автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии белковых гидролизатов из вторичного сырья мясной промышленности

На правах рукописи

г> г- -( • У

од

БЕРДУТИНА Алла Викторовна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БЕЛКОВЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ ИЗ ВТОРИЧНОГО СЫРЬЯ МЯСНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных и рыбных продуктов

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва 2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте мясной промышленности (ВНИИМП) им. В.М.Горбатова

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор Неклюдов А.Д.

Официальные оппоненты: академик РАСХН,

доктор технических наук, профессор Липатов H.H.

доктор химических наук, профессор Крылов И.А.

Ведущая организация:

Московский Государственный университет прикладной биотехнологии

Защита состоится « ¿3

2000 г. в час.

на заседании диссертационного совета Д.020.62.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте мясной промышленности им. В.М.Горбатова по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИМП.

Автореферат разослан « ^^ » 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук,

старший научный сотрудник А.Н.Захаров

А СХП О Г\

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из основных задач современности-является вовлечение в сферу производства дополнительных источников сырья, создание комбинированных продуктов пищевого, медицинского и микробиологического назначения с оптимальным соотношением биологически активных веществ. Большими резервами увеличения выработки таких продуктов располагает мясная промышленность. Учитывая реальную ограниченность имеющихся природных ресурсов, актуальна разработка прогрессивных технологий, обеспечивающих максимальное использование белка животного происхождения.

В настоящее время большое внимание стали уделять рациональному использованию малоценных продуктов убоя и переработки скота для получения белковых гидролизатов, которые находят широкое применение в пищевой промышленности и медицине в качестве продукта для восстановления белкового баланса в организме, снижения явлений интоксикации и повышения активности иммунной системы, а также в производстве кормов и микробиологических сред.

Рациональное использование вторичного сырья мясной промышленности может привести не только к значительной экономии материальных ресурсов, но и позволит создать безотходные технологии, способствуя оздоровлению окружающей среды.

Работа проводилась с учетом трудов Горбатова В.М., Рогова И.А., Липатова H.H., Файвишевского МЛ., Сницаря А.И., Лимонова Г.Е., Гаевого Е.В., Волика В.Г., Либермана С.Г., и др., посвященных проблеме использования непищевых отходов мясной промышленности и изучению их биологической и питательной эффективности. Решение задач, поставленных в работе, основано на фундаментальных исследованиях в области гидролиза белка, выполненных Беликовым В.М., Ке-стнером А.И., Богатковым C.B., Неклюдовым А.Д., Латовым В.К., Крыловым И.А., Иванкиным А.Н. и др.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является создание технологии белковых гидролизатов из вторичного сырья мясоперерабатывающих предприятий, способных найти применение в микробиологической и других отраслях промышленности.

Для достижения поставленной цели предусматривается решение следующих задач:

• Изучить протеолитическую активность и термостабильность комплекса ферментов суспензии поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота, определить эффективность ее использования в качестве ферментного препарата для гидролиза белков.

• Определить параметры предварительной подготовки мясокостной сырья для ферментативного гидролиза.

• Вычислить кинетические параметры процесса гидролиза белко! мясокостного сырья ферментами поджелудочной железы, изучит! закономерности высвобождения отдельных аминокислот из полипептидных цепей.

• Изучить возможность повышения степени конверсии белков мясокостного сырья в результате дополнительного гидролиза прото-субтилином и протеазами дрожжей рода БассЬаготусеэ, и обогащения аминокислотного состава гидролизатов незаменимыми аминокислотами за счет сочетания различного белкового сырья.

• Вычислить кинетические параметры кислотного гидролиза остаточных белковых компонентов и кератинсодержащего сырья. Изучить особенности накопления и деструкции аминокислот в процессе термохимической деградации белков.

• Разработать лабораторную схему комплексной переработки вторичного сырья мясоперерабатывающей промышленности в амино-кислотно-пептидные смеси, способные найти применение в микробиологической и других отраслях промышленности.

• Провести масштабирование процесса ферментативного гидролиза мясокостного сырья и разработать технологию промышленного получения ферментативных гидролизатов.

Научная новизна. Определены параметры температурной активации ферментного комплекса поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота как технологического сырья для ферментативного гидролиза. Установлены кинетические закономерности накопления свободных аминокислот в процессах гидролиза белков мясокостного сырья ферментами поджелудочной железы свиней и сернокислотного гидролиза коллаген- и кератинсодержащего сырья. Определены условия повышения степени конверсии белка за счет применения ферментных препаратов с различной субстратной специфичностью. Установлено влияние сочетания различных видов сырья на сбалансированность аминокислотного состава гидролизатов.

Практическая ценность работы. Результаты научных исследований использованы при разработке промышленной технологии ферментативного гидролиза мясокостного сырья. Разработана нормативная документация, включающая технологический регламент на производство сухого гидролизата мясокостного фарша, утвержденный ВНИ-ИМПом в 1997 г. и технические условия ТУоп 6-09-10-0002-06-99 «Мясокостный гидролизат сухой», утвержденные ОАО «Мясокомбинат Раменский» 29 июня 1999 г. 2

Технология апробирована в цехе технических фабрикатов ОАО «Мясокомбинат Раменский». Полученные гидролизаты рекомендованы к использованию в составе питательных сред для роста мшсроорга---------

низмов.

Новизна предложенной технологии подтверждена тремя патентами РФ.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на конференциях; «Лечебно-профилактическое и детское питание» (С.-Петербург, 1996 г.), «Прогрессивные экологически безопасные технологии хранения и переработки сельскохозяйственной продукции для создания продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности» (г.Углич, 1996 г.), на 43-м Международном конгрессе ГСОМБТ (Окленд, Новая Зеландия, 1997 г.), на конференциях в Москве в 1999 г.: «Пища. Экология. Человек», «Химия и биотехнология пищевых веществ» (к 100-летию со дня рождения А.Н.Несмеянова), «Проблемы фундаментальных исследований в области обеспечения населения России здоровым питанием».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, технологической части, результатов проверки применения продуктов в микробиологии, выводов, списка литературы и приложений.

Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу, 18 рисунков, библиография включает 200 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель и определены направления исследований.

В первой главе приведен аналитический обзор научно-технической литературы по методам получения и очистки белковых гидролизатов, изложены основные подходы к описанию механизма гидролиза белков, показана взаимосвязь между степенью конверсии белка и физико-химическими свойствами гидролизатов, определены основные области применения белковых гидролизатов в зависимости от их состава и свойств. На основании проведенного анализа литературы сформулированы задачи исследований.

Во второй главе «Экспериментальные исследования. Объекты и методы» дана характеристика объектов исследования, описаны усло-

вия постановки экспериментов и методы определения изучаемых показателей.

Объектами исследований являлись: мясокостное сырье (МКС), цельная кровь крупного рогатого скота (к.р.с.), рогокопытное сырье (РКС), перопуховые отходы птицеперерабатывающей промышленности (ППО), мясокостный остаток после ферментативного гидролиза (МКО), поджелудочная железа свиней и к.р.с., биомасса остаточных пивных дрожжей рода Saccharomyces carlsbergensis, протосубтилины Г-10Х и Г-20Х.

Исследования проводили в соответствии со следующей схемой (рис.1). Массовую долю влаги, жира, золы определяли по стандартным методикам, содержание общего азота - по методу Кьельдаля, содержание азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов - формольным титрованием потенциометрически по Зеренсену, содержание свободных аминокислот и полный аминокислотный состав - методом ионообменной хроматографии на аминокислотном анализаторе «Eppendorf Biotronik LC-3000» (Германия), содержание триптофана - по Хорну, протеолитическую активность - модифицированным методом Ансона. Повторность опытов - трехкратная. Экспериментальные данные обрабатывали с использованием методов математической статистики.

Микробиологические исследования выполнены сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института контроля, сертификации, стандартизации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по ГОСТ 13805-76.

В разделах экспериментальной части работы обсуждены и обобщены результаты исследований, приведены данные производственных испытаний и выводы.

В приложении представлены копии документов, подтверждающие завершенность работы: отчеты об апробации разработанной технологии ферментативного гидролиза вторичного белоксодержащего сырья в промышленности, технологический регламент на производство сухого гидролизата мясокостного фарша, и технические условия ТУоп 6-09-10-0002-06-99.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение возможности применения суспензии поджелудочной железы убойных животных для гидролиза белка

Известно, что суспензия поджелудочной железы (СПЖ) используется для гидролиза белков крови с последующим получением препа-

4-11 1-7,10,12

Показатели: 1 - массовая доля влаги, 2 - массовая доля жира, 3 - массовая доля золы, 4 - содержание общего азота, 5 - содержание азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов, 6 - содержание свободных аминокислот, 7 -полный аминокислотный состав, 8 - протеолитическая активность, 9 - температура, 10-рН, 11-длительность, 12 - микробиологические показатели

Рис. 1. Схема проведения исследований

ратов для парентерального белкового питания. Однако относитель; низкая активность СПЖ не давала возможность за короткое время п лучить высокую степень расщепления белков. В связи с этим в рабо была предпринята попытка увеличить протеолитическую активное ферментного комплекса за счет подбора условий разбавления суспе зии и инкубирования ее при различных температурах.

Изучение термостабильности и протеолитической активное суспензии поджелудочной железы (СПЖ) к.р.с. и свиней в буфернъ растворах позволило рассчитать кинетические константы стабильн сти Ка и Ки„, а также определить энергию активации Еа и Е™а проце сов активации и инактивации ферментного комплекса СПЖ, предста ленные в табл. 1.

Таблица

Значения констант активации и энергии активации ферментного комплекса СПЖ свиней и к.р.с.

и о Активация ферментного комплекса СПЖ Инактивация ферментного комплекса СПЖ

Вид Температура Константа активации, Ках104, с' Е„ кДж/моль Константа инактивации, К„„х10\ с'! рИИ J-. а» кДж/моль

СПЖ свиней 45 50 55 4,57 ±0,13 5,63 ±0,18 8,65 ± 0,22 55,15 ±0,86 2,40 ± 0,03 3,27 ± 0,05 4,97 ± 0,07 60,24 ± 0,32

СПЖ 45 9,98 ± 0,93 1,02 + 0,02

к.р.с. 50 55 15,28± 0,92 25,58± 0,77 81,39 ±0,85 1,55 ±0,02 2,60 ± 0,05 81,21 ±0,45

В результате проделанной работы был найден способ активаци! ферментного комплекса СПЖ, заключающийся в получении суспензи! поджелудочной железы с гидромодулем 0,5 и последующем термоста тировании СПЖ к.р.с. и свиней при 45°С в течение 1,5 ч и при 50 °С 1 течение 2 ч соответственно. СПЖ к.р.с. и свиней имели рН-оптиму? 7,0. Активированные ферментные препараты СПЖ к.р.с. и свиней об ладали протеолитической активностью 6000 и 9000 ПЕ/г соответст венно.

С целью изучения эффективности использования ферментных препаратов СПЖ был проведен гидролиз 3% раствора сухого белкового экстракта мясокостного фарша панкреатином, а также неактивиро-

ванным~ и активированным ферментным - комплексом СПЖ- свиней_________

Применение ферментных препаратов СПЖ свиней обеспечивало выход свободных аминокислот на уровне 45-50%, что примерно в 1,3-1,5 раза выше, чем при использовании панкреатина, причем предварительная активация ферментного комплекса СПЖ повышала эффективность гидролиза.

Изучение ферментативного гидролиза вторичного сырья мясоперерабатывающей промышленности

В мясокостном сырье присутствует смесь белков различной химической структуры и биологической ценности с преобладанием коллагена, который, как известно, является трудногидролизуемым. Для повышения доступности белков действию протеолитических ферментов была проведена предварительная подготовка МКС к гидролизу, которая заключалась в нагревании измельченного МКС с водой в соотношении 1:2 (масс.) при 95-98 °С в течение 40-50 мин. При этом концентрация белков в водной фазе составляла 8-10%, а их аминокислотный состав был наиболее сбалансированным.

Одновременно происходило обезжиривание МКС, степень извлечения жира составила 50%.

Для осуществлена эффективного гидролиза белка необходимо правильно выбрать оптимальное соотношение фермента к субстрату. В результате серии экспериментов было установлено, что с увеличением содержания СПЖ в реакционной смеси степень гидролиза белков суспензии МКС возрастала до тех пор, пока соотношение белка фермента к белку субстрата не достигло значения 1:15. Именно с этим соотношением в дальнейшем и проводились все кинетические и другие исследования.

Для описания кинетических закономерностей протекания ферментативного гидролиза была использована следующая модель, предложенная в работах Кестнера А.И., Богаткова C.B. и Неклюдова А.Д.

(1978 г.), согласно которой основные эффективные кинетические характеристики процесса ферментативного гидролиза можно определить по уравнениям:

P/t=Vmax-Kt, (1)

InV = ln(P/t) = lnVmœ( -Kj t, (2)

KM = Vmax/K, (3)

где Р - концентрация расщепленных пептидных связей к моменту времени t, выраженная в данном случае в граммах условного азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов в литре реакционной смеси, г-л"1; Vmax- максимальная скорость гидролиза, гл''-c'1; К, - константа интенсивности протекания процесса гидролиза пептидных связей, с'1; Км -константа Михаэлиса, г-л"1.

Для процесса гидролиза обезжиренного МКС ферментами СПЖ были экспериментально определены зависимости накопления азота аминогрупп от времени при 40,45, 50, 55°С (рис.1).

На рис.2а представлено графическое определение максимальных скоростей реакции ферментативного гидролиза. Как видно из графиков, в результате линеаризации кинетических кривых гидролиза в координатах P/t = f(t) зависимости скоростей этих реакций носят сложный характер, причем могут быть условно выделены две стадии: "быстрая" и "медленная", которые имеют в этом случае псевдопервый порядок. Отрезки, отсекаемые на оси ординат, позволили определить максимальные скорости гидролиза Vmax, а отрезки, отсекаемые на оси абсцисс - эффективное время гидролиза. Зависимость логарифма текущих скоростей от времени (рис.2, уравн. 2) позволила определить константу интенсивности протекания процесса гидролиза К„ а значит, и "эффективную" константу Михаэлиса Км (уравн. 3).

Рассчитанные кинетические характеристики представлены в табл.2.

Таблица 2

Макрокинетические характеристики процесса гидролиза белков суспензии МКС ферментным комплексом СПЖ свиней

Макрокинети- Температура, °С

ческая характе- 40 45 50 55

ристика «Быстрая» стадия

Утак-104,г-л-'-с 2,53 ±0,17 3,20 ±0,28 3,87 ±0,38 4,25 ± 0,20

Ki-io'V 1,87 + 0,03 2,02 ± 0,07 2,75 + 0,17 2,75 ± 0,03

Км, г ■ л"' 1,36 ± 0,11 1,59 ±0,10 1,41 ±0,12 1,54 ±0,11

Еа, кДж/моль 29,83 ±0,81

«Медленная» стадия

Утах-104,г-л"'-с 0,93 ± 0,08 1,13 ±0,08 1,38 ±0,10 1,63 ±0,13

К;-104,с"' 0,35 ± 0,02 0,37 ± 0,02 0,50 ± 0,02 0,85 ± 0,03

Км.г-л'1 2,67 ±0,18 3,09 ± 0,20 2,77 ± 0,20 1,92 + 0,13

Еа, кДж/моль 32,20 ± 0,04

с 0,6 ]

0,4 | 0,2 -I

0,(

0 60 120 180 240 300 360 420 480 1, мин

Рис.1. Зависимость накопления продуктов гидролиза суспензии МКС ферментным комплексом СПЖ свиней при различных температурах, °С: 1 -40; 2 -45; 3-50; 4-55.

0,0 -ь

0 60 120 180 240 300 360 420 480

I , мин

• 40 оС X 45 оС ■ 50 оС * 55 оС

Рис.2а. Графическое определение максимальных кажущихся скоростей и эффективного времени ферментативного гидролиза

г, мин

• 40 оС х 45 оС ■ 50 оС * 55 оС

Рис. 26. Графическое определение констант интенсивности (б) процесса ферментативного гидролиза

Из рис. 1 и табл. 2 видно, что наиболее высокая степень конверсии белка достигалась при 45°С. Эффективное время гидролиза в этом случае составило 2,5 ч (рис.2б). Повышение температуры до 55°С приводило к снижению выхода свободного азота аминогрупп, что, скорее всего, связано с температурной инактивацией ферментного комплекса.

В данной работе была предпринята попытка изучить кинетические закономерности выхода каждой аминокислоты в отдельности в процессе ферментативного гидролиза. Такие сведения практически отсутствуют в литературе, хотя они могли бы приблизить исследователей к решению вопроса о направленном гидролизе и получению гидролизатов с заданным аминокислотным составом.

Аналогично накоплению азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов (рис.1, 2), кинетические кривые выхода различных аминокислот также удалось условно аппроксимировать двумя прямолинейными участками, характеризующими "быструю" и "медленную" стадии процесса.

Используя вышеизложенный подход, были вычислены макроки-нетические константы при различных температурах протекания процесса гидролиза, энергии активации для каждой аминокислоты в отдельности. Выход аминокислот определяли по отношению содержания свободной аминокислоты в гидролизате по истечении 7 ч процесса к ее общему содержанию в субстрате. В табл. 3 приведены эффективные кинетические константы накопления аминокислот в процессе гидролиза при 45°С на «быстрой» стадии.

Таблица 3

Эффективные макрокинетические константы, энергия активации и выход отдельных аминокислот в процессе ферментативного гидролиза при 45 °С на «быстрой» стадии

Ами- Уюахх ю4, К, х 10\с"' Км,г/100г Р Выход,

ноки- г/100г бел- белка кДж/моль %

слота ка -с'1

Незаменимые аминокислоты:

ИЛЕ 1,39 ±0,02 1,62 ±0,02 0,86±0,07 63,43 ± 0,33 21,9

ЛЕЙ 4,63 ±0,15 1,40 ±0,05 3,31±0,27 61,25 ±0,23 35,7

ЛИЗ 4,05 ±0,11 1,88 ±0,02 2,15±0,18 54,58 ±0,01 34,9

МЕТ 1,06 ±0,12 3,00 ± 0,33 0,35+0,03 62,21+3,51 -

ФЕН 2,74 ±0,01 0,98 ± 0,02 2,79±0,21 69,68 ± 0,50 37,9

ТИР'' 3,61+0,17 1,22 + 0,07 2,97±0,22 83,78 + 7,73 77,4

ТРЕ 0,95 ± 0,02 1,83 ±0,02 0,52±0,04 106,12+ 1,46 25,0

ВАЛ 2,30 ± 0,02 1,67 ±0,02 1,38±0,11 106,72 ±6,25 24,2

Заменимые аминокислоты:

АЛА 1,76 ±0,09 2,60 ±0,03 0,68±0,05 52,88 ±0,04 6,6

АРГ 5,01 ±0,06 1,37 ±0,02 3,66±0,29 81,19 ± 2,31 62,0

' АСП 0,49 + 0,02 2,67 ± 0,03 0,19±0,01 38,84 ±2,47 1,8

гис 2,82 ± 0,09 1,28 ±0,05 2,20±0,18 78,55 ±2,35 47,9

гли 0,41 ±0,02 1,60 ±0,02 0,26±0,02 38,69 ±0,02 1,4

ГЛУ 1,50 ±0,01 1,75 ± 0,02 0,86±0,06 67,60 ± 3,47 5,8

СЕР 1,21 ±0,03 2,38 ±0,02 0,51 ±0,04 50,06 ± 0,06 14,6

*' - Тирозин, являясь полунезаменимой аминокислотой, обычно учитывается в сумме с фенилаланином.

Оказалось, что предложенная кинетическая модель процесса позволяет удовлетворительно описать закономерности накопления

большинства аминокислот. Было установлено, что наиболее интенсивно происходило накопление аргинина, лизина, лейцина и тирозина, о чем свидетельствовали достаточно высокие значения Утах, как на быстрой, так и на медленной стадиях. Аналогично, но менее интенсивно, происходило высвобождение фенилаланина, гистидина и валина. Для гистидина, аргинина и тирозина выход через 7 ч при 45°С составил 48 - 77 %, а для валина, лизина, лейцина и фенилаланина 24-38 %.

Алании, серии и аспарагиновая кислота образовывались в процессе гидролиза преимущественно во время быстрой стадии. Выход аспарагиновой кислоты и глицина не превышал 2%.

Анализируя вышесказанное, можно предположить, что ферменты поджелудочной железы гидролизовали в первую очередь актомиозин, миозин, миоглобин и затем уже коллаген и родственные ему белки, о чем свидетельствует низкое содержание в гидролизатах глицина, ала-нина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, серина, а также пролина, т.е. тех аминокислот, которые преимущественно содержатся в коллагене.

По результатам изучения кинетики было предложено проводить процесс ферментативного гидролиза МКС при 45°С 4 часа.

Влияние сочетания различных видов белковых субстратов и ферментных препаратов на сбалансированность аминокислотного состава

Известно, что основным показателем качества для белковых гид-ролизатов является сбалансированность аминокислотного состава, выражаемая соотношением незаменимых и заменимых аминокислот (Е/Ы). Значения соотношения Е/Ы менее 0,3 свидетельствуют о низкой питательной эффективности белковых препаратов. В большинстве эталонных белков Е/Ы равно или близко к единице.

С целью повышения степени конверсии белка и сбалансированности аминокислотного состава гидролизатов был изучен гидролиз нескольких видов белковых субстратов различными сочетаниями ферментных препаратов. В качестве субстратов для гидролиза использовали обезжиренную суспензию МКС и ее смесь с боенской кровью. С целью увеличения степени конверсии белка гидролиз проводили последовательно ферментами разной субстратной специфичности, используя сочетания: активированный препарат СПЖ и протосубти-лин, активированная биомасса пивных дрожжей рода БассИагошусез саг1зЬег§епз15 и СПЖ.

Таблица 4

Содержание свободных аминокислот (св.) и полный аминокислотный состав (полн.) в опытных образцах, полученных в результате гидролиза вторичного сырья ферментными препаратами в разных сочетаниях, г/100 г ________________- -----------------белка '

Ами- Субстрат: обезжиренная суспензия МКС Ферментные препараты: Субстрат: МКС:кровь в соотношении 1:2 по белку Ферментные препараты:

нокислота СПЖ СПЖ и про-тосубтилин Дрожжи и СПЖ СПЖ Дрожжи и СПЖ

св. полн. С!!. полн. св. полн. СП. полн. св. полн.

{езаме-

шмые, I т.ч : 10,1 21,01 10,41 20,83 .17,6 33,8 14,51 36,4 20,65 41,4

"ШЕ 0,6 1,6 0,6 1,6 1,7 4,1 0,5 1,5 1,6 2,8

1ЕИ 2,1 3,9 2,1 3,7 4,4 7,4 3 8,3 4,4 8,6

ШЗ 2,1 3,3 2,3 3,1 1,3 2,7 2,7 7,7 2,5 9,0

ЛЕТ 0,7 1,1 0,7 1,1 1,1 1,3 1,1 1,2 1,0 0,6

ЩС*** 0,03 0,12 0,03 0,08 0,3 0,6 0,05 0,1 0,05 0,2

ОЕН 1,2 3,1 1,0 3,3 2,7 4,6 2,1 4,9 3,5 5,1

-ИР'") 0,5 2,1 0,5 2,1 2,1 2,9 0,9 2,7 2,3 2,7

'РЕ 1,6 2,3 1,4 2,4 1,1 3,2 1,0 3,2 1,8 4,5

тп 0,07 0,39 0,08 0,25 0,5 1,1 0,06 0,8 0,10 1,3

¡АЛ 1,2 3,1 1,7 3,2 2,4 5,9 3,1 6,0 3,4 6.6

аме-имые т ч ■ 6,5 64,8 12,8 64,6 17,0 59,1 17,2 56,2 19,8 52,0

ЛА 0,7 7,6 1,5 7,7 2,4 6,3 2,3 6,8 3,6 6,5

ЛТ 2,5 6,1 2,3 6,3 3,7 6,4 1,5 4,9 2,1 5.3

iCll 0.2 6,9 0,9 6,7 1,8 10,5 3,2 9,6 2,8 9,7

ис 1,4 7,9 1,2 7,6 1,5 3,9 1,6 4.9 3,3 4,7

ли 0,2 12,0 2,6 12,2 0,8 7,9 2,6 8,4 1,0 5.4

ЛУ 0,9 13,9 2,2 13,8 3,9 11,8 3,8 14,6 3,1 11,1

1РО 0,1 7,7 1,5 7,5 и 7,4 0,9 3,3 1,3 4,7

:ер 0,5 2,7 0,6 2,8 1,8 4,9 1,3 3,7 2,6 4.6

[того: 16,6 85,81 23,21 85,43 34,6 92,7 31,71 92,7 40,45 93,3

/N 1,44 0,31 0,78 0,31 0,91 0,54 0,80 0,62 0,93 0,75

'Отклонения в содержании аминокислот составляли ± 5%. ' — Цистин, являясь полунезаменимой аминокислотой, обычно учитывается в

сумме с метионином. *' - Тирозин, являясь полунезаменимой аминокислотой, обычно учитывается в сумме с фенилаланином.

Из табл. 4 видно, что применение протосубтилина в качестве дополнительного ферментного препарата повышало степень конверсии белков МКС с 30 до 40%, но не приводило к повышению питательной эффективности гидролизатов. Применение биомассы пивных дрожжей не только увеличивало степень конверсии белка до 46-48%, но и приводило к обогащению гидролизатов незаменимыми аминокислотами: изолейцином, лейцином, треонином, триптофаном и фенилаланином, так как дрожжи, в силу своей способности к автолизу одновременно являются и субстратом, и ферментным препаратом.

Добавление белков крови к субстрату МКС приводило к обогащению гидролизатов триптофаном и валином и увеличению Е/Ы до 0,62 и выше. Однако с ростом концентрации белков крови возникал и усиливался дисбаланс между изолейцином и лейцином, который удалось устранить, вводя в реакционную смесь пивные дрожжи.

Наилучшей сбалансированности аминокислотного состава (Е/Ы = 0,75) удалось достичь в результате гидролиза смеси белков МКС и крови в соотношении 1:2 ферментами дрожжевой биомассы и СПЖ. Степень конверсии белка составила 53-55%, выход свободных аминокислот 38-41%.

Изучение кислотного гидролиза субстратов, содержащих в своем составе коллаген и кератин

После ферментативного гидролиза МКС или его сочетания с кровью и дрожжевой биомассой и фильтрации гидролизата остается значительное количество твердых отходов, содержащих до 50 % белка в пересчете на сухое вещество. Утилизацию мясокостного остатка (МКО) целесообразно осуществлять методом кислотного гидролиза, который позволяет с высокой степенью конверсии расщеплять трудно гидролизуемые белки, в частности, коллаген.

Известно, что кислотный гидролиз приводит к разрушению некоторых аминокислот, поэтому представляло интерес оценить кинетически процесс высвобождения индивидуальных аминокислот в ходе гидролиза.

В работе изучен гидролиз МКО и кератинсодержащего сырья (рогокопытного и перопухового) растворами серной кислоты. В результате серии экспериментов по подбору оптимальной концентрации серной кислоты было установлено, что наибольший суммарный выход свободных аминокислот наблюдался при воздействии на белок 50% Н2504 для МКО и рогокопытного сырья (РКС), и 20-25% Н2504 для

перопуховых отходов (ГТПО). Поэтому кинетические исследования проводили, применяя серную кислоту указанных концентраций.

Кинетические зависимости накопления большинства аминокислот от продолжительности гидролиза при_100,.110 и 120°С имели видг характерный для реакций псёвдопервого порядка (рис.За).

а) б)

Рис. 3. Зависимость накопления лейцина от длительности гидролиза МКО 50% серной кислотой (а) и ее анаморфозы в полулогарифмических координатах (б) при температурах, °С: I - 100, 2 - 110, 3 - 120.

Макроконстанту скорости реакции (с"1) находили графически из уравнения 1п(Р 1 - Р) = 1п Рх. - ! как тангенс угла наклона прямой в координатах /Уи/У5^/ (РК - Р)] , !}, вычисленный по методу наименьших квадратов, где Р - концентрация продукта реакции в момент времени /, г/л; Рх- концентрация продукта реакции после завершения реакции, г/л (рис.Зб).

В табл.5 приведены некоторые макрокинетические константы накопления аминокислот, не претерпевающих окислительной деструкции в процессе кислотного гидролиза МКО, РКС и ППО.

Из табл.5 видно, что в процессе гидролиза изученных видов сырья наиболее быстро происходило накопление аспарагиновой и глута-миновой кислот, глицина, аланина, тирозина и фенилаланина. Высво-зождение валина, изолейцина, лейцина и треонина из коллагена происходило несколько быстрее, чем из кератинсодержащего сырья.

Таблица 5

Эффективные значения констант скоростей накопления отдельных аминокислот (кзфф) и энергии активации (Еа) в процессе гидролиза

Аминокислота Гидролиз МКО 50% Н2504 при 120°С Гидролиз РКС 50% Н2804 при 120 °С Гидролиз ППО 20% Н2504 при 110 °С

ЦфхЮ4, с"' Е» кДж/моль к^хШ4, с"1 Е„ кДж/моль кэ4фх104, с Еа, кДж/моль

Незаменимые аминокислоты:

ИЛЕ 1,15 ±0,02 18,0 ±0,3 0,83 ± 0,02 19,5 ±0,3 0,23 ±0,01 30,0 + 0,2

ЛЕЙ 1,57 ±0,02 30,7 ±0,2 1,46 ±0,03 19,8 ±0,2 0,47 ± 0,09 57,7+0,4

ЛИЗ 1,58 + 0,02 32,5 ±0,1 1,25 ±0,03 17,0 ±0,2 0,28 ± 0,03 64,7 ±0,5

ЦИС'1 - - 1,12 ±0,03 15,0 ±0,2 - -

ФЕН 2,05 ± 0,04 32,6 ± 0,5 1,80 ±0,02 15,0 ±0,1 1,28 ±0,02 36,9 ± 0,2

ТИР"' 1,93 + 0,03 33,5 ±0,2 1,98 ±0,02 16,6 ±0,3 1,50 ± 0,05 33,7 ±0,3

ТРЕ 2,10 ±0,02 22,0 ±0,1 1,12 ±0,02 15,1 ±0,1 0,42 ± 0,02 78,3 ± 0,5

ВАЛ 1,57 ±0,02 31,4 ±0,2 1,03 + 0,02 15,2 + 0,2 0,30 ± 0,02 31,0±0,4

Заменимые аминокислоты:

АЛА 1,40 ±0,03 18,9 ±0,5 1,47 ±0,03 18,6 ±0,1 0,68 ±0,03 73,6 ±0,6

АРГ 1,48 ±0,03 21,5 ±0,3 1,45 ±0,02 15,5 ±0,1 - -

АСП 2,17 ±0,02 21,2 ±0,2 1,40 ±0,03 11,6 ±0,2 1,20 ±0,02 59,6 ±0,5

ГЛИ 2,02 ±0,03 10,2 + 0,5 1,93 ±0,03 13,1+0,1 1,10 ±0,03 59,2 ±0,5

ГЛУ 1,53 ±0,02 23,4 ±0,1 1,47 ±0,03 12,8 + 0,2 0,57 ± 0,02 88,1 ±0,7

ПРО 1Д7±0,02 17,1 ±0,2 0,92 ± 0,03 16,0 ±0,4 - -

- Цистин, являясь полунезаменимой аминокислотой, обычно учитывается в сумме с метионином.

**' - Тирозин, являясь полунезаменимой аминокислотой, обычно учитывается в сумме с фенилаланином.

Во всех случаях отмечалась деструкция гистидина, серина и ме-тионина, причем степень разрушения последнего была наибольшей. Интересно отметить, деструкция цистина была замечена лишь при гидролизе МКО и ППО. Кинетические кривые накопления цистина в результате гидролиза РКС не имели максимума. Вероятно, скорость накопления цистина была выше скорости его разрушения из-за высокого содержания этой аминокислоты в РКС.

Рассмотрев кинетику накопления и разрушения аминокислот при кислотном гидролизе, были определены условия достижения наибольшей степени конверсии белка при сохранении лабильных амино-

кислот: 120°С, 5 ч, концентрация Н2Б04 50% (масс.) для МКО и РКС; и 110°С, 5 ч, концентрация Н2804 20% (масс.) для ППО.

Аминокислотный состав гидролизатов, полученных в этих условиях,

приведен в табл.6. __ __________________________

_____________________________________ ~~ Таблица 6

Содержание свободных аминокислот в образцах сернокислотных гидролизатов МКО, РКС и ППО, г/100 г белка*'

Пока- Гид- Гид- Гид- Показа- Гид- Гид- Гид-

затель роли- роли- роли- тель роли- роли- роли-

зат зат зат зат зат заг

МКО РКС ППО МКО РКС ППО

Сумма Замени-

амино- 49,5 50,9 53,1 мые, в 38,7 36,7 37,0

кислот, т.ч.

из них:

Неза- АЛА 4',4 2,1 2,3

мени- 10,8 19,0 16,1 АРГ 4,4 4,5 1,0

мые, в

т.ч. АСП 4,6 4,5 5,1

ИЛЕ 1,0 1,4 1,3 ГИС 1,6 1,5 3,0

ЛЕЙ 2,0 4,1 2,9 гли 9,1 3,1 5,1

ЛИЗ 2,6 2,3 0,4 ГЛУ 8,3 10,7 5,4

МЕТ 0,5 0,9 0,3 ПРО 4,6 1,7 7,8

цис"1 0,2 2,2 1,0 СЕР 1,7 3,8 7,3

ФЕН 1,1 1,7 4,2 Е/Ы 0,2 8 0,52 0,44

ТИР'"> 0,8 2,6 1,7 Степень

ТРЕ 1,2 1,9 1,6 конверсии 98 96 93

ВАЛ 1,4 1,9 2,7 белка, %

Отклонения в содержании аминокислот составляли ± 5%. "> - Цистин, являясь полунездменимой аминокислотой, обычно учитывается в сумме с

метионином.

Тирозин, являясь полунезаменимой аминокислочой, обычно учитывается в сумме с фенилаланином.

Из табл. 6 видно, что наиболее сбалансированными являлись гидролизаты РКС. В них наблюдалось наибольшее содержание серосодержащих аминокислот: 0,9% метионина и 2,2% цистина.

Таким образом, ферментативные гидролизаты отличаются достаточно высоким содержанием валина, лейцина, треонина, фенилалани-на, а кислотные - аспарагиновой и глутаминовой кислот и серосодержащих аминокислот. Ферментативные гидролизаты, в отличие от кислотных, содержат триптофан. Поэтому для получения гидролизатов с полноценным аминокислотным составом ферментативные гидролгоа-

17

ты рекомендуется смешивать с кислотными в требуемых соотношениях.

Разработка технологии белковых гидролизатов

На основании проведенных исследований разработана технология белковых гидролизатов из вторичного сырья мясоперерабатывающей промышленности, включающая ферментативный и кислотный гидролиз. В промышленном масштабе в условиях ОАО «Мясокомбинат Раменский» отработана первая часть предложенной технологии -ферментативный гидролиз. Технологическая схема промышленного производства ферментативных гидролизатов приведена на рис.4.

МКС измельчали на силовом измельчителе И-1 и обезжиривали в вибрационном экстракторе Э-1, промывая циркулирующей водой при 100 °С. Полученную суспензию направляли на проточно-разделительную центрифугу Ц-1, где происходило разделение на жидкую и твердую фракции. Жидкую фракцию с помощью центробежных насосных установок последовательно обезжиривали в шнековой центрифуге Ц-2 и сепараторе С-1. Обезжиренное МКС направляли в горизонтальный вакуумный котел К-1, где смешивали с жидкой фракцией. Смесь нагревали при 130 °С в течение 2 ч. Параллельно в реакторе с рубашкой и мешалкой Р-1 активировали ферментный комплекс СПЖ свиней при 50°С в течение 2 ч. Суспензию обезжиренного МКС охлаждали до 45°С, вносили ферментный препарат из реактора Р-1 и проводили гидролиз в котле К-1 в течение 4 ч при 45°С и перемешивании. По окончании гидролиза реакционную смесь инактивировали нагреванием до 120°С, центрифугировали на проточно-разделительной центрифуге Ц-3 и шнековой центрифуге Ц-4 и отфильтровывали реакционную массу на рамном фильтр-прессе Ф-1 через пористый картон. Фильтрат направляли на сепаратор С-2 для удаления остатков жира, а после этого высушивали на распылительной сушильной установке РС-1 при следующих параметрах: температура на входе 140 °С, на выходе 90°С.

По предлагаемой схеме были наработаны опытно-промышленные партии гидролизатов костного сырья (серии Кс-1 и Кс-2), включающего кость 1-й и 2-й категории; мясокостного сырья (серии КсМ-1 и КсМ-2), включающего кость и субпродукты; а также смеси мясокостного сырья и боенской крови (серии КсМКр-1 и КсМКр-2).

Вода

МКС

1

И-1 Э-1 Ц-1 Ц-2 С-1

>

Обезжиренное МКС (твердая фракция) Реакционная смесь

Жидкая фракция

У у

Жир на переработку

Р-2

Р-1

^ Вода

Поджелудочная

железа <-

ц-з Ц-4 Ф-1 С-2 РС-1 '

> р ►

МКО на производство мясокостной муки или на кислотный гидролиз

Жир на Сухой ферментативный переработку гидролизат па упаковку

Рис.4. Технологическая схема производства ферментативных гидролизатов.

Таблица 7

Физико-химические показатели опытно-промышленных серий ферментативных гидролизатов

Наименование показателя Серия № 1 Кс-1 Серия № Кс-2 1 Серия № 1 КсМ-1 ! Серия № 1 КсМ-2 Серия № КсМКр-1 Серия № КсМКр-2 Пептон по ГОСТ 13805-76

Внешний вид и цвет Порошок однородный, светло-желтого цвета, гигроскопичный Порошок однородный, светло-желтого цвета, гигроскопичный Порошок однородный, светло-коричневого цвета, гигроскопичный Порошок аморфный однородный

Запах Характерный без гнилостного характерный

Массовая доля влаги, % 7,0 6,8 6,7 6,9 7,5 7,2 Не более 7

Массовая доля белка, % 77,4 77,6 82,4 82,1 81,3 82,0 Не нормируется

Массовая доля жира, % 11,6 11,5 7,6 7,8 8,5 8,3 Не нормируется

Массовая доля золы, % 4,0 4,1 з,з 3,2 2,7 2,5 Не более 5

Водородный показатель, рН 1% раствора 5,72 5,75 5,68 5,71 5,83 5,81 6,5-7,0

Массовая доля азота аминогрупп, % 2,9 2,9 4,3 4,3 5,5 5,4 Не менее 3

Массовая доля общего азота, % 12,4 12,4 13,2 13,1 13,0 13,1 14-15

Степень конверсии белка, % 23,4 23,4 32,6 32,8 42,3 41,2 Не нормируется

Основные физико-химические характеристики полученных гидролизатов (табл. 7), в частности, содержание азота аминогрупп, общего азота, золы и влаги, находились на уровне требований ГОСТ 1380576 «Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей».

Аминокислотный состав некоторых промышленных, партгий ферментативных гидролизатов приведен в табл. 8.

Таблица 8

Содержание свободных аминокислот (св.) и полный аминокислотный состав (полн.) опытно-!1ролШШ^нныхЪбр1ЩЖУидр^ г белка '

Серия Кс-2 Серия КсМ-1 Серия

Аминокислота КсМКр-2

полн. св. полн. св. полн. св.

Незаменимые, в т.ч. 8,46 7,62 21,4 9,33 36,38 13,82

ИЛЕ 0,6 0,4 1,9 0,8 1,5 0,5

ЛЕЙ 1,4 1,4 4,3 2,1 8,3 2,8

ЛИЗ 2,1 2,1 4,3 2.1 7,7 2,4

МЕТ 0,2 0,2 0,4 0,3 1,7 1,7

цисЯ 0,06 0,02 0,2 0,03 0,10 0,07

ФЕН 1,0 1,0 2,6 0,8 4,9 1,7

ТИР*"1 0,4 0,4 1,3 0,5 2,7 0,9

ТРЕ 1,0 0,6 2,8 0,9 3,2 1,0

ТРП 0 0 0 0 0,28 0,05

ВАЛ 1,7 1,5 3,6 1,8 6,0 2,7

Заменимые, в т.ч. 84,8 10,2 70,2 15,5 55,3 18,6

АЛЛ 9,6 и 7,8 1,6 6,8 2,3

АРГ 2,0 1,8 6,4 2,5 4,0 1,3

АСП 4,4 0,5 6,5 2,1 9,6 3,4

ГИС 1,0 1,0 2,5 1,3 4,9 1,8

гли 42,3 1,4 23,8 2,4 8,4 3,1

ГЛУ 11,8 3,3 10,5 3,5 14,6 4,5

ПРО 12,2 0,5 9,5 0,5 3,3 0,8

СЕР 1,5 0,6 3,2 1,6 3,7 1,4

Итого 93,2 17,9 91,6 24,8 91,7 32,5

0,10 0,75 0,30 0,60 0,66 0,74

*' Отклонения в содержании аминокислот составляли + 5%.

- Цистин, являясь полунезаменимой аминокислотой, обычно учитывается в сумме с метионином.

Тирозин, являясь полунезаменимой аминокислотой, обычно учитывается в сумме с фенилалашшом.

Как видно из табл. 8, белки крови обогащали аминокислотный состав гидролизатов незаменимыми аминокислотами, и, в частности, триптофаном, повышая соотношение Е/Ы до 0,66. Кроме этого, добавление мякотных тканей и особенно, крови, обеспечивало более высокую степень конверсии белка (табл. 7). Сравнивая аминокислотный

состав гидролизатов, полученных в лаборатории (табл. 4), с опытно-промышленными образцами (табл. 8), можно отметить, что процесс гидролиза хорошо воспроизводится в промышленном масштабе.

Микробиологические испытания показали, что на средах, приготовленных с использованием опытно-промышленных образцов гидролизатов из мясокостного сырья и смесей мясокостного сырья с боен-ской кровью, отмечался рост микроорганизмов, сравнимый с тем, который наблюдался на средах, содержащих пептон отечественного и импортного производства. Таким образом, белковые гидролизаты из вторичного сырья мясной промышленности, полученные по разработанной технологии, отвечают требованиям, предъявляемым к пептону, и могут быть использованы в этом качестве в микробиологической промышленности.

ВЫВОДЫ

1. Изучена ферментативная активность, термостабильность и рН -оптимум ферментного комплекса суспензии поджелудочной железы, предложен способ получения ферментного препарата для гидролиза белков.

2. Определены параметры предварительной подготовки мясокостного сырья к гидролизу, найдено оптимальное соотношение фермента к субстрату.

3. Изучены кинетические характеристики процесса гидролиза белков обезжиренного мясокостного сырья ферментным комплексом СПЖ. Определены макрокинетические константы и энергия активации процесса. Для семнадцати аминокислот найдены кинетические зависимости их высвобождения из полипептидных цепей. По результатам изучения кинетики предложено проводить гидролиз при 45°С 4 часа.

4. Показано, что степень гидролиза белка, достигнутую в результате действия ферментов поджелудочной железы, можно повысить при помощи ферментов иной субстратной специфичности, в частности, протосубтилинов Г-10Х или Г-20Х и ферментов активированной биомассы пивных дрожжей.

5. В результате проведения гидролиза смеси белков мясокостного сырья и крови ферментами активированной дрожжевой биомассы и поджелудочной железы получен гидролизат с аминокислотным составом, близким к оптимальному.

6. Изучена кинетика сернокислотного гидролиза остаточных белковых компонентов после ферментативного гидролиза, а также рого-

копытного сырья и перопуховых отходов птицеперерабатывающей

____промышленности. Для аминокислот, которые не подвергались

окислительной деструкции в исследованном промежутке времени, вычислены эффективные кинетические константы.

7. Определены параметры ведения кислотного гидролиза различных субстратов, при которых достигается наибольшая степень конверсии белка.

8. Показано, что сбалансированность аминокислотного состава белковых гидролизатов может быть повышена при совместном гидролизе нескольких белковых субстратов и смешении ферментативных и кислотных гидролизатов.

9. Разработана схема комплексной' переработки вторичного сырья мясоперерабатывающей промышленности, основаннгш на сочетании энзиматических и химических методов гидролиза, когда не-прогидролизованные белковые компоненты отделяются от ферментативного гидролизата и подвергаются исчерпывающему химическому гидролизу.

10. Разработана и внедрена на ОАО «Мясокомбинат Раменский» технология промышленного получения ферментативных гидролизатов из вторичного сырья мясоперерабатывающей промышленности. На основании выполненных исследований рекомендовано использовать их в качестве пептона.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Бсрдутина A.B., Неклюдов Л.Д., Иваикип А.Н., Карпо Б.С., Осока A.B. Определение макрокинетических констант кислотного гидролиза кера-тинсодержащего сырья. // Тезисы докладов Международной конференции: "Лечебно-профилактическое и детское питание". - С.-Петербург. 1996. С. 83.

2. Бердутина A.B., Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Карпо Б.С., Осока A.B. Изучение процесса кислотного гидролиза кератинсодержащего сырья. // Тезисы докладов 2-й Всероссийской конференции "Прогрессивные экологически безопасные технологии хранения и переработки сельскохозяйственной продукции для создания продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности. - Углич, 1996. С.48.

3. Berdutina A.V. , Nekiudov A.D., Ivankin A.N., Osoka A.V.. Karpo B.S. Study of the process of acid hydrolysis of keratin-containing row materials as a method for manufacture of food additives. // Congr. proceedings 43rd ICOMST. - Auckland. New Zeland, 1997. P. 482-483.

4. Неклюдов А.Д., Иванкин A.H., Баер H.A., Бердутина A.B., Дубина В.И. Источники резервного белка для получения пищевых гидролизатов из

животного сырья. И Хранение и переработка сельхозсырья: - 1998.- N 3. С. 24 -25.

5. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Баер H.A., Бердутина A.B., Дубина В.И., Карпо Б.С. Получение гидролизатов из мясо-костного сырья. // Мясная индустрия: - 1998,- N 6. С. 42-43.

6. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина A.B., Карпо Б.С., Миталева С.И., Баер H.A. Получение пищевых гидролизатов из отходов мясопере-работки в присутствии ферментов поджелудочной железы. // Сб.научных трудов ВНИИМП, -М.: 1998.- С.70-78.

7. Неклюдов А.Д., Бердутина A.B., Иванкин А.Н., Карпо Б.С., Осока A.B. Определение кинетических констант гидролиза кератинсодержащего сырья. // Прикладная биохимия и микробиология: - 1999. Т.35. N1. С.45-49.

8. Неклюдов А.Д., Бердутина A.B., Иванкин А.Н., Карпо Б.С., Баер H.A., ДубинаВ.И., Тимошкина Е.А., Алешин A.A. Пищевые гидролизаты из мясокостного сырья как основа для получения питательных добавок. // Тезисы докладов 3 Международной научно-технической конференции: «Пища.Экология.Человек»: - М.: МГУПБ, 1999. С.87.

9. Бердутина A.B., Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Карпо Б.С., Алешин A.A. Химическая утилизация кератина из рогокопытного и перопухового сырья. // Тезисы докладов 3 Международной научно-технической конференции: «Пища.Экология.Человек»: - М.: МГУПБ, 1999. С.55.

10. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина A.B., Евстафьева Е.А., Лунев Г.Г. Переработка вторичных продуктов убоя сельскохозяйственных животных в белковые гидролизаты для пищевых,кормовых и микробиологических целей. // Тезисы докладов Научно-практической конференции: «Проблемы фундаментальных исследований в области обеспечения населения России здоровым питанием»: - М.:-1999. С.287-288.

11. Бердутина A.B., Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Карпо Б.С., Миталева С.И. Протеолитическая активность ферментного комплекса поджелудочной железы млекопитающих в сравнении с панкреатином. // Прикладная биохимия и микробиология: - 2000. Т.36. N4. С. 415-420.

12. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина A.B. Получение и очистка белковых гидролизатов. Обзор. // Прикладная биохимия и микробиология: -2000. Т.36. N4. С. 373-381.

13. Баер H.A. Неклюдов А.Д. Иванкин А.Н. Дубина В.И. Бердутина A.B. Баканов H.A. Способ активации комплекса протеолитических ферментов поджелудочной железы убойных животных. Патент РФ N 2112801, Б.И. N 16,1998.

14. Баер H.A. Неклюдов А.Д. Иванкин А.Н. Дубина В.И. Бердутина A.B. Баканов Н.А Способ получения белкового гидролизата из мясного и мясокостного сырья убойных животных. Патент РФ N 2112397, Б.И. N 16, 1998.

15. Баер H.A. Неклюдов А.Д. Дубина В.И. Миркин М.Г. Бердутина A.B. Баканов H.A. Лунев Г.Г. Способ получения белкового гидролизата' из мясного и мясокостного сырья убойных животных. Патент РФ N 2132141, Б.И. N 18, 1999.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Получение и очистка белковых гидролизатов.

1.1.1. Основные принципы получения белковых гидролизатов.

1.1.2. Подходы к описанию механизма гидролиза белков.

1.1.3. Очистка белковых гидролизатов.

Актуальность работы. Одной из важнейших задач современности является вовлечение в сферу производства дополнительных источников сырья, создание комбинированных продуктов и рационов с оптимальным соотношением биологически активных веществ. Учитывая тенденцию роста численности населения, увеличения потребления лекарственных препаратов и необходимость расширения сырьевых источников для производства пищевых добавок, а также реальную ограниченность имеющихся природных ресурсов, задача разработки усовершенствованных методов получения сложных биологически активных веществ пищевого, медицинского и микробиологического назначения является актуальной.

Одним из наиболее быстрых путей ликвидации все возрастающего белкового дефицита является создание новых форм белковой пищи на основе использования попутных продуктов убоя сельскохозяйственных животных: субпродуктов второй категории, крови, костей и т.д.

В связи с этим особенно актуальна разработка прогрессивных технологий, обеспечивающих максимальное использование белка животного происхождения, таких, как производство кормовых и пищевых добавок, обладающих высокой биологической ценностью.

Мясная промышленность располагает большими резервами увеличения выработки ценных пищевых продуктов. В настоящее время большое внимание стали уделять рациональному использованию малоценных продуктов убоя и переработки скота для получения белковых гидролизатов, которые находят широкое применение не только как компонент пищи и среда для микробиологических производств, но и как диетический продукт для лечебного питания. Отмечен положительный эффект применения белковых гидролизатов не 8 только для восстановления белкового баланса в организме, но и для снижения явлений интоксикации и повышения активности иммунной системы.

Наряду с белками животного происхождения одним из перспективных источников получения аминокислот и низкомолекулярных пептидов могут быть отходы, образующиеся после получения ценных биологически активных веществ из органов сельскохозяйственных животных. В настоящее время только часть из них используется для кормовых целей, большая же масса попадает в стоки и отвалы.

Таким образом, рациональное использование вторичного сырья мясной промышленности может привести не только к значительной экономии материальных ресурсов, но и имеет важное социальное значение, т.к. позволяет создать безотходные технологии и, тем самым, способствует оздоровлению окружающей среды.

Работы по теме диссертации проводились в соответствии с Российской научно-технической программой «Разработать теоретические основы улучшенной биоконверсии белков крови и кератин-содержащего сырья на базе биотермической, химической и энзима-тической трансформации в продукты с повышенными биологическими и потребительскими свойствами» и программой «Разработать безотходные технологии переработки вторичных и нетрадиционных продуктов на основе их функционально-технологической и медико-биологической адекватности».

Работа проводилась с учетом трудов Горбатова В.М., Рогова И.А., Липатова H.H., Файвишевского М.Л., Сницаря А.И., Лимонова Г.Е., Гаевого Е.В., Волика В.Г., Либермана С.Г., и др., посвященных проблеме использования непищевых отходов мясной промышленности и изучению их биологической и питательной эффективности. Решение задач, поставленных в работе, основано на фундаменталь9 ных исследованиях в области гидролиза белка, выполненных Беликовым В.М., Кестнером А.И., Богатковым C.B., Неклюдовым А.Д., Латовым В.К., Крыловым И.А., Иванкиным А.Н. и др.

Цель и задачи работы. Целью настоящей диссертационной работы является создание технологии белковых гидролизатов из вторичного сырья мясоперерабатывающих предприятий, способных найти применение в микробиологической и других отраслях промышленности.

Для достижения поставленной цели предусматривается решение следующих задач:

• Изучить протеолитическую активность и термостабильность комплекса ферментов суспензии поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота, определить эффективность ее использования в качестве ферментного препарата для гидролиза белков.

• Определить параметры предварительной подготовки мясокостного сырья для ферментативного гидролиза.

• Вычислить кинетические параметры процесса гидролиза белков мясокостного сырья ферментами поджелудочной железы, изучить закономерности высвобождения отдельных аминокислот из полипептидных цепей.

• Изучить возможность повышения степени конверсии белков мясокостного сырья в результате дополнительного гидролиза прото-субтилином и протеазами дрожжей рода Saccharomyces, и обогащения аминокислотного состава гидролизатов незаменимыми аминокислотами за счет сочетания различного белкового сырья.

• Вычислить кинетические параметры кислотного гидролиза остаточных белковых компонентов и кератинсодержащего сырья. Изучить особенности накопления и деструкции аминокислот в процессе термохимической деградации белков.

10

• Разработать лабораторную схему комплексной переработки вторичного сырья мясоперерабатывающей промышленности в ами-нокислотно-пептидные смеси, способные найти применение в микробиологической и других отраслях промышленности.

• Провести масштабирование процесса ферментативного гидролиза мясокостного сырья и разработать технологию промышленного получения ферментативных гидролизатов.

Научная новизна. Определены параметры температурной активации ферментного комплекса поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота как технологического сырья для ферментативного гидролиза.

Установлены кинетические закономерности накопления свободных аминокислот в процессах гидролиза белков мясокостного сырья ферментами поджелудочной железы свиней и сернокислотного гидролиза коллаген- и кератинсодержащего сырья.

Определены условия повышения степени конверсии белка за счет применения ферментных препаратов с различной субстратной специфичностью.

Установлено влияние сочетания различных видов сырья на сбалансированность аминокислотного состава гидролизатов.

Практическая ценность работы. Результаты научных исследований использованы при разработке промышленной технологии гидролиза мясокостного сырья. Предложенная технология позволяет вырабатывать сухие аминокислотно-пептидные смеси, характеризующиеся сбалансированным аминокислотным составом и способные найти себе применение в микробиологической и комбикормовой промышленности.

11

Разработана научно-техническая документация, включающая технологический регламент на производство сухого гидролизата мясокостного фарша, утвержденный ВНИИМПом в 1997 г. и технические условия Туоп 6-09-10-0002-06-99 «Мясокостный гидролизат сухой», утвержденные ОАО «Мясокомбинат Раменский» 29.06.1999 г. (см. приложения).

Технология производства ферментативных гидролизатов мясокостного сырья апробирована и внедрена в цехе технических фабрикатов ОАО «Мясокомбинат Раменский». Полученные гидролиза-ты исследованы на предмет использования в составе питательных сред для роста микроорганизмов и рекомендованы Всероссийским научно-исследовательским институтом контроля, сертификации и стандартизации ветеринарных препаратов к использованию в качестве пептона.

Новизна предложенной технологии подтверждена патентами РФ № 2112801, № 2112397, №2132141.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на конференциях: «Лечебно-профилактическое и детское питание» (С.-Петербург, 1996 г.), «Прогрессивные экологически безопасные технологии хранения и переработки сельскохозяйственной продукции для создания продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности» (г.Углич, 1996 г.), на 43-м Международном конгрессе 1СОМ8Т (Окленд, Новая Зеландия, 1997 г.), на конференциях в Москве в 1999 г.: «Пища. Экология. Человек», «Химия и биотехнология пищевых веществ» (к 100-летию со дня рождения А.Н.Несмеянова), «Проблемы фундаментальных исследований в области обеспечения населения России здоровым питанием».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

13

ВЫВОДЫ

1. Изучена ферментативная активность, термостабильность и рН -оптимум ферментного комплекса суспензии поджелудочной железы, предложен способ получения ферментного препарата для гидролиза белков.

2. Определены параметры предварительной подготовки мясокостного сырья к гидролизу, найдено оптимальное соотношение фермента к субстрату.

3. Изучены кинетические характиристики процесса гидролиза белков обезжиренного мясокостного сырья ферментным комплексом СПЖ. Определены макрокинетические константы и энергия активации процесса. Для семнадцати аминокислот найдены кинетические зависимости компонентов после ферментативного гидролиза, а также рогокопытного их высвобождения из полипептидных цепей. По результатам изучения кинетики предложено проводить гидролиз при 45 °С 4 часа.

4. Показано, что степень гидролиза белка, достигнутую в результате действия ферментов поджелудочной железы, можно повысить при

158 помощи ферментов иной субстратной специфичности, в частности, протосубтилинов Г-10Х или Г-20Х и ферментов активированной биомассы пивных дрожжей.

5. В результате проведения гидролиза смеси составом, близким к оптимальному. белков мясокостного сырья и крови ферментами активированной дрожжевой биомассы и поджелудочной железы получен гидролизат с аминокислотным

6. Изучена кинетика сернокислотного гидролиза остаточных белковых сырья и перопуховых отходов птицеперерабатывающей промышленности. Для аминокислот, которые не подвергались окислительной деструкции в исследованном промежутке времени, вычислены эффективные кинетические константы.

7. Определены параметры ведения кислотного гидролиза различных субстратов, при которых достигается наибольшая степень конверсии белка.

8. Показано, что сбалансированность аминокислотного состава белковых гидролизатов может быть повышена при совместном гидролизе нескольких белковых субстратов и смешении ферментативных и кислотных гидролизатов.

9. Разработана схема комплексной переработки вторичного сырья мясоперерабатывающей промышленности, основанная на сочетании энзиматических и химических методов гидролиза, когда не-прогидролизованные белковые компоненты отделяются от ферментативного гидролизата и подвергаются исчерпывающему химическому гидролизу.

10.Разработана и внедрена на ОАО «Мясокомбинат Раменский» технология промышленного получения ферментативных гидролизатов из вторичного сырья мясоперерабатывающей промышленности. На основании выполненных исследований рекомендовано использовать их в качестве пептона.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования процесса гидролитической деградации белковых отходов показали, что многие отходы пищевой и микробиологической промышленности являются ценным резервным источником белка, который после соответствующей биохимической трансформации может быть превращен в аминокислотно-пептидные смеси, имеющие биологическую ценность. Использование деградированных белковых отходов в качестве добавок к питательным рационам животных и микроорганизмов расширяет сырьевую базу и позволяет получать обогащенные питательными веществами смеси для культивирования микроорганизмов и выращивания животных. Методы химико-ферментативной трансформации позволяют также решать задачу по рациональному применению малоиспользуемых отходов.

Лучше всего осуществлять гидролитическую переработку таких отходов в присутствии ферментных препаратов с максимально широкой субстратной специфичностью животного или микробного происхождения. В большинстве случаев ферментативный гидролиз проводится в закрытых системах (реактор с перемешиванием), при этом, образующиеся продукты реакции ингибируют основной процесс гидролиза и реакция протекает с выходом 25-30% при использовании одного ферментного препарата.

Для переработки оставшейся части белка может быть использован другой ферментный препарат с иной субстратной специфичностью, или водный раствор минеральной кислоты. В последнем случае происходит исчерпывающий гидролиз всего оставшегося белкового сырья, включая не только белковую, но и полисахарид-ную, липидную и даже минеральную часть. Несмотря на явное преимущество такого метода, при использовании сильных минеральных

156 кислот для гидролиза возможно частичное разрушение ряда аминокислот и, кроме того, существенно образование смолообразных примесей. В связи с этими обстоятельствами, для использования таких гидролизатов в пищевой промышленности необходима их обязательная очистка на селективных сорбентах типа ионитов, или другими методами.

Сочетая различные вторичные продукты убоя, можно получать белковые гидролизаты, близкие по аминокислотному составу к эталонным белкам.

В данной работе предлагаются технологии получения белковых гидролизатов из мясокостного и кератинсодержащего сырья, а также боенской крови, с помощью ферментов, содержащихся в поджелудочной железе свиней, крупного рогатого скота и пивных дрожжах с последующим догидролизом серной кислотой.

Рассмотрена формальная кинетика гидролиза белков, предложены математические модели и методы расчета констант скоростей химической реакции, что позволило получить гидролизаты с заданной степенью конверсии белка и соответствующими физико-химическими характеристиками. Исследование кинетики процесса высвобождения отдельных аминокислот дало возможность приблизиться к пониманию механизма ферментативного и кислотного гидролиза и позволило определить оптимальные параметры получения аминокислотных смесей с заданным составом.

Изучение физико-химических свойств гидролизатов показало, что в зависимости от условий получения гидролизатов ферментативным или химическим путем наблюдается более сбалансированный состав по свободным аминокислотам в случае ферментативных гидролизатов, а также большее количество непрогидролизованных пептидов. Кислотный гидролиз позволяет осуществлять глубокую деградацию белков даже в трудно растворимых кератинсодержащих

157 отходах, а подбор условий и использование различного сырья позволяет получать гидролизаты, обогащенные незаменимыми аминокислотами с оптимальным балансом состава.

Полученные белковые гидролизаты хорошо зарекомендовали себя в качестве основы питательных сред. В настоящее время проводятся исследования по их использованию в качестве биостимули-рующих добавок к кормам сельскохозяйственных животных.

1. Антипова Л.В., Кадачев A.A., Новрузов Б.Н. Восстановление сублимированного мяса с применением ферментных препаратов.// Мясная промышленность. Научно-техн. информ. сборник. М.: Изд-во АгроНИИТЭИММП, 1991. N 5. С. 16-19.

2. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука, 1984. С. 113-161.

3. Ахназарова С. Л., Кафаров В. В. Оптимизация эксперимента в химии и химической технологии. М.: Высшая школа, 1978.

4. Баер H.A., Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Дубина В.И.,Бердутина A.B., Баканов H.A. Способ получения белкового гидролизата из мясного и мясокостного сырья убойных животных. Пат. 2112397 РФ //Б.И.1998. N 16. С. 19-20.

5. Беликов В.М., Антонова Т.В., Квасов Б.В. . Кинетика гидролиза казеина протеолитическими ферментами. //Биоорганическая химия. 1979. Т.5. N 3. С. 449-457.

6. Беликов В.М., Бабаян Т.Л. Смеси аминокислот в питании человека и животных. В кн. : // Химические и физиологические проблемы создания и использования синтетической пищи. Рига: Зинат-не, 1972. С. 5-59.

7. Беликов В.М., Гололобов М.Ю. Пластеины, их получение, свойства и применение в питанииУ/Die Nahrung. 1986. V. 30. N 3-4. Р. 281-287.

8. Беликов В.М., Гололобов М.Ю. Пластеины. Получение, свойства и использование в питании.// Успехи химии. 1979. Т. 48. N 8. С. 1686-1710.

9. Беликов В.М., Гордиенко C.B., Рожанский М.О. Способ освобождения смеси аминокислот от фенилаланина. A.c. 437750 СССР// Б.И. 1974. N12. С. 32.160

10. Ю.Беликов В.М., Кудинова Е.Г., Воробьев М.М. Кинетическое описание протеолиза. Ч. 1. Гидролиз изолята белка из куриных сердец пепсином. Оптимизация по времени и концентрации субстрата. //Die Nahrung. 1986. T. 30. N 5. С.501-506.

11. П.Беликов В.М., Латов В.К., Гордиенко С.В Получение аминокислотных смесей из автолизатов пекарских дрожжей. II. Оптимизация параметров стандартной процедуры ионообменной очистки автолизатов. //. Хим. фарм. жур нал. 1976. Т. 10. N 6. Р. 126-131.

12. Белки. / под ред. Нейрата Г. и Бэйли К. Т. III. Биохимия белковых веществ. М.: Изд. иностр. литературы, 1959. 706 с.

13. Березин И. В., Клесов А. А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: Наука, 1979, с. 102-175.

14. Березин И.В., Мартинек К. Введение в прикладную энзимоло-гию.-М. :МГУ, 1982.382 с.

15. Биотехнология / Под ред. Баева A.A. М.: Наука, 1984. С. 70-77.

16. Богатков C.B., Фролова Т.Т., Грачева И.М. Оптимизация гидролиза белков щелочной протеиназой Bac.subtilis. //Прикл. биохимия и микробиология. 1982. Т. 18. № 1. С. 71-75.

17. Борисенко Е.Г. Автолиз дрожжей рода Candida. // Микробиология. 1967. T. 36.N 2. С. 240.

18. Бравова Г.Б., Иванова Н.Г., Шишкова Э.А., Сухих O.A., Иншути-на Н.Б., Фокина С.С., Эль-Регистан Г.И., Козлова А.Н. Способ получения осветленного экстракта автолизованных дрожжей. Пат. N 94011521/13 РФ // Б.И. 1997. N 20 . С.44.

19. Брызгалова Т.Е., Цибанов В.В., Бартошевич Ю.Э., Неклюдов А.Д. Изучение условий иммобилизации Streptomycius Epitreus каль-ций-альгинатным гелем и аппаратурное оформление процесса. //Антибиотики и мед. биотехнология . 1988. Т. 32. N 1. С. 26-31.

20. Васильев П.С., Суздалева В.В., НеклюдовА.Д. // Препараты для парентерального питания: Современные кровезаменители. М.: ВНИИ мед. информации, 1980. С. 29-43.

21. Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизованные ферменты. / Под ред. Березина И. В. и Мартинека К. М.: Изд-во МГУ, 1982. 383 с.161

22. Волик В.Г. Биотехнологический способ выработки пищевого, лечебного и косметического белка. //Мясная индустрия. 1999. N 4. С. 36-38.

23. Гальперин Ю.М. Парезы, параличи и функциональная непроходимость кишечника. М.: Медицина, 1975. 219 с.

24. Гмошинский И.В., Зорин С.Н., Конь И.Я., Мазо В. К. Протеолиз биологически активной добавки иммуноглобулинов в составе кисломолочного продукта в желудочно-кишечном тракте крыс. // Вопросы питания . 1998. N 4. С. 5-8.

25. Гололобов М.Ю., Антонова Т.В., Беликов В.М., Пасконова Е.А. Связь реакции, катализируемой ферментами, с образованием структуры при пластеиновой реакции. //Die Nahrung. 1982. V. 26. N5. P. 427-433.

26. Гололобов М.Ю., Беликов В.М., Витт C.B., Пасконова Е.А. Титова Е.Ф. Транспептидация в концентрированных растворах пепсинового гидролизата яичного альбуминаУ/Die Nahrung. 1981. V. 25. N10. Р. 961-967.

27. Гордиенко C.B., Ермакова Л.Н., Подольский М.В., Беликов В.М., Латов В.К., Цыряпкин В.А. Получение смеси аминокислот для питания больных фенилкетонурией. // Хим.-фармацевт. журн. 1980. Т. 14. N 12. С.72-75.

28. Горская Н. А. Адсорбционная хроматография на активированных углях при получении белковых гидролизатов. В кн.: // Лечебные препараты из крови и тканей. Л.: Медицина, 1974. С.171-173.

29. Денякина Е.К., Логинова Т.А., Крестьянова И.Н., Бартошевич Ю.Э., Неклюдов А.Д. Получение и свойства иммобилизованного ферментного препарата с пептидазной активностью. // Прикл. биохимия и микробиология. 1985. Т. 21. N2. С. 177- 183.

30. Денякина Е.К., Неклюдов А.Д., Герасимова Е.В. О количественном соотношении аминокислот и пептидов в белковых гидроли162затах для парентерального питания// Прикл. биохим. и микро-биол. 1983. Т. 19. № 4. С. 503-506.

31. Деханов В.П., Лимонов Г.Е., Сницарь А.И. Вибрационный экстрактор жира из кости. //Мясная индустрия СССР. 1982. N 2. С. 13-15.

32. Джафаров А.Ф., Коршунов Б.А., Мотильская С.П., Щукина Н.И. Способ получения аминокислотного концентрата. Патент N 93021411/13 РФ// Б. И. 1997. N 27. С. 102

33. Иванкин А. Н., Герман А. Б., Тележкин В.В., Осотов A.A. Практикум по основам биохимии. М.: Изд-во МГУЛ, 1996, 100с.

34. Иванкин А.Н. Перспективы получения биологически активных веществ из животного и генетически трансформированного сырья. //Мясная индустрия. 1998. N 5. С . 13-14.

35. Ивашов В.И., Неклюдов А.Д., Федорова Н.В., Хромова P.A. О некоторых макрокинетических закономерностях протеолиза белков. //Докл. РАН . 1992. Т. 322. N 5. С. 989-993.

36. Ивашов В.И., Неклюдов А.Д., Федорова Н.В., Хромова P.A. Получение и применение белковых гидролизатов. М.: АгроНИИТЭ-ИММП, 1991.44 с.

37. Ивашов В.И., Сницарь А.И. Современные направления развития переработки костного сырья. // Мясная индустрия. 1994. N 2. С. 15-16.

38. Иммобилизованные клетки и ферменты / Под ред. Дж. Вудворда. М.: Мир, 1988.216 с.

39. Калмыков Л.Е., Голубев Т.И. Белковый препарат для парентерального питания аминопептид// Советская медицина. 1956. № 3. С. 66-69.

40. Кислухина О., Кюдулас И. Биотехнологические основы переработки растительного сырья. Каунас.: Технология, 1997. 183 с.

41. Кошелев Н. Ф., Головина Н. К. Опыт использования микробных пептидаз в приготовлении белковых гидролизатов для парентерального питания. // В кн. Актуальные вопросы парентерального питания. Рига: Зинатне, 1982. С.157-162.

42. Красильникова Т.Е. Ускоренный метод определения азота в мя-сопродуктах/ТМясная индустрия, 1973. -N 8. С.21.

43. Крылов И.А., Красноштанова A.A., Манаков М.Н. Гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов ферментными системами поджелудочной железы. Количественные закономерности процесса.//Биотехнология. 1998. № 6. С. 63-68.

44. Крылов И.А., Красноштанова A.A., Манаков М.Н. Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Биотехнология. 1996. № 3. С. 39-44.

45. Крылова В. Б., Попов В. П. Способ получения белкового гидро-лизата из кератинсодержащего сырья (к. р. е.). А. с. 1161064 СССР//Б. И. 1985. № 9. С 14.

46. Крылова H.H., Лясковская Ю.Н. Физико-химические методы исследования продуктов животного происхождения. М.: Пищевая промышленность, 1965. - 316 с.

47. Купов Х.А. Разработка и масштабирование процесса получения церевизиамина препарата для парентерального азотистого питания из биомассы хлебопекарных дрожжей. Автореф. дисс. канд. хим.наук.-М. 1990.-20 с.164

48. Латов В.К., Бабаян Т.Л., Гордиенко C.B. Коган A.C., Цыряпкин В.А., Беликов В.М. Комплексная переработка дрожжевой биомассы//Биотехнология. 1990. N 3. С. 14-18.

49. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир. 1976. 957 с.

50. Либерман С.Г. Производство пищевых животных жиров на мясокомбинатах. М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982. - 255 с.

51. Линд P.M., Гмошинский И.В., Зорин С.Н., Линд А.Р. Характеристика белкового состава и антигенности молочной сыворотки, подвергнутой ферментативному гидролизу. //Вопросы питания. 1996. N3. С. 20-23.

52. Мазо В.К. Возможности и перспективы развития методов экспериментальной оценки гипоаллергенных продуктов и их компонентов. //Вопросы питания. 1994. N 3. С. 16-18.

53. Майснер. Биохимия аминокислот. М.: Изд. иностр. литературы, 1961.-530 с.

54. Мархгейм Г.Г., Сницарь А.И., Будрик Г.В. Опыт эксплуатации линии переработки кости. // Мясная индустрия. 1995. N 4. С. 1214.

55. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1993. Т.2. С.63.

56. Неклюдов А.Д. Метаболизм аминокислот и их использование при создании белоккоррегирующих препаратов (обзор). //Антибиотики и мед. биотехнология. 1987. Т. 32. N 4. С. 302-312.

57. Неклюдов А.Д., Бердутина A.B., Иванкин А.Н., Карпо Б.С., Осока A.B. Гидролиз кератинсодержащего сырья водными растворами серной кислоты. //Прикл. биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. N 1.С. 45-49.

58. Неклюдов А.Д., Евстафьева Е.А., Козлова Н.Д. Сравнительная оценка сорбционных свойств карбоксиметилцеллюлозы по отно165шению к гемину и глобину // Прикл. биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. N3. С. 290-293.

59. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бабурина М.И. Получение и свойства панкреатина, иммобилизованного на карбоксиметилцеллю-лозе. //Прикл. биохимия и микробиология. 1998. Т.34. N1. С 5761.

60. Неклюдов А. Д., Иванкин А. Н., Баер Н. А., Бердутина А. В. Источники резервного белка для получения пищевых гидролизатов из животного сырья. // Хранение и переработка сельхозсырья. 1998. №3. С. 24-25.

61. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Баер H.A. Бердутина A.B., Дубина

62. B.И., Карпо Б.С. Получение гидролизатов из мясокостного сырья. // Мясная индустрия. 1998. N 6. С.42-43.

63. Неклюдов А. Д., Иванкин А. Н., Бердутина А. В. и др. Получение пищевых гидролизатов из отходов мясопереработки в присутствии ферментов поджелудочной железы // Сб. научных трудов ВНИИМП. М.: Изд-во ВНИИмясной промышленности, 1998. С. 70-78.

64. Неклюдов А.Д., Илюхина В.П., Мосина Г.И. Гидролизующая способность дрожжевых протеаз по отношению к белковым субстратам. //Прикл. биохимия и микробиология. 1996. Т.32. N 2. С. 231236.

65. Неклюдов А.Д., Илюхина В.П., Федорова Н.П., Бабурина М.И. Гидролиз как способ переработки боенской крови. //Мясная промышленность. 1994. N2. С.21-23.

66. Неклюдов А.Д., Илюхина В.П., Хромова P.A. Перспективы комплексной переработки боенской крови //Мясная промышленность. 1993 N2. С. 6-7.166

67. Неклюдов А.Д., Купов Х.А. Дрожжи как источник получения аминокислотных препаратов. // Антибиотики и химиотерапия. 1988. Т. 33. N9. С. 701-708

68. Неклюдов А.Д., Лисицын А.Б., Иванкин А.Н. Изучение возможности использования белков крови в лечебном и профилактическом питании. // 4 Междунар. симп. «Экол. человека: пищ. тех-нол. и продукты». М., 1995 Т. 2 . С. 246-247.

69. Неклюдов А. Д., Навашин С. М. Получение белковых гидролиза-тов с заданными свойствами. // Прикл. биохимия и микробиология. 1985. Т. 21. N 1.С. 3-17.

70. Неклюдов А.Д., Навашин С.М., Бартошевич Ю.Э., Цибанов В.В. Получение белковых гидролизатов при помощи иммобилизованных бактериальных пептид-гидролаз. // Антибиотики и мед. биотехнология. 1985.Т. 33. N 4. С. 243-249.

71. Неклюдов А.Д., Федорова Н.В., Илюхина В.П., Лисица Е.П. Ферментативный профиль автолизированной дрожжевой биомасссы рода Saccharomyses. // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. N5. С. 734-743.

72. Неклюдов А.Д., Цибанов В.В., Купов Х.А., Беликов В.М. Получение аминокислотных смесей из дрожжевых автолизатов. III. Исследование процесса очистки дрожжевого автолизата на различных сорбентах. //Хим.-фарм. журнал 1983. N 11. С. 1348-1352.

73. Неклюдов А.Д., Цибанов В.В., Логинова Т.В. Моделирование протеолиза в рН-статируемых биореакторах.// Антибиотики и мед. биотехнология. 1987. Т.ЗО. N 1. С. 57-66.

74. Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Позднякова Ю.Н., Давидович В.В. Ферментативные способы приготовления белковых гидролизатов с использованием протеолитических ферментов различной специфичности. // Вопросы питания. 1997. № 5. С. 34-38.167

75. Практическая химия белка /Под ред. А.Дарбре. М.: Мир, 1989. С. 291.

76. Римарева JI.B. Использование комплексного ферментного препарата амилопротооризина для гидролиза дрожжевого белка. //Хранение и переработка сельхозсырья. 1996. N 2. С. 39-40.

77. Римарева JI.B., Оверченко М.Б., Трифонова В.В. Способ получения белкового гидролизата дрожжевой биомассы. Пат. N 96101956/13 РФ//Б.И. 1998. N4. С. 33.

78. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. Скурихина И.М., Тутельяна В.А.- М.: Брандес-Медицина,1998. 342 с.

79. Рухлядева А.П., Полыгалина Г.В. Методы определения активности гидролитических ферментов . М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1981.

80. Сиймер Э.Х., Паппель К.Э., Кестнер А.И. Метод описания кинетики ферментативных реакций. // Труды Таллинского политехнического института. 1979. № 424. С. 13-17.

81. Скоупс Р. Методы очистки белков: Пер. с англ. М. : Мир, 1985. 385 с.

82. Таранич A.B., Анохина В. И., Кононенко Л. В. Способ получения кормовой добавки из отходов мехового сырья. A.c. 1151236 СССР// Б.И. 1985. №7. С. 7 .

83. Устинова A.B., Тимошенко Н.В. Мясные продукты для детского питания . М.: Изд-во ВНИИмясной промышленности, 1997. 252 с.

84. Файвишевский М.Л. Переработка пищевой кости. М.: Агро-промиздат, 1986. - 176 с.

85. Файвишевский М.Л. Производства пищевых животных жиров. -М.: Антиква, 1995.-378 с.

86. Файвишевский М.Л., Либерман С.Г. Комплексная переработка кости на мясокомбинатах. М.: Пищевая пром-сть, 1974. - 90 с.

87. Федорова Н.В. Гидролиз белково-пептидных субстратов протеа-зами дрожжей Saccharomyces. Автореф. дисс. канд. хим.наук.-М. 1991.- 18 с.

88. Федорова Н.В., Неклюдов А.Д. Влияние концентрации дрожжевой биомассы и экзогенных протеолитических ферментов на168интенсивность процесса автолиза пекарских дрожжей. //Прикл. биохимия и микробиология. 1985. Т.21. N 6. С. 714-718.

89. Ферментация и технология ферментов. /Под ред. Уонт Д., Коней И., Домайн А. М.: Легкая и пищевая промышленность. 1983. 336 с.

90. Химический состав пищевых продуктов /Под ред. Скурихина И. М., Волгарева М.Н. М.: Агропромиздат, 1987. Т.1.224 с.

91. Черников М.П. Протеолиз и биологическая ценность белков. М.: Медицина, 1975. 232 с.

92. Шатерников В.А., Конышев В.А., Мазо В.К. Строение и свойства пищевых аллергенов. // Вопросы питания. 1980. N 1. С.3-9.

93. Шевкунов К.Ф., Либерман С.Г., Файвишевский М.Л., Яцышин А.П., Щербаков А.А. Переработка кератинсодержащего сырья. // Обзорная информация, серия "Мясная промышленность". М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1979. 30 с.

94. Якубке Х.Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1985. С. 262-271.

95. Adamson N.J., Reynolds Е.С. Relationship between degree of casein hydrolysis and phosphopeptide release. //J. Dairy Res. 1997. N 4. P. 505-514.

96. Adler-Nissen J. Enzymatic hydrolysis of food proteins. // Dan. Kemi. 1986 . V. 67. N 1. P. 19-43.

97. Agboola S.O., Singh H., Munro P.A., Dalgleish D.G., Singh A.M. Destabilization of oil-in-water emulsions formed using highly hydrolyzed whey proteins. // J. Agr. Food Chem. 1998. V. 46. N 1. P. 84-90.

98. Agboola S.O., Dalgleish D.G. Enzymatic hydrolysis of milk proteins used for emulsion formation. 1. Kinetics of protein169breakdown and storage stability of the emulsion. //J. Agr. Food Chem.1996. V. 44. N 11. P. 3631-3636.

99. Amino acids. Tables and charts. Tokyo: Ajinomoto Co. 1990. Part 4. 28 p.

100. Aubes-Dufau I., Combes D. Effect of different proteases on bitterness of hemoglobin hydrolyzates. // Appl. Biochem. Biotechnol.1997. V. 67. N1-2. P. 127-138.

101. Batista I. , Nunes M.L. Preparatio of enzymic hydrolyzates from fish wastes. // Dev. Food Sci. 1997. V. 38. N 1. P. 59-70.

102. Beck R.H.F., De Sadelur J.W.G.C. Process for the production of glutamic acid and the use of protein hydrolyzates in this process. Pat. Europa. 1998. N 834573.

103. Berthelsen J.H., Frokjaer S., Saltin B. Additive for use in any energy supplementation and use of a protein hydrolyzate for the preparation of energy supplementation. Int. Pat. 1997. WO 39641.

104. Bilinski C.A., Stnart G.G. Yest proteases and brewing. //Biopass Technol. (Yeast). 1990.V.5. N 1. P. 147-162.

105. Chakrabarti R. A metod of debittering fish protein hydrolysate. // J. Food Sci. Technol. 1983. V. 20. N 1. P. 154-156.

106. Chobert J.-M., Bertrand-Harb C., Dalgalarrando M., Nicolas M.-G. Solubility and emulsifying properties of beta-casein modified enzymatically by trypsin. //J. Food Biochem. 1989. V. 13. N 2. P. 335352.

107. Clegg K.M., Lim C.L., Manson W. The structure of a bitter peptide derived from casein by digestion with papain. // J. Dairy Res. 1974. Y. 41. N 2. P. 283-287.

108. Comprehensive biotechnology. The principles of biotechnology. /Ed. Moo-Young M. N.Y.: Pergamon Press, 1985. V.2. 670 p.

109. Cornelius L., Vosburgh F., Schubert R.L. Protein hydrolysate derived from mucosa tissue. Pat .USA . 1997. N 5607840

110. Diaz O., Gouldsworthy A.H., Leaver J. Identification of peptide released from casein micelles by limited trypsinolysis.// J. Agr. Food Chem. 1996. V. 44. N 9. P. 2517-2522.170

111. Diniz F.M., Martin A.M. Stable isothiocyanate emulsion compositions for food additives. // Food Sci. Technol. (London). 1997. V. 30. N3. P. 266-272.

112. Diniz F.M., Martin A.M. Influence of process variables on the hydrolysis of shark muscle protein. // Food Sci. Technol. Int. (London). 1998. V. 4. N2. P. 91-98.

113. Ellis L., Kalnins D., Corey M. Do infants with cystic fibrosis need a protein hydrolyzate formula? A prospective, randomized, comparative study. // J. Pediatr. (St. Louis). 1998. V. 132. N 2. P. 270-276.

114. Enari T.M., Fogarty W.M., Kelly C.T. Microbial amilases,pectic enzymes and microbal cellulases In:Microbail enzymes and biotechnology. // Microbail Enzymes and Biotechnology/Ed. Fogarty W.M. London: Appl. Sci, 1988.267 p.

115. Enzymes and Related Biochemicals. Freehold: Worthington Biochem. Div., 1990. 212 p.

116. Fanst P.L. Expression of the yeast aspartyl protease, proteinase A //J. Biol. Chem. 1989.V. 264. N 1. P.479-488.

117. Fik M, Surowka K. Enzymic hydrolysis of proteins from chicken heads using Alcalase and Esperase. // Acta Aliment. 1997. V. 26. N1. P. 35-45.

118. Flaczyk E. Technologycal and nutritional aspects of protein hydrolyzates. Part I: Preparation and chemical characterization.// Przem. Spozyw. 1997. V. 51 . N 3. P. 6- 31.

119. Flaczyk E. Technologycal and nutritional value of protein hydrolyzates. Part II. // Przem. Spozyw. 1997. V. 51. N 4. P. 43-45.

120. Frokjaer S. Use od hydrolysates for protein supplementation. // Food Technol. 1994. V. 48. N 10. P. 86-88.

121. Gray D, Schmelkin N.S, Alexader J, Mark D.A, Twyman D. Enteral formulation designed for optimized nutrient absorption and wound healing. Pat. USA. 1998. N 5723446.171

122. Grimble G.K. Protein hydrolyzates as vehicles for the application of di- and tripeptides in clinical nutrition // Portland Press Proc. 1998. N 11.P. 119-139.

123. Hadulla A., Braun P., Balzer W.R., Deutz, H. Hair dye composition containing beeswax and protein hydrolyzate or amino acids. Pat. Ger. 1996. N 19637966 .

124. Hagi T., Hatta H. , Kobayashi M., Yoshikawa K. Meat containing food with improved elasticity and water retention. Pat. Japan. 1997. N09-121814.

125. Hagi T., Hatta H. , Kobayashi M. Galacturonic acid and polygalacturonic acid for improvement of protein functionality. Pat. Japan. 1997. N09-107886.

126. Haque Z.U., Casay G.A., Wilson W.W., Antila, P, Antila, V. Effect of casein hydrolysates on association properties of milk proteins as seen by dynamic light scattering.//J. Agr. Food Chem. 1993. V. 41. N 3. P. 203-207.

127. Haque Z.U., Mozaffar Z. Casein hydrolysate. II. Functional properties of peptides. //Food Hydrocolloids. 1992. N 5. P. 559-571.

128. Hart J., Polla Ch., Hull J.C. Oat fractions .// Cosmet. Toiletries. 1998. V. 113. N3. P. 45- 52.

129. Helbig N.B., Ho L., Chirsty G.E., Nakai S. Debittering of skim milk hydrolysates by adsorption for incorporation into acidic beverages. //J. Food Sci. 1980.V. 45. N 2. P. 331-335.

130. Hidalgo J., Gamper E. . Solubility and heat stability of whey protein concentrates. //J. Dairy Sci. 1977. V. 60. N 7. P. 1515-1518.

131. Hollenberg D., Ehlert M., Goddinger D. Hair conditioners containing carboxamido vinyl polimers. Pat. Ger. 1997. N 19540853.

132. Huang X.L., Catignani G.L., Swaisgood H.E. Improved emulsifying properties of (3-barrel domain peptides obtained by membrane-fractionation of a limited tryptic hydrolysate of p-lactoglobulin. // J. Agr. Food Chem. 1996. V. 44. N 11. P. 3437-3445.

133. Hyun Ch. K., Shin H.-K. Utilization of animal blood proteins as nitrogen sources for the cultivation of lactic acid bacteria. // Sanop Misaengmul Hakhoechi. 1997. V. 25. N 2. P. 218-223.172

134. Isugita A., Scheffler I.I A rapid method for acid hydrolysis of protein with a mixture of trifluoroacetic and hydrochloric acid. //Eur. J. Biochem. 1982. V.124. N 3. P. 585-588.

135. Ito T., Saito T. Whey beverages and their manufacture with proteases. Pat. Japan .1998. N 10- 33115.

136. Kludas K. U., Kamieth R., Stache B. Stepwise preparation of protein hydrolysate with enzymes, asids and base. Pat. DDR. 1987 № 244760.

137. Kolomaznik K., Mladek M., Langmaier F. Process for preparing hydrolyzate of proteinaceous waste of animal origin. Pat. Czech Rep. 1996 .N280655 .

138. Kotani S., Ageta A. Stable isothiocyanate emulsion compositions for food additives. Pat. Japan. 1997. N 09-308453.

139. Kuriki H., Motojima H., Minagawa E., Sugano Ch., Tsukashiro F. Preparation of proteose peptone component-3 from milk as additive to food, cosmetics, and pharmaceuticals. Pat. Japan 1997 . N 09110896 .

140. Lahl W.J, Braun S.D. Enzymatic Production of Protein Hydrolysates for Food Use. // Food Technol. 1994. V. 48. N 10. P. 68-71.

141. Lalasidis G., Sjoberg L.-B. Two new methods of debittering protein hydrolysates and a fraction of hydrolysates with exeptionally high content of essential amino acids. //J. Agr. Food Chem. 1978. V. 26. N3. P. 709-723.

142. Lin S.B., Chiang W., Cordle Ch.T., Thomas R.L. Functional and immunological properties of casein hydrolysate produced from a two-stage membrane system. // J. Food Sci. 1997 V. 62. N 3. P. 480-483.

143. Lin S.B., Nelles L.P., Cordle Ch.T., Thomas R.L. Debittering casein hydrolysates with octadecyl-siloxane columns. // J. Food Sci. 1997. V. 62. N4. P. 665-670.173

144. Linder M., Rozan P., Lamghari E., Kossori R., Janni J., Villaume C., Mejean L., Parmentier M. Nutritional value of veal bone hydrolysate. //J. Food Sei. 1997.V. 62. № 1. C. 183-189.

145. Lisitcin A.B., Nekludov A.D., Ivankin A.N. Investigations of amino acids composition of cattle muscules. // Meat for the consumer / Eds Hildrum K.I., Larsen E.G. Lillehammer: MATFORSK, 1996. P. 334-335.

146. Lorenzen P., Schulzen D., Schulte D., Schlimme E. Caseinolyse mit lab. und chymosin boviner sowie gentechniser herkunft. // Dtsch. Milehwirk. 1996. V. 47. N 11. P. 492-495.

147. Lyons T.P. Proteinases in industry. //Crit. Rev. Biotechnol. 1988. V. 8. N2. P. 99-110.

148. Mahmoud M.I. Physicochemical and functional properties of protein hydrolysates in nutritional products. //Food Technol. 1994. V. 48. N 10. P. 89-95.

149. Mahmoud M.I., Malone W.T., Cordle C.T. Enzymatic hydrolysis of casein: Effect of degree of hydrolysis on antigenicity and physical properties. // J. Food Sei. 1992. V. 57 . N 5. P. 1223-1229.

150. Mangino M.E., Kim J.H., Dunkerly J.A., Zadow J.G. Factors important to the gelation of whey protein concentrates. // Food Hydrocolloids. 1987. N 1. P. 277-282.

151. Martinez S.B., Leary H.L., Nichols D.J. Milk protein partial hydrolysate and infant formula containing same. Pat. USA. 1995. N 5405637.

152. Moos A.M.Hydrolysis of protein. Pat. USA . 1988. N 2442055.

153. Morelle J., Lauzanne E., Rothfuss P. Compositions free from proteins and peptides obtained from whole animal protein for cosmetic, pharmaceutical, and agricultural uses. Pat. France . 1998. N 2751177.

154. Nakamura T., Syukunobe Y., Sakurai T., Igota T. Enzymatic production of hypoallergenic peptides from casein .// Milchwissenschaft. 1993. V.48. N1. P. 11-14.

155. Nekludov A.D., Lisitcin A.B., Fiodorova N.B., Ivankin A.N., Yevstafieva E. A. Hydrolysis of the slaughter cattle blood by yeast174proteases.//Proc. 41-th Annual Int. Congress of Meat Science and Technology. San Antonio, 1995. P. 260.

156. Nekludov A.D., Lisitcin A.B., Ivankin A.N. ,Hromova R.A., Mosina G.I., Petrakova A.N. Poboljsanje kvaliteta krui zaklanih zivitinja hidroliticnom metodom. // Tehnology mesa. 1995. V. 36. N 2-3.P. 50.

157. Nielsen P.M. A method of obtaining protein hydrolyzates. Int. Pat. 1997. WO 43910.

158. Nielsen P.M. Functionality of protein hydrolyzates. // Food Sci. Technol. (N.Y.). 1997. V. 80. N2. P. 443-472.

159. Pedersen B. Removing bitterness from protein hydrolysates. // Food Technol. 1994. 48. N 10. P. 96-98.

160. Pintado M.E., Pintado A.E., Silva E.R. Evaluation of whey protein hydrolysis using protease A and trypsin. // Biol. Wet. (Univ. Gent) 1997. V.62. N 4a. P. 1365-1368.

161. Roland J.F., Mattis D.L., Kiang S. Hydrophobic chromotography: Debittering protein hydrolysates. // J. Food Sci. 1978. V. 43. N 8. P. 1491-1493.

162. Sakata R., Segava S., Morita H., Yukiharu N. Tenderization of hog casings. Application of organic acids and proteases. // Fleischwirtschaft. 1998. V. 78. N 6. P. 703-704.

163. Sampson H.A., Mendelson L., Rosen J.P. Fatal and nearfatal anaphylactic reactions to food in children and adolescents. // N. Eng. J. Med. 1992. V 327. N 1. P. 380-384.

164. Samuelsson E. G. A peptide preparation, a process for producing it and use of the peptide preparation. European pat. 1987. N 0226221.

165. Sandeaux J., Sandeaux R., Gavach C., Grib H., Sadat T., Bel-hocine D., Mameri N. J. Extraction of amino acids from protein hydrolyzates by electrodialysis. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1998. V. 71. N.3. P. 267-273.

166. Schmidl M.K., Taylor S.L., Nordlee J.A. Use of hydrolysate-based products in special medical diets. //Food Technol. 1994. V. 48. N 10. P. 77-80, 85.

167. ShanidiF, Synowiecki//J. Food Chem. 1997. V. 60. N 1. P. 2932.175

168. Siemensma A.D., Weijer W.J., Bak H.J. The importance of peptide length in hypoallergenic infant formulae. //Trends in Food Sci. & Tech. 1993. V. 4.N1.P. 16-21.

169. Slattery H., Fitzgerald R.J. Functional properties and bitterness of sodium caseinate hydrolysates prepared with a Bacillus proteinase. //J. Food Sci. 1998. V. 63. N3. P. 418-422.

170. Surowka K., Fik M. Recovery of proteinaceous substances from chicken heads by proteolysis with trypsin. // Die Nahrung. 1996. V.40. №3. C. 132-137.

171. Szpendowski J. Hidrophobicity of milk proteins and their functional properties. //Przem. Spozyw. 1997. V. 51. N 8. P. 16-18, 31.

172. Tamura M., Mori N., Miyoshi T. Practical debittering using model peptides and related compounds. // Agric. Biol. Chem. 1990. V. 54. N l.P. 41-51.

173. Tanford C., Kawahara R., Lapanje S. Method of protein hydrolys by HC1//J. Biol. Chem. 1966. V. 241. N 9. P. 1926.

174. Tarrant P.V. Some recent advances and future priorities in research for the meat industry. // Meat Sci. 1998. V. 49. N 1. P. 1-16.

175. Taylor S.L. Immunologic and allergic properties of cows' milk proteins in humans. //J. Food Protect. 1986. V. 49. N 2. P. 239-250.

176. Tokita F. Enzymatische und nicht enzymatische Ausschaltung des Bittergeschmacks bei enzymatischen Eieweisshydrolysaten. //Z. Lebensm. Untersuch. Forsch. 1990. V. 138. N 2. P. 351-355.

177. Tomizawa T. Food containing protein hydrolyzates of the squid. Pat. Japan. 1998. N 10-113152 .

178. Tomizawa T. Osmotic agents for peritoneal hemodialysis. Pat. Japan. 1987. N6260563.

179. Trujillo A., Guamis B., Carreto C. Hydrolysis of bovine and caprine caseins by reanet and plasmin model system. // J. Agr. Food Chem. 1998. V. 46. N 8. P. 3066-3072.

180. Tsumura K., Kugimiya W., Hoshino K. A protein hydrolyzate and process for producing it. Pat. Europa. 1997. N 797928.

181. Umetsu H., Matsuoka H., Ichishima E. Debittering mechanism of bitter peptides from milk casein by wheat carboxy peptidase. //J. Agr. Food Chem. 1983. V. 31. N 1. P. 50-53.176

182. Van Leeuwen HJ. Removal of a bitter peptide form tryptic hydrolysates of casein coprecipitate by immunoadsorbent affinity chromatography.// Agric. Biol. Chem. 1978. V. 42. N 6. P. 1375-1378.

183. Wahn U, Wahl R, Rugo E. Comparison of residual allergenic activity of six different hydrolyzed protein formulas. // J. Pediatrics. 1992.V.121. N2. P. 580-584.

184. Webster J. D, Ledward D. A, Lawrie A. A. Protein hydrolysates from meat industry byproducts //Meat Science. 1982. V. 7. N 2. P. 147-157.

185. Xu Yonghong. Control of bitter taste of enzymic hydrolyzates of proteins. // Shipin Gongye Keji. 1997. N 3. P. 1-3.

186. Yoshihara D, Nakamura T, Yanai M, Takeshita Y, Nippon E. Effect of coexistence of di-, tripeptides, and amino acids on absorption of nitrogen source. // Shokuryo Gakkaishi. 1997. V. 50 . N 6. P. 411416.

187. Yoshimoto T, Kabashima T, Fuji M. Novel salt-resistant prolyl oligopeptidase from Sphingomonas capsulata, cloning of its gene, and use of the enzyme for preparing flavoring agents. Pat. Japan. 1998. N 10- 66570.

188. Zhao X. Shipin Lexue.// Food Sei. 1996. V. 17. N 5. P. 3-6.

189. Zumbusch P, Kulke W, Brunner G. Elektro-Ultrafiltration von biotechnischen Losungen. // Chem. Jad. Techn. 1997. V. 69. N 9. P. 1226-1227.177