автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии молочного фибронектина и его использование в биотехнологии клеточных культур

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ЮСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

п г •.

I I

•л На правах рукописи

1 Ь ЬаН Гс!ЬЭ

Федотова Алла Васильевна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МОЛОЧНОГО ФИБРОНЕКТИНА И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных и рыбных продуктов

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва 1993

Работа выполнена на кафедра биохимии .пищевой химии и технологии ВМС Московской ордена Трудового Красного Знамени Государственной Академии прикладной биотехнологии .

Научный руководитель -действительный член АЕН РФ,

доктор химических наук, профессор РОЗАНЦЕВ Э.Г.

Научный консультант - кандидат технических наук,

старший научный сотрудник СНЕЖО А.Г.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор ТИХОМИРОВА A.C.

- кандидат технических наук, доцент 1ИНЯК0В В.Г.

Ведущеэ предприятие - Сибирский научно-исследователь

ский и проектно-технологически институт переработки сельскохозяйственной продукции.

Защита дисертации состоится_ _ 1993г в часов

на заседании специализированного совета К 063.46.01 Московской ордена Трудового Красного Знамени Государственной Академии прикладной биотехнологии по адресу: I09818 Москва, ул. Талалихина, 33.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Академии.

Автореферат разослан 1993 года.

Ученый секретарь специализированного Совета, к.т.н.,доцент

А.Г. ЗАБАШТА

РЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из задач молочной отрасли являете? азработка эффективных безотходных технологий переработки молочного ьтрья. Перспективным направд 'ием. применения нетрадиционного и вто-ичного молочного сырья является биотехнология клеток млекспитаю-их. Использование составных частей молока при конструировании пи-ательных сред для выращивание клеток тканевых культур поставило еред исследователями задачу разработки новых перспективных техно-огий выделения биологически активных веществ из молочного сырья, аиболее богатым источником биологически активных веществ является ак называемое первое молоко - молозиво, которое не используется технологии молочных продуктов. Промышленное животноводство, при отором в хозяйствах концентрируется большое поголовье коров,про-сходят круглогодовые отелы, а также наличие низкотемпературных ефрижераторов, позволяют получать и стабилизировать глубоким за-ораживанием значительное количество молозива. Таким образом, соз-ались необходимые условия по целенаправленному исследованию, про-лшленной разработке и испытанию биологических препаратов из моло-ява, к числу которых относится фибронектин - димерный гликопроте-1 - фактор клеточной адгезии, присутствующий во всех биологичес-лх жидкостях организма к.,0?г1епК. 1576/. Важность исследо-

аний по выделению фибронектина из молозива по сравнению с плазмой зови обусловлена тем, что молезиво имеет высокое содержание имму-зглобулинов и, в связи с этим, достаточно высокую бактерицидную <тивность. Б молозиве и молоке отсутствуют такие опасные вирусы ак Альнгеймера, гепатита В и др., что несомненно важно для гаран-'.й от загрязнения готового препарата и дальнейшего его использо-шия в биотехнологии клеточных культур.

К началу наших исследований данные по содержанию фибронектина молочном сырье были единичными / Лй^/С.оЛ 19Ы/, а по вы-;лению его из сыворотки молозива и последующему использованию от-'тствовали.

Целью данного исследования является:

Разработка технологии фибронектина из молозива (МФО, выявление :ловий его иммобилизации на полимерной матрице и культивирование :еток животных с использованием МФн и гидролизата сывороточных !ЛКов молока /ГСБМ/.

В соответствие с поставленной целью решались следующие основные дачи:

- определение параметров процесса выделения МФн, изучение его физико-химических и функциональных свойств;

- разработка технологической схемы и регламента на получение МФн;

- определение эффективных условий реализации Зункцио-нальных свойств М®н;

- изучение возможности применения МЗн в биотехнологии клеточных кул тур.

Научная новизна. Определена возможность использования молозива в качестве нового сырья для получения фибронектина - фактора адгезии клеток тканевых культур. Научно обоснованы и определены параметры ввделения белка из сыворотки молозива. Установлена зависимость выхода М<!н от температуры, рН процесса выделения, типа и емкости сорбента. Показана зависимость содержания фибронектина в молози ве от периода лактации; наибольшее количество МЗу содержится в моло зиве первого дня лактации. Получены данные об основных свойствах молочного фибронектина. Показано влияние концентрации М$н на его функцию как фактора адгезии клеток животных. Выявлена эффективность действия М?н, иммобилизованного на полимерной матрице, как фактора адгезии клеток.

Практическая значимость работы. На основании проведенных экспериментальных исследований разработана технология получения фибронек на из молозива, которая отражена в технологическом регламенте на по лучение препарата "Фибронектин молочный для научно-исследовательских и биотехнологических целей" /согласовано с Сибирским научно-исследовательским и проектно-технологическим институтом переработки сельскохозяйственной продукции РАСХН/. Полученный Жн прошел испыта ния в качестве фактора адгезии на первичных и перевиваемых линиях клеток животных /Акт испытаний М®н от 12.02.62; справка об использовании результатов научно-изыскательской работы по применению ППС для культивирования клеток животных модифицированного Ж«, выданная Всесоюзным институтом экспериментальной ветеринарии от 21.02.92 г.; акт о внедрении М5н в составе питательных сред и в качестве субстратов для иммобилизации клеток печени животных, утвержденный Центральным научно-исследовательским институтом гастроэнтерологии/

Разработаны рекомендации по составу и режимам получения ППС для иммобилизации М^н и культивирования клеток млекопитающих, а также предложены способы использования в методах клеточных нультур. Определена возможность использования ППС-М'Тн в качестве носителя для иммобилизации клеток печени животных и показана способность ППС № обеспечивать нормальный рост клеток ЩС и СПЭВ в отечественных

средах на основе ГСЕМ,содержащих 1% сыворотки крови.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на:

- Третьем Всесоюзном Совещании "Культивирование клеток животных и человека" /Пущино, 1990/;

- Всесоюзной научно-технической конференции "Итоги и перспективы использования природных и синтетических высокомолекулярных соединений в производстве пищи" /Суздаль, 1591 г./;

- Всесоюзной конференции "Химические превращения пищевых полимеров" Аветлогорск, 1991 г./;

- УШ Всесоюзной научно-технической конференции "Синтетические латек-сы, их применение и модифицирование" /Воронеж, 1551 г./.

Публикации. По теме диссертации опубликовано шесть работ.

Структура работы и ее объем. Диссертация состоит из Еведения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы. /£Л •

Работа содержит: страниц машинописного текста, 2?, таблиц, 23 рисунков, О приложений.

Объекты и методы исследований. Экспериментальные исследования выполняли в ПНИЛГМиПП Московской Государственной Академии прикладной биотехнологииув лаборатории биотехнологии клеточных культур и технологии питательных сред Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии /ВИЭВ/, в лаборатории интенсивной печеночной терапии Цен1ральнсго научно-исследовательского института гастроэнтерологии /цНИИГ/.

Объектами исследований служили: молозиво и молоко крупного рогатого скота первого месяца лактации. При разработке полимерного пленочного субстрата использовали латексный пленкообразователь пищевой марки - ВХБД-65"В", представляющий собой водную дисперсию жесткопеп-ного сополимера винилиденхлорида с винилхлоридом, стабилизированную эмульгатоиом. алкилмоносульфонатом натрия /Е-30/ в концентрации 1,0-1,4 мас.5о. В качестве модифицирующих добавок служили: медицинский поливинилпирролидон /ПВП/ с молекулярной массой М= 12500, /МРТУ 42392Ь—71/; желатина /ТУ 64-7224-83/. В работе использовали первичные и перевиваемые линии клеток животных. Первичные линии клеток выделяли из кишечника эмбриона свиньи /КЭС/; те&тикул ягненка ДЯ/; сердца ягненка /СЯ/; печени свиньи /ПС/; печени щенка собаки /ПцС/. Перевиваемые линии клеток - почки плода свиньи /СПЗВ/; почки теленка /ПТ-60/; трахеи эмбриона коровы /ТК/; щитовидной железы свиньи /1ДС/; мышиных фибробластов /УЩ-ЗТЗ/. Первичные культуры клеток готовили в лаборатории биотехнологии клеточных культур

и технологии питательных сред Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии /ВИЭБ/ и лаборатории интенсивной печеночной терапии центрального института гастроэтерологии. Перевиваемые клеточные культуры были получены из коллекции клеточных культур ВИЭВ. Культивирование проводили с использованием питательных сред и растворов: 0,Е$ гидрояиэата сывороточных белков молока на растворе Хенкса /ГСЕМ/, среды Игла и 199, сыворотки крови телят. Фибронектин /М?н/ выделяли методом аффинной хроматографии из сыворотки молозива, после отделения жировой фракции центрифугированием, казеина - кислотным методом коагуляции. Очистку проводили диализом против бидис-тиллированной воды, фосфатного буфера рН 7,4 , 4 °С, концентрировали МЗн сульфатом аммония, обессоливали гель - фильтрацией на сефа-дексе G -25.

Количество М5н определяли спектрофотометрически при 230 ям на приборе " Spekot-cL M 400" и с помощью реакции пассивной гемаг-глютинации на желатинизированных эритроцитах; аминокислотный состав MÎH - на аминокислотном анализаторе „ BCoit-c/ii/f ¿С~5000 /?РГ/;молекулярную массу, электрсфоретическую чистоту и подвижность М?н - методом электрофореза в полиакриламидном геле с 0,1% ДСН по Леммли. Изоэлектрическую точку /ИЭТ/ МФн определяли методом изоэлектрического фокусирования /ИЭ?/ с использованием амфолита-носителя с диапазоном рН 3,8-8,9 фирмы ¿КБ /Швеция/ на приборе фирмы LYSi-PtodocUb, функциональную активность М<*н определяли по гепаринсвязывающему компоненту на гепарин-сефарозе 6В фирмы .¿'¿дта /США/; по реакции пассивной гемагглютинации на желатинизированных эритроцитах /Овчарук И. Я. и др. 1990/; по адгезивной активности клеток, которая определялась по количеству прикрепившихся клеток на поверхность субстрата /Дьяконов Л.П. и др., 1986/. Пролифератив-ную активность клеток оценивали по индексу пролиферации /Дьяконов Л.П. и др., 1986/. Степень чувствительности культур к вирусам по методу Knedi .,-МцелсАН{ 1938). Цитологические исследования проводили согласно методикам, описанным Дьконовым Л.П. и др. /IS86, 1988 г.г./. Математическую обработку экспериментальных данных осуществляли с помощью методов математической статистики и с применением ЭЕМ "Искра-1030".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка технологии фибронектина из молозива /М3н/ и изучение его показателей качества.

Первая задача исследований состояла в рассмотрении и обосновании технологических параметров процесса выделения молочного фибро-нектина из молочной сыворотки, полученной из молозива, обеспечивающих максимальное извлечение белка и исходного сырья. Выделение 1.1 *н проводили методом адсорбционной аффинной хроматографии, основные стадии которой-адсорбция и элюшя. Принцип адсорбции основан на том, что выделяемый белок обладает биоспешфическим сродством к лиганду, иммобилизованному на твердом носителе. Нами исследовались ряд аффинных сорбентов,полученных путем синтеза различных матриц-носителей во Всесоюзном институте экспериментальной ветеринарии, институте биоорганической химии, сорбенты фирмы " ¿¿р.ъл " (СМ) (табл. I). Лигандом служила желатина, так как молекула фибронекти-на имеет специфический центр связывания с желатиной.

Таблица I

Влияние типа сорбента на выход и биологическую активность М<*н

Тип сорбента ! Адсорбционная ! мг/мл ! | | емкость! мкмоль/' л ! Выход ,ЛГн : 1° ! I I ! БиологичеС' ! кая актив! ность, %

КСК-нелатина 2,0+0,Ь 4,5 95 70

гИПС-желатина 1,2+0,2 2,7 95 75

Сефароза-желатина 1,0+0,2 2,3 92 63

<итозан-желатина 0,5+0,3 1,1 44 30

Агаооза-желатина 1,0+0,2 2,3 90 45

Акриламид-желатина 0,5+0,1 1,1 75 60

В качестве сорбента для аффинной сорбции МЗн нами был выбран НМПС-желатина, так как другие типы сорбентов уступали выбранному то выходу целевого продукта, более низкой активности полученного трепарата после завершающих стадий очистки белка. Б связи с тем, тго молекула фибронектша связана биоспецифически с лигандом-же-1атиной, а в жестких условиях происходит денатурация исследуемого зелка, были выбраны в качестве элюентов растворы мочевины "Реахим ЗССР" и гуанидина-ЧС1 "б'С^та." /СНА/ в линейном градиенте возрастающей концентрации 0,3-М. Наиболее эффективными концентрациями ючевины являются 4.4 на трис-:-ГС1 буферной основе с рН-7,4 или на фосфатном буфере.

Емкость сорбента - один из ведущих технологических параметров

при разделении белков. Еыла исследована емкость КЛПС-жеяатины при внесении в колонку разного объема М?н с известной концентрацией. При увеличении объема вносимого образца почти вдвое от первоначального не наблюдается изменения количества задерживаемого на матрице белка-, это означало, что все свободные места лиганда занята и молекул фибронектина проходят через сорбент не связываясь. Емкость ШПС-желатины составила 2,8 + 0,15 мкмоль/мл сорбента,

Для получения ¡Л^н необходим оптимальный объем сырья для наибольшего извлечения целевого продукта. При этом большую роль играет соотношение объемов сыворотки и сорбента. Аффинная хроматография показала, что оптимальным соотношением для эффективного извлечения препарата является' соотношение образец - объем сорбента не менее 3:1. Значительное влияние на многие биоспеиифические взаимодействия оказывает рЯ и температура процесс** адсорбции. Дня оптимизации разделения белков была изучена рН и температурная зависимость связывания М'Гн с лигандом-желатиной /рис. I/. Как следует из полу-

ченных данных, рН 7-Б и температура 5-15 му связыванию М^н с лигандом.

С способствует наилучше-

100

. 80

60

к

ей

6;

£С О

с> р«

о

О

ч7 ч

\ \ ч

\

А \ л [\

«—О \ ■ - 1

10 _I_

II

12

10

1Ь

¿0

4А

РН

ть

Рис. I. Влияние рН и температуры на связывание М5н с КМПС-желатиной/ О -рН, температура /.

Следующим этапом наших исследований было определение влияния времени лактации на содержание М<Тн в сырье. Определение содержания белка п сыворотке проводили после выделения методом аффинной хроматографии на приборе " 400" /Германия/ и реакцией пассивной гемагглютинаиии на желатинизированных эритроцитах. Данные обеих методов коррелируют между собой /рис. 2/. В результате было показано, что наибольшее содержание в первом удое - 75+12 мг/л сыворотки. Уже к двадцатому дню лактации количество МТн составляло 6+5 мг/л. Среднее содержание М<*н первого месяца лактации составило - 40,1+28,4 мг/л /рис.2 /. В соответствие с полученными данными можно заключить следующее: препаративное количество М®н содержится в молозиве и молоке до десятого дня лактации.

В результате проведенных исследований определены параметры выделения Й^н из сыворотки молозива /табл. 2/.

Таблица 2

Параметры процесса выделения молочного фибронектина

_Параметр_

Тип сорбента Элюэнт

Температура, °С рН

Соотношение образец-Дербент Емкость сорбента, мкмоль/мл Период сбора сырья

! Определяемая величина_

КМПС-желатина

4М мочевина на фосфатном буфере

3-15

7-8

3:1

2,8+0,15

первые 10 дней лактации

Далее были изучены показатели качества МЗн, которые включали определение физико-химических и функциональных свойств белка /табл. 3/.

Таблица 3

Физико-химические и функциональные свойства М?н Свойства !&{ ! Показатели

1. Молекулярная масса, кД(субъединицы) 220-230

2. Электрофооетическая чистота по результатам

оценки в Ъ% ПААГе, % 96

3. Коэффициент молярной экстинкции Ег^онм 1,2В

■г",сут.

Рис,2.Зависимость содержания Мйн в сыворотке молозива от периода лактации.

«

о X

а ю к с о о.

съ» о * т ь; Е< О о н о о з- ч к к

100

75

50

кй

' (г X \ < \

V- ч>

10

12

:фн,МКГ/Ш1

Рис.3„Влияние концентрации фибронектинов на прикрепление клеток линии //хИ-оТЗ.

- йибронектик молочный; 0 - тибронектин плазны крови:

9

Рис. 4. СХЕМ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА

производства г.юлочного ¿ибронектина

сбор ыолозива

охлаждение

[ хранение

| отделение ¿¡ИРОВОЛ фракции ]

титрование

| осаддение казеина

восстановление

разделение белков сыворотки афмкно,! • адсорбционной хролатографиел 1

0т;.шка слабосвязанньк белков

Продолжение таблицы 3

I ! 2

4. Изоэлектрическая точка, рН 5. Гепаринсвязнвающий компонент по результатам аффинной хроматографии на гепарин-сефарсзе, % о. Титр в реакции пассивной гемагглютинапии с келатинйзкрованными эритроцитами 5,6-6,4 70 ' 1:32

При изучении эффективности действия ..^н и фибронектина плазмы крови как факторов адгезии клеток было показано, что действие лГн идентично фибронектину плазмы крови/рис. 3/ и зависит от концентрации белка. Сба они обеспечивают прикрепление 70 % клеток тестовой культуры ЛТ1-ЗТЗ. Таким образом, разработанные решения использованы при создании технологи1/' молочного фибронектина, отражены б технологическом регламенте, и представлены схематическом виде на рис.<

Спределение эффективных условий реализации функциональных свойств .VI"н

Известно, что фибрснектин является одним из компонентов сыворотки, обеспечивающих прикрепление и распластывание клеток при культивировании ин вктро. По данным многих исследователей / ¿'/-и'е/-А'. е{.а?г?$Р9;Па.-11их119$с/ лучшая адгезия клеток обеспечивается при наличии фибронектина на поверхности субстрата, поскольку находясь в составе среды, он конкурирует за адсорбшю на поверхности субстпата с белками сыворотки крови, добавляемой в питательную среду Иеи.1^- <*ибронектин в силу своей поли-

функииональности связывается с различными субстратами, а клетки прикрепляются к нему, с помощью специальных фибронектиновьгх рецептеров, находящихся на их поверхности, то есть он опосредует связь клетка-субстрат. При осуществлении этого взаимодействия большую роль играет природа субстрата. Поэтому для изучения функциональных

Ьвойств полученного '¿'"н как фактора адгезии, следующим этапом наших исследований была разработка состава полимерного пленочного субстрата-носителя /ППС/ для иммобилизации на основании совмещения природных и синтетических высокомолекулярных соединений. И качестве синтетической основы ППС были использованы полимерные пленкообразователи-латексы различных марок, определены их коллоидно-химические характеристики и рассмотрена способность прикреплять клетки животных на примере перевиваемой линии ПТ-ЬЭ. В результате оказалось, что наилучшей способностью прикреплять клетки обладают пленки на основе водной дисперсии винилиденхлорида, модифицированного поливинилпирролидоном /БХВД-65В-ПЕП/. а качестве природного компонента была использована желатина, это обусловлено ее способностью стимулировать адгезию клеток и служить лигандом.для иммобилизации фибронектина. Действие желатины в составе композиции связано с модифицирующим влиянием на агрегативную устойчивость латексов, их пленкообразующую способность, эксплуатационные характеристики пленок. Б связи с этим, методом адсорбционного анализа» был изучен механизм взаимодействия желатины в латексной системе и определено её количество, способное адсорбционно взаимодействовать в латексной системе с поливинилпирролидоном, образовывать монолитные шенки,последнее составило 0,2 мас/о к полимерной фазе. На основании проведенных исследований были разработаны и утверждены "Рекомендации по составу и режимам получения пленочных суббтра-тов". ППС прошел испытания по способности обеспечивать пролиферацию первичных клеток /ЮС, ТЯ, СЯ/ и перевиваемых линий /СПЭВ, ТР, ПТ-60, 11С/£ применяемых при культивировании вирусов с целью производства вирусных вашин. Культивирование клеток проводили в среде на основе гидролизатов сывороточных белков молока и 199 среде с добавлением 10 % сыворотки крови, в качестве контроля использовали традиционные субстраты-стекло и пластик.

Первичные культуры клеток при выращивании на ППС по скорости роста и накоплению клеток не уступали аналогичным показателям контрольных клеток, что свидетельствует об отсутствии цитотоксичности субстрата. При культивировании перевиваемых линий наблюдали рост-стимулирующую способность ППС /рис. 5/ . Прирост клеток на ППС зоставил 25-30 %, время образования монослоя сокращалось на сутки, время жизнеспособности клеточного монослоя без дегенеративных изменений увеличивалось на 4-5 суток. Таким образом, нами показа-т возможность и эффективность использования разработанного ППС 5ля наращивания клеточной биомассы.

1,4 -

к о

£ 1,3

к

л 1,2 Ей >=;

о о г ОР.1,1

8 а:

но т „ 1,0

• Е-> Ж о

контроль

спэв

Ж

щс

линия ПТ-80 клеток

Рис. 5. Влияние ППС на относительный прирост клеток перевиваемых линий.

Далее были проведены исследования с целью определения параметров иммобилизации МЯн на поверхность ППС и выявления оптимальных концентраций М?н, обеспечивающих прикрепление клеток. Самый простой способ иммобилизации биополимеров - это адсорбция на нерастворимом носителе. При установлении равновесия в системе количество адсорбированного вещества в поверхностном слое находится в определенной зависимости от концентрации и температуры. Б связи с этим, нами изучен процесс адсорбши М-Тн на поверхность ППС из раствора в зависимости от его концентрации при температуре 22 °С и температуре эксплуатации субстрата - 37 °С. Определение количества адсорбированного М*н на поверхность ППС проводили по изменению концентрации раствора в течение 1,5 ч. Зависимость количества ^^адсорбированного на поверхность ППС,от концентрации раствора при 22 °С описывается выражением:

у = 21,03 х/ (44,02 + х); ^у = 0,995 X - концентрация МФн в растворе, мг/мл;

У - количество ЬЙн, адсорбированного на единицу площади ППС, мг/см^. При повышении температуры процесса до 37 °С количество адсорбирован-

ного возрастает почти в два раза и зависимость приобретает вид:

у = 40,01 х/ (50,27 + х); = 0,996

Вместе с тем, при изучении динамики адсорбции в зависимости от температуры равновесие наступало при 37 °С в течение 1,5 часов и данная зависимость выражалась уравнением:

у = 16,06 х/ (0,15 + х); ^ = 0,99В

где X - время, час;

У - количество адсорбированного вещества на единицу поверхности ПЛС;

при 22°С - в течение двух часов и зависимость имела следующий вид: у = 12,05 х/ (0,4Ь + х); ¡г_, = 0,999

лу

^бронектин кроме фактора адгезии также.выступает в роли регулятора адгезии, последнее обусловлено его количественны!.'! содержанием в системе культивирования. Поэтому необходимо определить его концентрацию, определяющую максимум прикрепления клеток. Эту зависимость рассматривали на перевиваемых линиях СПЭВ и ЛЭК. Опыты проводили в среде на основе 0,5 % гидролизата сывороточных белков мо-иока в отсутствие сыворотки крови, чтобы исключить влияние содержащихся в ней адгезивных факторов на прикрепление клеток. Было зтмечено, что зависимость прикрепления клеток от коцентрации вно-;имого Жн носит экстремальный характер. Изменение выявленной для саждой отдельной линии оптимальной концентрации как в сторону 'меньшения., так в сторону увеличения приводило к снижению количест-¡енного проявления стимулирующего эффекта. Оптимальное содержание ['>1, обеспечивающее эффективное прикрепление клеток-СПЭВ, состави-:о 10-20 мкг/см^ поверхности субстрата, для ЛЭК 5-10 мкг/см^, а аоте функция М?н как фактора адгезии инактивируется при концент-аиии свыше 30-50 мкг/см^. На основании проведенных исследований ыли разработаны способы использования лКн в методах клеточных ультур.

Применение л13н в биотехнологии клеточных культур

Нами рассмотрены два варианта возможного практического приме-гния л!Сн и ППС-М?н в биотехнологии клеточных культур: культивиро-шие перевиваемых линий клеток в отечественной гидролизатной сре-

о

CD

и <0 ¡J

s

g

80

<0 ft

к

a X 5= В в

1 60 о,

V К

40

20

¡Л

к 4 [\

о к \

0

10

15

20

WISH

, мкг/сг/"

Рис. б Влияние концентрации МФн на прикрепление

клеток перевиваемых линий ЛЗК /О/ и СП® /А /.

де /0,5% ГСБМ/ с кизкиш концентрациями сыворотки крови и в качестве носителя для иммобилизации первичных клеток печени животных.

При культивировании клеток ин витро , с целью получения биологически активных Ееществ клеточного происхождения .одним из главных требований к питательной среде является уменьшение или, по-возможности »полное исключение содержания в ней сыворотки крови, белки которой затрудняют очистку клеточных метаболитов; а также ока может служить источником вирусов, присутствующих в крови животного. В связи с этим »были прогедены исследования по определению возможности культивирования на ШС-Шн клетокСПЗЗи Щу в отечественной среде на основе 0,5 % гидрэлизата сывороточных белков молока со снижением содержания сыворотки с до Ь». Представленные в табл.' данные свидетельствуют , что в среде .содержащей 2 и I сыворотки крови , при посадочной концентрации 100-120 тыс. кл/ыл на четвертые сутки образуется плотный монослой, который сохраняется 7-9 суток без смены среды- Отмечено, что клетки имеют полигональную форму с четко выраженными границами .признаков цитопатологии не наблю' далось .В контрольном варианте в среде, содержащей 2 и1 ^ сыворотю крови,монослой не образуется. Идентичную картину наблюдали и при культивировании клеток СП2В.

Таблица 4

Влияние концентрации сыворотки крови на ростовые свойства клеток щС в среде на основе ГСШ

Наименование пробы ¡Содержание !Ьремя формиро-!сыворотки крови!вания монослоя, 'телят, % !сут. ¡Индекс пролифёра-, !ции

контроль** 10 3-4 3,2+0,5

опыт* 3 з,е+о,4

контроль 7 3-4 3,1+0,2

опыт 3 3,5+0,3

контроль 5 4 3,0+0,2

опыт 3-4 3,Ь+0,1

контроль О не образуется -

опыт 3-4 3,1+0,4

контроль I не образуется -

опыт 4 3,0+0,3

кк - выращивание клеток на ППС; * - - -на ППС-Л?н:

/посадочная концентрация 120 тыс. кл/мл/.

Нами были проведены исследования с целью определения возможности иммобилизации на разработанный клеток печени свиньи и щенка собаки. Степень функциональной активности ППС-:Л^н оценивали по количеству прикрепившихся клеток,'^. В качестве контроля использовали количество прикрепизигихся клеток к ППС, пластику, а также рассматривали функциональную активность М^н в составе питательной среды.

Полученные данные свидетельствуют, что ¡л^н,иммобилизованный на НПО.способствует адгезии клеток печени свиньи, в то время как на стекле и пласуике, так и на ППС в отсутствие ¡ЛТн уже через 24 часа происходит отторжение клеток . Прикрепление клеток печени щенка собаки более эффективно /на 4Б %/ на поверхности ППС-.\'^н по сравнению с введением МсГн в среду культивирования ,

Таким образом, полученные результаты показывают, что использование Жн в среде и иммобилизованного на поверхность субстрата может привести к значительному снижению доли сыворотки крови, в частности, использование ППС-М*н и среды на основе 0,5 % гидролизата сывороточных белков молока способствует снижению сыворотки крови в среде культивирования с 10 % до I % при культивировании клеток 15

СПЭВ и ЩС. В то же время ППС-МФн может применятся в качества носителя для иммобилизации клеток печени животных. По результатам исследований получены акты испытаний МФн и акты о внедрении результатов.

ВЫВОДЫ

1. На основании экспериментальных исследований разработана технология фибронектина из молозива коров , в основу которой положена аффинная хроматография белков.

2. Максимальное извлечение фибронектина из молочного сырья обеспечивается использованием сорбента КМПС-желатины, элгаента 4Ммочевины на 0,02 М ФСБР и соотношением образец-сорбент 3:1. Установлена зависимость выхода МФн от температуры и рН процесса выделения белка.

3. Определена зависимость содержания ЫФн в сырье от периода лактации и установлено, что наибольшее количество МФн содержится в молозиве первого удоя.

4. Изучены физико-химические и функциональные характеристики МФн

и установлена их идентичность свойствам фибронектина плазмы крови.

5. Разработан состав полимерного пленочного субстрата (ППС)-носи-теля для иммобилизации МФн и проведены испытания его способности обеспечивать эффективную пролиферацию первичных и перевиваемых клеток животных.

6. Определены параметры иммобилизации МФн на поверхность ППС и разработана методика создания системы ППС-МФн.

7. Показано влияние концентрации МФн на его функцию как фактора адгезии клеток . Оптимальная концентрация МФн, обеспечивающая прикрепление перевиваемых линий клеток СПЭВ и ЛЭК .составляет 5-20 мкг/см^ поверхности субстрата.

8. Определена возможность использования ППС-МФн в качестве носителя для иммобилизации клеток печени животных и показана способность ППС-МФн обеспечивать нормальный рост клеток линии ЩС и СПЭВ в среде на основе 0,5% гидролизата сывороточных белков молока со снижением концентрации сыворотки крови с 10% до 1%.

9. Разработан технологический регламент на получение молочного фибронектина и рекомендации по составу и режимам получения ППС для иммобилизации и культивирования клеток млекопитающих. Ожидаемый экономический эффект от применения ППС-МФн в методах клеточных культур составил 5481 руб. на 1м2 субстрата (по ценам 1992г).

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Федотова А.В.,ДьяконовЛ.П.,РозанцевЭ.Г.,СнегноА.Г.,ФадотовА.В., Строкина Г.Ы.. Адгезивные свойства модифицированных коллагеном и фибронектином латексных подложек для культивирования клеток. // Тезисы доклада III Всесоюзного совещания * Культивирование клеток животных и человека П.-М.,1990,-0.143.

2. Снежко А.Г. .Белавкина Н.С. .Федотова A.B.. Проблемы создания и использования систем на основе био-и синтетических полимеров для биотехнологических процессов // Тезисы доклада Всесоюзной научно-технической конференции " Итоги и перспектива использования природных и синтетических высокомолекулярных соединений в производстве пищи",- М.,I99I-C.I58.

3. Федотов A.B..Дьяконов Л.П., Федотова A.B.,Строкина Г.М. .Сравнительная характеристика фибронектинов животных . Физико-химические и биологические свойства.// Вестник АМН CCCP.-I99I.JP2,

-С.42-44.

4. Федотова A.B., СнежкоА.Г. Федотов A.B. Дьяконов Л.П.,Белавкин на Н.С., Розанцев Э.Г..Культивирование клеток млекопитающих на биологически активном полимерном пленочном субстрате. //Биотехнология.- 1992, №4.-С. 15-17.

5.Федотова А«В.,Бондаренко С.Я.,Федотов А.В.,Токаев И.С..Ферментативный гидролиз фибронектина на иммобилизованной папаин-сефарозе-4В //Тезисы доклада Всесоюзной конференции "Химичесг кие превращения пищевых полимеров".-Калининград,1991,-С

3. Снежко А.Г., Федотова A.B., Розанцев Э.Г. Модификация латексов комплексами поли-У-лактам-белок.// Тезисы докладов УШ Всесоюзной научно-технической конференции " Синтетические латексы, их применение и модифицирование".-М:.ЦНИИТэнефтехим,1991,-С

Заказ 32 Тираж 100

Формат 60x84/16 - 1,0п.л. - 1,04 уч.-изд.л.

Предприятие "Полиграфсервис" "I093I6, г.Москва, ул.Талалихина, 26