автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МУЛЬТИЭНЗИМНОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ БИОКОНВЕРСИН ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ

Л- з/з 1}- '

~ Государственный комитет Российской Федерации по высшему

образованию

Московская Государственная Академия пищевых производств

На правах рукописи Экз. >6

УДК: 663.15:663.53 <0433)

БуйТхиТху Ха

Разработка технологии мультюнзимной композиции ддя биокоиверсии неллюлозосодержашего сырья

\

Специальность 05.18,10 -. . Технология витаминных, ферментных и белковых препаратов, чая и табака

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук.

Москва, 1995

GOv - Jvíooóo'^ _ Ju^po

\

Работа выполнена в Московской государственной академии пишевых производств.

Научный руководитель: доктор технических наук,

профессор М.В. Гернет

Официальные оппоненты: доктор технических наук,

профессор Е.Г. Борнсенко4 кандидат -технических наук, С.Н.С. Н.В. Сурикова

Ведущая организация: Кафедра химической энзимолопш Московского Государственного университета им. Ломоносова

Защита состоится "ttf " 1995 г, в 40 часов на

заседании специализированного Совета № К 063.04 в Московской ордена Трудового Красного Знамени государственной академии пищевых производств по адресу: 125080, Москва А-80, Волоколамское т., 11.

Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по этому адресу на имя ученого секретаря специализированного Совета ífe К 063.5!.0<1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГАПП.

Автореферат разослан и-юиА^ 1995 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, к.т.н. доц. =

Тихомирова О.И.

Tht use of higtfoctiv* eiryeetic preparations is una of tfce nays of production inttnsification- lb* application of a ikm active mlti-nttyedc ccnplex. vhieh crritflinn a necasaary «nzyn oc a gro<p of mijm wllcm to inown the capacity of an entetfriae without additional capital im »■!»— ■ B—iaatj the application of « nev high-^active collar create* the poeaifility of brewing all basis indices of the production: to enlarge the yield of finished prodiwe witt)' On Caw Materials wit> to loner tht tytyli^m* of wtic # sttasf «Lac* trie pomtci labour focce, and as a 1 in—fmi a to at. pcotation* costs of the finidied peo4nce, novadaya a atgrdliant ino:«—« of way— ■oafaetace, a croation of bic^tnactive ca^J.*x is being envisaged/ as nil as the elaboration of chfiEal technological ptccassea of obtaining biological active aub-atances vith the given properties using non-deficit raw «In lull In collection vith this the investigations bound up with the creation o{ new highly productive strain associations, vith the elaboration of cultivation technology and the secretion of aiuyaa ace particularly urgent. V* writing out of ceLltjlolytic entyae preparations technology 00 the base of dMp aictoarganiaaB cultivation is actual aa it allows to create new complex s^staas for ut effective and purposeful hy^kolysis of natural nco-aiaidiy golysaoefcarides far the solution of uif tasks in the food industry* Bdid» aad agriculture. The intensification of technological procoaaia of application nee balanced (en ccaplex) enzyae systaae is «11 over the uocldi including and

Yietma.

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Одним из путей интенсификации производства является использование высокоактивных ферментных препаратов. Применение нового активного уч мультиэнзимного комплекса, содержащего необходимый фермент или группы ферментов позволяет увеличить мощность предприятия без дополнительных капитальных вложений. Кроме того, применение нового высокоактивного комплекса дает возможность улучшить все основные показатели производства: увеличить выход готовой продукции с единицы сырья, снизить расход воды, пара, электроэнергии, рабочей силы и, как следствие, снизить себестоимость готовой продукции.

В настоящее время предусматривается значительное увеличение производства ферментов, создание высокоактивного хомпдекса, -разработка хнмико-технапогических процессов получения биологически активных, веществ с- заданными - свойствами при' использовании" недефицшного сырья.

В связи с этим исследования, связанные с созданием новых высокопродуктивных ассоциаций штаммов, с разработкой технологии культивирования и выделением ферментов является актуальными.

Разработка технологии целпюлолитичеасих ферментных препаратов на основе глубинного культивирования микроорганизмов актуальна, так как позволяет создать новые комплексные системы для эффогтивного и целенаправленного гидролиза природных некрахмальных полисахаридов для решения многих задач пищевой промышленности, медицины и сельского хозяйства. Интенсификация технологических процессов применения более сбалансированных по комплексу ферментных систем актуальна во всем мире, в том числе и в России и во Вьетнаме.

работы являлась разработка технологии на основе глубинного культивирования ассоциации микроорганизмов препаратов целлюлаз н гемицеллюлаз, эффективно пщролизующих натнвную целлюлозу до глюкозы.

Исходя кз цели работы поставлены следующие задачи:

- Осуществить поиск микроорганизмов - продуцентов цешполазно-гемицеллюлазного комплекса; „ '

• Оптимизировать условия культивирования монокультур продуцентов; г

- Провести совместное культивирование продуцентов для получения сбалансированных по составу мультюнзнмных композиций;

• Оптимизировать условия культивирования, позволяющие повысить активность и осуществлять направленный биосинтез ферментов целлкшазно-гемнцешполазного комплекса;

• Получить мультнэнзимный комплекс разной степени очистки с повышенным * содержанием , ксилапаз и изучить эффективность гидролиза целлюлоз под действием этого комплекса.

Научная новщна работы. Разработаны питательные среды и оптимизированы условия глубинного культивирования

микроскопического гриба Алрет^Шш Гое^йш £>-73 с целью

*

направленного биосинтеза гемицеллюлаз.

Провести скрининг микроорганизмов среди промышленных продуцентов цеплюлаз и гемицеллюлаз. Выявлены ассоциации культур, способные совместно развиваться на твердых агаризованных средах и разработаны условия для благоприятного роста сообщества^. Оптимизирован состав питательной среды н параметры совместного культивирования * ассоциации грибов, позволяющей . получить сбалансированный 4 мультиэнзнмный комплекс, эффективно гкдролизуюший целлюлозу до глюкозы.

Практически ценность работы. На основании полученных данных разработан лабораторный технологический регламент производства МЭК "ЦКГ" (Цешполазноксиланазноглюканазного) разной степени очистки. '

Полученный на . основе ассоциации микроорганизмов-мульттаизимный комплекс позволяет увеличить эффективность гидролиза различных видов целлюлозы от 15 до 50%.

Технология апробирована на стендовой установке МГАПП, а ферментный препарат был использован для интенсификации процессов в пивоварении.

Разработаны схемы получения препаратов разной степени очистки с применением методов ультрафильтраци и и аффинной хро м ато графии.

Ожидаемый экономический эффект от применения МЭК "ЦКГ" при производстве пива в расчете на 1 млн. дал составит 85,5 млн. рублей.

Работа .выполнены ira кафедре "Процессы ферментации и _ промышленного биокатализа " Московской Ордена Трудового Красного Знамени государственной Академии пищевых производств.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на республиканской научно-технической конференции "Проблемы энергетики теплотехнологии в отраслях АПК, перерабатывающих растительное сырье"(Мосжва* 1994).

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 215 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка й 18 таблиц.

Диссертация состоят та введения, обзора литературы, экспериментальной частн, выводе», списка цитируемой литературы (включающего 125 наименований советской литературы и 152 иностранных работ) и предложение.

1. Обзор литературы.

Рассмотрены целлюлазы и гемицеллкшазы, их субстраты и микроорганизмы - их продуценты. Приведены данные ло вопроса» смешанных культур , изучения механизмов , принципов создания н управления микробными ассоциациями.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы н метода исследования:

Объектами исследования являлись различные штаммы грибов -продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз , полученные в лаборатории МГАПП. Культуры поддерживали, пересевали на пробирках со скошенным сусло-агаром раз в 2-3 месяца.

Культивирование осуществляли в конических колбах емкостью 250 мл и на пилотной установке "Анкум" емкостью 50 литров , в течение 6-7 суток при температуре 28-30 С .

В колбу помещали: 50 мл питательной среды . Контрольная среда для Т. longibfachiatum7-26 (Гериет М.В. ,1986) - среда "Ki" : свекловичный жом" 4,6J," пшейи«(ные отруби 0,35; хлопковый" шрот -0,35 ; КН2РО4- 0,3; NH4NO3 - 0,7, контрольная среда для T.viride 44 (Острикова H.A., 1983) - среда "КГ : свекловичный жом - 3 гузупая -0,3; БВК-0,03; лактоза-0,4; (NH^iSO-t - 0,3; КН3РО/- 0,6; MnSOi -0,06; UQ -0,06.

Среда для совместного культивирования T.viride 44 и Т. longibrachiatum 7-26 : среда "О" ( подобранная нами): свекловичный жом 4,6; пшеничные отруби -0,35; хлопковый шрот - 0,35; KHiPCb -0,6; NH4NO} - 0,7; лактоза - 0,4; MnSOu * 5НгО - 0,096; LiCI - 0,06. '

Среда для глубинного культивирования Aspergillus foetidus D-73, (подобранная нами) • среда "А" : свекловичный жом - t,5; пшеничные отруби -.2,0; овсяная шелуха • 1,0; БВК • 0,1; лактоза - 0,4; КН3РО4 - 0,6; NH*NOj - 0,7; UCI-0,06.

■ . 6

Среда для совместного культивирования T.viride 44 и A. foetldus D-73 (подобранная нами) - среда "Ос" : свекловичный жом • 2,0; пшеничные отруби - 2,0; овсяная шелуха -1,0; БВК - 0J8; лактоза 0,4; NH+ЫОз - 0,7; KHjPO* - хлопковый шрот - 0,35; LiCl •0,6;MnSO4 * 5 HiO * 0.096.

Ферментативную активность определяли методами принятыми в работе других исследователей : активность целлюлаз при гидролизе фильтровальной бумаги (АФБ) - по методу Манделъс-Вебера (Mandéis M.,Webex 1969) , активность по КМЦ осахаривающей - методой Мандельс- Вебера (Mandéis M.,Weber Т.,1969), кенпаназную аггивностъ. - по рекомендации Рухшдева (Рухдядева, Пояыгалнна, 1981).

В ходе исследования определяли белок методом Лоури (Lowry et at,19St), восстанавливающие сахара - методом Шомодьи- Нельсона (Somodyi,1952J4dson, 1944).

В работе применяли методы статистической обработки экспериментальных данных , факторного плана эксперимент^ Грачев, 1979). - * ... '

Опыты проводились в трех и более повторностях. Для каждого опыта рассчитывали среднеарифметические нз полученных результатов н оценки дисперсии единичного и среднего результата.

В рамках каждого опыта осуществлен анализ достоверности результате» с применением критерия максимального отклонения. Оценки двшерсии старались объединить , проанализировав сначала их однородность, как правило, с помощью критерия Фишера.

Найденные ередвевзвешанные оосякк дисперсии использовали для расчета доверщеяьиых ошибок средних результатов опытов с помощью критерия Стыадогга при доверительной вероятности 0,95.

Среди микроскопических грибов для получения препаратов цсшполаэ и гемицешполаз был выбран гриб Азрег^Нш ГоешЭш £>-73 -наиболее продуктивный по синтезу гемниеллюлаз, а среди грибов ТпсЬо<]сппа выбраны ТпсЪоёеппа У1п<1е 44 и Т. ктрЬгасЫашт 7-26 -активные продуценты целлюлолнтических ферментов (таблица I).

Таблица 1

Биосинтез целлюлоз и гемицеляшш различных микроорганизмов

№ Наименование хувьтур Уровень фермекгггшной активности

КМЦ АФБ КС

1 ТпсЬодеппа утйе 44 +++ +++ +

2 ТпсЬодотпа 1опв№»сЫгиит 7-26 ++ ++ - +

3 Ахрег^Ншшзег + -

4 Азрег^тш ГовМш [>-52 - +

5 АзрегеШю ГомМш 0-73 + + +++

6 Азрег^Циз Гое*и1и5 ВВ - - +

7 АфегрМш Гой)<1|» 45 + + +

8 АарегрПю НГУ-9 - - +

Сравнительные обозначения:

(+++) очень активный биосинтез, (++) активный биосинтез, (+) активность на среднем уровне, (-) активности не обнаружено. Совместимость культур проведена на сусло- агаровой среде в чашке Петри.

При совместимости двух популяций на среду в жаждой чашке наносили по одному вертикальному штриху одной популяции и вверху по 2 параллельным горизонтальным штрихом.

При совместном выживании в местах соединения популяций по. штриху образовалась зона преимущественного развития предыдущей популяции. * . • • ,

Очередность и момент засева популяции играют важную роль ъ их совместном выживании . При одновременном засеве ТпсЬо^егта

1оп{рЬгасЫашт 7-26 и ТпсЬо<1егта \ап<к 44 «спи ТпсЬоёсгта 1оп;»?Ьгас}йа1ит был засеян первым , то развитие Т.тдпёе подавляется ростом ТЛопрЬпсЫашт , а в противном случае, когда Т.уцкк был засеян первым, его рост достигается на 50% меньше монокультуры. Когда ТпсЬсн1еппа 1опрЬгасЫашт засевали через-одни сутки после внесения Т.етпёе , то Т.чпёе уже успел гармонично развиться и у ТпсЬоёеппа 1оп§ПиасЫашт не существует конкуренции за субстрат. Совместимость культур Т.утс1е и А. Гоейдю проявляется наилучшим образом при подсеве последней через двое суток аг начала культивирбванш.

Результаты испытаний совместимости двух и трех культур ТпсЬск1еппа утпбе 44 (Т.у,) ,ТпсЬос1егта кжрЬгасЫатт 7-26 (ТЛ.) и МрегрНиэ Соеййщ В-73 (АД показали следующие варианты, в которых популяция при совместимости со временем благоприятно сосуществует.

1.Т.*+А1(1)

2.Т.У + ТЛ (I) .

3. Т.у + А/(2)

4. Т.1 + (АТ.у) (О

5. ТЛ+'(А.Г+Т,у)(2)

6.Т.у + (АХ+Т.у) (2)

Цифры ( 1), (2) обозначают, что эта популяция внесена через одни или двое суток после засева первой культуры.

Таким. образом, выявлены возможные варианты совместимости микроорганизмов на твердой агярнзоваиной среде с предпочтительными диапазонами н момент их внесения в ассоциации.

Проведено совместное культивирование ассоциации Т.у + Т.1 и Т.у + ТЦ (1^ на средах, подобранных для них в отдельности ( "К»" н "Кг") и подобранной нами для их совместного роста (среда "0").

Диаграмма 1. Изменение ферментативной шшюсп при совместном •ыращмванин культур Т.у н Т.1 на различных питательных средах.

1-Т.у. на контрольной среде "К|"; 2 -Т.1. на среде "Кг";

3 - Т.у. + ) на среде "О".

Во всех случаях совместного культивирования Т.у и Т.1 не происходит существенного изменения активности иеллюлаз и гемикеялюлаз, хотя их совместимости на твердой агаризо ванной среде оказываются хорошими. Только в случае культивирования вариантом Т.у и Т.] (I) на среде "О" происходит повышение кенланазной активности на 10% по сравнению с монокультурой Т.у и на 30% с монокультурой Т.1. Однако это повышение сопровождалось относительно снижением активности деяяхмш на 10-25%. А по сравнению с монокультурой Т.у на среде" К) " , Т.1 на среде "Кг" „, повышение биосинтеза ксиланаз у ассоциации Т.у + ТЛ (1) на среде "0" .достигается от 20 до 70 % ( диаграмма 1) при этом снижение суммарной целлюлазной активности наблюдается на уровне 10-16%.

Таким образом гриб Тлтёе 44 в совместном выращивании с 7-26 не дает существенного повышения гемицеппкшазной активности, активносг цещполаз значительно снижается, хотя по их совместимости на твердой среде можно было рассчитывать на большую эффективность результатов. .

Поэтому считаем нецелесообразным совместное культивирование Т.тлгМе 44 и ТЛол ¡рЬгасЫаШт 7-26 с целью получения комплекса ферментов с повышенной гемицеллюяазной активностью при достаточно хорошей цашопазной активности.

23 Разработка условий глубинного культивирования гриба А5регр0т 1м1Ик 0-73 для получения целлюдаз ио-гемиоеллюлазного комплекса.

При разработке состава питательных сред принимали во внимание способность микроорганизмов изменить комплекс синтезируемых ферментов в зависимости от состава питательных сред.

В соответствии с рекомендациями других' исследователей (Гогинова и др., 1981 , Месхн ,1983) , в поверхностных условиях крахмал и пектин значительно оказывают влияние н биосинтез кснланаз . Мы исследовали влияние этих компонентов на активность ксилаиаз, цепшолаз грибом Азрег^Шш £ое^и$ 0-73 в глубинных условиях. Использовали для . конструирования питательных сред компоненты, такие как пшеничные отруби, содержащие крахмал, свекловичный жом, содержащий пектин, овсяную шелуху, содержащую ксилан, рисовые отруби, солому, шелуху, пшеничные шелуху, солому, опилки, хлопковый шрот, фермеяшлкзат БВК...■■■

В качестве. неорганических источников азота использовали аммонийные сопи соляной, азотной, серной н фосфорной ^кислот , а также азотнокислые сопи щелочных металлов.- А в качестве

легкодоступного источника углерода служили глюкоза, ксилоза, лактоза.

Установлено, что внесение в среду овсяной шелухи приводит к существенному изменению ксиланазной активности: биосинтез кшланаз грибом повышается в раз при внесении в среду овсяной шелухи в количестве 1%.

Доппнительное введение в среду с определенной концентрацией улучшает биосинтез цедлюлаз и гемицслЬолаз: Глокоза в количестве 0,3 % позволяет повысить КМЦазу, активность по АФБ и по хеиланазе на 10,12,16% соответственно.

При замене КН2РО4 на ЫН<НгРО< происходит ухудшение биосинтез ферментов, ■ активности снижаются на 18-30 %. В присутствии КН}РО< и ЫН<Н}Ю4 наблюдается дополнительное снижение активностей ферментов: АФБ - на 50%, КМЦ- 37%, ксипаназы - 44%.

Дополнительное введение таких компонентов как рисовые отруби, солома, шелуха, пшеничная солома, .опилки в различных концентрациях не оказывает активирующего действия. А ряд исследований замен ими таких, компонентов, как свекловичного жома, пшеничных отрубей, овсяной шелухи не приводит к повышению уровнябиосингеза изучаемых ферментов у гриба.

На основании проведенных исследований, нами были определены набор элементов питательной среды и их композиции для обеспечения активного биосинтеза цеппюлаз и гемицешполаз грибом А$рег^Ши$ Гое^из 0-73. В состав згой среды входят свекловичный жом, пшеничные отруби, овсяная шелуха, хлопковый шрот, лактоза,

юъро«, бвк, аддоо», иа.

pH

Рис. la. Влияние активной кислотности среды на биосинтез raot-целдгаляз а пешковш гриба A. foetidas D-73.

u|

1

i15

1 ' / -—^ \

« 1.s / \

s v /у/___^^iqju

í.s

в

иапмйяямаизизмммм«

1с

Рис. 16. Влияние температуры культивирования гриба A. foetidus D-73 иа биосинтез гемипемкмаз и целдаодаз.

Рис. Is. Динамика биосинтеза гемнцеялюлаз-н целдюдаз у гриба А. foetídss D-73.

Оптимизация состава питательной среды осуществлена с помощью факторного плана эксперимента ДФЭ2" ', в результате чего подобрана среда состав которой состоит из следующего компонента (среда "А"): свекловичный жом -1,5; пшеничные отруби - 2,0; овсяная шелуха -1,0; хлопковый шрот - 0,35; лактоза - 0,4; БВК - ОД; NH+NQj - 0,7; KHjPO* -0,6; UC1 - 0,06. На этой среде Aspergillus foetid us D-73 дает активность по АФБ - 1 ед/мл, по КМЦ - 6 ед/мл, по ксипанаэе - 320 ед/мл.

Как показали результаты испытаний, что наиболее активный биосинтез цеялюлаз и ксиланаэ грибом AspetgiUas foetidus D-73 протекает на средах, исходное значение рН которых находится в пределах 4,9-5,2 (рис 1а).

Установлено , что оптимальной для роста триба и накопления ферментов является температура 28-31 "С ( рис. 16), а для получения максимального накопления целлюлаз н кошаназ грибом необходима продолжительность культивирования 4-5 суток (рис. 1в).

2.4 Разработка условий совместного кухътнв и рожаема Tridtodemu viride 44 . и Aspergillus foetidus D-73 для получины цеплюлазно-геммиеллюлазного комплекса.

- Проведен ряд культивирований монокультурой Trichoderma viride 44 на среде "Ki", среде "О" и среде "А" . Результат показал, что среда "А" обеспечивает активный биосинтез ксиланаз и целлюлаз ие только гриба Aspergillus foetidus D-73, но и для Tridiodenna viride 44. На этой среде наблюдается повышение всех активностей у Tiichoderma viride 44;

На фоне компонентов среды "А" проводили конструирование питательной среды для Trichoderma viride 44 и доя сообщества с Aspergillus foetidus D-73. Исследовали влияния концентрации таких .компонентов как свекловичный жом, пшеничные отруби, гйкжоза, БВК, лактоза на биосинтез целлюлаз и ксиланаз так и монокультурой Tricboderma viride 44, как и сообществом. И установлено, что

свекловичный жом в количестве 2%, отрубей - 2%, лактозы - 0,4% , БВК - 0,18 % обеспечивают максимальное накопление ферментов монокультурой в смешанной культурой, а глюкоза не оказывает -активирующего действия дня биосинтеза ферментов монокультурой и в концентрации (0,1%) она позволяет повысить биосинтез целлюлаз смешанной культурой на 10-15 %.

Свекловичный жом после обработки на "стадии очистки целлюлазы а финной хроматографией уже частично гидролизуетса ферментом, Его можно использовать снова в качестве компонента питательной среды для ассоциации Т. V. 4- А/.(2), и для Т.у. монокультуры.

Результаты исследования показали, что жом в количестве 1,5- 2,0 % обеспечивает активный биосинтез целлюлаз. В количестве 1,5% наблюдается повышение активности по АФБ на 25% , КМЦ на 15% , ксиланазы • на 7,5% , в количестве 2% обработанной жом позволяет повышение активности по АФБ на 20%, КМЦ * 7% и кеяланазы на 5% при культивировашш ТпсЬосктта утёс 44 монокультурой.

В результате конструирования питательной среды подобрана среда ("Ос"), обеспечивающая максимальное накопление ферментов монокультурой ТпсЬоёегта утёе 44 и смешанной ТпсЬоёегша *т<к 44 и АврегеШив (6ей<1ш Е>-73. 'Эта среда содержит следующие компоненты : свекловичный жом -2,0 ; пшеничные отруби - 2,0 ; овсяная шелуха -1,0; БВК - 0,18; хлопковый шрот - 0,35; ЫНчИСЬ - 0,7 ; КН}РО< -0,6 ; 1X3 - 0,06 МпЭО« - 5НгО - 0,096 ; лактоза - 0,4. На этой среде гриб ТпсЬос1еппа ипс1е 44 обеспечивает КМЦ - 40 ед/мл, АФБ -10 еа/мл, кеяланаза - 280 ея/мл, что по КМЦ иа 33%, по АФБ -33%, по кскланаэе- на 3 раза больше чем на контрольной среде "К|

Среда" Ос " дает способность, смешанной /ультуре синтезировать КМЦаэу - 30 ед/мп, АФБ - 7 ец/шг, кеяланазу - 480 ед/мл.

Таким образом, совместное культивирование ТпсЪскЗеппа У1п(1е 44 и А^рарНив й>ей<1и5 Е>-73 на подобранной среде позволяет повысить ксняанаэную активность ферментной ^системы в 5,5 раз прк ;зтом сохраняется цешпалазная активность' на 93-100% по сравнению с. биосинтезом этих фермеягов монокультурой ТпЫюёегпц пп<1е 44 из контрольной среде. .. . : '

Очередность / и / ; предпочтительный даапоэон Пч, ззеева микроорганизмов ' существенно влияют на их развитие и фнзилогическую активность в ассоциации.

Изучай рань этих факторе» на биосинтез ферментов при совместном культивировании ТпсЬоёегшд утйе 44 к А$регвШи$ Гостия Е>-73 (диаграмма 2 и табл12). Во всех вариантах совместного культивирования цежижазная активность по АФБ достигается ниже моно ТпсЬо4ета «п<1е 44, больше моно АврефИиз Гоейс1и5 0-73, способность синтезировать КМЦазу у ТпсЬовеппа тойе 44 не ингябнруется грибом АзретрПиз Аэсовю 1>73 если его подсев осуществляет через 2 суток и 3 суток. Самый интенсивный биосинтез ксиланаз достигается, когда к двухсуточной культуре ТпсЬос1етпа «гМе 44 подсевают АгрегрИиз Азе^из Е>-73. При этом биосинтез целтолаз сохраа»ется ш193-10№Л актяввости по сравнению с кою ТпсЫхкяоа игк!е44. } . /

Намечена четкая твщенцня : -чем дальше микроорганизмы находятся в контакте друг с другом, тем больше негативное влияние они проявляют на суммарное накопление целтаололйтнчеосих фермента«. Разновременное внесение посевного материала, продуцентов позволило в широких пределах варьировать соотношение-компонентов в мульткэнзнмном комплексе.

Таблица 2.

Актааность целлюлаз и геммицеотолаз при совместном культньмрокахнн к зависимости от очередмосгн н врокни внесения

■ А

поемного материма.

Наименование культуры - Срок подсева Ферментативная активность

КМЦ АФБ КС

ед/ мл % еШ мл % ед/ мл %

ТпсЬойеппа мШе 44 Подсев:А. Гой1()11$ Г-73.- * 30 100 7,5 100 87. 100

Одновременно 15,4 51 4,5 60 306 350

Через 1 сут. 24,8 82,6 72 325 370

Через 2 сут. 30,0 100 7,0 93 480 550

Черз 3 сут. 30,0 100 7,3 97 275 320

АЛоейёизГ)-73 / Подсев: ТлсЬоёеппа Ут<1е 44 Г 6,0 ».о 320

Через 1 сут. 15 50 52 300 340

Через 2 сут. 12^ 41 3,2 42 320 360

Через 3 сут. 12 40 3,2 40 320 360

Этот вариант совместного культивирования имеет преимущество по сравнению с раздельным выращиванием грибов, т.к. за одну ферментацию позволяет получить более активную кулътуральную жидкость, чем давали бы две раздельные - ферментации. Если объединить' равные объемы культуральной жидкости ТпсЬск1егта ут<1е 44 н АзрегрЛиа Гоеи«1и5 [>-73, то ксиланазная активность в смеси состааляет . 0,5*(320+87)=203,5 ед/мл, КМЦазная активность: 0,5*(30+6)=18 ед/мл, активность по АФБ: 0,5*(1+7)=4,25 ед/мл. В то время при совместном культивировании продуцентов в одном _ ферментере мы получали кулътуральную жидкость с ксиланазиой, КМЦэзной, активность по АФБ: 480,30,7 со/мл соответственно.

Диаграмма 2. Имокшк ферментативной активности при совместном культкрожшни ТгкЬо4егтв тейе 4* н Авфврв^ИмЬб^ТЗ.

1- Т. Утс5е 44 на контрольной среде "К1"; 2- А. АоеосЬк 0-73 на среде "А"; 3- Т. \riride 44 + А. Гоеййш 1>-73 (2) на среде "О."

" Кроме того, мы предположили, что мультиэнзимный комплекс, полученный при данном способе засева будет более эффективно гидролизовать нативиую целлюлозу, чем ферментная система ТпсЬоскппа пгк1е 44 и АарегрНш йаеШиз 0-73, как показано далее в разд.2.5, такой подход был вполне оправдан.

На фойе оптимальной питательной среды исследовали влияние условий культивирования на продуктивность биосинтеза ферментов смешанной культурой. Максимальное накопление ферментов наблюдается когда значение рН исходной среды после стерилизации находится в пределах 5,0-5,5 (рис. 2а). В случае, когда температура -процесса хульпширбвання снижает ниже 28" С или превышает более 32е С наблюдается и снижение активности ферментов. Температура 30* С-оптимальная для роста ассоциации культур (рис.26).

РнсЛа. Влияние величин рН питательной среды на биосинтез ферментов ассоциаомй ТпсЬобеппа тюйе 44 и (ойиЬвП-ТЗ

11т

Рнс.26. Влияние температуры культивирование на биосинтез -ферментов ассоциацией ТгкЬо4слпа У1п<1е 44 и АзрегдНж {оейЛю 1>-73

РисА Биосинтез фермента* ассоциацией ТпсЬобеппа *мтйе 44 и ' А^ро^Шш {ое1Иш 1)-73 в зависимости от длительности культивирования

А при испытании процесса совместного культивирования по времени то активный биосинтез целлюлаз и гемицеллюлаз у ассоциации - начинается с 6-ых до 7-ых суток культивирования, что этот фактор совладает с опткмумами длительности культивирования каждой монокультуры (рис.2в). '■■■,' " -

15 Получение прелжрггя МЭК "ЦКГ и изучение эффективное™ сгодейслш

Исследовали динамику гидролиза дативной целлюлозы ферментом системы ТпсЬойепва \ппс1е 44 в ассоциации с А$ро^Ши$ ■ Гоеоёиз Г)-73. Использовали микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) (рис.3), карбоксиметил - целлюлозу (КМЦ) (рис.4) и сервацео (рисД) с концентрациями 10 г/а и 20 г/л . Гидролиз проводится при 40* С, рН 4,5, в течении 36 часов. Использована дозировка ферментов 3 ад. по фильтровальной бумаге на 1г субстрата.

Результаты исследований показали, что МЭК "ЦКГ" , полученный на основе совместного культивирования ТпсЬсккппа * игнк 44 и АзрегрИш Горбив 0^73' во-всех вариантах гидролиза целлюлоз дает самый высокий выход продукта при этом сокращается время гидролиза; гидролиз МКЦ, КМЦ, 10 г/л • время выхода на стационарный уровень >12 часов, гидролиз МКЦ, КМЦ 20 г(л - 18 часов , а гидролиз сервацела • 24 часа. Т.о. благодаря набору ферментов в МЭКе "ЦКГ* позволяет уменьшить время гидролиза натнвной целлюлозы и повысить выход продуктов на 15-50% по сравнению с препаратами из монокультур.

] - препарат из А. (оеп^ Ь-73:3 ед. АФБ; 13 ед. КМЦ; 960 сд. КС 2-препарат из Т. «пйе 44 :3 ед. АФБ; 12 ед. КМЦ; 35 ед. КС 3 - МЭК : 3 ед. АФБ; 12,8 ед. КМЦ; 206 ед. КС

2.6 Разработка способ* очистки ИЦКГ* методом аффинной хроматографии.

Для очистки и концентрирования ферментных растворов сушетвуюг многие методы, такие как вакуум- выпаривание, ультрафильтра цня, осаждение органическими растворителями, аффинная хроматография. И значительный эффект очистки удается при исследовании последнего метода. В литературе имеются примеры применения данного метода для фракционирования целлюлазных комплексов по компонентному составу. Основываясь на различной степени сродства компонентов целлюлазной системе к субстрату нами была проведена очистка методом аффинной хроматографии.

i

I - свекловичный жом; 2 - осиновые опилки; 3 - бумажные отходы

Рис.6. Влияние размера цедлюлозосодержащих субстратов на

(Кр).

Для подбора носителя процессаистюльзовали свекловичный жом, осиновые опилки, бумажные отхсды (рис. б). Видно из рис.6, что все кривые близки друг к другу, при этом коффициент пригодности -критерия оценки сырья этих субстратов практически одинаковы, и средний равен 7*33. Поскольку свекловичный жом

часгичнообработанный ферментным раствором активно интенсифицирует процесс биосинтеза целлюлаз, как компонент питательной среды нами был выбран в качестве носителя процесса аффинной хроматографии свекловичный жом.

Нами проведай аффинная хроматография целлюлаз с помощью буферных растворов - 0,1 М ацетатного на стадии адсорбции ферментов на субстратах н 0,1 М фосфатного буфера на стадии дассорбции ферменте» со субстратов (Мартьянов В.А., 1982) и также осуществлен этот процесс с помощью электрохимической активированной воды (ЭХА-воды) различной величиной рН.

На основе литературных данных процесс адсорбции проводится при температуре 4-10® С, величине рН 4,5-5,0, времени контакта с адсорбентом 10-40 мин. а процесс десорбции осуществлен при 30-40" С , рН 6-7,0,15-20 мин.

Для подготовки носителя к адсорбции, свекловичный жом предварительно замачивается с буфером или ЭХА-водой рН 4,7 в , течении 1 часа. . . ..... ...

Процесс очистки ферментов с участием ЭХА-воды дает значительный эффект по сравнению с традициоиым методом. Степень адсорбции целлюлаз на свекловичном жоме ацетатным буфером составляет 96,1% по КМЦ, 94,5 по АФБ , 92% по КС к 91% по белку, в то время эти величины становятся 95,5,95,94 . 92,6 соответственно, на 1-3 % больше при использовании ЭХА-воды рН 4,7.

При десорбции ферментов элюированием ЭХА-воды рН 7,0 выход активности и белка составляет 87,5 % ,88%, 84,5% и 79,5% соответственно, что на 4-8% выше, чем при десорбции фосфатным буфером.

Особенно получюю 3 фракции ферментов с различной степенью очистки как ло удельной активности так и по сухим веществам. Эффект очистки составлял от 40 до 100 раз.

Соотношение ферментов в каждой фракшш представлены в таб-3.

Та&мшаЗ.

* Очиспса ферментов.

№ фракции Соотношение ферментов

КМЦ АФБ КС

Фракция 1 1.1 ' 1 1.2

Фракция 2 0.87 1 0.87

Фракция 3 0.93 1 0.7

Таким образом , полученный результат аффинной хроматографии целлюлаз на свекловичном жоме с помощью ЭХА-воды подтверждает практическую значимость; метод простой, дешевый, экономически выгоден, экологически чнще, перспективен по выходу активностей и белка,-решает проблему очистки с целью получения высокой чищенных ферментных препаратов,

2.7 Получение мультюизямного комплекса веялюлаз "ЦКГ" и его

Культуральную жидкость, полученную после культивирования ' смешанной культурой ТпсЬоёехта мпёе 44 и АкрегрПиз Гое(Ми$ 1>73 отделяли от биомассы центрифугированием при 6000 об/мин в течении 15 минут. Концентрирование культуральной жидкости осуществляли методом вакуум-выпаривания при температуре греющего пара 60-80° • С , температуре вторичного пара 25-30° С и давлении 0,8 а№ и" методом чультрафидьтрацин с мембраной УАМ-300 до 1/10 первоначальных объемов и до объемов, удобных для последующего процесса.

Концентрат после вакуум-вьтарки осаждали этиловым спиртом.Максимальный выход ферментов и наилучшее формирование осадка были получили при осаждении спиртов 79%, время контакта 15 мин при 0-4*. С. Оптимальная концентрация сухих веществ в растворе ферментов %. При этом выделяется 92% активности по ЛФБ, 90% по КМЦ, 92% по ксиланаэе. После формирования осадка его отделяли центрифугированием при 5000 об/мин, 25 мин Сушку влажного осадка проводили в оптимальном режиме: слой осадка высотой до 4 мм, предварительно замораживали до (-40 *> С), после замораживания сушку осадка проводили при следующих условиях : температура излучателя - 20 С, температура хонденсатора - (-40®С) , среднее давление в вакуумной камере - 20 Па. При этом выход активности высушенного препарата достигается 98-99% от неходкой.

Характеристика высушенного спиргоосажденного целлюлазного комплекса "ЦКГ"

- Выход препарата с 1 мэ культуральнон жидкости - 10,4 кг

- - Содержание белка -130 мг/г -

- Активность по АФБ - 360 ед/г

- Активность по КМЦ -1562 ед/г

- Гемицешполазная активность (хеиланазная) - 23000 ед/г

ШНОЛОГИЗДШЯ ОШ ПОЛУЧЕНИЯ НУЛЬТИЭНЗНННОГО ЦШОЯАЭНОКСИЛАНАЭВОГЛВКАНАЭНОГО КОМПЛЕКСА -ЦК!*" ПО*

l.ftserrco дм cMKMwtera тт. 2. Рмпср дм оояиоМ «мухи. 3. Реактор дм пмцммг omflefti СКЗяУ т юмйомго чхнв, 8. йваяв» m гатгапной qww, в,9. Ощимаацюмим миомя, 7,10.- Вцшмвп» ^n.TtewoJ«»«, .12.13.ltooe*«v апцмтн, Н.вчишир, l&.Càpm дая доикшыай «вдкости. 1в.&имр -цмоо KWH, 17.0öcpe« дм Swvrpe«, 18.В«ууи-в«р»ая успнмша, lB.CÖcpw« дня жж*жтр«та, ао.Уоте-няшв дм 'осепщаюм фрюпсв атаманам, Й.Свирвтер, 22. ВавднедеяькА anafe'

Выводы,

м

1. Проведен скрининг микроорганизмов • активных продуцентов ксиланаз и цешполаз . Исследованы совместимости различных продуцентов цешполаз и гемицсллюлаз на твердой агаризованной среде. Проведены совместимости неосодьсхих культур; Trichoderma viride 44, Trichoderma tongibrachiamm 7-26, Aspergillus foetidus D-73 на твердой агаризованной среде. Исследована возможность их сосуществования. Установлена роль очередности н момента внесения культур на совместимости двух и трех культур. Выделены возможные варианты смешанной культуры в которых микроорганизмы благоприятно сосуществуют.

2. Разработаны условия глубинного культивирования микроскопического гриба Aspergillus foetidus D-73 для направленного биосинтеза ферментов целлюлазно-гсмицеллюлазного комплекса.

- Исследовано влияние состава 'питательной среды на биосинтез цедлюлаз, гемипешполаз у Aspergillus foetidus D-73. Отмечено, что биосинтез ксиланаз и цешполаз повышается при использовании в питательной среде свекловичного жома, пшеничных отрубей и овсяной шелухи.

- Показано, что биосинтез ферментов повышается значительно при внесении в питательную среду КН2ГО4 . Установлено влияние глюкозы , ксилозы, лактозы на биосинтез ксиланаз у гриба. Установлено, что при добавке глюкозы в среде не более' 0,3 % активность ксиланаз и целлюлаз повышется.

• Оптимизирован состав питательной среды для глубинного культивирования гриба Aspergillus foetidus D-73 с целью биосинтеза ксиланаз и цешполаз. Определены оптимальные условия '

культивирования Aspergillus foetidus D-73 с целью биосинтеза ксиланаз и цедлкшаз.

3. Проведено совместное культивирование Tndioderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73 , с целью биосинтеза пеллюлаз и гемицеллюлаз.

• Оптимизирована питательная среда для совместного культивирования Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus D-73 с целью биосинтеза цеплюлаз и гемицеллюлаз, позволяющая увеличить активность кенгоназ в 1,5-5,5 раза.

Разработаны оптимальные параметры совместного культивирования. Установлено, что время и очередности внесения посевного материала оказывают существенное влияние на соотношение компонентов целлголазно-гемнцешволазного комплекса.

4. Изучена динамика гидролиза МКЦ, КМЦ и .сервацела под действием полиферментных систем. Показано, что использование мультиэнзнмного комплекса,. полученного совместным культивированием продуцентов, ' позволяет значительно интенсифицировать конверсию целлюлозы в различных процессах и увеличить концентрацию продукта гидролиза на 15-50%.

5. Разработан способ очиспси ферментного комплекса аффинной хроматографией пешпопаз на свекловичном жоме с помощью ЭХА-

воды. Выделены активные фракции ферментов для получения

i

высокоактивного, высокоочищенного мультиэнзнмного комплекса.

6. Разработана технологическая схема получения МЭК "ЦКГ* разной степени очистки.

7. Ожидаемый экономический эффект от применения МЭК "ЦКГ" для получения экстрактов хмеля в пивоваренной промышяенносги в -расчете на 1 млн. дал . пива составил* 85,5 млн .руб. Экономический

»

эффект основан на снижении количества хмеля при применении ферментированного экстракта.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Буй Тхи Тху Ха, Гериет М.В. Микроскопическое исследование совместимости различных продуцентов целлюлаз и гемицедлюлаз.-М.,1993,-9с.-Деп. в ЦН И ИТЭИттнщепрома.2! дек. 1993 N25« (28).

2. Буй Тхи Тху Ха, Гериет МЗ. Разработка условий глубинного культивирования гриб АзретрПих Гоеис1ш 15-73 для биосинтеза ферментов целлкшаэно-гемнцеяшапазного коштоекса.-М.,1993,-6с.-Деп. в ЦНИИТЭИпищепрома.21 дек.1993,К 2544(26).

3. Буй Тхи Тху Ха, Гериет М.В. Разработка технологии мультиэнзимной композиции для биоконверсии растительного сырья на основе совместного культивирования микроскопических грибов -М., 1993,-9с.-Дел. в ЦНИИТЭИпищепрома.21 дек.1993,Ы 2545(27).

4. Буй Тхи Тху Ха, Теряет МЗ. Разработка мультнэнзнмных композиций для биоконверсии целлюлоэосодержащего сырья. В кн.: Тездокл. Республиканская научно-техническая конференция Проблемы энергетики тешютсхнологин в отраслях АПК, перерабатывающих растительное сырье.М. 1994.с. 10-И.

5. Буй Тхя Тху Ха, Гериет М.В. Сравнительная оценка деградации целлюлозы под действием комплексов целлюлолитических ферментов. Биотехнология и управление,вып^ 1,1995, с.39-41.

6. Буй Тхи Тху Ха, Гериет М.В. Аффинная хроматография целлюлаз на целлюлозе. Научно-технический инф. сборник.Отечлауч. произв. опыт, рекомендуемый дня внедрения на предприятиях отраслей, достижение зарубежной науки и техники. Винодельческая пнвобезалкогольная, спиртовая .лнкероводочная и дрожжевая промышленность. Вып. 2,1995, АгроНИИТЭИПП. ---""

Подписан» к печати " УР_1995года.

Отпечатано па ротапринте в Формат бумаги 35*42/4 Производственном комбинате Объем ¿^ пл.

Лнгертгурного фонда Зах. Тир. 100

ух Усиевича, д. 8-а' - Тел. 152-17-71