автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка биотехнологии препаратов кислых протеаз на основе высокоактивного мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 для использования в производстве спирта

На правах рукописи

МОРОЗОВА КИРА АНАТОЛЬЕВНА

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПРЕПАРАТОВ КИСЛЫХ ПРОТЕАЗ НА ОСНОВЕ ВЫСОКОАКТИВНОГО МУТАНТНОГО ШТАММА ASPERGILLUS ORYZAE 107 ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПРОИЗВОДСТВЕ СПИРТА

t/лГ

Специальность №¡.18.07. - Биотехнология пищевых продуктов (по отраслям)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2006

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии» Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Римарева Любовь Вячеславовна Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Кривова Анна Юрьевна кандидат технических наук Абрамова Ирина Михайловна Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт крахмалопродуктов» РАСХН

Защита состоится: «15» ноября 2006 г. в 11.00 час. на заседании диссертационного совета К 006.036.01 Всероссийского научно-исследовательского института пищевой биотехнологии по адресу: 111033, Москва, Самокатная ул., д. 4 б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИПБТ,

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 111033, Москва, Самокатная ул., д. 4 б, ГНУ ВНИИПБТ, ученому секретарю диссертационного совета К 006.036.01.

Автореферат разослан «Ц» оууя^ря 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук

Погоржельская Н.С.

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. В основе большинства биотехнологий в промышленности и сельском хозяйстве лежат каталитические процессы, осуществляемые ферментами микробного происхождения. Особое значение в настоящее время придается комплексным ферментным препаратам протеолитического и кснланояитического действия, что обусловлено значительными возможностями их многоцелевого применения в пищевой промышленности для решения практических задач биотехнологических производств, перерабатывающих сырье с высоким содержанием белка и полисахаридов.

Применение высокоактивных биологических катализаторов направленного спектра действия позволяет ускорить решение рада проблем, которые сдерживали развитие технологий использования белковых субстратов в последние годы. Наиболее характерное практическое применение протеолитических комплексов, содержащих активные протеин азы и пептадазы, связано с интенсификацией биотехнологических процессов, основанных на энзиматическом гидролизе растительного и животного сырья, д ля получения легкоусвояемых продуктов питания, пищевых и кормовых добавок, для повышения качества мясопродуктов, а также для интенсификации технологических процессов в кондитерском, спиртовом, пивоваренном н других производствах пищевой промышленности.

Таким образом, разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства и применения комплексных ферментных препаратов, содержащих наряду с активными протеин азами н пептидазамн, действующими в кислой и слабокислой зоне рН, ферменты ксиланояитического действия актуальна и перспективна, особенно в свете отсутствия подобных препаратов в России.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в проведении селекционных работ по получению активного штамма Aspergillus oryzae -продуцента комплекса кислых и слабокислых протеаз, оптимизации условий его культивирования для биосинтеза ферментов и экспериментальном обосновании целесообразности использования полученных ферментных препаратов в спиртовой и других отраслях пищевого производства.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи;

- научное обоснование критериев отбора препаратов протеолитических ферментов, эффективных при биоконверсии растительного сырья в перерабатывающих отраслях АПК;

- скрининг и селекция перспективных штаммов — продуцентов кислых протеаз;

- направленный мутагенез отселекционированных штаммов-продуцентов, исследование комплексов гидролитических ферментов, синтезируемых мутантными штаммами;

- на основе отселекционированных штаммов и выявленных закономерностей биосинтеза гидролитических ферментов с заданным составом отработать оптимальные биотехнологическне процессы производства комплексных препаратов, содержащих ферменты протеолитического и ксиланолнтического действия в различных соотношениях в зависимости от целевого назначения их применения;

- выявление оптимальных параметров технологических процессов очистки и концентрирования ферментных препаратов;

- изучение основных физико-химических и биохимических свойств полученного комплексного ферментного препарата кислых протеаз;

- создание нормативно-технической документации на комплексный ферментный препарат кислых протеаз и проведение необходимых санитарно-гигиенических исследований;

- наработка опытных партий препаратов и испытание их в различных отраслях народного хозяйства.

Научная новизна работы. Впервые методом направленного мутагенеза и селекции получен новый мутантный штамм Aspergillus oryzae 107 - суперпродуцент комплекса ферментов протеолитического действия, а также сопутствующего фермента -ксиланазы; исследованы его морфолого-биохимические и культуральные признаки.

На основе установленных физиологических особенностей полученного мугант-ного штамма и закономерностей биосинтеза экзогндролаз впервые подобраны условия, позволяющие синтезировать ферментативный комплекс с заданным составом индивидуальных ферментов, а именно, с преимущественно протеолитической или ксилаполитической активностью.

Получены новые экспериментальные данные по составу ферментного комплекса протеолитического действия и изучены его физико-химические свойства.

Выявленные зависимости качественных показателей комплексных ферментных препаратов от условий культивирования мутантного штамма Aspergillus oryzae 107, способа их выделения и очистки позволили дать научное обоснование новой техно-логин получения препаратов кислых протеаз и рекомендации по их использованию в пищевой промышленности.

Практическая значимость и реализация результатов работы. Проведенные исследования явились основой для решения задачи по получению мутантного штамма

Aspergillus oryzae 107 — суп ер продуцента комплекса ферментов протеолнтического и ксиланолитического действия.

В результате изучения свойств полученного мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 разработана и экспериментально обоснована новая технология комплексного ферментного препарата с возможностью преимущественного синтеза протеаз или кси-лаяаз путем варьирования условий культивирования.

Разработаны паспорт на штамм Aspergillus oryzae 107, Технические условия на комплексный ферментный препарат кислых протеаз и Технологическая инструкция по получению комплексного препарата кислых протеаз. Подана заявка на патент РФ на мутантный штамм Aspergillus oryzae 107.

Проведены производственные испытания, подтвердившие разработанные технологические параметры получения комплексного ферментного препарата кислых протеаз и эффективность его использования в спиртовом производстве для интенсификации процессов генерации дрожжей, спиртового брожения и увеличения выхода спирта.

Разработаны и апробированы в производственных условиях Мичуринского экспериментального спиртового завода биотехнологические схемы получения комплексного ферментного препарата протеолитического и кешштлигичешого действия и его применения для ферментолиза хлебопекарных дрожжей для получения аминокислотных смесей многоцелевого назначения.

Исследованы перспективы применения комплексного ферментного препарата кислых протеаз в кондитерском производстве, мясной промышленности, сыроделии, косметологии.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на российских и международных конференциях и симпозиумах: Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2004 и 2005); Научно-практической конференции «Качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов» (Углич, 2004); Научно-практической конференции «Приоритетные направления комплексных научных исследований в области производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» (Углич, 2005); Пятой ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ (Москва, 2005); Третьем международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы н перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, подана 1 заявка на патент РФ.

Структу ра и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 284 источника, из них 159 иностранных, и 8 приложений. Работа изложена на 223 страницах машинописного текста, включает 33 таблицы и 20 рисунков.

2. Обзор литературы

В литературном обзоре рассмотрено общее состояние проблемы дефицита комплексных препаратов кислых протеаз с содержанием сопутствующих ксиланолитиче-ских ферментов на российском и мировом рынках. Приведены классификации протео-литических и ксиланолитических ферментов, основные продуценты данных ферментов, описаны физико-химические свойства протеаз и ксиланаз. Представлены способы регуляции синтеза протеолитических и ксиланолитических ферментов и подробно рассмотрены области применения ферментных препаратов комплексного действия,

Анализ литературных данных выявил проблемы, существующие в дайной области, и позволил сформулировать цели и задачи данного исследования.

3. Экспериментальная часть 3.1. Материалы н методы исследований

Исследования проводили в лабораторных условиях на базе отдела биотехнологии ферментных препаратов ГНУ ВНИИПБТ, кафедры химической эюимолоши МГУ им. МЗ. Ломоносова, ИБФМ РАН г. Пущино, в опытно-экспериментальных и промышленных условиях на базе ФГУП МЭЗ г. Мичуринск.

Объектами исследований служили штаммы микромицетов рода Aspergillus из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии.

Хранение культур осуществляли на агаризованной среде, содержащей солодовое сусло 8°Б, водопроводную воду и агар-агар — 3%. рН среды 5,0-5,5. Инкубацию штаммов для спороношения проводили в течение 5-ти суток при 30°С.

Мутагенез проводили по следующей схеме:

Исходный штамм —+ приготовление споровой суспензии облучение ультрафиолетом —► высев облученной суспензии на селективную агаризованную среду —»отбор мутантов по зонам гидролиза —* отсев отобранных вариантов на скошенный сусло-агар —»тестирование мутантов по протеолитической активности.

Культивирование микроорганизмов осуществляли глубинным способом на синтетических и натуральных средах. Состав компонентов и их количество зависел от условий экспериментов.

Культивирование продуцентов проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 см3 с 50 см3 ферментационной среды на микробиологической качалке при скорости 260

об/мин б течение 42-72 часов при температуре 30-36°С в зависимости от условий эксперимента.

Определение общей протеолитической активности проводили модифицированным методом Ансона по степени гидролиза гемоглобина [Полыгалина Г.В,Т Чередниченко B.C. и др., 2003].

Определение ксилаполитической активности основано на измерении скорости образования восстанавливающих Сахаров методом Шомоди-Нельсона при гидролизе ксилана [Сишшын А.П., Черноглазое В.М. и др., 1993]. В качестве субстрата использовали 1%-ный раствор березового ксилана («Sigma» № Х0502, США) в 0,1 М ацетатом буфере, рН 5,0, время инкубации — 10 минут.

Основные этапы исследований представлены на рис. 1.

Статистическую обработку экспериментальных данных, полученных не менее, чем в 3-х повторностях, проводили по программе Excel 2003 Microsoft Office.

3.2. Результаты исследований н их обсуждение 3.2Д. Сравнительная характеристика мнкромнцетов - продуцентов экзогклролаз н скрининг наиболее активного штамма

Проведены сравнительные исследования 29 штаммов микромшетов рода Aspergillus: A. oryzae, A. terricola, A. flavus, A. foetidus по способности к синтезу кислых протеаз при глубинном культивировании. Наибольшую активность проявили штаммы A, oryzae 251, A. oryzae 387, A. oryzae 387-4-1, A. oryzae 379 (рис. 2).

Из них наиболее высокой продуктивностью по отношению к синтезу кислых и слабокислых протеаз обладал штамм Aspergillus oryzae 387, который был использован в дальнейших селекционных работах.

В результате селекции было выделено более 200 популяций и осуществлен скрининг наиболее активного штамма, синтезирующего комплекс кислых и слабокислых протеаз. Исследованы морфологические особенности селекционированного штамма А. oryzae 387-32-S. Установлен состав ферментативного комплекса, синтезируемого ыик-ромицетом. Полученный штамм обладал биосингетичесхой способностью по отношению к комплексу протеаз (уровень общей протеолитической активности - 8,0 ед. ПС/см3): сериновой, карбоксильной и нейтральной протеиназам, карбокси- и амино-пептидазам, а также сопутствующим ферментам; ксиланазе (1,2 ед. КС/см3) и а-амилазе (8,4 ед. АС/см3).

Рис. 1. Структура теоретических и экспериментальных исследований

ПС, ед/см3

Рис, 2. Результаты скрининга мнкромицетов A. oryzae по способности к синтезу кислых протеаз

3.2Л, Получение высокоактивного штамма Aspergillus oryzae 107- продуцента кислых протеаз методами мутагенеза и селекции

Для создания конкурентоспособной биотехнологии производства и применения ферментных препаратов кислых протеаз в спиртовом производстве для катализа белковых соединений и полисахаридов зернового сусла необходимо получение нового штамма, обладающего более высокой продуктивностью по отношению к протеазам, а также ксиланазе.

Штамм A. oryzae 387-32-5 был использован в селекционных работах в качестве родительского штамма.

I этап - мутагенез

Совместно с ИЕФМ РАН (г, Пущино) был проведен первичный мутагенез селекционированного штамма Aspergillus oryzae 387-32-5.

В результате I этапа мутагенеза было получено более 1600 различных клонов родительского штамма Aspergillus oryzae 387-32-5.

Среди проверенных мутантов было отобрано около 40 вариантов, которые отличались от родительского штамма по морфологическим признакам и по уровню активности синтезируемых протеолитических ферментов. Из них наиболее активными оказались штаммы Jfeife 3,4, 5, б, 61, 108 и 801. Уровень активности кислых протеаз в их культуральных жидкостях превышал на 36-43% уровень активности родительского штамма Aspergillus oryzae 387-32-5 (рис. 3).

ПС, ед/см'

Родительский 3 4 5 (5 61 108 801 штаммы

штамм

Рис. 3. Селекция мутантных штаммов Aspergillus oryzae по уровню протеолтической активности в клс.

II этап - селекция н скрининг активных вариантов мутантных штаммов

Второй этап селекционных работ проводили с семью отобранными мутантными штаммами. Целью исследований явилась селекция более активного варианта, выделенного из рассева с гигантских колоний мутантных штаммов, отличающихся морфологически от основной массы мутантов.

Полученные морфологические варианты были тестированы по сравнению с исходным мутантным штаммом в глубинных условиях на полусинтетической среде с солями Чапека и сухим молоком и на натуральной питательной среде.

После II этапа селекции было выделено 11 более активных вариантов, продуктивность которых превышала продуктивность полученных мутантных штаммов от 2% до 45%(табл. 1). Уровень протеолитической активности в соответствующих kjk. на натуральной среде составил 11,7-15,8 ед. ПС/см1, в то время как у исходного штамма - 8,0 ед. ПС/см3. По сравнению с родительским штаммом уровень активности кислых проте-аз, синтезируемых полученными вариантами, был выше на 46-98%. Таблица 1. Характеристика активных вариантов мутантных штаммов после мутагенеза

и селекции (II этап отбора)

№ Исходный Вариант Полусинтетическая среда Натуральная среда

мутант ПС, ед/см" 50°С; pH 4,7 %к контролю ПС, ед^см* 50°С; pH 4,7 % к контролю

1 2 3 4 5 6 7

1 4 Контроль 2,7 too 11.7 100

2 4-0017 3,1 115 И,9 102

3 Контроль 2,6 100 11,4 100

4 61 61-0031 за 123 13,9 122

5 61-0033 3,4 131 14,6 128

1 2 ' 3 4 5 6 7

б 108 Контроль 2,8 100 10,9 100

7 108-0039 3,6 129 13,2 121

8 108-0040 3,4 121 133 122

9 108-0043 3,2 114 11,7 107

10 108-0044- 3,9 139 15,8 145

1) 108-0045 2,9 11 12,9 118

12 801 Контроль 2,8 100 10,5 100

13 801-0050 3,5 125 14,9 142

14 801-0053 3,4 121 13,5 128

15 801-0055 3,2 114 12,0 114

16 387-32-5 Родительский штамм 2,3 8,0

П1 этап — повторный мутагенез

С целью получения активного варианта мнкроммцета был проведен повторный мутагенез шеста наиболее активных вариантов.

В результате мутагенеза было получено еще 430 вариантов, из которых около 1/3 представляли интерес. В дальнейших селекционных работах по скринингу активного продуцента кислых протеаз на основе тестирования мутант пых штаммов было отобрано 19 наиболее активных (табл. 2).

Таблица 2. Характеристика активных мутантных штаммов (1П этап отбора)

Исходный мутант Варнанг Полусинтетическая среда Натуральная среда

ПС, ед/см1 50°С; рН 4,7 %к контролю ПС, сд/ш1 50®С; рН 4,7 %к контролю

1 2 3 4 5 6

61-0031 Контроль 12 100 13,9 100

17 4.4 137 17,0 122

44 3.4 106 15,0 108

57 3,8 119 16,3 117

61-0033 Контроль 3,5 100 14,6 100

75 4,1 117 16,8 115

98 4.0 114 15,8 108

108-0040 Контроль 3,4 100 13,3 100

103 3,9 115 17,0 128

107 4,8 140 18,5 139

131 4,0 118 16,7 125

168 3,8 112 16,5 124

172 3,6 106 16,3 122

108-0044 Контроль 3,6 100 15,8 100

196 4,0 111 17,7 112

230 4 а 117 17,5 111

298 3.9 108 16,5 104

321 3,8 106 17,1 108

I 2 3 4 5 6

801-0050 Контроль 3,4 100 14,9 100

368 4.1 120 17,1 115

395 3,7 109 16,0 107

801-0053 Контроль 3,5 100 13,5 100

401 3,8 109 15,5 115

412 3,6 103 16,0 118

425 4,0 114 16,4 121

387-32-5 Родительский штамм 2,5 8,0

Проведенные исследования показали, что после повторного мутагенеза с дальнейшим рассевом полученных мутантов были выделены клоны с протеолитиче-ской активностью, превышающей активность мутантных штаммов второго поколения после I и II этапов селекционных работ от 4% до 39%.

Из них наиболее активными были штаммы №№ 17, 107 и 368. Результаты селекции и мутагенеза наиболее активных вариантов - продуцентов кислых и слабокислых протеаз приведена в табл. 3.

Таблица 3. Селекция и мутагенез активных штаммов — продуцентов

кислых протеаз и ксиланазы

Этапы исследований Штамм Протеолитичес кая активность Ксил аналитическая активность

ед ПС/смл % от родит. ед КС/смл % от родит.

Селекция 387-32-5 8,0 100 1Д 100

1этап 61 11,4 143 5,9 492

108 10,9 136 5,8 483

801 10,5 131 5,7 475

II этап 61-0031 13,9 174 7,3 608

108-0040 13,3 166 73 650

801-0050 14,9 186 7,4 617

III этап 17 17,0 213 8,5 708

107 18,5 231 10,1 842

368 17,1 214 9,0 750

Из отобранных вариантов наиболее активным являлся штамм Aspergillus огухае

10?, синтезирующий протеолитические ферменты с уровнем активности в культураль-ной жидкости 18,5 ед. ПС/см3 и ксиланазу - 10,1 ед. КС/см3. Результаты селекции и мутагенеза, в процессе которых получен новый мутантный штамм Aspergillvs огугае 107, представлены на рис. 4.

Активности, «я/см3

20 л

15 -

В ПС

□ КС

10-

ив

t i_

__шш—I

Родительски б штамм

[этап

П этап

Шэтап

Рис. 4. Результаты селекции и мутагенеза микромицета Aspergillus oryzae 387-32-5

Таким образом, в результате многоступенчатой селекции был получен мутант-ный штамм Aspergillus oryzae 107, уровень протеолитической активности которого в культуральной жидкости на 131%, а ксиланолитической на 742% превышал уровень активности у родительского штамма.

Полученный мутант Aspergillus oryzae 107 отличался от исходного пггамма по биосинтетической способности по отношению к различным экзогидролазам (табл. 4).

Таблица 4. Биохимический состав ферментативных комплексов, синтезируемых микромицетамн Aspergillus oryzae

Наименование фермента Ферментативная активность A. oryzae, ед/см1* к.ж.

387-32-5 родительский 107 мутантный

Общая протео-литическая активность 8,0 18,5

Протеиназы: Сериновая Карбоксильная Металлозависнмая 0,019 0,730 0,112 0,040 1,065 0,207

Пептидазы: Лейцишмино-Карбокси- 0,710 0,370 1,100 0,680

Ксиланаза 1,3 10,1

а-амилаза 8,4 19,4

ß-глижаняза 0.1 0,9

Целлюлоза 0.7 1.0

Фосфагаз* 0,2 0,1

Глюкоамилаза 0,6 0,3

Выделенный мутактный штамм Азре^Шт огугае 107 отличается от родительского и по морфологическим признакам: размерами колоний, их цветом, структурой и плотностью биомассы на различных агаризованных средах. Колонии мутантного штамма по размеру несколько меньше, имеют более однородную структуру (рис. 5).

Питательная среда с сусло-агаром

i/iby'riv,'

штамм Aspergillus oryzae 387-32-5 штамм Aspergillus oryzae I Ol Питательная среда Чапека с казеинатом натрия

¿г- ■

Y . * Vr,

штамм Aspergillus oryzae 387-32-5 штамм Aspergillus oryzae 107

Питательная среда Чапека с ксиланом

MS

штамм Aspergillus oryzae 387-32-5 штамм Aspergillus oryzae 107

Питательная среда Чапека с крахмалом

ЩЩ

Штт,____________

'rt'VWSTi vT.??, .'SU

штамм Aspergillus oryzae 387-32-5 штамм Aspergillus oryzae 107 Питательная среда Чапека с пептоном

1ШНШрйМЙЙ

щШШ&ФШш

штамм Aspergillus oryzae 387-32-5 штамм Aspergillus oryzae J07

Рис. 5.Родительский и мутантный пгтммы Aspergillus oryzae, выращенные на различных средах

На основании результатов проведенных исследований разработан паспорт на штамм и подана заявка на патент РФ. Штамм Aspergillus oryzae 107 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП «ГНИИ Генетика».

Подбор питательных срез для культивирования гриба Aspergillus oryzae 107- продуцента кислых nporcaj и ксиланазы

На основе установленных физиологических особенностей нового мутангного штамма Aspergillus oryzae 107 были подобраны оптимальные питательные среды, обеспечивающие активный синтез экзопротеаз и ксиланазы.

С целью получения направленного биосинтеза протеолитических ферментов и повышения продуктивности микромицета Aspergillus oryzae 107 исследовали влияние различных источников крахмала, белка, аминокислот и других биологически активных веществ на синтез экзогидролаз.

Культивироаание гриба на средах, содержащих зерновое сырье (рожь, ячмень, пшеница кукуруза) обеспечивало активный рост продуцента, но недостаточно высокий синтез кислых протеаз (6,5-8,2 ед. ПС/см3). Добавление к зерновому субстрату соевой муки или солодовых ростков стимулировало образование экзопротеаз, уровень активности которых в культуральной жидкости составил 17,0-18,4 ед. ПС/см3. Введение в состав питательной среды кукурузного экстракта снижало выход экзопротеаз в 2 раза, а использование пшеничных отрубей позволило достигнуть высокого уровня их активности в культур альной жидкости (18,0-18,5 ед. ПС/см3).

Дальнейшие эксперименты были направлены на оптимизацию питательной среда для синтеза ксиланазы Aspergillus oryzae 107. С этой целью в питательную среду дополнительно вводили такие стимуляторы синтеза ксиланазы, как березовый ксипан, ксилоза и кукурузные столбики. Эксперимент реализовывали по методу аддитивно-решетчатого описания объекта.

В результате для получения ферментного препарата с содержанием в комплексе сопутствующего ксиланолитического фермента на уровне 18,6 ед. КС/см3 подобрана питательная среда, содержащая в своем составе кукурузные столбики, при этом уровень активности ксиланазы в культур альной жидкости был увеличен на 1760 % по сравнению с исходной.

Влияние условий культивирования на синтез кислых протеаз Aspergillus oryzae 107

В ходе эксперимента по определению оптимального возраста посевного материала Aspergillus oryzae 107 мутантный штамм выращивали на среде следующего состава, %: ячменная мука- 3,0; пшеничные отруби - 1,0; КН2РО4 — 0,5 на протяжении 6; 16; 24; 32; 48 часов в колбах на качалочной установке прн 32°С. По истечении указанного времени определяли титр посевного материала и активность кислых протваз и ксиланазы в инокуляте и культуральной жидкости (табл. 5).

Таблица 5, Влияние возраста посевного материала мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 на биосинтез экзогидролаз

Возраст посевного материала, час Активность экзогидролаз в посевном материале, ед./см3 Титр посевного материала, кл/см3 Активность экзогидролаз в к.ж. после биосинтеза в течение 48 часов, едУсм3

ПС КС ПС КС

6 0,1 0 1 X 105 11.7 8,3

16 0,2 0 3* 10 5 16,3 8,3

24 0,9 следы 4 * 10 3 18,5 10,1

32 2,8 следы 6И01 17,8 9,1

48 5,4 следы 6" ю5 17,2 8,4

Микроскопический триб Азра^Шш огугае 107 является мезофильным микроорганизмом и способен расти в интервале температур 25 - 40°С, но оптимальной температурой для синтеза кислых протеаз является 32°С, а ксиланазы - 34°С (рис. 6),

■ ПС ПКС

Рис. 6. Влияние температуры культивиро вания на синтез фер-

36 °С ментов Aspergillus огугае 107.

Результаты исследований по влиянию рН ферментационной среды при культивировании мутантного штамма Aspergillus огугае 107 на уровень активности кислых протеаз и ксиланазы в культуральной жидкости показали, что оптимальным значением для синтеза кислых протеаз и ксиланазы является рН 5,5 (рис. 7).

рНхж

Рис- 7. Влияние исходного pH среды на синтез ферментов Aspergillus oryzae 107,

5,5 6 исходный pH среды • pH к.ж.

4 4,5 ■ ПС РКС

При исследовании влияния аэрации на способность продуцента к биосинтезу кислых протеаз и ксиланазы в колбах различная степень аэрации достигалась изменением объема питательной среды (рис. 8).

■ ПС

□ КС

Рис. 8. Влияние степени аэрирования на синтез ферментов Aspergillus oryzae 107.

среды, см

Проведенные исследования показали, что оптимальными условиями культивирования мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 для максимального синтеза протеоли-тических ферментов являются дозировка посевного материала - 4 об.%, возраст посевного материала 24 часа, температура культивирования 32-34°С, рН питательной среды 5,5, объем питательной среды в колбе 50 см3.

На основе установленных закономерностей и физиологических особенностей полученного штамма подобраны условия культивирования, обеспечивающие максимальный синтез протеолитических и ксилаполитических ферментов.

Установленные зависимости синтеза протеаз и ксиланаз от условий ферментации (температура, рН, состав питательных сред) позволили разработать регулируемый процесс биосинтеза ферментативных комплексов с заданным составом.

Таким образом, в результате проведенных исследований с использованием эффективных методов мутагенеза и многоступенчатой селекции был получен новый мутантаый штамм Aspergillus oryzae 107 — активный продуцент кислых протеаз и ксиланазы, подобраны оптимальные условия его культивирования; уровень ферментативной активности в культуральной жидкости мутантного штамма превышал по протеазе в 3,9 раза, а по ксиланазе в 18,6 раз показатели культур альной жидкости исходного штамма {рис. 9).

■пс а кс

I - A. oryzae 387 (исходный штамм),

2 - A. oryzae 387-32-5 (после селекции, родительский),

4 - A. oryzae 107 (при оптимальных условиях культивирования).

3- A. oryzae 108-0040-107 (после П1 этапа),

2

3

4

Рис. 9. Характеристика нового мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 - продуцента кислых протеаз и ксиланазы

Получение концентрированного комплексного препарата кислых и слабокислых протеяз

С целью получения концентрированных ферментных препаратов были исследованы и подобраны оптимальные условия выделения мультиэнзимных препаратов с различным ферментативным составом из культуральной жидкости мутантного штамма микромицета Aspergillus oryzae 107.

Получение ФП категории очистки ГЮх осуществляли методом осаждения ферментов этиловым спиртом (96 %об.) го супернатанта к.ж. Aspergillus oryzae 107, варьируя соотношение растворителя и супернатанта, при различных значениях рН. В результате были подобраны оптимальные условия получения концентрированных слиртоосажденных препаратов: рН 5,0 и соотношение этанол : к.ж. = 3:1. Выход препарата составил по протеолитической активности 90%.

Получение Протооризнна Г18х методом ультрафильтрации проводили по следующей технологической схеме: фильтрование к.ж, через ткань «Бельтинг», затем стерилизация через металлокерамический фильтр н концентрирование с помощью мембраны УАМ-150П. Балансовый выход ферментных препаратов представлен в таблице б.

Из таблицы б видно, что при фильтровании распределение ферментативной активности происходит следующим образом: в фильтрате - 60-75%, в биомассе - 38-30%. Через ультрафильтрационную мембран}' УАМ-150П потери протеолитической активности составляют около 2%,

Таблица 6. Влияние метода подготовки к.ж. на концентрирование протеаз

№ п/п Наименование операции и образца Объём, см3 СВ,% Ферментатн вная активность, ед. ПС/см3(г) Выход фермента по стадиям, %

I Исходная кж 2000 1,6 18,5 100

2 Фильтрование:

■ фильтрат к^к. 1240 1,6 17,9 74,9

■ биомасса 750 - 13,5 31,3

3 Стерилизация:

■ фильтрат к.ж. 1100 1,6 15,5 76,7

4 Концентрирование:

■ фильтрат к.ж. 1100 1,6 15,5 -

■ концентрат 45 9,2 291.0 77,0

■ дермеат 970 1,2 0,35 2,0

Была изучена сравнительная характеристика полученного протеолнтического ферментного препарата Протоорнзин с имеющимися аналогами - промышленными

ферментными препаратами отечественного и импортного производства, а именно: Про* тосубтилин (Сиббнофарм), нейтраза (Novozymes), БНЗ (Епшех), Максазим (DSM).

Как видно из таблицы 7, наиболее сложным протеолитическим комплексом обладал препарат из гриба Aspergillus oryzae 107, продуцирующего сериновую (щелочную), карбоксильную (кислую) и металлозависимую (нейтральную) протеиназы, а также амин о- и карбоксипептидазы. Кроме того, ферментный препарат Протооризин имел высокую протеолитическую активностью в кислой зоне pH. Испытанные аналоги про-теолнтических ферментных препаратов содержали, в основном, нейтральную и щелочную протеиназы.

Таблица 7. Биохимическая характеристика ферментативного комплекса концен-

трированных препаратов ггротеолитического действия

Наименование фермента Активность ферментов в ФП, ед/г

1 а"4 8 3 Ь ^ 8 я j Нейтраза БНЗ ж s

Общая протеояи-

тическая активность

(ПС)

pH - 4,0 1530 680 150 38 170 220

pH - 5,5 1870 820 609 150 600 ; 540

Протеиназы

Сериновая »1,0 4,8 9,5 2,4 9,1 10,2

Карбоксильная 182,3 79,3 - - - -

Металлозависимая 32,7 14,2 18,0 5,3 19,5 16,7

Пептид азы

Лейцинамижь 185,1 80,5 - - - 2,1

Карбокси- 89,5 38,9 - - - -

а-амилаза 2323 1010 500 - 2000 -

Ксилаыаза 295,1 65,1 - - - -

Наличие многокомпонентного состава протеолитнческого комплекса, синтезируемого мюфомицетом А$рег£Ши$ огугае 107, позволяет получать более активные ферментные препараты, обеспечивающие глубокий гидролиз белка до аминокислот и способствующие эффективной конверсии высокомолекулярных белковых полимеров зернового сырья при производстве спирта.

Изучение фракционного состава ферментного препарата кислых протеаз, полученного на основе нового мутантного штамма Aspergillus oryzae iö7 методом хроматографического разделения ферментов комплекса

Данные исследования проводились совместно со специалистами кафедры химической этимологии Химического факультета Московского государственного университета им. МЗ. Ломоносова,

Детальный анализ изучаемого ферментативного комплекса Aspergillus oryzae 107 проводили по методу, в основе которого лежало двухстадийное хроматографическое фракционирование препарата с использованием хроматографической системы среднего давления FPLC («Pharmacia», Швеция). Полученные на стадии тонкой очистки фракции подвергали элекрофорезу в денатурирующих условиях (ДДС-ЭФ). В них определяли специфические активности к широкому ряду субстратов, используя «плашечные» методы. Результаты аналитического фракционирования ферментного препарата, полученного на основе Aspergillus oryzae 107, представлены на рис. 10.

Во фракциях препарата на первой стадии разделения было найдено множество ферментов: фосфатаза, кислая и щелочная протеазы в соотношении 5:1, лейцинамино-пепгндаза, ß-гапактозидаза, а-амилаза, ксиланаза, арабиноксиланаза, а-галактшндаза, ß-глюкозидаза и арабиноксиланаза.

Рис. 10, Аналитическое фракционирование ферментного препарата Протооризин Г 2Ох, полученного на основе Aspergillus oryzae 107

На второй стадии во фракциях основными выделенными ферментами были: кислая протеаза, щелочная протеаза и ксиланаза.

По данным ДДС-электрофореза (рис. 11 дорожка prep) препарат, полученный на основе Aspergillus oryzae 107, содержал белки с различной молекулярной массой 52, 37, 35,30, и 22 кДа. Во фракциях после хроматографического разделения препарата проте-азная активность присутствовала в 3-ей фракции (кислая протеаза, активная к гемоглобину при рН 4,7), в 4-ой фракции (лейцинам инопептидаза) и во фракции, не связавшейся с носителем (нейтрально-щелочная протеаза с массой 35 кДа, активная к казеину при рН 9,0). При этом фракция с нейтрально-щелочной протеазой содержала сопутствующую ксиланазную активность, а фракция 4 обладала также Р-галактозидазной активностью.

lib iV. fi'4 fi.7 P,eP fi.3 ft '.6 M

mmllO

I

66

««45

U _-- — 36

^ ^ „ Рис. II, ДДС-элекгрофорез ферментного

Id it

«■*■ -•+ препарата Протооризин, полученного на основе

Aspergillus oryzae 107

Таким образом, анализ биохимического состава ферментативного комплекса из Aspergillus oryzae 107 на основе тестирования активности ферментов по специфичности их действия, а также результатов фракционного состава, полученных при хроматогра-фическом разделении, показали многокомпонентность протеолитического комплекса, а также состав минорных ферментов.

Изучение рН- и термостабнльностн препарата кислых протеаэ, полученных на основе мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 Известно, что внеклеточные ферменты относятся к весьма лабильным вешествам и их активность часто зависит от условий и времени хранения. Эффективное нспользо-

ванне ферментного препарата требует знания его основных физико-химических свойств, таких как рН- и термостабильность.

В связи с этим представляло интерес изучить некоторые физико-химические свойства протеаз полученного препарата.

Приведенные результаты (рис. 12-14) позволяют сделать вывод о стабильности фермента в диапазоне рН 4,0-5,0 при температуре до 50°С. Изученные свойства протеаз, полученных из Aspergillus oryzae 107, имеют не только научное, но и практическое значение, т.к. они позволяют потребителю разработать наиболее эффективные способы его использования в различных отраслях АПК.

Рис. 12. Влияние рН и длительности инкубации ферментного препарата на рН-стабильность протео-литических ферментов в присутствии субстрата (]%-ный раствор гемоглобина) и отсутствии субстрата при температуре 30°С

время, мин

—рН5,0, гм 1% ■ рН 4,0, гм 1%—*—рН 3,0, гм 1% - -♦■ - рН 5,0, вода ■ • рН 4,0, вода - -¿г - рН 3,0, вода

время, мин

—•— рН 5,0, ш 1% —рН 4,0, ш 1% —рН 3,0, гм 1% - - рН 5,0, вода • - рН 4,0, вода • -Ле • рН 3,0, вода

Рис, 13. Влияние рН и длительности инкубации ферментного препарата на рН-стабильность гтротео-литических ферментов в присутствии субстрата (1 %-ный раствор гемоглобина) и отсутствии субстрата при температуре 50°С

Рис. 14. Влияние температуры и длительности инкубации ферментного препарата на термостабильность протеолитическнх ферментов в присутствии и отсутствии субстрата при рН 5,0

i ■ г»

0

20 40 60

80 100 120 время, мин

—ЖС, гм \%

50°С,гм1%

60°С, гм 1%

' 30°С, вода - ■ - 50°С, вода - ■Л - 60°С,вода

Масштабирование процесса культивирования мутанта ого штамма Aspergillus огутде 107 - продуцента кислых протеаз Масштабирование процесса культивирования мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 - продуцента кислых протеаз осуществляли в ферментном цехе Мичуринского экспериментального завода (МЭЗ).

Технология культивирования микромицета, разработанная на основе установленных в результате экспериментальных исследований оптимальных условий культивирования и биосинтеза кислых протеаз, включает следующие основные стадии:

■ приготовление спорового посевного материала в лаборатории;

■ приготовление вегетативного посевного материала в производстве;

■ приготовление и стерилизация питательной среды для культивирования;

■ процесс ферментации;

Процессуально-технологическая схема получения ферментного препарата кислых протеаз приведена на рис. 15.

В результате производственных испытаний были наработаны опытные шртии комплексных ферментных препаратов кислых протеаз и ксиланазы: Протооризин Г20х с активностью 500 ед. ПС/г и 100 ед. КС/г в объеме 100 кг и Протооризин Гх с активностью 22,5 ед. ПС/см3 и 10,2 ед. КС/см3 в объеме 10 т.

Применение ферментного препарата кислых протеаз в спиртовом производстве Ферментный препарат Протооризин Гх использовали на стадии приготовления дрожжевого сусла для протеолиза белковых веществ зернового сырья (задавали порционно совместно с глкжоамилазой) и на стадии сбраживания зернового сусла, задавая непосредственно в головной чан. Дозировка ферментного препарата кислых протеаз составляла 0,7-2,1 ед. ПС/г белка. Приготовленное сусло, обработанное протеазами,

Протооризин Г20х

Рис. 15. Блок-схема технологии ферментного препарата кислых протеаз Протооризин

характеризовалось отличной степенью осахаривания и подавалось на поток, а также в дрожжанки и в возбраживатели.

Отмечена интенсификация процесса генерации дрожжей Saccharomyces cerevisiae при использовании дрожжевого сусла, обогащенного аминокислотами и пептидами в результате протеолиза белков зернового сырья. При этом повышалась бродильная активность дрожжей: на 10 часов роста опытные дрожжанки были уже готовы и захоло-жены, в то время как в контрольных дрожжанках длительность генерации составляла 18 часов. Интенсифицировалось накопление биомассы: концентрация дрожжевых клеток в опытных дрожжанках - 140-150 млнЛм3, в контрольных - 103-115 млнУсм3.

Аналогичные закономерности интенсификации роста и размножения дрожжей, а также повышение их качества наблюдалось и в возбраживателях. На 11 часов роста дрожжей в возбраживателях отброды снижались с 17,0-17,5% до 5,3-4,0%. Концентрация клеток составляла 148-162 млн./см1.

Сказалась эффективность использования ферментного препарата кислых протеаз для осахаривания и протеолиза крахмалсодержащего сырья и на технохимических показателях производственного потока. При использовании препарата кислых протеаз повышалась скорость сбраживания сусла. Средняя концентрация растворимых сухих веществ бродящей массы снижалась практически вдвое по сравнению с контрольным потоком.

Достигнутые показатели указывают на возможность не только сокращения длительности брожения и дрожжегенерации, но и увеличения концентрации сбраживаемого сусла, что приводит, в конечном итоге, к повышению рентабельности производства спирта.

Применение ферментного препарата кислых протеаз при получении Б АД

На основе активного штамма Aspergillus oryzae 107 на Мичуринском экспериментальном заводе была наработана опытная партия комплексного ферментного препарата кислых протеаз Протооризин Г18х, которая была использована для гидролиза биомассы хлебопекарных дрожжей, в результате чего получена биологически активная пищевая добавка. Степень гидролиза белка подобранным ферментативным комплексом составляла 75-87%, при этом в свободное состояние было переведено более 60% аминокислот.

Полученная пищевая добавка содержит полный комплекс витаминов и аминокислот, соответствующих составу дрожжевой биомассы. В связи с глубоким гидролизом белков протоплазмы клеток, ft также глубокой деполимеризацией полисахаридов

клеточных стенок и нуклеиновых кислот этот дрожжевой гидролизат обладает высокой усвояемостью и биологической ценностью. Кроме того, технология его получения отличается высокой рентабельностью и экономичностью, что обусловлено сокращением длительности гидролиза по сравнению с автолизом, а также возможностью исключения дополнительных технологических стадий по очистке ферменголизата дрожжевой биомассы.

Аминокислотный состав полученной пищевой добавки соответствует требованиям ВОЗ. Она содержит незаменимые аминокислоты, г/100г белка: треонин - 4,6; ва-лин - 5,7; метионин - 1,3; изолейцин - 4,3; лейцин - 7,2; фенилаланин - 4,7; лизин -10,1 и триптофан — 1,1. В состав пищевой добавки входят также все определяемые аминокислоты, а именно: аспарагнновая и глутаминовах кислоты, серии, глицин, аланин, цистеин, тирозин, гнстадии аргинин, пролин и витамины группы В, макро и микроэлементы.

Пищевая добавка, полученная на основе гидролиза биомассы хлебопекарных дрожжей с применением высокоактивного ферментного препарата направленного спектра действия, может быть использована для создания новых видов биологически полноценной продукции функционального назначения, для обогащения пищевых продуктов и напитков белком и свободными аминокислотами.

Кроме того, ферментный препарат кислых протеаз был испытан в различных отраслях пищевой промышленности: при гидролизе белоксодержащих субстратов, в кондитерском производстве и в мясной промышленности. Результаты испытаний приведены в таблице 8.

Таблица 8. Перспективы применения ферментного препарата кислых протеаз

Протооризин в перерабатывающих отраслях АПК

Область применения (Место проведения испытаний) Гидролизуемый субстрат и эффективность действия Действующий фермент Цель применения Достигнутый результат

1 2 3 4 5

Спиртовое производство (МЭЗ) Гидролиз белков зернового сырья до пептидов и аминокислот и кснланов зерна до ксилозы Протеазы Ксиланазы Амилазы Обогащение зернового сусла легкоусвояемым аминным азотом, снижение вязкости сусла, улучшение его реологических свойств Интенсификация процесса дрожже-генерации на 5080%, повышение бродильной активности дрожжей на 30-40%

1 2 3 4 5

Кондитерское производство (ВНИИ кондитерской промышленности) Частичный гидролиз белков пшеничной муки до пептидов и крахмала до декстринов Протеин азы Амилазы Повышение эластичности теста при производстве крекеров Замена химических реагентов, повышение качества продукции

Мясная промышленность (ВНИИ мясной промышленности) Гидролиз белков животного происхождения Кислые протеазы Деструкция белков мышечной ткани Интенсификация процесса тендери-зацни мяса

Сыроделие (Бел НИИ пищевой промышленности) Гидролиз молочного казеина Кислые протеазы ß. галактозидаза Деструкция молочного белка Интенсификация технологического процесса плавления сыров

Косметология (ЗАО НПО «Тех-кон») Глубокий гидролиз белков животного происхождения до аминокислот Протеин азы пептидазы Получение свободных аминокислот Обогащение тоников, кремов и лосьонов аминокислотами

Получение бел- ково-аминоки слота ых обогатителей (МЭЗ) Гидролиз белков протоплазмы дрожжевой биомассы до пептидов и аминокислот Протеазы ß-глюканаза маннаназа Интенсификация процесса гидролиза полимеров дрожжевой биомассы Получение фер-ментолизатов белков и полисахаридов: белково-аминокислотного обогатителя «Протамин»

Выводы

1. Проведены сравнительные исследования различных микроорганизмов-продуцентов кислых протеаз и осуществлен скрининг наиболее активного штамма Aspergillus oryzae 387-32-5. .

2. Методами мутагенеза и селекции получен новый активный штамм Aspergillus oryzae 107, протеолитическая активность которого увеличена в 3,3 раза по сравнению с исходным штаммом, ксиланолшическая в 10^ раза.

3. Исследованы культур ально-морфологические особенности мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 и оптимизированы питательная среда й условия его глубинного культивирования, что позволило увеличить выход протеазы в 3,9 раза и ксиланазы в 18,6 раза по сравнению с исходным штаммом.

4. Установлена возможность направленного культивирования Aspergillus oryzae 107 с целью получения ферментных препаратов с различным соотношением протеолитиче-ской и ксипаяояитической активности.'

5. Проведено масштабирование разработанной технологии глубинного культивирования Aspergillus oryzae 107 в опытно-промышленных и производственных условиях; разработана Технологическая инструкция на получение препарата кислых протеаз.

6. Разработаны оптимальные параметры процесса получения концентрированных высокоактивных ферментных препаратов кислых протеаз и наработаны опытные партии комплексных ферментных препаратов Протооризин ПОх, Г18хи Г20х.

7. Исследованы физико-химические свойства протеаз, синтезируемых Aspergillus oryzae 107 и установлены основные параметры (рН 4,0-5,0, температура до 50аС), обеспечивающие стабильность ферментных препаратов и сохранение уровня активности протеолитических ферментов в течение длительного времени,

8. Показана высокая эффективность полученного комплексного ферментного препарата кислой протеазы и кснланазы для интенсификации бнотехнологическнх процессов при производстве спирта и в других отраслях АПК.

9. Экономическая эффективность от производства J 00 т ферментного препарата кислых протеаз по предложенной технологии составит более 34,2 млн. рубЛгод.

Список публикаций

1. Морозова К.А., Грачева И.М., Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Цурикова Н.В„ Синицын А.П. Селекция штамма A. oryzae с целью получения активного продуцента протеолитических я амилолитических ферментов // Тезисы док. Всероссийской научно-технической конференции-выставки «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации».ч.2, М.: МГУПП, 2004, с. 143-145.

2. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Морозова К.А. Скрининг активного продуцента комплекса гидролаз, эффективного для гидролиза полимеров дрожжевой биомассы // В сб. докладов научно-практической конференции «Качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов», ч2, Углич: ВНИИМС, 2004, с.75-78.

3. Римарева ЛЗ., Оверченко М.Б., Морозова К.А., Цурикова Н.В., Синицын АЛ. Перспективные штаммы-продуценты комплекса гидролаз для биокатализа растительного и микробного сырья // В сб. трудов научно-практической конференции «Приоритетные направления комплексных научных исследований в области производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции», Углич: ВНИИМС, 2005, с.357-360.

4. Морозова К.А., Грачева И.М., Римарева Л.В., Оверченко М.Б. Селекция нового штамма-продуцента протеаз и гемицеллюлаз // В сб.: III юбилейной международной

конференция-выставки «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации».ч.2, М.: МГУ1111,2005, с. 9-11.

5. Морозова К.А., Грачева И.М., Римарева Л .В., Оверченко М.Б. Влияние условий культивирования на синтез экзощдролаз мутантным штаммом Aspergillus oryzae sp, // В сб. трудов V ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ, М., 2005, с. 324-327.

6. Морозова К.А., Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Синицын АЛ. Селекция штамма микромицета Aspergillus oryzae — продуцента комплекса экзогидролаз // В сб. научных трудов «Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» М.: ВНИИПБТ, 2006, с. 10-14.

7. Римарева Л.В., Оверченко MJS., Морозова К.А. Влияние условий культивирования на синтез кислых протеаз, а-амклазы и ксиланазы микромицетом Aspergillus oryzae /IВ сб. научных трудов «Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» М.: ВНИИПБТ, 2006, с. 35-40.

8. Римарева Л.В., Оверченко М3„ Морозова К.А., Серба Е.М. Роль ферментативных систем различной специфичности действия на степень биокатализа полимеров дрожжевой биомассы // В сб. научных трудов «Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» М.: ВНИИПБТ, 2006, с. 162-174.

9. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Морозова К.А., Серба ЕЛ. Влияние ферментативного комплекса гриба Aspergillus oryzae на степень гидролиза биополимеров дрожжевой биомассы И Хранение и переработка сельхозсырья, 2006, № 4, с. 39-43.

. 10. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Морозова КЛ., Синицын А.П. Штамм гриба Aspergillus oryzae - продуцент кислых и слабокислых протеаз. Заявка на патент РФ № 2006123547/13(025556) от 04.07.2006.

Заказ № 635. Объем 1п,я. Т ираж 100эю. Отпечатано в ООО «Петроруш» г.Москва,ул.Пшшха 2а.тел.250-92-06 www.pOSlitDr.ni

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Протеолитические ферменты микроорганизмов.

1.1.1. Классификация протеаз.

1.1.2. Продуцен гы протеолитических фермеп i ов.

1.1.3. Физико-химические свойства протеолитических ферментов.

1.1.4. Регуляция синтеза протеолитических фермешов.

1.1.5. Применение протеолитических ферментов.

1.2. Ксиланолитические ферменты микроорганизмов.

1.2.1. Классификация ксиланаз.

1.2.2. Продуценты ксиланолитических ферментов.

1.2.3. Физико-химические свойства ксиланолшических ферментов.

1 2.4. Регуляция синтеза ксиланолитических ферментов.

1.2.5. Применение ксиланолитических ферментов.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАС1Ь.

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1.1. Объекты исследований.

2.1.2. Условия хранения посевного материала.

2.1.3. Условия культивирования.

2.1.3.1. Приютовление вегетативного посевного материала.

2.1.3.2. Культивирование микроорганизмов.

2.1.3.3. Влияние возрасча посевного материала.

2.1.3.4. Влияние начального значения рН пита1ельной среды.

2.1.3.5. Влияние аэрации питательной среды.

2.1.4. Получение концентрированных фермешных ирепараюв.

2.1.5. Метод проведения мутагенеза.

2.1.6. Селекция активного варианта продуцента комплекса кислых и слабокислых протеаз.

2.1.7. Изучение культуральных признаков продуцента.

2.1.8. Методы определения активностей ферментов.

2.1.8.1. Определение общей протеолигической активное!и по модифицированному методу Ансона.

2.1.8.2. Определение активностей индивидуальных протеолитических ферментов.

2.1.8.3. Определение амилолитической активноеi и.

2.1.8.4. Определение ксиланолитической активноеi и.

2.1.8.5. Определение целлюлазной акшвности.

2.1.8.6. Определение (3-глюканазной активности.

2.1.8.7. Определение глюкоамилазной активности.

2.1.8.8. Определение фосфагазной активности.

2.1.9. Определение содержания растворимого белка по методу Лоури.

2.1.10. Определение термостабильности протеолитических ферментов.

2.1.11. Определение рН-стабильности протеолитических ферментов.

2.1.12. Структура теоретических и экспериментальных исследований.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

2.2.1. Селекция и скрининг активных продуцентов комплекса кислых протеаз и ксиланаз.

2.2.1.1. Сравнительная характеристика продуцентов кислых и слабокислых протеаз при твердофазном и 1лубишюм кулыивировании.

2.2.1.2. Селекция акшвною варианта продуцент комплекса кислых и слабокислых протеаз.

2.2.1.3. Устойчивость штаммов Aspergillus oryzae при пересевах и хранении.

2.2.2. Исследование состава ферментативного комплекса, синтезируемого микромицеюм Aspergillus oryzae.

2.2.3. Изучение морфологических особенностей ипамма

Aspergillus oryzae 387-32-5.

2.2.4. Влияние спорового и вегетажвного посевного материала на биосишез протеазы штаммом Aspergillus oryzae 387-32-5.

2.2.5. Проведение мутагенеза и селекционных работ по получению штамма-суперпродуцента кислой и слабокислой протеаз.

2.2.5.1. Подбор питательных сред для тестирования мугантных вариантов микромицета Aspergillus oryzae 387-32-5.

2.2.5.2. Проведение I этапа мутагенеза селекционированною штамма Aspergillus oryzae 387-32-5.

2.2.5.3. Селекция активных вариантов штамма Aspergillus oryzae 387-32-5, полученных методом мутагенеза (II этап).

2.2.5.4. Получение активных вариантов микромицета Aspergillus oryzae 387-32-5 с применением повторного мутагенеза и методов рассева мугангных вариантов (III этап).

2.2.6. Кулыурально-морфоло1 ические признаки новою мугангною штамма Aspergillus oryzae 107 - продуцента протеаз и ксиланазы.

2.2.6.1. Характеристика ферментативного комплекса, сишезируемою мутантным штаммом Aspergillus oryzae 107.

2.2.6.2. Кулыурально-морфологические особенное!и мутантного штамма Aspergillus oryzae 107.

2.2.7. Разработка метода ведения и хранения в активном состоянии высокоактивного штамма Aspergillus oryzae 107 - суперпродуцента кислых и слабокислых протеаз.

2.2.7.1. Пригоювлепие посевного материала.

2.2.7.2. Получение исходной кулыуры на косяках.

2.2.7.3. Способ приготовления посевного ма1ериала.

2.2.7.4. Контроль микробиологической чистоты посевного материала.

2.2.7.5. Контроль ферментативной активности посевного материала.

2.2.8. Подбор натуральных питательных сред для культивирования гриба Aspergillus oryzae 107 - продуцента кислой протеазы.

2.2.9. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза ксиланазы Aspergillus oryzae 107 методом аддитивно-решетчатою математического описания объекта.

2.2.10. Регуляция сишеза кислых протеаз условиями кулыивирования Aspergillus oryzae 107.

2.2.10.1. Влияние возраста и дозы посевного материала на рост и биосинтетическую активность продуцента.

2.2.10.2. Влияние температуры культивирования на биосинтез кислых протеаз и ксиланаз Aspergillus oryzae 107.

2.2.10.3. Влияние начального значения рН пшагельной среды при культивировании Aspergillus oryzae 107 на биосинтез кислых протеаз и ксиланаз.

2.2.10.4. Влияние интенсивности аэрирования при культивировании Aspergillus oryzae 107 на биосинтез кислых протеаз и ксиланаз.

2.2.11. Получение концентрированного комплексного препарата кислых и слабокислых протеаз.

2.2.11.1. Получение комплексного препарата кислых и слабокислых протеаз методом спиртоосаждения.

2.2.11.2. Получение комплексного препарата кислых и слабокислых пролаз методом ультрафильтрации.

2.2.11.3. Разработка сгадии отделения биомассы штамма-продуцента и холодной «стерилизации» культуральной жидкости.

2.2.11.4. Исследование процесса концентрирования методом ультрафильтрации.

2.2.12. Изучение фракционного состава и биохимических свойав ферментного препарата кислых протеаз, полученного на основе нового мутантною штамма

A spergillus or vzae 107.

2.2.12.1. Хромато1 рафическое разделение ферментных комплексов Aspergillus oryzae 107 на компоненты.

2.2.12.2. Определение рН- и 1ермос1абилыюсти препарата кислых протеаз, полученных на основе мутантного штамма Aspergillus oryzae 107.

2.2.13. Масштабирование процесса культивирования мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 - продуцента кислых npoiea3.

2.2.14. Разработка ТИ по применению ферментного препарата кислых протеаз в спиртовом производстве.

Актуальность темы. В основе большинства био1ехнологий в промышленности и сельском хозяйстве лежат катали 1ические процессы, осуществляемые ферментами микробного происхождения. Особое значение в настоящее время придае1ся комплексным ферметным препаратам протеоли-тического и ксиланолитического действия, чю обусловлено зпачшельными возможное 1ями их многоцелевого применения в пищевой промышленности для решения практических задач биотехнологических производств, перерабатывающих сырье с высоким содержанием белка и полисахаридов.

Применение высокоактивных биологических катализаторов направленного спектра действия позволяет ускорить решение ряда проблем, которые сдерживали развитие технологий использования белковых субстратов в последние юды. Наиболее характерное практическое применение проклитических комплексов, содержащих активные протеиназы и пепгидазы, связано с интенсификацией биотехнологических процессов, основанных на энзи-матическом гидролизе растительного и животного сырья, для получения легкоусвояемых продуктов питания, пищевых и кормовых добавок, для повышения качества мясопродуктов, а также для интенсификации технологических процессов в кондитерском, спиртовом, пивоваренном и других производствах пищевой промышленности.

Таким образом, разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства и применения комплексных ферментных препаратов, содержащих наряду с активными протеиназами и пептидазами, действующими в кислой и слабокислой зоне рН, ферменты ксиланолитическою действия актуальна и перспективна, особенно в свете отсутствия подобных препаратов в России.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в проведении селекционных работ по получению активного ипамма

Aspergillus oryzae - продуцента комплекса кислых и слабокислых протеаз, оптимизации условий его культивирования для биосинтеза ферментов и экспериментальном обосновании целесообразности использования полученных ферментных препаратов в спиртовой и других отраслях пищевого производ-ci ва.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- научное обоснование критериев отбора препаратов протеолитических ферментов, эффективных при биоконверсии раашельного сырья в перерабатывающих отраслях АПК;

- скрининг и селекция перспективных штаммов продуцентов кислых протеаз;

- направленный мутагенез отселекционированных штаммов-продуцентов, исследование комплексов гидролитических ферментов, синтезируемых муташными штаммами;

- на основе отселекционированных штаммов и выявленных закономерности биосинтеза гидролитических ферментов с заданным составом о [работать оптимальные биотехнологические процессы производства комплексных препаратов, содержащих ферменты протеолитического и кси-ланолитического действия в различных соотношениях в зависимости от целевого назначения их применения;

- выявление оптимальных параметров технологических процессов очистки и концентрирования ферментных препаратов;

- изучение основных физико-химических и биохимических свойств полученного комплексного ферментного iipenapaia кислых протеаз;

- создание нормативно-технической докумешации на комплексный ферментный препарат кислых протеаз и проведение необходимых санитарно-гигиенических исследований;

- наработка опытных партий препаратов и испытание их в различных отраслях народного хозяйства.

Научная новизна работы. Впервые методом направленного мутгене-за и селекции получен новый мутантный штамм Aspergillus oryzae 107 - суперпродуцент комплекса ферментов протеолитическою действия, а также сопутствующею фермента - ксиланазы; исследованы его морфолого-биохимические и культуральные признаки.

На основе установленных физиологических особенностей полученного мутантного штамма и закономерностей биосинтеза экзогидролаз впервые подобраны условия, позволяющие синтезировать фермент а [ивный комплекс с заданным составом индивидуальных ферментов, а именно, с преимущественно протеолитической или ксиланолитической активностью.

Получены новые экспериментальные данные по составу ферментного комплекса протеолитического действия и изучены его физико-химические свойства

Выявленные зависимости качественных показаiелей комплексных ферментных препаратов от условий культивирования му!антного ппамма Aspergillus oryzae 107, способа их выделения и очиаки позволили да1ь научное обоснование новой технологии получения препаратов кислых протеаз и рекомендации по их использованию в пищевой промышленности.

Практическая значимость и реализация результатов работы. Проведенные исследования явились основой для решения задачи по получению мутантного ппамма Aspergillus oryzae 107 - суперпродуцента комплекса ферментов про политического и ксиланолитического действия.

В резулыаге изучения свойств полученпою му1антного ппамма Aspergillus oryzae 107 разработана и экспериментально обоснована новая технология комплексного ферментного препарата с возможностью преимущественною синтеза протеаз или ксиланаз путем варьирования условий культивирования.

Разработаны паспорт на штамм Aspergillus oryzae 107, Технические условия на комплексный ферментный препарат кислых протеаз и Технологическая инструкция по получению комплексного препарата кислых протеаз. Подана заявка на патент РФ на мутантный штамм Aspergillus oryzae 107.

Проведены производственные испытания, подтвердившие разработанные технологические параметры получения комплексного ферментного препарата кислых протеаз и эффективность его использования в спиртовом производстве для интенсификации процессов генерации дрожжей, спиртовою брожения и увеличения выхода спирта.

Разработаны и апробированы в производственных условиях Мичуринского экспериментального спиртового завода биотехнологические схемы получения комплексного ферментного препарата протеолитического и ксила-нолитического действия и его применения для ферментолиза хлебопекарных дрожжей для получения аминокислотных смесей мноюцелевого назначения.

Исследованы перспективы применения комплексного ферментного препарата кислых протеаз в кондитерском производстве, мясной промышленное ж, сыроделии, косметологии.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на российских и международных конференциях и симпозиумах: Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2004 и 2005); Научно-практической конференции «Качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов» (Углич, 2004); Научно-практической конференции «Приоритетные направления комплексных научных исследований в обласш производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» (Углич, 2005); Пятой ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ (Москва, 2005); Третьем международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях ЛПК» (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, подана 1 заявка на патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающею 284 источника, из них 159 иностранных, и 10 приложений. Работа изложена на 227 страницах машинописного 1ексга, включает 33 1абли-цы и 20 рисунков.

ВЫВОДЫ

1. Проведены сравнительные исследования различных микроорганизмов-продуцентов кислых протеаз и осуществлен скрининг наиболее активного штамма Aspergillus oryzae 387-32-5.

2. Методами мутагенеза и селекции получен новый активный ниамм Aspergillus oryzae 107, протеолитическая активность которою увеличена в 3,3 раза по сравнению с исходным штаммом, ксиланолитическая в 10,2 раза.

3. Исследованы культурально-морфологические особенности мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 и оптимизированы питательная среда и условия его глубинного культивирования, что позволило увеличить выход протеазы в 3,9 раза и ксиланазы в 18,6 раза по сравнению с исходным штаммом.

4. Установлена возможность направленного культивирования Aspergillus oryzae 107 с целью получения ферментных препаратов с различным соотношением протеолитической и ксиланолитической активноеi и.

5. Проведено масштабирование разработанной технолот ии глубинного культивирования Aspergillus oryzae 107 в опьпно-промышленпых и производственных условиях; разработана Технологическая инструкция на получение препарата кислых протеаз Протооризин.

6. Разработаны оптимальные параметры процесса получения концентрированных высокоактивных ферментных препаратов кислых протеаз и наработаны опытные партии комплексных ферментных препаратов Протооризин ПОх, Г18х и Г20х.

7. Исследованы физико-химические свойства протеаз, синтезируемых Aspergillus oryzae 107 и установлены основные параметры (рН 4,0-5,0, температура до 50°С), обеспечивающие стабильность ферментных препараюв и сохранение уровня активности протеолитических ферментов в течение длительного времени.

8. Показана высокая эффективность полученною комплексного ферментного препарата кислой протеазы и ксиланазы для интенсификации биотехнологических процессов при производстве спирта и в других отраслях АПК.

9. Экономическая эффективность от производства 100 т фермешною препарата кислых протеаз по предложенной технолот ии составит более 34,2 млн. руб./год.

2.2.15. Заключение

В результате проведенных исследований с использованием эффективных методов мутагенеза и многоступенчатой селекции был получен новый мутантный штамм Aspergillus oryzae 107 - активный продуцент кислых протеаз, ксиланазы и других сопутствующих гидролитических ферментов.

На диаграмме (рис. 20) приведены обобщенные результаты экспериментальных исследований по получению нового мутантного штамма Aspergillus oryzae 107, продуктивность коюрото в 3,3 раза превышала исходный штамм по уровню синтеза протеаз и в 10,2 раз - ксиланаз.

Штамм Aspergillus oryzae 107 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП «ГНИИ Генетика».

На основе установленных зависимостей и физиоло1 ических особенностей полученного штамма подобраны условия культивирования, обеспечивающие максимальный синтез протеолитических и ксиланолитических ферментов.

Установленные зависимости синтеза протеаз и ксиланаз от условий ферментации (температура, рН, состав питательных сред) позволили разработать регулируемый процесс биосинтеза ферментативных комплексов с заданным составом.

Активности, ед/см"'

Ш Протеолитичсская активность □ Ксиланолитическая активность

Рис. 20. Протеолитическая и ксиланолитическая активности штаммов Aspergillus oryzae: 1 - A. oryzae 387 (исходный штамм),

2 - A. oryzae 387-32-5 (после селекции, родительский),

3 - A. oryzae 108 (после I этапа),

4 - A. oryzae 108-0040 (после II этапа),

5- A. oryzae 108-0040-107 (после III этапа),

6 - A. oryzae 107 (при оптимальных условиях культивирования)

Анализ биохимического состава ферментативных комплексов на основе тестирования активности ферментов по специфичности их действия, а также результатов фракционного состава ферментного препарата, полученного при хроматографическом разделении показал многокомпонентность протеолитического комплекса, синтезируемого микромицетом, а также состав сопутствующих минорных ферментов.

Разработаны оптимальные условия получения концентрированных ферментных препаратов методом осаждения этанолом и ультрафильтрацией.

Получены опытные образцы ферментных препаратов: Протооризип ПОх (ПС =1870 ед/г, КС =295 ед/г) и Протооризин Г20х (ПС = 500 ед/г, КС = 100 ед/г).

Показана эффективность использования полученного ферментного препарата в производстве спирта для интенсификации процессов генерации дрожжей, спиртовою брожения и увеличения выхода спирт.

Полученные результаты позволили разработать гехполотию процесса получения и применения кислых протеаз па основе нового мутантного штамма Aspergillus oryzae 107.

Сравнительные исследования полученных ферментных препараюв из Aspergillus oryzae 107 с имеющимися аналотами - промышленными ферментными препаратами отечественного и импортного производства показали преимущество селекционированного штамма для получения комплексных ферментных препаратов кислых протеаз, содержащих наряду с сериновой (щелочной) и мегаллозависимой (нейтральной) про1еиназами, карбоксильную протеиназу, а 1акже амино- и карбоксипетидазы.

В то время как испытанные аналоги протеолитических ферменшых препаратов содержали, в основном, только нейфальную и щелочную протеиназы. Наличие такого многокомпонентною состава протеолитического комплекса, синтезируемого микромицетом Aspergillus oryzae 107, позволяет получать более активные ферментные препараты и обеспечивать более глубокий гидролиз белка до аминокислот.

Полученный препарат кислых протеаз был испытан в различных отраслях пищевой промышленности: при гидролизе белоксодержащих субсфагов; в спиртовом производстве; в кондитерском производстве; в мясной промышленности; при получении БАД на основе биокатализа микробной биомассы.

Результаты испытаний приведены в таблице 33.

1. ГОСТ 20264.2-88 Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности.

2. ГОСТ 20264.4-89 Препараты ферметные. Meiоды определения амилолиш-ческой активности.

3. Абрамзон А.А. Поверхностно-активные вещества. Свойства и применение // Ленинград. Химия. -1975, 248 с.

4. Азаренкова Н.М., Ваганова Т.И., Стронгин А.Я., С|епанов В.М. Выделение и свойства кислой карбоксипептидазы из A oryzae. Биохимия, 1976, 41, №1, с. 20.

5. Александрова Г.П., Медведева С.А., Синицын А.П., Окунев О.Н. Изменение состава структурных компонентов лиственной сульфатной целлюлозы в процессе ферментативного отбеливания ксиланазами // Прикл. биохимия и микробиология. -2000. -Т.36, №3. С. 287-292.

6. Аль-Нури М.А., Иваница В.А., Егоров Н.С. Биосинтез внеклеточных протеаз Asp candidus при отсутствии источников углерода и серы // Микробиология. -1981, 50, №6. - с. 10.

7. Альперович Е.Д. Получение целлюлазных ферментных препараюв на основе грибных культур // Автореферат дисс. на соискание ученой степени k.i.h. -М. -1986.-25 с.

8. Антипова Л.В. Биотехнологические основы получения и применения препаратов протеолигических ферментов для обработки сырья молочной и мясной промышленности // Авюрефераг дисс. на соискание ученой степени д.т.н. -М.-1992,-55 с.

9. Байгильдина А. А., Терегулова Т. Г., Камилов Ф. X. Номенклатура и классификация ферментов. Коферменты и кофакторы//Уфа: Здравоохранение Башкортостана, 2005. -72 с.

10. Ю.Безбородов A.M. Биохимические основы микробиологического синтеза // М.: Легкая и пищевая промышленность-1984,-304 с.

11. Бондарчук А.А., Колтукова Н.В., Василевская И.Я. и др. Питательная среда для выделения протеаз бактерий рода Bacillus II Микробиологический журнал.-1987, 49 № 3. - С. 110.

12. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза.// М.: Наука, 1985. 296 с.

13. Бравова Г.Б. Ферментные препараты нового поколения для отраслей агропромышленного комплекса// Микробные биокатализа юры для перерабатывающих отраслей АПК. М.: ВНИИПБТ, 2006. - С. 284-298.

14. М.Брустовецкая Т.П., Окунев О.Н., Шульга А.В. Образование и свойства грибных целлюлаз и ксиланаз в жидкой среде и в условиях твердофазной ферментации // Прикл. биохимия и микробиоло1 ия. -1991. -Т.27, №4. С. 577583.

15. Гапонов К.П. Процессы и аппараты микробиологических производств // М.: Легкая и пищевая промышленность.-1981, 210 с.

16. Голубев В.Н., Чичева-Филатова Л.В., Игленская Т.В. Пищевые и биологически активные добавки. М.: Издательский центр «Академия», - 2003. - 208 с.

17. Голубев В.Н., Жиганов И.Н. Пищевая биотехнология. М.: ДеЛи принт, -2001.-123 с.

18. Голубев A.M., Иватулин Ф.М., Килимник Ф.Ю., Родионова Н.А., Неустроев К.Н. Выделение и свойства эндоксиланазы и р-ксилозидазы из A oryzae И Биотехнолот ия. -1993. -Т.58, №6. С. 845-851.

19. Горбачева И.М. Ферменты Aspergillus niger, расщепляющие ксилапы // Автореферат дисс. на соискание ученой степени к.б.н. М. - 1977. - 25 с.

20. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий // М.: Мир.-1982, 310 с.

21. Грачева И.М., Кривава А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: Изд. Элевар, - 2000. - 512 с.

22. Гужова Э.П., Логинова Л.Г. Целлюлолитические ферменты и ксиланаза Му-celiophthora thermophila II Прикл. биохимия и микробиология. 1987. - Т.23, №6.-С. 820-825.

23. Дарбре А. Практическая химия белка // М. Мир, 1989, 623 с.

24. Демьяновская В.И., Павлюк М.И., Кучер Р.В. Растворимость кислорода в ферментационных средах // Укр. хим. ж. .-1975, 41 № 10. - С. 1073.

25. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты, (в 3-х т.) // М.: Мир. 1982.

26. Дубовая Н.В. Исследование процессов выделения и очистки микробной эндл-1,4-3-ксиланазы из рода Geotrichum и изучение свойств фермента // Автореферат дисс. на соискание ученой степени к.б.н. М. - 2002. - 25 с.

27. Егоров Н.С., Выборных С.Н., Лория Ж.К., Фишешер 3. Репрессия синтеза экзопротеазы Bacillus licheniformis II Микробиология. -1983, 52, №6. -С.941.

28. Егоров Н.С., Лория Ж.К., Юдина Т.Г. Регуляция синтеза экзопротеазы Bacillus thuringiensis II Известия АН СССР, сер. биол.-1984, № 2. - С. 165.

29. Епремян А.С., Честухина Г.Г., Азизбекян P.P., Нетыкса Е.М., Руденская Т.И., Степанов В.М. Внеклеточная сериновая протеипаза Bacillus thuringiensis. Биохимия, 1981, Т. 46, № 5, с.920.

30. ЗО.Зуева Р.В., Коновалов С.А. Получение муташов A oryzae, активных продуцентов кислой протеиназы // Микробиология. -1971, 40, №1. - С.83.

31. Иванова Н.М., Ва1анова Т.И., Стронгин А.Я., Степанов В.М. Выделение и свойства лейцинаминопептидазы из A. oryzae. Биохимия, 1977, Т. 42, № 5, с. 843.

32. Извекова Г.И. Протеолитические свойства гриба // Микробиология. -1985, -54, №1. С.62.

33. Имшенецкий А.А., Касаткина И.Д., Желюва Е.Г. Репрессия синтеза протеаз у Aspergillus terricola под влиянием экзогенных аминокислот // Микробиология.-1971,-40, №3. С.439.

34. Имшенецкий А.А., Попова Н.В. Биосинтез протеиназы Aspergillus terricola на средах с ортническими соединениями азо1а // Микробиология. -1970, -39, №3. С.421.

35. Калашникова Н.А., Родзевич В.И. Активность фосфа1аз различных культур плесневых грибов // Прикл. биохимия и микробиология. 1971. - Т. 7, № 4. -С. 446.

36. Калунянц К.А., Яровенко В.Л., Домарецкий В.А., Колчева Р.А. Технология солода, пива и безалкогольных напитков. М.: Колос, - 1992. - 446 с.

37. Квеситадзе Э., Гомартели М., Безбородов A.M., Адейшвили Е. Термостабильные зндоксиланазы фибов-термофилов // Прикл. биохимия и микро-биоло1 ия. 1998. - Т. 34, № 5. - С. 517-520.

38. Клесов А.А., Рабинович М.Л., Синицын А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. 1. Активность и компонентный состав целлюлазных комплексов из различных источников. // Биоортаниче-ская химия, -1980. т. 6, N 8, - с. 1225-1242.

39. Ковалева Г.Г., Юсупова М.П., Лысогорская Е.Н., Баландина Г.Н., Степанов В.М. Получение очищенного аспергиллопепсина А. Биохимия, - 1977. -42, № 3, - с. 534.

40. Коломбет Л.В., Жиглецова С.К., Дербышев В.В., Ежов Д.В., Косарева Н.И., Быстрова Е.В. Микрофунгин препарат на основе Trichoderma viride для борьбы с болезнями растений // Прикл. биохимия и микробиология. - 2001. -Т. 37, № 1.-С. 110-114.

41. Кнопова С.И., Савенкова Т.В. Технологические аспекш применения комплексного ферментного препарата в производстве крекера // Микробные биокатали за юры для перерабатывающих отраслей АПК. М.: ВНИИПБТ, 2006. - С. 202-207.

42. Лобуцкая Н.В., Волков Ю.Г., Ермак И.М., Дедюхипа В.II. Получение биологически активных веществ с помощью грибных ферментов // Биотехнология. -2002. -№6.- С. 68-69.

43. Люблинская Л.А., Ластовецкая Л.В., Шехватова Г.В., Ваганова I .И., Ciena-нов В.М. Определение активности нейфальных металлопрогеиназ по хро-могенному субстрату 2,4-динитрофенил-глицил-глицил-валил-аргинину -Химия природных соединений, 1976, 1, с.75.

44. Марков А.В. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мугантны-ми штаммами Trichoderma reesei // Автореферат дисс. па соискание ученой степени к.х.н. М. - 2003. - 26 с.

45. Маркина О.А., Румянцева Г.Н., Птичкина Н.М. Использование отечественных ферментных препаратов для получения пектина из жома // Материалы 1-го конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» - М. Наука, 2003.-С. 379.

46. Матвеева И.В., Пучкова Л.И., Малофеева Ю.П., Юдина Е.А. Применение ферментных препаратов при производстве хлеба из смеси ржаной и пшеничной муки // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. 2001. - №2. - С. 68-71.

47. Молосова О.В., Руденская Г.Н., Степанов В.М., Ходова О.М., Цаплина И.А. Глутамип, аспарагин-специфичпая протеиназа акшномицетов. // Биохимия. 1987.- 52, №3.- С. 414-422.

48. Месхи Р.Г. Разработка технологи комплексного ферментною npenapaia 3-глюканазы, ксиланазы и глюкозидазы // Автореферат дисс. на соискание ученой степени к.т.н. М. -1983. - 25 с.

49. Мехузла Н.А., Панасюк A.JT. Плодово-ягодные вина. М.: Легкая и пищевая промышленность, - 1984. - 240 с.

50. Микробные биокатализа горы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК. Под общ. ред. В.А. Полякова. М.: Пищепромиздат, - 2004. - 320 с.

51. Островский Д.Н., Капрельянц А.С., Лукоянова М.А. Прикладные аспекты биохимии мембран // Прикл. биохимия и микробиол. -1983, 19, №1. - С.60.

52. Пащенко Л.П. Биотехнологические основы производства хлебобулочных изделий. М.: Колос, - 2002. - 368 с.

53. Перерабогка продукции растительного и животною происхождения (под ред. А.В. Богомолова, Ф.В. Перцевого). СПб.: ГИОРД, - 2001. - 336 с.

54. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток // М.: Мир.-1978, 332 с.

55. Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева J1.B. Определение активности ферментов. Справочник. // М.: ДеЛи приш, 2003. 375 с.

56. Поляков В.А., Римарева Л.В. Перспективные ферментные препараты и особенности их применения в спиртовой промышленности // Пиво и напигки. -2000.-№2.-С. 52-55.

57. Прудлов Б., Ушакова В.И., Егоров Н.С. Влияние различных соединений углерода на образование протеолитических ферментов Fusarium graminearum uAltemaria sp. II Микробиология. -1972. 41, №5. - С.791.

58. Римарева Л.В. Роль протеолитических ферментов в интенсификации процессов дрожжсченерации и спиртового брожения // Авюреферат дисс. на соискание ученой степени к.т.н. М. - 1980. - 25 с.

59. Римарева Л.В., Войнарский И.Н., Яровенко BJI. Роль протеолитических ферментов в повышении активности солода и интенсификации спиртовою брожения // Ферментная и спиртовая промышленность. 1981. - № 3. - С. 27-30.

60. Римарева Л.В., Войнарский И.Н., Устинников Б.А., Яровенко В.Л., Коновалов С.А. Влияние протеолитических ферментов на физиоло1 ическое состояние и размножение дрожжей // Ферментная и спиртовая промышленность. -1983.-№ 2.-С. 36-39.

61. Римарева Л.В., Милюкова Т.Б., Войнарский И.П. Применение активированного солода в спиртовом производстве // Спиртовая и ликероводочная промышленность. ЦНИИТЭИ. 1983. -№ 3. - С. 2-3.

62. Римарева Л.В., Войнарский И.Н., Милюкова Т.Б., Устинников Б.А. Роль протеаз в повышении активности солода и интенсификации спирювого производства // Сб.: V Всесоюзный биохимический съезд. Изд. «Наука». 1986. - Г. 2.-С. 142.

63. Римарева JI.B., Милюкова Т.Б., Войнарский ИЛ. Влияние три юна Х-100 на рост и продуцирующую способность гриба Aspergillus oryzae II Деп. ВИНИТИ. М. - 1989.-№ 7. - С. 120.

64. Римарева Л.В., Милюкова Т.Б. Влияние поверхносшо-активных вещеав на биосинтез протеаз и амилазы фибом Aspergillus oryzae II Деп. ВИНИ1И. -М.-1991.-№7.-С. 75.

65. Римарева Л.В., Макеев Д.М., Устинников Б.А. Влияние протеолитических ферментов на выход спирта // Пищевая промышленность. 1993. - № 2. - С. 29-30.

66. Римарева Л.В. Перспективы использования про политических ферментных препаратов // Пищевая промышленность. 1996. - № 3. - С. 44-45.

67. Римарева Л.В. Использование комплексною ферментного препарата Амило-протооризина для гидролиза дрожжевого белка // Хранение и переработка сельхозсырья. 1996. - № 2. - С. 39-40.

68. Римарева Л.В., Милюкова Т.Б., Оверченко М.Ь., I рифонова В В., Устинников Б.А. Штамм-продуцент комплекса кислых и слабокислых npoiea3 и других гидролаз // Патент РФ № 2070921. Б.И. 1996. - № 36.

69. Римарева Л.В., Милюкова Т.Б., Оверченко М.Б., Трифонова В.В., Устинников Б.А. Питательная среда для культивирования Aspergillus oryzae продуцента гидролитических ферментов // Патент РФ № 2061035. Б.И. - 1996. - № 15.

70. Римарева Л.В. Биотехнология комплексных препаратов кислых протеаз и их роль в интенсификации технологических процессов в перерабатывающих отраслях АПК // Автореферат дисс. на соискание ученой степени д.т.п. М. - 1997.-51 с.

71. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Серба Е.М., Трифонова В.В. Сравнительная характеристика микробных протеаз по степени гидролиза белковых субстратов // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. - Г.ЗЗ, №1. - С. 43-45.

72. Римарева JI.B., Оверченко М.Б. Роль протеаз в спиртовом брожении // Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК. М.: ВНИИПБТ, 2006. - С. 127-137.

73. Родионова Н.А., Горбачев И.В., Тавобилов И.М. Ксиланазы Aspergillus niger // Проблемы биоконверсии растительного сырья / Ред. Скрябин Г.К., Голов-лев ЕЛ., Клесов А.А. М.: Наука, 1986. - С. 237-271.

74. Руденская Г.Н. Глутамил эндопептидаза микроорганизмов новое подсемейство химотрепсиновых протеиназ. // Биоорганическая химия. - 1998 -24, №4. - С.256-261.

75. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизипов. // Биоорганическая химия. 1994. - 20, №5. - С.475-484.

76. Рыжова Н.В., Иванова JI.A., Мураенко Е.Н. Совершена вовапие способов экаракции красящих веществ из paciтельного сырья // Хранение и переработка сельхозсырья, 2006, № 5, - С. 17-19.

77. Самуйтенс М.А., Чюрлис Т.Н. Влияние условий культивирования на биосинтез протеолитических ферментов бактериями рода Bacillus II Сб. Микробиология и производство Вильнюс. - 1981. - С. 33.

78. Семенова М.В. Свойства внеклеточных пектиназ грибов рода Aspergillus II П Автореферат дисс. на соискание ученой степени к.х.н. М. - 2005. - 26 с.

79. Серба Е.М. Разработка био1ехнологического процесса фермешашвнот гидролиза дрожжевой биомассы с целью получения биологически акшвных добавок// Автореферат дисс. на соискание ученой смепени к.т.н. М. - 2005. -25 с.

80. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов // Итоги науки и 1ехники, Сер. "Биотехнология", т.25, 1990 (1-е изд.), 1993 (2-е изд.), Москва, Изд-во ВИНИТИ.

81. Скоупс. Р. Методы очистки белков М.: Мир - 1985 - 358 с.

82. Скулачев В.П. Транспорт энергии, метаболитов, кислорода и электронов вдоль биологических мембран // Успехи современной биологии. -1979, 88, №2 (5). - С.163.

83. Супрунов Д., Обогащение комбикормов ферментным комплексом для цыплят-бройлеров // Комбикорма. 2000. - № 1. - С. 47-48.

84. Тиунова Н.А., Кобзева И.Я., Сороваева А.В. Ферментные системы Geotrichum candidum ЗС и Penicillium citreo-viride 26, гидролизующие полисахариды клеточных стенок // Прикл. биохимия и микробиология. -1991. -Т.27, №3. С. 338-345.

85. Тукмачев В.А., Заславский Б.Ю., Рогожин С.В. Сравнение действия ионных и неионных поверхностно-активных веществ на плазматическую мембрану дрожжевых протопластов // Биохимия. -1978, 43, №3. - С.568.

86. Тукмачев В.А., Заславский Б.Ю., Рогожин С В. Лизис дрожжевых про-тпластов под действием алкилсульфаюв натрия // Биохимия. -1977, 42, №12. - С.2246.

87. Удалова Э.В., Околелова Т.М. МЭК для птицы // Комбикормовая промышленность. 1995. - №6. - С 18-20

88. Устинов Б.Б. Свойства ксиланаз Chrysosporium lucknowense II Автореферат дисс. на соискание ученой степени к.х.н. М. - 2006. - 24 с.

89. Устюжанина С.В., Войнарский И.Н., Яровенко В Л Синтез протеазы и а-амилазы грибом A. oryzae 251-90 // Прикл. биохимия и микробиол. -1984. -20, №5. С.616.

90. Устюжанина С.В., Войнарский И.Н., Яровенко B.J1. Синтез протеазы и а-амилазы отмытыми клетками A. oryzae 251-90 // Прикл. биохимия и микробиол.-1985. 21, №1. - С.67.

91. Устюжанина С.В., Римарева Л.В., Милюкова Т.В., Войнарский И Н. Регуляция образования грибных экзогидролаз уровнем их в среде и практическое применение установленных закономерностей // Деп ВИНИТИ. М. -1989. -№7. -С. 120.

92. Хайдарова И.В., Егоров П.С. Фибринолитические ферменты микроорганизмов // В кн. «Функциональная активность ферментов и пуш ее рефляции» М.: МГУ .-1981,-С. 155.

93. Хамидулин В.А., Егоров Н.С., Ландау Н.С., Войнарский И.Н. Штамм гриба A. oryzae продуцент амилолитических и протеолитических ферментов. Авт. свид. СССР № 1440922 // Б.И. -1988, № 44 - С. 122.

94. Хмельницкая Д.Л., Дзумедзей И.В., Кучер РВ Коррелятивная связь основных параметров роста микроорганизмов в присутствии поверхностно-активных вещееI в//Микробиология. -1980, -49, №6. С. 1007.

95. Черемнова Е.А. Изучение биосинтеза ксиланазы плеспевым фибом Aspergillus awamori II Автореферат дисс. на соискание ученой степени к.т.н. -М.-1979.-24 с.

96. Чурсип В.И. Биокатализ в процессах переработки кожевепною сырья и коллагенсодержащих материалов // Микробные биокатализаторы и перепекшвы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК. -М.: Пищепромиздат, 2004. С. 137-144

97. Чурсин В.И. Влияние ферментов на термодеформационные и упруго-пластические свойства кожевенною сырья // Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК. М.: ВНИИ1 IB Г, 2006. - С. 276-283.

98. Шахова Т.В. Биохимические основы получения кислой протеиназы при культивировании мутанта Aspergillus awamori 78-2 // Автореферат дисс. на соискание ученой степени к.т.н., М.-1971,-25 с.

99. Шлелепко J1.A., Поландова З.В., Дремучева I .Ф. Влияние мильтиэнзим-ных композиций на свойство теста и качество пшеничного хлеба // Хлебопечение России. 2001.-№1.-С. 22-24.

100. Шубаков А.А., Михалева II.И., Боев А.В., Окунев О.Н. Образование ксиланазы дрожжами Cryptococcus podzolicus II Прикл. биохимия и микробиология. -1994. -Т.30, №6. С. 812-820.

101. Шубаков А.А., Елькина У.Ф., Федоров Э.И. Биоотбеливание лиственной сульфашой целлюлозы ферментными препаратами Целловиридин ГЗх и Пектофоетидин ГЗх // Биотехнология. -2000. №1. - С. 52-57.

102. Щеблыкина Л.В. Исследование протеолитического комплекса микроскопического гриба Rhizopus pygmaues PI-8 // Автореферат дисс. на соискание ученой степени к. кн., Воронеж. -1980, 26 с.

103. Элисашвили В.И. Биосишез и свойства целлюлаз и ксиланаз высших ба-зидиомицетов // Прикл. биохимия и микробиология. -1993. -Т.29, №3. С 340-452.

104. Югова Л.В., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б., Покровская С.С., Покровский/

105. А.В. Полиферментный комплекс в биотехнологии виноградного виноделия // Микробные биокагализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК. М.: Пищепромиздат, 2004. - С. 237-242.

106. Юркевич В.В., Зуева Е.С. Белки среды, как факторы регуляции синтеза секретируемой протеиназы // Биохимия. 1982, - 47, № 10. - С. 1670.

107. Яровенко В.Л., Войнарский И.П., Римарева Л.В. Отбор препараюв npoie-аз для спиртового производства по интенсивное i и и глубине гидролиза белков сусла // Ферменжая и спиртовая промышленность. . 1979, - №8. - С. 29-31.

108. Яровенко В.Л., Маринченко В.А., Смирнов В.А. и др. ехнология спирта. Под ред. В.Л. Яровенко. М.: Колос, - 1996. - 464 с

109. Aleksenko, A., Nielsen, М. L., and Clutterbuck, A. J. (2001). Genetic and physical mapping of two centromere-proximal regions of chromosome IV in Aspergillus nidulans. Fungal Genet. Biol. 32,45-54.

110. Aleksieva P., Djerova A., Tchorbanov В., Grigorov J. Submerget cultivation of a strain оt Humicola lutea 72 producing acid protease // Eur. J. Appl. Microbiol, and Biotechnol. -1981, 13, №3. - P. 165.

111. Anthony Т., Raj K.C., Rajendran A., Gunasekan P. I ligh molecular weight cel-lulase-free xylanase from alkali-tolerant Aspergillus fumigatus II Fn/yme Microbial Technology. 2003. - V. 32. - P. 647-654.

112. Archer D.B., Dyer P.S. From genomics to post-genomics in Aspergillus // Curr. Opin. Microbiol. 2004. - V. 7, - P. 499-504.

113. Argos P. A sensitive procedure to compare amino acid sequences // J. Mol. Biol. 1987. - V. 193. - P. 385-396.

114. Ashita D., Sunil K. Production of a thermostable alkali-tolerant xylanase from Bacillus circulans AD 16 grown on wheat straw // Wold J. Microb. Biotechnol. -2000. V. 16, № 14. -P. 325-327.

115. Bakir U., Yavascaoghlu S., Guvens F., Ersyin A. An endo-|3-l ,4-xylanase from Rhizopus oryzae: production, partial purification and biochemical characterization // Enzyme Microbial Technology. 2001. - V. 29. - P. 328-334.

116. Bangam J.A., Lea E.J.A. The interaction of detergents with bilayer lipid membrane // Boichim. et Biophys. Acta. -1978, -511.- P.388.

117. Barett A. J. Proteolytic enzymes: serine and cysteine peptidases // Methods En-zymol. 1994. - V. 244 - P. 1-15.

118. Beidman G., Vogaren A.G.J., Rombouts F.M., Searle-van Leeuwen M.F., Pil-nik W. Specific and nonspecific glucanases from Trichoderma viride // Biotech-nol. Bioeng. 1988,-V. 31.-F. 160-167.

119. Berenger J.-F., Frixon C., Bigliardi J., Creuzet N. Production, purification and properties of thermostable xylanase from Clostridium stetcorarium II Can. J. Microbiol. 1985. - V. 31, №7. - P. 635-643.

120. Berens S., Kaaspari H., Kiemme J. Purification and characterization of two different xylanases from the thermophilic aktinomycete Microtetraspora fiexuosa SIIX // Antonie van Leeuwenhoek 69. 1996.-P. 235-341.

121. Biely P., Petrakova E. Novel inducer of the xylan-degrading enzyme system of Cryptococcus albidus Hi. Bacteriol. 1984. - V. 160. - P. 408-412.

122. Biely P., MacKenzie C.R., Puis J., Schneider II. Cooperatively of esterases and xylanases in the enzymatic degradation of acetyl xylan // Biotechnol. 1986. - V. 4.-P. 731-733.

123. Biely P. Biochemical aspect of production of microbial hemicellulases // Hemicellulose and Hemicellulases / Eds. Coughian M.P., Hazlewood G.P. Portland Press. Cambridge, 1993. - P. 29-51.

124. Biswas S.R., Jana S.C., Mishra A.K., Nanda G. Production, purification and characterization of xylanase from a hyper xylanolitic mutant of Aspergillus ochraceus II Biotechnol. Bioeng. 1990. - V. 35. - F. 244.

125. Brenner, S. The molecular evolution of genes and proteins: a tale of two serines //. Nature -1988. V. 334.- P. 528-530.

126. Camacho N.A., Aguilar G.A. Production, purification and characterization of a low-molecular-mass xylanase from Aspergillus sp. and its application in baking // Appl. Biochem. Biotechnol. 2003. - V. 104. - P. 159-171.

127. Cho H.K., Jung H.K., Pack Y.M. Xylanase encoded by genetically engineered Clostridium thermocellum gene in Bacillus subtihs. II Biotechnol. 1995. - V 17.-P. 157-160.

128. Cohen B.L. Regulation of intracellular and extracellular neutral and alkaline proteases in Aspergillus mdulans II J. Gen. Microbiol. -1973, 79, №2. - P.311.

129. Copa-Patino J.L., Kim Y.G., Broda P. Production and initial characterization of the xylan-degrading system of Phanerochaete chrysospotium II Appl. Microbiol Biotechnol. 1993. - V. 40. - P. 69-76.

130. Coronel L., Mesina O.G., Jonson L.M., Sobrejuanite E.E. Cellulase and xylanase production of Aspergillus fumigatus, a thermophilic fungus // Philipp. J. Sci. 1991. - V. 120, № 3. - P. 283-303.

131. Curotto E., Concha M., Milagres A., Duran N. Production of extracellular xy-lanases by Penicillium jantinellum: effect of selected growth condition // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. - V. 48, № 2. - P. 107-116.

132. Curotto E., Nasal A., Aguirre C., Campos V., Duran N. bn/ymatic pretreat-ment of kraft pulps from pinus radiate D don with xylanolytic complex of Penicillium canescens (CP 1) fungi // Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. - V. 73. - P. 29-42.

133. Czakaj J., Sawicka-Zukowska R., Jedry Chowska B. Optizyrnawa nie ksy-lanazy z Chaetomium globosum. Pr. Inst, i lab. bak. przem. spo/., 2000. - V. 55.-P. 41-59.

134. Czapinska R., Otlenski J. Structual and energetic determinants of the Sl-site speciflty in serine proteases// Eur. J. Bioch., 1999, V. 260. - P. 571-595.

135. Dahlberg L., Hoist O., Kristjansson J.K. Thermostable xyianoiytic enzymes from Rhodothermus marinus grown on xyian // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1993.-V. 40.-P. 63-68.

136. Defaye J., Guillot J.M., Biely P., Угьапька M. Positional isomers of thioxylo-biose, their synthesis and inducing ability for D-xylan-degrading enzymes in the yeast Cryptococcus albidus II Carbohydrate Research. 1992. - V. 228. - P. 4764.

137. Dekker R.F.H., Richard G.N. Purification, properties and mode of action of hemicellulase producer by Ceratocystis paradoxa // Carbohydr. Res. - 1971. -V.39.-P. 97-114.

138. De Marco A.C., Dick A.J. Aminopeptidase I activities in several microorganisms.// Can. J. Biochem., 1978, V. 56, P. 66-71.

139. Deschamps P., Iluet M.C. Xylanase production in solid-state fermentation: a study of its properties // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. V. 22. - P. 177180.

140. Drapeau G.R., Boily Y., Houmard J.J. Purification and properties of an extracellular protease of Staphilococcus aureus И J. Biol. Chem. 1972, V. 247, №20, P. 6720-6726.

141. Femandez-Espinar M., Pinaga F., de Graaff L., Visser J., Ramon D., Valles S. Purification, characterization and regulation of the synthesis of an Aspergillus nidudans acidic xylanase // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - V. 42. - P. 555-562.

142. Ferreira-Costa M., Dias A., Maximo C., Morgado M.J., Martins-Sena G., Duarte C.J. Xylanolitic enzyme production by an Aspergillus niger isolate // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. - V. 44. - P. 231 -242.

143. Filho E.X.F., Puis J., Coughlan M.P. Biochemical characteristics of two endo-(3-1,4-xylanases produced by Penicillium capsulatum II J. Industrial Microbiology. 1993,-V. 11.-P. 171-180.

144. Fond O., Engasser J.-M., Matta-El-Amouri G. et al. The acetone butanol fermentation on glucose and xylose. Regulation and kinetic in fed-batch culture // Biotechnol. Bioeng. 1986. - V. 28, № 2. - P. 167-175.

145. Gandhi J.P., Rao K.K., Dave P.J. Characterization of exracellular thermostable xylanase from Chaetomium globusum II Chem. Technol. Biotechnol. 1994. - V. 60, № 1.-P. 55-60.

146. Gao P.J., Gu Y.B., Wang D., Zhang X. Production, characterization and application of cellulase-free xylanase from Aspergillus niger П Appl. Biochem. Biotechnol.- 1996.-V. 57-58.-P. 375-381.

147. Gasper A., Cosson T. Study on production of a xylanolitic complex from Peni-cillium canescens 10-10c // Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. - V. 67, №1-2. -P.45-68.

148. Gawande P.V., Kamat M.Y. Production of xylanase by immobilized Aspergillus sp. using lignocellulosic waste // World. J. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 16, №1.-P. 111-112.

149. Ghareib M., Nour Ec., Dein Mahmoud M. Purification and general properties of xylanase from Aspergillus terreus II Microbiol. 1992. - V. 147, № 8. P. 569-576.

150. Ghosh V.K., Deb J.K. Production and characterization of xylanase from Thie-laviopsis basicola II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988. - V. 29, P. 44-47.

151. Gill P.P., Modi V.V. Induction of extracellular proteases by egg-white in Aspergillus nidulans II Folia microbial -1981,-26, №2. P.78.

152. Haltrich D., Laussamayer В., Steinar W. Xylanase formation by Scierotium rolfsii: effect of growth substrates and development of a culture medium using statistically designed experiments // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - V. 42. -P. 522-530.

153. Haltrich D., Steiner W. Formation of xylanase by Shizophyllum commune: Effect of medium components // Enzyme Microb. Technol. 1994. - V. 16. - P. 229-235.

154. Hare P., Long S., Robb F.T., Woods D.R. Regulation of exoprotease production by temperature and oxygen in Vibrio alginolyticus II Arch. Microbiol. -1981, -V. 130, №4. P.276.

155. Haros M., Rosell C.M., Benedito C. Improvement of flour quality through carbohydrates treatment during wheat tempering // J. Agric. Food. Chem. 2002. V. 50.-P. 4126-4130.

156. Hartley B.S. Proteolytic enzymes // Annu. Rev. Biochem. 1960. - V. 29. - P. 45-72.

157. Heldt-Hansen H.P. Development of enzymes for food applications // Biotechnology in the food chain-new tools and applications for future foods: VTT symp. / Ed. Poutanen K. Helsenki, Finland, 1997. - № 177 - P. 45-55.

158. Helenius A., Simons K. Solubilazation of membrane by detergents // Boichim. et Biophys. Acta. -1975, 415. - P.29.

159. Hog M.M., Deckwer W.-D. Cellulase-free xylanase by thermophilic fungi: A comparison of xylanase production by two Thermomyces lanuginosus strans // Appl Microbiol. Biotechnol. 1995. -№ 4. - P. 604-609.

160. Honda H., Kudo Т., Horikoshi K. Selective excretion of alkalin xylanase by Escherichia coli carry in PCX3 11 // Agric. Bios. Chem. 1985. - V. 49, № 10. -P. 3011-3015.

161. Hrmova M., Biely P., Vrsanska M. Specifity of cellulase and xylanase induction in Trichoderma reesei QM 9419 // Arch. Microbiol. 1986. - V. 144. -P.307-311.

162. Hrmova M., Beily P., Vrsanska M. Cellulose and xylan degrading enzymes of Aspergillus terreus И Enzyme Microbiol. Technol. 1989. - V. 11. - P. 610-616.

163. Iefuji H., Chino M., Kato M., Iimura Y. Acid xylanase from yeast Cryptococ-cus sp. S-2: purification, characterization, cloning and sequencing // Biosci. Biotech. Biochem. 1996. - V. 80, №8.-P. 1331-1338.

164. International Union of Biochemistry. Enzyme nomenclatuie // Academic Press Inc., 1992.-Orlando, Fla.

165. John M., Schmidt J. Xylanase and |3-xylosidase of Trichoderma lignorum II Meth. Enzymol. 1988. - V. 160. - P. 662-670.

166. Kanauchi M., Bamfort C.W. Growth of Trichoderma viride on crude cell wall preparations from barley // Agric. Food. Chem. 2001. - V. 49, № 2. - P. 883887.

167. Kanson A.L., M-Ali A., A-El-Gammal A. Xylanolytic activities of Streptomyces sp. 1 taxonomy, production, partial purification and utilization of agricultural wastes // Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. - 2001. - V. 48. -P. 39-52.

168. Lappalainen A. Purification and characterization of xylanolytic enzymes from Trichoderma reesei II Biotechnol. Appl. Biochem. 1986. - V. 8, № 5. - P. 437448.

169. Leenhouts, К. J., J. Gietema, J. Kok, and G. Venema. Chromosomal stabilization of the proteinase genes in Lactococcus lactis. II Appl. Environ. Microbiol. -1991.- V.57-P. 2568-2575.

170. Lemmel A.S., Dalta R., Frankiewicz R.J. Fermentation of xylan by Clostridium acenobutylicum II Enzyme Microb. Technol. 1986. - V. 8. - P. 217-222.

171. Lemos J.L., Solorzano B.E.P.S., Ebole S.M.F., Pereira J.N. Thermal stability of xylanases produced by Aspergillus awamori II Praz. J .Microbiol. 2000.-V. 31, №3. - P. 206-211.

172. Lesk A.M., Fordman W.D. Conservation and variability in the structyre of serine proteinases of the chymotrypsin family // J. Mol. Biol. 1996, - V. 258, P. 501-537.

173. Lindberg R.A., Eirich L.D., Price J.S., Wolfinbarger 1 ., Drucker II. Alkaline protease from Neurospora crassa II J. Biol. Chem. 1981 - V. 256, - p. 811-814.

174. Mabey J.E., Anderson M.J., Giles P.F., Miller C.J., Attwood Г.К., Paton N.W., Bornberg-Bauer E., Robson G.D., Oliver S.G., Denning D.W. The central Aspergillus data repository // Nucleic Acids Res. CADRE 2004 - № 32, - p. 401-405.

175. Magnuson T.S. Purification and characterization of alkalin xylanase from Streptomyces viridesporus II Abstr. Gen. Meet. Am. Microbiol. 1996. - V. 96. -P. 566.

176. Mala B. Rao, Aparna M. Tanksale, Mohini S. Ghatge, Vasanti V. Deshpande. Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases // Microbiology and molecular biology reviews 1998. - V. 62, №.3. - P. 597-635.

177. Mendicuti С., Laura P., Trejo-Aguilar B.A., Aguilar O.G. Thermostable xy-lanase produced at 37 °C and 45 °C by a thermotolerant Aspergililus strain II FEMS Microbiol. Lett. 1997. - V. 146. - P. 97-102.

178. Merchant R., Merchant P., Margaritis. Production of xylanase by thermophilic fungus Thielavia terrestris // Biotechnol. Lett. 1988. - V 10, № 7 - P. 513-516.

179. Milagres A.M., Prade R.A. Production of xylanase from Penicillium janthinel-lum and its use in the recovery of cellulosic-textile fibers // Enzyme Microbial Technology. 1994. - V. 16. - P. 627-632.

180. Mizrahi A., Miller G. Role of glucols and tweens in the production of ergot alkaloids by Claviceps paspali II J. Bact. -1969, 97, №3. - P. 1155.

181. Morales P., Madarto A., Flors A., Sendrra J.M., Peres-Gonzales J.A. Purification and characterization of a xylanase and arabinofuranosidase from Bacillus po-lymixa II Enzyme Microdial Technol. 1995. - V. 17. - P. 424-429.

182. Nath D., Rao M. Increase in stability of xylanase from an alkalophilic Bacillus (NCIM 59) // Biotechnology. 1995. - V. 17, № 5. - P. 557-560.

183. Ohkoshi A., Kudo Т., Mase Т., Horikoshi K. Purification of three types of xy-lanases from an alkalophilic Aeromonas sp. II Agric. Biol. Chem. 1985. - V. 49.-P. 3037-3038.

184. Ogridaziak D.M., Demain A.L., Tannenbarum S.R. Regulation of extracellular production in Candida lipolitica И Boichim. et Biophys. Acta. -1977, V. 497. -P.525.

185. Okunev O.N., Lappalainen A., Niku-Paovola M.L., Nummi M. Xylanase and cellobiohydrolase from Aspergillus terreus IIVII Symp. 1985. - № 60. - P. 171180.

186. Paul J., Varma A.K. Influence of sugars on endoglucanase and p-xylanase activities of a Bacillus strain // Biotechnol. Left. 1990. - V. 12 - P. 6 1-64.

187. Pekka M., Raudaskoski M., Viikari L. I lemicellulolytic enzymes in P- and S-strains of Heterobasidion annosum II Microbiology. 1995. - V. 141. - P. 743750.

188. Peter-Avalos O.P., Neresa P., Ignasio M., Mayra 1). Induction of xylanase and P-xylosidase in Cellulomonas flavigena growing on different carbon sours // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - V. 46. - P. 405-409.

189. Pham P.J. Optimization of a culture medium to xylanase production by Bacillus sp. using statistical experimental designs. Nat. Polytech. Inst. Toulouse // Wold J. Microbiol. Biotecimol. 1998. - V. 14. - P. 2185-2190.

190. Pham P.L., laillander P., Delmans M., Strehaiano P. Production of xylanase by Bacillus polymyxa using lignocellulosic wastes // Industrial Crops and Products. -1998.-V. 7.-P. 195-203.

191. Postemsky C.J., Dignam S.S., Setlow P. Isolation and characterization of Bacillus megaterim mutants containing decreased levels of spore protease // J. Bacterid. 1978, - V. 135, P. 841-850.

192. Poutanen K., Puis J. Characteristics of Trichoderma reesei (3-xylosidase and its use in the hydrolisis of solubilized xylans // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988. -V. 28. - P.425-432.

193. Poutanen K., Puis J. 1 he xylanolytic enzyme system of Trichoderma reesei: Plan cell wall polymers // Biogenes and biodegradation of plan cell wall polymers / Eds. Lewis G., Paice M. American Chemical Society. Washington. D. C., 1989.-P. 630-640.

194. Prabhu K.A., Manshwari R. Biochemical properties of xylanases from a thermophilic fungus, Melanocarpus albomyces, and their action on plant cell walls // J. Biosci. 1999. - V. 24, № 4. - P. 46 1-470.

195. Rahman A.K.M.S., Sugitani N., Hatsu M., Takamizawa K. A role of xylanase, a-L-arabinofuranosidase, and xylosidase in xylan degradation // Can. J. Microbiol. -2003.-V. 49.-P. 58-64.

196. Raijaram S., Varma A. Production and characterization of xylanase from Bacillus thermoalkalophilus grown on agricultural wastes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. - V. 34-P. 141-144.

197. Ramakrishnan V.M., Strohfus B.R.-H., West T. P. Characterization of a xylanase from Aureobasidium pullulam // Microbios. 1996. - V. 85, № 344. - P. 179-187.

198. Rao K.K., Rao S. Effect on the production of ergot alkaloids by Aspergillus fumigatus II Folia microbial. -1975, 20, №5. - P.418.

199. Rao M., Gaikwad S., Mishra C., Deshpande V. Induction and catabolite repression ofcellulase in Pemcillium juniculosum II Appl Biochem. Biotechnol. 1988. - V. 19.-P. 129-137.

200. Ratto M., Pautanen K., Viikari L. Production of xylanolitic enzymes by an al-kalitolerant Bacillus circulans stran // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. - V. 37.-P. 470.

201. Ravijot K., Dhillon G.S, Singa A., Kalsa M.S. Xylanase and celilulase production by mutant №10 of Trichoderma reesei QM 9414 // J. Res. Punjab Agr. Univ. -1996.-V. 32,№2.-P. 170-177.

202. Rawlings, N. D., and A. J. Barrett. 1993. Evolutionary families of peptidases. Biochem. J. 290:205-218.

203. ReilyP.J. Xylanases structure and function // Basic 1 ife Sci. 1981. - V. 18. -P. 111-129.

204. Rehacek Z., Basappa S.C. Effect of Tween 80 on alkaloid-producing cultures of Clavicept paspali II Folia microbial. -1971, 16, №2. - P. 110.

205. Rishnan M.V.R., Strohfus B.R-H., West 11.P. Characterization of a xylanase from Aureobasidium pullulam II Microbios. 1996. - V. 85, № 344. - P. 159-187.

206. Ristroph D.L., Humphey A.E. Kinetic characterization of the extracellular xy-lanases of Termomonospora sp. II Biotechnol. Bioeng. 1985. - V. 27, № 6. - P. 832-836.

207. Rodrigues E.M., Milagres A.M.F., Pessoa J.A. Selective recovery of xylanase from Renicillium janthinellum using BDBAC recovered micelles // Acta Biotechnol. 1999. - V. 19, №2.-P. 157-161.

208. Rodziewisz A. // Zesz. nauk AR Wroclawiu Technol. /yw. -1989, №5. -L.167.

209. Rodziewisz A. // Zes/. nauk AR Wroclawiu Technol. zyw. -1989, №5. -L.207.

210. Royer J., Nakas J. Production of xylanase by Trichoderma longibrachiatum II Enzyme Microbiol. Technol. 1989. - V. 11, № 7. - P. 405-410.

211. Rulkarni N., Shendye A., Rao M. Molecular and biotechnology aspects of xy-lanases // FEMS Microbiol. Rev. 1999. - V. 23. - P. 411 -456.

212. Sakaswat V., Bisaria V.S. Purification, characterization and substrate specificities of xylanase isoensymese from Melanocarpus albomyces // Biosci Biotechnol. Biochem. 2000. - V. 64, № 6. - P. 1147-1180.

213. Sandhu D.K., Karla M.K. Production of cellulase, xylanase and pectinase by Trichoderma longibranhiatum on different substrates // Trans .Br. Mycol. Soc. -1982.-V. 79, №3.-P. 409-413.

214. Sa-Pereira P., Mesquita A., Duarte J.C., Barros M.R.A., Costa-Ferreira M. Rapid production of thermostable cellulase-free xylanase by a strain of Bacillus subtillis and its properties // Enzyme Microbial Technology. 2002. - V. 30 - P. 924-933.

215. Sharma A., Gurta M.N. Macroaffinity ligand-facilitated three-phase partitioning (MLFTPP) for purification of xylanase // Biotech. Bioeng. 2002 - V. 80, № 2.-P. 228-232.

216. Shei J С., Fratzke A.K., Frederick M.M., Frederick J.R., Reilly P.J. Purification and characterization of endoxylanases fiom Asp mgei II An enzyme of pi 4,5 1 // Biotechnol. Bioeng. 1985. - V. 27, № 4 - P. 533-538.

217. Shinmyo A., Davis I.K., Nomoto F., Tahara Т., Enatsu T. Catabolite repression of hydrolases in Aspergillus niger // Eur. J. Appl. Microbiol, and Biotechnol. -1978, 5, №1. - P.59.

218. Siedenberg D. Production of xylanase by Asp awamory on complex medium in stirred tank and airlift tower loop reactor endo-l,4-(3-D-xylanase production in a fermentator // J. Biotechnol. - 1997. - V. 56, № 3. - P. 205-216.

219. Sielecki A.R., Fujinaga M., Read R.J., James N.G. Refined structure of porcine pepsinogen et 1,8A resolution // J. Mol. Biol. 1991, - V. 219, P. 671 -692.

220. Simao C.R, Souza M.G.C., Peralta M.R. Induction of xylanase in Aspergillus fumarii by methyl-fi-D-xyloside // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 47. -P. 267-271.

221. Simons K., Helenius A., Garoff H. Solubilization of the membrane proteins from Semliki Forest virus with Triton X-100 // J. Mol. Biol. 1973, - 80, № 1. -P. 119.

222. Simpson H.D. Haufler U.D., Daniel R.M. An extremely thermostable xylanase from the thermophilic eubacterium Thermotoga II Biochem. J. 1991. - V. 277. -P. 413-417.

223. Singht A., Kuhad R.C., Manish K. Xylanase production by a hyperxylanolytic mutant of Fusarium oxysorum II Enzyme Microb. Technol. 1995. - V. 17, № 6 -P. 252-253.

224. Somkuti G.A., Babel F.J. Acid protease syntesis by Mucor pusillus in chemically defined media//J. Bacteriol. 1968,-95, № 4. - P. 1415.

225. Srivastava R., Srivastava A.K. Characterization of a bacterial xylanase resistant to repression by glucose and xylose // Biotechnol. I ett. 1993. - V 15 - P. 847852.

226. Srivastava R., Srivastava A.K. Characterization of a bacterial xylanase resistant to repression by glucose and xylose // Biotechnol. Lett. 1993. - V. 15. - P. 847852.

227. Sternberg D., Mandels G.R. Induction of cellulolytic enzymes in Trichoderma reesei by soforose // Journal of Bacteriology. 1979. - V. 139. - P. 761 -769.

228. Stewart J.C., Lester A., Milburn В., Parry J.B. Xylanase and cellulase production by Aspergillus fumigatus fresenius // Biotechnol. 1 ettes. 1983. - V. 5, № 8. -P. 543-548.

229. Stoll E., Weder H.G., Zuber И. Aminopeptidase II from Bacillus stearother-mophilus II Biochem. Biophys. Acta. 1976, - V. 438, P. 212-220.

230. Svedsen 1., Breddman K. Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specific endopeptidases from Bacillus licheniformis II Eur. J. Biochem 1992, -V. 204, P. 165-171.

231. Svendsen, I., Jensen M.R. Breddman K. The primary structure of the glutamic acid specific protease of Streptomyces griseus.ll FFBS Lett. 1991. - V. 292. - P. 165-167.

232. Taguchi F., Hasegawa K., Saito-Taki Т., Нага К. Simultaneous production of xylanase and hydrogen using xylan in batch culture of Clostridium sp. Strain X 53 // J. Ferment. Bioeng. 1996. - V. 81. - P. 178-180.

233. Tailor, M.J., and Richardson, T. Application of microbial enzymes in food systems and in biotechnology. //Adv. Appl. Microbiol. -1979. V. 25, - P. 7-35.

234. Tenkanen M., ViiKari L., Bucher J. Use of acid-tolerant xylanase for bleaching of kraft puips // Biotechnol. Techn. 1997. - V. 11, № 2. - P.935-938.

235. Thomson J.A. Molecular biology of xylan degradation // FEMS Microbiol. Rev.- 1993.-V. 104.-P. 65-82.

236. Thukral V., Dey S., Panda T. Multipl pH and temperature optimum of extracellular xylanase from T reesei QM 9414 // Bioprocess. 1989. - V. 4. - P. 40-47.

237. Toida J., Fukuzawa M , Kobayashi G., I to K., Sekiguchi J. (2000). Cloning and sequencing of the triacylglycerol lipase gene of Aspergillus oryzae and its expression in lischerichiacoli. FEMS Microbiol Lett. 189, 159 164.

238. Tomonaga G., Ohama H., Yanagita T. Effect of sulphur compounds on the protease formation by Aspergillus niger II J. Gen. and Appl. Microbiol 1964, -№ 10.-P. 373.

239. Tomonaga G. Preferential synthesis of extracellular proteases by Aspergillus niger in sulphur deficiency // J. Gen. and Appl. Microbiol. 1966, -№ 12. - P. 267.

240. Tribak M., Ocampo J.A., Garcia-Romera I. Production of xyloglucanolytic enzymes by Trichoderma viride, Paecilomyces fannosus, Wardomyces inflatus and Pleurotus ostreatus II Mycologia. 2002. - V. 94, № 3. - P. 404-4 10.

241. Tsuge H., Suzuke M., Kito N., Nakanishi Y., Ohashi K., Aoki K. Inactivation of glucose oxydase by the cationic detergents, hexadecyltrimethylammonium bromide // Agric. Biol. Chem. 1984, -48, № 1. - P. 19

242. Uden K.O. Effect of different inorganic sources on the production of cellulase-free beta-l,4-xylanase by Aurebasidium pullulans II Pol. J. Food. Nutrit. Sc. -1999.-V. 8, №3,-P. 39-48.

243. Uhlig H. Industrial enzymes and their applications // New York: John Wiley & Sons, Inc. 1998.-P.435.

244. Ujile M., Roy C., Yaguchi M. Low molecular weight xylanase from Trichoderma viride II Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57. - P. 1860-1862.

245. Van den Hombergh J.P.T.W., van de Vondervoort P.J.I., Fraissinet 1 ., Visser J. Aspergillus as a host for heterologous protein production: The problem of proteases // Trends Biotechnol., 1997. - V. 15, - P. 256-263.

246. Vap der Toom J.J.T.K., Van Gelswyk N.O. Xylan-degesting bacteria from the rumen of sheep fed maize straw diets // J. Gen. Microbiol. 1985. - V. 131, № 10.-P. 2601-2607.

247. Viikari L., Tenkanen M., Buchert J., Ratto M., Bailey M., Siika-Aho M., Linko M. Hemicellulases for industrial applications // Bioconversion of forest and agricultural wastes / Ed. Saddler J. CAB International. Oxon. UK., 1993. - P. 131182.

248. Viikari Г., Kantelinen A., Buchert J., Puis J. Enzymatic accessibility of xylans in lignocellulosic materials // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - V. 41. - P. 124-129.

249. Viikari L., Kantelinen A., Sundquist J., I inko M. Xylanases in bleaching: From an idea to the industry // FEMS Microbiol. Rev. 1994. - V 13. - P. 335350.

250. Wizani W., Esterbaner H., Steiner W., Gomen G., Cheie L. Exo- und endo cel-lulase-free xylanase. Verfahren und deren Verwendung. Г1ат.40175221, ФРГ, МКИ5 CI2 N 9/24. (Dentschland) GmbH. № 40175227 Заявл. 31.05.90. Опубл. 05.12.91.

251. Wong K.K.J., Tan L.U.L, Saddler J.N., Vaguchi M. Purification of third distinct xylanase from xylanolytic system of Trihoderma harzianum 11 Canad. J. Mi-crob. 1986. - V. 32, № 7. - P. 570-576.

252. Wong K.K.Y., Saddler J.N. Trichoderma xylanases: their properties and application // Xylans and xylanases / Eds. Visser J., Belman G., Someren M.A.K., Vor-agen A.G.J.-Elser, Amsterdam, 1992.-P. 171-186.

253. Woodvard D.J. Xylanases: function, properties, and application // Fnzyme ferment Biotechnol. 1984. - V. 8. - P. 9-30.

254. Xu J., Nogava M., Okada H., Morickawa Y. Xylana/e induction by L-corbose in a fungus Trichoderma reesei HC-3-7 // Biosc. Biotechnol. Biochem. 1998. -V. 62,№8.-P. 1555-1559.