автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии ферментного препарата из моллюска дрейссены (Dreissena polymorpha Pallas)

На правах рукописи

Литвинова Ольга Александровна

Ü03486750

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ МОЛЛЮСКА ДРЕЙССЕНА (DREISSENA POLYMORPHA PALLAS)

05.18.04 Технология мясных, молочных, рыбных продуктов и холодильных производств 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

- з ПЕН 2009

Калининград - 2009

003486750

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Калининградский государственный технический университет» (ФГОУ ВПО «КГТУ»).

Научный руководитель

кандидат технический наук, доцент Лысова Альбина Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Шендерюк Владимир Ильич

доктор технических наук, Новикова Маргарита Владимировна

Ведущая организация

Федеральное унитарное предприятие «Атлантический научно-исследовательский институт рыбной промышленности и океанографии» (ФУП «АтлантНИРО»)

Защита состоится «25» декабря 2009 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 307.007.01 при ФГОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет» по адресу: 236022, г. Калининград, Советский проспект, 1, ауд. 255. Факс: 8 (4012)91-68-46

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет».

Автореферат разослан «/£» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор технических наук, профессор

Н.Л. Великанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. В современной биотехнологии одно из видных мест принадлежит ферментам, которые широко используются в различных областях промышленности (пищевая, текстильная, целлюлозно-бумажная, химическая, фармацевтическая и др.), а также сельском хозяйстве (кормовые добавки, ветеринарные препараты), медицине, экологии.

Однако, отечественная промышленность заметно отстает по объему производства и областям применения ферментных препаратов от ведущих стран мира (США, Япония, Дания, Нидерланды). Объяснением данного факта является ограниченная доступность ферментов, отсутствие в достаточном количестве исходного сырья, высокая цена.

Источниками ферментных препаратов являются: растительное сырье, органы и ткани наземных животных, микроорганизмы, гидробионты. Применение протеиназ растительного происхождения (фицин, бромелин, папаин) наиболее часто практикуется в южных странах: Индия, Бразилия, Новая Зеландия, реже - в нашем регионе. Необходимо отметить трудоемкость сбора и консервирования животного ферментсодержащего сырья (поджелудочная железа, слизистые оболочки, семенники половозрелых животных) на мясоперерабатывающих комбинатах, но, из поджелудочной железы получают главным образом, инсулин, в связи с чем существует проблема обеспечения этим сырьем производство ферментных препаратов. В настоящее время широкое применение нашли ферменты микробиологического происхождения, но они не всегда эффективны при созревании соленой рыбопродукции и не исключена возможность их остаточной обсемененности. Поэтому поиск новых доступных массовых источников ферментсодержащего сырья является весьма актуальным.

Вопросами совершенствования производства и применения ферментных препаратов занимались многие ученые: Грачева И.М., Черногорцев А.П., Слуцкая Т.Н., Шендерюк В.И., Константинова JI.JL, Паукова JI.M., Лысова A.C., Некрасова Г.Т., Новикова М.В., Новиков В.Ю., Мухин В.А., Пивненко Т.Н., Разумовская Р.Г., Байдалинова JLC., Цибизова М.Е, Бердышев Г.Д., Сахаров И. Ю., и ряд других. В работах этих ученых показано, что ферментная система гидробионтов содержит высокоактивные комплексы протеолитических ферментов, которые могут найти широкое применение в различных отраслях народного хозяйства: при производстве белковых концентратов, изолятов, гидролизатов, белковых ферментативных масс, соусов и др. Применение коллагеназы облегчает удаление кожи с плавников ската, кальмаров,

темной пленки с брюшной полости у ряда рыб, снятие чешуи, очистку креветок от панциря и др. Мышечная ткань целого ряда объектов рыбного промысла (пеламида, салака, тунец, судак, хек, путассу и др.), которые могли бы составить сырьевую базу для производства слабосоленой деликатесной продукции, имеет низкий уровень активности собственных протеиназ, что не позволяет достичь нужной степени созревания без дополнительного внесения протеолитических ферментных препаратов, интенсифицирующих процесс созревания.

Ферментные препараты, получаемые из гидробионтов, содержат оптимальную композицию ферментов, которые мягко и последовательно расщепляют белки рыб до компонентов, формирующих традиционный букет, свойственный созревшему продукту. Наибольшую ферментативную активность имеют нерыбные объекты промысла, в том числе двустворчатые моллюски.

В водах Каспийского и Аральского морей, около Балканского полуострова, в бассейнах Азовского, Чёрного, Балтийского морей, в Рыбинском, Угличском, Горьковском, Иваньковском, Учинском, Саратовском, Куйбышевском и Кременчугском водохранилищах, реках Кольского полуострова и Карелии, в водоемах практически всей Европы, Северной Америки, в том числе и в Великих озерах, в Калининградском регионе (Куршском и Вислинском заливах, Виштынецком и других озерах области) в большом количестве обитает малоисподьзуемый в промышленности двустворчатый моллюск дрейссена (Dreissena polymorpha Pallas, 1771/ Исследованию расселения дрейссены посвящены работы ряда ученых [Аристова, 1971; Старобогатов, 1994; Johnson, Carlton, 1996; Ворошилова, 2008; Протасов, 2008; Щербина, 2008 и др.]. Учитывая существующие запасы дрейссены, её высокую способность к размножению и образованию значительных скоплений на небольшой площади [Истомина, 2008; Пряничникова, 2008; Санжак, 2008 и др.], можно констатировать, что существуют широкие возможности для промысла этого моллюска с целью прикладного использования.

Из дрейссены уже выделен фермент 5-фосфодиэстераза, рекомендованный для применения в медицине в качестве лечебного препарата [Бердышев с соавт., 1977]. Ведутся работы по получению белковых гидролизатов из моллюска дрейссены различного происхождения, которые могут найти широкое применение в промышленности, в том числе пищевой, микробиологической, ветеринарной и медицинской [Новикова, Нгуен, 2009]. Однако в настоящее время отсутствуют исследования по получению и применению протеолигаческого комплекса ферментов из моллюска дрейссены, отсутствуют литературные данные по ее заготовке и

хранению, рН - активности, влиянию температуры, сезонным изменениям активности протеолитических ферментов дрейссены. Принимая во внимание выше изложенное, а также биотехнологический потенциал дрейссены, представляется целесообразным изучение этого моллюска как потенциального ферментсодержащего сырья и разработка технологии получения из него ферментного препарата протеолитического действия.

Цель работы: разработать технологию протеолитического ферментного препарата из нового вида сырья - двустворчатого моллюска дрейссена (Dreissena polymorpha Pallas).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- исследовать био- и техно-химические показатели дрейссены;

- установить способы и сроки холодильного хранения дрейссены;

- исследовать влияние температуры, рН-среды и сезона вылова на активность протеолитических ферментов моллюска;

- обосновать технологию получения ферментного препарата протеолитического действия из целого моллюска дрейссены;

- разработать технологию получения ферментного препарата из дрейссены и определить его качественные показатели;

- провести производственные испытания полученного ферментного препарата в качестве созревателя в технологии рыбных пресервов;

- оценить эффективность внедрения разработанной технологии получения ферментного препарата из дрейссены;

- разработать проекты технологической инструкции и технических условий на ферментный препарат «Протофермол» из моллюска дрейссены.

Научная новизна работы. Впервые разработана технология ферментного препарата протеолитического действия из дрейссены (Dreissena polymorpha), взятого из озера Форелевое Калинишрадской области и изучена его био - и технохимическая характеристика. Установлены сроки и условия холодильного хранения дрейссены до обработки. Изучено влияние температуры, рН, сезона вылова на активность протеолитических ферментов дрейссены, позволяющий наиболее полно использовать биотехнологический потенциал моллюска. Получена математическая модель ключевого процесса автопротеолиза дрейссены в водно-спиртовом растворе, исследованы основные качественные характеристики ферментного препарата (протеолитическая активность, органолептические, физико-химические и

микробиологические показатели). Установлена эффективность применения ферментного препарата «Протофермол» для интенсификации процесса созревания пресервов из разделанной салаки.

Практическая значимость работы. Разработана технология получения ферментного препарата протеолитического действия из двустворчатого моллюска дрейссены без предварительного отделения створок, обладающего высокой эффективностью в качестве созревателя для рыбной продукции (заявка на изобретение от 28.07.09. № 2009129081 «Способ получения ферментного препарата протеолитического действия»).

Разработан проект нормативной и технической документации на ферментный препарат «Протофермол» из целого моллюска дрейссены.

Показана эффективность применения ферментного препарата из дрейссены в качестве интенсификатора процесса созревания рыбных пресервов из слабо и несозревающего сырья.

Результаты экспериментальных исследований апробированы в производственных условиях в ООО «Рыбокомбинат «За Родину» (пос. Взморье Калининградской обл.), получили положительную оценку и рекомендованы к внедрению.

Положения, выносимые на защиту:

- результаты исследований био- и технохимических показателей моллюска дрейссены;

- влияние температуры, рН-среды, сезона вылова дрейссены из озера Форелевое на активность её протеолитияеских ферментов;

- обоснование технологических параметров получения ферментного препарата протеолитического действия из дрейссены.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на МНК «Инновации в науке и образовании - 2004», посвященной 10-летию КГТУ (Калининград, 2004), НПК «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем» (Калининград, 2005), НПК «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы» (Москва, 2006), МНК ППС и студентов вуза «Социально-ориентированная экономика Калининградского региона: Проблемы и перспективы развития. М.: АНОВПОЦС РФ, 2007» (Москва, 2007), V съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2008), международной научно-практической конференции «Олимпиада 2014: Технологические и экологические аспекты производства продуктов здорового питания» (Краснодар,

2009), VII Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании - 2009» (Калининград, 2009).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из списка сокращений, введения, 3 глав, выводов, списка литературных источников и приложений. Работа изложена на 170 страницах компьютерного текста, содержит 12 таблиц, 14 рисунков и 7 приложений. Библиография включает 208 источников, из которых - 37 на иностранных языках. В приложениях представлены балловая шкала оценки качества пресервов, проекты ТИ и ТУ на ферментный препарат, акт производственных испытаний, протокол дегустационного совещания, исходные требования к оборудованию для производства ферментного препарата, расчет экономической эффективности разработанной технологии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во «Введении» обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследований, научная новизна, практическая значимость работы, положения, выносимые на защшу.

В первой главе «Обзор литературы» проанализированы существующие технологии получения ферментных препаратов протеолитического действия го различных видов сырья, показан биотехнологический потенциал недоиспользуемого на практике двустворчатого моллюска дрейссены. Анализ литературного материала позволил установить, что в настоящее время существует дефицит ферментсодержащего сырья и ферментных препаратов натурального происхождения, отсутствуют технологии получения ферментного препарата протеолитического действия из моллюска дрейссены.

Во второй главе «Организация эксперимента, объект и методы исследований» представлена схема исследований (рисунок 1), а также приведена характеристика объекта и методов исследования.

В качестве объекта исследования использовали двустворчатого моллюска дрейссена (Dreissenapolymorpha) из озера Форелевое Калининградской области. Сбор материала проводили в период с 2002 по 2009 гг. Для исследований по сезонным изменениям активности ферментов сбор дрейссены осуществляли ежемесячно в течение 3-х лет. Для лова дрейссены применяли скребки и драги. Моллюсков

извлекали вместе с фрагментами субстрата (раковинами моллюсков - унионид, кусками дерева и др.).

Оценка эффективности разработанной технологии получения ферментного препарата

Рисунок 1 -Схема исследований Моллюска отделяли от грунта, после чего промывали водой через сито, после

чего отделяли посторонних включений и некондиционного моллюска. Собранные пробы упаковывали в полиэтиленовые пакеты, их хранили при температуре минус (20 ±2) °С.

Химический состав мягкого тела дрейссены определяли общепринятыми методами: массовую долю белка, жира, воды, минеральных веществ по ГОСТ 7636, углеводы по методу Бертрана ГОСТ 3628.

При определении диапазонов рН- активности ферментов мягкого тела дрейссены применяли универсальную буферную смесь.

Доброкачественность сырья (моллюск дрейссена) в процессе холодильного хранения, готовых рыбных пресервов, а также надежность консервирования процесса автопротеолиза дрейссены оценивали по отношению содержания азота летучих оснований (AJIO) к формольно - титруемому азоту (ФТА), выраженному в процентах [Черногорцев, 1959]. Азот летучих оснований определяли по ГОСТ 7636.

При изучении влияния температуры, рН -среды, сезона вылова дрейссены на активность протеолигических ферментов осуществляли методом формольного титрования (мг%/час) по ГОСТ 7636.

Активность протеолигических ферментов (АПФ) мягкого тела дрейссены и ферментного препарата из него определяли модифицированным методом Ансона по ГОСТ 20264.2 на спектрофотометре Photoelectric colorimeter АР-101.

Качество рыбных пресервов с ферментным препаратом из дрейссены оценивали по показателю буферности, кислотности, массовой доли поваренной соли. Буферность определяли титриметрическим методом по ГОСТ 19182. Кислотность пресервов определяли по ГОСТ 27083 (в пересчете на уксусную кислоту). Массовую долю поваренной соли аргентометрическим методом ГОСТ 27207 (метод Мора). Массовую долю бензойнокислого натрия в пресервах - по ГОСТ 27001.

Органолептическую оценку ферментного препарата осуществляли описательными методами, используя 5-ти балловую шкалу с коэффициентами значимости и последующим построением профилограмм [Сафронова, 1985].

Микробиологические испытания ферментного препарата проводили по стандартным методикам: ГОСТ 10444.15, ГОСТ Р 50474, ГОСТ 30726, ГОСТ Р 50480, ГОСТ 10444.12; общую бактериальную обсемененность - по ГОСТ 20264.1; определение дрожжей и плесневых грибов - по ГОСТ 10444.12. Полученные результаты сравнивали с нормативными показателями.

Определение оптимальных технологических параметров получения ферментного препарата осуществляли путем моделирования процесса методом математического

планирования эксперимента [Адлер с соавт., 1976; Мезенова, 1995] с применением ортогонального центрального композиционного плана (ОЦКП) второго порядка для двух факторов.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили стандартными методы вариационной статистики. Расчеты и построение графических зависимостей осуществляли с помощью программ Microsoft Office Excel 2003 и MathCAD 2000 при доверительной вероятности 95 %.

Апробирование ферментного препарата «Протофермол» в качестве интенсификатора процесса созревания пресервов из разделанной салаки проводили в условиях предприятия ООО «Рыбокомбинат «За Родину» (пос. Взморье Калининградской области).

Оценку эффективности разработанной технологии получения ферментного препарата осуществляли путем расчета технико-экономических показателей с учетом производственного аспекта, социальной и экологической составляющих.

В третьей главе «Результаты исследований и их обсуждение» в разделе «Исследование био- и техно-химических показателей моллюска дрейссены» приведены сравнительный химический состав дрейссены разных мест вылова и зеленой мидии (таблица 1), активности протеолигических ферментов дрейссены и влияние на неё различных факторов (рН, температуры, сезона вылова), определены сроки холодильного хранения дрейссены.

Таблица 1 - Химический состав мягкого тела некоторых двустворчатых моллюсков, %

Объекты исследования Сухие вещества Белок (N*6,25) Липиды Минеральные вещества Углеводы

Дрейссена (озеро Форелевое) 19,53±1,02 14,74±0Д5 1,62±0,05 1,22±0,02 1,95±,0,13

Дрейссена (залив Куршю-Марес) * 13,83±1,05 9,15±0,26 1,56±0,03 1,16±0,02 1,86±0,б5

Дрейссена (озеро Плещеево)** 20,34±1,04 14,83±0,24 2,09±0,07 1,55±0,01 1,87±0,73

Зеленая мидия (Вьетнам, район острова Кат Ба)** 22,05±1,34 15,7±1,25 1,08±0,03 1,93±0,01 3,29±0,12

* — по [Скиркявичене, 1974]; **— по [Нгуен, Новикова, 2009].

По химическому составу (таблица 1) мягкое тело двустворчатого моллюска дрейссена (Dreissena polymorpha) из озера Форелевое, не имеет значительных отличий от дрейссены других районов, а также от моллюска зеленая мидия (Mytilus perna viridis). Анализ представленных в таблице 1 данных, показывает, что по содержанию белка в мягком теле изучаемой нами дрейссены, а также дрейссены других районов вылова, её можно отнести к белковому сырью [по классификации Леванидова И.П.].

Таблица 2 - Активность протеолитических ферментов мягкого тела дрейссены

(озеро Форелевое)

Дата вылова моллюска Активность протеолитических ферментов (субстрат 2 %-ный казеинат натрия)

мкмоль тирозина / г мягкого тела • мин мкмоль тирозина / г белка мягкого тела ■ мин

15 июня 2004 0,90 13,24

2 августа 2004 0,65 9,56

12 апреля 2005 1,24 18,24

15 июля 2005 0,82 12,06

3 февраля 2006 0,61 8,97

4 августа 2006 0,80 11,97

Изучение протеолитической активности ферментов мягкого тела дрейссены в период 2003-2005 гг. при естественном значении рН мышечной такни моллюска 6,7 показала, что на протяжении всего периода активность протеолитических ферментов дрейссены находилась в пределах от 0,61 до 1,24 ед/г (таблица 2).

Полученные нами собственные данные по активности протеолитических ферментов дрейссены, а также опубликованные результаты [ОаЬгоУзЫ, Ок^омгеИ, 1974], позволили сделать заключение о рациональности использования двустворчатого моллюска дрейссены в качестве ферментсодержащего сырья для получения препарата протеолитического действия.

С целью обоснования сроков холодильного хранения дрейссены и его влияния на качество моллюска, сырье хранили в охлажденном и мороженом виде. Охлаждение моллюска проводили на воздухе при температуре +4-2°С (СанПиН 2.3.2.1324-03 Гигиенические требования к срокам годности и условиям хранения пищевых продуктов) и во льду. Результаты исследований показали, что данные способы охлаждения позволяют сохранять моллюска без снижения активности ферментов и

видимых признаков порчи не более 12 часов. Способ охлаждения в жидкой среде был нами сразу отклонен в связи с возможными потерями водорастворимых белков, обладающих ферментативной активностью.

Наиболее перспективным способом хранения сырья является замораживание. Для установления сроков хранения дрейссены в мороженом виде определяли показатели доброкачественности АЛО/ФТА -100% и активность протеолитических ферментов моллюска. Известно, что если микробиологические процессы не превалируют над автолитическими, то отношение АЛО/ФТА -100% является величиной постоянной, не превышающей 8,0 % [Черногорцев, 1960]. В эксперименте исследовалась дрейссена взятая из озера в июне 2007г. Хранение сырья осуществляли с июня по ноябрь 2007 г. включительно при температуре минус (20±2) °С.

2 3 4 5

Продолжительность хранения дрейссены при минус (20±2)°С

Рисунок 2 - Влияние сроков холодильного хранения дрейссены на активность протеолитических ферментов сырья

В результате проведенных экспериментов установлено (рисунок 2), что в ходе хранения дрейссены при температуре минус (20±2) °С активность протеолитических ферментов (АПФ) в течение первого месяца хранения не изменялась и оставалась на исходном уровне 0,49 мкмоль тирозина/мл-мин. К середине второго месяца активность ферментов возросла на 8 %, что можно объяснить процессом денатурации белковой молекулы и более легкой атакуемости белка собственными ферментами дрейссены.

Показатель доброкачественности сырья АЛО/ФТА -100% в начале хранении равнялся 6,7 %. При дальнейшем хранении он постепенно возрастал и к пятому месяцу достиг 8,0 %, что позволило установить предельный срок хранения дрейссены без снижения её качества и сделать вывод, что гарантированным сроком хранения дрейссены при указанных режимах (температура минус 20°С (±2 °С) следует считать пять месяцев.

Влияние температуры, рН- среды на активность протеолитических ферментов моллюска дрейссены и сезонные изменения активности протеолитических ферментов представлены на рисунках 3,4,5.

При исследовании рН - активности (рисунок 3) нами обнаружены два ясно выраженных оптимума. Первый - на участке рН 4,0-6,0, который можно принять за «пепсиновый», второй оптимум - на участке рН 9,0-10,0, этот комплекс протеаз может быть принят за «трипсиновый». Установлено, что проводить автопротеолиз дрейссены можно достаточно эффективно в широком диапазоне рН, а именно при значениях от 4 до 11, в том числе и при естественном значении рН мягкого тела дрейссены (рН 6,7).

® -с

Температура, С

Рисунок 3 - Влияние рН на изменение АПФ мягкого тела дрейссены

Рисунок 4 - Влияние температуры на изменение АПФ мягкого тела дрейссены

,/у * ✓ ✓ //>#Л/

Месяцы

Рисунок 5 - Сезонные изменение активности протеолитических ферментов дрейссены

Данные на рисунке 4 показывают, что протеолитические ферменты дрейссены проявляют максимальную активность в диапазоне температур 45... 55 °С.

Результаты исследований сезонных изменений активности протеолигических ферментов дрейссены (рисунок 5) показывают, что максимальная АПФ (7,5 мг%/ч) проявляется в весенние месяцы (апрель-май).

В этот период в дрейссене интенсивно протекают процессы синтеза белка и он характеризуется как подготовительный к размножению.

Факторами интенсификации активности ферментов являются также пробуждение моллюсков от зимнего покоя с повышением температуры воды и увеличением темпа их роста [Ляшенко, 1989]. В осенний посленерестовый период в связи с ослаблением обменных процессов в мягком теле дрейссены отмечена минимальная активность протеолитических ферментов (от 0,78 до 1,5 мг% /ч).

Резюмируя полученные результаты можно заключить, что наиболее целесообразным периодом заготовки дрейссены в качестве ферментсодержащего сырья является период с марта по июнь.

В разделе «Моделирование и оптимизация технологического процесса получения ферментного препарата» получена математическая модель и установлены оптимальные параметры ключевого процесса автопротеолиза дрейссены в водно-спиртовом растворе с использованием ортогонального центрального композиционного плана (ОЦКП) второго порядка для двух факторов. План эксперимента и результаты его реализации представлены в таблице 3.

В качестве варьируемых частных факторов, подлежащих оптимизации, были выделены продолжительность ферментации т (ч) и температура ферментации / (°С). Параметром оптимизации математической модели была выбрана совокупная безразмерная характеристика у, объединяющая два частных отклика - удельную активность протеолитических ферментов дрейссены и выход ферментного препарата.

С целью установления влияния факторов, подлежащих оптимизации (температура, продолжительность), концентрацию консерванта (10 %-ный водно-спиртовой раствор) и соотношение моллюск : раствор, равное 2:1, в эксперименте поддерживали на постоянных рациональных уровнях, определенных в дополнительных экспериментах.

Математическая обработка экспериментальных данных по алгоритмам ОЦКП второго порядка позволила получить модель исследуемого процесса (рисунок 6).

Оптимальные значения факторов, графически представленные в виде координат точки экстремума: продолжительность - 40 ч, температура-+47°С.

Номер опыта План эксперимента Частные отклики Обобщенный параметр оптимизации, у

Продолжительность ферментации, ч Температура ферментации, °С ПА, ед/мг белка Выход ферментного препарата, %

по матрице X! натурально -с по матрице натурально г

1 +1 48 +1 60 0,11 46,67 0,93

2 -1 24 +1 60 0,53 33,33 0,79

3 +1 48 -1 40 1,09 53,23 0,41

4 -1 24 -1 40 0,28 33,13 0,93

5 +1 48 0 50 0,34 47,12 0,79

6 -1 24 0 50 1,30 46,62 0,32

7 0 36 +1 60 0,26 46,63 0,84

8 0 36 -1 40 0,61 53,33 0,64

9 0 36 0 50 1,01 46,63 0,44

Таблица 3 - План эксперимента и результаты его реализации по моделированию и оптимизации технологии получения протеолитического ферментного препарата из дрейссены

Примечание: «Идеалы» частных безразмерных откликов, принятые по результатам испытаний: ПА= 3 ед/мг белка; выход ферментного препарата от массы автолизата —50 %.

У Л_1

Продолжительность аетопротеолвза, ч

- Графическая интерпретация полученной модели исследуемого процесса автопротеолиза

Рисунок 6

I

|

Температура автопротеолиза, "С

Проверка полученных значений, проведенная путем постановки многократных экспериментов при данных условиях, позволила уточнить диапазон рациональных значений процесса : продолжительность автопротеолиза дрейссены — от 36 до 40 ч при поддержании в системе температуры в диапазоне от +42 до +47 °С.

В разделе «Технология получения ферментного препарата из моллюска дрейссены» на основании результатов собственных исследований, а также анализа существующих технологий получения ферментных препаратов из рыбного сырья [Черногорцев, 1973; Слуцкая, 1987; Паукова, 1988; Шендерюк, 1979], обоснована технология получения ферментного препарата «Протофермол» из моллюска

дрейссены, схема которой представлена на рисунке 7.

Рисунок 7 -Схема технологического процесса получения ферментного препарата «Протофермол» из моллюска дрейссены

В качестве сырья для производства ферментного препарата используют дрейссену - сырец, охлажденную или мороженую. Мороженое сырье размораживают на воздухе при температуре не выше 20°С, промывают проточной водой температурой 15 - 20°С для удаления остатка грунта, песка, выдерживают для стекания воды 5-10 мин. Затем целую дрейссену, без предварительного отделения створок загружают в ферментер, куда подают 10-15%-ный водно-спиртовой раствор в

качестве консерванта при соотношении моллюск : раствор 2:1. Консервированную массу нагревают до температуры автопротеолиза (47°С) путем подачи в зарубашечное пространство ферментера горячей воды температурой 80°С. Нагрев осуществляют при непрерывной работе мешалки, чтобы исключить «заваривание» сырья возле стенок ферментера, а следовательно, и инактивацию ферментов. После достижения указанной температуры ферментируемой массы идет непосредственно процесс автопротеолиза, который продолжается в течение 36-40 ч, при этом температурный режим поддерживается на заданном уровне автоматически.

После автопротеолиза жидкую фракцию (раствор ферментов) отделяют от непрогидролизовавшегося плотного остатка в центрифуге со скоростью вращения ротора 3000-5000 об/мин, в течение 30-45мин. Жвдкую фракцию направляют на сепарирование для отделения жира, а затем на сушку, которая осуществляется на вакуум-сушильной установке при температуре не выше 30°С или на распылительной сушилке до массовой доли воды в препарате не более 8,0 %. Плотный остаток собирают для передачи на производство кормовых продуктов.

Полученный сухой ферментный препарат «Протофермол» расфасовывали в герметически укупоренные полиэтиленовые пакеты и хранили при нерегулируемой положительной температуре (17±2)°С в течение восьми месяцев. Изменения протеолитической активности ферментного препарата в течение указанного срока хранения не наблюдалось и равнялось исходному значению (1,6 ед/г). Хранение ферментного препарата и исследование изменения его качества продолжается.

На получение ферментного препарата «Протофермол» разработаны проекты нормативной и технической документации (ТИ, ТУ).

В разделе «Исследование показателей качества ферментного препарата» представлены характеристики органолелтических, физико-химических и микробиологических показателей качества сухого ферментного препарата «Протофермол». В таблице 4 представлены органолептические показатели качества сухого ферментного препарата.

Таблица 4 - Органолептические показатели качества сухого ферментного препарата «Протофермол»__

Наименование показателей Характеристика

Внешний вид Рассыпчатый порошок

Цвет От желтого до светло-коричневого

Запах Свойственный, без постороннего запаха

Учитывая, что запах является важным показателем, влияющим на вкус и запах рыбных пресервов, приготавливаемый с использованием данного ферментного препарата, изучали композицию запаха, используя профильный метод. На рисунке 8 приведена профилограмма запаха ферментного препарата «Протофермол».

приятный, свойственный данному виду продукции

сушеных морепродуктов

вяленой рыбы

натуральный //7 специфичский

Неприятный, неприемлемый данному продукту

Рисунок 8 - Профилограмма запаха ферментного препарата

растительных компонентов*-

данному продукту

Полученная профилограмма показывает, что для образцов данного ферментного препарата наиболее характерен аромат сушеных морепродуктов с оттенком растительных компонентов, характеризующийся как натуральный, приятный, свойственный данной продукции.

Физико-химические показатели сухого ферментного препарата представлены в таблице 5,

Таблица 5 - Физико-химические показатели качества сухого ферментного препарата «Протофермол»

Наименование показателей Характеристика

Массовая доля воды, % 7,9±0,2

Протеолитическая активность (ПА), ед/г 1,5±0,01

Этиловый спирт (консервант) отсутствует

Выход готового продукта составляет 3,2-3,5 % от массы моллюска со створками.

Микробиологические показатели сухого ферментного препарата приведены в таблице 6. В ферментном препарате были также обнаружены дрожжи и плесени в количестве 7,9Т02 (КОЕ/г) и установлено отсутствие патогенной микрофлоры. Сравнивая полученные результаты с нормативными показателями (СанПиН 2.3.2.1293-03 Гигиенические требования по применению пищевых добавок, 2003), можно констатировать, что по данным санитарно-гигиеническим показателям полученный ферментный препарат соответствует требованиям, предъявляемым к ферментным препаратам, применяемым в пищевой промышленности.

Таблица 6 - Микробиологические показатели сухого ферментного препарата «Протофермол»

Наименование показателей Нормативный показатель Фактическое содержание

Количество мезофильно аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, КОЕ в 1г продукта, не более 1-Ю4 0,8-104

Бактерии группы кишечных палочек (колиформы) в ОД г продукта не допускаются не обнаружены

Е. coli в 25 г продукта не допускаются не обнаружены

Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, в 25 г продукта не допускаются не обнаружены

Таким образом, полученные характеристики сухого ферментного препарата «Протофермол» свидетельствуют о его высокой протеолитической активности, стойкости при хранении, микробиологической безопасности.

Оставшаяся после гидролиза твердая часть, представляющую собой ценный по химическому составу плотный остаток непрогидролизованных мягких тканей и створок дрейссены (вода - 70±0,25; белок - 4,3±0,18; липиды - 10,1±0,28; минеральные вещества - 13±0,21%) рекомендуется направлять на производство кормов для сельскохозяйственных животных.

В разделе «Обоснование влияния дозировки ферментного препарата на скорость процесса созревания рыбных пресервов» проведены исследования по установлению оптимальной дозировки ферментного препарата «Протофермол» при изготовлении рыбных пресервов.

350

| 300I

§ 250

£

0 200

1 150

£ 100

<8 50

а

Б 0

5 0 10 30 60 90 120

Продолжительность хранения пресервов, сутки

Рисунок 9 - Накопление азота свободных аминогрупп в мышечной ткани из салаки в процессе хранения пресервов

С этой целью была приготовлена опытная партия слабосоленых пресервов из разделанной салаки в уксусно-масляной заливке с добавлением 10%-ного ферментного препарата в количестве 3 % (кривая 1), 4 % (кривая 2) и 5 %(кривая 3) от массы салаки. Пресервы в уксусно-масляной заливке готовили по действующей технологической инструкции на производство пресервов из разделанной рыбы.

Степень созревания пресервов определяли методом формольного титрования по накоплению азота свободных аминогрупп. Анализ полученных данных (рисунок 9) свидетельствует, что ферментный препарат «Протофермол» значительно ускоряет процесс созревания слабосоленых пресервов из разделанной салаки в уксусно-масляной заливке.

Первые признаки, характерные созревшим пресервам, отмечены на десятые сутки хранения. При добавлении ферментного препарата «Протофермол» в количестве 4 % от массы салаки содержание азота свободных аминогрупп в мясе рыбы достигает 120 мг% на десятые сутки хранения. На 15 сутки пресервы, приготовленные с добавлением «Протофермол» в количестве 4 %, уже имели нежную консистенцию, приятный внешний вид, запах и вкус - свойственные созревшей рыбе данного вида.

Пресервы с добавлением ферментного препарата в количестве 3 % от массы салаки значительно отставали по темпам роста азота свободных аминогрупп и степени созревания.

При добавлении ферментного препарата «Протофермол» в количестве 5 % от массы салаки наблюдался быстрый рост азота свободных аминогрупп. К концу первого месяца хранения пресервы характеризовались повышенной размягченностью поверхностных слоев мяса, содержание азота свободных аминогрупп в мясе салаки составило 275 мг%, появились первые признаки, характерные перезревшему продукту (мажущаяся консистенция, привкус горечи).

При производстве пресервов нами была использована дозировка ферментного препарата 4% от массы рыбы.

В разделе «Производственные испытания ферментного препарата в технологии рыбных пресервов» приведены результаты апробации ферментного препарата «Протофермол» в качестве созревателя пресервов из разделанной салаки, проведенной в условиях предприятия ООО «Рыбокомбинат «За Родину» (пос. Взморье Калининградской области).

На базе действующего оборудования были изготовлены две промышленные партии малосоленых пресервов из салаки филе-кусочки в уксусно-масляной заливке

с добавлением ферментного препарата «Протофермол» (экспериментальная партия) и без него (контрольная партия) в соответствии с действующей технологической инструкцией на пресервы из разделанной рыбы [Сборник ТИ по производству рыбных консервов и пресервов, 1989]. «Протофермол» вводили в жидкую часть заливки в виде 10 %-ного водного раствора (4 % от массы рыбы).

Результаты оценки качества экспериментальной и контрольной партии малосоленых пресервов из салаки в уксусно-масляной заливке после двухнедельного хранения при температуре минус 2 °С приведены в таблице 7. Ферментный препарат

Таблица 7 - Показатели качества экспериментальной и контрольной партии малосоленых пресервов из салаки в уксусно-масляной заливке

Показатели качества пресервов Образцы пресервов

С добавлением ферментного препарата «Протофермол» (экспериментальная партия) Без добавления ферментного препарата (контрольная партия)

Внешний вид: - цвет цвет филе-кусочков светло-серый, чистый, без налета белкового коагулята

- запах и вкус приятный, с признаками, характерными для созревшего продукта с незначительным оттенком сырости

- консистенция мягковатая, нежная, сочная плотная, недостаточно сочная, признак нежности отсутствует

Массовая доля поваренной соли, % 4,20 4,10

Кислотность (в пересчете на уксусную кислоту), % 0,53 0,62

Бензойнокислый натрий, % 0,08 0,09

Массовая доля: - рыбы, % - заливки, % 78,00 22,00 77,80 22,20

Буферность, град 110,00 45,00

АЛО/ФТА • 100, % 7,20 6,50

В процессе хранения экспериментальных и контрольных промышленных партий пресервов определяли степень их созревания по показателю буферность.

Из полученных данных следует, что пресервы из салаки с добавлением фермент-

ного препарата уже на 7 сутки имели буферность 75 град, на 14-ые сутки - 110 град и характеризовались нежной консистенцией с ароматом и вкусом, свойственным созревшей рыбе. Буферность пресервов без добавления ферментного препарата на 14 сутки хранения была равна 45 град, консистенция плотная, запах - с незначительным оттенком сырости, пресервы не достигли нужных гастрономических показателей. По всем нормативным показателям пресервы экспериментальной партии соответствовали требованиям, регламентированным в ГОСТ 7453 «Пресервы из разделанной рыбы».

Качество готовой продукции получило положительную оценку у специалистов предприятия, а технология производства пресервов из слабо созревающего рыбного сырья с применением ферментного препарата «Протофермол», полученного из двустворчатого моллюска дрейссена, рекомендована к внедрению. Результаты проведенных исследований удостоверены актом производственных испытаний пресервов с применением ферментного препарата «Протофермол» и протоколом дегустационного совещания специалистов.

В разделе «Оценка эффективности разработанной технологии» показаны социальная и экологическая составляющая разработки с учетом производственного аспекта. Сделан расчет экономической эффективности, который показал, что прибыль от внедрения разработанной технологии получения ферментных препаратов из моллюска дрейссены себестоимостью 670 руб./ кг может составлять более 3 млн. руб./год, при окупаемости в течение четырех с половиной лет и рентабельности выпуска продукции - 25 %.

ВЫВОДЫ

1. Исследована био- и техно-химическая характеристика моллюска дрейссена (Dreissena polymorpha Pallas) из озера Форелевое Калининградской области. Установлено, что по химическому составу моллюск относится к белковым объектам промысла; протеолигическая активность мягкого тела дрейссены - 0,61 -1,24 ед/г (по казеинату натрия).

2. Определены способы и сроки хранения охлажденной и мороженной дрейссены. Установлено, что дрейссену можно хранить в охлажденном виде при температуре +4-2°С не более 12 часов, в мороженом - при температуре минус (20±2)°С - в течение пяти месяцев.

3. Определены диапазоны рН - активности протеолитическйх ферментов моллюска. Обнаружены два ясно выраженных оптимума - на участке рН 4,0-6,0

(«пепсиновый»), второй - на участке рН 9,0-10,0 («трипсиновый»). Максимальная активность протеолитических ферментов моллюска обнаружена при рН 5,0.

4. Установлено, что максимальная активность протеолитических ферментов моллюска дрейссены проявляется в диапазоне температур 45. ..55 °С.

5. Исследовано изменение активности протеолитических ферментов дрейссены по сезонам. Установлено, что максимальная активность ферментов (7,5 мг%/час) проявляется в весенние месяцы (апрель-май), наименьшая (0,78-1,5 мг%/час) - в осенний посленерестовый период. Рекомендуемый период вылова дрейссены в качестве ферментсодержащего сырья март-июнь.

6. Оптимизированы параметры (температура, продолжительность) основного технологического процесса получения ферментного препарата - автопротеолиза тканей дрейссены в 10-15%-ном водно-спиртовом растворе путем проведения математического моделирования по специальным алгоритмам ОЦКП второго порядка. Рациональные значения параметров процесса составили: продолжительность - от 36 до 40 ч, температура - от 42 до 47 °С.

7. Разработана технология получения ферментного препарата протеолитического действия «Протофермол» из целого моллюска дрейссены, исключающая трудоемкий процесс отделения мягкого тела от створок дрейссены; выход ферментного препарата составил 3,5% от массы исходного сырья.

8. Определены органолептические, физико-химические и микробиологические показатели качества сухого ферментного препарата «Протофермол» подтверждающие его высокую протеолитическую активность (1,5-1,6 ед/г), стойкость при хранении и микробиологическая безопасность.

9. Показана целесообразность применения полученного ферментного препарата «Протофермол». Обоснована его дозировка для ускорения процесса созревания рыбных пресервов в качестве интенсификатора созревания. Пресервы с наилучшими органолептическими и физико-химическими показателями были получены при дозировке ферментного препарата 4% от массы рыбы (пресервы созревали на 14-ые сутки, при этом буферность достигает 110 градусов).

10. Ферментный препарат апробирован в промышленных условиях на ООО «Рыбокомбинат «За Родину» и рекомендован специалистами предприятия к внедрению в качестве интенсификатора процесса созревания пресервов из слабо и несозревающего сырья.

11. Разработаны проекты технологической инструкции и технических условий на ферментный препарат «Протофермол» из моллюска дрейссены.

12. Проведена оценка экономической эффективности разработанной технологии. Срок окупаемости предлагаемой технологии составляет 4,4 года при рентабельности производства - 25%. Прибыль от внедрения технологии ферментного препарата из моллюска дрейссены при объеме выпуска 25 т/год составляет более 3 млн. руб./год, что характеризует перспективность предложенной технологии ферментного препарата, а низкая себестоимость - 670 руб./ кг - доступность д ля потребителя.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях рекомендованных ВАК:

1. Судник O.A. Перспективы использования двустворчатого моллюска Dreissena polymorpha Pallas для получения комплекса протеолитических ферментов / O.A. Судник //РыбПром, 2009. -№2. -С. 54-55.

2. Судник O.A. Протеолитические ферменты дрейссены и технология их получения / О.А.Судник, A.C. Лысова, О Л. Мезенова // Известия вузов. Пищевая технология, 2009.-№4. -С. 54-56.

В других изданиях:

3. Лысова A.C. Изучение технохимической характеристики и активности протеолитических ферментов дрейссены / A.C. Лысова, O.A. Судник // Материалы научной конференции «Инновации в науке и образовании - 2004», посвященной 10-летию КГТУ,- Калининград, 2004,- С.103-104.

4. Лысова A.C. Технология получения ферментного препарата из моллюска дрейссены (.Dreissena polymorpha Pallas) / A.C. Лысова, O.A. Судник // Тезисы НПК «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социатьных проблем».- М-, 2005,- С. 51-52.

5. Лысова A.C. Изучение характеристики двустворчатого моллюска Dreissena polymorpha Pallas как нового источника ферментсодержащего сырья / A.C. Лысова, O.A. Судник // Рыбная промышленность, 2007.- №1.-С. 20-22.

6. Лысова A.C. Обоснование технологии ферментного препарата из моллюска дрейссены / A.C. Лысова, O.A. Судник // Материалы МНК ППС и студентов вуза «Социально-ориентированная экономика Калининградского региона: Проблемы и перспективы развития»,- М.: АНОВПОЦС РФ, 2007.-С. 147-152.

7. Судник O.A. Обоснование режимов хранения дрейссены - сырца / O.A. Судник, A.C. Лысова // Материалы НПК «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы»,- М., 2006.-С. 113-114.

8. Судник O.A. Влияние сезона вылова на активность протеолитических ферментов двустворчатого моллюска Dreissena polymorpha Pallas / O.A. Судник, A.C. Лысова // Материалы пятого съезда ОБР им. Ю.А. Овчинникова.- М., 2008.-С. 164165.

9. Судник O.A. Характеристика протеолитических комплексов ферментов двустворчатого моллюска дрейссены (,Dreissena polymoprpha Pallas) I O.A. Судник, A.C. Лысова // Вестник молодежной науки.- Калининград, 2009.-С. 195-199.

10. Судник O.A. Применение математического планирования эксперимента при разработке технологии получения комплекса протеолитических ферментных препаратов МНК / O.A. Судник, A.C. Лысова // «Олимпиада 2014: Технологические и экологиечекие аспекты производства продуктов здорового питания».- Краснодар, 2009.-С. 291-292.

11. Судник O.A. Оптимизация технологии получения протеолитических ферментных препаратов из двустворчатого моллюска / O.A. Судник, A.C. Лысова // VII Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании -2009».-Калининград:ФГОУ ВПО КГТУ, 2009.-С. 358-360.

Заказ № ¿О . Подл, в печать 12.11.2009. Формат 60x84/16 Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 90 экз.

Отпечатано УОП ФГОУ ВПО «КГТУ». Калининград, Советский пр-кт, 1.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Основные свойства ферментов, механизм их действия.

1.2 Характеристика ферментсодержащего сырья.

1.3 Способы получения ферментных препаратов протеолитического действия и их применение в промышленности.

1.4 Характеристика двустворчатого моллюска (Dreissena polymorpha

Pallas) как перспективного источника получения ферментов.

ГЛАВА 2. ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА, ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Схема исследований.

2.2 Объект и методы исследований.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Исследование био- и техно-химических показателей моллюска дрейссены.

3.1.1 Изучение химического состава и протеолитической активности ферментов мягкого тела дрейссены.

3.1.2 Определение способов и сроков холодильного хранения дрейссены.

3.1.3 Исследование влияния рН среды, температуры и сезона вылова на изменение активности протеолитических ферментов дрейссены.

3.2 Моделирование и оптимизация технологического процесса получения ферментного препарата.

3.3 Технология получения ферментного препарата «Протофермол» из моллюска дрейссены.

3.4 Исследование показателей качества ферментного препарата.

3.5 Обоснование влияния дозировки ферментного препарата на скорость процесса созревания рыбных пресервов.

3.6 Производственные испытания ферментного препарата в технологии рыбных пресервов.

3.7 Оценка эффективности разработанной технологии.

ВЫВОДЫ.

Актуальность работы. В современной биотехнологии одно из видных мест принадлежит ферментам, которые широко используются в различных областях промышленности (пищевая, текстильная, целлюлозно-бумажная, химическая, фармацевтическая и др.), в сельском хозяйстве (кормовые добавки, ветеринарные препараты), в медицине.

Несмотря на актуальность применения ферментных препаратов, отечественная промышленность заметно отстает по объему производства и областям применения ферментных препаратов от ведущих стран мира (США, Япония, Дания, Нидерланды) [35]. Объяснением данного факта является их ограниченная доступность, отсутствие в достаточном количестве исходного сырья, высокая цена.

Источниками получения ферментных препаратов являются: растительное сырье, органы и ткани наземных животных, микроорганизмы, гидробионты. Протеиназы растительного происхождения (фицин, бромелин, папаин) наиболее часто практикуется в южных странах: Индия, Бразилия, Новая Зеландия, реже в нашем регионе. Необходимо отметить трудоемкость сбора и консервирования сырья (поджелудочная железа, слизистые оболочки, семенники половозрелых животных) на мясоперерабатывающих комбинатах для получения ферментных препаратов. В связи с тем, что из поджелудочной железы получают, главным образом, инсулин, существует проблема обеспечения этим сырьем производство ферментных препаратов. В настоящее время широкое применение нашли ферменты микробного происхождения, но они не всегда дают нужные результаты при созревании соленой рыбопродукции, не исключена возможность их остаточной обсемененности [191]. Поэтому поиск новых доступных крупномасштабных источников ферментсодержащего сырья является весьма актуальным.

Вопросами совершенствования производства и применения ферментных препаратов занимались многие ученые: Грачева И.М., Черногорцев А.П., Слуцкая Т. Н., Шендерюк В.И., Константинова Л. Л., Паукова Л. М., Лысова

А.С., Некрасова Г.Т., Новикова М.В., Новиков В.Ю., Мухин В.А., Пивненко Т.Н., Разумовская Р.Г., Байдалинова JLC., Цибизова М.Е, Бердышев Г.Д., Сахаров И.Ю. и ряд других исследователей. В работах этих ученых показано, что ферментная система щдробионтов содержит высокоактивные протеолитические ферменты, которые могут найти широкое применение в различных отраслях народного хозяйства. Эти ферменты, используются в пищевой промышленности при производстве белковых концентратов, изолятов, гидролизатов, белковых ферментативных масс, соусов и др. Применение коллагеназы облегчает удаление кожи с плавников ската, кальмаров, темной пленки с брюшной полости у ряда рыб, снятие чешуи, очистку креветок от панциря и др. Мышечная ткань целого ряда объектов рыбного промысла (пеламида, салака, тунец, судак, хек, путассу и др.), которые могли бы составить сырьевую базу для производства слабосоленой деликатесной продукции, имеет низкий уровень активности собственных протеиназ, что не позволяет достичь нужной степени созревания без дополнительного внесения протеолитических ферментных препаратов, интенсифицирующих процесс созревания [8].

Ферментные препараты, получаемые из гидробионтов, содержат оптимальную композицию ферментов, которые мягко и последовательно расщепляют белки рыб до компонентов, формирующих традиционный букет, свойственный созревшему продукту. Наибольшую ферментативную активность имеют нерыбные объекты промысла, в том числе двустворчатые моллюски [8, 129, 163].

В водах Каспийского и Аральского морей, около Балканского полуострова, в бассейнах Азовского, Чёрного, Балтийского морей, в Рыбинском, Угличском, Горьковском, Иваньковском Учинском, Саратовском, Куйбышевском и Кременчугском водохранилищах, реках Кольского полуострова и Карелии, в водоемах практически всей Европы, Северной Америки, в том числе и в Великих озерах, в Калининградском регионе (Куршском и Вислинском заливах, Виштынецком и других озерах области) в большом количестве обитает недоиспользуемый в промышленности двустворчатый моллюск дрейссена (Dreissena polymorpha Pallas, 1771/ Исследованию расселения дрейссены посвящены работы ряда ученых: Аристовой [5], Ворошиловой [29], Протасова с соавт. [109], Старобогатов [137], Щербина [170], Джонсона с соавт. [192] и др. Принимая во внимание существующие запасы дрейссены, её высокую способность к размножению и образованию значительных скоплений на небольшой площади [46, 110, 123, 81, 171, 170], можно констатировать, что существуют широкие возможности для промысла этого моллюска и его прикладного использования.

Ранее из дрейссены был выделен фермент 5-фосфодиэстераза, рекомендованный для применения в медицине в качестве лечебного препарата [100]. Ведутся работы по получению белковых гидролизатов из моллюска дрейссены различного происхождения, которые могут найти широкое применение в промышленности, в том числе пищевой, микробиологической, ветеринарной и медицинской [91]. Однако в настоящее время отсутствуют исследования по получению и применению протеолитического ферментного препарата из моллюска дрейссены, отсутствуют литературные данные по ее заготовке и хранению, рН -активности, влиянию температуры, сезонным изменениям активности протеолитических ферментов дрейссены. Принимая во внимание выше сказанное, а также биотехнологический потенциал дрейссены, представляется целесообразным изучение этого моллюска как потенциального ферментсодержащего сырья и разработка технологии из него ферментного препарата протеолитического действия.

Цель работы: разработать технологию протеолитического ферментного препарата из нового вида сырья — двустворчатого моллюска дрейссена (Dreissena polymorpha Pallas,)

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- исследовать био- и техно-химические показатели дрейссены;

- установить способы и сроки холодильного хранения дрейссены;

- исследовать влияние температуры, рН и сезона вылова на активность протеолитических ферментов моллюска; обосновать технологию получения ферментного препарата протеолитического действия из моллюска дрейссены;

- разработать технологию получения ферментного препарата из дрейссены и определить его качественные показатели; провести производственные испытания полученного ферментного препарата в качестве созревателя в технологии рыбных пресервов;

- оценить эффективность внедрения разработанной технологии получения ферментного препарата из дрейссены;

- разработать проекты технологической инструкции и технических условий на ферментный препарат «Протофермол» из моллюска дрейссены.

Научная новизна работы. Впервые разработана технология ферментного препарата протеолитического действия из дрейссены (Dreissena polymorpha), взятого из озера Форелевое Калининградской области и изучена его био — и технохимическая характеристика. Установлены сроки и условия холодильного хранения дрейссены. Изучено влияние температуры, рН, сезона вылова на активность протеолитических ферментов дрейссены, обоснован диапазон данных характеристик, позволяющий наиболее полно использовать биотехнологический потенциал моллюска. Получена математическая модель ключевого процесса автопротеолиза дрейссены в водно-спиртовом растворе, исследованы основные качественные характеристики ферментного препарата (протеолитическая активность, органолептические, физико-химические и микробиологические показатели). Показана эффективность применения ферментного препарата «Протофермол» для интенсификации процесса созревания пресервов из разделанной салаки.

Практическая значимость работы. Разработана технология получения ферментного препарата протеолитического действия из двустворчатого моллюска дрейссены, обладающего высокими качественными характеристиками и рекомендуемого в качестве созревателя для рыбной продукции (заявка на изобретение от 28.07.09. № 2009129081 «Способ получения ферментного препарата протеолитического действия»).

Разработан проект нормативной и технической документации на ферментный препарат «Протофермол» из моллюска дрейссены.

Показана эффективность применения ферментного препарата из дрейссены в качестве интенсификатора процесса созревания рыбных пресервов из слабо и несозревающего сырья.

Результаты экспериментальных исследований апробированы в производственных условиях в ООО «Рыбокомбинат «За Родину» (пос. Взморье Калининградской обл.), получили положительную оценку и рекомендованы к внедрению.

Положения, выносимые на защиту:

- результаты исследований био- и технохимических показателей моллюска дрейссены;

- влияние температуры, рН среды, сезона вылова дрейссены на активность её протеолитических ферментов;

- обоснование технологических параметров получения ферментного препарата протеолитического действия из дрейссены.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены и обсуждены на МНК «Инновации в науке и образовании - 2004», посвященной 10-летию КГТУ (Калининград, 2004), НПК «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем» (Калининград, 2005), НПК «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы» (Москва, 2006), МНК ППС и студентов вуза «Социально-ориентированная экономика Калининградского региона: Проблемы и перспективы развития. М.: АНОВПОЦС РФ, 2007» (Москва, 2007), V съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2008), международной научно-практической конференции «Олимпиада 2014: Технологические и экологические аспекты производства продуктов здорового питания» (Краснодар, 2009), VII Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании — 2009» (Калининград, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из списка сокращений, введения, 3 глав, выводов, списка литературных источников и приложений. Работа изложена на 170 страницах компьютерного текста, содержит 12 таблиц, 14 рисунков и 7 приложений. Библиография включает 208 источников, из которых - 37 на иностранных языках. В приложениях представлены балловая шкала оценки качества пресервов, проекты ТИ и ТУ на ферментный препарат, акт производственных испытаний, протокол дегустационного совещания, исходные требования к оборудованию для производства ферментного препарата, расчет экономической эффективности разработанной технологии.

Благодарности. Приношу глубокую благодарность моему научному руководителю к.т.н. А.С. Лысовой за ценные советы и практическую помощь при выполнении работы; д.т.н. О.Я. Мезеновой за всестороннее внимание, практические советы, консультации и помощь по ходу работы; д.б.н. Р.Н. Буруковскому за внимание к работе, содействие при подборе литературы и полезные советы; к.т.н. Л.С. Байдалиновой за ценные замечания; к.б.н. С.А.Судник за душевную поддержку и всестороннюю помощь; И.В. Литвинову за терпение и поддержку в течение работы над диссертацией, а также помощь при сборе материала. Самую искреннюю благодарность хочу выразить моим родителям.

выводы

1. Исследована био- и техно-химическая характеристика дрейссены (Dreissena polymorpha Pallas), взятой из озера Форелевое Калининградской области. Установлено, что по химическому составу моллюск относится к белковым объектам промысла; протеолитическая активность мягкого тела дрейссены - 0,61 - 1,24 ед/г.

2. Определены способы и сроки холодильного хранения дрейссены. Установлено, что дрейссену можно хранить в охлажденном виде при температуре +4-2°С не более 12 часов, в мороженом - при температуре минус 20± 2°С - в течение пяти месяцев.

3. Определены диапазоны рН - активности протеолитических ферментов моллюска. Обнаружены два ясно выраженных оптимума — на участке рН 4,0-6,0 («пепсиновый»), второй - на участке рН 9,0-10,0 («трипсиновый»). Максимальная активность протеолитических ферментов моллюска обнаружена при рН 5,0.

4. Получены данные по влиянию температуры на активность протеолитических ферментов дрейссены. Установлено, что максимальная активность ферментов моллюска проявляется в диапазоне температур +45

- +55 °С.

5. Исследовано влияние сезона вылова на изменение активности протеолитических ферментов дрейссены. Установлено, что максимальная активность ферментов (7,5 мг%/час) проявляется в весенние месяцы (апрель-май), наименьшая (0,78-1,5 мг%/час) - в осенний посленерестовый период.

6. Оптимизированы параметры (температура, продолжительность) основного технологического процесса получения ферментного препарата

- автопротеолиза тканей дрейссены в водно-спиртовом растворе путем проведения математического моделирования по специальным алгоритмам ОЦКП второго порядка. Рациональные значения параметров процесса составили: продолжительность — от 36 до 40 ч, температура — от 42 до 47 °С.

7. Разработана технология получения ферментного препарата протеолитического действия «Протофермол» из целого моллюска дрейссены, исключающая трудоемкий процесс отделения мягкого тела от створок дрейссены; выход ферментного препарата составил 3,5% от массы исходного сырья.

8. Определены органолептические, физико-химические и микробиологические показатели качества ферментного препарата «Протофермол» подтверждающие его высокую протеолитическую активность (1,5-1,6 ед/г), стойкость при хранении и микробиологическую безопасность.

9. Показана целесообразность применения полученного ферментного препарата «Протофермол». Обоснована его дозировка для ускорения процесса созревания рыбных пресервов в качестве интенсификатора созревания. Наилучшие органолептические и физико-химические показатели качества пресервов были получены при дозировке ферментного препарата 4% от массы рыбы (пресервы созревали на 14-ые сутки хранения, при этом буферность составила 110 градусов).

10.Ферментный препарат апробирован в промышленных условиях на ООО «Рыбокомбинат «За Родину» и рекомендован специалистами предприятия к внедрению в качестве интенсификатора процесса созревания пресервов из слабо и несозревающего сырья.

11. Разработаны проекты технологической инструкции и технический условий на ферментный препарат «Протофермол» из моллюска дрейссены.

12. Проведена оценка экономической эффективности разработанной технологии. Срок окупаемости - четыре с половиной года при рентабельности производства - 25,0%. Прибыль от внедрения технологии ферментного препарата из моллюска дрейссены при объеме выпуска 25 т/год составляет более 3 млн. руб./год, что характеризует перспективность предложенной технологии ферментного препарата, а низкая себестоимость - 670 руб./ кг - доступность для потребителя.

1. Адлер Ю.П. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий. / Ю.П. Адлер, Е.В. Маркова, Ю.П. Грановский. М., 1976. -280с.

2. Антонов П.И. Устойчивость моллюсков Dreissena polymorpha (Pall.) к высыханию /П.И. Антонов // Автореф. докл. VIII Всесоюз. совещ. по изуч. моллюсков: Моллюски. Результаты и перспективы их исследований.- Л., 1987. С. 268-269.

3. Ахмичева. О. В. Использование энзимов при производстве мясных изделий / О. В. Ахмичева//Мясная индустрия.-2005.-№1.-С.35-36.

4. Аристова Г.И. Дрейссена Куршского залива и перспективы ее использования / Г.И. Аристова // Труды Калинингр. техн. ин-та рыб. промети и хоз-ва. — Калининград., 1968. вып. 20. - С. 17-21.

5. А.с. №1687213 СССР, бюл. №40, Маслова Г.В. Способ получения белкового гидролизата из гидробионтов / Г.В. Маслова, Е.Э. Егорова, Е.Э. Куприна, А.А. Прокошенков (СССР). 1991.

6. Асатиани B.C. Ферментные методы анализа/B.C. Асатини.- М., 1969.-127с.

7. Афонский Г.А. Влияние комплексного ферментного препарата пектофоетедина ГЗХ на рост телят / B.C. Асатиани // Новые аспекты участия БАВ в регуляции метаболизма и продуктивности с.х. животных: Тез. докл. Всесоюз. совещ.-Боровск., 1993.-С.36-37.

8. Байдалинова Л.С., Киселев В.И., Лысова А.С., Мезенова О.Я., Сергеева Н.Т., Степанцова Г.Е., Терещенко В.П. Биотехнология гидробионтов / под ред. О .Я. Мезенова., В.П. Терещенко. Калининград: КГТУ., 2004.-416с.

9. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментного катализа / И.В. Березин, К. Мартинек.-М.: Высшая школа., 1977.-280с.

10. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия / Под. Ред. С.С. Дебова.- М.: Медицина, 1983 .-752с.

11. П.Березов Т.Т. Применение ферментов в медицине / Т.Т. Березов // Соросовский образоват. журн.-Соросов., 1996.-№ З.-С. 23—27

12. Берникова Т.А. Озеро Форелевое / Т.А. Берникова // Очерки природы. -Калининград. 1999. -С. 90-91.

13. Бернхольд С. Структура и функции ферментов / Перевод с английского языка JI.M. Гинодмана.-М.: Мир.,1971.-336с.

14. Биргер Т.И. Метаболизм беспозвоночных в токсичной среде / Т.И. Биргер.-1979.- 147с.

15. Биргер Т.И., Маляревская А.Я. Изменение биохимического состава дрейссен в условиях зарегулированного стока Днепра / Т.И. Биргер, А.Я. Маляревская //Гидробиол. Журн.- 1975.- т. II.- № 3.-С.72-76.

16. Биргер Т.И., Маляревская А.Я. Биохимический состав некоторых видов пресноводных моллюсков и их использование рыбами/в кн.: И.М. Лихарев // Моллюски.-М.,1965.-С.40-42.

17. Бобровская Н.Д. Исследование активности протеолитических и липолитических ферментов криля. Технология переработки криля / Н.Д. Бобровская, А.В. Кардашев, В.П. Вайтман // ВНИРО:сб, науч.тр. / ВНИРО. -М., 1981. — С16-20.

18. Боярский Л.Г., Коршун В.П., Бикташев Р.У., Недзведский В.К. Значение ферментов в обмене веществ у животных/ Л.Г. Боярский, В.П. Коршун, Р.У. Бикташев, В.К. Недзведский // Ферментные препараты в кормление животных.-М., Россельхозиздат, 1985.-С.13-17.

19. Брей Д., Уайт К., Кинетика и термодинамика биохимических процессов / Д. Брей К. Уайт.- М., 1959.-261с.

20. Бреслер С.Е. Об активном центре ферментов / С.Е. Бреслер // в кн.: Тр. 5-го международ. Биохимич. Конгресса.-М., 1962.-С. 51-57.

21. Бурлакова Л.Е. Экология моллюска Dressena Polimorphs (Pallas) / Л.Е Бурлакова // Автореферат диссертации.-Минск, 1988.-168с.

22. Быковская Г.В. Использование ферментов в хлебопечении / Г.В. Быковская // Хлебопродукты.-2000.-№5.-С.43-45.

23. Веремеенко К.Н., Коваленко В.Н. Системная энзимотерапия. Теоретические основы, опыт клинического применения / К.Н. Веремеенко.- Киев.: Морион.,2000.- 320 с.

24. Ворошилова (Сергеева) И. С. Происхождение и популяционная структура переферических поселений Dreissena Polymorpha (Pallas, 1771) Северовосточной границы ареала вида / И.С. Ворошилова (Сергеева) // Автореферат диссертации.-Борок, 2008.-24с.

25. Гауровиц Ф. Химия и функции белков / Ф. Гауровиц .- М.: Мир., 1965.-531с.

26. ГОСТ 7453-86 Пресервы из разделанной рыбы. ТУ.-М., 1990.-26 с.

27. ГОСТ 20264.2-88 Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности. М.,1988.

28. ГОСТ 7636-85 Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные, водоросли и продукты их переработки. Методы анализа. -М., 1985.

29. ГОСТ 7631-85 Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний. -М., 1985.

30. ГОСТ 10444.12-88 Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов. -М., 1988.

31. ГОСТ Р 50474-93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий). -М., 1993.

32. ГОСТ Р 50480-93 Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Salmonella. -М., 1993.

33. ГОСТ 10444.15-94 Продукты пищевые. Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. -М., 1994.

34. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева, А.Ю. Кривова. М., 2000. -512с.

35. Диксон М. Ферменты: пер. с англ. / М.Диксон, Э. Уэбб М., 1982. - Т. 1-3. -935с.

36. Дин Р. Процессы распада в клетке.-М.:Мир, 1981.-120с.

37. Донец А.А. Исследование свойств и применение ферментного препарата коллагеназы из гепатопанкреаса камчатского краба в технологии мясных продуктов : Дис. канд. техн. наук / А.А. Донец.-Воронеж, 2002.-203с.

38. Дубровская Т.А. Биологически активные вещества рыбы и морепродуктов / Т.А. Дубровская // Обработка рыбы и морепродуктов: обзорная информация / ВНИЭРХ. М., 1990. - 69с.

39. Дудникова Е. А. Разработка гибкой малоотходной технологии переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов: дис. канд. биол. наук / Е.А. Дудникова. Москва, 2009.- 160с.

40. Ездаков Н.В. Применение ферментных припаратов в животноводстве / Н.В. Ездаков.-М.: Колос, 1976,- 210с.

41. Жадин В.И. Моллюски пресных и солоноватых вод СССР / В.И. Жадин.-М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1952,- 376с.

42. Зевина Г.Б. Обрастания в морях СССР / Г.Б. Зевина.- М., Изд. Москов. унта., 1972.- С. 149-152

43. Иголкина JI.A. Выделение препаратов катепсина из мышечной ткани рыб на специфических сорбентах / JI.A. Иголкина, Т.Н. Слуцкая // Известия вузов СССР. Пищевая технология. 1989. - № 4. - С.36 -40.

44. Изотов О.В. Разработка рецептуры и технологии производства быстрозамороженных мясных рубленых полуфабрикатов сиспользованием протеолитических ферментов гидробионтов и овощных наполнителей : Дис. . канд. техн. Наук / О.В. Изотов.- М, 2003 154с.

45. Истомина A.M. Распространение Дрейссны в водохранилищах республики Башкортостан / A.M. Истомина // 1-я Международная школа-конференции «Дрейссениды: эволюция, систематика, экология»,-Ярославль, 2008. —1. C.78-79.

46. Казакова О.В. Выделение катепсинов группы С с помощью хроматографии по сродству / О.В. Казакова, В.Н. Орехович // Биохимия. -1975.- Т 40. — вып 5.-С. 969-972.

47. D. polymorpha (Pall.) (Bivalvia, Dreissenidae): Систематика, экология, практическое значение. М.: Наука, 1994. - с. 180-195.

48. Карпевич А.Ф. Избранные труды: В 2-х т. / А.Ф. Карпеви // Эколого-физиологические особенности гидробионтов.-М.: ВНИРО, 1998. -т.2.-922с.

49. Каталог зарубежного технологического оборудования для обработки рыбы и морепродуктов. Вып. 5. - М., 1996. - 54 с.

50. Каталог зарубежного технологического оборудования для обработки рыбы и морепродуктов. Вып. 6. - М., 1997. - 48 с.

51. Кирпиченко М.Я. К экологии D. polymorpha Pallas в Цимлянском водохранилище /М.Я. Кирпиченко // Труды ин-та биол. внутр. вод.АН СССР.-1971.-вып. 21.-С. 142-154.

52. Козлова Н.А. Совершенствование промышленной технологии плодоовощных пюре и соков с применением ферментных препаратов : Дис. . канд. техн. наук /Н.А. Козлова.- М, 2006.-173с.

53. Константинова JI.JL, Пахомова К.И. К Вопросу изучения протеолитических ферментов сельди / J1.J1. Константинова, К.И. Пахомова // Труды ПИНРО. 1970. - Вып. 30.- С.66- 69.

54. Константинова Л.Л., Пахомова К.И. Применение ферментных препаратов для улучшения созревания соленой атлантической сельди / JI.JL Константинова, К.И. Пахомова // Труды ПИНРО.-1966.-вып. 18. С.53- 59

55. Кретович B.JI. Введение в энзимиологию / B.JI. Кретович. — М., 1986. -323 с.

56. Лагунов Л.Л. Пищевая ценность мидий и их использование/ Л.Л. Лагунов // Промысловые двустворчатые моллюски — мидии и их роль в экосистемах / Зоолог.ин-т АН СССР. Л., 1979. - С.80-81.

57. Леванидов И.П., Ионас Г.П., Слуцкая Т.Н. Технология соленых, копченых и вяленых рыбных продуктов.-М.:ВО "Агропромиздат", 1987.-160с.

58. Леонова А.П. Опыт применения ферментных препаратов при посоле сельди /А.П. Леонова // Рыбохозяйственные исследования в бассейне Балтийского моря. Рига,1968. - № 4.-С. 157-161.

59. Леонова А.П. Плоринь А.П. Особенности созревания соленой рыбы под влиянием ферментного препарата «Терризин ПК» / А.П. Леонов, А.П. Плоринь // Труды БалтНИРХ.-1962.-J\|b4. .-С.135-141.

60. Липатов Н.Н. Применение ферментологии при производстве мясных продуктов / Н.Н. Липатов, В.Г. Боресков, Д.М. Мамаева // Изв. вузов СССР. Пищевая технология.- 1981.-№ 5.-С.64-67.

61. Липсиц И.В. Коммерческое ценообразование: Учебник.-М.: Издательство БЕК, 2000.-368с.

62. Литвин Ф.Е. Коллагенолитические протеазы из гепатопанкреаса камчетского краба: выделение их свойства: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Ф.Е. Литвин.-М., 1993.-25с.

63. Локшина Л.А. Регуляторная роль протеолитических ферментов /Л.А. Локишна// Молекулярная биология.-1979.-Т.18.-С.162-184.

64. Локшина Л.А. Кальций-активируемые нейтральные протеиназы и их регуляторная роль / Л.А. Локшина // Вестник АМН СССР.-1986.-Т. 59, №8.-С. 59-68.

65. Лосякова Л.С., Мушникова Л.Н., Мишина З.Н. Разработка оптимального режима получения пектолитических ферментных препаратов / Л.С. Лосякова, Л.Н. Мушникова, З.Н. Мишина // Микробиосинтез.-1961.-№6.-С.12-13.

66. Луферов В.П. О пагоне прибрежья Рыбинского водохранилища / В.П. Луферов // Экология и биология пресноводных беспозвоночных/ Тр. Института биологии внутренних вод АН СССР.- Л.: Наука., 1975. вып. 8 (11).-С. 51-54.

67. Лысова А.С. Исследование процесса ферментации каспийской кильки с целью получения пищевого белкового концентрата: дис. канд. биол. наук / А.С. Лысова. Астрахань. - 1970.- 178с.

68. Лысова А.С. Технохимический контроль производства: Методические указания / А.С. Лысова. Калининград, КГТУ, 2007. - 133с.

69. Лысова А.С. Сравнительные данные по ферментированию кильки микробными ферментными препаратами и собственными протеазами./ А.С.Лысова, А.П.Черногорцев // Рефераты докладов и сообщений на 17-й научной конференции. Астрахань, Астррыбвтуз, 1966 - С. 13-14.

70. Лысова А.С. Применение ферментных препаратов для производства белковых гидролизатов из кильки /А.С Лысова, А.П. Черногорцев // Пищевая технология. -1968, Известия вузов СССР. №4.- С.34-36.

71. Лысова А.С. Скорость и состав продуктов протеолиза каспийской анчоусовидной кильки в присутствии ферментных препаратов/А.С. Лысова, А.П. Черногорцев// Рефераты докладов на 19-й научной конференции. Астрахань, Астрыбвтуз,1968. - С.13-14.

72. Лысова А.С. Изучение характеристики двустворчатого моллюска Dreissena polymorpha Pallas как нового источника ферментсодержащего сырья / Лысова А.С., Судник О.А.// Журнал Рыбная промышленность.-2007.- №1.-С. 20-22.

73. Львова А.А. Экология D. polymorpha {Pall.) Учинского водохранилища: Дис. канд. биол. наук / А.А. Львова. М. - 1977. - 114с.

74. Ляхов С.М. Работы Института биологии внутренних вод АН СССР по защите гидротехнических сооружений от обрастаний дрейссеной /С.М. Ляхов // Труды ин-та биол. внутр. вод.- 1964.- вып. 7 №10.- С.66-70.

75. Ляшенко А.В., Харченко Т.А. Годовая динамика энергетического обмена у Дрейссены. / А.В. Ляшенко, Т.А. Харченко // Гидробиологический журнал. М., 1989. - Т.25, №3. - С.58-63.

76. Мак- Джинис Дж. Ферменты в кормление для животных / Дж. Мак-Джинис // Новое в кормление с.х. животных.-М.Д958.-265с.

77. Мезенова О .Я. Моделирование и оптимизация технологических процессов производства продуктов питания путем математического планирования эксперимента /О.Я. Мезенова// Методические указания.- Калининград., 1995.- 50с.

78. Михеев В.П. О линейном росте Dreissena polymorpha Pallas в некоторых водохранилищах европейской части СССР / В.П. Михеев // Труды ин-та биол. внутр. вод. 1964. — вып. 7 (10). — С. 55-65.

79. Модянов А.В. Ферментные препараты в кормление животных / А.В. Модянов.-М.:Колос, 1973.-160с.

80. Моисеенко Л.Ф.Производство пектолитического ферментного препарата и применение его при изготовлении виноградных вин и соков: Дис.канд.техн.наук / Л.Ф. Моисеенко.-Краснодар.,1966.-210с.

81. Мосс Д. Ферменты / Перевод с английского языка.-М.:Мир, 1970.- 182с.

82. Мухин В.А Разработка стратегии получения ферметативных белковых гидролизатов из тканей морских гидробионтов: дис. канд. биол. наук / В.А. Мухин.- Москва 2003

83. Мухин В.А., Новиков В.Ю. Протеолиз и протеолитические ферменты в тканях морских беспозвоночных/В. А. Мухин, В.Ю. Новиков. — Мурманск:Изд-во ПИНРО, 2002.-118с.

84. Назыров А.Д. Биоаккумуляция тяжелых металлов, диоксинов и влияние на гематологические, биохимические показатели гидробионтов р. Уфа / А.Д. Назыров // Автореферат диссертации Уфа, 2003. - 23 с.

85. Нгуен Х.И., Новикова М.В., Хамзина А.К. Получение гидролизата из пресноводного моллюска дрейссены / Х.И.Нгуен, М.В.Новикова, А.К.Хамзина // РЫБпром.-М., 2007.-вып. 4.-С.14-15.

86. Нгуен Х.И. Разработка технологии ферментативных гидролизатов из пресноводного моллюска дрейссена (Dreissena polymorpha Pallas) изеленой мидии (Perna Viridis) / Х.И. Нгуен // Автореферат диссертации.-М.- 2009.-25е.

87. Нейрат Г. Некоторые соображения о структуре и функции протеолитических ферментов / Г. Нейрат // Труды V Межд. биохим. конгр., Молекулярные основы действия и торможения ферментов.-1961. С. 84-89.

88. Неманова Ю.В. Обоснование подбора ферментных препаратов для биохимических способов подготовки льняных текстильных материалов : Дис. . канд. техн. наук / Ю.В. Неманова.- Иваново, 2005.- 200с.

89. Ноздрина Т.Д. Модификация низкосортного мясного сырья протеолитическими ферментами гидробионтов: дис. канд. техн. наук / Т.Д. Ноздрина.-М., 1996.-120с.

90. Обработка рыбы и морепродуктов / Под ред. JI.M. Новолоцкой // Обзорная информация.-М.,1972.-вып.6. С. 37-43.

91. Павловская В.В. экологические аспекты реакции моллюсков Dreissena polymorpha (Pallas, 1771) на действие ионов тяжелых металлов: дис. канд. биол. наук / В.В. Павловская. Калининград.-2007. - 102с.

92. Панченко Н.И., Гусева Н.Р., Масленникова Н.К., и др. Лаб. диагностика / Н.И. Панченко, Н.Р. Гусева, Н.К. Масленникова.-1993.-№4.-С. 37-41.

93. Пат. 566589 СССР, Способ получения 5 '-фосфодиэстеразы / Г.Д. Бердышев, Н.В. Югай, Н.А. Луценко (СССР).-1977.

94. Паукова JI.M. Разработка технологии ферментных препаратов из криля: дис. канд. биол. наук / JI.M. Наукова — М., 1988. 24 с.

95. Пивненко Т.Н. Технология белковых гидролизатов и продуктов на их основе / Т.Н. Пивненко.-1967.165с.

96. Пивненко Т.Н., Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Получение и характеристика белковых гидролизатов с использованием ферментных препаратов различной специфичности /Т.Н. Пивненко, Ю.М. Позднякова, В.В. Давидович //Изв. ТИНРО-центра.-1997.-Т.120.-С.23-31.

97. Полыгина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева Л.В. Определение активности ферментов / Г.В. Полыгина, B.C. Чередниченко, Л.В. Римарева // Справочник.- М.:ДеЛи принт, 2003.-375с.

98. Постановление Совета Министров СССР N 1072 ."О единых нормах амортизационных отчислений на полное восстановление основных фондов народного хозяйства СССР ".-1990

99. Протасов А.А., Афанасьев С.А. Основные типы сообществ дрейссены в перифитоне / А.А. Протасов, С.А. Афанасьев // Гидробиологический журнал 1990.-Т.26, вып. 4.-С. 15-22

100. Пряничникова Е.Г. Динамика размерно-весовой структуры дрейссенид Волжского плеса Рыбинского водохранилища / Е.Г. Пряничникова // 1-я

101. Международная школа-конференции «Дрейссениды: эволюция, систематика, экология—Ярославль, 2008. — С. 116-119.

102. Пятышина Е. В. Продуктивность растущего молодняка овец при включении в состав комбикормов отходов пивоварения и ферментных препаратов : дис. канд. биол. наук / Е.В. Пятышина.- М., 2004.-131 с.

103. Разумовская Р.Г. Применение протосубтилина для удаления кожи рыб и получения белковой массы (фарша) / Р.Г. Разумовская, А.Т. Черногорцев // Известия вузов. СССР. Пищевая технология. 1976. - № 4, - С. 76-79.

104. Ратушный А.С. Применение ферментных препаратов для обработки мяса /А.С. Ратушный.-М.:Пищевая пром-ть,1976. С. 54-59.

105. Реутов Р.В. Эффективность использования ферментных препаратов отечественного и зарубежного производства в кормлении цыплят-бройлеров : Дис. канд. с.-х. наук / Р.В. Реутов .-Курск, 2005.-122 с.

106. Римарева JI.B. Перспективы использования протеолитических ферментных препаратов / JI.B. Римарева // Пищевая промышленность.-1996.- № 3.-С.44-45.

107. Савельева Т.А., Савельев С.А., Батчаев А.Ю. Роль ферментов в производстве твердых сыров / Т.А. Савельева, С.А. Савельев, А.Ю. Батчаев// Сыроделие и маслоделие.-2003.-№3.- С.13-15.

108. Садыхова И.А. Биология мидий / И.А. Садыхова.-М.ВНИРО., 1964.-44с.

109. СанПиН 2.3.2.1293-03 Гигиенические требования по применению пищевых добавок. — М., 2003.

110. СанПин 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов.-М., 2001.

111. СанПиН 2.3.2.1324-03 Гигиенические требования к срокам годности и условиям хранения пищевых продуктов.- М.: РИОР, 2003 .-18с.

112. Санжак Ю.О., Лященко А.В. Структурные характеристики дрейссены Киевского участка реки Днепр / Ю.О. Санжак // 1-я Международная школа-конференции «Дрейссениды: эволюция, систематика, экология».-Ярославль, 2008. С. 119-124.

113. Сафронова Т.М. Органолептическая оценка рыбной продукции /Т.М. Сафронова. — М.: -Агропромиздат., 1985.-216с.

114. Сахаров И.Ю. Выделение и исследование ферментов из морских организмов и некоторые аспекты их применения: Автореф. дис. . докт. хим. наук / И.Ю. Сахаров.-М., 1992.-47с.

115. Сборник технологических инструкций по производству рыбных консервов и пресервов/ Гипрорыбфлот.-Л.,1989.-часть III, IV, V.-218c.

116. Скиркявичене З.Ю. Дрейссена (Dreissena polymorpha Pallas) залива Курппо-Марес, её биохимический состав и кормовое значение: дис. канд. биол. наук / З.Ю. Скиркявичене.- Петрозаводск, 1974.-22с.

117. Слуцкая Т.Н. Выделение катепсина D мышечной ткани рыб / Т.Н. Слуцкая, Л.А. Иголкина, Е.В.Соколова // Прикладная биохимия и микробиология.-1987. Т 23.- вып 4. - С. 447-452.

118. Слуцкая Т.Н. Протеолитические ферменты мышечной ткани и внутренностей рыб / Т.Н. Слуцкая// Технология гидробионтов.-Влидивосток. :ТИНРО., 1987.-С.4-21.

119. Соколова Н.Ю., Извекова Э.И., Львова А.А., Сахарова М.И. Состав, распределение и сезонная динамика численности и биомассы бентоса / Н.Ю. Соколова, Э.И. Извекова, А.А. Львова, М.И. Сахарова // Бентос Учинского водохранилища. М.: Наука, 1980. — С.5-20.

120. Спиридонов А.А. Планирование эксперимента: уч. пособие / А.А. Спиридонов, Н.Г. Васильев. Свердловск, 1975,- 150 с.

121. Справочник по технологическому рыбообрабатывающему оборудованию отечественного производства для механизации и автоматизации производственных процессов обработки рыбы и .нерыбных объектов промысла в 2-ух книгах. — Калининград, 1991 .-213с.

122. Старобогатов Я.И. Систематика и палеонтология / Я.И. Старобогатов // Дрейссена Dreissena polymorpha (Pall.) (Bivalvia, Dreissenidae): Систематика, экология, практическое значение. М.: Наука, - 1994. — С.18-46.

123. Старобогатов Я.И., Андреева С.И., Биочино Г.И.Протасов А.А. идр. Дрейссена Dreissena polymorpha (Pallas),(Bivalvia,Dreissenidae) / Под ред. Я.И.Старобогатова// Систематика, экология, практическое значение.-М.: Наука, 1994.-240с.

124. Старобогатов Я.И. Раки, моллюски / Я.И. Старобогатов.- Л.: Лениздат, 1982.- 126с.

125. Судник О.А. Обоснование режимов хранения дрейссены — сырца / Судник О.А., Лысова А.С. // Материалы НПК «Пищевая и морскаябиотехнология: проблемы и перспективы».- М.:Макс- пресс, 2006.-С. 113114.

126. Судник О.А. Влияние сезона вылова на активность протеолитических ферментов двустворчатого моллюска Dreissena Polymorpha Pallas / Судник О.А., Лысова А.С. // Материалы пятого съезда ОБР им. Ю.А. Овчинникова.-М.,2008.-С. 164-165.

127. Судник О.А. Характеристика протолитических комплексов ферментов двутворчатого моллюска дрейссены (Dreissena Polymoprpha Pallas) /Судник О.А., Лысова А.С.// Вестник молодежной науки.-Калининград, 2009.-С.195-199.

128. Судник О.А. Перспективы использования двустворчатого моллюска Dreissena Polymorpha Pallas для получения комплекса протеолитических ферментов / О.А. Судник // Рыбпром .- 2009.-№2.-С. 54-55.

129. Судник О.А. Протеолитические ферменты дрейссены и технология их получения / Судник О.А., Лысова А.С., Мезенова О.Я. // Изв.вузов. Пищ. Технология.-2009.-№4.-с.54-56.

130. Талмуд Д.Я., Структурные превращения белковых молекул / Д.Я. Толмуд // Совещание по белку.- Л., 1948.-324с.

131. Терещенко В.П. Холодильная обработка водного сырья: учебное пособие / В.П. Терещенко.- Калининград: КГТУ, 1994.-151с.

132. Технология продуктов из гидробионтов /С.А. Артюхова, В.Д. Богданов, В.М. Дацун и др.: Под ред. Т.М. Сафроновой, В.И. Шендерюка. М., 2001.- 496 с.

133. Тимонина Л.Г. О липолитических и протеолитических ферментах кальмаров / Л.Г. Тимонина // Технология перспективных видов рыбопродукции: сборник научных трудов /АтлантНИРО. — Калининград, 1984. -С.14-17.

134. Уолтер Ч. Кинематика ферментных реакций. Открытие и важные системы.:Перевод с английского /Под ред. В.А. Яковлева.-М.: Мир.-1969.-213с.

135. Упаковка пищевых продуктов. Коулз Р., МакДауэлл Д., Кирван М.Дж.- СПб.: Профессия, 2008. 416с.

136. Учет затрат на производство.-М.:Главбух, 1999.-144с.

137. Ферейт Э. Структура и механизм действия ферментов / Перевод с английского Ю.Б. Гребенщиковой.-М.:Мир, 1980.- 432с.

138. Финансы в промышленности:Учебник /Д.С. Моляков, B.C. Бард, С.В. Большаков и др.; Под ред. Д.С. Молякова.-М.:Финансы и статистика, 1990.-224с.

139. Фомич Д.П. Перспективы пищевого использования двустворчатых черноморских моллюсков / Д.П. Фомич // Известия вузов. Пищевая технология. 2007.- №3.- С. 24-26.

140. Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимической адаптации.-М.,1977.-398с.

141. Черников М.П., Некоторые вопросы теории действия протеиназ /М.П. Черников // Успехи соврем. Биологии.- 1965,- Т 12 № 3.-С.34-42.

142. Черногорцев А.П., Исследование процесса созревания и хранения килечных пресервов (консервов): дис. канд. техн. наук / А.П. Черногорцев .-М., 1959.-258с.

143. Черногорцев А.П., Объективный показатель степени созревания кильки пряного посола / Черногорцев // Труды Асрыбвтуза.- Астрахань.-вып.З.-1956.С.54-54.

144. Черногорцев А.П. Переработка мелкой рыбы на основе ферментирования сырья/ А.П.Черногорцев. — М., 1973. — 151 с.

145. Черняховский М.Е. Природа России: жизнь животных. Беспозвоночные / М.Е. Черняховский.- М., 1999. 519с.

146. Чумаков В.П., Письменская В.Н., Ноздрина Т.Н. Новые ферментные препараты для обработки соединительной ткани / В.П. Чумаков, В.Н. Письменская, Т.Н. Ноздрина // Мясная промышленность.-1995.-№2.-С.45.56.

147. Швидкая З.П., Блинов Ю.Г. Технология и химия консервов и нерыбных объектов промысла дальневосточного бассейна/З.П. Швидкая, Ю.Г. Блинов// ТИНРО центр.-Влаидвосток., 1988.-118с.

148. Шендерюк В.И. Научные основы использования комплексов пептидгидролаз в технологии рыбных продуктов / В.И. Шендерюк // Автореф. дис. д.т.н.-М.,1984.-42с.

149. Шендерюк В.И. Технология ферментного препарата "Океан" /В.И. Шендерюк, Г.Т. Некрасова // Совершенствование производства соленых рыбопродуктов из новых видов сырья: тезисы доклада Всесоюзной конференции / АтлантНИРО .- Калининград, 1979.- С. 31-33.

150. Шендерюк В.И. Термостабильность комплекса протеолитических ферментов пищеварительного тракта рыб при естественном значении рН /В.И. Шендерюк, Г.Т. Некрасова // Труды АтлантНИРО.-Калининград, 1973.-Вып. 54.-С. 13-16.

151. Шкорбатов Г.Л. Методы изучения двухстворчатых моллюсков /Г.Л. Шкорбатов, Я.И. Сторобогатов // Зоологический ин-т АН СССР.-Л.,1990,-205с.

152. Bias R. & Karbe Bioaccumulation and partitioning of Cadmium within the freshwater mussel Dreissena polymorpha Pallas /R. Bias & Karbe// International Revue der Gesamten Hydrobiologie.- 1985.-V70 (l).-P.l 13-125.

153. Bleeker, E.A.J., M.H.S. Kraak & C. Davids Ecotoxity of lead to the zebra mussel Dreissena polymorpha, Pallas /E.AJ. Bleeker, M.H.S. Kraak & C. Davids//Hidrobiological Bulletin.- 1992.-V25 (3).- P. 233-236.

154. Bohley P. Intracellular proteolysis / P. Bohley// Hydrolitic enzymes. Biomedical divison.-1987.-P. 307.

155. Borcendirg J. Nhe annual reproductive cycle of the freshwater mussel Dreissena polymorpha Pallas in lakes / J. Borcendirg// Oecologia.-1991.-V.87(2).-P. 208-218.

156. Borcendirg J. Morphometric changes in relation to the annual reproductive cycle in Dreissena polymorpha-a prereguisite for biomonitoring studies with zebra mussels / Borcendirg J.// VCH Publishers, Deerfield Beach.- Florida U.S.A.,1992.- P. 262.

157. Boyer P.D., Lardy H., Myrback K. The Enzymes / P.D Boyer, H. Lardy, K. Myrback // Kinetics, Thermodynamics, Mechanism, Academic Press.-1959.- V 4.

158. Burky A.J., Burky K.A. Seasonal respiratory variation and acclimation in the Pea clam, Pisidium walkeri Sterki / A. J. Burky, K.A. Burky // Сотр. Biochem. And physiol. 1976. -V. 55. - P. 109 -114.

159. Comparison of the properties of m-calpain from tilapia and grass shrimp muscles / Jeng H.W., Wei Ch.M., Jong Ch.S. et al // J. of Agrigultural and Food Chem.-1993.-V.41,№9.-P.1379-1384.

160. Dabrovski К., Glogowski J. Studies on the proteolytic emymes of invertebrates constituting fish food / K. Dabrovski, J. Glogowski // Hydrobiologia. 1977. -V. 52 №(2-3). - P. 171-174.

161. Foltman B. Gastric proteinases-structure, function, evolution and mechanism of action/ B. Foltman // Essays in Biochem.-1981.-V.17.-P.52-84.

162. Galperina, G.E. Study of the growth of bivalve mollusks /G.E. Galperina // Hydrobiological Journal.-1975.-V.l 1(6).- P.75-80.

163. Gildberg A. Purification and characterization of cathepsin D from the digestive gland of the pelagic squid Todarodes sagitatus / A. Gildberg // J. Sci. Food Agric.-1987.-V.39.-P.85-94.

164. Gontya, F.A. Some results of the studies of mollusks from wsterbodies of the Dniester drainage /F.A. Gontya // MalacologicalReview.-1978.-V.l 1(1-2).-P.88.

165. Grimble G.K., Silk D.B.A. Milk protein and entreat and parenteral feeding in disease / G.K. Grimble, D.B.A. Silk // Milk proteins: nutritional, functional and technological aspects.- Steincopft Vergal, Darmstagt, Germany.-1989.-P. 270-281

166. Johnson, L.E., Carlton, J.T. Post-establishment spread in large-scale invasionsm dispersal mechanisms of the zebra mussel Dreissena polymorpha / L.E. Johnson, J.T. Carlton // Ecology.- 1996.- V. 77., №6, P.1686-1690.

167. Kopecny I., Marounek M., Holub K. Overenni vkodnosti aplikale cellular Trichoderma viride do krmni ch daver prezykaven / I. Kopecny, M. Marounek, K. Holub // Zivocisna Vyroda.-1987.-V. 32.- №2.- P.587-592.

168. Leblans E.L., Gill T.A. Comparative study of proteolysis in ahort-finned (Illex illecebrosus) and long-finned (Loligo pealei) squid / E.L. Leblans, T.A. Gill // Сотр. Biochem. Physiol.-1982,- V. 73B.-P.201-210.

169. Michaellis L., M. Menten M. Biochem / L. Michaellis, M. Menten.-1913.-V 49.-P 333.

170. Mycles D.L., Scinner D.M. Ca -dependent proteolitic activity in Crab Clew muscle / L. Michaellis, D.M. Scinner // J. Biol. Chem.-1983.-V.258,№17.-P10474-1048.

171. Nachmansohn D., Wilson I. Advances in Enzymol./D. Nachmansohn, I. Wilson .-1951.-V. 12 .-P. 259.

172. Okada S., Aikawa T. Cathepsin D-like acid proteinase in the mantle of the marine mussel Mytilus edulis / S. Okada, T. Aikawa // Сотр. Biochem. Physiol.-1986.-V.48B.-P.333-341.

173. Phillips D.J.H., Rainbow P.S. Biomonitoring of trace aquatic contaminants / D.J.H. Phillips, P.S. Rainbow // Elsevier Applied Science.-London.-1992.- P. 371.

174. Smith E.L., Sumner J.B., Myrback K. The Enzymes, Academic Press / E.L. Smith, J.B. Sumner.-New York., 1951.-P. 120-147.

175. Toyohara H., Makinodan Y. Camparison of calpain II from carp muscle / H. Toyohara, Y. Makinodan // Сотр. Biochem. Physiol.-1989.-V.92B,№3.-P.577-581.

176. Tsai I.H., Lu P.J., Chuang J.L. The midgut chymotrypsins of shrimps (Penaeus monodon, Penaeus japonicas and Penaeus penicillatus) / I.H. Tsai, P.J. Lu, J.L. Chuang//Biochem. biophys. Acta.-199l.-V. 1080, №l.-P.59-67.

177. Vooys C.G. N. The influence of temperature and time of year on the oxygen uptake of sea mussel Mytilus edulis / C.G. N. Vooys // Mar. Biol. 1978. - V. 36 N 1.- P. 25-30.

178. Wang J.H., Su J.C., Jiang S.T. Stability of calcium-autolyzed calpain II from tilapia muscle (Tilapia nilitica x Tilapia urea) / J.H. Wan, J.C. Su, S.T. Jiang// J. Agricul. &Food Chem.-1992.-V.40,№4.-P.535-539.

179. Watson C.L., Morrow H.A., Brill R.W. Proteolisis of skeletal muscle in yellowfin tuna: Evidence of calpain activation / C.L. Watson, H.A. Morrow,. R.W. Brill // Сотр. Biochem. Physiol.-1992.-V.103B, №4.-P.881-887.