустрия белка // Журнал Всесоюзного хим. Общества им. Д.И. Менделеева.-1982.-Т. XXVII, №6.- с.617-621.

39. Клесов A.A. Целлюлазы третьего поколения // Биотехнология.- 1987.-Т.З, № 2.- с.132-138.

40. Ковзов В.В., Островский A.B., Шериков С.Е. Желудочное пищеварение у жвачных животных: учебно методическое пособие. Витебск, 2003. - 23с.

41. Колосков С.П. Оборудование предприятий ферментной промышленности. -М.: Пищевая промышленность, 1969. 386с.

42. Коршунов В.М. Проблема регуляции микрофлоры кишечника.//Журнал микробиологии. 1995. - №3. - с. 48-55.

43. Костенко В.Г. Компонентный состав летучих органических соединений, присутствующих в гидролизатах, получаемых при кислотном гидролизе древесины. Гидролизное производство. 1977. -№8

44. Красноголовцев В.Н. Дисбактериоз кишечника. -М.: 1989. 195с.

45. Курилов Н.В., Короткова А.П. Физиология и биохимия жвачных с интродукцией микроорганизмов. М., 1971. - 432 с.

46. Ладан П.Е., Ужако П.В., Велик A.A. Влияние кормовых дрожжей намолочную продуктивность, качество молока и воспроизводительнуюфункцию коров // Повышение продуктивности сельскохозяйственныхживотных и птицы.-Персиановка, 1980.- Т.15, вып.З.- с.12-15.146

47. Ле Ван Ньонг. Микробиологические и биохимические основы технологии вьетнамских традиционных ферментированных пищевых продуктов: дисс. док. тех. наук. МТИПП. М., 1981. - 366с.

48. Леонов П.А. Биотехнология в действии // Достижения науки и техники АПК.- 1987.-№6.- с.31-32.

49. Леснова О.П. Эффективный способ получения высокобелкового корма // Зоотехния. №1. - 2001.

50. Лобзин Ю.В. Введение. Классификация инфекционных болезней.// Руководство по инфекционным болезням / Под ред. Ю.В. Лобзина, А.П. Казанцева. СПб., 1996. - с. 4-10.

51. Лобзин Ю.В., Волжанин В.М., Захаренко С.М., Клиника, диагностика и лечение актуальных кишечных инфекций. СПб.: Фолиант, 1999. - 187 с.

52. Лобзин Ю.В., Позняк А.Л., Добрынин В.М. и др. Дисбактериозы при острых кишечных инфекциях. СПб., 1997. - 79 с.

53. Лыско К.А. Разработка технологии дрожжевых обогатителей пищи на базе молочной сыворотки и растительного сырья: дисс. канд. тех. наук. М., 2007. - 193с.

54. Мамедьяров М.А., Ганбаров Х.Г., Исмаилов Э.И., Алиева С.М. Биоконверсия обрезков виноградной лозы с применением целлюлолитических ферментных препаратов// Биотехнология.- 1988.- № 3.-с.99-103.

55. Марагашвили Г.Р., Эпистов Э.М. Повышение питательной ценности отходов виноделения с помощью ускорителей электронов. 1-ый Всесоюзный радиобиологический съезд: Тезис, докл. Пущино, 1989. - ТЗ. - стр. 789 -790.

56. Микеладзе Г.Г., Кишелашвили. Биотрансфорация вторичного сырья виноделия путем симбиоза различных микроорганизмов. Биотрансформация вторичного растительного сырья в белковые кормовые продукты. Тез. докл. респ. конф. Тбилиси. 1987. - стр. 57.

57. Нгуен Ким Зунг. Разработка технологии получения дрожжевых лечебно профилактических препаратов на твердых раститёльных субстратах: дисс. кан. тех. наук. МГАПП. - М. - 1996. -151с.

58. Нейчев С. Клиническая микробиология: Пер. с болгар.- София: Медицина и физкультура, 1977. 316с.

59. Новиков Ю.Ф. и др. Выращивание микробов методом твердофазной ферментации. Биотехнология. Москва, 1985. - №4. - стр. 12-27.

60. Обгольц А. А. Иммунология и микробиология грудного молока. -Омск, 2000.-108с.

61. Огарков В.И. Основные биотехнологические проблемы микробиологической промышленности//Биотехнология.-1986.-№4. С. 1-6.

62. Огарков В.И., Киселев О.И., Быков В.А. Биотехнологические направления использования растительного сырья // Биотехнология.- 1985.-№3.- с.1-15.

63. Павлова И.Б., Ленченко Е.М., Банникова Д.А. Атлас морфологии популяций патогенных бактерий. -М.: Колос, 2007. 180с.

64. Панин А.Н., Малик Н.И., Малик Е.В. Иммунология и кишечная микрофлора. М., 1998. - с. 47.

65. Перовская В.Г., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии. М., 1976. - 94 с.

66. Плященко С.И., Сапего В.И., Соляник А.В., Соляник В.В. Анатомо -физиологические особенности пищеварения у сельскохозяйственных животных: учебно методическое пособие. Минск, 2002. - С. 17.

67. Пузанков А., Мхитарян Г. Техника для повышения питательной ценности кормов // Свиноводство. №6. - 2000.

68. Раковский В.Е. Получение кормовых дрожжей из торфа. Минск: Наука и техника, 1977.

69. Рябиков А.Я.и др. Методы изучения пищеварительной функции желудка жвачных животных: учебное пособие, 1983 г.

70. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. М.: Мир, 1987. -411с.

71. Скрябин Г.К., Головлев Е.П. Вклад микробиологии в современную биотехнологию // Труды 16-ой конф. ФЕБО, Москва, 1984.-М., 1987.-Т.2.-с.304-318.

72. Соколов Ю.А. Использование кормов из одноклеточных организмов в рационах сельскохозяйственных животных // Кормовые дрожжи в рационах сельскохозяйственных животных.- Боровск, 1980.- Т.23.- с.3-11.

73. Солдатова С.Ю. Разработка технологии биологически активного полуфабриката пищи и корма на основе растительного сырья и дрожжей: дис. канд. техн. наук. М., 2004. - 170 с.

74. Состояние и перспективы развития производства микробного белка // Биотехнология, 1986.- №5.- с.117-118.

75. Способ получения биомассы кормовых дрожжей: А.с. 114697 СССР: М.КлЗ С12№1/16, А23К 1/12 / Л.Н. Глушанкова, Н.И. Монахова, Т.Н. Семушина, Б.И. Токарев, Л.В. Козлова и А.И. Кунина.- Опубл. 23.09.84. Бюл. №35

76. Стефании Д.В., Вельтищев Ю.Е. Клиническая иммунология детского возраста. JL: медицина, 1977. - 280 с.

77. Сушкова В.И., Воробьева Г.И. Безотходная конверсия растительного сырья в биологически активные вещества.- М.: ДеЛи принт, 2008. 117с.

78. Сытник С.И. Антибиотикочувствительность стафилококков -представителей аутофлоры кожи молочных желез здоровых женщин // Антибиотики и мед. биотехнол. 1987. - Т.32, №6. - с. 460-463.

79. Сытник С.И. Бактериальная обсемененность кожи молочных желез беременных женщин // Акушерство и гинекол. 1987, №8.- с.41-45.

80. Сытник С.И. Коринебактерии в кожном микробиоценозе молочных желез здоровых женщин // Детские инфекции. 1987, №17. - с. 64-67.

81. Сытник С.И. Популяционные характеристики и биологические свойства микрококков, населяющих кожу молочных желез // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1988, №6. - с 16-20.

82. Сытник С.И. Стафилококки в кожном микробиоценозе молочных желез беременных женщин // Журн. микробиол. эпидимеиол. и иммунобиол. — 1987, №8. с15-19.

83. Сытник С.И. Стафилококки в кожном микробиоценозе молочных желез здоровых женщин // Журнал микробилогии, эпидемиологии и иммунологии. 1986, №8. с. 28-32.

84. Трачук Т.Ю., Шраер О.Т. Этапы микробной колонизации организма новорожденных.//Рос. педиатр, журн. 1999. - №3. - с. 37-39.

85. Тужилкин В.И., Доронин А.Ф., Кочеткова A.A., Шендеров Б.А. и др. Функциональные пищевые продукты стратегия современного питания.//Сб.докладов Международной конференции «Технологии и продукты здорового питания». М.,2003. - с. 3-10.

86. Тутельян В. А, Шевелева С.А, Ефимочкина Н.Р. и др.// Методические указания.-М.: МУК 4.2.2429-08.

87. Тырсин Ю.А., Иванова JI.A., Кривова А.Ю. Методические указания к выполнению лабораторных работ по курсу «Специальная биохимия». М.: Изд. Центр МГАПП, 1993. - 66 с.

88. Уголев A.M. Естественные технологии биологических систем. JL: Наука, 1987. - С. 95-96.

89. Федеральный закон «О качестве и безопасности пищевых продуктов» №29-ФЗ. М., 2000.

90. Федорова Г.Г., Барахнина В.Б. Трофические цепи и сети в экосистеме. Учебное пособие по экологии. Уфа, 2008. С. 4-10.

91. Флуер Ф.С., Меньшиков Д.Д., Лазарева Е.Б., Прохоров В.Я., Веснин A.B. Влияние различных пектинов на продукцию стафилококковых энтеротоксинов типов А и В. Журнал микробиологии, 2007, 6, с 11-16

92. Фомичева Г.М., Василенко О.В., Марфенина O.E. Сравнительные морфологические, экологические и молекулярные исследования штаммов Aspergillus versicolor (Vuill.)

93. Хазин Д.А. Производство кормового микробного белка и его использование в кормлении сельскохозяйственных животных.- М.: Агропромиздат, 1987.- с. 53.

94. Холькин Ю.И. Технология гидролизных производств. М.: Лесная промышленность, 1989.-496 с.

95. Хоулт Д. Краткий определитель Берджи. М.: Мир, 1980г, 490с

96. Цирлин Ю.А. Ректификация спирта и фурфурола. М.: лесная промышленность, 1972.

97. Цирлин Ю.А. Ректификация фурфурола. М.: Лесная промышленность, 1971.

98. Чернин В.В., Червинец В.М., Бондаренко В.М., Базлов С.Н. Язвенная болезнь, хронический гастрит и эзофагит в аспекте дисбактериоза эзофагогастродуоденальной зоны. Тверь: ООО "Издательство "Триада", 2004. - С.96-97.

99. Шамсутдинова В.Р. Глубинное культивирование дрожжей на молочной сыворотке и разработка технологий ферментированных продуктов: дис. канд. техн. наук. М., 2008. - 181 с.

100. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса./ЯЗопросы питания. 1999. - т.68,№2. -с.32-40.

101. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т.З. Пробиотики и функциональное питание. М.: «Грантъ», 2001. -287с.

102. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том I: Микрофлора человека и животных и ее функции. М.: Грантъ, 1998. - 288с.

103. Шептулин А.А. Синдром избыточного роста бактерий и «дисбактериоз кишечника»: их место в современной гастроэнтерологии.//Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1999. - №3. - С. 14-18.

104. Шувалова Е.П., Осипова Г.И., Короткова М.Р. Шептулин А.А. Синдром избыточного роста бактерий и «дисбактериоз кишечника»: их место в современной гастроэнтерологии.//Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1999. - №3. - с. 51-54.

105. Щеглов В.В., Боярский Л.Г. Корма: приготовление, хранение, использование. Справочник. М.: Агропромиздат, 1990 г.- 255 с.

106. Яровенко В.Л. и др. Технология спирта. М.: Колос, Колос-Пресс, 2002.116 Álvaro В Serafini; Maria Cláudia D.P. and etc. Microbiological quality of human milk from a Brazilian milk bank // Revista de Saúde Pública, 2003.-Vol. 37.-№6.

107. Amagai M, Yamaguchi T, Hanakawa Y, Nishifuji К, Sugai M, Stanley JR. Staphylococcal exfoliative toxin В specifically cleaves desmoglein. J. Invest Dermatology, 2002, 118(5):845-50.

108. Araujo Alberto, D'Souza Joe. Production of biomass from enzymatic hydrolysate of agriculture waste // J. Ferment. Technol.- 1980.- Vol. 58.- N 4,- P. 399-401.

109. Baldensperger J. Solid substrate fermentation of wheat straw. Biotechnol andBioeng 1985, Vol. 27, N1, p.21-27

110. Barnett J.A., Payne R.W., Yarrow D. Yeasts. Characteristics and Identification. -Cambridge Univ. Press, 1990. P. 1002.

111. Bates C.J., Prentice A. Breast milk as a source of vitamins essential minerals and trace elements// Pharmacol Ther. 1994. - V. 62, №l.-p. 193-220.

112. Batra L.R. and Miller P.D. Some Asian fermented foods and beverages and associated fungi // Mycologia, 66, P. 943

113. Bautista L., Gaya P., Medina M. and Nunez M. A quantitative study of enterotoxin production by sheep milk staphylococci. Appl. Environ. Microbiol. 1988, 54: 566-569.

114. Bergdoll M. S, Surgalla M. G. and Dack U. M. Staphylococcal enterotoxin identification of specific precipitation antibody with enterotoxin neutralizing property J. Immunol. 1959., 83. 334.

115. Bergdoll M.S., Boija C. R., Robbins R .N. and Weiiss K.F. Identification of enterotoxin E. Infect, and Immun. 1971., 11. 593 -595.

116. Bergdoll M.S., Boija C.R. and Avena R. M. Identification of new enterotoxin as enterotoxin C. J. Bacterid., 1965., 90.1481 1485.

117. Bergdoll, M.S. Staphylococcus aureus. In: Foodborne Bacterial Pathogens (Doyle, M.P., ed.). Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA, 1989. pp. 463-523.

118. Brock E., Stanton W. Fermentation methods for protein enrichment of cassava. Biotechnol and Bioeng 1983, Vol. 11 N8, p.1211-1284.

119. Broek A. Van den. Functional foods the Japanese approach.//Intern. Food Ingredients. - 1992. - N1/2. - P. 4-9.

120. Brooker R.J., Widmaier E.P., Graham L.E., Stiling P.D. Biology. McGraw-Hill. New York, 2008.

121. Cannel E. Solid state fermentation. Process Biochemesitry. 1980. Vol. 15. N5, p. 2-7.

122. Casman E.P., Bergdoll M. S., Robinson J. Designation of staphilococcal enterotoxin. J. Bacteriol. 1963 . 85 , p.715 -716

123. Casman E. P, Bennet R. W., Dorsey A. E. and Yasa J.A. Identification of fourth staphylococcal enterotoxin D. J. Bacteriol. 1967., 94.1875.

124. Casman E.P. Further serological studies of staph, enterotoxin J. Bacteriol., 1960. 79,849-856

125. Cletus P. Kurtzman. Four new yeasts in the Pichia anomala clade // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2000. - Vol. 50.-P. 395-404.

126. Dale Bruce E. Lignocellulose conversion and the future of fermentation biotechnology//Trends Biotchnol.- 1987.-Vol. 5.-N 10.-p.287-291.

127. Dijkstra J. Quantitative Aspects of Ruminant Digestion and Metabolism (2nd Edition). CABI Publishing. Wallingford, 2005. 736 p/

128. El Mohandes A.E., Keiser J.F., Johnson L.A. et al. Aerobes isolated in fecal microflora of infants in the intensive care nursery relationship to human milk use and systemic sepsis. Am J. Infect. Control. - 1993.- V. 21, №5. - p. 231-234.

129. El Mohandes A.E., Schatz V., Keiser J.F., Jackson B.J. Bacteria contaminants of collected and frozen human milk in an intensive care nursery // Am J. Infect. Control.-1993.-V. 21, №5. p. 226-230.

130. Fuller R. Probiotics in man and animals. //J. of Appl. Bacteriol. 1989. -Vol. 66.-P. 365-378.

131. Gardes M, Bruns TD. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes-application to the identification of mycorrhizae and rusts.//

132. Genigeorgis C.A. Present state of knowledge on staphylococcal intoxication. Int. J. Food Microbiol 1989. 9: 327-360.

133. Gissen A.S. Off Probiotics, Prebiotics & Synbiotics.//VRP's Inc. Vit. Res. Prod. Newsletters, Sept. 1995. P.56-66.

134. Gregory F. Food enrichment with microbial protein. Conserv and recycle. 1982. Vol. 5. N1. p. 33-40.

135. Haeghebaert S, Le Querrec F, Gallay A, Bouvet P, Gomez M, Vaillant V. Les toxi-infections alimentaires collectives en France, en 1999 et 2000. Bull Epidemiol Hebdo 2002; 23: 105-109.

136. Haines W.C., Harmon L.G. Effect of Variations in Conditions of Incubation upon Inhibition of Staphylococcus aureus by Pediococcus cerevisiae and Streptococcus lactis. Appl Microbiol. 1973,25(2): 169-172.

137. Hamama A.E., Hanouri N.E., Ayadi M.// Int.J. Dairy J 2002.12. 933 -938.

138. Hammer K.A, Carson CF & Riley TV, , Effects of Tea Tree Oil onStaphylococcus aureus Virulence Factors, Rural Industries Research andDevelopment Corporation. 2005, Publication No 05/115155

139. Han Y.W. Microbial utilization of straw. Adv. App. Microbiol. 1978. Vol. 23. p. 119-153.

140. Hernández F.J., Goyache J., Orden J.A., Blanco J.L., Doménech A., Suárez G., Gómez-Lucía E. Repair and enterotoxin synthesis by Staphylococcus aureus after thermal shock. Appl Environ Microbiol. 1993 May; 59(5): 1515-1519.

141. Hesseltine C.W. A millennium of fungi, food and fermentation. Process Biochem. 1977. Vol 12. p. 12-27.

142. Hesseltine C.W. Solid state fermentation. Biotechnol.1977. Vol. 12. N 29. p. 29-32.

143. Jay J.M. Staphylococcal gastroenteritis. // Modern Food Microbiology, 4th edn. Van Nostrand Reinhold, New York, NY, USA, 1992, p.455-478.

144. Jenness R. The composition of human milk //. Semin Perinatol, 1979. Vol. 3. № 3. -P.225-239.

145. Jiménez E., Langa S., Martín V., Arroyo R., Martín R., Fernández L., Rodriguez J.M. Complete genome sequence of Lactobacillus fermentum // Journal of Bacteriology, September 2010. Vol. 192. - No. 18. - P. 4800.

146. Kreger-van-Rij. The yeasts. A Taxonomic Study. Ed. N.J.W. Amsterdam: Elsevier Ski.Publ.B.V., 1984.- P. 1082.

147. Macfarlane S. Microbial biofilm communities in the gastrointestinal tract // J Clin Gastroenterol. 2008. - P. 142 - 143.

148. Marín M.L., Arroyo R., Jiménez E., Gómez A., Fernández L., Rodriguez J.M. Cold storage of human milk: effect on its bacterial composition // J Pediatr Gastroenterol Nutr., 2009. Sep;49(3):343-8.

149. Markus Z.H., Silverman G.J. Factors Affecting the Secretion of Staphylococcal Enterotoxin A. Appl Environ Microbiology, 1970, 20(3): 492-496

150. Marrack P., Kappler J. The staphylococcal enterotoxins and their relatives Science 1990 v 248 P 705-711.

151. Miller G.H., Sabatelli F.J., Hare R.S. et al. The most frequent aminoglycoside resistance mechanisms Changes with time and geographic area:A reflection of aminoglycoside usage patterns?// Clin.I nfect. Dis. 1997. - Vol. 24, Suppl. I. - P.46-62.

152. MolEcol., 1993; 2(2)-P.l 13-118.

153. Mose J.R. Aeromonas species in municipal water supply of a central European city. Biotyping of strains and detection of toxins. Zbt. 1988. Bd. 186. p. 333-337.

154. Nabrotzky K. Was sind «neuartige» Lebensmittel // Deutsche LebensmittelRundschau. №7. - 2002. - S. 257-261.

155. Nagel Frank-Jan J.I., Tramper Johannens, Bakker Maijolein S.N., Rinzema Aijen. Temperature control in a continuously mixed bioreactor for solid-state fermentation.// Biotechnol. And Bioeng. 2001. - Vol.72, N2. - P. 219-230.

156. Nagpal R, Puniya AK, Singh K. In-vitro fibrolytic activities of the anaerobic fungus, Caecomyces sp., immobilized in alginate beads // J. Anim. Feed Sei., 2009. -18 P. 758-768.

157. Nigam Roonam, Pandey Ashok, Prabhu K.A. Cellulase and ligninase production by bacidiomycete culture inn solid-state fermentation // Biol. Wastes.-1987.-Vol. 20.-N1.-p. 1-9.

158. Norman F. Haard, S.A. Odunfa and etc. Fermented cereals a global perspective // FAO agricultural services bulletin. № 138. - 1999. - 268p.

159. Notermans, S. and Heuvelman, CJ. Combined effects of water activity, pH, and suboptimal temperature on growth and enterotoxin production. J. Food Sei. 1983. 48:1832-1835

160. Novick R.P., Fischetti V.A., Feretti J J., Portnoy D.A, Rood J.I. Pathogenicity factors and their regulation. In: Gram Positive Pathogens (.). ASM Press, Washington, D.C., USA, 2000, pp. 392-407.

161. Oddy W.H. The impact of breastmilk on infant and child health // Breastfeed Rev, 2002. Vol. 10. - №3. - P. 5-18.

162. O'Donnell K., Fusarium and its near relatives. //The fungal holomorph:mititic? Meiotic and pleomrphic speciation in fungal systematics // Eds ReynoldsD.R., Taylor J.W. Wallingford, UK: CAB International, 1993, p.225-233.157

163. Otero A., Garcia, M.C., Garcia, M.L et al. Effect of a commercial starter culture on growth of Staphylococcus aureus and thermonuclease and enterotoxins (CI and C2) production in broth cultures. Int.J. Food Microbiol. 1988., 6:107-114.

164. Ozkose E 2001. Morphology and molecular ecology of anaerobic fungi. PhD dissertation, University of Wales, Aberystwyth, UK.

165. Reeiser R. F., Weiss K. F. Production of staphylococcal enterotoxin A, B, C in various media. Appl Microbiol. 1969. 10. 1041.

166. Regassa L.B., Betley M.J. Alkaline pH decreases expression of the accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 1992 174: 5095-5100.

167. Roberts A.K., Harzer G., Drazer B.S., Hill M.J. The effect of diet on the bacterial flora of the infant gut.//Microecological Therapy. 1984. -Vol.14. -P. 1219.

168. Roger L.C., Costabile A., Holland D.T., Hoyles L., McCartney A.L. Examination of faecal Bifidobacterium populations in breast- and formula-fed infants during the first 18 months of life // Microbiology, 2010 Sep 23.

169. Sarafian S.K., Morse, S A. Environmental factors affecting toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) synthesis. J-Med-Microbiol. 1987 Aug; 24(1): 75-81.

170. Senes J.C. Solid state fermentation of starchy substrates. UFU. Intern conf. 1978. P. 131. - Guatemala City.

171. Shah Nadendra P. Functional foods from probiotics and prebiotics.//Food Technol. 2001. -Vol.55, N11.- P.46-53.

172. Sidell FR, Takafuji ET, Franz DR, eds. Medical aspects of chemical and biological warfare. Washington, DC, Department of the Army, Office of The Surgeon General and Borden, Institute, 1997.

173. Silva M. Jacobus N.V. Denek C. Antimicrobial substance from a human Lactobacillus strain. Antimicrobial Agents and Chemother. 1987. Vol. 71. N8. p. 1231-1233.

174. Sproule-Willoughby K.M., Stanton M.M., Rioux K.P., McKay D.M., Buret A.G., Ceri H. In vitro anaerobic biofilms of human colonic microbiota // J Microbiol Methods. 2010.

175. Stewart S.C., Flint H.J., Bryant M.P. The rumen anaerobic fungi. In: Hobson, P.N. and Stewart, C.S. (eds) The Rumen microbial Ecosystem // Kluwer Academic Publishers, Inc. Book News, Portland. 1997. - P. 10-72.

176. Stoltz D.R. Suspected cyclopopiazonic acid of quail in Indonesia. First Asia-Pacific Congr on Animal, Plant and Microbial. Toxins 24 37 June 1987, Toxicon - 1988. Vol. 26. -Nl. p. 39-40.

177. Su Y.C., Wong A.C. Identification an purification of anew staphylococcal enterotoxin H Appl. Microbiol., 1995., 4. p.1438-1443

178. Tannock G.W. The normal microflora: a new concepts in health promotion.//Microbial sci. 1988. - Vol.5, N1. - P.4-9.

179. Tranter H. S., Tassous S. C., Nychas G. J. The effect of the olive phenolic compound, oleuropein, on growth and enterotoxin B production by Staphylococcus aureus. Microbios. 1998,93 (374), 43-54

180. Vath M.G., Earhart C.A., Monie D.D., Iandolo J.J., Schlievert P.M. and Ohlendorf D.H. The Crystal Structure of Exfoliative Toxin B: A Superantigen with Enzymatic Activity. J. Biochemistry, 1999, 38 (32), pp 10239-10246.

181. Walker A. Breast milk as the gold standard for protective nutrients // J Pediatr, 2010. Vol. 156. № 2. - P.3-7.

182. Wieneke AA, Roberts D, Gilbert RJ. Staphylococcal food poisoning in the United Kingdom, 1969-90. Epidemiol Infect 1993; 110:519-531.

183. Williams AG, Coleman GS (1997). The rumen protozoa. In: Hobson, P.N. and Stewart, C.S. (eds) The Rumen Microbial Ecosystem. 2nd edn. Blackie Academic & Professional, London. 1997. - P. 73 - 139.

184. Ydav J.S. Influence of nutritional supplementation of solid substrate fermentation of wheat straw with alkalifitic white rot fungus. Appl. Microbiol and Biotechnol. 1987. Vol 26. N5. p. 474-478.

185. Ydav J.S. SSF of wheat straw with alkaliphitic coprinus. Biotecnhol and Bioeng. 1988. Vol. 31. N5. p. 414-417.

186. Young F.M. Microbiology and Biochemistry of soy sauce fermentation. Adv. Appl. Microbiol. 1974. Vol. 17. p. 157 194.

187. URL: http://www.funpecф.com.br/gmr/year2003/voll-2/sim0009fulltext.htm (дата обращения 23.09.2009)

188. URL: http://www.gatesfoundation.org/topics/Pages/topics-overview.aspx (дата обращения 4.10.2011).

189. URL: http://www.mcx.ru/documents/document/show/14165.308.htm (дата обращения 12.10.2009)

190. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi (дата обращения 3.09.2011)

191. URL:http://www.diarea.ru/modules.php?name=Encyclopedia&op=content &tid=5662 (дата обращения 11.10.2008)

192. URL:http://www.eurolab.ua/microbiology-virology-immunology/3663/3682/31694/ (дата обращения 16.08.2008)

193. URL:http://www.nzfsa.govt.nz/science/data-sheets/staphylococcus-aureus.pdf\ (дата обращения 17.02.2009)